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JP7498708B2 - モグロシドの生合成 - Google Patents

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マクマホン，マシュー
サラン，ダヤル
ワン，ジュエ
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ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月９日出願の「Biosynthesis of Mogrosides」なる名称の米国仮出願６２／７５８,４７４に基づく35 U.S.C. § 119(e)下の優先権の利益を主張し、その開示を、全体として引用により本明細書に包含させる。
ＥＦＳ－ＷＥＢによりテキストファイルとして提出した配列表の記載
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してASCII形式で提供した配列表を含み、ここにその全体を引用により包含させる。該ASCIIコピーは２０１９年１１月９日に作成し、G091970023WO00-SEQ-OMJ.TXTなる名称であり、９２８キロバイトサイズである。
発明の分野
本発明は、組み換え細胞におけるモグロール前駆体、モグロールおよびモグロシドの産生に関する。
背景
モグロシドは、ククルビタン誘導体の配糖体である。甘味料および糖代替物として高度に需要がある、モグロシドは、シライチア・グロスベノリイ(Siraitia grosvenorii)(ラカンカ)を含む食物果実で天然に合成されている。抗癌、抗酸化および抗炎症性質はモグロシドに帰属するとされているが、モグロシド生合成に関与する正確な酵素の特徴づけは限られている。さらに、果実からのモグロシド抽出は大きな労働力を要し、モグロシドの構造の複雑さが、デノボ化学合成をしばしば妨げている。
概要
本発明の態様は、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む領域；および／または野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する位置にアミノ酸置換を含む領域を含み；ここで、該宿主細胞は、少なくとも１つのモグロシド前駆体の存在下、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に比して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるループ６、アルファヘリックス３、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２およびアルファヘリックス７から選択される構造モチーフに対応する構造モチーフのアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＨ８３；Ｔ８４；Ｔ８５；Ｎ８６；Ｐ８９；Ｌ９２；Ｙ１７９；Ｓ１８０；Ａ１８１；Ｇ１８４；Ａ１８５；Ｖ１８６；Ｔ１８７；Ｋ１８９；Ｈ１９１；Ｋ１９２；Ｇ１９４；Ｅ１９５；およびＡ１９８から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、宿主細胞は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
本発明のさらなる態様は、ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する位置にアミノ酸置換を含む領域；および／または野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する位置にアミノ酸置換を含む領域を含み；ここで、該ＵＧＴは、配列番号１０９に９０％未満の同一性を含む。
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるループ６、アルファヘリックス３、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２およびアルファヘリックス７から選択される構造モチーフに対応する構造モチーフのアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
本発明のさらなる態様は、ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)のＮ１４３またはＬ３７４に対応する残基の位置にアミノ酸置換を含み、ここで、該宿主細胞は、少なくとも１つのモグロシド前駆体存在下、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して、活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるループ６、アルファヘリックス３、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２およびアルファヘリックス７から選択される構造モチーフに対応するＵＧＴの構造モチーフのアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
本発明のさらなる態様は、ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)のループ８；ベータシート５；ループ１０；アルファヘリックス５；ループ１１；ループ２；アルファヘリックス６；ループ１２；アルファヘリックス１；アルファヘリックス７；ループ１８；アルファヘリックス１４；ループ２６；アルファヘリックス２；ループ６；およびアルファヘリックス３から選択される構造モチーフに対応する構造モチーフのアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含み；ここで、該宿主細胞は、少なくとも１つのモグロシド前駆体存在下、アミノ酸置換を含まないＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い、１以上のモグロシドを産生する。
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
本発明のさらなる態様は、ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)のＨ２１／Ｄ１２２に対応する触媒ダイアドから７オングストローム以内であるアミノ酸残基にアミノ酸置換を含み、ここで、該ＵＧＴは、アミノ酸置換を含まない同じＵＧＴに比して活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。
本発明のさらなる態様は、循環置換(circularly permuted)ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該循環置換ＵＧＴは(ａ)触媒ダイアド；および(ｂ)補因子結合部位を含み；
ここで、触媒ダイアドは補因子結合部位に対してＣ末端に位置し、そして
ここで、該宿主細胞は、少なくとも１つのモグロシド前駆体の存在下、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む対照宿主細胞に比して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。
ある実施態様において、循環置換ＵＧＴは、表６内の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。
ある実施態様において、本明細書に記載するＵＧＴは、表３または表７内の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるループ６、アルファヘリックス３、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２およびアルファヘリックス７から選択される構造モチーフに対応する構造モチーフのアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、宿主細胞は、少なくとも１つのモグロシド前駆体の存在下、アミノ酸置換を含まないＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。
ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
ある実施態様において、ＵＧＴの比活性は、１時間あたり酵素１グラムあたり少なくとも１mmolのグリコシル化モグロシド標的の産生である。
本発明のさらなる態様は、ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＨ８３；Ｔ８４；Ｔ８５；Ｎ８６；Ｐ８９；Ｌ９２；Ｙ１７９；Ｓ１８０；Ａ１８１；Ｇ１８４；Ａ１８５；Ｖ１８６；Ｔ１８７；Ｋ１８９；Ｈ１９１；Ｋ１９２；Ｇ１９４；Ｅ１９５；およびＡ１９８から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。
本発明のさらなる態様は、ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＧ１８；Ｙ１９；Ｓ１２３；Ｎ４７；Ｆ１２４；Ｎ１４３、Ｔ１４４；Ｔ１４５；Ｖ１４９；Ｆ２７６；Ｎ３５５；Ｈ３７３およびＬ３７４から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の位置にアミノ酸置換を含む。
ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換を触媒できる。ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールのＣ２４でのグリコシル化；モグロールのＣ３でのグリコシル化；モグロールのＣ３での分岐グリコシル化；またはモグロールのＣ２４での分岐グリコシル化ができる。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)に比して活性(例えば、比活性)の少なくとも１.３倍増加を示す。ある実施態様において、宿主細胞は、少なくとも１つのモグロシド前駆体存在下、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。
ある実施態様において、Ｙ１７９はグルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、バリンまたはトリプトファンに変異され；Ｓ１８０はアラニンまたはバリンに変異され；Ａ１８１はリシンまたはスレオニンに変異され；Ｇ１８４はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニンまたはチロシンに変異され；Ａ１８５はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、スレオニン、トリプトファンまたはチロシンに変異され；Ｖ１８６はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、トリプトファンまたはチロシンに変異され；Ｔ１８７はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンまたはチロシンに変異され；Ｋ１８９はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンに変異され；Ｈ１９１はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンに変異され；Ｋ１９２はシステインまたはフェニルアラニンに変異され；Ｇ１９４はアスパラギン酸、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、セリンまたはトリプトファンに変異され；Ｅ１９５はアラニン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンまたはチロシンに変異され；Ａ１９８はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンまたはチロシンに変異され；Ｈ８３はグルタミンまたはトリプトファンに変異され；Ｔ８４はチロシンに変異され；Ｔ８５はグリシン、リシン、プロリン、セリンまたはチロシンに変異され；Ｎ８６はアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、リシン、ロイシン、セリン、トリプトファンまたはチロシンに変異され；Ｐ８９はメチオニンまたはセリンに変異され；および／またはＬ９２はヒスチジンまたはリシンに変異される。
ある実施態様において、Ｎ１４３はアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、スレオニンまたはバリンに変異され；Ｌ３７４はアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンに変異され；Ｓ１２３はアラニン、システイン、グリシンまたはバリンに変異され；Ｆ１２４はチロシンに変異され；Ｔ１４４はアラニン、システイン、アスパラギンまたはプロリンに変異され；Ｔ１４５はアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンまたはセリンに変異され；Ｖ１４９はシステイン、ロイシンまたはメチオニンに変異され；Ｇ１８はセリンに変異され；Ｙ１９はフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシンまたはバリンに変異され；Ｆ２７６はシステインまたはグルタミンに変異され；Ｎ３５５はグルタミンまたはセリンに変異され；Ｈ３７３はリシン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、バリンまたはチロシンに変異され；および／またはＮ４７はグリシンに変異される。
ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＤＳ酵素、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、エポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)および／またはスクアレンエポキシダーゼをコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施態様において、ＣＤＳをコードする異種ポリヌクレオチドは、配列番号３、９または１２と少なくとも９０％同一である。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号４３、４９または５２と少なくとも９０％同一である。
ある実施態様において、ＵＧＴの活性(例えば、比活性)は、１時間あたり酵素１グラムあたり少なくとも１mmolのグリコシル化モグロシド標的の産生である。ある実施態様において、細胞は酵母細胞、植物細胞または細菌細胞である。ある実施態様において、細胞はサッカロマイセス・セレビシエ(出芽酵母)細胞である。ある実施態様において、細胞はエシェリキア・コリ(大腸菌)細胞である。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の宿主細胞の何れかを少なくとも１つのモグロシド前駆体と共に培養することを含む、モグロシドを産生する方法に関する。ある実施態様において、モグロシド前駆体は、モグロール、ＭＩＡ１、ＭIIＡ１、ＭIIIＡ１、ＭIIＥ、ＭIIIおよびＭIIIＥから選択される。ある実施態様において、産生されるモグロシドは、ＭＩＡ１、ＭIIＡ１、ＭIIIＡ１、ＭIIＥ、ＭIII、シアメノシドおよびＭIIIＥから選択される。
本発明のさらなる態様は、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＣＤＳ酵素は、表２内の配列から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、該宿主細胞は、異種遺伝子を発現しない同じ宿主細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以上のククルビタジエノール化合物を産生する。
ある実施態様において、ククルビタジエノール化合物は、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールである。ある実施態様において、ＣＤＳ酵素は、配列番号７３の１２３位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基にロイシンを含む。ある実施態様において、ＣＤＳは、オキシドスクアレンをククルビタジエノール化合物に変換できる。ある実施態様において、オキシドスクアレンは、２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレンである。ある実施態様において、ＣＤＳ酵素は、基質溝および活性部位腔を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素、エポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)酵素および／またはスクアレンエポキシダーゼ酵素をコードする異種遺伝子をさらに発現する。
本発明のさらなる態様は、ククルビタジエノール化合物を産生する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞とオキシドスクアレンを接触させることを含み、それにより、ククルビタジエノール化合物を産生する、方法に関する。ある実施態様において、ククルビタジエノール化合物は、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールである。ある実施態様において、オキシドスクアレンは、２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレンである。ある実施態様において、方法は、ククルビタジエノール化合物の単離をさらに含む。
本発明のさらなる態様は、モグロールまたはモグロシドを産生する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞とオキシドスクアレンを接触させることを含み、それによりモグロールまたはモグロシドを産生する、方法に関する。本発明のさらなる態様は、モグロシドを産生する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞を少なくとも１つのモグロシド前駆体と共に培養することを含む、方法に関する。
