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CN111868039A - 用于治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗癌症的组合物和方法 Download PDF

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CN111868039A
CN111868039A CN201880075999.2A CN201880075999A CN111868039A CN 111868039 A CN111868039 A CN 111868039A CN 201880075999 A CN201880075999 A CN 201880075999A CN 111868039 A CN111868039 A CN 111868039A
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CN
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inhibitor
compound
subject
glucose
glucose metabolism
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CN201880075999.2A
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D·A·内桑森
W·X·麦伊
M·E·荣格
P·M·克拉克
T·F·克劳希
G·金姆
J·曾
L·乌纳
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University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
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Abstract

本公开涉及能够渗透到血脑屏障中以调节EGFR酪氨酸激酶的活性的化合物。本公开还涉及治疗胶质母细胞瘤和其他EGFR介导的癌症的方法。本公开还涉及治疗胶质母细胞瘤和已被确定在抑制剂存在时具有改变的葡萄糖代谢的其他EGFR介导的癌症的方法。本公开还提供向受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂的方法。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法
相关申请
本申请要求2017年11月22日提交的美国临时专利申请号62/589,972和2017年9月26日提交的美国临时专利申请号62/563,373的权益。这些申请中每一个的内容特此以引用的方式整体并入。
政府资助声明
本发明是根据美国国立卫生研究院授予的授权号CA151819、CA211015和CA213133在政府资助下完成的。政府对本发明具有某些权利。
背景技术
胶质母细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤；GBM)占成人原发性恶性脑肿瘤的大部分。表皮生长因子受体(EGFR)基因的扩增和突变是GBM中遇到的特征性遗传异常(Sugawa,等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87:8602-8606；Ekstrand,等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.89:4309-4313)。靶向EGFR或其突变体组成型活性形式ΔEGFR的一系列潜在疗法(包括酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、单克隆抗体、疫苗和基于RNA的剂)目前正在开发中或处于用于治疗GBM的临床试验中。然而，迄今为止，它们在临床上的功效至今一直受到前期和获得性耐药性的限制(Taylor,等人(2012)Curr.Cancer Drug Targets.12:197-209)。一个主要的限制是当前疗法诸如厄洛替尼、拉帕替尼、吉非替尼和阿法替尼具有不良的脑渗透性(Razier,等人(2010)Neuro-Oncology 12:95-103；Reardon,等人(2015)Neuro-Oncology 17:430-439；Thiessen,等人(2010)Cancer Chemother.Pharmacol.65:353-361)。
分子靶向疗法已彻底改变了癌症治疗并为现代精密医学奠定了基础。然而，尽管明确定义了可行的遗传改变，但靶向药物在胶质母细胞瘤(GBM)患者中仍然无效。这在很大程度上是由于大多数靶向剂的CNS渗透不足以达到杀死肿瘤所必需的水平；可能会诱发强大的自适应机制来驱动治疗抗性。尽管抑制原发性病变和补偿性信号传导途径的药物组合很有吸引力，但这些组合治疗策略因毒性增强而导致每种药物的亚阈值给药受到阻碍。
另一种治疗方法靶向致癌驱动因子，以改变肿瘤存活的重要功能特性，使细胞易受正交第二攻击6。当癌基因调节的功能网络与肿瘤细胞死亡途径相交时，这种“合成致死”策略可能特别有吸引力。在某个实例中，致癌信号传导驱动葡萄糖代谢以抑制内在细胞凋亡并促进存活。用靶向疗法抑制致癌驱动因子可以触发内在细胞凋亡机制，这是葡萄糖消耗减少的直接结果。这些致瘤途径的相互交织的性质可能为合理的组合治疗提供治疗机会，但是，这仍有待研究。
鉴于前述内容，临床上仍然需要用于治疗胶质母细胞瘤和其他癌症的脑渗透化学疗法。
发明内容
本公开提供式I-a或I-b的化合物：
Figure GDA0002684671720000021
或其药学上可接受的盐，其中：
Z是芳基或杂芳基，并且任选地被一个或多个R6取代；
R1是氢、烷基、卤基、CN、NO2、OR7、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R2是氢、烷基、卤基、CN、NO2、OR8、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或者R1和R2形成碳环或杂环；
R3是氢、烷基或酰基；
R4是烷氧基；
R5是烷基；
R6在每种情况下独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、烯基、炔基、芳烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；并且
R7和R8各自独立地选自氢、烷基诸如烷氧基烷基、芳烷基或芳酰基。
在某些方面，本公开提供抑制EGFR或ΔEGFR的方法，其包括向受试者施用有效量的式I-a或I-b的化合物。
在某些方面，本公开提供治疗癌症的方法，其包括向需要癌症治疗的受试者施用有效量的式I-a或I-b的化合物。在一些实施方案中，所述癌症是多形性胶质母细胞瘤。
在某些方面，本公开提供治疗癌症的方法，其包括向受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。在一些实施方案中，所述癌症是多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂是式I-a或I-b的化合物。
通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应理解的是，尽管指示本发明的优选实施方案，但是详细描述和特定实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
预期本文所述的任何方法或组合物可以针对本文所述的任何其他方法或组合物实施并且可以组合不同的实施方案。
附图说明
图1描绘了10mg/kg的JGK005和25mg/kg的厄洛替尼的口服药代动力学。与厄洛替尼相比，JGK005具有良好的CNS渗透性。
图2描绘了厄洛替尼(左列)和JGK005(右列)分别针对EGFR突变体胶质母细胞瘤HK301和GBM39的活性。在这两种情况下，JGK005的活性均低于厄洛替尼。
图3描绘了厄洛替尼和JGK010的无细胞EGFR激酶活性。两种化合物均具有大约8nM的IC50。
图4描绘了厄洛替尼(左列)、JGK005(中列)和JGK010(右列)针对HK301和GBM39细胞的效力。
图5示出了10mg/kg的JGK005和10mg/kg的JGK010的口服药代动力学。
图6描绘了EGFR抑制剂在多种原发性胶质母细胞瘤细胞系中的比较。第1-4列：GBM39(EGFRvIII)，第5-8列：GS100(EGFRwt/EGFRvIII)，第9-12列：GS017(A289T)，第13-16列：GS024(EGFR多体性)。
图7A描绘了JGK010在EGFR改变的肺癌中的活性。图7B描绘了JGK010在EGFR扩增表皮样癌中的活性。
图8A描绘了JGK010在6mg/kg下的口服药代动力学。图8B描绘了JGK010在10mg/kg下的口服药代动力学。图8C描绘了JGK010在6mg/kg下的IV药代动力学。图8D描绘了JGK010在6mg/kg下的IP药代动力学。
图9描绘了厄洛替尼和本公开的示例性化合物针对EGFR扩增WT+vIII HK301的活性。
图10描绘了厄洛替尼和本公开的示例性化合物针对EGFR vIII扩增GBM39的活性。
图11描绘了厄洛替尼和本公开的示例性化合物针对HK301细胞的活性。
图12描绘了厄洛替尼和本公开的示例性化合物针对GBM 39细胞的活性。
图13A描绘了厄洛替尼和本公开的示例性化合物的磷光体-EGFR vIII抑制。图13B描绘了厄洛替尼和本公开的示例性化合物的磷光体-EGFR vIII抑制。
图14A描绘了JGK005的药代动力学。图14B描绘了JGK005的药代动力学。
图15A描绘了JGK038的药代动力学。图15B描绘了JGK038的药代动力学。
图16A描绘了JGK010的药代动力学。图16B描绘了JGK010的药代动力学。
图17A描绘了JGK037的药代动力学。图17B描绘了JGK037的药代动力学。
图18A描绘了厄洛替尼与JGK037之间的小鼠脑/血液药代动力学的比较。图18B描绘了厄洛替尼与JGK037之间的小鼠脑/血液药代动力学的比较。
图19描绘了厄洛替尼和本公开的示例性化合物的脑渗透性。
图20描绘了用媒介物或JGK037处理对RLU变化的影响。
图21描绘了EGFR驱动的葡萄糖代谢的抑制诱导最小细胞死亡，但是引发GBM细胞的细胞凋亡。图21A描绘了在19个患者来源的GBM胶质瘤球中，相对于媒介物，4小时的厄洛替尼处理之后18F-FDG摄取的变化百分比。“代谢反应者”(蓝色)是相对于媒介物显示18F-FDG摄取的显著降低的样品，而“无反应者”(红色)则没有显示显著降低。图21B描绘了相对于媒介物，在12小时的厄洛替尼处理的情况下葡萄糖消耗和乳酸产生的变化百分比。使用Nova Biomedical BioProfile分析仪进行测量。图21C描绘了用厄洛替尼处理72小时之后，代谢反应者(蓝色，n＝10)或无反应者(红色，n＝9)的膜联蛋白V染色。图21D描绘了在用厄洛替尼处理24小时的代谢反应者或无反应者中，相对于媒介物对照，通过暴露于每种BH3肽(BIM、BID或PUMA)后细胞色素c释放所确定的引发的变化百分比。图21E描绘了左侧：过表达GFP对照或GLUT1和GLUT3(GLUT1/3)的HK301细胞的全细胞裂解液的免疫印迹。右侧：厄洛替尼处理12小时之后，HK301-GFP或HK301-GLUT1/3的葡萄糖消耗或乳酸产生的变化。值是相对于媒介物对照的。图21F描绘了使用HK301-GFP或HK301-GLUT1/3细胞。所有实验的厄洛替尼浓度均为1μM。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图22描绘了细胞质p53将EGFR与内在细胞凋亡联系起来。图22A描绘了在用对照指导RNA(sgCtrl)或p53指导RNA(p53KO)表达CRISPR/CAS9蛋白的两个反应者(HK301和HK336)中指定蛋白的免疫印迹。图22B描绘了在用厄洛替尼处理24小时的sgCtrl细胞和p53KO细胞中，相对于媒介物对照，通过暴露于BIM肽后细胞色素c释放所确定的引发的变化百分比。图22C描绘了HK301sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt中的指定蛋白的免疫印迹。图22D描绘了p53蛋白的免疫荧光与DAPI染色相结合，以揭示HK301 sgCtrl、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt中的蛋白质定位(比例尺＝20μm)。首先将胶质瘤球分离为单细胞，并使用Cell-Tak(Corning)根据制造商的说明书将其粘附到96孔板。然后将粘附的细胞用冰冷的甲醇固定10分钟，然后用PBS洗涤3次。然后将细胞与在PBS中含10％FBS和3％BSA的封闭溶液一起孵育1小时，并且随后与p53(Santa Cruz，SC-126，1:50的稀释度)抗体在4℃下一起孵育过夜。第二天，将细胞与二抗(Alexa Fluor 647，稀释度1:2000)一起孵育1小时并进行DAPI染色10min，然后使用配备有Cascade II荧光照相机(Roper Scientific)的Nikon TIEclipse显微镜成像。利用461nM和647nM的发射对细胞进行成像，并且然后使用NIS-Elements AR分析软件进行处理。图22E描绘了在24小时的100nM阿霉素处理后，HK301sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt中指定mRNA水平的变化。将水平归一化到相应的DMSO处理的细胞。图22F描绘了与22B相似的数据，但是在HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt中。图22G描绘了与22E相似的数据，但是在HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53R175H、p53KO+p53R273H和p53KO+p53NES中。图22H描绘了与22B和22F相似的数据，但是在HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53R175H、p53KO+p53R273H和p53KO+p53NES中。所有实验的厄洛替尼浓度均为1μM。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图23描绘了Bcl-xL通过结合并螯合EGFRi-代谢反应者中的细胞质p53来防止GBM细胞死亡。图23A描绘了24小时的厄洛替尼处理后在两个代谢反应者(HK301和GBM39)中p53的免疫沉淀。用指定抗体探测免疫沉淀物。下面是相应的pre-immunoprecipitation裂解物(输入)。图23B描绘了与23A相似的数据，但是在两个无反应者(HK393和HK254)中。图23C描绘了与23A和23B相似的数据，但是在HK301-GFP和HK301-GLUT1/3中。右侧是指定输入的免疫印迹。图23D描绘了将HK301用厄洛替尼、WEHI-539或两者处理24小时，并且如前所述进行免疫沉淀和免疫印迹。图23E描绘了用厄洛替尼、WEHI-539或两者处理72小时后两个反应者(GBM39和HK301)和无反应者(HK393)的膜联蛋白V染色。图23F描绘了用厄洛替尼、wehi-539或两者处理72小时后HK301-GFP和HK301-GLUT1/3的膜联蛋白V染色。所有实验的厄洛替尼和WEHI-539浓度分别为1μM和5μM。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01。
图24描绘了EGFR和p53的组合靶向的协同致死性。图24A描绘了273个GBM样品中EGFR和参与p53调节的基因的改变的概述。EGFR中的遗传改变(扩增/突变)与p53中的遗传改变是互斥的。如图所示，EGFR改变位于表格的左侧，而p53中的大多数改变位于右侧。图24B描绘了表明EGFR与参与p53途径的基因中的改变之间的显著关联的表。图24C描绘了用不同浓度的厄洛替尼、nutlin以及表示为剂量滴定基质的组合处理的代谢反应者(左：HK301)和无反应者(右：GS017)的膜联蛋白V染色。图24D描绘了对10个代谢反应者和6个无反应者进行24C中描述的厄洛替尼和nutlin的剂量滴定，并且计算协同作用得分(参见材料和方法)。图24E描绘了用厄洛替尼、nutlin或两者处理72小时后HK301-GFP和HK301 GLUT1/3的膜联蛋白V染色。图24F描绘的与24E相同，但是在HK301-sgCtrl和HK301-p53KO中。图24G描绘了用厄洛替尼、nutlin或组合处理24小时的HK301。用免疫球蛋白G对照抗体或抗p53抗体进行免疫沉淀，并用指定抗体探测免疫沉淀物。以下是相应的免疫沉淀前裂解液(输入)。所有数据代表至少n＝3个独立实验，平均值±SEM。除非有所指示，否则所有实验的厄洛替尼和nutlin浓度分别为1μM和2.5μM。**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001
图25描绘了葡萄糖代谢的调节引发了EGFRi无反应者的p53介导的细胞死亡。图25A描绘了在HK393和HK254中，相对于媒介物，4小时的厄洛替尼、2DG或匹替利司(pictilisib)处理之后18F-FDG摄取的变化百分比。图25B描绘了在用厄洛替尼、2DG或匹替利司处理24小时后的HK393和HK254中，相对于媒介物对照，通过暴露于BIM肽后细胞色素c释放所确定的引发的变化百分比。图25C描绘了与25B相似的数据，但是在HK393 sgCtrl和p53KO中。图25D描绘了在24小时的2DG或匹替利司处理后，HK393和HK254中p53的免疫沉淀。用指定抗体探测免疫沉淀物。以下是相应的免疫沉淀前裂解液(输入)。图25E描绘了在HK393和HK254中与nutlin组合的各种药物(厄洛替尼、2DG和匹替利司)的协同作用得分。图25F描绘了在用2DG、匹替利司、2DG+nutlin或匹替利司+nutlin处理72小时后HK393 sgCtrl和HK393 p53KO的膜联蛋白V染色。除非有所指示，否则所有实验的厄洛替尼、2DG、匹替利司和nutlin的浓度分别为1μM、1mM、1μM和2.5μM。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图26描绘了EGFR驱动的葡萄糖摄取和p53的组合靶向抑制体内肿瘤生长。图26A描绘了15小时的厄洛替尼处理(75mg/kg)之前和之后的GBM39颅内异种移植物的18F-FDG PET/CT成像。图26B描绘了用媒介物(n＝5)、75mg/kg厄洛替尼(n＝7)、50mg/kg依达奴林(Idasanutlin)(n＝5)或每日组合(n＝12)处理的GBM39颅内异种移植物，并且在指定天数使用分泌的高斯荧光素酶评估肿瘤负荷(参见材料和方法)。图26C描绘了与26A相似的数据，但是在HK393颅内异种移植物中。图26D描绘了与26B相似的数据，但是在HK393颅内异种移植物中(对于所有组，n＝7)。图25E描绘了26B的存活百分比。图26F描绘了26C的存活百分比。图26G描绘了在指定处理25天并且然后停止药物后的代谢反应者HK336的存活百分比(对于所有组，n＝7)。图26H描绘了在指定处理25天并且然后停止药物后的无反应者GS025的存活百分比(对于所有组，n＝9)。26B和26D的比较使用来自上次测量的数据集，并使用双尾非配对t检验进行。数据表示平均值±s.e.m.值。**p<0.01。
图27描绘了EGFR抑制后GBM细胞系的表征。图27A描绘了在两个代谢反应者(HK301和GBM39)中，相对于媒介物，在厄洛替尼处理的指定时间处的18F-FDG摄取的变化百分比。图27B描绘了在用siRNA对EGFR进行基因敲低后，代谢反应者(HK301)和无反应者(HK217)的指定蛋白的免疫印迹。图27C描绘了在EGFR的基因敲低后，HK301和HK217中18F-FDG摄取的变化百分比。图27D描绘了在三个代谢反应者(HK301，GBM39，HK390)和三个无反应者(HK393，HK217，HK254)中，12小时的厄洛替尼处理后葡萄糖消耗的变化。使用Nova BiomedicalBioProfile分析仪进行测量。图27E描绘了在三个代谢反应者(HK301，GBM39，HK390)和三个无反应者(HK393，HK217，HK254)中，12小时的厄洛替尼处理后乳酸产生的变化。使用NovaBiomedical BioProfile分析仪进行测量。图27F描绘了12小时的厄洛替尼处理后，两个反应者(HK301和GBM39，蓝色)和两个无反应者(HK217和HK393，红色)的基础ECAR测量值。图27G描绘了12小时的厄洛替尼处理后，通过Nova Biomedical BioProfile分析仪测量的谷氨酰胺消耗的变化。所有实验的厄洛替尼浓度均为1μM。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图28描绘了EGFR抑制后下游信号传导的改变与代谢反应相关。图28A描绘了在4小时的厄洛替尼处理后，代谢反应者中指定蛋白的免疫印迹。图28B描绘了在4小时的厄洛替尼后，代谢无反应者中指定蛋白的免疫印迹。
图29描绘了患者来源的GBM细胞系的遗传表征。图29A描绘了一组GBM系的遗传背景。图29B描绘了HK390、HK336、HK254和HK393的荧光原位杂交(FISH)，其显示了EGFR的多体性。使用可商购的荧光标记的双色EGFR(红色)/CEP 7(绿色)探针(Abbott-Molecular)进行荧光原位杂交(FISH)。按照制造商建议的方案，对细胞系进行FISH杂交和分析。用DAPI对细胞进行复染，并且在配备有双色和三色滤光器的Zeiss(Axiophot)荧光显微镜下对荧光探针信号成像。
图30描绘了EGFR抑制在代谢反应者中改变细胞凋亡平衡。图30A描绘了在24小时的厄洛替尼处理后，代谢反应者(GBM39、HK301和HK336)和无反应者(HK217、HK393和HK254)中指定蛋白的免疫印迹。图30B描绘了代谢反应者(HK301)中的动态BH3概况分析的实例。左侧：在暴露于指定浓度的各种肽后测量细胞色素c释放百分比。右侧：计算媒介物处理的细胞与厄洛替尼处理的细胞之间细胞色素c释放的差异，以获得引发百分比。所有实验的厄洛替尼浓度均为1μM。
图31描绘了GLUT1/3过表达挽救了由EGFR抑制引起的葡萄糖代谢降低。图31A描绘了在HK301-GFP和HK301 GLUT1/3中在12小时的厄洛替尼处理的情况下葡萄糖消耗和乳酸产生的变化。使用Nova Biomedical BioProfile分析仪进行测量。图31B描绘了左侧：过表达GFP对照或GLUT1和GLUT3(GLUT1/3)的GBM39细胞的全细胞裂解液的免疫印迹。右侧：在12小时的厄洛替尼处理之后，GBM39-GFP或GBM39-GLUT1/3的葡萄糖消耗或乳酸产生的变化。值是相对于媒介物对照的。图31C描绘了与35A相似的数据，但是在GBM39-GFP和GBM39-GLUT1/3中。所有实验的厄洛替尼浓度均为1μM。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图32描绘了细胞质p53是EGFRi介导的细胞凋亡引发所需的。图32A描绘了4小时的厄洛替尼处理后，HK301 sgCtrl和p53 KO细胞中18F-FDG摄取的变化百分比(平均值±s.d.，n＝3)。图32B描绘了在24小时的1μM厄洛替尼处理或100nM阿霉素处理后，HK301(代谢反应者)中p53调节基因的相对mRNA水平。图32C描绘了用p53-荧光素酶报告基因系统感染的HK301细胞，并且在24小时的1μM厄洛替尼处理后测量p53活性(平均值±s.d.，n＝3)。结果代表两个独立实验。图32D描绘了HK336 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto、和p53KO+p53wt中指定蛋白的免疫印迹。图32E描绘了p53蛋白的免疫荧光与DAPI染色相结合，以揭示在HK336sgCtrl、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt中的蛋白质定位(比例尺＝20μm)。如前所述进行免疫荧光。图32F描绘了在24小时的100nM阿霉素处理后，HK336 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt中指定mRNA水平的变化(平均值±s.d.，n＝3)。将水平归一化到相应的DMSO处理的细胞。图32G描绘了用厄洛替尼处理24小时的HK336 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt细胞中，相对于媒介物对照，通过暴露于BIM肽后细胞色素c释放所确定的细胞凋亡引发的变化百分比。(平均值±s.d.，n＝2)。结果代表两个独立实验。图32H描绘了HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53R175H、p53KO+p53R273H和p53KO+p53NES中指定蛋白的免疫印迹。图32I描绘了在进行或未进行PFTμ预处理(10μM进行2小时)的情况下，24小时的厄洛替尼处理后，HK301中引发的变化百分比(平均值±s.d.，n＝2)。结果代表两个独立实验。
图33描绘了对EGFR驱动的葡萄糖代谢的抑制通过细胞质p53功能诱导Bcl-xL依赖性。图33A描绘了在用厄洛替尼处理的代谢反应者(HK301和HK336)或无反应者(HK229)中，相对于媒介物对照，通过暴露于BAD和HRK肽后细胞色素c释放所确定的引发的变化百分比。图33B描绘了左侧：24小时的厄洛替尼处理后，GBM39-GFP和GBM39-GLUT1/3中p53的免疫沉淀。用指定抗体探测免疫沉淀物。右侧：相应的免疫沉淀前裂解液(输入)。图33C描绘了用厄洛替尼、WEHI-539或组合处理72小时后，HK301(左)和HK336(右)sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt的膜联蛋白V染色。图33D描绘了与33C相似的数据，但是在GBM39-GFP和GBM39-GLUT1/3中。所有实验的厄洛替尼和WEHI-539浓度均为1μM。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图34描绘了对EGFR调节的葡萄糖代谢的抑制和p53激活促进GBM中的内在细胞凋亡。图34A描绘了厄洛替尼、nutlin或组合进行24小时后，两个代谢反应者(HK301和GBM39)中指定蛋白的免疫印迹。图34B描绘了EGFR的基因敲低和随后的72小时nutlin处理后的HK301和HK217中的膜联蛋白V染色。图34C描绘了在HK301-GFP和HK301-GLUT1/GLUT3中BAX低聚化的检测。进行24小时的指定处理后，收获细胞并在1mM BMH中孵育以促进蛋白质交联，并用指定抗体进行免疫印迹。BAX下方是细胞分级后胞质细胞色素c的免疫印迹。图34D描绘了顶图：HK301-GFP和HK301-HA-BclxL中指定蛋白的免疫印迹。底图：用厄洛替尼、nutlin或组合处理72小时后，HK301-GFP和HK301-HA-BclxL中的膜联蛋白V染色。图34E描绘了在+/-PFTμ预处理(10μM进行2小时)的情况下，厄洛替尼、nutlin或组合进行72小时后，HK301的膜联蛋白V染色。图34F描绘了用厄洛替尼、nutlin或组合处理72小时后，HK301sgCtrl、p53KO、p53KO+p53R175H、p53KO+p53R273H和p53KO+p53NES的膜联蛋白V染色。图34G描绘了与34F相似的数据，但是在HK301 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt中。所有实验的药物浓度如下：厄洛替尼(1μM)，nutlin(2.5μM)。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。图34H描绘了与34G相似的数据，但是在HK336 sgCtrl、p53KO、p53KO+p53cyto和p53KO+p53wt中。所有实验的药物浓度如下：厄洛替尼(1μM)，nutlin(2.5μM)。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。
图35描绘了在代谢反应者和无反应者中对葡萄糖代谢的抑制促进内在细胞凋亡。图35A描绘了在24小时的厄洛替尼或2DG处理后，在代谢反应者HK301中，相对于媒介物对照，通过暴露于BIM肽后细胞色素c释放所确定的引发的变化百分比。图35B描绘了左侧：24小时的2DG处理后，HK301中p53的免疫沉淀。用指定抗体探测免疫沉淀物。右侧：相应的免疫沉淀前裂解液(输入)。图35C描绘了暴露于寡霉素和鱼藤酮后，HK301细胞的OCR和ECAR测量值。图35D描绘了用nutlin、厄洛替尼、2DG、寡霉素、鱼藤酮作为单独剂或与nutlin组合处理72小时后，HK301中的膜联蛋白V染色。图35E描绘了在4小时的厄洛替尼或匹替利司处理后，两个无反应者(HK254和HK393)中指定蛋白的免疫印迹。图35F描绘了在24小时的匹替利司或2DG处理后，HK254中p53的免疫沉淀。用指定抗体探测免疫沉淀物。以下是相应的免疫沉淀前裂解液(输入)。所有实验的药物浓度如下：厄洛替尼(1μM)，nutlin(2.5μM)，2DG(对于HK301为3mM并且对于HK254为1mM)，寡霉素(1μM)，鱼藤酮(1μM)和匹替利司(1μM)。使用双尾非配对学生t检验进行比较。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。****p<0.0001。
图36描绘了EGFR抑制和p53激活的体内功效。图36A描绘了非荷瘤小鼠中，在指定时间点(n＝2只小鼠/时间点)处的依达奴林的脑和血浆浓度。图36B描绘了36小时的依达奴林(50mg/kg)处理后，颅内荷瘤异种移植物中p53表达的免疫组织化学(IHC)分析。图36C描绘了15小时的厄洛替尼处理后，GBM39(n＝3)和HK393(n＝5)颅内异种移植物中18F-FDG摄取的变化百分比。图36D描绘了每天用厄洛替尼(75mg/kg)或厄洛替尼(75mg/kg)和依达奴林(50mg/kg)组合处理后小鼠体重的变化。所有处理均口服进行。数据表示三个独立实验的平均值±s.e.m.值。*p<0.05。
图37A描绘了用2DG(己糖激酶抑制剂)或细胞松弛素B(葡萄糖转运蛋白抑制剂)直接抑制糖酵解出乎意料地与p53激活(用nutlin进行)协同作用。图37B描绘了低葡萄糖(0.25mM)与用纳维克拉(navitoclax，ABT-263)进行的BCL-xL抑制导致协同细胞杀伤。图37C描绘了低葡萄糖(0.25mM)与用nutlin进行的BCL-xL抑制导致协同细胞杀伤。
图38描绘了对EGFRi抑制剂厄洛替尼的代谢反应者与代谢无反应者之间的比较。厄洛替尼和nutlin的组合在代谢反应者中导致意想不到的协同合成致死性，但在无反应者中则不会。
具体实施方式
胶质瘤是最常见的脑肿瘤形式，其中多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最恶性的形式，导致所有癌症相关死亡中的3-4％(Louis等人(2007)Acta.Neuropathol.114:97-109.)。世界卫生组织将GBM定义为IV级癌症，其特征是恶性的，有丝分裂活性的且易坏死。GBM的预后非常差，其5年存活率为4–5％，GBM的中位存活率为12.6个月(McLendon等人(2003)Cancer.98:1745-1748.)。这可以归因于独特的治疗限制，诸如高平均发病年龄，肿瘤位置以及对肿瘤病理生理学的当前了解不足(Louis等人(2007)Acta.Neuropathol.114:97-109)。GBM当前的标准护理标准包括肿瘤切除，同时进行放疗和化疗，近年来，几乎没有显著的提高存活率的改善措施(Stewart,等人(2002)Lancet.359:1011-1018.)。
GBM化疗的标准是替莫唑胺(TMZ)，它是一种使DNA中的嘌呤(A或G)甲基化并诱导细胞凋亡的脑渗透性烷基化剂(Stupp,等人(2005)N.Engl.J.Med.352:987-996)。然而，使用TMZ的缺点在于，健康细胞中的DNA损伤会引起明显的风险，并且GBM细胞可能迅速发展出对药物的抗性(Carlsson,等人(2014)EMBO.Mol.Med.6:1359-1370)。因此，迫切需要另外的化疗选择。
EGFR与ERBB2、ERBB3和ERBB4一起是受体酪氨酸激酶的HER超家族的成员。GBM进展的常见驱动因素是EGFR扩增，这在几乎40％的所有GBM病例中被发现(Hynes等人(2005)Nat.Rev.Cancer.5:341-354；Hatanpaa等人(2010)Neoplasia.12:675-684)。另外，EGFR扩增与EGFR蛋白变体的存在相关联：在68％的EGFR突变体中；在氨基酸6与273之间的N末端配体结合区中存在缺失。在EGFR的配体结合结构域中的这些缺失可能导致EGFR的非配体依赖性激活(Yamazaki等人(1990)Jpn.J.Cancer Res.81:773-779.)。
小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是EGFR靶向疗法中临床上最先进的，并且可逆和不可逆抑制剂均处于临床试验中。可逆抑制剂和不可逆抑制剂的实例包括厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、PKI166、卡奈替尼和培利替尼(Mischel等人(2003)Brain Pathol.13:52-61)。从机理上讲，这些TKI与ATP竞争结合EGFR的酪氨酸激酶结构域，然而，这些EGFR特异性酪氨酸激酶抑制剂对胶质瘤相对无效，在厄洛替尼的情况下，应答率仅高达25％(Mischel等人(2003)Brain Pathol.13:52-61；Gan等人(2009)J.Clin.Neurosci.16:748-54)。尽管TKI在GBM患者中具有良好的耐受性并显示出一定的抗肿瘤活性，但对受体抑制的抗性的反复出现的问题限制了它们的功效(Learn等人(2004)Clin.Cancer.Res.10:3216-3224；Rich等人(2004)Nat.Rev.Drug Discov.3:430-446)。另外，最近的研究表明，吉非替尼和厄洛替尼在治疗后的脑血浆浓度仅为起始剂量的6–11％，这表明这些化合物可能无法穿过血脑屏障，如表1所示(Karpel-Massler等人(2009)Mol.Cancer Res.7:1000-1012)。因此，向靶的递送不足可能是导致临床结果令人失望的另一个原因。
表1：当前护理药物标准的脑渗透率
Figure GDA0002684671720000141
根据此证据，临床上仍然需要有效的酪氨酸激酶抑制剂，其能够穿越血脑屏障并治疗抑制EGFR及其同工型。
此外，发明人显示致癌信号传导和代谢途径之间的串扰为GBM中的新型组合疗法创造了机会。更具体地，发明人发现对EGFR驱动的葡萄糖摄取的急性抑制诱导最小的细胞死亡，但是降低了患者来源的GBM细胞的细胞凋亡阈值并“引发”细胞的细胞凋亡。出乎意料的是，发明人的机理研究揭示，Bcl-xL阻断细胞质p53触发内在细胞凋亡，从而导致肿瘤存活。p53的药理学稳定(例如像，使用脑渗透性小分子依达奴林)能够使p53参与内在细胞凋亡机制，从而促进与靶向GBM异种移植物中EGFR驱动的葡萄糖摄取的协同致死性。值得注意的是，发明人还发现，使用例如非侵入性正电子发射断层摄影术的18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)摄取的快速变化可以预测对体内组合的敏感性。
发明人尤其鉴定了癌基因信号传导、葡萄糖代谢和细胞质p53之间的关键联系，可以将其用于GBM和其他恶性肿瘤的组合疗法。
本公开的化合物
本公开提供式I-a或I-b的化合物：
Figure GDA0002684671720000151
或其药学上可接受的盐，其中：
Z是芳基或杂芳基，并且任选地被一个或多个R6取代；
R1是氢、烷基、卤基、CN、NO2、OR7、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R2是氢、烷基、卤基、CN、NO2、OR8、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或者R1和R2形成碳环或杂环；
R3是氢、烷基或酰基；
R4是烷氧基；
R5是烷基；
R6在每种情况下独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、烯基、炔基、芳烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；并且
R7和R8各自独立地选自氢、烷基诸如烷氧基烷基、芳烷基或芳酰基。
在式I-a或式I-b的某些实施方案中，如果R7和R8是烷氧基烷基并且R3是氢，则Z不是3-乙炔基苯基。
在式I-a或式I-b的某些实施方案中，Z任选地被选自以下的R6取代：烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、烯基、芳烷氧基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
在式I-a或式I-b的某些实施方案中，R7和R8各自独立地选自氢、芳烷基或芳酰基；R6在每种情况下独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、烯基、芳烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或者R1和R2一起形成碳环或杂环。
在式I-a或式I-b的某些实施方案中，如果R7和R8组合形成杂环并且R3是氢，则Z不是2-氟,4-溴苯基、3-溴苯基、3-甲基苯基、3-三氟甲基苯基或3-氯,4-氟苯基。
在式I-a或式I-b的某些实施方案中，所述化合物是式(II-a)或式(II-b)的化合物：
Figure GDA0002684671720000171
在式I-a、式I-b、式II-a或式II-b的某些实施方案中，R1是氢。在其他实施方案中，R1是OR7。
在式I-a、式I-b、式II-a或式II-b的某些实施方案中，R7是氢。在某些实施方案中，R7是烷基。在某些实施方案中，R7是烷氧基烷基。在某些实施方案中，R7是芳酰基。
在式I-a、式I-b、式II-a或式II-b的某些实施方案中，R2是杂芳基，诸如呋喃基。在某些实施方案中，R2的杂芳基被烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、
Figure GDA0002684671720000172
取代。在其他实施方案中，R2是OR8。
在式I-a、式I-b、式II-a或式II-b的某些实施方案中，R8是氢。在某些实施方案中，R8是烷氧基烷基。在某些实施方案中，R8是被
Figure GDA0002684671720000173
Figure GDA0002684671720000174
取代的烷基。在某些实施方案中，R8是酰基。在某些实施方案中，R8是芳酰基。
在式I-a、式I-b、式II-a或式II-b的某些优选的实施方案中，R1和R2组合形成碳环或杂环，诸如5元、6元或7元碳环或杂环。在某些实施方案中，碳环或杂环被羟基、烷基(例如，甲基)或烯基(例如，乙烯基)取代。在某些实施方案中，所述化合物是
Figure GDA0002684671720000181
在某些实施方案中，碳环或杂环被烷基(例如，甲基)取代，并且烷基部分相对于彼此为反式。在某些实施方案中，所述化合物是
Figure GDA0002684671720000182
在某些实施方案中，碳环或杂环被烷基(例如，甲基)取代，并且烷基部分相对于彼此为顺式。在某些实施方案中，所述化合物是
Figure GDA0002684671720000183