本発明のさらなる態様は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＣＤＳは、ａ)モチーフＧＸ１ＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３１)(ここで、Ｘ１はＮまたはＨである)；ｂ)モチーフＤＸ１ＧＷＬ(配列番号３３２)(ここで、Ｘ１はＨまたはＱである)；および／またはｃ)モチーフＣＷＧＶＣＦＴＹＡＧＷ(配列番号３３３)を含み、ここで、該ＣＤＳは、ラカンカＣＤＳ(配列番号７３)の配列を含まず；そしてここで、該宿主細胞は、対照に比して少なくとも１０％、２０％または３０％以上のククルビタジエノール化合物を産生し、ここで、該対照は、配列番号３３に対応するポリヌクレオチドによりコードされるラカンカＣＤＳを発現する宿主細胞である。
ある実施態様において、モチーフＧＸ１ＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３１)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における残基１１７～１２６に対応する残基に存在し；モチーフＤＸ１ＧＷＬ(配列番号３３２)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における残基４７９～４８３に対応する残基に存在しおよび／またはモチーフＣＷＧＶＣＦＴＹＡＧＷ(配列番号３３３)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における残基６１２～６２２に対応する残基に存在する。
本発明のさらなる態様は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＣＤＳは、ａ)モチーフＧＨＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３４)；および／またはｂ)モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)を含む。
ある実施態様において、モチーフＧＨＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３４)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における残基１１７～１２６に対応する残基に存在し；および／またはモチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における残基４７９～４８３に対応する残基に存在する。
本発明のさらなる態様は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＣＤＳは、ａ)モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ(配列番号３３６)；ｂ)モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)；および／またはｃ)モチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ(配列番号３３７)を含む。
ある実施態様において、モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ(配列番号３３６)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における残基１１７～１２６に対応する残基に存在し；モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における残基４７９～４８３に対応する残基に存在し；および／またはモチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ(配列番号３３７)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における残基６１２～６２２に対応する残基に存在する。
ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、配列番号３、９または１２と少なくとも９０％同一である。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号４３、４９または５２と少なくとも９０％同一である。ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、配列番号３と少なくとも９０％同一である。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号４３と少なくとも９０％同一である。
本発明のさらなる態様は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、異種ポリヌクレオチド配列は、配列番号３と少なくとも９０％同一であるおよび／または異種ポリヌクレオチドによりコードされるＣＤＳのアミノ酸配列は、配列番号４３と少なくとも９０％同一であり、そしてここで、該宿主細胞はククルビタジエノール化合物を産生する。
ある実施態様において、ククルビタジエノール化合物は、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールである。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号７３の１２３位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の位置にロイシンを含む。ある実施態様において、ＣＤＳは、オキシドスクアレンをククルビタジエノール化合物に変換できる。ある実施態様において、オキシドスクアレンは、２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレンである。ある実施態様において、ＣＤＳ酵素は、基質溝および活性部位腔を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、エポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)および／またはスクアレンエポキシダーゼをコードする１以上の異種ポリヌクレオチドをさらに含む。
本発明のさらなる態様は、ククルビタジエノール化合物を産生する方法であって、本明細書に記載の宿主細胞の何れかとオキシドスクアレンを接触させることを含み、それにより、ククルビタジエノール化合物を産生する、方法に関する。ある実施態様において、ククルビタジエノール化合物は、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールである。ある実施態様において、オキシドスクアレンは、２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレンである。ある実施態様において、方法は、ククルビタジエノール化合物の単離をさらに含む。ある実施態様において、宿主細胞は酵母細胞、植物細胞または細菌細胞である。ある実施態様において、宿主細胞はサッカロマイセス・セレビシエ細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は大腸菌細胞である。
本発明の限定の各々は、種々の本発明の実施態様を含み得る。それ故に、要素の何れか一つまたは複数要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各態様に包含され得ると見込まれる。この発明は、以下に記載されまたは図面において説明される、構成の詳細および要素の配置にその適用は限定されない。本発明は、他の実施態様が可能であり、種々の方法で実施または実行されることが可能である。
添付する図面は、正確な比率であることは意図しない。図面は説明のためのみであり、本発明の実施可能性に必要なものではない。明確にする目的で、全ての図面に全ての要素がラベルされていない可能性がある。図面は次のとおりである。
図１Ａ～１Ｄは、推定されるモグロール生合成経路の図式的概略を示す。ＳＱＳはスクアレンシンターゼを示し、ＥＰＤはエポキシダーゼを示し、Ｐ４５０はＣ１１ヒドロキシラーゼを示し、ＥＰＨはエポキシドヒドロラーゼを示し、ＣＤＳはククルビタジエノールシンターゼを示す。図１Ａおよび図１Ｂは、推定されるモグロール生合成経路を示す。図１Ｃは、一次ＵＧＴ活性の非限定的例を示す。図１Ｄは、二次ＵＧＴ活性の非限定的例を示す。
図２は、モグロール、モグロシドＩ－Ａ１、モグロシドＩ－Ｅ１、モグロシドII－Ａ１、モグロシドII－Ａ２、モグロシドII－Ｅ、モグロシドIII－Ａ１、モグロシドIII－Ｅ、モグロシドIVおよびシアメノシドＩの液体クロマトグラフィー－マススペクトロメトリー(ＬＣ－ＭＳ)プロファイルを示すグラフである。８分ＬＣ－ＭＳ方法を使用して、これら全モグロシド標品間を区別した。
図３Ａ～３Ｂは、モグロシド基質に対してスクリーニングしたＵＧＴライブラリーからのモグロシドＩ－Ａ１(図３Ａ)およびシアメノシドＩ(図３Ｂ)の産生を示す、一連のグラフである。各株の各２個の生物学的反復をスクリーニングした。
図４Ａ～４Ｂは、個々の基質の的中株の二次スクリーニングにおける、モグロールからモグロシドＩ－Ａ１の産生(図４Ａ)およびモグロシドIII－Ａ１からシアメノシドＩの産生(図４Ｂ)を示す、一連のグラフである。各々の２個の技術的反復を伴う２個の生物学的反復を、各的中株についてスクリーニングした。
図５は、ＵＧＴ９４－２８９－１の相同性モデルの図式である。触媒ダイアド側鎖を四角内に示し、活性増強変異を特徴づける位置を黒色で強調する。
図６は、ＵＧＴ９４－２８９－１相同性モデルのＮ末端およびＣ末端の近接を示す略図である。