在式I-a、式I-b、式II-a或式II-b的甚至更优选的实施方案中，所述化合物是式(III-a)、(III-b)、(III-c)、(III-d)、(III-e)或(III-f)的化合物：
Figure GDA0002684671720000191
在式I-a、式I-b、式II-a、式II-b、式III-a、式III-b、式III-c、式III-d、式III-e或式III-f的某些实施方案中，R3是氢。在某些实施方案中，R3是酰基。在某些实施方案中，R3是烷基酰基。在某些实施方案中，R3是烷氧基酰基。在某些实施方案中，R3是酰氧基烷基。在某些实施方案中，R3是
Figure GDA0002684671720000192
并且R9是烷基。
在式I-a、式I-b、式II-a、式II-b、式III-a、式III-b、式III-c、式III-d、式III-e或式III-f的某些实施方案中，Z是任选地被一个或多个R6取代的芳基或杂芳基；并且R6在每种情况下独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、烯基、炔基、芳烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。在某些优选的实施方案中，Z是被1、2、3、4或5个R6取代的苯基。在某些实施方案中，每个R6独立地选自卤基、烷基、炔基或芳基烷氧基。在甚至更优选的实施方案中，Z是2-氟-3-氯苯基、2-氟苯基、2,3-二氟苯基、2,4-二氟苯基、2,5-二氟苯基、2,6-二氟苯基、2,4,6-三氟苯基、五氟苯基、2-氟-3-溴苯基、2-氟-3-乙炔基苯基和2-氟-3-(三氟甲基)苯基。在其他甚至更优选的实施方案中，Z是3-乙炔基苯基。在另其他甚至更优选的实施方案中，Z是3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯。在另其他甚至更优选的实施方案中，Z是3-氯-2-(三氟甲基)苯基。在另其他甚至更优选的实施方案中，Z是3-溴苯基。在另其他甚至更优选的实施方案中，Z是2-氟,5-溴苯基。在另其他甚至更优选的实施方案中，Z是2,6-二氟,5-溴苯基。在某些实施方案中，Z被选自
Figure GDA0002684671720000201
的一个R6取代；并且R9和R10独立地选自烷基。
在式I-a、式I-b、式II-a、式II-b、式III-a、式III-b、式III-c、式III-d、式III-e或式III-f的某些实施方案中，所述化合物是式(IV-a)的化合物：
Figure GDA0002684671720000202
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
在式I-a、式I-b、式II-a、式II-b、式III-a、式III-b、式III-c、式III-d、式III-e或式III-f的某些实施方案中，所述化合物是式(IV-b)的化合物：
Figure GDA0002684671720000203
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
在式I-a、式I-b、式II-a、式II-b、式III-a、式III-b、式III-c、式III-d、式III-e或式III-f的某些实施方案中，所述化合物是式(IV-c)的化合物：
Figure GDA0002684671720000211
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
在式I-a、式I-b、式II-a、式II-b、式III-a、式III-b、式III-c、式III-d、式III-e、式III-f、式IV-a、式IV-b或式IV-c的某些实施方案中，所述化合物是式(V-a)的化合物：
Figure GDA0002684671720000212
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
在式I-a、式I-b、式II-a、式II-b、式III-a、式III-b、式III-c、式III-d、式III-e、式III-f、式IV-a、式IV-b或式IV-c的某些实施方案中，所述化合物是式(V-b)的化合物：
Figure GDA0002684671720000221
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
在式I-a、式I-b、式II-a、式II-b、式III-a、式III-b、式III-c、式III-d、式III-e、式III-f、式IV-a、式IV-b或式IV-c的某些实施方案中，所述化合物是式(V-b)的化合物：
Figure GDA0002684671720000222
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
在某些实施方案中，式I-a或I-b的化合物选自表2中的化合物。
表2：本发明的示例性化合物
Figure GDA0002684671720000223
Figure GDA0002684671720000231
Figure GDA0002684671720000241
Figure GDA0002684671720000251
Figure GDA0002684671720000261
Figure GDA0002684671720000271
Figure GDA0002684671720000281
Figure GDA0002684671720000291
Figure GDA0002684671720000301
治疗方法
在某些方面，本公开提供抑制EGFR或ΔEGFR的方法，其包括向受试者施用有效量的式I-a或I-b的化合物。
在某些方面，本公开提供治疗癌症的方法，其包括向需要癌症治疗的受试者施用有效量的式I-a或I-b的化合物。在一些实施方案中，所述癌症是多形性胶质母细胞瘤。
在某些方面，本公开提供治疗受试者的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向受试者施用一定量的葡萄糖摄取抑制剂和细胞质p53稳定剂。
在某些方面，本公开提供减少受试者的胶质母细胞瘤增殖的方法，所述方法包括向受试者施用一定量的EGFR抑制剂和MDM2抑制剂。
在某些方面，本公开提供在受试者中治疗癌症或减少癌细胞增殖的方法，其包括向受试者施用一定量的葡萄糖代谢抑制剂和p53稳定剂。
在某些方面，本公开提供治疗受试者的恶性胶质瘤或胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向受试者施用一定量的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。
在某些方面，本公开提供在受试者中治疗癌症或减少癌细胞增殖的方法，其包括向受试者施用一定量的葡萄糖代谢抑制剂和p53稳定剂。
在某些方面，本公开提供治疗癌症的方法，其包括向需要癌症治疗的受试者施用有效量的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。在一些实施方案中，所述癌症是多形性胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，已经确定受试者的肿瘤对葡萄糖代谢抑制剂敏感。
在一些实施方案中，本公开提供通过向先前已经确定有资格进行这种治疗的受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂来抑制GBM生长或增殖的方法。在一些实施方案中，葡萄糖代谢的抑制和细胞质p53的稳定可以是同时的或顺序的。
在一些实施方案中，本公开提供在受试者中治疗GBM的方法，减少或抑制GBM的方法。在一些实施方案中，本公开提供抑制GBM细胞生长的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂治疗GBM患者的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于改善GMB患者的预后的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于降低GBM风险的方法。在一些实施方案中，本公开提供对GBM患者进行分类的方法。在一些实施方案中，本公开提供评估患者对治疗的反应的方法。在一些实施方案中，本公开提供引发GBM肿瘤细胞凋亡的方法。在一些实施方案中，本公开提供使GBM患者适应治疗的方法。在一些实施方案中，本公开提供降低无效疗法的风险的方法。在一些实施方案中，本公开提供改善GBM的症状的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于减少肿瘤存活的机会的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于增加肿瘤细胞对疗法的易损性的方法。在本公开中讨论的步骤和实施方案被认为是这些方法中的任一个的一部分。此外，还考虑了用于这些方法中的任一个的组合物。
在某些方面，本公开提供治疗受试者的恶性胶质瘤或GBM的方法，所述方法包括在已经确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感之后，向所述受试者施用一定量的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。
在一些实施方案中，已经通过以下方法确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感，所述方法包括：从受试者获得肿瘤活检物；测量在任何葡萄糖代谢抑制剂存在时肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平；将所获得的肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平与对照的葡萄糖摄取水平进行比较；以及如果与对照相比肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平降低，则确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感。在一些实施方案中，通过放射标记的葡萄糖2-脱氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(18F-FDG)的摄取来测量葡萄糖摄取。在另外的实施方案中，通过正电子发射断层摄影术(PET)检测18F-FDG。在一些实施方案中，所述活检物取自GBM肿瘤。
在一些实施方案中，已经通过以下方法确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感：所述方法包括：从所述受试者获得第一血液样品；让所述受试者进行生酮饮食一段时间；在进行生酮饮食之后从所述受试者获得第二血液样品；测量第一血液样品和第二血液样品中的葡萄糖水平；将第二血液样品中的葡萄糖水平与第一血液样品中的葡萄糖水平进行比较；以及如果第二血液样品中的葡萄糖水平与第一血液样品中的葡萄糖水平相比降低，则确定受试者是易感的。在一些实施方案中，在第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平的降低为约或大于0.15mM，约或大于0.20mM，在0.15mM-2.0mM的范围内或在0.25mM–1.0mM的范围内。在一些实施方案中，葡萄糖水平的降低为约、至少约或至多约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mM(或其中可推导的任何范围)。
在某些方面，本公开提供对被诊断患有胶质瘤或GBM的受试者进行分类的方法，所述方法包括从所述受试者获得生物样品；用一种或多种葡萄糖代谢抑制剂处理所述生物样品；以及确定葡萄糖代谢是否被葡萄糖代谢抑制剂降低。确定葡萄糖代谢的降低包括在施用葡萄糖代谢抑制剂之前和之后，确定葡萄糖水平的变化和/或糖酵解速率的变化和/或葡萄糖摄取的变化和/或细胞外酸化率(ECAR)的变化，和/或测量己糖激酶或果糖磷酸激酶或丙酮酸激酶的活性。在一些实施方案中，确定糖酵解的变化包括直接测量丙酮酸和/或乳酸。在某些实施方案中，生物样品包括来自GBM肿瘤的癌细胞。在其他实施方案中，所述方法还包括将葡萄糖降低水平与对照进行比较。在一些实施方案中，所述方法还包括如果生物样品中葡萄糖代谢被葡萄糖代谢抑制剂降低，则将所述受试者分类为代谢反应者。在另外的实施方案中，所述方法还包括用包含葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂的组合物治疗被分类为代谢反应者的受试者。
在某些方面，本公开提供评估癌细胞或肿瘤对用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括测量或检测癌细胞的葡萄糖摄取水平以及将所述葡萄糖摄取水平与对照进行比较。葡萄糖可以被放射标记，例如像2-脱氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(18F-FDG)。在一些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术(PET)进行放射标记的葡萄糖摄取的测量和检测。
在某些方面，本公开提供治疗受试者的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括在确定受试者对EGFR抑制剂降低葡萄糖代谢易感之后，向受试者施用治疗有效量的葡萄糖摄取抑制剂和细胞质p53稳定剂。
在某些方面，本公开提供减少受试者的胶质母细胞瘤增殖的方法，所述方法包括在确定受试者对EGFR抑制剂易感之后，向受试者施用有效量的EGFR抑制剂和MDM2抑制剂。
在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂以同一组合物施用。在其他实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53在单独组合物中施用。例如，在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂在彼此的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时内或在30分钟内或在其间的任何小时或分钟的部分内施用。在其他实施方案中，将葡萄糖代谢抑制剂和p53稳定剂同时施用于受试者。
在本发明方法的某些实施方案中，考虑使用对照，诸如将来自受试者的样品中的葡萄糖水平(或葡萄糖变化或葡萄糖降低)与对照样品进行比较。对照可以包括非癌样品、具有不同表型的癌样品、具有野生型EGFR表达水平的癌症样品或任何其他取自患者的非癌症细胞或不取自患者的对照样品。在某些实施方案中，对照来自样品经受葡萄糖代谢抑制剂之前取自患者的样品。
在某些方面，本公开提供用于在已经被确定患有对葡萄糖代谢抑制剂有反应的癌症的受试者中治疗癌症或减少癌细胞增殖的方法，其包括向癌症患者施用有效量的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。在一些实施方案中，所述癌症是中枢神经系统(CNS)癌症，例如CNS转移。在一些实施方案中，所述癌症是非CNS癌症。在一些实施方案中，所述癌症是多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、低级星形细胞瘤、混合型少突星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、肺癌或其他癌症。
在本文方法的实施方案中，所述受试者已经被诊断患有多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用先前治疗方法治疗了胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，已经确定所述受试者对先前治疗方法有抗性。
在本发明方法的某些实施方案中，所述方法还包括施用另外的疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是放疗、化疗、靶向疗法、免疫疗法、手术。在一些实施方案中，另外的疗法包括本文所述的一种或多种疗法。
恶性胶质瘤和胶质母细胞瘤
胶质瘤的类型和阶段
原发性恶性脑肿瘤是始于脑或脊柱的肿瘤，统称为胶质瘤。胶质瘤不是特定类型的癌症，而是用于描述起源于胶质细胞的肿瘤的术语。原发性恶性脑肿瘤的实例包括星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、GBM、神经节胶质瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤。根据WHO对脑肿瘤的分类，星形细胞瘤被分为四个等级，由潜在病理学确定。用于分类胶质瘤的特征包括有丝分裂，细胞或核异型性以及具有伪栅栏样特征的血管增殖和坏死。恶性(或高级)胶质瘤包括间变性胶质瘤(WHO III级)以及多形性胶质母细胞瘤(GBM；WHO IV级)。这些是最具侵袭性的脑肿瘤，其预后最差。
GBM是最常见的、复杂的、难治的且最致命类型的脑癌，占所有脑癌的45％，每年诊断出近11,000名男性、女性和儿童。GBM(也称为4级星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤)是恶性(癌性)原发性脑肿瘤的最常见类型。它们由于许多原因而极具侵袭性。首先，胶质母细胞瘤细胞快速增殖，因为它们分泌刺激大量血液供应的物质。它们还具有通过将肿瘤的微观卷须与正常细胞一起发送而长距离侵入和渗透到正常大脑中的能力。已知两种类型的胶质母细胞瘤。原发性GBM是最常见的形式；它们生长迅速，通常会引起早期症状。继发性胶质母细胞瘤较少见，占所有GBM的约10％。它们从低等级弥漫性星形细胞瘤或间变性星形细胞瘤发展而来，并且在年轻患者中更为常见。继发性GBM优选位于额叶中并且预后较好。
GBM通常通过包括手术切除肿瘤、放射和化疗的组合的多模式治疗计划来治疗。首先，在手术过程中切除尽可能多的肿瘤。肿瘤在脑中的位置通常决定了可以安全地切除多少肿瘤。手术后，放射和化疗减慢剩余肿瘤细胞的生长。口服化疗药物替莫唑胺最常使用六周，然后每月一次。治疗期间还使用了另一种药物贝伐单抗(称为
Figure GDA0002684671720000351
)。这种药物会攻击肿瘤补充血液供应的能力，通常会减慢甚至停止肿瘤生长。
还使用了新的研究治疗方法，并且这些方法可能涉及向标准疗法中增加治疗方法，或者用效果可能更好的不同治疗方法代替标准疗法的一部分。这些治疗方法中的一些包括免疫疗法诸如疫苗免疫疗法，或对存在肿瘤的脑区域的低剂量电脉冲，以及涉及球形核酸(SNA)诸如NU-0129的纳米疗法。在一些实施方案中，本公开的方法与一种或多种前述疗法组合使用。
还考虑本文讨论的方法和组合物的实施方案适用于其他类型的癌症，包括但不限于肺癌、非CNS癌症、CNS癌症和CNS转移，诸如脑转移、软脑膜转移、脉络膜转移、脊髓转移和其他类型的癌症。
葡萄糖代谢抑制剂
在某些方面，本公开的方法和组合物包含一种或多种葡萄糖代谢抑制剂。所述抑制剂可以是葡萄糖摄取抑制剂、葡萄糖转运蛋白抑制剂、糖酵解抑制剂、己糖激酶抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、细胞内葡萄糖剥夺的任何诱导剂或其任何组合。
EGFR抑制剂
在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂是EGFR抑制剂。EGFR信号传导途径在若干种癌症(包括胶质瘤和GBM)中被激活。激活可能通过多种机制发生，包括激活EGFR蛋白中的突变或EGFR过表达，通常是由于EGFR基因拷贝数增加所致。EGFR基因扩增和过表达是胶质母细胞瘤(GBM)的一个特别显著特征，在大约40％的肿瘤中观察到。EGFR抑制剂可以是小分子酪氨酸激酶抑制剂或抗体。例如，单克隆抗体。
小分子抑制剂
在一些实施方案中，EGFR抑制剂是厄洛替尼，一种小分子靶向疗法，其以可逆方式与EGFR受体的ATP结合位点结合，从而阻断受体在EGFR同型二聚体上形成磷酸酪氨酸残基的能力并阻止信号级联的转导以激活其他细胞生化过程。本公开还考虑，其他EGFR抑制剂也可以与本文所述的方法和组合物一起使用，例如像吉非替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、凡德他尼、耐昔妥珠单抗或奧希替尼。在一些实施方案中，本公开的组合物不包含一种或多种EGFR抑制剂。在某些优选的实施方案中，EGFR抑制剂是式I-a或I-b的化合物。
抗体
在某些实施方案中，所述方法和组合物包含作为抗体的EGFR抑制剂。临床上使用的EGFR抗体包括但不限于与EGFR的细胞外结构域结合的西妥昔单抗(ERBITUX.TM)和帕尼单抗(VECTIBIX.TM)。细胞外受体结构域包含配体结合位点，并且这些抗体被认为阻断配体结合；从而破坏EGFR信号传导。许多研究关注于对EGFR细胞外结构域具有特异性的抗体(或其他结合分子)的产生(参见，例如，美国专利号5,459,061、5,558,864、5,891,996、6,217,866、6,235,883、6,699,473和7,060,808；欧洲专利号EP0359282和EP0667165，它们均特此以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施方案中，抗体是抗体片段。在一些实施方案中，抗体是Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2或scFv。在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，包含来自移植到异源非人、人或人源化序列(例如，构架和/或恒定结构域序列)的非人供体的抗原结合序列的抗体。在一个实施方案中，非人供体是小鼠。在一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变(例如，噬菌体展示筛选等)获得的。在一个实施方案中，嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个实施方案中，鼠轻链V区与人κ轻链或人IgG1 C区融合。
抗体片段的实例包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的“Fv”片段；(iv)由VH结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合以形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)和(ix)双抗体，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(美国专利公布2005/0214860)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定。也可以制备包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Hu等人,1996)。
单克隆抗体是单一种类的抗体，其中每个抗体分子都识别相同的表位，因为所有抗体产生细胞均来源于单个B淋巴细胞细胞系。杂交瘤技术涉及将来自先前用抗原免疫的小鼠的单个B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)融合。此技术提供了使单个抗体产生细胞无限代繁殖的方法，从而可以产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同的抗体(单克隆抗体)。但是，在治疗应用中，杂交瘤技术的目标是减少人的免疫反应，所述免疫反应可能是由于施用非人(例如，小鼠)杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体而引起的。
已经开发出用类似的人起源结构域代替单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，使外源抗体的可变区保持完整的方法。替代地，在针对人免疫球蛋白基因转基因的小鼠中产生“完全人”单克隆抗体。还开发了通过重组构建具有啮齿动物和人氨基酸序列的抗体可变结构域将单克隆抗体的可变结构域转化为更多人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，仅高变CDR来源于小鼠单克隆抗体，而构架区则来源于人氨基酸序列。据认为，用在人抗体的对应位置上发现的氨基酸序列代替啮齿动物特有的抗体中的氨基酸序列将降低治疗应用期间发生不良免疫反应的可能性。产生抗体的杂交瘤或其他细胞也可以经受遗传突变或其他改变，其可以改变或可以不改变杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
可以使用单克隆和其他抗体和重组DNA技术以产生保留原始抗体的抗原或表位特异性的其他抗体或嵌合分子，即具有结合结构域的分子，来创建工程化抗体。此类技术可包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同抗体的构架区、恒定区或恒定区加构架区的遗传物质中。参见，例如，美国专利号5,091,513和6,881,557，其以引用的方式并入本文。
通过本文所述的已知方法，可以创建对本文所述的蛋白质、其一个或多个相应表位或前述任一种的的缀合物具有特异性的多克隆或单克隆抗体、结合片段和结合结构域和CDR(包括前述任一种的工程化形式)，无论此类抗原或表位是从天然来源分离的，还是天然化合物的合成衍生物或变体。
抗体可以从任何动物来源产生，包括鸟类和哺乳动物。特别地，抗体可以是绵羊、鼠类(例如，小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。另外，更新的技术允许从人组合抗体文库开发和筛选人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在没有动物免疫的情况下产生特异性抗体，如美国专利号6,946,546中所述，其以引用的方式并入本文。这些技术进一步描述于以下中：Marks(1992)；Stemmer(1994)；Gram等人(1992)；Barbas等人(1994)；和Schier等人(1996)。
用于在各种动物物种中产生多克隆抗体以及用于产生各种类型(包括人源化的，嵌合的和完全人的)的单克隆抗体的方法是本领域熟知的。用于产生这些抗体的方法也是熟知的。例如，以下美国专利和专利公布提供此类方法的可行描述，并以引用的方式并入本文：美国专利公布号2004/0126828和2002/0172677；以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024。本文及其中引用的所有专利、专利公布和其他公布均特此以引用的方式并入本申请。
完全期望针对EGFR的抗体将具有中和或抵消蛋白质作用的能力，而与动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源无关。对于产生治疗性抗体，某些动物物种可能不太理想，因为它们更可能由于通过抗体的“Fc”部分激活补体系统而引起过敏反应。然而，整个抗体可以被酶促消化成“Fc”(补体结合)片段，以及具有结合结构域或CDR的结合片段。去除Fc部分降低了抗原结合片段引起不期望的免疫应答的可能性，因此，不含Fc的抗体对于预防性或治疗性治疗可能是特别有用的。如上所述，抗体也可以构建为嵌合的，部分或完全人的，从而减少或消除由于向动物施用已在其他物种中产生或具有来自其他物种的序列的抗体而导致的不良免疫后果。在一些实施方案中，抑制剂是肽、多肽或蛋白质抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是拮抗性抗体。
PI3K抑制剂
在某些实施方案中，所述方法和组合物包含葡萄糖代谢抑制剂，其为磷脂酰肌醇3-激酶PI3K抑制剂。通过丝裂原活化蛋白(MAP)激酶和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途径的信号传导由细胞外刺激触发，并调节多种生物过程，诸如增殖、分化和细胞死亡。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是响应于这种细胞外刺激的细胞内信号传导的关键协调者。它们包含脂质激酶家族，其催化磷酸转移至肌醇脂质的D-3'位置，从而产生磷酸肌醇-3-磷酸(PIP)、磷酸肌醇-3,4-二磷酸(PIP2)和磷酸肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，其继而通过将包含普列克底物蛋白同源、FYVE、Phox和其他磷脂结合结构域的蛋白通常在质膜处对接成各种信号传导复合物而在信号级联中充当第二信使(Vanhaesebroeck等人,Annu.Rev.Biochem 70:535(2001)；Katso等人,Annu.Rev.Cell Dev.Biol.17:615(2001))。本发明方法和组合物还考虑了使用对不同的PI3K同工型的同工型选择性抑制剂，其中每种在细胞信号传导和癌症中起不同作用。靶向单个同工型的抑制剂可能能够实现更大的治疗功效。
示例性PI3K抑制剂包括匹替利司、达托利司(dactolisib)、渥曼青霉素、LY294002、艾代拉里斯(CAL-101、GS-1101)、度维利司(duvelisib)、布帕尼西、IPI-549、SP2523、GDC-0326、TGR-1202、VPS34抑制剂1、GSK2269557(奈米利塞(Nemiralisib))、GDC-0084、SAR405、AZD8835、LY3023414、PI-103、TGX-221、NU7441(KU-57788)、IC-87114、渥曼青霉素、XL147类似物、ZSTK474、阿培利司(BYL719)、PIK-75HCl、A66、AS-605240、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、PIK-93、PIK-90、AZD64822、PF-04691502、阿托利司(Apitolisib，GDC-0980、RG7422)、GSK1059615、度维利司(IPI-145、INK1197)、吉托利司(Gedatolisib，PF-05212384、PKI-587)、TG100-115、AS-252424、BGT226(NVP-BGT226)、CUDC-907、AS-604850、PIK-294、GSK2636771、考泮利司(Copanlisib，BAY 80-6946)、YM201636、CH5132799、CAY10505、PIK-293、PKI-402、TG100713、VS-5584(SB2343)、他塞利司(Taselisib，GDC0032)、CZC24832、AMG319、GSK2292767、HS-173、槲皮素、沃他利司(Voxtalisib，SAR245409、XL765)、PIK-93、奥帕利司(Omipalisib，GSK2126458、GSK458)、PIK-90、GNE-317、匹雷利司(Pilaralisib，XL147)、PF-4989216、AZD8186、740Y-P、Vps34-IN1、PIK-III、PI-3065或任何其他PI3K抑制剂或其类似物。
葡萄糖摄取抑制剂/己糖激酶抑制剂
在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂是葡萄糖摄取或糖酵解抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是己糖激酶抑制剂。示例性的己糖激酶抑制剂包括但不限于2-脱氧葡萄糖(2DG)、溴丙酮酸、氯尼达明线粒体己糖激酶抑制剂和PKM2调节剂。
葡萄糖转运蛋白抑制剂
在一些实施方案中，治疗GBM或癌症的方法包括向受试者施用有效量的葡萄糖转运蛋白抑制剂和细胞质p53稳定剂。分子的葡萄糖转运蛋白家族的示例性抑制剂包括类黄酮家族的若干成员。例如，已知毛喉素、根皮素(类黄酮样化合物)和细胞松弛素B抑制GLUT1。槲皮素(一种黄酮醇)已显示出抑制GLUT2介导的葡萄糖转运(Song等人,J.Biol.Chem.277:15252-15260,2002)。雌二醇和异黄酮植物雌激素金雀异黄素也是GLUT1介导的葡萄糖转运的抑制剂(Afzal等人,Biochem J.365:707-719,2002)。葡萄糖转运蛋白抑制剂毛喉素、双嘧达莫和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)与GLUT1和GLUT4结合(Hellwig&Joost,Mol.Pharmacol.40:383-389,1991)。细胞松弛素B也结合GLUT4(Wandel等人,Biochim.Biophys.Acta 1284:56-62,1996)。因此，在本发明方法和组合物的一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂是毛喉素、槲皮素、金雀异黄素、雌二醇、双嘧达莫、异丁基甲基黄嘌呤或细胞松弛素B。
除这些已知的抑制剂以外，本领域技术人员将理解，存在许多已知的鉴定葡萄糖转运蛋白抑制剂的测定。例如，抑制剂对葡萄糖转运蛋白的作用可以通过以下来评估：在诸如非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞或CHO的细胞中表达目的GLUT，优选地葡萄糖转运蛋白8，在存在或不存在抑制剂的情况下测量葡萄糖摄取，并确定抑制剂是竞争性的还是非竞争性的。一旦已知给定GLUT同工型的序列，就可以容易地测试其对大量分子的敏感性以鉴定候选药物。
细胞质p53稳定剂
发明人已经证明，例如，在患者来源的原发性GBM模型中，药理学上的p53稳定(诸如使用CNS-渗透性小分子进行)与抑制EGFR驱动的葡萄糖摄取具有协同致死作用。发明人首次证明，p53的非转录功能可以在代谢反应者中在刺激内在细胞凋亡方面具有关键作用。因此，本文所述的治疗方法包括施用一种或多种细胞质p53稳定剂与葡萄糖代谢抑制剂的组合。一种或多种细胞质p53稳定剂和葡萄糖代谢抑制剂可以在相同或不同组合物中同时或顺序施用。考虑在一些实施方案中，使用单个p53稳定剂，并且在其他实施方案中，使用多于一种的p53稳定剂。例如，据报道，nutlin与ABT 737(其结合BCL-2和BCL-XL)的组合在线粒体水平下协同靶向促细胞凋亡蛋白和抗细胞凋亡蛋白的平衡，从而促进细胞死亡。(Hoe等人2014.Nature Reviews.第13卷第217页)如本文所预期，细胞质p53稳定剂是可以在药理学上直接或间接地稳定或激活p53的任何小分子、抗体、肽、蛋白质、核酸或其衍生物。细胞质p53的稳定导致引发细胞(诸如癌细胞)凋亡。
MDM2拮抗剂
细胞中p53的蛋白水平受到其负调控因子E3泛素蛋白连接酶MDM2的严格控制并保持低水平。在本公开的方法或组合物的实施方案中，细胞质p53稳定剂是MDM2拮抗剂/抑制剂。在一些实施方案中，MDM2拮抗剂是nutlin。在另外的实施方案中，nutlin是nutlin-3或依达奴林。在其他实施方案中，MDM2拮抗剂是RO5045337(也称为RG7112)、RO5503781、RO6839921、SAR405838(也称为MI-773)、DS-3032、DS-3032b或AMG-232或任何其他MDM2抑制剂。
已知结合MDM-2的本发明方法范围内的其他化合物包括Ro 2443、MI 219、MI 713、MI 888、DS 3032b、苯并二氮杂二酮(例如，TDP521252)、磺酰胺(例如，NSC279287)、苯并吡喃并三唑并嘧啶、吗啉酮和哌啶酮(AM 8553)、三联苯、查耳酮、吡唑、咪唑、咪唑-吲哚、异吲哚啉酮、吡咯烷酮(例如，PXN822)、priaxon、哌啶、天然衍生的异戊二烯化的呫吨酮、SAH 8(订书肽(stapled peptides))、sMTide 02、sMTide 02a(订书肽)、ATSP 7041(订书肽)、螺旋寡聚物(α螺旋模拟物)。已知引起MDM2的蛋白质折叠的其他化合物包括PRIMA 1MET(也称为APR 246)、Aprea 102–105、PK083、PK5174、PK5196、PK7088、苯并噻唑、斑点酸和NSC319726。
BCL-2抑制剂
在本发明方法或组合物的另外的实施方案中，细胞质p53稳定剂是BCL-2抑制剂。在一些实施方案中，BCL-2抑制剂是例如反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维耐托克(ABT-199)、GDC-0199、奥巴妥拉(obatoclax)、紫杉醇、纳维克拉(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746、APG-1252或任何其他BCL-2抑制剂。
Bcl-xL抑制剂
在本发明方法或组合物的又另外的实施方案中，细胞质p53稳定剂是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，Bcl-xL抑制剂是例如WEHI 539、ABT-263、ABT-199、ABT-737、萨布克拉(sabutoclax)、AT101、TW-37、APG-1252、藤黄酸或任何其他Bcl-xL抑制剂。
额外方法
在某些方面，本公开提供抑制EGFR或ΔEGFR的方法，其包括向受试者施用有效量的式I-a或I-b的化合物。
在某些方面，本公开提供治疗癌症的方法，其包括向需要癌症治疗的受试者施用有效量的式I-a或I-b的化合物。在一些实施方案中，所述癌症是多形性胶质母细胞瘤。
在某些方面，本公开提供治疗癌症的方法，其包括向需要癌症治疗的受试者施用有效量的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。在一些实施方案中，所述癌症是多形性胶质母细胞瘤。在某些实施方案中，已经确定受试者的肿瘤对葡萄糖代谢抑制剂敏感。
在一些实施方案中，本公开提供通过向先前已经确定有资格进行这种治疗的受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂来抑制GBM生长或增殖的方法。在一些实施方案中，葡萄糖代谢的抑制和细胞质p53的稳定可以是同时的或顺序的。
在一些实施方案中，本公开提供在受试者中治疗GBM的方法，减少或抑制GBM的方法。在一些实施方案中，本公开提供抑制GBM细胞生长的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂治疗GBM患者的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于改善GMB患者的预后的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于降低GBM风险的方法。在一些实施方案中，本公开提供对GBM患者进行分类的方法。在一些实施方案中，本公开提供评估患者对治疗的反应的方法。在一些实施方案中，本公开提供引发GBM肿瘤细胞凋亡的方法。在一些实施方案中，本公开提供使GBM患者适应治疗的方法。在一些实施方案中，本公开提供降低无效疗法的风险的方法。在一些实施方案中，本公开提供改善GBM的症状的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于减少肿瘤存活的机会的方法。在一些实施方案中，本公开提供用于增加肿瘤细胞对疗法的易损性的方法。在本公开中讨论的步骤和实施方案被认为是这些方法中的任一个的一部分。此外，还考虑了用于这些方法中的任一个的组合物。
在某些方面，本公开提供治疗受试者的恶性胶质瘤或GBM的方法，所述方法包括在已经确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感之后，向所述受试者施用一定量的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。
在一些实施方案中，已经通过以下方法确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感，所述方法包括：从受试者获得肿瘤活检物；测量在任何葡萄糖代谢抑制剂存在时肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平；将所获得的肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平与对照的葡萄糖摄取水平进行比较；以及如果与对照相比肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平降低，则确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感。在一些实施方案中，通过放射标记的葡萄糖2-脱氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(18F-FDG)的摄取来测量葡萄糖摄取。在另外的实施方案中，通过正电子发射断层摄影术(PET)检测18F-FDG。在一些实施方案中，所述活检物取自GBM肿瘤。
在一些实施方案中，已经通过以下方法确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感：所述方法包括：从所述受试者获得第一血液样品；让所述受试者进行生酮饮食一段时间；在进行生酮饮食之后从所述受试者获得第二血液样品；测量第一血液样品和第二血液样品中的葡萄糖水平；将第二血液样品中的葡萄糖水平与第一血液样品中的葡萄糖水平进行比较；以及如果第二血液样品中的葡萄糖水平与第一血液样品中的葡萄糖水平相比降低，则确定受试者是易感的。在一些实施方案中，在第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平的降低为约或大于0.15mM，约或大于0.20mM，在0.15mM-2.0mM的范围内或在0.25mM–1.0mM的范围内。在一些实施方案中，葡萄糖水平的降低为约、至少约或至多约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mM(或其中可推导的任何范围)。
在某些方面，本公开提供对被诊断患有胶质瘤或GBM的受试者进行分类的方法，所述方法包括从所述受试者获得生物样品；用一种或多种葡萄糖代谢抑制剂处理所述生物样品；以及确定葡萄糖代谢是否被葡萄糖代谢抑制剂降低。确定葡萄糖代谢的降低包括在施用葡萄糖代谢抑制剂之前和之后，确定葡萄糖水平的变化和/或糖酵解速率的变化和/或葡萄糖摄取的变化和/或细胞外酸化率(ECAR)的变化，和/或测量己糖激酶或果糖磷酸激酶或丙酮酸激酶的活性。在一些实施方案中，确定糖酵解的变化包括直接测量丙酮酸和/或乳酸。在某些实施方案中，生物样品包括来自GBM肿瘤的癌细胞。在其他实施方案中，所述方法还包括将葡萄糖降低水平与对照进行比较。在一些实施方案中，所述方法还包括如果生物样品中葡萄糖代谢被葡萄糖代谢抑制剂降低，则将所述受试者分类为代谢反应者。在另外的实施方案中，所述方法还包括用包含葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂的组合物治疗被分类为代谢反应者的受试者。
在某些方面，本公开提供评估癌细胞或肿瘤对用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括测量或检测癌细胞的葡萄糖摄取水平以及将所述葡萄糖摄取水平与对照进行比较。葡萄糖可以被放射标记，例如像2-脱氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(18F-FDG)。在一些实施方案中，通过正电子发射断层摄影术(PET)进行放射标记的葡萄糖摄取的测量和检测。
在某些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂包括葡萄糖摄取抑制剂、葡萄糖转运蛋白抑制剂、糖酵解抑制剂、己糖激酶抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、细胞内葡萄糖剥夺的任何诱导剂或其任何组合中的一种或多种。在一些实施方案中，EGFR抑制剂是厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、凡德他尼、耐昔妥珠单抗或奧希替尼。在其他实施方案中，葡萄糖抑制剂为磷脂酰肌醇3-激酶PI3K抑制剂。PI3K抑制剂可以是例如匹替利司、达托利司、渥曼青霉素、LY294002、艾代拉里斯、度维利司、布帕尼西、IPI-549、SP2523、GDC-0326、TGR-1202、VPS34抑制剂1、GSK2269557、GDC-0084、SAR405、AZD8835、LY3023414、PI-103、TGX-221、NU7441、IC-87114、渥曼青霉素、XL147类似物、ZSTK474、阿培利司、PIK-75HCl、A66、AS-605240、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、PIK-93、PIK-90、AZD64822、PF-04691502、阿托利司、GSK1059615、度维利司、吉托利司、TG100-115、AS-252424、BGT226、CUDC-907、AS-604850、PIK-294、GSK2636771、考泮利司、YM201636、CH5132799、CAY10505、PIK-293、PKI-402、TG100713、VS-5584、他塞利司、CZC24832、AMG319、GSK2292767、HS-173、槲皮素、沃他利司、PIK-93、奥帕利司、PIK-90、GNE-317、匹雷利司、PF-4989216、AZD8186、740Y-P、Vps34-IN1、PIK-III、PI-3065或其类似物。在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂是2-脱氧葡萄糖(2DG)或细胞松弛素B。
在一些实施方案中，细胞质p53稳定剂是MDM2拮抗剂/抑制剂。在一些实施方案中，MDM2拮抗剂是nutlin。在另外的实施方案中，nutlin是nutlin-3或依达奴林。在其他实施方案中，MDM2拮抗剂是RO5045337、RO5503781、RO6839921、SAR405838、DS-3032、DS-3032b或AMG-232或任何其他MDM2抑制剂。
在一些实施方案中，细胞质p53稳定剂是BCL-2抑制剂。在一些实施方案中，BCL-2抑制剂是例如反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维耐托克(ABT-199)、GDC-0199、奥巴妥拉(obatoclax)、紫杉醇、纳维克拉(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746、APG-1252或任何其他BCL-2抑制剂。
在一些实施方案中，细胞质p53稳定剂是Bcl-xL抑制剂。在一些实施方案中，Bcl-xL抑制剂是例如WEHI 539、ABT-263、ABT-199、ABT-737、萨布克拉(sabutoclax)、AT101、TW-37、APG-1252、藤黄酸或任何其他Bcl-xL抑制剂。
在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂是厄洛替尼，而细胞质p53稳定剂是依达奴林。在一些实施方案中，向受试者施用约1mg至250mg厄洛替尼之间的任何剂量。在一些实施方案中，向受试者施用1、5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、21、32、33、34、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、115、120、125、130、135、140、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、160、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245和250mg厄洛替尼或其间可推导的任何剂量。在一些实施方案中，向受试者施用50mg至1600mg依达奴林之间的任何剂量。在一些实施方案中，向受试者施用100、150、300、400、450或600mg的依达奴林。在一些实施方案中，向受试者施用100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625和1650mg或其中可推导的任何剂量。
在其他实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂是式I-a或I-b的化合物。在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂是式I-a或I-b的化合物，而细胞质p53稳定剂是依达奴林。
在某些方面，本公开提供治疗受试者的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括在确定受试者对EGFR抑制剂降低葡萄糖代谢易感之后，向受试者施用治疗有效量的葡萄糖摄取抑制剂和细胞质p53稳定剂。
在某些方面，本公开提供减少受试者的胶质母细胞瘤增殖的方法，所述方法包括在确定受试者对EGFR抑制剂易感之后，向受试者施用有效量的EGFR抑制剂和MDM2抑制剂。
在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂以同一组合物施用。在其他实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53在单独组合物中施用。例如，在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂在彼此的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时内或在30分钟内或在其间的任何小时或分钟的部分内施用。在其他实施方案中，将葡萄糖代谢抑制剂和p53稳定剂同时施用于受试者。
在本发明方法的某些实施方案中，考虑使用对照，诸如将来自受试者的样品中的葡萄糖水平(或葡萄糖变化或葡萄糖降低)与对照样品进行比较。对照可以包括非癌样品、具有不同表型的癌样品、具有野生型EGFR表达水平的癌症样品或任何其他取自患者的非癌症细胞或不取自患者的对照样品。在某些实施方案中，对照来自样品经受葡萄糖代谢抑制剂之前取自患者的样品。
在某些方面，本公开提供用于在已经被确定患有对葡萄糖代谢抑制剂有反应的癌症的受试者中治疗癌症或减少癌细胞增殖的方法，其包括向癌症患者施用有效量的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。在一些实施方案中，所述癌症是中枢神经系统(CNS)癌症，例如CNS转移。在一些实施方案中，所述癌症是非CNS癌症。在一些实施方案中，所述癌症是多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、低级星形细胞瘤、混合型少突星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、肺癌或其他癌症。
在本文方法的实施方案中，所述受试者已经被诊断患有多形性胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述受试者先前已经用先前治疗方法治疗了胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，已经确定所述受试者对先前治疗方法有抗性。
在本发明方法的某些实施方案中，所述方法还包括施用另外的疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是放疗、化疗、靶向疗法、免疫疗法、手术。在一些实施方案中，另外的疗法包括本文所述的一种或多种疗法。
在一些实施方案中，本公开的组合物和/或方法不包括吉非替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、凡德他尼、耐昔妥珠单抗或奧希替尼、匹替利司、达托利司、LY294002、度维利司或布帕尼西、2-脱氧葡萄糖(2DG)、细胞松弛素B、APR-246、RO5045337、RO5503781、RO6839921、SAR405838、DS-3032、DS-3032b或AMG-232、反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维耐托克(ABT-199)、GDC-0199、奥巴妥拉、紫杉醇、纳维克拉(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746或APG-1252、萨布克拉、AT101、TW-37、APG-1252或藤黄酸中的一种或多种。在一些实施方案中，组合物和/或方法不包括匹替利司、达托利司、渥曼青霉素、LY294002、艾代拉里斯、度维利司、布帕尼西、IPI-549、SP2523、GDC-0326、TGR-1202、VPS34抑制剂1、GSK2269557、GDC-0084、SAR405、AZD8835、LY3023414、PI-103、TGX-221、NU7441、IC-87114、渥曼青霉素、XL147类似物、ZSTK474、阿培利司、PIK-75HCl、A66、AS-605240、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、PIK-93、PIK-90、AZD64822、PF-04691502、阿托利司、GSK1059615、度维利司、吉托利司、TG100-115、AS-252424、BGT226、CUDC-907、AS-604850、PIK-294、GSK2636771、考泮利司、YM201636、CH5132799、CAY10505、PIK-293、PKI-402、TG100713、VS-5584、他塞利司、CZC24832、AMG319、GSK2292767、HS-173、槲皮素、沃他利司、PIK-93、奥帕利司、PIK-90、GNE-317、匹雷利司、PF-4989216、AZD8186、740Y-P、Vps34-IN1、PIK-III、PI-3065或其类似物。
可以基于本文所述的方法来使用一种或多种组合物。可以根据本文所述的方法将一种或多种组合物用于制备用于治疗的药物。在整个本申请中讨论了其他实施方案。针对本公开的一个方面讨论的任何实施方案适用于本公开的其他方面，反之亦然。实施例部分中的实施方案应理解为适用于本文所述技术的所有方面的实施方案。
评估方法
葡萄糖摄取测试
在本公开的方法和组合物的实施方案中，患有GBM或癌症的受试者被分类为“代谢反应者”或“代谢无反应者”，即确定对葡萄糖代谢抑制剂易感。在某些实施方案中，受试者的分类是在向受试者施用包括葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂的治疗之前。因此，本公开提供用于评估癌症、对受试者进行分类、确定受试者对治疗的易感性的方法，其涉及葡萄糖代谢、糖酵解或葡萄糖摄取的分析。实施例1中详细描述了将受试者分类为代谢反应者的方法。T.TeSlaa和M.A.Teitell.2014.Methods in Enzymology,第542卷,第92-114页提供了监测糖酵解和葡萄糖摄取的技术，其以引用的方式并入本文。
糖酵解是一分子葡萄糖细胞内生化转化为两分子丙酮酸，同时生成两分子ATP。丙酮酸是一种具有若干潜在命运的代谢中间体，包括进入线粒体内的三羧酸(TCA)循环以产生NADH和FADH2。替代地，丙酮酸可以通过乳酸脱氢酶在胞浆中转化为乳酸，同时由NADH再生成NAD+。通过糖酵解增加的通量通过提供例如ATP形式的额外能量以及用于核苷酸、脂质和蛋白质生物合成的葡萄糖衍生的代谢中间体来支持癌细胞的增殖。Warburg(Oncologia.1956；9(2):75-83)首次观察到，增殖的肿瘤细胞增强有氧糖酵解，在氧存在下葡萄糖转化为乳酸，而非恶性细胞在有氧时主要进行呼吸。这种线粒体绕过现象(称为Warburg效应)发生在快速增殖的细胞中，包括癌细胞、活化的淋巴细胞和多能干细胞。Warburg效应已被用于临床诊断测试，所述测试使用正电子发射断层摄影术(PET)扫描来鉴定氟化葡萄糖类似物诸如18F-脱氧葡萄糖的细胞摄取增加。
因此，糖酵解代表了治疗和诊断方法的目标。在本发明方法的上下文中，恶性细胞的葡萄糖摄取和乳酸排泄的测量可以用于检测葡萄糖分解代谢的变化和/或对葡萄糖代谢抑制剂的易感性。对于治疗GBM的方法、降低无效疗法风险的方法、降低肿瘤存活的机会的方法，检测此类变化是重要的。出于本公开的目的，在某些实施方案中，18F-脱氧葡萄糖PET充当预测对p53激活的敏感性的快速非侵入性功能性生物标记物。这种非侵入性分析对于药代动力学/药效学评估非常困难且不切实际的恶性脑肿瘤可能特别有价值。在一些情况下，利用MRI融合的延迟成像方案(41)和参数反应图(PRM)可以用于定量肿瘤18F-FDG摄取的变化(42)。
在某些方面，所述方法可以涉及测量葡萄糖摄取和乳酸产生。对于培养中的细胞，糖酵解通量可以通过测量葡萄糖摄取和乳酸排泄来定量。葡萄糖摄取到细胞中是通过葡萄糖转运蛋白(Glut1-Glut4)进行的，而乳酸排泄是通过细胞膜上的单羧酸转运蛋白(MCT1-MCT4)进行的。
细胞外葡萄糖和乳酸
检测葡萄糖摄取和乳酸排泄的方法包括，例如，细胞外葡萄糖或乳酸试剂盒、细胞外生物分析仪、ECAR测量、[3H]-2-DG或[14C]-2-DG摄取、18FDG摄取或2-NBDG摄取。
可商购的试剂盒和仪器可用于定量细胞培养基中的葡萄糖和乳酸水平。试剂盒检测方法通常是比色法或荧光法，并且与标准实验室设备(诸如分光光度计)兼容。BioProfile分析仪(诸如Nova Biomedical)或生物化学分析仪(例如像YSI LifeSciences)可以测量细胞培养基中的葡萄糖和乳酸水平。GlucCell(Cesco BioProducts)只能测量细胞培养基中的葡萄糖水平。虽然每种商业方法都有不同的检测方案，但用于分析的培养基的收集是相同的。
细胞外酸化率
糖酵解也可以通过测量周围培养基的细胞外酸化率(ECAR)来确定，其主要来自在其从丙酮酸转化后每单位时间的乳酸排泄。Seahorse细胞外通量(XF)分析仪(SeahorseBioscience)是用于在同一细胞中同时测量糖酵解和氧化磷酸化(通过耗氧)的工具。
葡萄糖类似物摄取
本公开方法的某些实施方案包括使用葡萄糖类似物。如本领域技术人员所熟悉的，为了确定细胞的葡萄糖摄取率，可以将标记的葡萄糖同工型添加到细胞培养基中，然后在给定的时间段后在细胞内进行测量。用于这些研究的葡萄糖类似物的示例性类型实例包括但不限于放射性葡萄糖类似物，诸如2-脱氧-D-[1,2-3H]-葡萄糖、2-脱氧-D-[1-14C]-葡萄糖或2-脱氧-2-(18F)-氟-D-葡萄糖(18FDG)，或者荧光葡萄糖类似物，诸如2-[N-(7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)。放射性葡萄糖类似物摄取的测量需要闪烁计数器，而2-NBDG摄取通常通过流式细胞术或荧光显微镜进行测量。在一些实施方案中，通过放射标记的葡萄糖2-脱氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(18F-FDG)的摄取来测量葡萄糖摄取。在另外的实施方案中，通过正电子发射断层摄影术(PET)检测18F-FDG。在一些实施方案中，所述活检物取自GBM肿瘤。在下面的实施例中提供测量18F-FDG的实例的详细描述。
在某些方面，所述方法可以涉及将生物样品(诸如肿瘤样品)的葡萄糖摄取与对照进行比较。倍数增加或减少可以是、至少或至多1-、2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-、14-、15-、16-、17-、18-、19-、20-、25-、30-、35-、40-、45-、50-、55-、60-、65-、70-、75-、80-、85-、90-、95-、100-或更多或其中可推导的任何范围。替代地，样品与参考之间的表达差异可以表示为减少或增加百分比，诸如至少或至多20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000％差异或其中可推导的任何范围。
表达相对表达水平的其他方式是使用归一化或相对数，诸如0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0或其中可推导的任何范围。在一些实施方案中，水平可以相对于对照而言。
诸如加权投票程序的算法可以用于促进生物标记物水平的评估。此外，其他临床证据可以与基于生物标记物的测试组合，以降低错误评估的风险。在一些实施方案中，可以考虑其他细胞遗传学评估。
生物样品制备
在某些方面，方法涉及从受试者获得样品。来自患者的含有癌细胞的任何生物样品都可以用于评估本文讨论的葡萄糖摄取。在一些实施方案中，使用来自肿瘤的生物样品。在其他实施方案中，生物样品是血液或血浆。样品的评估可能涉及但不必须涉及淘选(富集)癌细胞、细胞系的体外生长或分离癌细胞。
在一些实施方案中，已经通过以下方法确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感，所述方法包括：从受试者获得肿瘤活检物；测量在任何葡萄糖代谢抑制剂存在时肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平；将所获得的肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平与对照的葡萄糖摄取水平进行比较；以及如果与对照相比肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平降低，则确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感。
肿瘤活检物可以是但不限于GBM。本文提供的获得方法可以包括活检方法，诸如针吸、切取活检、切除活检、穿孔活检等。针吸的方法还可以包括细针抽吸、芯针活检、真空辅助活检或大芯活检。在一些实施方案中，可以通过本文的方法获得多个样品以确保足够量的生物材料。在一些情况下，细针抽吸取样过程可以通过使用超声波、X射线或其他成像设备进行引导。
在其他实施方案中，样品可以从包括但不限于非癌性或癌性组织的任何组织中获得。用于获得生物样品的一般方法是本领域已知的。诸如以引用的方式整体并入本文的Ramzy,Ibrahim Clinical Cytopathology and Aspiration Biopsy 2001的公布描述了用于活检和细胞学方法的一般方法。
在其他实施方案中，通过以下方法确定受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感：所述方法包括：从所述受试者获得第一血液样品；让所述受试者进行生酮饮食一段时间；在进行生酮饮食之后从所述受试者获得第二血液样品；测量第一血液样品和第二血液样品中的葡萄糖水平；将第二血液样品中的葡萄糖水平与第一血液样品中的葡萄糖水平进行比较；以及如果第二血液样品中的葡萄糖水平与第一血液样品中的葡萄糖水平相比降低，则确定受试者是易感的。在一些实施方案中，在第二血液样品与对照血液样品之间的葡萄糖水平的降低为约或大于0.15mM，约或大于0.20mM，在0.15mM-2.0mM的范围内或在0.25mM–1.0mM的范围内。
生物样品可以是血液或血浆，可以是异质或同质的细胞群体。生物样品可以使用本领域已知的可以提供适用于本文所述的分析方法的样品的任何方法获得。
样品可以通过本领域已知的方法获得。在一些情况下，可以使用本方法的试剂盒的组分来获得、储存或运输样品。在一些情况下，可以通过本文所述的方法获得多个样品诸如多个癌样品以进行诊断。在其他情况下，可以通过所述方法获得多个样品诸如来自一种组织类型的一个或多个样品以及来自另一组织的一个或多个样品以进行诊断。可以在不同时间获得的样品，通过不同方法储存和/或分析。
药物组合物
在某些方面，本公开提供包含如本文所述的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂的药物组合物。
在某些方面，用于本文所述方法的组合物或剂(诸如治疗剂或抑制剂)适当地包含在药学上可接受的载剂中。载剂是无毒的，生物相容的并且被选择为并不有害地影响剂的生物活性。本公开的一些方面中的剂可以以固体、半固体、凝胶、液体或气体形式配制成用于局部递送(即，到身体的特定位置，诸如骨骼肌或其他组织)或全身递送的制剂，诸如允许口服、肠胃外或外科施用的片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、贮存剂、吸入剂和注射剂。本公开的某些方面还考虑通过涂覆医疗装置、局部施用等对组合物进行局部施用。
本发明的组合物和方法可以用于治疗有需要的个体。在某些实施方案中，所述个体是哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物。当施用于动物诸如人时，组合物或化合物优选以药物组合物施用，所述药物组合物包含例如本发明的化合物和药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂是本领域熟知的，并且包括例如水溶液，诸如水或生理缓冲盐水或其他溶剂或媒介物，诸如乙二醇、甘油、油诸如橄榄油或可注射的有机酯。在优选的实施方案中，当此类药物组合物施用于人时，特别是用于侵入性施用途径(即，诸如规避通过上皮屏障的运输或扩散的注射或植入的途径)时，水溶液是无热原或基本上无热原的。可以选择赋形剂，例如以实现剂的延迟释放或选择性地靶向一种或多种细胞、组织或器官。药物组合物可以是剂量单位形式，诸如片剂、胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、颗粒、用于重构的亲液胶体、粉末、溶液、糖浆、栓剂、注射剂等。所述组合物也可以存在于透皮递送系统，例如皮肤贴剂中。所述组合物也可以存在于适合局部施用的溶液，诸如洗剂、乳膏或软膏中。
药学上可接受的载剂可以含有生理上可接受的剂，所述剂例如起到稳定化合物(诸如本发明的化合物)、增加其溶解性或增加其吸收的作用。此类生理上可接受的剂包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。药学上可接受的载剂(包括生理学上可接受的剂)的选择取决于例如组合物的施用途径。制剂或药物组合物可以是自乳化药物递送系统或自微乳化药物递送系统。药物组合物(制剂)也可以是脂质体或其他聚合物基质，其可以在其中掺入例如本发明的化合物。例如包含磷脂或其他脂质的脂质体可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理上可接受的和可代谢的载剂。
本文采用短语“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内、适用于与人和动物组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。每种载剂在可与制剂的其他成分相容并且不损伤患者的意义上必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素以及乙酸纤维素；(4)黄芪胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原质水；(17)等渗盐水；(18)林格式溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；以及(21)药物制剂中采用的其他无毒相容性物质。
药物组合物(制剂)可以通过多种施用途径中的任一种施用给受试者，所述施用途径包括例如口服(例如，用于施加到舌的在水或非水溶液或悬浮液中的浸液、片剂、胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、大丸剂、粉末、颗粒、糊剂)；通过口腔粘膜吸收(例如，舌下)；皮下；透皮(例如，作为施加到皮肤的贴剂)；和局部施用(例如，作为施加到皮肤的乳膏、软膏或喷雾剂)。所述化合物也可以配制成用于吸入。在某些实施方案中，化合物可以简单地溶解或悬浮在无菌水中。适当的施用途径和适用于其的组合物的细节可以在例如美国专利号6,110,973、5,763,493、5,731,000、5,541,231、5,427,798、5,358,970和4,172,896以及其中引用的专利中找到。
制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域中熟知的任何方法来制备。可以与载剂材料组合以制备单一剂型的活性成分的量将根据被治疗的受试者特别是施用方式而变化。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效应的化合物的量。一般而言，在一百份中，此量的范围为约1％至约99％活性成分，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
制备这些制剂或组合物的方法包括使活性化合物(诸如本发明的化合物)与载剂和任选地一种或多种辅助成分缔和的步骤。一般而言，通过将本发明的化合物与液体载剂、或精细分开的固体载剂、或两者均匀地和密切地缔合，并且然后，如果必要，使产物成形来制备制剂。
适用于口服施用的本发明的制剂可以呈以下形式：胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用经调味的基质、通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、亲液胶体、粉末、颗粒、或作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水液体乳剂、或作为酏剂或糖浆、或作为锭剂(使用惰性碱，诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口水等，它们各自包含预定量的本发明的化合物作为活性成分。组合物或化合物还可以作为大丸剂、糖饵剂(electuary)或糊剂施用。
为了制备用于口服施用的固体剂型(胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、片剂、丸剂、糖衣丸、粉末、颗粒等)，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载剂诸如柠檬酸钠或磷酸氢钙和/或以下任何一种混合：(1)填充剂或增充剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如像羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)湿润剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液延迟剂，诸如石蜡；(6)吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，例如像鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物；(10)络合剂，诸如修饰和未修饰的环糊精；以及(11)着色剂。在胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、片剂和丸剂的情况下)，药物组合物还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以使用此类赋形剂如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等来用作软质和硬质填充的明胶胶囊中的填充剂。
片剂可以通过压制或模制来制备，任选地含有一种或多种辅助成分。可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羧甲基淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压制片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物来制备。
片剂和其他药物组合物的固体剂型诸如糖衣丸、胶囊(包括分散型胶囊和明胶胶囊)、丸剂和颗粒可以任选地刻痕或用包衣和外壳，诸如肠溶包衣或药物配制领域熟知的其他包衣来制备。还可以使用例如用于提供所需释放特征的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球将它们配制成用于提供其中所含活性成分的缓慢释放或受控释放。可以通过例如过滤通过截留细菌的滤膜或通过在使用前即刻掺入呈可以溶于无菌水或一些其他无菌可注射介质的无菌固体组合物形式的灭菌剂将它们灭菌。这些组合物还可以任选地含有遮光剂并且还可以为仅在或优先在胃肠道的某一部分任选地以延迟方式释放所述活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。所述活性成分还可以呈微囊化形式，在适当情况下，具有一种或多种上述赋形剂。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、用于重构的亲液胶体、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分以外，液体剂型可以含有通常在本领域中使用的惰性稀释剂，例如像水或其他溶剂、环糊精及其衍生物、溶解剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(具体地是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯及其混合物。
除了惰性稀释剂，所述口服组合物还可以包含助剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除活性化合物以外，悬浮液还可以包含悬浮剂，例如像乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。
用于局部或透皮施用的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗液、凝胶、溶液、贴剂以及吸入剂。可以在无菌条件下将所述活性化合物与药学上可接受的载剂以及与可能必需的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
除活性化合物以外，所述软膏、糊剂、乳膏和凝胶还可以含有赋形剂，诸如动物和蔬菜脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石以及氧化锌或其混合物。
除活性化合物以外，粉末和喷雾剂还可以含有赋形剂诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂可以额外含有常规推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未取代的烃(诸如丁烷或丙烷)。
透皮贴剂具有提供本发明化合物向身体的受控递送的附加优点。此类剂型可以通过将活性化合物溶解或分散于适当的介质中来制备。吸收增强剂也可以用于增加化合物穿过皮肤的通量。这种通量的速率可以通过提供速率控制膜或将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。
如本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指除了肠内施用和局部施用以外的、通常通过注射进行的施用模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内以及胸骨内注射和输注。适用于肠胃外施用的药物组合物包含一种或多种活性化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液，或可以在临使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末的组合，所述组合可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、使制剂与预期受体的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂。
可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。适当流动性可以例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需粒径和通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可以含有助剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂例如尼泊金、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可能需要在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的剂诸如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延迟吸收。
在一些情况下，为了延长药物的作用，需要减缓皮下注射或肌肉内注射的药物的吸收。这可以通过使用具有低水溶性的结晶或无定形材料的液态悬浮液来实现。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，溶解速率进而可以取决于晶体大小和晶形。替代地，通过将药物溶解或悬浮于油媒介物中来完成肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。
可注射储库式形式是通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯等生物可降解聚合物中形成主题化合物的微囊化基质来制备。取决于药物与聚合物的比率和所采用的具体聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库式可注射制剂。
为了用于本发明的方法，可以本身或作为含有例如0.1％至99.5％(更优选0.5％至90％)的活性成分与药学上可接受的载剂组合的药物组合物来提供活性化合物。
引入方法也可以由可再装填或可生物降解的装置提供。近年来，已经开发了各种缓释聚合物装置并在体内测试了药物(包括蛋白质生物药物)的受控递送。包括可生物降解和不可降解的聚合物在内的多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)可以用于形成植入物，以在特定目标部位处持续释放化合物。
药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便获得对于特定患者、组合物以及施用模式有效实现所需治疗反应，而对患者无毒的活性成分的量。
剂量
选择的剂量水平取决于多种因素，包括使用的特定化合物或化合物的组合或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与使用的特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病状、综合的健康状态和先前的病史和在医学领域熟知的类似因素。
在某些实施方案中，药物组合物可以包含例如至少约0.1％的活性剂，诸如治疗剂或诊断剂。在其他实施方案中，所述活性剂可以占重量单元的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，以及其中可推导的任何范围。在实施方案中，组合物口服施用。在实施方案中，组合物舌下施用。在其他非限制性实例中，剂量还可以包含每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重至约1000mg/kg/体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在从本文列出的数字可推导的范围的非限制性实例中，可以施用约5微克/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等的范围。