図７は、タンパク質の循環置換を示す図式である。天然タンパク質の元のＮ末端およびＣ末端は、直接的にまたはリンカー配列により共に結合される。新規Ｎ末端およびＣ末端がタンパク質配列内の他の位置に導入され、配列／構造バリアントが産生される。
図８は、ｔ８５０２４＿Ｎ１４３Ｖの残基５０～５９の位置特異的スコアマトリックス(ＰＳＳＭ)(上部パネル)およびロゼッタエネルギー関数を使用するこれら潜在的変異の影響の評価(下部パネル)を示す略図である。下部パネルにおいて、変異残基をステイックとして示し、周囲の原子を線で示す。
図９は、ＵＧＴ Ｕ７３Ｃ６(配列番号１０３)とＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)のアライメントの非限定的例を示す図式である。四角は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)における１２３位、１４３位および２７３位に対応するＵ７３Ｃ６(配列番号１０３)における残基を強調する。
図１０は、循環置換により産生されたＵＧＴによる、ＭIII、ＭIVおよびＭＶと比較したＭ、ＭＩおよびＭIIの相対的産生を示すグラフである。
図１１は、推定されるＵＧＴによる、ＭIII、ＭIVおよびＭＶと比較したＭ、ＭＩおよびＭIIの相対的産生を示すグラフである。
詳細な記載
モグロシドは、例えば、飲料において、天然甘味料として広く使用されている。しかしながら、デノボ合成および天然源からのモグロシド抽出にはしばしば高い製造費と低収量が伴う。本明細書は、モグロール(または１１,２４,２５－トリヒドロキシククルビタジエノール)、モグロシドおよびその前駆体を効率的に産生するよう操作された宿主細胞を記載する。方法は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)酵素、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素、エポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)酵素、スクアレンエポキシダーゼ(ＳＱＥ)酵素またはこれらの組み合わせの異種発現を含む。本明細書は、モグロールおよびモグロシド産生のための改善されたＵＧＴおよびＣＤＳ酵素の特徴を記載する。本明細書に記載の酵素および宿主細胞は、モグロール、モグロシドおよびその前駆体の製造に使用され得る。
モグロールおよびモグロシドの合成
図１Ａ～１Ｂは、推定されるモグロール合成経路を示す。経路における初期工程は、スクアレンから２,３－オキシドスクアレンへの変換を含む。図１Ａに示すとおり、２,３－オキシドスクアレンをまずククルビタジエノールに環化し、続いてエポキシ化して２４,２５－エポキシククルビタジエノールを形成できるかまたは２,３－オキシドスクアレンを２,３,２２,２３－ジオキシドスクアレンにエポキシ化し、次いで２４,２５－エポキシククルビタジエノールに環化し得る。次に、２４,２５－エポキシククルビタジエノールを、エポキシド加水分解、次いで酸化または酸化、次いでエポキシド加水分解の後にモグロール(モグロシドのアグリコン)に変換し得る。図１Ｂに示すとおり、２,３－オキシドスクアレンをまずククルビタジエノールに環化し、次いでシトクロムＰ４５０ Ｃ１１ヒドロキシラーゼにより１１－ヒドロキシククルビタジエノールに変換し得る。次いで、シトクロムＰ４５０ Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、１１－ヒドロキシククルビタジエノールを１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールに変換し得る。１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールは、エポキシドヒドロラーゼによりモグロールに変換され得る。Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、シトクロムＰ４５０レダクターゼと共に働く(図１Ａ～１Ｂに示していない)。
モグロールは、Ｃ３、Ｃ１１、Ｃ２４およびＣ２５での酸素化により、他のククルビタントリテルペノイド類と区別され得る。モグロールの、例えばＣ３および／またはＣ２４のグリコシル化により、モグロシドが形成され得る。
モグロール前駆体は、スクアレン、２－３－オキシドスクアレン、２,３,２２,２３－ジオキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４,２５－エポキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノール、１１－オキソ－ククルビタジエノールおよび２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノールを含むが、これらに限定されない。用語「ジオキシドスクアレン」を使用して、２,３,２２,２３－ジエポキシスクアレンまたは２,３,２２,２３－ジオキシドスクアレンを言い得る。用語「２,３－エポキシスクアレン」は、用語「２－３－オキシドスクアレン」と相互交換可能に使用され得る。本明細書で使用する、モグロシド前駆体はモグロール前駆体、モグロールおよびモグロシドを含む。
モグロシドの例は、モグロシドＩ－Ａ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩＥ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドII－Ａ２(ＭIIＡ２)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIV、モグロシドIVａ、イソモグロシドIV、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドＶおよびモグロシドVIを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、産生されるモグロシドは、Ｓｉａｍと称され得るシアメノシドＩである。ある実施態様において、産生されるモグロシドはＭIIIＥである。
他の実施態様において、モグロシドは、式１
Figure 0007498708000001
 の化合物である。
ある実施態様において、本明細書に記載する方法は、ＵＳ２０１９／００７１７０５に開示の化合物１～２０を含み、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載され、引用により本明細書に包含される化合物の何れかを産生するのに使用され得る。ある実施態様において、本明細書に記載する方法は、ＵＳ２０１９／００７１７０５に開示の化合物１～２０のバリアントを含み、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載され、引用により本明細書に包含される化合物のバリアントの何れかを産生するのに使用され得る。例えば、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物における１以上のアルファ－グリコシル結合の、１以上のベータ－グリコシル結合への置換を含み得る。ある実施態様において、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物における１以上のベータ－グリコシル結合の、１以上のアルファ－グリコシル結合での置換を含む。ある実施態様において、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、上記式１の化合物である。
ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素
本発明の態様は、例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールなどのククルビタジエノール化合物の産生に有用であり得る、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素を提供する。ＣＤＳは、オキシドスクアレン(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレン)から２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールなどのククルビタジエノール化合物の形成を触媒できる。
ある実施態様において、ＣＤＳ酵素は、配列番号７４の１２３位に対応するロイシン残基を有し、これは、引用により全体として本明細書に包含させる、Takase et al. Org. Biomol. Chem., 2015,13, 7331-7336に記載のとおり、他のオキシドスクアレンシクラーゼと区別する。
本発明のＣＤＳは、表２における核酸またはアミノ酸配列または配列番号１～８０から選択される配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一(各数値間の全数値を含む)である、配列を含み得る。
ある実施態様において、ＣＤＳ酵素は配列番号４３、配列番号５２または配列番号４９に対応する。
ある実施態様において、ＣＤＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、出芽酵母を含む特定の宿主細胞における発現のために、再コード化され得る。ある実施態様において、再コード化されたＣＤＳ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３４に対応する。