具有本领域中的普通技艺的医师或兽医可以容易地判定和开具治疗有效量的所需药物组合物。例如，医师或兽医可以低于为达成所需治疗效应所需水平的水平开始药物组合物或化合物剂量且逐渐增加剂量，直至达成所需效应。“治疗有效量”意指足以引起所需治疗效应的化合物的浓度。通常应理解，化合物的有效量将根据受试者的体重、性别、年龄和病史而变化。影响有效量的其他因素可以包括但不限于患者病状的严重性、所治疗的病症、化合物的稳定性，以及如果需要的话，将另一种类型的治疗剂与本发明的化合物一起施用。通过多次施用所述剂可以递送更大的总剂量。确定功效和剂量的方法是本领域技术人员已知的(Isselbacher等人(1996)Harrison’s Principles of Internal Medicine第13版,1814-1882,以引用的方式并入本文)。
一般而言，用于本发明的组合物和方法中的活性化合物的适合每日剂量将为化合物有效产生治疗效应的最低剂量的量。这种有效剂量将通常取决于上述因素。
如果需要，活性化合物的有效每日剂量可以任选地以单位剂型作为在全天内以适当间隔分开施用的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用。在本发明的某些实施方案中，活性化合物可以每天施用两次或三次。在优选的实施方案中，活性化合物将每天施用一次。
接受这种治疗的患者为任何有需要的动物，包括灵长类动物，特别是人；以及其他哺乳动物，例如马、牛、猪、绵羊、猫和狗；家禽；以及一般的宠物。
药物组合物和制剂的剂量取决于制剂的类型，并根据受试者的身材和健康状况而变化。考虑各种组合和剂量，它们在本发明的范围内，并且在“有效剂量”、“治疗有效剂量”、“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”组合物的范围内，诸如，举例而言，厄洛替尼为1-250mg之间的任何剂量，依达奴林为50-450mg之间的任何剂量。在一些实施方案中，向受试者施用150、125、100、75、50、25mg的厄洛替尼。在一些实施方案中，向受试者施用50mg至450mg依达奴林之间的任何剂量。在一些实施方案中，向受试者施用100或150mg的依达奴林。根据本文所述的方法和组合物的其他治疗剂的剂量是医学界已知的。短语“有效剂量”、“治疗有效剂量”、“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。
在某些实施方案中，对于成人(体重大约70公斤)，施用约0.1mg至约3000mg(包括其间的所有值和范围)，或约5mg至约1000mg(包括其间的所有值和范围)，或约10mg至约100mg(包括其间的所有值和范围)的化合物。应理解，这些剂量范围仅作为实例，并且可以根据技术人员已知的因素来调整施用。
在配制时，溶液将以可与剂量配制相容的方式并且以如治疗或预防有效的量施用。所述制剂易于以多种剂型施用，诸如以上所述的舌下、颊和透皮制剂。基于预期目标确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的组合物，所述量经计算产生与其施用(即，适当的途径和方案)相关的以上讨论的所需反应。根据治疗次数和单位剂量的施用量取决于所需结果和/或保护。组合物的精确量还取决于医师的判断并且为各个体所特有的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目标(缓解症状相对于治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。
在某些实施方案中，向受试者施用的厄洛替尼的量为约、至少约或至多约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000毫克(mg)或微克(mcg)或μg/kg或微克/kg/分钟或mg/kg/min或微克/kg/小时或mg/kg/小时，或其中可推导的任何范围。
可以根据需要或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24小时(或其中可推导的任何范围)或每天1、2、3、4、5、6、7、8、9或次(或其中可推导的任何范围)施用剂量。可以在病状迹象之前或之后第一次施用剂量。在一些实施方案中，在患者经历或表现出病状的迹象或症状之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时(或其中可推导的任何范围)或1、2、3、4或5天(或其中可推导的任何范围)，向患者施用第一剂量方案。可以将患者治疗1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天(或其中可推导的任何范围)，或者直到病状的症状消失或减轻或在症状消失或减轻之后的6、12、18、24小时或1、2、3、4或5天之后。
在一些实施方案中，可以重复受试者的治疗，例如每隔1、2、3、4、5、6或7天，或每隔1、2、3、4和5周或每隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。
可以向患者施用本文所述的单一化合物或化合物组合，其量为、至少为或至多为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mg/kg(或其中可推导的任何范围)。
在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂以同一组合物施用。在其他实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53在单独组合物中施用。例如，在一些实施方案中，葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂在彼此的24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时内或在30分钟内或在其间的任何小时或分钟的部分内施用。在其他实施方案中，将葡萄糖代谢抑制剂和p53稳定剂同时施用于受试者。在一些实施方案中，将葡萄糖代谢抑制剂和p53稳定剂联合施用。
组合疗法
在某些实施方案中，本发明的化合物可以单独使用或与另一种类型的治疗剂联合施用。
在某些实施方案中，本公开的方法与另外的疗法组合使用，诸如化疗、治疗剂、手术移除癌细胞、放疗及其组合。在一些方面，治疗方案不包括化疗、治疗剂、手术移除癌细胞和/或放疗中的一种或多种。当同时施用时，组合癌症疗法可以在单一制剂或单独制剂中施用，并且如果单独施用，则任选地通过不同的施用模式施用。
在另外的实施方案中，将治疗性治疗剂的组合施用于癌细胞。治疗剂可以连续地(在彼此的几分钟、几小时或几天之内)或并行地施用；它们也可以在预混合的单一组合物中施用给患者。
可以采用多于一种抗癌模式、剂或化合物的各种组合(或此类剂和/或化合物的组合)，例如，第一抗癌模式、剂或化合物为“A”，并且作为抗癌疗法方案的一部分给出的第二抗癌模式、剂或化合物(或此类模式、剂和/或化合物的组合)为“B”：
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考虑到疗法的毒性(如果有的话)，向患者施用治疗性化合物或剂将遵循施用此类化合物的一般方案。预期将根据需要重复治疗周期。还考虑可以将各种标准疗法以及手术介入与所述疗法组合应用。
造成DNA损伤且已广泛使用的放疗包括通常所说的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑其他形式的DNA损伤因素，诸如微波和UV照射。所有这些因素最有可能对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成大范围的损伤。X射线的剂量范围在从延长时间段(3至4周)内50至200伦琴的每日剂量至2000至6000伦琴的单剂量的范围内。放射性同位素的剂量范围广泛变化，并且取决于同位素的半衰期、所发射的放射的强度和类型以及赘生性细胞的摄取。
替代性癌症疗法包括除手术、化疗和放疗以外的任何癌症疗法，诸如免疫疗法、靶向疗法、基因疗法或其组合。使用本方法鉴定出预后不良的受试者可能对单独的常规治疗没有良好的反应，并且可能被开具或施用本身一种或多种替代性癌症疗法或与一种或多种常规治疗组合。
药学上可接受的盐
本公开包括本发明的化合物的药学上可接受的盐在本发明的组合物和方法中的用途。在某些实施方案中，本发明所考虑的盐包括但不限于烷基、二烷基、三烷基或四烷基铵盐。在某些实施方案中，本发明所考虑的盐包括但不限于L-精氨酸、苯乙苄胺、苄星、甜菜碱、氢氧化钙、胆碱、地阿诺、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙氨基)乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、海巴明、1H-咪唑、锂、L-赖氨酸、镁、4-(2-羟乙基)吗啉、哌嗪、钾、1-(2-羟乙基)吡咯烷、钠、三乙醇胺、氨丁三醇和锌盐。在某些实施方案中，本发明所考虑的盐包括但不限于Na、Ca、K、Mg、Zn或其他金属盐。在某些实施方案中，本发明所考虑的盐包括但不限于1-羟基-2-萘甲酸、2,2-二氯乙酸、2-羟基-乙磺酸、2-氧代戊二酸、4-乙酰氨基苯甲酸、4-氨基水杨酸、乙酸、己二酸、l-抗坏血酸、l-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、(+)-樟脑酸、(+)-樟脑-10-磺酸、癸酸(capric acid/decanoic acid)、己酸(caproic acid/hexanoic acid)、辛酸(caprylic acid/octanoic acid)、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、d-葡庚糖酸、d-葡萄糖酸、d-葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、l-苹果酸、丙二酸、苯基乙醇酸、甲磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、尼克酸、硝酸、油酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、l-焦谷氨酸、水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、l-酒石酸、硫氰酸(thiocyanic acid)、对甲苯磺酸、三氟乙酸以及十一碳烯酸盐。
药学上可接受的酸加成盐也可以作为各种溶剂化物存在，诸如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺等。也可以制备此类溶剂化物的混合物。此类溶剂化物的来源可以来自结晶的溶剂，制备或结晶的溶剂中固有的或对于此类溶剂外来的。
润湿剂、乳化剂和润滑剂诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于所述组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
定义
除非本文另外定义，否则本申请中使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文所述的与化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学以及蛋白质和核酸化学结合使用的术语和技术是本领域熟知和常用的那些。
除非另外指示，否则本公开的方法和技术一般是根据本领域中熟知并且如本说明书通篇引用和论述的各种一般性和更特定参考文献中所述的常规方法来执行。参见例如，“Principles of Neural Science”,McGraw-Hill Medical,New York,N.Y.(2000)；Motulsky,“Intuitive Biostatistics”,Oxford University Press,Inc.(1995)；Lodish等人,“Molecular Cell Biology,第4版”,W.H.Freeman&Co.,New York(2000)；Griffiths等人,“Introduction to Genetic Analysis,第7版”,W.H.Freeman&Co.,N.Y.(1999)；和Gilbert等人,“Developmental Biology,第6版”,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(2000)。
除非本文另外定义，否则本文使用的化学术语根据本领域中的常规用法来使用，如由“The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms”,Parker S.编,McGraw-Hill,San Francisco,C.A.(1985)所示例的。
以上所有内容以及本申请中提及的任何其他公布、专利和公布的专利申请均以引用的方式明确并入本文。当发生冲突时，以本说明书(包括其特定定义)为准。
本文使用的术语“剂”表示化合物(诸如有机或无机化合物、化合物的混合物)、生物大分子(诸如核酸、抗体，包括其部分以及人源化、嵌合和人抗体以及单克隆抗体、蛋白质或其部分，例如肽、脂质、碳水化合物)或由生物材料诸如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物。剂包括例如结构已知的剂和结构未知的剂。
“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用并且是指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物诸如人类、灵长类动物、家畜动物(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如，犬、猫科动物等)以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
“治疗”病症或患者是指采取措施以获得有益的或所需的结果，包括临床结果。如本文所用以及本领域中很好地理解的，“治疗”是用于获得有益的或所需的结果(包括临床结果)的方式。有益的或所需的临床结果可包括但不限于一种或多种病状或病症的减缓或改善、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病扩散的预防、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论是可检测的或是不可检测的。“治疗”还可以意指与未接受治疗时期望的存活相比延长存活。
术语“预防”是本领域公认的，并且当相对于病状诸如局部复发(例如，疼痛)、疾病诸如癌症、征候诸如心力衰竭或任何其他医学病状使用时，是在本领域中所熟知的，并且包括施用组合物，相对于不接受所述组合物的受试者，所述组合物减少医学病状的症状的频率，或延缓其发病。因此，癌症的预防例如包括，例如以统计上和/或临床上显著的量，减少接受预防性治疗的患者群体相对于未治疗对照群体的可检测癌性生长的数量，和/或延缓治疗群体相对于未治疗对照群体的可检测癌性生长的出现。
向受检者“施用”物质、化合物或剂或者对物质、化合物或剂的“施用”可使用本领域的技术人员已知的各种方法中的一种来实施。例如，化合物或剂可通过以下方式施用：静脉内、动脉内、真皮内、肌内、腹膜内、皮下、经眼部、舌下、口服(通过摄取)、鼻内(通过吸入)、脊柱内、脑内以及经皮(通过吸收，例如，通过皮肤管)。化合物或剂还可适当地通过可再充电或生物可降解聚合物装置或其他装置引入，例如药贴和泵剂，或配制品，其提供对化合物或剂的延长的、缓慢的或受控的释放。施用还可以例如进行一次、多次和/或在一个或多个延长时间段内进行。
向受试者施用物质、化合物或剂的适当方法还将取决于例如受试者的年龄和/或身体状况以及化合物或剂的化学和生物特性(例如，溶解性、可消化性、生物可用性、稳定性以及毒性)。在一些实施方案中，化合物或剂例如通过摄取向受检者口服施用。在一些实施方案中，口服施用化合物或剂在延长释放或缓慢释放的配制品中，或使用用于此缓慢或延长释放的装置来施用。
如本文所用，短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗剂的任何形式的施用，使得当先前施用的治疗剂在体内仍然有效时施用第二剂(例如，两种剂在患者中同时有效，其可以包括两种剂的协同作用)。例如，不同的治疗化合物可以在相同的制剂中或在单独的制剂中同时地或顺序地施用。因此，接受这种治疗的个体可以受益于不同治疗剂的组合作用。
药物或剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是药物或剂当向受试者施用时将具有预期的治疗性作用的量。完全的治疗性作用并不一定通过施用一次剂量而出现，而可能仅在施用一系列剂量之后才出现。因此，可以一次或多次施用来施用治疗有效量。受试者所需的精确有效量将取决于例如受试者的身材、健康和年龄，以及受治疗的病状(诸如癌症或MDS)的性质和程度。技术人员可以易于通过常规实验确定给定情况的有效量。
术语“酰基”是本领域公认的，并且是指由通式烃基C(O)-，优选烷基C(O)-表示的基团。
术语“酰基氨基”是本领域公认的，并且是指被酰基基团取代的氨基基团，并且可以例如由式烃基C(O)NH-表示。
术语“酰氧基”是本领域公认的，并且是指由通式烃基C(O)O-，优选烷基C(O)O-表示的基团。
术语“烷氧基”是指连接有氧的烷基基团。代表性烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基基团，并且可以由通式烷基-O-烷基表示。
术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括直链烷基基团、支链烷基基团、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在优选的实施方案中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，对于直链为C1-30，对于支链为C3-30)，并且更优选为20个或更少。
此外，在整个说明书，实施例和权利要求书中使用的术语“烷基”旨在包括未取代的和取代的烷基基团，后者是指在烃主链的一个或多个碳原子上具有替换氢的取代基的烷基部分，包括卤代烷基基团，诸如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。
当与诸如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基的化学部分结合使用时，术语“Cx-y”或“Cx-Cy”意指包括在链中含有x至y个碳的基团。C0烷基表示氢，其中基团在末端位置，如果在内部则为键。例如，C1-6烷基基团在链中含有1至6个碳原子。
如本文所用，术语“烷基氨基”是指被至少一个烷基基团取代的氨基基团。
如本文所用，术语“烷硫基”是指被烷基基团取代的硫醇基，并且可以由通式烷基S-表示。
如本文所用，术语“酰胺”是指基团
Figure GDA0002684671720000701
其中R9和R10各自独立地表示氢或烃基基团，或者R9和R10与它们所连接的N原子一起形成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
术语“胺”和“氨基”是本领域公认的，并且是指未取代的和取代的胺及其盐，例如可以由下式表示的部分
Figure GDA0002684671720000702
其中R9、R10和R10’各自独立地表示氢或烃基基团，或者R9和R10与它们所连接的N原子一起形成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
如本文所用，术语“氨基烷基”是指被氨基基团取代的烷基基团。
如本文所用，术语“芳烷基”是指被芳基基团取代的烷基基团。
如本文所用，术语“芳基”包括取代或未取代的单环芳族基团，其中环的每个原子为碳。优选地，环是5元至7元环，更优选地6元环。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳是两个相邻环共有的，其中至少一个环是芳族的，例如，其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。芳基包括苯、萘、菲、苯酚、苯胺等。
术语“氨基甲酸酯”是本领域公认的，并且是指以下基团
Figure GDA0002684671720000703
其中R9和R10独立地表示氢或烃基基团。
如本文所用，术语“碳环基烷基”是指被碳环基团取代的烷基基团。
如本文所用，术语“碳环”、“碳环基”和“碳环”是指其中环的每个原子为碳的非芳族饱和或不饱和环。优选地，碳环含有3至10个原子，更优选地5至7个原子。
如本文所用，术语“碳环基烷基”是指被碳环基团取代的烷基基团。
术语“碳酸酯”是本领域公认的，并且是指基团-OCO2-。
如本文所用，术语“羧基”是指由式-CO2H表示的基团。
如本文所用，术语“酯”是指基团-C(O)OR9，其中OR9表示烃基基团。
如本文所用，术语“醚”是指通过氧连接至另一个烃基基团的烃基基团。因此，烃基基团的醚取代基可以是烃基-O-。醚可以是对称的或不对称的。醚的实例包括但不限于杂环-O-杂环和芳基-O-杂环。醚包括“烷氧基烷基”基团，其可以由通式烷基-O-烷基表示。
如本文所用，术语“卤基”和“卤素”意指卤素，并且包括氯、氟、溴和碘。
如本文所用，术语“杂芳烷基(hetaralkyl)”和“杂芳烷基(heteroaralkyl)”是指被杂芳基基团取代的烷基基团。
术语“杂芳基(heteroaryl)”和“杂芳基(hetaryl)”包括取代或未取代的芳族单环结构，优选5元至7元环，更优选5元至6元环，其环结构包含至少一个杂原子，优选一至四个杂原子，更优选一个或两个杂原子。术语“杂芳基(heteroaryl)”和“杂芳基(hetaryl)”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳是两个相邻环共有的，其中至少一个环是杂芳族的，例如，其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。
如本文所用，术语“杂原子”意指除碳或氢以外的任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧和硫。
如本文所述的术语“杂环基烷基”是指被杂环基团取代的烷基基团。
术语“杂环基”、“杂环”和“杂环的”是指取代或未取代的非芳族环结构，优选3元至10元环，更优选3元至7元环，其环结构包含至少一个杂原子，优选一至四个杂原子，更优选一个或两个杂原子。术语“杂环基”和“杂环的”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳是两个相邻环共有的，其中至少一个环是杂环的，例如，其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂环基基团包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。
如本文所用，术语“烃基”是指通过不具有＝O或＝S取代基的碳原子键合的基团，并且通常具有至少一个碳-氢键和主要为碳的主链，但是可以任选地包含杂原子。因此，出于本申请的目的，诸如甲基、乙氧基乙基、2-吡啶基和甚至三氟甲基的基团被认为是烃基，但是诸如乙酰基(其在连接碳上具有＝O取代基)和乙氧基(其通过氧而不是碳连接)的取代基不是。烃基基团包括但不限于芳基、杂芳基、碳环、杂环、烷基、烯基、炔基及其组合。
如本文所用，术语“羟烷基”是指被羟基基团取代的烷基基团。
当与化学部分诸如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基结合使用时，术语“低级”意指包括其中取代基中有十个或更少原子，优选六个或更少原子的基团。例如，“低级烷基”是指含有十个或更少，优选六个或更少的碳原子的烷基。在某些实施方案中，本文所定义的酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基取代基分别是低级酰基、低级酰氧基、低级烷基、低级烯基、低级炔基或低级烷氧基，无论它们是单独出现还是与其他取代基组合出现，诸如在叙述羟烷基和芳烷基中(在这种情况下，例如，当计算烷基取代基中的碳原子时，不计算芳基内的原子)。
术语“多环基”、“多环”和“多环的”是指两个或更多个环(例如，环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基)，其中两个或更多个原子是两个相邻环共用的，例如，环是“稠合环”。多环的每个环可以是取代或未取代的。在某些实施方案中，多环的每个环在环中含有3至10个原子，优选5至7个原子。
术语“硫酸酯”是本领域公认的，并且是指基团–OSO3H或其药学上可接受的盐。
术语“磺酰胺”是本领域公认的，并且是指由以下通式表示的基团
Figure GDA0002684671720000731
其中R9和R10独立地表示氢或烃基。
术语“亚砜”是本领域公认的，并且是指基团-S(O)-。
术语“磺酸酯”是本领域公认的，并指基团SO3H或其药学上可接受的盐。
术语“砜”是本领域公认的，并且是指基团–S(O)2-。
术语“取代的”是指在主链的一个或多个碳上具有替换氢的取代基的部分。应理解，“取代”或“被……取代”包括隐含的条件，即这种取代是根据取代原子和取代基的允许化合价，并且所述取代产生稳定的化合物，例如，其不会自发地进行诸如通过重排、环化、消除等的转化。如本文所用，术语“取代的”考虑包括有机化合物的所有允许的取代基。在广义方面，可允许的取代基包括有机化合物的非环状的和环状的、支链的和非支链的、碳环的和杂环的、芳族的和非芳族的取代基。可允许的取代基可以是一个或多个取代基并且对于适当的有机化合物而言是相同或不同的。出于本发明的目的，杂原子诸如氮可以具有氢取代基和/或本文所述的有机化合物的满足杂原子的化合价的任何可允许的取代基。取代基可以包括本文所述的任何取代基，例如卤素、羟基、羰基(诸如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(诸如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸根、膦酸根、次膦酸根、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸根、磺酸根、磺酰胺基、亚磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员将理解，如果合适，在烃链上取代的部分本身可以被取代。
如本文所用，术语“硫代烷基”是指被硫醇基团取代的烷基基团。
如本文所用，术语“硫酯”是指基团-C(O)SR9或–SC(O)R9
其中R9表示烃基。
如本文所用，术语“硫醚”等同于醚，其中氧被硫替换。
术语“脲”是本领域公认的并且可以由以下通式表示
Figure GDA0002684671720000741
其中R9和R10独立地表示氢或烃基。
如本文所用，术语“调节”包括抑制或压制功能或活性(诸如细胞增殖)以及增强功能或活性。
短语“药学上可接受的”是本领域公认的。在某些实施方案中，所述术语包括在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织相接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的利益/风险比相称的组合物、赋形剂、助剂、聚合物以及其他材料和/或剂型。
“药学上可接受的盐”在本文中用于是指适用于治疗患者或与患者的治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。
如本文所用，术语“药学上可接受的酸加成盐”意指由式I表示的任何基础化合物的任何无毒的有机或无机盐。形成合适的盐的示例性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及金属盐诸如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适的盐的例示性有机酸包括一元羧酸、二元羧酸和三元羧酸，诸如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸以及磺酸，诸如对甲苯磺酸和甲磺酸。可以形成一元酸盐或二元酸盐，并且此类盐可以水合形式、溶剂化形式或基本上无水形式存在。通常，式I的化合物的酸加成盐更易溶于水和各种亲水性有机溶剂，并且与它们的游离碱形式相比，通常表现出更高的熔点。适当的盐的选择对本领域技术人员是已知的。其他非药学上可接受的盐(例如草酸盐)可以用于例如分离式I的化合物，用于实验室使用或随后转化为药学上可接受的酸加成盐。
如本文所用的术语“药学上可接受的碱加成盐”意指由式I表示的任何酸化合物或其任何中间体的任何无毒的有机或无机碱加成盐。形成合适的盐的例示性无机碱包括氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化钡。形成合适的盐的例示性有机碱包括脂族、脂环族或芳族有机胺，诸如甲胺、三甲胺和甲基吡啶或氨。适当盐的选择将对本领域的技术人员是已知的。
可用于本公开的方法和组合物的许多化合物在其结构中具有至少一个立构中心。这个立构中心可以R或S构型存在，所述R和S符号根据Pure Appli.Chem.(1976),45,11-30中所描述的规则来使用。本公开考虑所有立体异构形式，诸如化合物、盐、前药或其混合物的对映异构体和非对映异构体形式(包括立体异构体的所有可能的混合物)。参见例如WO01/062726。
此外，某些含有烯基基团的化合物可以作为Z(同侧)或E(异侧)异构体存在。在每种情况下，本公开包括混合物和单独的个体异构体两者。
一些化合物也可以作为互变异构形式存在。尽管未在本文所述的式中明确指出，但此类形式意图包含在本公开的范围内。
“前药”或“药学上可接受的前药”是指在施用之后在宿主中被代谢例如水解或氧化以形成本公开的化合物(例如，式的I化合物)的化合物。前药的典型实例包括在活性化合物的官能部分上具有生物不稳定或可裂解(保护)基团的化合物。前药包括可以被氧化、还原、胺化、脱胺化、羟基化、脱羟基化、水解、脱水解、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化或脱磷酸化以产生活性化合物的化合物。在美国专利6,875,751、7,585,851和7,964,580中公开了使用酯或磷酰胺酯作为生物不稳定或可裂解(保护)基团的前药的实例，其公开内容以引用的方式并入本文。本公开的前药被代谢以产生式I的化合物。本公开在其范围内包括本文所述化合物的前药。例如，在“Design of Prodrugs”Ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985中描述了合适前药的选择和制备的常规程序。
如本文所用的术语“药学上可接受的载剂”意指可用于配制用于医学或治疗性用途的药物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体助滤剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。
如本文所用，术语“溶解度的对数”、“LogS”或“logS”在本领域中用于定量化合物的水溶性。化合物的水溶性显著地影响其吸收和分布特性。低溶解度通常伴随着不良吸收。LogS值是以摩尔/升为单位测量的溶解度的单位剥离对数(以10为底数)。
本文所述的化合物包括本发明化合物的所有合适的同位素变化。本发明化合物的同位素变化定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于通常或主要存在于自然界中的原子质量的原子替换的化合物。可以掺入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，诸如分别为2H(氘)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I和131I。因此，除非另外说明，否则“氢”或“H”的叙述应理解为涵盖1H(氕)、2H(氘)和3H(氚)。
如本文所用，“表达增加”、“表达水平增加”、“表达提高”、“表达降低”或“表达水平降低”是指与参考水平或对照相比的生物标记物的表达水平，诸如受试者样品中的葡萄糖摄取。在某些方面，参考水平可以是来自相同受试者的非癌组织的表达的参考水平。替代地，参考水平可以是来自不同受试者或受试者组的表达的参考水平。例如，表达的参考水平可以是从没有癌症的受试者或受试者组的样品(例如，组织、液体或细胞样品)获得的表达水平，或者从患有癌症的受试者或受试者组的非癌组织获得的表达水平。参考水平可以是单个值或可以是值的范围。表达的参考水平可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法来确定。在一些实施方案中，参考水平是从患有癌症或没有癌症的受试者队列中确定的平均表达水平。参考水平也可以图形化地描绘为图上的面积。在某些实施方案中，参考水平是归一化水平。
鉴于测量的性质或精度，“约”和“大约”通常意指所测量的量的可接受的误差度。通常，示例性误差度在给定值或值范围的20％(％)以内，优选在10％以内，并且更优选在5％以内。替代地并且具体地在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指在给定值的一个数量级内，优选在5倍内并且更优选地在2倍内的值。在一些实施方案中，考虑本文讨论的数值可以与术语“约”或“大约”一起使用。
在某些实施方案中，当提及基因产物或功能性蛋白质时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文可互换使用。但是，这些术语不限于此用法，并且在某些实施方案中传达了它们在本领域中的公认含义。
当在权利要求书和/或说明书中使用时，术语“降低”、“改善”、“抑制”或“减少”或这些术语的任何变化包括任何可测量的降低或完全抑制以达到所需结果。
术语“抑制剂”是指间接或直接抑制蛋白质的活性或表达、过程(例如，代谢过程)或生化途径的治疗剂。
本领域普通技术人员应理解，与参考水平相比，可以确定来自测试受试者的表达水平具有升高的表达水平、相似的表达水平或降低的表达水平。
如本文所用，“拮抗剂”描述了与激动剂在相同位点处竞争性结合受体但不激活由受体的活性形式引发的细胞内反应并因此可以通过激动剂或部分激动剂抑制细胞内反应的部分。
术语“抑制剂”是指间接或直接抑制蛋白质表达、过程(例如，代谢过程)或生化途径的活性的治疗剂。
如本文所用，在某些实施方案中，“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法(therapy)”是用于获得有益或所需临床结果的方法。这包括：减轻症状的缓解、减轻炎症、抑制癌细胞生长和/或减小肿瘤大小。在一些实施方案中，术语治疗是指在患有癌症的受试者中抑制或减少癌细胞增殖。此外，这些术语旨在涵盖治愈以及改善病状或疾病的至少一种症状。例如，在癌症的情况下，对治疗的反应包括：恶病质减少、存活时间增加、肿瘤进展时间延长、肿瘤块减小、肿瘤负荷减小，和/或肿瘤转移时间、肿瘤复发时间、肿瘤反应、完全反应、部分反应、稳定疾病、进行性疾病、无进展生存期、总生存期的延长，各自如通过由国家癌症研究所和批准新药的美国食品和药品管理局所设定的标准来测量。参见Johnson等人,(2003)J.Clin.Oncol.21(7):1404-1411。
在某些实施方案中，术语“药物制剂”或“药物组合物”旨在意指包含至少一种活性成分的组合物或组合物的混合物；包括但不限于本文所述化合物的盐、溶剂化物和水合物。
当在权利要求书和/或说明书中连同术语“包含”一起使用时，使用的措辞“一个(a)”或“一种(an)”可以意指“一个”，但它也符合“一个或多个”、“至少一个”及“一个或多于一个”的含义。
贯穿本申请，在某些实施方案中，术语“约”用于指示，值包括用于确定所述值的装置或方法的误差的标准偏差。
除非明确指出仅指替代物或替代物是相互排斥的，在权利要求书中使用术语“或”是用于指“和/或”，不过本公开支持仅指替代物的定义以及“和/或”。如本文所用的“另一个(种)”可以指至少第二个(种)或更多个(种)。
实施例
现已大体上描述本发明，参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例被包括仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的并且不意图限制本发明。
实施例1：JGK系列的示例性化合物的制备
一般程序：所有反应常规在惰性氩气下进行。除非另外说明，否则材料获自商业供应商并未经纯化即可使用。所有溶剂在即将使用之前均已通过标准技术纯化和干燥。从钠和二苯甲酮中新鲜蒸馏出THF和Et2O。通过与CaH2回流来纯化二氯甲烷、甲苯和苯。通过薄层色谱法(Kieselgel 60F254,Merck)来检查反应。通过在UV光下观察并通过在浸入对茴香醛溶液或磷钼酸溶液后炭化着色来检测斑点。在水性后处理中，所有有机溶液经无水硫酸镁干燥并过滤，之后在水泵压力下旋转蒸发。通过硅胶柱色谱法(SilicaFlash P60,230-400目,SiliCycle Inc)纯化粗化合物。通过Bruker AV 400(400/100MHz)或Bruker AV500(500/125MHz)光谱仪获得质子(1H)和碳(13C)NMR光谱。以Me4Si或CHCl3作为内标，以ppm单位报道化学位移。分裂模式通过以下指定：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；m，多重峰；b，宽峰。使用具有IonSense ID-CUBE DART源的Thermo Fisher Scientific Exactive Plus获得高分辨率质谱数据。
JGK001，JGK003的制备
Figure GDA0002684671720000791
[JGK001]在室温下，向厄洛替尼(134mg，0.3406mmol)在无水甲醇(5.0mL)中的溶液中一次性添加二碳酸二叔丁酯(228mg，1.7029mmol)。在相同温度下搅拌48h之后，真空浓缩。将反应混合物用H2O(30mL)和EtOAc(30mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1)纯化以得到JGK001(156mg，73％)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,1H),7.43(s,1H),7.20-7.23(m,2H),7.16(td,J＝1.2,7.6Hz,1H),7.09(d,J＝8.0Hz,1H),4.16-4.25(m,4H),3.80(t,J＝5.2Hz,2H),3.77(t,J＝5.2Hz,2H),3.45(s,3H),3.44(s,3H),3.44(s,3H),3.03(s,1H),1.55(s,9H),1.11(s,9H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ152.1,151.5,149.2,148.8,145.7,142.7,130.6,128.9,127.4,125.3,122.6,121.5,114.7,111.4,108.0,90.7,83.7,83.3,82.9,76.8,70.9,70.7,68.8,68.7,59.2,59.1,55.0,28.2,27.3；HRMS-ESI[M+H]+实验值626.3061[C33H43N3O9计算值625.2993]。
[JGK003]在室温下，向厄洛替尼(101mg，0.2567mmol)在无水乙醇(2.6mL)中的溶液中一次性添加二碳酸二叔丁酯(172mg，1.2836mmol)。在相同温度下搅拌48h之后，真空浓缩。将反应混合物用H2O(30mL)和EtOAc(30mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1)纯化以得到JGK003(117mg，71％)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(s,1H),7.43(s,1H),7.34(s,1H),7.21-7.24(m,2H),7.16(d,J＝7.6Hz,1H),7.10(d,J＝7.6Hz,1H),4.17-4.25(m,4H),3.61-3.82(m,6H),3.46(s,3H),3.45(s,3H),3.02(s,1H),1.55(s,9H),1.23(t,J＝6.8Hz,3H),1.12(s,9H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ152.0,151.4,149.2,148.9,145.5,143.0,130.8,128.8,127.3,125.3,122.5,121.7,114.7,111.3,107.9,89.3,83.7,83.2,82.8,76.7,70.9,70.7,68.8,68.6,63.0,59.2,59.1,28.2,27.4,14.6；HRMS-ESI[M+H]+实验值640.3211[C34H45N3O9计算值639.3150]。
JGK002的制备
Figure GDA0002684671720000801
向厄洛替尼的固体(165mg，0.4194mmol)添加乙酸酐(5.0mL)。伴随搅拌在90℃(浴温)下加热3天之后，将反应混合物冷却至室温，并用饱和NaHCO3水溶液(20mL)中和，并用EtOAc(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，1/1至1/3)纯化以得到JGK002(161mg，88％分离产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.06(s,1H,),7.45(t,J＝1.6Hz,1H,),7.37-7.39(m,2H),7.36(s,1H),7.30-7.34(m,1H),7.15(s,1H),4.32(t,J＝4.8Hz,2H),4.16(t,J＝4.8Hz,2H),3.86(t,J＝4.8Hz,2H),3.79(t,J＝4.8Hz,2H),3.46(s,3H),3.45(s,3H),3.06(s,1H),2.14(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.5,158.8,156.1,153.5,151.1,150.8,141.0,130.9,130.3,129.3,127.5,123.4,117.2,107.9,103.1,82.4,78.4,70.6,70.3,68.9,68.7,59.3,59.3,23.7；HRMS-ESI[M+H]+实验值436.1811[C24H25N3O5计算值435.1788]。
JGK010，JGK032的制备-用苯胺类似物取代的一般程序
Figure GDA0002684671720000811
[环化]在室温下在Ar下，向二醇2(530mg，2.6959mmol)在DMF(13.5mL，0.2M)中的溶液中一次性添加碳酸钾(1490mg)，接着依次滴加1-溴-2-氯乙烷(1.3mL)。伴随搅拌在60℃(浴温)下加热24h之后，将反应混合物冷却至室温，用H2O(50mL)淬灭。分离各层，并且将水层用EtOAc(50mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，6/1至3/1)纯化以得到稠合的氯喹唑啉3(404mg，67％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(s,1H),7.64(s,1H),7.47(s,1H),4.43-4.45(m,2H),4.39-4.42(m,2H)。[已知化合物；Chilin,A.等人J.Med.Chem.2010,53,1862-1866]
[JGK010]在室温下，向稠合的氯喹唑啉3(114mg，0.5120mmol)在DMF(2.6mL)中的溶液中滴加3-氯-2-氟苯胺(0.10mL)。伴随搅拌在60℃(浴温)下加热24h之后，将反应混合物冷却至室温，并用Et2O(30.0mL)稀释以得到白色悬浮液。将所得白色固体依次用Et2O(2×50mL)洗涤并收集以得到JGK010(140mg，82％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(s,1H),8.59(ddd,J＝3.2,6.8,6.8Hz,1H),7.39(s,1H),7.34(s,1H),7.29(s,1H),7.10-7.18(m,2H),4.38-4.43(m,4H)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.78(s,1H),8.79(s,1H),8.45(s,1H),7.62(t,J＝7.0Hz,1H),7.50(t,J＝7.0Hz,1H),7.43(s,1H),7.34(t,J＝8.0Hz,1H),4.46-4.53(m,2H),4.40-4.52(m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ159.8,154.0,152.2,149.9,145.7,135.2,129.9,128.1,126.4,125.8,120.9,111.3,108.1,105.8,65.5,64.6；HRMS-ESI[M+H]+实验值332.0551[C16H11ClFN3O2计算值331.0518]。
JGK005的制备
Figure GDA0002684671720000821
在室温下，向稠合的氯喹唑啉3(14mg，0.0628mmol)在CH3CN(2.0mL)中的溶液中滴加3-乙炔基苯胺(0.05mL)。伴随搅拌在80℃(浴温)下加热12h之后，将反应混合物冷却至室温并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1)纯化以得到JGK005(10mg，52％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.45(s,1H),8.43(s,1H),8.04-8.05(m,2H),7.87-7.90(m,1H),7.34(t,J＝7.9Hz,1H),7.14-7.16(m,2H),4.35-4.39(m,4H),4.14(s,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ156.8,153.3,149.5,146.5,144.1,140.2,129.3,126.7,124.9,122.7,122.1,113.0,110.4,108.8,84.0,80.9,64.9,64.6；HRMS-ESI[M+H]+实验值304.1079[C18H13N3O2计算值303.1002]。
JGK025
Figure GDA0002684671720000822
按照一般程序制备JGK025；JGK025(25％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.30(s,1H),8.73(s,1H),8.28(s,1H),7.51-7.58(m,1H),7.41-7.48(m,1H),7.35(s,1H),7.17-7.23(m,1H),4.44-4.50(m,2H),4.39-4.44(m,2H)；13C NMR(125MHz,MeOD)δ161.6(J＝245.9Hz),160.0,157.6(J＝249.6Hz),152.1,150.1,145.6,135.4,130.4,121.4,112.4,110.9,108.1,108.1,105.4,65.5,64.6；HRMS-ESI[M+H]+实验值316.0890[C16H11F2N3O2计算值315.0813]。
JGK026
Figure GDA0002684671720000831
按照一般程序制备JGK026；JGK026(22％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.09(s,1H),8.74(s,1H),8.18(s,1H),7.39-7.51(m,2H),7.30(s,1H),7.23-7.29(m,1H),4.45-4.49(m,2H),4.40-4.44(m,2H)；13C NMR(125MHz,MeOD)δ159.8,158.1(J＝239.6Hz),153.7(J＝243.2Hz),152.1,150.1,145.7,135.7,126.0,117.9,117.8,116.0,110.9,108.2,106.2,65.5,64.6；HRMS-ESI[M+H]+实验值316.0893[C16H11F2N3O2计算值315.0813]。
JGK027
Figure GDA0002684671720000832
按照一般程序制备JGK027；JGK027(6％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.23(bs,1H),8.75(s,1H),8.29(s,1H),7.91(s,1H),7.46-7.55(m,1H),7.29(t,J＝8.1Hz,2H),4.46-4.50(m,2H),4.40-4.46(m,2H)；13C NMR(125MHz,MeOD)δ163.6,160.7,160.4,158.4,152.5,151.5,146.2,130.6,115.6,113.5,113.4,111.9,109.3,108.2,66.2,65.3；HRMS-ESI[M+H]+实验值316.0889[C16H11F2N3O2计算值315.0813]。
JGK028
Figure GDA0002684671720000833
按照一般程序制备JGK028；JGK028(41％)；1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.64(s,1H),8.03(s,1H),7.31-7.38(m,2H),7.24-7.31(m,2H),4.50-4.55(m,2H),4.44-4.50(m,2H)；13CNMR(125MHz,MeOD)δ160.1,152.8,150.9(J＝245.6Hz),149.0,146.2,145.9(J＝249.7Hz),134.6,126.0,124.0,123.1,116.2,109.8,107.8,105.0,65.2,64.2；HRMS-ESI[M+H]+实验值316.0884[C16H11F2N3O2计算值315.0813]。
JGK029
Figure GDA0002684671720000841
按照一般程序制备JGK029；JGK029(52％)；1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.60(s,1H),7.98(s,1H),7.29(s,1H),7.07-7.13(m,2H),4.50-4.53(m,2H),4.44-4.48(m,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ161.7,160.3,158.6,158.1,153.2,150.3,144.4,143.7,117.2,113.8,113.0,112.3,109.5,101.5,65.3,64.5；HRMS-ESI[M+H]+实验值334.0794[C16H10F3N3O2计算值333.0719]。
JGK017
Figure GDA0002684671720000842
按照一般程序制备JGK017；JGK017(5％)；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.59(s,1H),8.15(d,J＝8.3Hz,1H),7.49(t,J＝8.1Hz,1H),7.38(s,1H),7.34(d,J＝7.9Hz,1H),7.21(s,1H),4.41-4.42(m,2H),4.38-4.40(m,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ156.4,153.2,149.7,146.7,144.5,138.4,133.5,132.2,128.2,125.4,119.9,119.7,114.3,110.4,105.7,64.5,64.3。
JGK004的制备
Figure GDA0002684671720000851
[苯甲酰化]在Ar下，向二醇2(205mg，1.0428mmol)在无水CH2Cl2(5.2mL，0.2M)中的冷却(0℃)溶液中依次滴加吡啶(0.5mL)和苯甲酰氯(0.7mL)。在室温下搅拌12h之后，将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(20mL)淬灭，并用CH2Cl2(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用CH2Cl2(2×50mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，10/1)纯化以得到苯甲酰基氯喹唑啉2-(2)(220mg，52％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.07(s,1H),8.31(s,1H),8.16(s,1H),8.04-8.07(m,4H),7.53-7.58(m,2H),7.34-7.39(m,4H)。
[JGK004]在室温下，向苯甲酰基氯喹唑啉2-(2)(180mg，0.444mmol)在CH3CN(3.0mL)中的溶液中滴加3-氯-2-氟苯胺(0.06mL，0.533mmol)。伴随搅拌在80℃(浴温)下加热15h之后，将反应混合物冷却至室温并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1)纯化以得到JGK004(109mg，48％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.85(s,1H),8.48-8.53(m,1H),8.08(t,J＝7.2Hz,4H),7.99(d,J＝3.2Hz,2H),7.51-7.59(m,3H),7.39(dd,J＝8.4,16.0Hz,4H),7.16-7.21(m,2H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.2,163.7,156.6,155.1,150.6,149.1,148.6,147.5,142.1,134.1,134.1,130.3,130.2,128.6,128.6,128.1,128.0,127.9,127.8,125.3,124.6,124.5,122.9,121.6,121.0,120.9,114.4,113.3；HRMS-ESI[M+H]+实验值514.0963[C28H17ClFN3O4计算值513.0886]。
JGK006的制备
Figure GDA0002684671720000861
在室温下，向苯甲酰基氯喹唑啉2-(2)(100mg，0.247mmol)在CH3CN(3.0mL)中的溶液中滴加3-乙炔基苯胺(0.05mL，0.430mmol)。伴随搅拌在50℃(浴温)下加热24h之后，将反应混合物冷却至室温并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，4/1)纯化以得到JGK006(48mg，40％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(s,1H),8.03(d,J＝8.0Hz,2H),7.96(s,1H),7.90-7.95(m,2H),7.79(s,1H),7.62-7.75(m,3H),7.55(t,J＝7.3Hz,1H),7.48(t,J＝7.5Hz,1H),7.37(t,J＝7.4Hz,2H),7.22-7.31(m,4H),3.04(s,1H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ164.8,163.9,156.7,155.3,148.9,146.9,141.3,138.1,134.1,134.0,130.3,130.1,128.9,128.6,128.5,128.1,128.0,127.9,124.8,122.7,122.4,122.1,115.1,113.1,83.3；HRMS-ESI[M+H]+实验值486.1443[C30H19N3O4计算值485.1370]
JGK032的制备
Figure GDA0002684671720000862
通过在室温下将氯化氢溶液(0.1mL，4.0M在二噁烷中，0.4mmol)添加到THF(0.3mL)中，生成1.0M氯化氢溶液。在室温下，向JGK010(6.1mg，0.01839mmol)在MeOH中的溶液中滴加以上生成的氯化氢溶液(0.030mL，0.030mmol)。在相同温度下搅拌10秒之后，将反应混合物真空浓缩以得到JGK032(6.7mg，99％)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ11.63(s,1H),8.81(s,1H),8.36(s,1H),7.63(ddd,J＝1.6,6.9,8.3Hz,1H),7.39(s,1H),7.35(ddd,J＝1.1,8.1,16.2Hz,1H),4.49-4.51(m,2H),4.43-4.45(m,2H)。
JGK012的制备
Figure GDA0002684671720000871
向JGK010的固体(39mg，0.1176mmol)添加乙酸酐(5.0mL)。伴随搅拌在80℃(浴温)下加热12h之后，将反应混合物冷却至室温，并用饱和NaHCO3水溶液(20mL)中和，并用EtOAc(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，2/1至1/1)纯化以得到JGK012(37mg，84％分离产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(s,1H),7.49(s,1H),7.44(s,1H),7.31-7.41(m,2H),7.09(t,J＝8.0Hz,1H),4.41-4.43(m,2H),4.37-4.40(m,2H),2.15(s,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ170.2,159.2,153.3,151.3,149.7,145.8,130.6,129.8,129.7,124.7,122.5,122.4,117.7,113.6,109.2,64.5,64.2,22.9；HRMS-ESI[M+H]+实验值374.0701[C18H13ClFN3O3计算值373.0623]。
JGK015的制备
Figure GDA0002684671720000872
在室温下，向L-氨基酸类似物A(227mg，0.7712mmol)在DMF(3.0mL)中的溶液中一次性添加稠合的氯喹唑啉3(117mg，0.5932mmol)。伴随搅拌在35℃(浴温)下加热12h之后，将反应混合物冷却至室温，并用饱和盐水(30.0mL)和EtOAc(30.0mL)稀释以得到黄色悬浮液。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，CH2Cl2/MeOH，40/1至10/1)纯化以得到JGK015(261mg，92％)；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.57(s,1H),7.64(s,1H),7.61(d,J＝8.0Hz,2H),7.37(s,1H),7.27(s,1H),7.08(d,J＝8.5Hz,2H),5.09(d,J＝7.5Hz,1H),4.54(dd,J＝6.0,13.5Hz,1H),4.31-4.33(m,2H),4.27-4.29(m,2H),3.68(s,3H),3.06(dd,J＝5.6,14.0Hz,1H),3.00(dd,J＝6.1,13.8Hz,1H),1.39(s,9H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ172.4,156.5,155.2,153.6,149.1,146.3,143.8,137.6,131.6,129.7,121.7,113.8,110.3,106.6,80.0,64.4,64.2,54.4,52.2,37.6,28.3；HRMS-ESI[M+H]+实验值481.2082[C25H28N4O6计算值480.2003]。
JGK016，JGK023的制备
Figure GDA0002684671720000881
[JGK016(Boc脱保护)]在室温下，向JGK015(121mg，0.251mmol)在无水CH2Cl2(5mL，0.05M)中的溶液中滴加三氟乙酸(1.0mL)。在相同温度下搅拌5h之后，将反应混合物用饱和NaHCO3水溶液(20mL)淬灭，并用CH2Cl2(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，CH2Cl2/MeOH，20/1)纯化以得到JGK016(74mg，77％)；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.5(s,1H),8.68(s,1H),8.43(s,2H),8.20(s,1H),7.68(d,J＝8.4Hz,2H),7.26(d,J＝8.4Hz,2H),7.23(s,1H),4.44-4.46(m,2H),4.39-4.41(m,2H),3.68(s,3H),3.03-3.13(m,2H)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.26(s,1H),7.73(s,1H),7.60(d,J＝8.4Hz,2H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.08(s,1H),4.31-4.35(m,4H),3.72(t,J＝6.6Hz,1H),3.68(s,3H),3.27-3.29(m,1H),3.01(dd,J＝5.9,13.6Hz,1H),2.89(dd,J＝7.0,13.5Hz,1H)；13C NMR(100MHz,CD3OD)δ174.4,157.4,152.6,149.7,145.0,144.2,137.5,132.8,129.2,122.8,122.3,111.5,110.1,107.9,64.5,64.1,55.2,51.0,39.5；HRMS-ESI[M+H]+实验值381.1553[C20H20N4O4计算值380.1479]。
[JGK023(水解)]向JGK016(42mg，0.1104mmol)在THF/H2O(3:1，总计4.0mL)中的冷却(0℃)溶液中一次性添加氢氧化锂(14mg)。在室温下搅拌2h之后，将反应混合物用1N HCl中和并用EtOAc(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(100mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，CH2Cl2/MeOH，30/1至15/1)纯化以得到JGK023(25mg，62％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),8.12(s,1H),7.71(d,J＝8.4Hz,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(s,1H),4.48-4.50(m,2H),4.42-4.44(m,2H),4.28(t,J＝6.8Hz,1H),3.32-3.37(m,1H),3.20(dd,J＝7.6,14.8Hz,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ169.7,159.1,152.4,148.8,146.0,136.1,134.1,133.1,129.7,129.7,124.8,124.8,110.0,108.1,104.9,65.2,64.2,53.6,35.4；HRMS-ESI[M+H]+实验值367.1334[C19H18N4O4计算值366.1322]。
JGK020的制备
Figure GDA0002684671720000891
在室温下，向氯喹唑啉2(104mg，0.5294mmol)在异丙醇(5.3mL)中的溶液中滴加氨基酸(187mg)。伴随搅拌在50℃(浴温)下加热12h之后，将反应混合物冷却至室温并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，5/1至3/1)纯化以得到JGK020(128mg，53％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.68(s,1H),10.22(br,1H),8.64(s,1H),7.91(s,1H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.26-7.31(m,4H),4.12-4.18(m,1H),3.59(s,3H),2.98(dd,J＝5.2,14.0Hz,1H),2.84(dd,J＝10.0,13.2Hz,1H),1.30(s,9H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ173.0,158.2,155.9,155.6,148.7,148.4,136.1,135.8,129.7,124.7,107.6,107.3,103.3,78.8,55.7,52.3,36.3,28.6；HRMS-ESI[M+H]+实验值455.1920[C23H26N4O6计算值454.1846]。
JGK014
Figure GDA0002684671720000901
JGK014(26％)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),7.66(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(s,1H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),4.99(d,J＝7.6Hz,1H),4.56-4.62(m,1H),4.36-4.42(m,4H),3.73(s,3H),3.03-3.15(m,2H),1.43(s,9H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ172.4,156.5,155.2,153.6,149.1,146.3,143.8,137.6,131.6,129.7,121.7,113.8,110.3,106.6,80.0,64.4,64.2,54.4,52.2,37.6,28.3；HRMS-ESI[M+H]+实验值481.2080[C25H28N4O6计算值480.2003]。
JGK021
Figure GDA0002684671720000902
JGK021制备后进行JGK023的合成程序；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),8.12(s,1H),7.71(d,J＝8.4Hz,2H),7.40(d,J＝8.4Hz,2H),7.24(s,1H),4.48-4.50(m,2H),4.42-4.44(m,2H),4.28(t,J＝6.8Hz,1H),3.32-3.37(m,1H),3.20(dd,J＝7.6,14.8Hz,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ169.7,159.1,152.4,148.8,146.0,136.1,134.1,133.1,129.7,129.7,124.8,124.8,110.0,108.1,104.9,65.2,64.2,53.6,35.4；HRMS-ESI[M+H]+实验值367.1347[C19H18N4O4计算值366.1322]。
JGK022的制备
Figure GDA0002684671720000911
在室温下，向二醇X(121mg，0.6155mmol)在DMF(3.0mL)中的溶液中滴加3-氯-2-氟苯胺(0.14mL)。伴随搅拌在60℃(浴温)下加热3天之后，将反应混合物冷却至室温，并用Et2O(30.0mL)稀释以得到白色悬浮液。将所得白色固体依次用Et2O(3×50mL)和CH2Cl2(2×30mL)洗涤并收集以得到JGK022(132mg，70％)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.16(br,1H),10.43(br,1H),8.68(s,1H),7.91(s,1H),7.58(t,J＝7.1Hz,1H),7.48(t,J＝6.8Hz,1H),7.40(s,1H),7.30(t,J＝8.1Hz,1H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ159.1,156.4,154.1,152.1,149.1,148.3,135.1,129.7,128.1,126.8,125.7,120.8,107.4,106.9,102.9；HRMS-ESI[M+H]+实验值306.0437[C14H9ClFN3O2计算值305.0361]。
JGK018的制备
Figure GDA0002684671720000912
[氯化]向11(500mg，2.134mmol)在亚硫酰氯(7.5mL，0.28M)中的溶液中滴加二甲基甲酰胺(0.15mL)。伴随搅拌在80℃(浴温)下加热2h之后，将反应混合物冷却至室温并真空浓缩。将残余物依次用Et2O(200mL)洗涤，并立即用于下一步骤中。
[取代]在室温下在Ar下，向以上生成的氯喹唑啉12在无水DMF(11mL，0.2M)中的溶液中滴加3-氯-2-氟苯胺(0.50mL，4.548mmol)。在相同温度下搅拌1h之后，将反应混合物用Et2O(100.0mL)稀释以得到白色悬浮液。将所得白色固体依次用Et2O(2×50mL)洗涤并收集以得到JGK018(525mg，68％)；光谱数据与Zhang,X.等人J.Med.Chem.2015,58,8200-8215。
13的制备
Figure GDA0002684671720000921
[乙酰基脱保护]向JGK018(550mg，1.520mmol)中滴加氨溶液(8.0mL，7N在甲醇中)。在密封管中伴随搅拌在50℃(浴温)下加热2h之后，将反应混合物冷却至室温并真空浓缩。将所得白色固体依次用Et2O(2×50mL)洗涤并收集以得到13(394mg，81％)；所得光谱数据与Zhang,X.等人J.Med.Chem.2015,58,8200-8215。
14的制备
Figure GDA0002684671720000922
在Ar下，向13(113mg，0.353mmol)在无水DMF(2mL)中的冷却(0℃)溶液中滴加三乙胺(0.25mL，1.767mmol)，接着滴加二碳酸二叔丁酯(62mg，0.459mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液。在室温下搅拌3天之后，将反应混合物用饱和H2O水溶液(10mL)淬灭，并用EtOAc(10mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，5/1至3/1)纯化以得到14(42mg，28％分离产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.69(s,1H),8.39-8.45(m,1H),7.64(s,1H),7.44(s,1H),7.11-7.16(m,2H),3.90(s,3H),1.59(s,9H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ156.2(J＝39.5Hz),154.9,151.3,150.3,149.5(J＝224.1Hz),140.4,128.1(J＝9.6Hz),124.8,124.4(J＝4.8Hz),121.5,120.8(J＝51.2Hz),113.5,109.0,108.8,84.6,56.2,27.6；
C的制备
Figure GDA0002684671720000931
在室温下在Ar下，向A1(56mg，0.1904mmol)在无水CH2Cl2(2mL)中的溶液中滴加三乙胺(0.08mL，0.5712mmol)，接着添加氯乙酰氯(0.05mL，0.6286mmol)。在相同温度下搅拌1h之后，将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(20mL)淬灭，并用CH2Cl2(20mL)稀释。分离各层，并且将水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗产物不经进一步纯化而用于下一步骤。
JGK031的制备
Figure GDA0002684671720000932
[烷基化]在室温下，向14(44mg，0.1058mmol)在DMF(2.0mL)中的冷却(0℃)溶液中一次性添加碳酸钾(73mg，0.528mmol)，接着滴加以上生成的C(0.1904mmol)在DMF(2.0mL)中的溶液。伴随搅拌在40℃(浴温)下加热3天之后，将反应混合物用H2O(10mL)淬灭，并用EtOAc(10mL)稀释。分离各层，并且将水层用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，100/1至30/1)纯化以得到烷基化产物14-(2)(43mg，55％分离产率)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.16(s,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,2H),7.44(s,1H),6.98-7.13(m,5H),6.34(m,1H),4.95(d,J＝7.4Hz,1H),4.54(d,J＝6.5Hz,1H),4.48(s,2H),3.69(s,6H),2.95-3.13(m,2H),1.53(s,9H),1.40(s,9H)。
[脱保护]向烷基化产物14-(2)(26mg，0.0348mmol)在无水MeOH(5.0mL)中的溶液中滴加0.5N盐酸盐溶液(0.5mL)。在相同温度下搅拌24h之后，将反应混合物真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(反相硅胶，MeOH或MeOH/H2O，10/1)纯化以得到JGK031(12mg，61％)；1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.20(s,1H),7.67(s,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,2H),7.24-7.30(m,1H),7.11-7.21(m,4H),3.94(s,3H),3.59(s,3H),2.83-3.01(m,2H)；HRMS-ESI[M+H]+实验值554.1631[C27H25ClFN5O5计算值553.1522]。
JGK033的制备
Figure GDA0002684671720000941
向JGK031(5mg，0.009026mmol)在无水THF(6mL)和H2O(2mL)中的溶液中一次性添加氢氧化锂·H2O(3mg)。在室温下搅拌2h之后，将反应混合物用1N盐酸盐溶液中和并真空浓缩。将残余物通过反相柱色谱法(反相硅胶，MeOH/H2O，5/1)纯化以得到JGK033(4.4mg，90％)；1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.16(s,1H),6.32(s,1H),6.03(d,J＝8.2Hz,2H),5.89-5.98(m,2H),5.59-5.79(m,4H),4.00(s,2H),2.51(s,3H),2.46(t,J＝5.6Hz,1H)；13C NMR(125MHz,MeOD)δ163.9,159.4,157.2,154.3,152.1,149.5,137.1,135.4,129.7,126.9,124.6,121.5,120.3,108.0,106.9,97.8,56.6,53.5,35.6；HRMS-ESI[M+H]+实验值540.1435[C26H23ClFN5O5计算值539.1366]。
JGK008的制备
Figure GDA0002684671720000951
在Ar下，向拉帕替尼(326mg，0.561mmol)在无水MeOH(5.6mL)和CH2Cl2(5.6mL)中的溶液中一次性滴加二碳酸二叔丁酯(378mg，2.819mmol)。在室温下搅拌2天之后，将反应混合物用饱和H2O水溶液(10mL)淬灭，并用CH2Cl2(10mL)稀释。分离各层，并且将水层用CH2Cl2(5×50mL)萃取。将合并的有机层依次用H2O和饱和盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1至1/1)纯化以得到JGK008(119mg，31％分离产率)；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.71(bs,1H),8.64(s,1H),8.44(s,1H),7.85-7.95(m,3H),7.68(d,J＝7.8Hz,1H),7.32-7.37(m,1H),7.21(dd,J＝8.4,10.8Hz,2H),6.98-7.03(m,1H),6.96(d,J＝8.9Hz,1H),6.39(d,J＝47.1Hz,1H),5.13(s,2H),4.53(d,J＝32.2Hz,2H),3.99(t,J＝7.3Hz,2H),3.39(d,J＝66.1Hz,2H),2.89(s,3H),1.49(s,9H)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δ163.9,162.0,158.0,154.2,152.7,151.7,151.0,139.1(d,J＝7.3Hz),132.4,130.1(d,J＝8.1Hz),129.1,128.6,128.2,125.1,123.1,122.4,122.3,115.4,114.9(d,J＝21.0Hz),114.1(d,J＝13.9Hz),113.9,111.5,110.9,107.7,81.3,70.9,45.0,43.6,42.3,41.4,41.2,28.4；HRMS-ESI[M+H]+实验值681.1946[C34H34ClFN4O6S计算值680.1866]。
JGK011的制备
Figure GDA0002684671720000952
在Ar下，向拉帕替尼的固体(68mg，0.353mmol)中添加乙酸酐(5.0mL)。在室温下搅拌2天之后，将反应混合物真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(硅胶，己烷/EtOAc，3/1至1/3)纯化以得到JGK002(48mg，62％分离产率)；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.18(s,1H),8.10-8.17(m,3H),7.50(d,J＝2.5Hz,1H),7.27-7.36(m,2H),7.18(dd,J＝7.6,13.8Hz,2H),6.97-7.03(m,2H),6.79(d,J＝3.3Hz,1H),6.44(d,J＝3.3Hz,1H),5.14(s,2H),4.66(s,2H),3.86(t,J＝6.6Hz,2H),3.30(t,J＝6.6Hz,2H),2.95(s,3H),2.33(s,3H),2.23(s,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ171.4,171.2,163.9,162.2,162.0,154.0,153.7,152.5,151.0,138.5(J＝7.3Hz),134.2,130.8,130.3,130.2,129.9,129.1,127.4,123.9,122.4(J＝2.9Hz),121.8,118.0,115.1,115.0,114.0(J＝5.2Hz),113.8,111.1,108.9,70.1(J＝1.7Hz),52.3,47.0,41.4,40.7,23.7,21.8；HRMS-ESI[M+H]+实验值665.1628[C33H30ClFN4O6S计算值664.1553]。