ある実施態様において、ＣＤＳをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３、９または１２と少なくとも９０％同一である。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号４３、４９または５２と少なくとも９０％同一である。
ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、基質としてオキシドスクアレン(例えば、２,３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレン)を使用できる。ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、ククルビタジエノール化合物(例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール)を産生できる。ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、オキシドスクアレン(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレン)からククルビタジエノール化合物(例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール)の形成を触媒する。
ＣＤＳの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＣＤＳの活性は、産生されたククルビタジエノールの正規化ピーク面積として測定され得る。ある実施態様において、この活性は、任意単位で測定される。ある実施態様において、本発明のＣＤＳの比活性などの活性は、対照ＣＤＳより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍(各数値間の全数値を含む)大きい。
当業者は、タンパク質に付随する構造的および／または機能的情報に基づき、ＣＤＳ酵素としてタンパク質を特徴づけできることは認識される。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、基質としてオキシドスクアレン(例えば、２,３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレン)を使用して、ククルビタジエノール化合物(例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール)を産生する能力などの機能に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。ある実施態様において、タンパク質は、少なくとも一部、配列番号７３の１２３位に対応する位置のロイシン残基の存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。
ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＧＸ１ＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３１)(ここで、Ｘ１はＮまたはＨである)を含む。ある実施態様において、モチーフＧＸ１ＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３１)は、ＣＤＳにおいて、配列番号７３における１１７～１２６位に対応する残基の位置に存在する。
ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＤＸ１ＧＷＬ(配列番号３３２)(ここで、Ｘ１はＨまたはＱである)を含む。ある実施態様において、モチーフＤＸ１ＧＷＬ(配列番号３３２)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における４７９～４８３位に対応する残基の位置に存在する。
ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＣＷＧＶＣＦＴＹＡＧＷ(配列番号３３３)を含む。ある実施態様において、モチーフＣＷＧＶＣＦＴＹＡＧＷ(配列番号３３３)は、ＣＤＳにおいて配列番号７３における６１２～６２２位に対応する残基の位置に存在する。
ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＧＨＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３４)を含む。ある実施態様において、モチーフＧＨＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３４)は、ＣＤＳにおいて、配列番号７３における１１７～１２６位に対応する残基の位置に存在する。ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)を含む。ある実施態様において、モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)は、ＣＤＳにおいて、配列番号７３における４７９～４８３位に対応する残基の位置に存在する。
ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＧＨＷＡＳＤＬＧＧＰ(配列番号３３４)、モチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)および／またはモチーフＣＷＧＶＣＦＴＹＡＧＷ(配列番号３３３)を含む。
ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号７３における１２３位に対応する残基の位置にロイシンを含む。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号７３における４８３位に対応する残基の位置にロイシンを含む。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号７３における６１２位に対応する残基の位置にシステイン、配列番号７３における６１４位に対応する残基の位置にグリシン、配列番号７３における６２０位に対応する残基の位置にアラニンおよび／または配列番号７３における６２１位に対応する残基の位置にグリシンを含む。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号７３における１２３位に対応する残基の位置にロイシン、配列番号７３における４８３位に対応する残基の位置にロイシン、配列番号７３における６１２位に対応する残基の位置にシステイン、配列番号７３における６１４位に対応する残基の位置にグリシン、配列番号７３における６２０位に対応する残基の位置にアラニンおよび／または配列番号７３における６２１位に対応する残基の位置にグリシンを含む。
ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ(配列番号３３６)を含む。ある実施態様において、モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ(配列番号３３６)は、ＣＤＳにおいて、配列番号７３における１１７～１２６位に対応する残基の位置に存在する。
ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＤＸ１ＧＷＬ(配列番号３３２)を含む。ある実施態様において、モチーフＤＸ１ＧＷＬ(配列番号３３２)は、ＣＤＳにおいて、配列番号７３における４７９～４８３位に対応する残基の位置に存在する。
ある実施態様において、ＣＤＳは、モチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ(配列番号３３７)を含む。ある実施態様において、モチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ(配列番号３３７)は、ＣＤＳにおいて、配列番号７３における６１２～６２２位に対応する残基の位置に存在する。
ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号７３における１１７～１２６位に対応する残基の位置に存在するモチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ(配列番号３３６)；配列番号７３における４７９～４８３位に対応する残基の位置に存在するモチーフＤＱＧＷＬ(配列番号３３５)；および／または配列番号７３における６１２～６２２位に対応する残基の位置に存在するモチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ(配列番号３３７)を含む。
ある実施態様において、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、異種遺伝子を発現しない同じ宿主細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以上のククルビタジエノール化合物を産生する。
ある実施態様において、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、対照宿主細胞に比して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以上のククルビタジエノール化合物を産生し、ここで、該対照宿主細胞は、配列番号３３に対応するポリヌクレオチドによりコードされるラカンカＣＤＳを発現する。