实施例2：JGK系列的另外的示例性化合物的制备
一般化学信息
所有化学品、试剂和溶剂均从商业来源购买(如果有的话)并按原样使用。必要时，通过标准方法对试剂和溶剂进行纯化和干燥。对空气和湿气敏感的反应在烘箱干燥的玻璃器皿中在氩气的惰性气氛下进行。在单模反应器CEM Discover微波合成器中进行微波照射反应。室温反应在环境温度(大约23℃)下进行。所有反应均通过薄层色谱法(TLC)在预涂覆的Merck 60F254硅胶板上进行监测，通过UV光(λ＝254，365nm)或通过使用碱性KMnO4溶液使斑点可视化。快速柱色谱法(FC)在SiO2 60(粒径0.040–0.063mm，230–400目)上进行。在25–50℃下通过旋转蒸发进行减压(真空)浓缩。将纯化的化合物在高真空下或在干燥器中进一步干燥。产率对应于纯化的化合物，并且不进行进一步优化。质子核磁共振(1H NMR)光谱在Bruker光谱仪上记录(在300、400或500MHz下操作)。碳NMR(13C NMR)光谱在Bruker光谱仪上记录(在400或500MHz下)。NMR化学位移(δppm)参考残留溶剂信号。1H NMR数据报告如下：化学位移，ppm；多重峰(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，m＝多重峰/复杂模式，td＝三重双峰，ddd＝双二重双峰，br＝宽峰信号)；耦合常数(J)以Hz为单位，积分。13C NMR光谱的数据以化学位移和偶合常数(如果适用)报告。高分辨率质谱(HRMS)在具有IonSense ID-CUBE DART源质谱仪的Thermo Fisher Scientific Exactive Plus上记录。如先前报道，制备化合物4-氯-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉(1)、4-氯喹唑啉-6,7-二醇(2)和JGK010。
合成4-苯胺基喹唑啉化合物JGK035–JGK041和JKG043的一般程序A。
用苯胺(1当量)处理4-氯喹唑啉(1当量)在iPrOH(0.1–0.3M)中的混合物，并且将混合物在微波照射(60W)下在80℃下加热15–20min。将混合物冷却至23℃，用额外的苯胺(1当量)处理，并且再进行微波照射(80℃，60W，15–20min)。将混合物减压浓缩，或者通过过滤分离沉淀的4-苯胺基喹唑啉盐酸盐(用冷iPrOH洗涤)。将残余物悬浮在饱和NaHCO3水溶液中，并用CH2Cl2萃取(3x)。将合并的有机萃取物用水、盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过FC(用CH2Cl2/EtOAc或己烷/EtOAc梯度洗脱)纯化，得到所需产物，通常为白色至灰白色固体或浅黄色固体。
N-(2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK035)。
Figure GDA0002684671720000971
按照一般程序A，由在iPrOH(1.5mL)中的4-氯喹唑啉1(51mg，0.23mmol)和2-氟苯胺(40μL，0.48mmol)制备化合物JGK035。FC(CH2Cl2/EtOAc 10:1→10:4)得到呈白色固体的JGK035(56mg，82％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.68(s,1H),8.64(td,J＝8.2,1.7Hz,1H),7.38(s,1H),7.36(br,1H),7.31(s,1H),7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(ddd,J＝11.2,8.3,1.5Hz,1H),7.10–7.05(m,1H),4.44–4.37ppm(m,4H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ156.08,153.60,153.50(d,J＝242.7Hz),149.52,146.65,144.34,127.31(d,J＝9.5Hz),124.66(d,J＝3.7Hz),123.97(d,J＝7.8Hz),122.89,115.06(d,J＝19.3Hz),114.46,110.62,106.10,64.69,64.51ppm。HRMS(DART):m/z[M–H]–C16H11FN3O2 –计算值296.0841；实验值296.0841。
4-氯(7,7,8,8-2H4)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉(3)。
Figure GDA0002684671720000981
将化合物2(193mg，0.98mmol)在干燥DMF(4.8mL)中的溶液用Cs2CO3(788mg，2.42mmol)处理，搅拌5min，并且用1-溴-2-氯(2H4)乙烷(270μL，3.16mmol)逐滴处理。将混合物在23℃下搅拌1h，并且然后在70℃下搅拌18h。将混合物冷却至23℃之后，真空除去所有挥发物。将残余物溶解在CH2Cl2(40mL)中，用水(2x 13mL)、盐水(13mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。通过FC(CH2Cl2/EtOAc 1:0→10:1.5)纯化，得到呈白色蓬松固体的标题化合物3(109mg，49％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.84(s,1H),7.64(s,1H),7.47ppm(s,1H).13CNMR(101MHz,CDCl3):δ160.19,152.52,151.54,147.93,146.06,120.10,113.72,110.83ppm(未观察到两个高磁场碳)。HRMS(DART):m/z[M+H]+C10H4D4ClN2O2 +计算值227.0520；实验值227.0516。
N-(3-氯-2-氟苯基)(7,7,8,8-2H4)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK036)。
Figure GDA0002684671720000982
按照一般程序A，由在iPrOH(1.2mL)中的4-氯喹唑啉3(55mg，0.24mmol)和3-氯-2-氟苯胺(52μL，0.47mmol)制备化合物JGK036。将JGK036·HCl通过过滤从粗反应混合物中分离出，并且在碱化和萃取之后得到呈浅黄色固体的纯JGK036(67mg，82％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.62(s,1H),8.34(s,1H),7.93(s,1H),7.53–7.43(m,2H),7.27(td,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.19ppm(s,1H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ157.17,153.10,152.45(d,J＝249.2Hz),149.28,146.04,143.68,128.21(d,J＝12.0Hz),127.27,127.03,124.87(d,J＝4.7Hz),120.11(d,J＝16.7Hz),112.48,109.64,108.35,63.50(m,2C’s)。HRMS(DART):m/z[M+H]+C16H8D4ClFN3O2 +计算值336.0848；实验值336.0841。
N-(3-溴-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK037)。
Figure GDA0002684671720000991
按照一般程序A，由在iPrOH(1.5mL)中的4-氯喹唑啉1(100mg，0.45mmol)和3-溴-2-氟苯胺(100μL，0.89mmol)制备化合物JGK037。FC(CH2Cl2/EtOAc 10:0→10:3)得到呈浅黄色固体的JGK037(150mg,89％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.68(s,1H),8.65(ddd,J＝8.3,7.4,1.5Hz,1H),7.39(s,1H),7.35(br,1H),7.29(s,1H),7.29–7.24(m,1H),7.11(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.44–4.38ppm(m,4H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ155.89,153.37,150.15(d,J＝242.2Hz),149.70,146.75,144.53,128.65(d,J＝10.5Hz),127.24,125.31(d,J＝4.7Hz),121.79,114.53,110.59,108.59(d,J＝19.4Hz),105.93,64.70,64.51ppm。HRMS(DART):m/z[M–H]–C16H10BrFN3O2 –计算值373.9946；实验值373.9946。
N-{2-氟-3-[(三乙基甲硅烷基)乙炔基]苯基}-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(4)。
Figure GDA0002684671720000992
在1英钱小瓶中装入JGK010(75mg，0.23mmol)、XPhos(19.7mg，0.041mmol)、Cs2CO3(195mg，0.60mmol)、[PdCl2·(MeCN)2](3.6mg,0.014mmol)。将小瓶抽真空并用氩气回填(至少重复两次)。添加干燥的乙腈(1mL)，并且将橙色悬浮液在23℃下搅拌25min，然后注入乙炔基三乙基硅烷(150μL，0.84mmol)。将管密封，并且将反应混合物在预热的油浴中在95℃下搅拌3.5h。使悬浮液达到23℃，用EtOAc稀释，通过SiO2塞过滤(用EtOAc洗涤)，并蒸发。通过FC(SiO2；己烷/EtOAc 8:2→4:6)纯化，得到呈黄色泡沫状固体的标题化合物4(48mg，49％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.681(td,J＝8.1,1.9Hz,1H),8.678(s,1H),7.382(s,1H),7.376(br,1H),7.28(s,1H),7.21–7.12(m,2H),4.44–4.38(m,4H),1.07(t,J＝7.9Hz,9H),0.71ppm(q,J＝7.9Hz,6H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ155.95,153.81(d,J＝248.0Hz),153.44,149.62,146.66,144.47,127.68,127.60,124.15(d,J＝4.5Hz),122.79,114.49,111.77(d,J＝14.6Hz),110.61,105.97,98.65,98.49(d,J＝3.7Hz),64.70,64.51,7.63,4.50ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C24H27N3O2Si+计算值436.1851；实验值436.1831。
N-(3-乙炔基-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK038)。
Figure GDA0002684671720001001
用1M TBAF在THF(450μL，0.45mmol)中的溶液逐滴处理化合物4(40mg，0.09mmol)在湿THF(0.9mL)中的混合物，并且将混合物在23℃下搅拌18h。添加水(10mL)，并且将混合物用EtOAc(3x 15mL)萃取。将合并的有机物用盐水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。通过FC(SiO2；己烷/EtOAc 7:3→3:7)纯化，接着进行第二次FC(SiO2；CH2Cl2/EtOAc 1:0→6:4)纯化，得到呈灰白色固体的JGK038(19mg，64％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.69(td,J＝8.0,1.8Hz,1H),8.67(s,1H),7.38(s,1H),7.36(br,1H),7.29(s,1H),7.24–7.15(m,2H),4.43–4.38(m,4H),3.34ppm(s,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ155.94,154.04(d,J＝248.8Hz),153.39,149.65,146.70,144.47,127.81,127.68(d,J＝9.1Hz),124.30(d,J＝4.7Hz),123.47,114.49,110.58,110.50(d,J＝14.3Hz),105.99,82.95(d,J＝3.5Hz),76.70(d,J＝1.6Hz),64.69,64.50ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C18H13FN3O2 +计算值322.0986；实验值322.0981。
N-[2-氟-3-(三氟甲基)苯基]-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK039)。
Figure GDA0002684671720001011
按照一般程序A，由在iPrOH(1.5mL)中的4-氯喹唑啉1(37mg，0.17mmol)和2-氟-3-(三氟甲基)苯胺(42μL，0.33mmol)制备化合物JGK039。FC(CH2Cl2/EtOAc 1:0→10:3)得到呈灰白色固体的JGK039(35mg，58％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ9.00–8.92(m,1H),8.70(s,1H),7.42(br,1H),7.40(s,1H),7.35–7.28(m,2H),7.30(s,1H),4.46–4.38ppm(m,4H).13CNMR(126MHz,CDCl3):δ155.77,153.24,150.27(d,J＝252.0Hz),149.81,146.80,144.66,128.62(d,J＝8.5Hz),126.34,124.44,124.40,122.66(q,J＝272.4Hz),120.41(q,J＝4.6Hz),114.58,110.55,105.86,64.70,64.51ppm。HRMS(DART):m/z[M–H]–C17H10F4N3O2 –计算值364.0715；实验值364.0712。
4-氯-8,9-二氢-7H-[1,4]二噁庚并[2,3-g]喹唑啉(5)。
Figure GDA0002684671720001012
将化合物2(100mg，0.51mmol)在干燥DMF(10mL)中的溶液用Cs2CO3(460mg，1.41mmol)处理，搅拌15min，并且用1,3-二溴丙烷(135μL，1.33mmol)逐滴处理。将混合物在23℃下搅拌1h，并且然后在65℃下搅拌18h。冷却至23℃之后，真空除去所有挥发物。将残余物悬浮在CH2Cl2(20mL)中，并且用水(2x 5mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。通过FC(己烷/CH2Cl2 1:10→0:1→CH2Cl2/EtOAc 10:1.5)纯化，然后进行第二次FC(己烷/EtOAc 10:1→10:3)纯化，得到呈白色固体的标题化合物5(41mg，34％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ8.87(s,1H),7.75(s,1H),7.55(s,1H),4.46(t,J＝5.8Hz,2H),4.40(t,J＝6.0Hz,2H),2.34ppm(quint,J＝5.9Hz,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ160.57,158.86,153.10,153.03,148.88,120.83,118.19,115.64,70.51,70.33,30.51ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C11H10ClN2O2 +计算值237.0425；实验值237.0416。
N-(3-氯-2-氟苯基)-8,9-二氢-7H-[1,4]二噁庚并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK040)。
Figure GDA0002684671720001021
按照一般程序A，由在iPrOH(1.5mL)中的4-氯喹唑啉5(33mg，0.14mmol)和3-氯-2-氟苯胺(32μL，0.29mmol)制备化合物JGK040。FC(CH2Cl2/EtOAc 1:0→10:3.5)得到呈白色固体的JGK040(34mg，70％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.72(s,1H),8.39(s,1H),8.08(s,1H),7.53–7.45(m,2H),7.29(s,1H),7.27(td,J＝8.1,1.3Hz,1H),4.32(t,J＝5.5Hz,2H),4.29(t,J＝5.6Hz,2H),2.22ppm(quint,J＝5.6Hz,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ157.43,156.67,153.85,152.48(d,J＝249.3Hz),150.74,147.29,128.05(d,J＝12.0Hz),127.41,127.04,124.91(d,J＝4.7Hz),120.13(d,J＝16.5Hz),117.52,113.81,110.77,70.75,70.62,30.80ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C17H14ClFN3O2 +计算值346.0753；实验值346.0740。
8-氯-2H-[1,3]二噁唑并[4,5-g]喹唑啉(6)。
Figure GDA0002684671720001022
用Cs2CO3(335mg，1.03mmol)处理化合物2(100mg，0.51mmol)在干燥DMF(3.4mL)中的溶液，并在23℃下搅拌15min。将混合物用氯碘甲烷(130μL，1.79mmol)逐滴处理，搅拌1h，并且然后在70℃搅拌17h。将混合物冷却至23℃之后，真空除去所有挥发物。将残余物悬浮在CH2Cl2(30mL)中，用水(2x 7mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并蒸发。通过FC(己烷/CH2Cl2 3:10→0:1→CH2Cl2/EtOAc 10:2)纯化，得到呈白色蓬松固体的标题化合物6(38mg，36％)。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.85(s,1H),7.49(s,1H),7.32(s,1H),6.21ppm(s,2H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ159.82,154.89,152.79,150.94,149.78,121.23,105.23,102.89,101.12ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C9H6ClN2O2 +计算值209.0112；实验值209.0104。
N-(3-氯-2-氟苯基)-2H-[1,3]二噁唑并[4,5-g]喹唑啉-8-胺(JGK041)。
Figure GDA0002684671720001031
按照一般程序A，由在iPrOH(1.5mL)中的4-氯喹唑啉6(35mg，0.17mmol)和3-氯-2-氟苯胺(38μL，0.35mmol)制备化合物JGK041。FC(CH2Cl2/EtOAc 1:0→1:1)得到呈浅黄色固体的JGK041(35mg，66％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ9.53(s,1H),8.37(s,1H),7.84(s,1H),7.53–7.44(m,2H),7.27(td,J＝8.1,1.3Hz,1H),7.20(s,1H),6.25ppm(s,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ157.37,153.10,152.60,152.43(d,J＝248.9Hz),148.56,147.28,128.30(d,J＝11.9Hz),127.17,126.90,124.88(d,J＝4.8Hz),120.12(d,J＝16.4Hz),109.82,104.59,102.38,98.77ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C15H10ClFN3O2 +计算值318.0440；实验值318.0435。
乙酸[(3-氯-2-氟苯基)(7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-基)氨基]甲酯(JGK043)。
Figure GDA0002684671720001032
在0℃下，用1M LiHMDS在THF(150μL，0.15mmol)中的溶液逐滴处理JGK010(50mg，0.15mmol)在干燥THF(0.5mL)中的混合物。在此温度下搅拌15min之后，将混合物滴加到乙酸氯甲酯(55μL，0.57mmol)在干燥THF(0.5mL)中的溶液中。将最初容纳JGK010溶液的烧瓶用0.5mL干燥THF冲洗，并添加到反应混合物中。在0℃下搅拌2h之后，在23℃下继续搅拌22h。添加饱和NaHCO3水溶液(10mL)，并且将混合物用EtOAc(3x 10mL)萃取。将合并的有机物干燥(Na2SO4)，过滤，并真空蒸发。通过FC(CH2Cl2/EtOAc 1:0->1:1)纯化，得到呈浅黄色固体的标题化合物JGK043(30mg，49％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ7.93(s,1H),7.88(s,1H),7.08–6.97(m,2H),6.94(td,J＝7.2,2.1Hz,1H),6.82(s,1H),5.73(s,2H),4.40–4.29(m,4H),2.12ppm(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ170.33,152.96,150.10(d,J＝245.6Hz),149.37,148.05,143.24,140.17(d,J＝13.1Hz),131.89,124.17,124.12(d,J＝4.8Hz),122.59(d,J＝2.4Hz),121.33(d,J＝17.1Hz),115.41,114.31,102.24,71.19,65.07,64.23,20.85ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C19H16ClFN3O4 +计算值404.0808；实验值404.0792。
实施例3：JGK系列的另外的示例性化合物的制备
一般程序：所有化学品、试剂和溶剂均从商业来源购买(如果有的话)并按原样使用。必要时，通过标准方法对试剂和溶剂进行纯化和干燥。对空气和湿气敏感的反应在烘箱干燥的玻璃器皿中在氩气的惰性气氛下进行。在单模反应器CEM Discover微波合成器中进行微波照射反应。室温(RT)反应在环境温度(大约23℃)下进行。所有反应均通过薄层色谱法(TLC)在预涂覆的Merck 60F254硅胶板上进行监测，通过UV光(λ＝254，365nm)或通过使用碱性KMnO4溶液使斑点可视化。快速柱色谱法(FC)在SiO2 60(粒径0.040–0.063mm，230–400目)上进行。在25–50℃下通过旋转蒸发进行减压(真空)浓缩。将纯化的化合物在高真空下或在干燥器中进一步干燥。产率对应于纯化的化合物，并且不进行进一步优化。质子核磁共振(1H NMR)光谱在Bruker光谱仪上记录(在300、400或500MHz下操作)。碳NMR(13C NMR)光谱在Bruker光谱仪上记录(在400或500MHz下)。NMR化学位移(δppm)参考残留溶剂信号。1HNMR数据报告如下：化学位移，ppm；多重峰(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，m＝多重峰/复杂模式，td＝三重双峰，ddd＝双二重双峰，br＝宽峰信号)；耦合常数(J)以Hz为单位，积分。13C NMR光谱的数据以化学位移和偶合常数(如果适用)报告。高分辨率质谱(HRMS)在具有IonSense ID-CUBE DART源质谱仪的Thermo Fisher ScientificExactive Plus上，或在具有ACQUITY UPLC和自动进样器的Waters LCT Premier质谱仪上进行记录。
3-[(7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-基)氨基]-2-氟苯甲腈(JGK044)。
Figure GDA0002684671720001051
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝9.06–8.98(m,1H),8.69(s,1H),7.41(s,1H),7.39(br,1H),7.35–7.31(m,2H),7.30(s,1H),4.45–4.37ppm(m,4H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝155.63,153.63(d,J＝254.6Hz),153.04,149.94,146.80,144.76,128.60(d,J＝7.8Hz),127.48,126.58,125.31(d,J＝4.5Hz),114.56,113.80,110.45,105.83,101.30(d,J＝13.9Hz),64.70,64.51ppm。HRMS(ESI):m/z[M+H]+C17H12FN4O2 +计算值323.0939；实验值323.0927。
3-[(7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-基)氨基]苯甲腈(JGK045)。
Figure GDA0002684671720001052
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.68(s,1H),8.52(s,1H),8.46(t,J＝1.9Hz,1H),8.18(ddd,J＝8.2,2.3,1.2Hz,1H),8.08(s,1H),7.58(t,J＝7.9Hz,1H),7.53(dt,J＝7.6,1.4Hz,1H),7.22(s,1H),4.49–4.36ppm(m,4H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ＝156.24,152.69,149.31,146.15,143.80,140.52,129.87,126.35,125.96,124.15,118.93,112.66,111.23,109.96,108.30,64.52,64.19ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C17H13N4O2 +计算值305.1033；实验值305.1018。
(3-氯-2-氟苯基)7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-基氨基甲酸乙酯(JGK047)。
Figure GDA0002684671720001053
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.96(s,1H),7.483(s,1H),7.477(s,1H),7.37(dd,J＝8.1,6.7Hz,2H),7.08(td,J＝8.1,1.5Hz,1H),4.45–4.38(m,4H),4.27(q,J＝7.1Hz,2H),1.22ppm(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3):158.98,154.43(d,J＝250.7Hz),153.90,153.41,151.17,149.68,145.61,130.12,129.85(d,J＝12.4Hz),128.20,124.50(d,J＝5.1Hz),122.22(d,J＝16.8Hz),117.96,113.51,109.68(d,J＝2.0Hz),64.73,64.36,63.44,14.43.ppm。HRMS(ESI):m/z[M+H]+C19H16ClFN3O4 +计算值404.0808；实验值404.0800。
(±)-4-(3-溴-2-氟苯胺基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-7-醇((±)-JGK050)。
Figure GDA0002684671720001061
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.61(s,1H),8.34(s,1H),7.91(s,1H),7.72(d,J＝5.4Hz,1H),7.60(t,J＝7.1Hz,1H),7.55(t,J＝7.5Hz,1H),7.21(t,J＝8.2Hz,1H),7.19(s,1H),5.70–5.59(m,1H),4.27(d,J＝11.0Hz,1H),4.17ppm(d,J＝10.6Hz,1H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ＝157.18,153.38(d,J＝247.4Hz),153.13,148.78,146.14,141.92,130.12,128.05(d,J＝13.8Hz),127.78,125.45(d,J＝4.4Hz),111.95,109.87,108.71,108.55(d,J＝20.3Hz),88.63,67.23ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C16H12BrFN3O3 +计算值392.0041；实验值392.0030。
(±)-顺式-和(±)-反式-N-(3-溴-2-氟苯基)-7,8-二甲基-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺的非对映异构混合物((±)-顺式/反式-JGK051)。
Figure GDA0002684671720001062
1H NMR(500MHz,CDCl3；(±)-顺式/反式2:1):δ＝8.68(s,1H),8.68–8.63(m,1H),7.37(s,1H),7.35(br,1H),7.28(s,1H),7.28–7.24(m,1H),7.10(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.52–4.39(m,1.3H),4.09–3.98(m,0.7H),1.453(d,J＝6.1Hz,1.1H),1.451(d,J＝6.1Hz,1.1H),1.369(d,J＝6.6Hz,1.9H),1.368ppm(d,J＝6.6Hz,1.9H).13C NMR(126MHz,CDCl3；(±)-cis/trans 2:1):δ＝155.87,155.84,153.19,150.12(d,J＝242.5Hz),150.09(d,J＝242.2Hz),149.87,148.89,146.77,144.64,143.63,128.73(d,J＝10.0Hz),127.15,127.12,125.31(d,J＝4.7Hz),121.71,121.70,114.30,113.93,110.54,110.47,108.57(d,J＝19.4Hz),105.66,105.28ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C18H16BrFN3O2 +计算值404.0404；实验值404.0393。
(±)-顺式-N-(3-溴-2-氟苯基)-7,8-二甲基-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK052)。
Figure GDA0002684671720001071
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.68(s,1H),8.66(ddd,J＝8.6,7.4,1.6Hz,1H),7.38(s,1H),7.35(br,1H),7.28(s,1H),7.30–7.23(m,1H),7.10(td,J＝8.2,1.5Hz,1H),4.50–4.41(m,2H),1.369(d,J＝6.6Hz,3H),1.368ppm(d,J＝6.5Hz,3H)。13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝155.85,153.19,150.11(d,J＝242.1Hz),148.89,146.77,143.63,128.73(d,J＝10.2Hz),127.14,125.31(d,J＝4.7Hz),121.71,114.30,110.54,108.57(d,J＝19.5Hz),105.65,72.85,72.58,14.71,14.55ppm。HRMS(ESI):m/z[M+H]+C18H16BrFN3O2 +计算值404.0404；实验值404.0416。
N-(3-溴-4-氯-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK053)。
Figure GDA0002684671720001072
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.70(s,1H),8.35(s,1H),7.94(s,1H),7.61(dd,J＝8.8,7.7Hz,1H),7.55(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),7.20(s,1H),4.47–4.35ppm(m,4H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ＝157.03,154.14(d,J＝249.5Hz),153.01,149.36,146.08,143.74,130.75,127.77(d,J＝2.9Hz),126.80(d,J＝13.4Hz),125.37(d,J＝3.8Hz),112.50,110.15(d,J＝22.5Hz),109.66,108.39,64.51,64.14ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C16H11BrClFN3O2 +计算值409.9702；实验值409.9697。
N-(3,4-二溴-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK054)。
Figure GDA0002684671720001081
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.65(s,1H),8.34(s,1H),7.92(s,1H),7.67(d,J＝8.7Hz,1H),7.55(t,J＝8.2Hz,1H),7.20(s,1H),4.45–4.35ppm(m,4H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ＝156.95,153.98(d,J＝249.1Hz),152.99,149.35,146.09,143.74,128.50(d,J＝3.7Hz),128.14,127.21(d,J＝13.7Hz),120.96,112.51,112.33,109.68,108.36,64.51,64.14ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C16H11Br2FN3O2 +计算值453.9197；实验值453.9191。
N-(5-溴-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK055)。
Figure GDA0002684671720001082
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.99(dd,J＝7.3,2.5Hz,1H),8.72(s,1H),7.38(s,1H),7.36(br,1H),7.27(s,1H),7.16(ddd,J＝8.7,4.6,2.5Hz,1H),7.04(dd,J＝10.9,8.7Hz,1H),4.44–4.36ppm(m,4H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝155.59,153.35,152.16(d,J＝243.1Hz),149.69,146.67,144.52,128.75(d,J＝10.5Hz),126.16(d,J＝7.6Hz),125.06,117.19(d,J＝3.4Hz),116.20(d,J＝20.9Hz),114.52,110.48,105.85,64.68,64.50ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C16H12BrFN3O2 +计算值376.0091；实验值376.0077。
N-(3-溴-2,6-二氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK056)。
Figure GDA0002684671720001091
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.60(s,1H),8.32(s,1H),7.94(s,1H),7.74(td,J＝8.1,5.5Hz,1H),7.28(t,J＝9.3Hz,1H),7.21(s,1H),4.44–4.38ppm(m,4H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ＝157.78(dd,J＝248.8,3.3Hz),157.37,155.01(dd,J＝247.9,4.9Hz),153.08,149.47,146.04,143.86,130.76(d,J＝9.3Hz),117.30(t,J＝17.5Hz),113.30(dd,J＝21.8,3.0Hz),112.56,109.45,108.28,103.55(dd,J＝20.4,3.6Hz),64.52,64.14ppm。HRMS(ESI):m/z[M+H]+C16H11BrF2N3O2 +计算值393.9997；实验值394.0008。
N-(3-溴-2,4-二氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK057)。
Figure GDA0002684671720001092