本明細書をとおして、本明細書に記載する異種ポリヌクレオチドの何れかを発現する宿主細胞を、対照宿主細胞と比較し得る。対照宿主細胞は、特定の異種ポリヌクレオチド配列を発現する宿主細胞と、対照宿主細胞が同じ特定の異種ポリヌクレオチド配列を発現しない以外同じ遺伝的背景を有し得ることは認識される。
他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質と既知ＣＤＳ酵素のパーセント同一性に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、本明細書に記載のＣＤＳ配列の何れかまたは他のＣＤＳ酵素の何れかの配列と、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一(各数値間の全数値を含む)であり得る。他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質における、ＣＤＳ酵素と関連する１以上のドメインの存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、当分野で知られるＣＤＳ酵素の基質溝および／または活性部位腔特徴の存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけられる。ある実施態様において、活性部位腔は、この溝へのゲートとして作用し、該腔から水を排除することを助ける、残基を含む。ある実施態様において、活性部位は、基質のエポキシドを開環するプロトンドナーとして、そして環化過程を触媒する残基を含む。
他の実施態様において、タンパク質は、既知ＣＤＳ酵素の三次元構造に対応する、タンパク質の三次元構造の比較に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。ＣＤＳ酵素は合成タンパク質であり得ることが認識される。
ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)酵素
本発明の態様は、例えば、モグロシド(例えば、モグロシドＩ－Ａ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩ－Ｅ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドII－Ａ２(ＭIIＡ２)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドIV、モグロシドIVａ、イソモグロシドIV、モグロシドＶまたはモグロシドVI)の産生に有用であり得る、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素(ＵＧＴ)を提供する。
本明細書で使用する、「ＵＧＴ」は、ＵＴＰ－糖からの化合物(例えば、モグロシドまたはモグロール)へのグリコシル基の付加を触媒できる、酵素をいう。ＵＧＴは、一次および／または二次ＵＧＴであり得る。「一次」ＵＧＴは、グリコシル基を含まない化合物上の位置へのグリコシル基の付加の触媒ができるＵＧＴをいう。例えば、一次ＵＧＴは、イソプレノイド基質(例えば、モグロール)のＣ３および／またはＣ２４位へのグリコシル基が可能であり得る。例えば、図１Ｃ参照。「二次」ＵＧＴは、グリコシル基を既に含む化合物のある位置へのグリコシル基の付加を触媒できるＵＧＴをいう。例えば、図１Ｄ参照。非限定的例として、二次ＵＧＴは、モグロシドＩ－Ａ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩ－Ｅ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドII－Ａ２(ＭIIＡ２)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドIV、モグロシドIVａ、イソモグロシドIV、モグロシドＶおよび／またはモグロシドVIにグリコシル基を付加し得る。
構造的に、ＵＧＴはしばしばＵＤＰＧＴ(Prosite: PS00375)ドメインおよび触媒ダイアドを含む。非限定的例として、当業者は、ＵＧＴ配列をＵＧＴ９４－２８９－１(ラカンカであるシライチア・グロスベノリイからの野生型ＵＧＴ配列)とアラインし、該ＵＧＴにおけるＵＧＴ９４－２８９－１のヒスチジン２１(Ｈ２１)およびアスパラギン酸１２２(Ｄ１２２)に対応する２残基を同定することにより、該ＵＧＴにおける触媒ダイアド(catalytic dyad)を同定し得る。
ＵＧＴ９４－２８９－１のアミノ酸配列は次のとおりである。
MDAQRGHTTTILMFPWLGYGHLSAFLELAKSLSRRNFHIYFCSTSVNLDAIKPKLPSSSSSDSIQLVELCLPSSPDQLPPHLHTTNALPPHLMPTLHQAFSMAAQHFAAILHTLAPHLLIYDSFQPWAPQLASSLNIPAINFNTTGASVLTRMLHATHYPSSKFPISEFVLHDYWKAMYSAAGGAVTKKDHKIGETLANCLHASCSVILINSFRELEEKYMDYLSVLLNKKVVPVGPLVYEPNQDGEDEGYSSIKNWLDKKEPSSTVFVSFGSEYFPSKEEMEEIAHGLEASEVHFIWVVRFPQGDNTSAIEDALPKGFLERVGERGMVVKGWAPQAKILKHWSTGGFVSHCGWNSVMESMMFGVPIIGVPMHLDQPFNAGLAEEAGVGVEAKRDPDGKIQRDEVAKLIKEVVVEKTREDVRKKAREMSEILRSKGEEKMDEMVAAISLFLKI(配列番号１０９)。
ＵＧＴ９４－２８９－１をコードする核酸配列の非限定的例は次のとおりである。
atggacgcgcaacgcggacatacgactaccatcctgatgtttccgtggttggggtacggccaccttagtgcattcctcgaattagccaagagcttgtcgcgtaggaactttcatatttatttctgttccacatctgtcaatttagatgctataaaacccaaactaccatcatcttcaagttccgattctattcagcttgtagagttatgcttgccttcctcgccagaccaactacccccacacctgcatacaactaatgctctacctccacatctaatgcctaccctgcaccaggccttttcaatggcagctcaacattttgcagctatattacatactttagcaccgcacttgttaatctatgattcgttccagccttgggcgccacaattggccagctctcttaacattcctgctattaattttaataccacgggtgccagtgtgctaacaagaatgttacacgcgactcattacccatcttcaaagttcccaatctccgaatttgttttacatgattattggaaagcaatgtattcagcagctggtggtgctgttacaaaaaaggaccataaaataggagaaaccttggcaaactgtttacacgcttcttgctcggtaattctgatcaattcattcagagagttggaagaaaaatacatggattacttgtctgtcttactaaacaagaaagttgtgcccgtgggtccgcttgtttatgagccaaaccaagatggcgaagacgaaggttatagttcgataaagaattggctcgataaaaaggagccctcctcaactgtctttgtttccttcgggtccgaatattttccgtccaaagaagaaatggaagaaattgcccatggcttggaggctagcgaggtacactttatttgggtcgttagattcccacaaggagacaatacttctgcaattgaagatgcccttcctaagggttttcttgagcgagtgggcgaacgtggaatggtggttaagggttgggctcctcaggccaaaattttgaaacattggagcacaggcggtttcgtaagtcattgtggatggaatagtgttatggagagcatgatgtttggtgtacccataataggtgttccgatgcatttagatcaaccatttaatgcagggctcgcggaagaagcaggagtaggggtagaggctaaaagggaccctgatggtaagatacagagagatgaagtcgctaaactgatcaaagaagtggttgtcgaaaaaacgcgcgaagatgtcagaaagaaggctagggaaatgtctgaaattttacgttcgaaaggtgaggaaaagatggacgagatggttgcagccattagtctcttcttgaagatataa(配列番号９３)。
当業者は、あらゆるＵＧＴ酵素ついて、例えば、配列のアラインおよび／または二次または三次構造の比較により、どのアミノ酸残基がＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)における特定のアミノ酸残基に対応するかをどのようにして決定するかを容易に認識する。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１における構造モチーフに対応する(例えば、表５に示す構造モチーフに対応する)１以上の構造モチーフを含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、表５における全構造モチーフに対応する構造モチーフを含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、表５に示す全てではなく、一部の構造モチーフに対応する構造モチーフを含む。ある実施態様において、一部構造モチーフは、異なる長さまたは異なるらせん構造を有する点で、異なり得る。例えば、本発明のＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－１におけるループ１１、１６、２０またはこれらの組み合わせの拡張バージョンを含み得る。本発明のＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－１における対応物(例えば、ＵＧＴ９４－２８９－１におけるループ１１、１６、２０またはこれらの組み合わせ)より大きならせん構造を有するループを含み得る。
ある実施態様において、ＵＧＴは、対照ＵＧＴの循環置換バージョンである。ある実施態様において、ＵＧＴは、対照ＵＧＴと異なる順番で表５からの少なくとも２つのモチーフを含む配列を含む。例えば、ＵＧＴ９４－２８９－１を対照ＵＧＴとして用い、第二モチーフのＣ末端に位置する第一モチーフを含むならば、循環置換ＵＧＴにおいて第一モチーフは第二モチーフのＮ末端に位置し得る。
ＵＧＴは、表５におけるベータシート７、ループ１６、アルファヘリックス９、ループ１７、ベータシート８、ループ１８、アルファヘリックス１０、ループ１９、ベータシート９、アルファヘリックス１１、ループ２０、アルファヘリックス１２、ループ２１、ベータシート１０、ループ２２、アルファヘリックス１３、ループ２３、ベータシート１１、ループ２４、アルファヘリックス１４、ループ２５、ベータシート１２、ループ２６、アルファヘリックス１５、ループ２７、ベータシート１３、ループ２８、アルファヘリックス１６、ループ２９、アルファヘリックス１７、ループ３０、アルファヘリックス１８およびループ３１から選択される１以上のモチーフに対応する１以上のモチーフに対してＣ末端に位置する、表５からのループ１、ベータシート１、ループ２、アルファヘリックス１、ループ３、ベータシート２、ループ４、アルファヘリックス２、ループ５、ベータシート３、ループ６、アルファヘリックス３、ループ７、ベータシート４、ループ８、アルファヘリックス４、ループ９、ベータシート５、ループ１０、アルファヘリックス５、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２、アルファヘリックス７、ループ１３、ベータシート６、ループ１４、アルファヘリックス８およびループ１５から選択される１以上のモチーフに対応する１以上のモチーフを含み得る。
ある実施態様において、ＵＧＴのＮ末端部分は、触媒ダイアドおよび／または基質結合部位を含む触媒部位を含む。ある実施態様において、ＵＧＴのＣ末端部分は、補因子結合部位を含む。例えば、ＵＧＴ９４－２８９－１のＮ末端部分は、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１の残基２１および１２２(例えば、ヒスチジン２１およびアスパラギン酸１２２)に対応する触媒ダイアドを含む。ＵＧＴ９４－２８９－１のＣ末端部分は、補因子結合部位を含む。
本発明のある態様は、循環置換されているＵＧＴを含む。ある実施態様において、ＵＧＴの循環置換バージョンにおいて、Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、全体的にまたは一部逆転し得る。例えば、循環置換ＵＧＴのＣ末端部分は触媒ダイアドおよび／または基質結合部位を含む触媒部位を含み得て、一方Ｎ末端部分は補因子結合部位を含み得る。
ある実施態様において、ＵＧＴの循環置換バージョンはＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ここで、該ＵＧＴは触媒ダイアドおよび補因子結合部位を含み、ここで、触媒ダイアドは補因子結合部位に対してＣ末端に位置する。
本発明に包含される循環置換ＵＧＴは、循環置換に付されていない同じＵＧＴと異なる性質を示し得る。ある実施態様において、このようなＵＧＴの循環置換バージョンを発現する宿主細胞は、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)などの循環置換されていない対照ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも１つのモグロシド前駆体の存在下、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。ある実施態様において、このようなＵＧＴの循環置換バージョンを発現する宿主細胞は、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)などの循環置換されていない参照ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも１つのモグロシド前駆体の存在下、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％少ない１以上のモグロシドを産生する。
ある実施態様において、ＵＧＴの循環置換バージョンにおいて、ＵＧＴのＮ末端部分は、ＵＧＴ９４－２８９－１などのＵＧＴのＣ末端部分に通常存在する残基を含む。ある実施態様において、ＵＧＴの循環置換バージョンにおいて、ＵＧＴのＣ末端部分は、ＵＧＴ９４－２８９－１などのＵＧＴのＮ末端部分に通常存在する残基を含む。
ある実施態様において、ＵＧＴ９４－２８９－１などのＵＧＴのＮ末端部分は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)などのＵＧＴのおおよその残基２～１２２、残基２～１２３、残基２～１２４、残基２～１２５、残基２～１２６、残基２～１２７、残基２～１２８、残基２～１２９、残基２～１３０、残基２～１３１、残基２～１３２、残基２～１３３、残基２～１３４、残基２～１３５、残基２～１３６、残基２～１３７、残基２～１３８、残基２～１３９、残基２～１４０、残基２～１４１、残基２～１４２、残基２～１４３、残基２～１４４、残基２～１４５、残基２～１４６、残基２～１４７、残基２～１４８、残基２～１４９、残基２～１５０、残基２～１５１、残基２～１５２、残基２～１５３、残基２～１５４、残基２～１５５、残基２～１５６、残基２～１５７、残基２～１５８、残基２～１５９、残基２～１６０、残基２～１６１、残基２～１６２、残基２～１６３、残基２～１６４、残基２～１６５、残基２～１６６、残基２～１６７、残基２～１６８、残基２～１６９、残基２～１７０、残基２～１７１、残基２～１７２、残基２～１７３、残基２～１７４、残基２～１７５、残基２～１７６、残基２～１７７、残基２～１７８、残基２～１７９、残基２～１８０、残基２～１８１、残基２～１８２、残基２～１８３、残基２～１８４、残基２～１８５、残基２～１８６、残基２～１８７、残基２～１８８、残基２～１８９、残基２～１９０、残基２～１９１、残基２～１９２、残基２～１９３、残基２～１９４、残基２～１９５、残基２～１９６、残基２～１９７、残基２～１９８、残基２～１９９、残基２～２００、残基２～２０１、残基２～２０２、残基２～２０３、残基２～２０４、残基２～２０５、残基２～２０６、残基２～２０７、残基２～２０８、残基２～２０９、残基２～２１０、残基２～２１１、残基２～２１２、残基２～２１３、残基２～２１４、残基２～２１５、残基２～２１６、残基２～２１７、残基２～２１８、残基２～２１９、残基２～２２０、残基２～２２１、残基２～２２２、残基２～２２３、残基２～２２４、残基２～２２５、残基２～２２６、残基２～２２７、残基２～２２８、残基２～２２９、残基２～２３０、残基２～２３１、残基２～２３２、残基２～２３３、残基２～２３４、残基２～２３５、残基２～２３６、残基２～２３７、残基２～２３８、残基２～２３９、残基２～２４０、残基２～２４１、残基２～２４２、残基２～２４３、残基２～２４４、残基２～２４５、残基２～２４６、残基２～２４７、残基２～２４８、残基２～２４９、残基２～２５０、残基２～２５１または残基２～２５２または他のＵＧＴにおける対応する残基に対応する。
ある実施態様において、ＵＧＴ９４－２８９－１などのＵＧＴのＣ末端ドメインは、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)などのＵＧＴのおおよそ残基１２３～４５６、残基１２４～４５６、残基１２５～４５６、残基１２６～４５６、残基１２７～４５６、残基１２８～４５６、残基１２９～４５６、残基１３０～４５６、残基１３１～４５６、残基１３２～４５６、残基１３３～４５６、残基１３４～４５６、残基１３５～４５６、残基１３６～４５６、残基１３７～４５６、残基１３８～４５６、残基１３９～４５６、残基１４０～４５６、残基１４１～４５６、残基１４２～４５６、残基１４３～４５６、残基１４４～４５６、残基１４５～４５６、残基１４６～４５６、残基１４７～４５６、残基１４８～４５６、残基１４９～４５６、残基１５０～４５６、残基１５１～４５６、残基１５２～４５６、残基１５３～４５６、残基１５４～４５６、残基１５５～４５６、残基１５６～４５６、残基１５７～４５６、残基１５８～４５６、残基１５９～４５６、残基１６０～４５６、残基１６１～４５６、残基１６２～４５６、残基１６３～４５６、残基１６４～４５６、残基１６５～４５６、残基１６６～４５６、残基１６７～４５６、残基１６８～４５６、残基１６９～４５６、残基１７０～４５６、残基１７１～４５６、残基１７２～４５６、残基１７３～４５６、残基１７４～４５６、残基１７５～４５６、残基１７６～４５６、残基１７７～４５６、残基１７８～４５６、残基１７９～４５６、残基１８０～４５６、残基１８１～４５６、残基１８２～４５６、残基１８３～４５６、残基１８４～４５６、残基１８５～４５６、残基１８６～４５６、残基１８７～４５６、残