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.64(s,1H),8.51(td,J＝9.0,5.6Hz,1H),7.38(s,1H),7.29(s,1H),7.23(br,1H),7.04(ddd,J＝9.2,7.8,2.1Hz,1H),4.45–4.37ppm(m,4H)。13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝156.10,155.80(dd,J＝246.6,3.5Hz),153.28,151.25(dd,J＝245.1,4.0Hz),149.74,146.56,144.53,124.39(dd,J＝10.8,3.4Hz),122.72(dd,J＝8.3,1.8Hz),114.42,111.49(dd,J＝22.5,3.9Hz),110.34,105.98,97.86(dd,J＝25.7,22.9Hz),64.69,64.50ppm。HRMS(ESI):m/z[M+H]+C16H11BrF2N3O2 +计算值393.9997；实验值394.0013。
N-(3-溴-5-氯-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK058)。
Figure GDA0002684671720001101
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.88(dd,J＝6.6,2.6Hz,1H),8.73(s,1H),7.41(s,1H),7.37(br,1H),7.26(s,1H),7.28–7.23(m,1H),4.44–4.39ppm(m,4H)。13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝155.45,153.13,149.88,148.60(d,J＝241.7Hz),146.76,144.72,130.30(d,J＝4.4Hz),129.26(d,J＝10.8Hz),126.08,121.21,114.60,110.49,108.68(d,J＝20.9Hz),105.71,64.70,64.52ppm。HRMS(ESI):m/z[M+H]+C16H11BrClFN3O2 +计算值409.9702；实验值409.9713。
(±)-反式-N-(3-溴-2-氟苯基)-7,8-二甲基-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK059)。
Figure GDA0002684671720001102
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.68(s,1H),8.66(ddd,J＝8.6,7.3,1.6Hz,1H),7.376(s,1H),7.375(br,1H),7.28(s,1H),7.28–7.24(m,1H),7.10(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),4.08–3.98(m,2H),1.451(d,J＝6.1Hz,3H),1.448ppm(d,J＝6.1Hz,3H)。13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝155.90,153.12,150.12(d,J＝242.5Hz),149.90,146.59,144.65,128.70(d,J＝10.2Hz),127.18,125.30(d,J＝4.5Hz),121.74,113.84,110.43,108.57(d,J＝19.2Hz),105.31,75.31,75.05,17.23,17.20ppm。HRMS(ESI):m/z[M+H]+C18H16BrFN3O2 +计算值404.0404；实验值404.0405。
N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK060)。
Figure GDA0002684671720001111
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.67(s,1H),8.59(t,J＝8.6Hz,1H),7.40(s,1H),7.38(br,1H),7.33(dd,J＝9.1,2.1Hz,1H),7.31(s,1H),4.45–4.38ppm(m,4H)。13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝155.84,153.08,149.98(d,J＝246.3Hz),149.88,146.42,144.67,127.55,127.19(d,J＝10.0Hz),125.30(d,J＝4.1Hz),121.05,120.47(d,J＝18.2Hz),114.36,110.43,105.97,64.71,64.51ppm。HRMS(ESI):m/z[M+H]+C16H11Cl2FN3O2 +计算值366.0207；实验值366.0207。
N-(3-溴-2,5-二氟苯基)-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺(JGK061)。
Figure GDA0002684671720001112
1H NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝9.65(s,1H),8.40(s,1H),7.93(s,1H),7.63–7.54(m,2H),7.21(s,1H),4.45–4.37ppm(m,4H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6):δ＝157.29(d,J＝243.5Hz),156.84,152.93,149.97(d,J＝242.9Hz),149.43,146.16,143.81,129.22–128.44(m),116.30(d,J＝26.7Hz),113.99(d,J＝25.7Hz),112.53,109.73,108.76(dd,J＝22.5,12.5Hz),108.33,64.52,64.15ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C16H11BrF2N3O2 +计算值393.9997；实验值393.9988。
(±)-N-(3-溴-2-氟苯基)-7-乙烯基-7,8-二氢[1,4]二噁并[2,3-g]喹唑啉-4-胺((±)-JGK062)。
Figure GDA0002684671720001121
1H NMR(500MHz,CDCl3):δ＝8.68(s,1H),8.65(ddd,J＝8.2,7.3,1.5Hz,1H),7.40(s,1H),7.37(br,1H),7.35(s,1H),7.27(ddd,J＝8.0,6.4,1.5Hz,1H),7.10(td,J＝8.2,1.6Hz,1H),5.95(ddd,J＝17.3,10.7,5.8Hz,1H),5.60(dt,J＝17.3,1.2Hz,1H),5.48(dt,J＝10.7,1.1Hz,1H),4.82–4.74(m,1H),4.42(dd,J＝11.5,2.5Hz,1H),4.09ppm(dd,J＝11.6,8.1Hz,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ＝155.90,153.38,150.14(d,J＝242.4Hz),149.12,146.70,144.12,131.48,128.64(d,J＝10.3Hz),127.24,125.30(d,J＝4.7Hz),121.76,120.43,114.29,110.69,108.58(d,J＝19.3Hz),106.06,74.03,67.84ppm。HRMS(DART):m/z[M+H]+C18H14BrFN3O2 +计算值402.0248；实验值402.0233。
实施例4：示例性化合物的生物活性和测定方案
使用EGFR激酶系统(Promega#V3831)进行无细胞EGFR激酶测定。将从250nM到0.03052nM的以2倍稀释的13个浓度、无药物对照和无酶对照以每个反应一式两份用于25ngEGFR酶。ADP-Glo激酶测定(Promega#V6930)用于在存在抑制剂的情况下测量EGFR活性。
GI50测定是使用患者来源的胶质母细胞瘤细胞进行的。将从40,000nM到9.77nM(对于GBM系)或从4,000nM到0.977nM(对于肺癌系(HK031))的以2倍稀释的13个浓度一式四份铺板在384孔板上，每孔1500个细胞。将细胞孵育3天，并且然后通过Cell Titer Glo(Promega#G7570)评估增殖。作为参考，厄洛替尼展示642nM(HK301)和2788nM(GBM39)的GI50。
对8-10周龄的雄性CD-1小鼠进行了药代动力学研究。如所指示的一式两份向小鼠给药。在所述时间点，通过眼眶后出血获得全血，并收获脑组织。将血液样品离心以获得血浆，并将脑组织洗涤并均化。用乙腈萃取样品，并使用speed-vac干燥上清液。将干燥的样品溶解在50:50:0.1的乙腈:水:甲酸中，并且在Agilent 6400系列三重四极杆LC/MS上进行定量。
表3：本发明的示例性化合物的活性
Figure GDA0002684671720001131
Figure GDA0002684671720001141
Figure GDA0002684671720001151
Figure GDA0002684671720001161
Figure GDA0002684671720001171
Figure GDA0002684671720001181
Figure GDA0002684671720001191
Figure GDA0002684671720001201
Figure GDA0002684671720001211
实施例5：厄洛替尼和本公开的示例性化合物的蛋白质结合
下表4中示出了厄洛替尼和本公开的若干示例性化合物的蛋白质结合。Fu是指“未结合分数”。
Figure GDA0002684671720001212
实施例6：EGFRi代谢反应者和无反应者的分类
表征了在19个患者来源的GBM细胞系中由于急性EGFR抑制而导致的葡萄糖消耗变化。将细胞作为胶质瘤球在补充无血清培养基中培养，与基于血清的培养条件相比，其保留了患者肿瘤的许多分子特征。用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFRi)厄洛替尼进行的处理鉴定了GBM的一个子集，其放射性标记的葡萄糖摄取(18F-FDG)因EGFR抑制而显著降低；此后称为“代谢反应者”(图21A和图27A)。使用siRNA使EGFR沉默证实了葡萄糖摄取的减少不是由于厄洛替尼的脱靶作用(图27B，27C)。在EGFRi处理的细胞中18F-FDG摄取减少与乳酸产生、葡萄糖消耗和细胞外酸化率(ECAR)的降低相关联，但是谷氨酰胺水平保持不变(图21B和图27D-G)。最后，降低的葡萄糖利用与RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR信号传导的扰动有关-它们各自可以调节GBM和其他癌症中的葡萄糖代谢(图28A)。
相比之下，在所有“无反应者”GBM中(即，18F-FDG摄取没有因EGFRi或siRNA而变化)(图21A和图27B，27C)，未观察到葡萄糖消耗、乳酸产生和ECAR的变化，尽管EGFR被强烈抑制(图21B，图27D-G和图28B)。此外，RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR信号传导在这些细胞中没有受到较大影响(图28B)。值得注意的是，尽管所有代谢反应者的EGFR都发生改变(拷贝数获得，突变)，但是没有代谢反应的6个GBM系也含有EGFR突变和/或拷贝数获得(图29A，29B)。综上所述，这些数据说明了两个关键点。首先，对EGFR的急性抑制在原代GBM细胞的子集中会迅速降低葡萄糖利用，其次，EGFR的基因改变不能单独预测哪些GBM对EGFRi具有代谢反应。
实施例7：EGFRi代谢反应者被引发细胞凋亡
葡萄糖代谢的扰动可以诱导促细胞凋亡因子的表达并刺激内在细胞凋亡，这表明对EGFRi的反应中葡萄糖摄取减少会刺激内在细胞凋亡途径。实际上，急性厄洛替尼处理仅在代谢反应者培养物中促进促细胞凋亡的仅BH3蛋白BIM和PUMA的表达(图30A)。然而，膜联蛋白V染色揭示，在厄洛替尼暴露72小时后，代谢反应者仅具有中度(～17％)的尽管与无反应者相比(～3％)明显更高的细胞凋亡(图21C)。
尽管明显诱导了促细胞凋亡因子，但低水平的细胞凋亡使得发明人怀疑用EGFRi扰动葡萄糖摄取是否“引发”GBM细胞凋亡；因此增加了细胞凋亡的倾向而没有诱导显著的细胞死亡。为了测试这一点，发明人用厄洛替尼处理代谢反应者和无反应者24小时，并进行了动态BH3分析，以定量细胞凋亡引发的变化(图30B)。使用多种BH3肽(例如，BIM、BID和PUMA)，我们在用厄洛替尼处理的代谢反应者中观察到细胞凋亡引发的显著增加-通过细胞色素c释放相对于媒介物的变化所确定(图21D–暗灰色条)。重要的是，代谢反应者的引发显著高于无反应者的引发(图21D–浅灰色条)，这支持了葡萄糖摄取因EGFRi的降低触发GBM中的细胞凋亡引发的假定。
发明人通过检查挽救葡萄糖消耗是否减轻这些作用，测试了葡萄糖摄取因EGFRi的减少否是细胞凋亡引发所需的。为了测试这一点，使葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和3(GLUT3)在两个代谢反应者(HK301和GBM39)中异位表达。GLUT1和GLUT3(GLUT1/3)的强制表达在两种细胞系中挽救了EGFRi介导的葡萄糖摄取和乳酸产生的降低(图21E和图31A-C)，并且重要的是，明显抑制了对EGFRi的反应中的细胞凋亡引发(图21F)。总体而言，这些数据表明，EGFRi介导的葡萄糖消耗抑制作用尽管不足以诱导显著的细胞死亡，但降低细胞凋亡阈值，从而可能使GBM细胞易受利用此引发状态的剂的影响。
实施例8：细胞质p53是通过EGFRi进行的细胞凋亡引发所需要的
研究了GBM通过EGFRi被引发细胞凋亡的机制。对癌基因驱动的葡萄糖代谢的抑制使GBM细胞协同地对细胞质p53依赖性细胞凋亡易感。通过靶向致癌信号传导(例如，EGFRi)使GBM中的葡萄糖代谢通量降低，导致细胞质p53参与内在细胞凋亡途径(“引发”)。然而，Bcl-xL阻断细胞质p53介导的细胞死亡。药理学上的p53稳定克服了这种细胞凋亡阻断，结合靶向GBM中致癌基因驱动的葡萄糖代谢导致协同致死性。
在处于引发状态的细胞中，抗细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白(例如，Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1)大量负载有促细胞凋亡的BH3蛋白(例如，BIM、BID、PUMA、BAD、NOXA、HRK)；因此，细胞的存活依赖于这些相互作用。已知肿瘤抑制蛋白p53上调促细胞凋亡蛋白，其随后需要与抗细胞凋亡Bcl-2蛋白结合以防止细胞死亡。为了检查EGFRi诱导的引发是否需要p53，我们在两个代谢反应者(HK301和HK336，图22A)中用CRISPR/CAS-9使p53沉默(下文称为p53KO)。尽管在p53KO细胞中葡萄糖消耗由于EGFRi的变化未受影响(图32A)，但BH3分析揭示p53KO在HK301和HK336细胞两者中均几乎消除了厄洛替尼诱导的细胞凋亡引发(图22B)。
由于已显示在葡萄糖限制下p53转录活性增强，因此我们进行了研究以确定p53介导的转录是否被EGFRi诱导。然而，厄洛替尼没有增加p53调节的基因(例如，p21、MDM2、PIG3、TIGAR)的表达(图32B)，也没有在HK301代谢反应者细胞中诱导p53-荧光素酶报告基因活性(图32C)。这些数据表明，虽然p53是通过EGFRi进行引发所必需的，但其转录活性可能不是必需的。
除p53的充分描述的核功能以外，p53还可以定位在细胞质中，在其中它可以直接参与内在细胞凋亡途径。为了评估细胞质p53对于通过EGFRi进行的细胞凋亡引发是否重要，我们将具有缺陷的核定位信号的p53突变体(p53cyto)稳定引入到HK301和HK336 p53KO胶质瘤球中。如所预期的，p53cyto被表达(图22C和图32D)，限于细胞质(图22D和图32E)并且没有转录活性(图22E和图32F)。相反，野生型p53(p53wt)在HK301和HK336 p53KO细胞中的重建展示与亲代细胞相似的定位，并挽救了p53调节的基因的转录(图22C-E和图32E-G)。明显地，p53cyto的稳定引入在HK301和HK336 p53KO细胞中用厄洛替尼显著地将引发恢复到与p53wt相当的水平(图22F和图32G)，这表明p53的细胞质功能是EGFRi介导的引发所必需的。为支持这一点，将转录活性的(图2622G)但核限制的p53突变体(p53NES)引入到HK301 p53KO细胞未能诱导EGFRi介导的细胞凋亡引发(图22G，22H和图32H)。最后，pifithrin-μ(PFTμ)对细胞质p53活性的药理学抑制明显降低了通过厄洛替尼进行的引发(图32I)。总体而言，这些结果显示在GBM中细胞质p53参与EGFRi后的内在细胞凋亡机制。
先前的研究表明，人肿瘤衍生的p53突变体–特别是在DNA结合结构域中的那些突变体–除反转录缺陷以外，还具有减弱的细胞质功能。因此，发明人测试了这些“热点”p53突变体中的两个R175H或R273H在HK301 p53KO中的稳定表达是否降低EGFRi介导的引发(图32H)。如所预期的，两种突变体都缺乏转录能力(图22G)，并且与降低的细胞质活性一致，不能用EGFRi进行细胞凋亡引发(图22H)。因此，与先前的发现一致，p53的DNA结合结构域中的致癌突变导致“双重攻击”，从而取消了反式激活和细胞质功能–后者与通过EGFRi进行的细胞凋亡引发有关。
实施例9：抑制EGFR驱动的葡萄糖摄取产生可利用的Bcl-xL依赖性
Bcl-xL可以螯合细胞质p53，并阻止p53介导的细胞凋亡；因此产生了引发的细胞凋亡状态以及存活对Bcl-xL的依赖性。实际上，BH3分析揭示了在EGFRi代谢反应者中细胞存活对Bcl-xL的依赖性(图33A)。因此，我们假设用EGFRi降低葡萄糖消耗可能导致Bcl-xL螯合细胞质p53。为了对此进行研究，我们进行了共免疫沉淀，以检查在反应者(n＝2)和无反应者(n＝2)两者中对EGFRi的反应中的p53-Bcl-xL相互作用的动力学。重要的是，我们在代谢反应者(图23A)而非无反应者(图23B)中观察到在厄洛替尼处理后明显提高Bcl-xL和p53相互作用。这表明抑制EGFR依赖性葡萄糖消耗导致Bcl-xL螯合p53。与这种解释一致，GLUT1/3的异位表达拯救了EGFRi介导的葡萄糖摄取减少和细胞凋亡引发，阻止了p53与Bcl-xL的缔和(图23C和图33B)。这些发现强烈表明，EGFRi介导的葡萄糖摄取抑制通过促进细胞质p53与Bcl-xL之间的相互作用而引发GBM细胞的细胞凋亡。
从Bcl-xL释放p53使p53能够直接激活BAX，导致细胞色素c释放和细胞死亡。一旦我们认识到在代谢反应者中对EGFRi的反应中的Bcl-xL与p53之间的结合增加，我们就怀疑p53从Bcl-xL中的移位是否引起细胞凋亡。为了测试这一点，我们用厄洛替尼和特定的Bcl-xL抑制剂WEHI-539处理代谢反应者(HK301)。在厄洛替尼处理下，WEHI-539的添加破坏了Bcl-xL与p53的缔合(图23D)，导致HK301和GBM39细胞(代谢反应者)中的协同致死性(图23E)。值得注意的是，细胞质p53足以在EGFRi代谢反应者细胞中产生组合作用(图33C)。然而，WEHI-539并未在厄洛替尼处理的无反应者(HK393)中增强细胞凋亡，这表明EGFRi使葡萄糖摄取降低以及随后p53与Bcl-xL之间的缔合对于产生存活对Bcl-xL的依赖性是必需的(图33E)。为了支持这一点，GLUT1/3的强制表达与药物组合显著减轻了细胞死亡(图23F和图33D)。总之，这些观察表明，Bcl-xL通过螯合细胞质p53降低对EGFRi介导的葡萄糖摄取抑制的反应中的GBM细胞死亡(图32G)。
实施例10：EGFR和p53的组合靶向在EGFRi代谢反应者中具有协同作用
机理研究揭示可能依赖于功能性p53的EGFR驱动的GBM中的潜在治疗机会。尽管p53信号传导轴是GBM中改变的三个核心途径之一，但TCGA GBM数据集的分析表明p53突变与EGFR中的改变是互斥的(图28A和28B)。相反，在具有EGFR突变或获得的患者中，可以通过MDM2的扩增和/或MDM2的负调节子p14 ARF在CDKN2A基因座处的缺失来抑制p53途径。鉴于这些关系，以及在EGFRi降低的葡萄糖摄取下引发对p53的需求，我们假设通过MDM2抑制来稳定p53可能具有与Bcl-xL拮抗作用相似的治疗作用。使用nutlin(一种广泛表征的MDM2抑制剂)，我们发现在代谢反应者胶质瘤球中与厄洛替尼配对的明显的协同致死性。超过90％的HK301细胞因厄洛替尼和nutlin组合经历了细胞凋亡(图24C)。值得注意的是，我们在代谢无反应者中未观察到这些药物之间的协同作用(GS017，图24C)。然后，我们在我们的一组原代GBM细胞(所有p53野生型)中测试了此组合，并发现仅在对EGFRi具有代谢反应的GBM中具有协同致死性(图24D和图34A)。EGFR的基因敲低仅在代谢反应者中证实了协同作用(图34B)。重要的是，GLUT1/3的强制表达与厄洛替尼和nutlin组合时显著降低了BAX寡聚化、细胞色素c释放和细胞凋亡(图24E和图34C)，这支持了以下概念：EGFRi对葡萄糖代谢的抑制是厄洛替尼和nutlin组合的协同作用所必需的。
然后研究了p53在厄洛替尼和nutlin组合引起的细胞死亡中的作用。如所预期的，在两个EGFRi代谢反应者(HK301和HK336)中CRISPR/CAS-9对p53的靶向完全减轻了对药物组合的敏感性(图24F)。同样，Bcl-xL的异位表达与组合处理一起明显抑制了细胞死亡，这与Bcl-xL在拮抗p53介导的细胞凋亡中的关键功能相一致(图34D)。此外，类似于Bcl-xL抑制(例如，WEHI-539)的结果，在厄洛替尼处理下，nutlin的添加使p53从Bcl-xL中释放(图24G)。这些数据与先前的观察一致，即p53稳定可以刺激细胞质p53介导的细胞凋亡。为了支持在代谢反应者中EGFRi和nutlin诱导的细胞凋亡需要细胞质p53活性的观点，用PFTμ阻断细胞质p53活性显著降低了组合的协同作用(图34E)，而含有核限制的p53突变体p53NES的HK301细胞不能用厄洛替尼和nutlin增强细胞凋亡(图34F)。最后，同时具有反式激活和细胞质缺陷的癌症“热点”突变体R175H和R273H对药物组合完全不敏感(图34F)。
尽管需要细胞质p53与药物组合一起促进细胞死亡，但我们观察到在某些情况下，为了与nutlin一起进行最佳协同细胞凋亡，需要p53的转录依赖性和非依赖性功能(图34F)。这些结果与以下报告一致：p53的转录非依赖性功能可以单独进行内在细胞凋亡，而在其他情况下，可能需要其转录依赖性功能来刺激细胞质p53介导的细胞杀伤。总体而言，本文所述的结果显示，EGFR驱动的葡萄糖代谢和p53的组合靶向可以诱导原发性GBM中明显的协同细胞死亡；这取决于p53的细胞质功能。
实施例11：葡萄糖代谢的调节引发EGFRi无反应者的p53介导的细胞死亡
前述数据使发明人提出了一种模型，其中EGFRi介导的葡萄糖代谢降低引发细胞凋亡机制，从而导致与促细胞凋亡刺激(诸如p53激活)的协同作用。协同作用在于通过EGFR抑制剂诱导细胞应激、葡萄糖摄取的减少和引发细胞凋亡以及BCL-2的拮抗剂使p53的稳定之间。EGFR抑制可以迅速降低细胞应激中的糖酵解。这产生了肿瘤特异性易损性，其中内在细胞凋亡可以通过以下显著增强：1)p53的激活(例如像，通过nutlin、类似物或本文所述的其他物质)和2)BCL-2的抑制(通过本文所述的若干剂中的任一种，例如像ABT-263(纳维克拉)。
此模型的逻辑预测是，对葡萄糖代谢的直接抑制应表征EGFRi的作用。与此相一致，在HK301细胞(EGFRi代谢反应者)中，添加葡萄糖代谢抑制剂2-脱氧葡萄糖(2DG)刺激细胞凋亡引发、p53与Bcl-xL的结合以及与nutlin的协同作用(图40A，40B和40D)。有趣的是，在HK301胶质瘤球中，用寡霉素(复合V/ATP合酶)或鱼藤酮(复合物I)抑制氧化磷酸化与nutlin处理没有协同作用(图35C和35D)。因此，仅葡萄糖代谢通量的减少而氧化代谢未减少似乎足以对p53激活产生协同敏感性。
这促使发明人考虑在EGFRi无反应者中调节葡萄糖消耗是否导致类似的p53依赖性易损性。为了研究这一点，他们测试了用2DG或通过靶向PI3K(葡萄糖代谢的一个良好表征的驱动因子)直接抑制葡萄糖摄取是否在两个EGFRi代谢无反应者中引起细胞凋亡引发(图25A)。与厄洛替尼处理相反，在HK393和HK254细胞中，用匹替利司对PI3K的急性抑制消除了PI3K-AKT-mTOR信号传导(图35E)，并显著减少了18-FDG摄取(图25B)。用匹替利司降低葡萄糖消耗与显著更高的细胞凋亡引发相关联，并且如所预期的，2DG完全反映了这些作用(图25B和C)。因此，EGFRi代谢无反应者可以在抑制葡萄糖摄取后引发细胞凋亡。重要的是，在HK393中CRISPR/CAS-9对p53的靶向显著抑制了2DG或匹替利司介导的引发。(图25D)。此外，p53依赖性引发与Bcl-xL和p53结合增强相关联，这表明Bcl-xL螯合p53阻断细胞凋亡(图25E和图35F)。与此解释一致，将2DG或匹替利司与nutlin组合在EGFRi无反应者细胞中引起显著的p53依赖性协同致死性(图25F和图25G)。综上所述，这些数据表明，对葡萄糖代谢的急性抑制直接或与靶向疗法一起促进GBM中p53依赖性细胞凋亡引发；这为增强的细胞杀伤创建可靶向的易损性。
实施例12：用于体内靶向GBM的组合治疗策略和非侵入性生物标记物
细胞培养中获得的结果显示，癌基因驱动的葡萄糖代谢和p53的组合靶向在原发性GBM中具有协同活性。这使我们研究这种方法在原位GBM异种移植物模型中是否有效。对于这些研究，我们采用了有效的MDM2抑制剂依达奴林，其目前处于许多恶性肿瘤的临床试验中。鉴于依达奴林的CNS渗透的不确定性，我们首先证明了依达奴林可以在具有完整血脑屏障(脑:血浆，0.35)的小鼠的大脑中积累并在原位荷瘤小鼠中稳定p53(图41A和图41B)。
接下来，由于癌基因抑制对葡萄糖代谢的扰动是对p53激活产生协同敏感性所需要的，因此我们认为，EGFRi施用后体内葡萄糖摄取的快速降低(如通过18F-FDG PET所测量)可以充当厄洛替尼+依达奴林组合处理的治疗功效的非侵入性预测生物标记物(图26A)。我们观察到，在EGFR-代谢反应者胶质瘤球(GBM39)的原位异种移植物中，急性厄洛替尼处理(75mg/kg)快速降低18F-FDG摄取(厄洛替尼施用后15小时)(图26B和图36C)。在单独的小鼠组中，他们测试了个体药物以及每日厄洛替尼(75mg/kg)处理和依达奴林(50mg/kg)的组合。相对于单一剂对照，我们在GBM39颅内荷瘤小鼠中观察到了由分泌的高斯荧光素酶确定的协同生长抑制作用，且毒性最小(图26B和图36D)。相比之下，无代谢反应者(HK393)的原位异种移植物没有因急性EGFRi而示出18F-FDG摄取的变化(图26D和图36C)，也没有与厄洛替尼和依达奴林组合的协同活性(图26E)。因此，用于测量因EGFRi的葡萄糖摄取的快速变化的非侵入性18F-FDG PET有效预测对组合厄洛替尼和依达奴林的随后协同敏感性。
最后，我们在两个EGFRi代谢反应者(GBM39和HK336)或两个无反应者(HK393和GS025)的原位异种移植物中评估了药物组合对总体存活率的影响。所有肿瘤均为p53野生型(图29A)。在发现肿瘤生长的证据(通过高斯荧光素酶确定)后，将小鼠用媒介物、厄洛替尼、依达奴林或其组合处理长达25天。所述药物组合仅在EGFRi代谢反应者GBM肿瘤中导致存活率明显增加(图30F-I)。综上所述，这些数据显示在p53野生型GBM原位异种移植物的子集中，EGFR和p53的组合靶向协同抑制了生长并延长了存活。重要的是，18F-FDG PET作为对这种新的组合治疗策略的敏感性的非侵入性预测生物标记物是有价值的。
实施例13：用2DG或细胞松弛素B直接抑制糖酵解
我们测试了用己糖激酶抑制剂(2DG)和葡萄糖转运蛋白抑制剂(细胞松弛素B)直接抑制糖酵解如何影响通过nutlin进行的p53激活。图37中所示的结果表明，低葡萄糖(0.25mM)与用纳维克拉或nutlin进行的BCL-xL抑制导致协同细胞杀伤作用。在用糖酵解抑制剂2DG或细胞松弛素B作为单一剂或与p53激活剂nutlin组合处理72小时的胶质瘤球样品中，使用膜联蛋白V染色测量细胞死亡。通过在低葡萄糖条件下(0.25mM)培养胶质瘤球并将它们用nutlin或纳维克拉(ABT-263)处理72小时来重现相同的作用。
实施例14：实验过程
小鼠
6-8周龄的雌性NOD scidγ(NSG)购自加州大学洛杉矶分校(UCLA)医疗中心动物养殖基地。6-8周龄的雄性CD-1小鼠购自Charles River。将所有小鼠保持在位于UCLA的AAALAC批准的实验动物部门(DLAM)的动物基地处的规定的不含病原体群体的条件下。所有动物实验均在UCLA动物资源监督办公室(OARO)的批准下进行。
患者来源的GBM细胞
使用UCLA机构审查委员会(IRB)协议：10-00065，通过明确的知情同意，获得了所有衍生GBM细胞培养物的患者组织。如前所述12，将原代GBM细胞建立并维持在由DMEM/F12(Gibco)、B27(Invitrogen)、青霉素-链霉素(Invitrogen)和补充肝素(5μg/mL，Sigma)、EGF(50ng/mL，Sigma)和FGF(20ng/mL，Sigma)的Glutamax(Invitrogen)组成的胶质瘤球条件下。所有细胞均在37℃，20％O2和5％CO2下生长，并使用可商购的试剂盒(MycoAlert，Lonza)进行常规监测，并对支原体的存在测试为阴性。实验时，使用的大多数HK系传代20-30次(HK385 p8，HK336 p15除外)，而GS和GBM39系传代少于10次。所有细胞均通过短串联重复序列(STR)分析进行鉴别。
试剂和抗体
将以下来源的化学抑制剂溶解在DMSO中以进行体外研究：厄洛替尼(Chemietek)、Nutlin-3A(Selleck Chemicals)、WEHI-539(APExBIO)、匹替利司(Selleck Chemicals)、寡霉素(Sigma)、鱼藤酮(Sigma)。使用前将2DG(Sigma)新鲜溶解在培养基中。用于免疫印迹的抗体获自下列来源：β-肌动蛋白(Cell signaling，3700)、微管蛋白(Cell signaling，3873)、p-EGFR Y1086(Thermo Fischer Scientific，36-9700)、t-EGFR(Millipore，06-847)、t-AKT(Cell Signaling，4685)、p-AKT T308(Cell Signaling，13038)、p-AKT S473(Cell Signaling，4060)、t-ERK(Cell Signaling，4695)、p-ERK T202/Y204(CellSignaling，4370)、t-S6(Cell Signaling，2217)、p-S6 S235/236(Cell Signaling，4858)、t-4EBP1(Cell Signaling，9644)、p-4EBP1 S65(Cell Signaling 9451)、Glut3(Abcam，ab15311)、Glut1(Millipore，07-1401)、p53(Santa Cruz Biotechnology，SC-126)、BAX(Cell Signaling，5023)、BIM(Cell Signaling，2933)、Bcl-2(Cell Signaling，2870)、Bcl-xL(Cell Signaling，2764)、Mcl-1(Cell Signaling，5453)、细胞色素c(CellSignaling，4272)和裂解半胱天冬酶-3(Cell Signaling，9661)。用于免疫沉淀的抗体获自下列来源：p53(Cell Signaling，12450)和Bcl-xL(Cell Signaling，2764)。二抗获自下列来源：抗兔IgG HRP连接(Cell Signaling，7074)和抗小鼠IgG HRP连接(Cell Signaling，7076)。所有免疫印迹抗体均以1:1000的稀释度使用，但β-肌动蛋白和微管蛋白以1:10,000使用。免疫沉淀抗体根据制造商的说明书进行稀释(对于p53为1:200并且对于Bcl-xL为1:100)。二抗以1:5000的稀释度使用。
18F-氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)摄取测定。
将细胞以5×104个细胞/ml铺板，并用指定的药物处理指定的时间点。经过适当的处理后，收集细胞并将其重悬于含有18F-FDG(放射性1μCi/mL)的无葡萄糖DMEM/F12(USBiological)中。将细胞在37℃下孵育1小时，然后用冰冷的PBS洗涤3次。然后使用γ计数器测量每个样品的放射性。
葡萄糖、谷氨酰胺和乳酸的测量
使用Nova Biomedical BioProfile Basic分析仪测量细胞葡萄糖消耗和乳酸产生。简而言之，将细胞以1x 105个细胞/ml铺板在2mL胶质瘤球条件和适当药物条件(n＝5)中。药物处理后12小时，从每个样品中取出1ml培养基，并在Nova BioProfile分析仪中进行分析。将测量值归一化到细胞数。
膜联蛋白V细胞凋亡测定
收集细胞，并根据制造商的方案(BD Biosciences)分析膜联蛋白V和PI染色。简而言之，将细胞以5x 104个细胞/ml铺板并用适当的药物处理。在指示的时间点后，收集细胞，用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，并用膜联蛋白V和PI染色15分钟。然后使用BD LSRII流式细胞仪分析样品。
免疫印迹
收集细胞，并在含有Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo Fischer Scientific)的RIPA缓冲液(Boston BioProducts)中进行裂解。将裂解液在4℃下以14,000xg离心15min。然后将蛋白质样品在NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)和NuPAGE样品还原剂(Invitrogen)中煮沸，并在12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上使用SDS-PAGE分离，并转移到硝酸纤维素膜(GE Healthcare)上。按照抗体制造商的说明书和如前所述进行免疫印迹。膜是使用SuperSignal系统(Thermo Fischer Scientific)开发的。
免疫沉淀
收集细胞，用PBS洗涤一次，并在4℃下在IP裂解缓冲液(25mM Tris-HCL pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40、5％甘油)中孵育15分钟。然后将300-500μg的每个样品在Protein A/G Plus琼脂糖珠(Thermo Fischer Scientific)中预澄清一小时。预澄清后，然后根据制造商的说明书和如前所述，将样品与抗体-珠缀合物一起孵育过夜。然后将样品以1000g离心1min，然后将珠粒用500μL IP裂解缓冲液洗涤5次。通过在95℃下于2x LDS样品缓冲液(Invitrogen)中煮沸5分钟，从珠粒上洗脱蛋白质。如前所述通过免疫印迹分析样品。免疫沉淀抗体根据制造商的说明书进行稀释(对于p53为1:200并且对于Bcl-xL为1:100)。
动态BH3分析
首先用TrypLE(Gibco)将GBM胶质瘤球分离为单细胞悬浮液，并重悬浮于MEB缓冲液(150mM甘露醇，10mM HEPES-KOH，50mM KCl，0.02mM EGTA，0.02mM EDTA，0.1％BSA，5mM琥珀酸盐)中。将50μl细胞悬浮液(3×104个细胞/孔)铺板在96孔板中的装有50μL含有0.002％毛地黄皂苷和指定肽的MEB缓冲液的孔中。然后将板在25℃下孵育50min。然后将细胞用4％多聚甲醛固定10min，接着用N2缓冲液(1.7M Tris，1.25M甘氨酸pH 9.1)中和5min。将样品用20μL含有DAPI和抗细胞色素c(BioLegend)的染色溶液(10％BSA，PBS中的2％Tween 20)染色过夜。第二天，使用BD LSRII流式细胞仪对细胞色素c释放进行定量。将测量值归一化到不促进细胞色素c释放的适当对照(DMSO和无活性PUMA2A肽)。Δ引发是指媒介物处理的细胞与药物处理的细胞之间的细胞色素c释放量的差值。
BAX低聚化
用指定药物处理7.5x 105个细胞。处理24小时后，收集细胞，用冰冷的PBS洗涤一次，并重悬浮于在PBS中的1mM双马来酰亚胺己烷(BMH)中30min。然后如上所述，将细胞沉淀并裂解以用于免疫印迹。
细胞色素c检测
将500万个细胞以1x105个细胞/mL的浓度铺板，并用指定的药物处理。处理24小时后，收集细胞，用冰冷的PBS洗涤一次。然后使用线粒体分离试剂盒(Thermo FischerScientific，89874)进行亚细胞分级。对细胞质和线粒体级分两者进行免疫印迹，并使用细胞色素c抗体(Cell Signaling，4272)以1:1000的稀释度检测细胞色素c。
小鼠异种移植物研究
对于颅内实验，将GBM39、HK336、HK393和GS025细胞(每次注射4×105个细胞)注射到雌性NSG小鼠(6-8周龄)的右脑纹状体中。注射坐标为前囟外侧2mm和后部1mm处，深度为2mm。通过分泌的高斯荧光素酶监测肿瘤负荷，并在连续三次生长测量后，将小鼠随机分为四个处理组，由适当的媒介物、75mg/kg厄洛替尼、50mg/kg依达奴林或两种药物的组合组成。媒介物由0.5％甲基纤维素水溶液(其用于溶解厄洛替尼)以及一种从罗氏公司获得的专有制剂(其用于溶解依达奴林)组成。每周两次通过分泌的高斯荧光素酶评估肿瘤负荷。在可能的情况下，将小鼠处理25天并停止治疗并监测存活率。通过口服管饲法施用药物。根据中试实验的估计和先前文献的结果12选择样本量。研究人员对小组分配或结果评估不知情。所有研究均符合UCLA OARO方案指南。
颅内延迟的PET/CT小鼠成像
用指定剂量和时间的厄洛替尼处理小鼠，然后预温热，用2％异氟烷麻醉，并静脉注射70μCi的18F-FDG。在1小时无意识摄取后，将小鼠停止麻醉，但保持温热，以再进行5小时摄取。首次施用18F-FDG之后6小时，使用G8 PET/CT扫描仪(Sofie Biosciences)对小鼠成像。如上所述，通过使用AMIDE软件绘制3D目的区域(ROI)进行定量。
免疫组织化学
在从FFPE(福尔马林固定，石蜡包埋)块切下的4μm切片上进行免疫组织化学。然后将切片用二甲苯脱石蜡，并通过分级乙醇再水化。用pH 9.5Nuclear Decloaker(BiocareMedical)在Decloaking压力锅中在95℃下进行抗原修复40min。然后将组织切片用3％过氧化氢(LOT161509；Fisher Chemical)和Background Sniper(Biocare Medical，Concord，CA，美国)处理，以减少非特异性背景染色。将p53的一抗(Cell Signaling，2527)以1:150稀释度施加80min，接着使用MACH 3Rabbit HRP-Polymer检测试剂盒(Biocare Medical)进行检测。使用VECTOR NovaRED(SK-4800；Vector Laboratories,Inc.)作为色原实现可视化。最后，将切片用Tacha自动苏木精(Biocare Medical)复染。
定量RT-PCR
使用Purelink RNA试剂盒(Invitrogen)从所有细胞中提取RNA。根据制造商的说明书，使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)合成cDNA。使用SYBRGreen主混合物(KapaBiosciences)在Roche LightCycler 480上进行定量PCR(qPCR)。将相对表达值归一化到对照基因(GAPDH)。引物序列如列出(5'至3')：P21(正向GACTTTGTCACCGAGACACC，反向GACAGGTCCACATGGTCTTC)，PUMA(正向ACGACCTCAACGCACAGTACG，反向GTAAGGGCAGGAGTCCCATGATG)，GAPDH(正向TGCCATGTAGACCCCTTGAAG，反向ATGGTACATGACAAGGTGCGG)，MDM2(正向CTGTGTTCAGTGGCGATTGG，反向AGGGTCTCTTGTTCCGAAGC)，TIGAR(正向GGAAGAGTGCCCTGTGTTTAC，反向GACTCAAGACTTCGGGAAAGG)，PIG3(正向GCAGCTGCTGGATTCAATTA，反向TCCCAGTAGGATCCGCCTAT)。
P53报告基因活性
首先用由p53报告基因质粒合成的慢病毒感染细胞，所述p53报告基因质粒在p53应答元件控制下编码荧光素酶：TACAGAACATGTCTAAGCATGCTGTGCCTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCTTGGG。然后将感染的细胞以5,000个细胞/50μL铺板到96孔板中，并用指定的药物处理24小时，然后与1mM D-荧光素一起孵育2小时。使用IVIS Lumina II(Perkin Elmer)测量生物发光。
遗传操作
通常，通过使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染293-FT细胞(Thermo)来产生用于遗传操作的慢病毒。转染之后48小时收集病毒。慢病毒sgp53载体和sg对照载体分别含有以下指导RNA：CCGGTTCATGCCGCCCATGC和GTAATCCTAGCACTTTTAGG。将LentiCRISPR-v2用作主链。从可商购的载体中克隆Glut1和Glut3 cDNA，并整合到含有CMV启动子的pLenti-GLuc-IRES-EGFP慢病毒主链中(Glut1由Wolf Wolfmer馈赠(Addgene#1808544)，Glut3获自OriGene#SC115791，并且慢病毒主链获自Targeting Systems#GL-GFP)。pMIG Bcl-xL由Stanley Korsmeyer馈赠(Addgene#879045)，并克隆到上述慢病毒主链中(TargetingSystems)。细胞质(K305A和R306A)和野生型p53构建体由R.Agami和G.Lahav馈赠。将目的基因克隆到含有PGK启动子的慢病毒载体中。对野生型p53构建体使用定点诱变(New EnglandBiolabs#E0554S)生成p53 DNA结合结构域突变体(R175H)和(R273H)以及核突变体(L348A和L350A)的构建体。
对于EGFR敲低实验，使用DharmaFECT 4(Dharmacon)将针对EGFR的siRNA(ThermoFischer Scientific，s563)转染到细胞中。48小时后，收获细胞并用于指定实验。
免疫荧光
对于免疫荧光，首先将胶质瘤球分离为单细胞，并使用Cell-Tak(Corning)根据制造商的说明书将其粘附到96孔板。然后将粘附的细胞用冰冷的甲醇固定10分钟，然后用PBS洗涤3次。然后将细胞与在PBS中含10％FBS和3％BSA的封闭溶液一起孵育1小时，并且随后与p53(Santa Cruz，SC-126，1:50的稀释度)抗体在4℃下一起孵育过夜。第二天，将细胞与二抗(Alexa Fluor 647，稀释度1:2000)一起孵育1小时并进行DAPI染色10min，然后使用配备有Cascade II荧光照相机(Roper Scientific)的Nikon TI Eclipse显微镜成像。利用461nM和647nM的发射对细胞进行成像，并且然后使用NIS-Elements AR分析软件进行处理。
耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)测量
对于涉及OCR和ECAR的代谢测量，首先将用指定药物处理的胶质瘤球分离为单细胞悬浮液，并根据制造商的说明书使用Cell-Tak(Corning)粘附到XF24板(SeahorseBioscience)。在测定之前，对细胞补充未缓冲的DMEM，并在开始OCR和ECAR测量之前在37℃下孵育30min。显示了对照与厄洛替尼处理的细胞之间的基础ECAR测量值。
质谱法样品制备
将雄性CD-1小鼠(6-8周龄)通过口服管饲法一式两份地用50mg/kg依达奴林处理。施用之后0.5、1、2、4、6、8、12和24小时，处死小鼠，通过眼眶后出血收集血液，并收集脑组织。对来自小鼠的全血进行离心以分离血浆。通过液-液萃取从血浆中分离出依达奴林：将50μL血浆添加到2μL内标和100μL乙腈中。将小鼠脑组织用2mL冷PBS洗涤，并使用组织均化器与新鲜的2mL冷PBS均化。然后，将依达奴林分离并通过液-液萃取以相似方式重构：将100μL脑匀浆添加到2μL内标和200μL乙腈中。涡旋混合之后，将样品离心。除去上清液，并通过旋转蒸发器蒸发，并在100μL 50:50水：乙腈中重构。
通过质谱法检测依达奴林
使用1290Infinity LC系统(Agilent)在100x 2.1mm Phenomenex Kinetex C18柱(Kinetex)上进行色谱分离。流动相由溶剂A：在Milli-Q水中的0.1％甲酸和B：在乙腈中的0.1％甲酸组成。以5％B(0-4min)，5-99％B(4-32min)，99％B(32-36min)的梯度洗脱分析物，并且然后返回到5％B持续12min以在注射之间重新平衡。以0.10mL/min的溶剂流速向色谱系统中注射20μL。在6460三重四极杆LC/MS系统(Agilent)上进行质谱法。通过在正模式下使用电喷雾实现电离，并在多反应监测(MRM)模式下进行数据采集。用于依达奴林检测的MRM跃迁为m/z 616.2→421.2，碎裂电压为114V，碰撞能量为20eV。将分析物信号归一化到内标，并通过与校准曲线(0.5、5、50、250、500、2000nM)比较确定浓度。对于脑血管中的残留血液，通过小鼠脑重量的1.4％调节依达奴林脑浓度。
分泌型高斯荧光素酶测量
用含有分泌型高斯荧光素酶(sGluc)报告基因的慢病毒载体(TargetingSystems#GL-GFP)感染细胞，然后将其颅内植入到小鼠的右纹状体中(4x 105个细胞/小鼠)。为了测量分泌型高斯荧光素酶(sGluc)的水平，从小鼠的尾静脉收集了6μL血液，并立即与50mM EDTA混合以防止凝血。在96孔板中注入100μL 100μM腔肠素(coelentarazine，Nanolight)后，通过测量化学发光来获得Gluc活性。
协同作用得分计算
将1.0x 105个GBM细胞一式三份铺板，并使用基质用多个浓度的厄洛替尼、nutlin或组合进行处理，其中将每种药物以六个浓度(0-10μM)添加到细胞中。处理72小时后测量膜联蛋白V染色。使用Chalice软件，将组合的反应与其单一剂进行比较。使用协同作用得分计算组合作用。
DNA测序
使用Illumina Miseq对样品HK206、HK217、HK250、HK296进行以下基因的靶向测序：BCL11A、BCL11B、BRAF、CDKN2A、CHEK2、EGFR、ERBB2、IDH1、IDH2、MSH6、NF1、PIK3CA、PIK3R1、PTEN、RB1、TP53。每个样品有1至2百万个读数，每个基因平均覆盖230个。使用全基因组SNP阵列确定这些样品的拷贝数变体。GBM39的遗传图谱先前已在文献中报告。
对样品HK157、HK229、HK248、HK250、HK254、HK296、HK301、HK336、HK350、HK390、HK393进行全外显子测序，并在SeqWright处进行。将样品用单独的捕获反应分为2个池。使用Nextera快速捕获和文库制备，在HiSeq 2500上进行测序，测序2x100 bp，靶上覆盖率100x，进行2次完全快速运行，每个使用1个正常二倍体对照。使用EXCAVATOR软件对这些样品进行拷贝数分析。
TCGA样品注释
分析了来自TCGA的273个GBM样品的EGFR、p53和p53调控途径的遗传改变。检查突变的共现，并且仅显示显著的相互作用。如前所述，使用cBioPortal分析数据。
荧光原位杂交(FISH)
使用可商购的荧光标记的双色EGFR(红色)/CEP 7(绿色)探针(Abbott-Molecular)进行荧光原位杂交(FISH)。按照制造商建议的方案，对细胞系进行FISH杂交和分析。用DAPI对细胞进行复染，并且在配备有双色和三色滤光器的Zeiss(Axiophot)荧光显微镜下对荧光探针信号成像。
统计分析。
使用双尾非配对学生t检验进行比较，并且p值<0.05被认为是统计学上显著的。认为来自多个独立实验的所有数据均具有正态方差。数据表示平均值±s.e.m.值。所有统计分析均使用Prism 6.0(GraphPad)计算。对于所有体外和体内实验，均未使用统计方法来预先确定样品量，并且未排除任何样品。对于体内肿瘤测量，最后的数据集用于组间比较。如上所述，在研究之前将所有小鼠随机化。
以引用的方式并入
本文提到的所有公布和专利都特此引用的方式整体并入，就如同具体且单个地指出单个的公布或专利各自以引用的方式并入本文中一样。在有冲突的情况下，将以本申请为准，包括本文中的任何定义。
等效方案
虽然已经讨论了本发明的特定实施方案，但以上说明书是示例性而非限制性的。在阅读本说明书和下面的权利要求之后，本发明的许多变化对于本领域技术人员而言将为显而易见的。本发明的全部范围应该通过参考权利要求连同权利要求的等效物的全部范围，以及本说明书连同这些变化方案来确定。

Claims (139)

1.一种式I-a或式I-b的化合物：
Figure FDA0002506325770000011
或其药学上可接受的盐或立体异构体，其中：
Z是芳基或杂芳基；
R1是氢、烷基、卤基、CN、NO2、OR7、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；
R2是氢、烷基、卤基、CN、NO2、OR8、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或者R1和R2一起形成碳环或杂环；
R3是氢、烷基或酰基；
R4是烷氧基；
R5是烷基；并且
R7和R8各自独立地选自氢、烷基诸如烷氧基烷基、芳烷基或芳酰基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中如果R7和R8是烷氧基烷基并且R3是氢，则Z不是3-乙炔基苯基。
3.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中Z任选地被选自以下的R6取代：烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、烯基、芳烷氧基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中：
R7和R8各自独立地选自氢、芳烷基或芳酰基；
R6在每种情况下独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、烯基、芳烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；或者
R1和R2一起形成碳环或杂环。
5.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中如果R7和R8组合形成杂环并且R3是氢，则Z不是2-氟,4-溴苯基、3-溴苯基、3-甲基苯基、3-三氟甲基苯基或3-氯,4-氟苯基。
6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(II-a)或式(II-b)的化合物：
Figure FDA0002506325770000021
7.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中R1是氢。
8.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中R1是OR7。
9.如权利要求8所述的化合物，其中R7是氢。
10.如权利要求8所述的化合物，其中R7是烷基。
11.如权利要求8所述的化合物，其中R7是烷氧基烷基。
12.如权利要求8所述的化合物，其中R7是芳酰基。
13.如权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中R2是杂芳基，诸如呋喃基。
14.如权利要求13所述的化合物，其中所述杂芳基被烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、
Figure FDA0002506325770000031
取代。
15.如权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中R2是OR8。
16.如权利要求15所述的化合物，其中R8是氢。
17.如权利要求15所述的化合物，其中R8是烷氧基烷基。
18.如权利要求15所述的化合物，其中R8是被
Figure FDA0002506325770000032
Figure FDA0002506325770000033
取代的烷基。
19.如权利要求15所述的化合物，其中R8是酰基。
20.如权利要求15所述的化合物，其中R8是芳酰基。
21.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中R1和R2组合形成碳环或杂环，诸如5元、6元或7元碳环或杂环。
22.如权利要求21所述的化合物，其中所述碳环或杂环被羟基、烷基(例如，甲基)或烯基(例如，乙烯基)取代。
23.如权利要求22所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0002506325770000034
24.如权利要求22所述的化合物，其中所述碳环或杂环被烷基(例如，甲基)取代，并且所述烷基部分相对于彼此为反式。
25.如权利要求24所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0002506325770000041
26.如权利要求22所述的化合物，其中所述碳环或杂环被烷基(例如，甲基)取代，并且所述烷基部分相对于彼此为顺式。
27.如权利要求26所述的化合物，其中所述化合物是
Figure FDA0002506325770000042
28.如权利要求21所述的化合物，其中所述化合物是式(III-a)、(III-b)、(III-c)、(III-d)、(III-e)或(III-f)的化合物：
Figure FDA0002506325770000051
29.如权利要求1-28中任一项所述的化合物，其中R3是氢。
30.如权利要求1-28中任一项所述的化合物，其中R3是酰基。
31.如权利要求30所述的化合物，其中R3是烷基酰基。
32.如权利要求30所述的化合物，其中R3是烷氧基酰基。
33.如权利要求30所述的化合物，其中R3是酰氧基烷基。
34.如权利要求30所述的化合物，其中R3是
Figure FDA0002506325770000061
并且
R9是烷基。
35.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中：
Z是任选地被一个或多个R6取代的芳基或杂芳基；并且
R6在每种情况下独立地选自烷基、烷氧基、OH、CN、NO2、卤基、烯基、炔基、芳烷氧基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基。
36.如权利要求35所述的化合物，其中Z是被1、2、3、4或5个R6取代的苯基。
37.如权利要求35或36所述的化合物，其中每个R6独立地选自卤基、烷基、炔基或芳基烷氧基。
38.如权利要求35-37中任一项所述的化合物，其中Z是2-氟-3-氯苯基、2-氟苯基、2,3-二氟苯基、2,4-二氟苯基、2,5-二氟苯基、2,6-二氟苯基、2,4,6-三氟苯基、五氟苯基、2-氟-3-溴苯基、2-氟-3-乙炔基苯基和2-氟-3-(三氟甲基)苯基。
39.如权利要求35-37中任一项所述的化合物，其中Z是3-乙炔基苯基。
40.如权利要求35-37中任一项所述的化合物，其中Z是3-氯-4-((3-氟苄基)氧基)苯。
41.如权利要求35-37中任一项所述的化合物，其中Z是3-氯-2-(三氟甲基)苯基。
42.如权利要求35-37中任一项所述的化合物，其中Z是2-氟-3-溴苯基。
43.如权利要求35-37中任一项所述的化合物，其中Z是2-氟,5-溴苯基。
44.如权利要求35-37中任一项所述的化合物，其中Z是2,6-二氟,5-溴苯基。
45.如权利要求35-44中任一项所述的化合物，其中：
Z被一个选自以下的R6取代：
Figure FDA0002506325770000071
并且
R9和R10独立地选自烷基。
46.如权利要求1-45中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IV-a)的化合物：
Figure FDA0002506325770000072
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
47.如权利要求1-45中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IV-b)的化合物：
Figure FDA0002506325770000073
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
48.如权利要求1-45中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IV-c)的化合物：
Figure FDA0002506325770000081
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
49.如权利要求1-45中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(IV-a)的化合物：
Figure FDA0002506325770000082
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
50.如权利要求1-45中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(V-b)的化合物：
Figure FDA0002506325770000091
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
51.如权利要求1-45中任一项所述的化合物，其中所述化合物是式(V-c)的化合物：
Figure FDA0002506325770000092
并且每个R6独立地选自氟、氯或溴。
52.如权利要求1-51中任一项所述的化合物，其中所述化合物是：
Figure FDA0002506325770000101
Figure FDA0002506325770000111
Figure FDA0002506325770000121
Figure FDA0002506325770000131
Figure FDA0002506325770000141
或其药学上可接受的盐或立体异构体。
53.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的化合物和药学上可接受的赋形剂。
54.一种抑制EGFR或其变体诸如ΔEGFR、EGFR细胞外突变体、EGFR A289、EGFR T263和/或EGFR激活突变体例如ex19缺失的方法，其包括向受试者施用如权利要求1-52中任一项所述的化合物或组合物。
55.一种治疗癌症的方法，其包括向需要癌症治疗的受试者施用如权利要求1-52中任一项所述的化合物或组合物。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠癌、头部、脊柱和颈部癌症、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、胰腺癌、阴茎癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤癌、胸腺癌、肺癌、卵巢癌或前列腺癌。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述癌症是胶质瘤、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。
58.一种对被诊断患有胶质瘤或GBM的受试者进行分类的方法，所述方法包括：
a.从所述受试者获得生物样品；
b.用葡萄糖代谢抑制剂处理所述生物样品；以及
c.确定葡萄糖代谢是否被所述葡萄糖代谢抑制剂降低。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述生物样品来自GBM肿瘤。
60.如权利要求58或59所述的方法，其中所述方法还包括将葡萄糖降低水平与对照进行比较。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述对照包括非癌样品、具有不同表型的癌样品、具有野生型EGFR表达水平的癌症样品或在所述生物样品经受葡萄糖代谢抑制剂之前取自所述生物样品的癌样品。
62.如权利要求58-61中任一项所述的方法，其中所述方法还包括如果所述生物样品中葡萄糖代谢被所述葡萄糖代谢抑制剂降低，则将所述受试者分类为代谢反应者。
63.如权利要求63所述的方法，其中所述方法还包括用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂治疗所述被分类为代谢反应者的受试者。
64.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述癌症是胶质瘤、星形细胞瘤或胶质母细胞瘤。
66.一种治疗受试者的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括在确定所述受试者对EGFR抑制剂降低葡萄糖代谢易感之后，向所述受试者施用一定量的葡萄糖摄取抑制剂和细胞质p53稳定剂。
67.一种治疗受试者的胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括在确定所述受试者对EGFR抑制剂降低葡萄糖代谢易感之后，向所述受试者施用治疗有效量的葡萄糖摄取抑制剂和细胞质p53稳定剂。
68.一种减少受试者的胶质母细胞瘤增殖的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的EGFR抑制剂和MDM2抑制剂。
69.一种减少受试者的胶质母细胞瘤增殖的方法，所述方法包括在确定取自所述受试者的样品中的葡萄糖代谢对EGFR抑制剂易感之后，向所述受试者施用有效量的EGFR抑制剂和MDM2抑制剂。
70.一种用于在受试者中治疗癌症或减少癌细胞增殖的方法，其包括向所述受试者施用一定量的葡萄糖代谢抑制剂和p53稳定剂。
71.一种用于在已经被确定患有对葡萄糖代谢抑制剂有反应的癌症的受试者中治疗癌症或减少癌细胞增殖的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的葡萄糖代谢抑制剂和p53稳定剂。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述癌症是多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、低级星形细胞瘤、混合型少突星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、CNS癌症、非CNS癌症或CNS转移或肺癌。
73.一种治疗受试者的恶性胶质瘤或胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用一定量的葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。
74.一种治疗受试者的恶性胶质瘤或胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括在已经确定所述受试者对葡萄糖代谢抑制剂易感之后，向所述受试者施用一定量的所述葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。
75.如权利要求58-74中任一项所述的方法，其中已经通过包括以下的方法确定所述受试者对所述葡萄糖代谢抑制剂易感：
a.从所述受试者获得肿瘤活检物；
b.测量在所述葡萄糖代谢抑制剂存在时所述肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平；
c.将步骤b.中获得的所述肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平与对照的葡萄糖摄取水平进行比较；以及
d.如果与所述对照相比，所述肿瘤细胞的葡萄糖摄取水平降低，则确定所述受试者对所述葡萄糖代谢抑制剂易感。
76.如权利要求75所述的方法，其中葡萄糖摄取通过放射标记的葡萄糖2-脱氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(18F-FDG)的摄取来测量。
77.如权利要求76所述的方法，其还包括通过正电子发射断层摄影术(PET)检测所述18F-FDG。
78.如权利要求58-74中任一项所述的方法，其中已经通过包括以下的方法确定所述受试者对所述葡萄糖代谢抑制剂易感：
a.从所述受试者获得第一血液样品；
b.让所述受试者进行生酮饮食；
c.在进行生酮饮食一段时间之后从所述受试者获得第二血液样品；
d.测量所述第一血液样品和所述第二血液样品中的葡萄糖水平；
e.将所述第二血液样品中的葡萄糖水平与所述第一血液样品中的葡萄糖水平进行比较；以及
f.如果所述第二血液样品中的葡萄糖水平与所述第一血液样品中的葡萄糖水平相比降低，则确定所述受试者是易感的。
79.如权利要求78所述的方法，其中在所述第二血液样品与所述对照血液样品之间的所述葡萄糖水平的所述降低为约0.15mM或大于0.15mM。
80.如权利要求78所述的方法，其中在所述第二血液样品与所述对照血液样品之间的所述葡萄糖水平的所述降低为约0.20mM或大于0.20mM。
81.如权利要求78所述的方法，其中在所述第二血液样品与所述对照血液样品之间的所述葡萄糖水平的所述降低在0.15mM-2.0mM的范围内。
82.如权利要求78所述的方法，其中在所述第二血液样品与所述对照血液样品之间的所述葡萄糖水平的所述降低在0.25mM–1.0mM的范围内。
83.一种评估癌细胞或肿瘤对用葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括测量或检测所述癌细胞的葡萄糖摄取水平以及将所述葡萄糖摄取水平与对照进行比较。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述葡萄糖被放射标记。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述放射标记的葡萄糖是2-脱氧-2-[氟-18]氟-D-葡萄糖(18F-FDG)。
86.如权利要求84所述的方法，其中测量和检测放射标记的葡萄糖摄取通过正电子发射断层摄影术(PET)来定量。
87.如权利要求83-86中任一项所述的方法，其中所述对照包括非癌样品、具有不同表型的癌样品、具有野生型EGFR表达水平的癌症样品。
88.如权利要求58-87中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂包括葡萄糖摄取抑制剂、葡萄糖转运蛋白抑制剂、糖酵解抑制剂或表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、凡德他尼、耐昔妥珠单抗或奧希替尼。
90.如权利要求88所述的方法，其中所述EGFR抑制剂是如权利要求1-43中任一项所述的化合物。
91.如权利要求88所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂是磷脂酰肌醇3-激酶PI3K抑制剂。
92.如权利要求88所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是匹替利司、达托利司、渥曼青霉素、LY294002、艾代拉里斯、度维利司、布帕尼西、IPI-549、SP2523、GDC-0326、TGR-1202、VPS34抑制剂1、GSK2269557、GDC-0084、SAR405、AZD8835、LY3023414、PI-103、TGX-221、NU7441、IC-87114、渥曼青霉素、XL147类似物、ZSTK474、阿培利司、PIK-75HCl、A66、AS-605240、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、PIK-93、PIK-90、AZD64822、PF-04691502、阿托利司、GSK1059615、度维利司、吉托利司、TG100-115、AS-252424、BGT226、CUDC-907、AS-604850、PIK-294、GSK2636771、考泮利司、YM201636、CH5132799、CAY10505、PIK-293、PKI-402、TG100713、VS-5584、他塞利司、CZC24832、AMG319、GSK2292767、HS-173、槲皮素、沃他利司、PIK-93、奥帕利司、PIK-90、GNE-317、匹雷利司、PF-4989216、AZD8186、740Y-P、Vps34-IN1、PIK-III、PI-3065或其类似物。
93.如权利要求88所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂是2-脱氧葡萄糖(2DG)或细胞松弛素B。
94.如权利要求63-93中任一项所述的方法，其中所述细胞质p53稳定剂是MDM2抑制剂。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述MDM2抑制剂是nutlin。
96.如权利要求94所述的方法，其中所述MDM2抑制剂是nutlin-3或依达奴林。
97.如权利要求94所述的方法，其中所述MDM2抑制剂是RO5045337、RO5503781、RO6839921、SAR405838、DS-3032、DS-3032b或AMG-232。
98.如权利要求63-93中任一项所述的方法，其中所述细胞质p53稳定剂是BCL-2抑制剂。
99.如权利要求85所述的方法，其中所述BCL-2抑制剂是反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维耐托克(ABT-199)、GDC-0199、奥巴妥拉、紫杉醇、纳维克拉(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746或APG-1252。
100.如权利要求63-93中任一项所述的方法，其中所述细胞质p53稳定剂是Bcl-xL抑制剂。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述Bcl-xL抑制剂是WEHI 539、ABT-263、ABT-199、ABT-737、萨布克拉、AT101、TW-37、APG-1252或藤黄酸。
102.如权利要求63-101中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂和所述细胞质p53稳定剂以同一组合物施用。
103.如权利要求63-101中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂和所述p53稳定剂联合施用。
104.如权利要求63-101中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂和所述p53稳定剂在彼此的24小时内施用。
105.如权利要求63-101中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂和所述p53稳定剂在彼此的6小时内施用。
106.如权利要求63-101中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂和所述p53稳定剂在彼此的2小时内施用。
107.如权利要求63-101中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂和所述p53稳定剂在彼此的1小时内施用。
108.如权利要求63-101中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖代谢抑制剂和所述p53稳定剂在彼此的30分钟内施用。
109.如权利要求63-101中任一项所述的方法，其中同时向所述受试者施用所述葡萄糖代谢抑制剂和所述p53稳定剂。
110.如权利要求57-89和94-109中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用1mg至250mg厄洛替尼。
111.如权利要求57-89和94-109中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用25mg厄洛替尼。
112.如权利要求57-89和94-109中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用100mg厄洛替尼。
113.如权利要求57-89和94-109中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用150mg厄洛替尼。
114.如权利要求57-96和102-113中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用50mg至1600mg依达奴林。
115.如权利要求57-96和102-113中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用100mg依达奴林。
116.如权利要求57-96和102-113中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用150mg依达奴林。
117.如权利要求57-96和102-113中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用300mg依达奴林。
118.如权利要求57-96和102-113中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用400mg依达奴林。
119.如权利要求57-96和102-113中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用600mg依达奴林。
120.如权利要求57-96和102-113中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用1600mg依达奴林。
121.如权利要求54-120中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有多形性胶质母细胞瘤。
122.如权利要求54-121中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经用先前治疗方法治疗了胶质母细胞瘤。
123.如权利要求54-122中任一项所述的方法，其中所述受试者已被确定对所述先前治疗方法有抗性。
124.如权利要求54-123中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用另外的疗法。
125.一种药物组合物，其包含葡萄糖代谢抑制剂和细胞质p53稳定剂。
126.如权利要求125所述的药物组合物，其中所述葡萄糖代谢抑制剂包括葡萄糖摄取抑制剂、葡萄糖转运蛋白抑制剂、糖酵解抑制剂或表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂。
127.如权利要求125或126所述的药物组合物，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗、凡德他尼、耐昔妥珠单抗或奧希替尼。
128.如权利要求125或126所述的药物组合物，其中所述EGFR抑制剂是如权利要求1-52中任一项所述的化合物。
129.如权利要求125或126所述的药物组合物，其中所述葡萄糖代谢抑制剂是磷脂酰肌醇3-激酶PI3K抑制剂。
130.如权利要求129所述的药物组合物，其中所述PI3K抑制剂是匹替利司、达托利司、渥曼青霉素、LY294002、艾代拉里斯、度维利司、布帕尼西、IPI-549、SP2523、GDC-0326、TGR-1202、VPS34抑制剂1、GSK2269557、GDC-0084、SAR405、AZD8835、LY3023414、PI-103、TGX-221、NU7441、IC-87114、渥曼青霉素、XL147类似物、ZSTK474、阿培利司、PIK-75HCl、A66、AS-605240、3-甲基腺嘌呤(3-MA)、PIK-93、PIK-90、AZD64822、PF-04691502、阿托利司、GSK1059615、度维利司、吉托利司、TG100-115、AS-252424、BGT226、CUDC-907、AS-604850、PIK-294、GSK2636771、考泮利司、YM201636、CH5132799、CAY10505、PIK-293、PKI-402、TG100713、VS-5584、他塞利司、CZC24832、AMG319、GSK2292767、HS-173、槲皮素、沃他利司、PIK-93、奥帕利司、PIK-90、GNE-317、匹雷利司、PF-4989216、AZD8186、740Y-P、Vps34-IN1、PIK-III、PI-3065或其类似物。
131.如权利要求125或126所述的药物组合物，其中所述葡萄糖代谢抑制剂是2-脱氧葡萄糖(2DG)或细胞松弛素B。
132.如权利要求125-131中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞质p53稳定剂是MDM2抑制剂或拮抗剂。
133.如权利要求132所述的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂是nutlin。
134.如权利要求132所述的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂是nutlin-3或依达奴林。
135.如权利要求132所述的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂是RO5045337、RO5503781、RO6839921、SAR405838、DS-3032、DS-3032b或AMG-232。
136.如权利要求125-131中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞质p53稳定剂是BCL-2抑制剂。
137.如权利要求136所述的药物组合物，其中所述BCL-2抑制剂是反义寡脱氧核苷酸G3139、mRNA拮抗剂SPC2996、维耐托克(ABT-199)、GDC-0199、奥巴妥拉、紫杉醇、纳维克拉(ABT-263)、ABT-737、NU-0129、S 055746或APG-1252。
138.如权利要求125-131中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞质p53稳定剂是Bcl-xL抑制剂。
139.如权利要求138所述的药物组合物，其中所述Bcl-xL抑制剂是WEHI 539、ABT-263、ABT-199、ABT-737、萨布克拉、AT101、TW-37、APG-1252或藤黄酸。
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