基１８８～４５６、残基１８９～４５６、残基１９０～４５６、残基１９１～４５６、残基１９２～４５６、残基１９３～４５６、残基１９４～４５６、残基１９５～４５６、残基１９６～４５６、残基１９７～４５６、残基１９８～４５６、残基１９９～４５６、残基２００～４５６、残基２０１～４５６、残基２０２～４５６、残基２０３～４５６、残基２０４～４５６、残基２０５～４５６、残基２０６～４５６、残基２０７～４５６、残基２０８～４５６、残基２０９～４５６、残基２１０～４５６、残基２１１～４５６、残基２１２～４５６、残基２１３～４５６、残基２１４～４５６、残基２１５～４５６、残基２１６～４５６、残基２１７～４５６、残基２１８～４５６、残基２１９～４５６、残基２２０～４５６、残基２２１～４５６、残基２２２～４５６、残基２２３～４５６、残基２２４～４５６、残基２２５～４５６、残基２２６～４５６、残基２２７～４５６、残基２２８～４５６、残基２２９～４５６、残基２３０～４５６、残基２３１～４５６、残基２３２～４５６、残基２３３～４５６、残基２３４～４５６、残基２３５～４５６、残基２３６～４５６、残基２３７～４５６、残基２３８～４５６、残基２３９～４５６、残基２４０～４５６、残基２４１～４５６、残基２４２～４５６、残基２４３～４５６、残基２４４～４５６、残基２４５～４５６、残基２４６～４５６、残基２４７～４５６、残基２４８～４５６、残基２４９～４５６、残基２５０～４５６または残基２５１～４５６または他のＵＧＴにおける対応する残基に対応する。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、表３、６または７における配列、配列番号２０７～２４２、配列番号２４３～３１６、配列番号２２５～２４２、配列番号２８０～３１６、配列番号３１７～３２２、配列番号３２３～３２８または配列番号３３０から選択される配列または本明細書に開示するＵＧＴの何れかと少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一(各数値間の全数値を含む)である、配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)を含む。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基でアミノ酸置換を含み得る。例えば、置換を含むアミノ酸残基は、例えば、Ｓ１２３；Ｆ１２４；Ｎ１４３；Ｔ１４４；Ｔ１４５；Ｖ１４９；Ｙ１７９；Ｇ１８；Ｓ１８０；Ａ１８１；Ｇ１８４；Ａ１８５；Ｖ１８６；Ｔ１８７；Ｋ１８９；Ｙ１９；Ｈ１９１；Ｋ１９２；Ｇ１９４；Ｅ１９５；Ａ１９８；Ｆ２７６；Ｎ３５５；Ｈ３７３；Ｌ３７４；Ｎ４７；Ｈ８３；Ｔ８４；Ｔ８５；Ｎ８６；Ｐ８９；および／またはＬ９２から選択される、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)のアミノ酸残基に対応するアミノ酸であり得る。このようなアミノ酸置換の非限定的例は次のものを含む。Ｓ１２３はアラニン、システイン、グリシンまたはバリンにまたはアラニン、システイン、グリシンまたはバリンの保存的置換に変異され得る；Ｆ１２４はチロシンにまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｎ１４３はアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、スレオニンまたはバリンにまたはアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、スレオニンまたはバリンの保存的置換に変異され得る；Ｔ１４４はアラニン、システイン、アスパラギンまたはプロリンにまたはアラニン、システイン、アスパラギンまたはプロリンの保存的置換に変異され得る；Ｔ１４５はアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンまたはセリンにまたはアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンまたはセリンの保存的置換に変異され得る；Ｖ１４９はシステイン、ロイシンまたはメチオニンにまたはシステイン、ロイシンまたはメチオニンの保存的置換に変異され得る；Ｙ１７９はグルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、バリンまたはトリプトファンにまたはグルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、バリンまたはトリプトファンの保存的置換に変異され得る；Ｇ１８はセリンにまたはセリンの保存的置換に変異され得る；Ｓ１８０はアラニンまたはバリンにまたはアラニンまたはバリンの保存的置換に変異され得る；Ａ１８１はリシンまたはスレオニンにまたはリシンまたはスレオニンの保存的置換に変異され得る；Ｇ１８４はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニンまたはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ａ１８５はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、スレオニン、トリプトファンまたはチロシンにまたはシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、スレオニン、トリプトファンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｖ１８６はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、トリプトファンまたはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、トリプトファンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｔ１８７はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンまたはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｋ１８９はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンのその保存的置換に変異され得る；Ｙ１９はフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシンまたはバリンにまたはフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシンまたはバリンの保存的置換に変異され得る；Ｈ１９１はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンへの変異の保存的置換に変異され得る；Ｋ１９２はシステインまたはフェニルアラニンにまたはシステインまたはフェニルアラニンの保存的置換に変異され得る；Ｇ１９４はアスパラギン酸、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、セリンまたはトリプトファンにまたはアスパラギン酸、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、セリンまたはトリプトファンの保存的置換に変異され得る；Ｅ１９５はアラニン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンまたはチロシンにまたはアラニン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ａ１９８はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンまたはチロシンにまたはシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｆ２７６はシステインまたはグルタミンにまたはシステインまたはグルタミンの保存的置換に変異され得る；Ｎ３５５はグルタミンまたはセリンまたはその何らかの保存的置換に変異され得る；Ｈ３７３はリシン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、バリンまたはチロシンにまたはリシン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、バリンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｌ３７４はアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンにまたはアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｎ４７はグリシンにまたはグリシンの保存的置換に変異され得る；Ｈ８３はグルタミンまたはトリプトファンにまたはグルタミンまたはトリプトファンの保存的置換に変異され得る；Ｔ８４はチロシンにまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｔ８５はグリシン、リシン、プロリン、セリンまたはチロシンにまたはグリシン、リシン、プロリン、セリンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｎ８６はアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、リシン、ロイシン、セリン、トリプトファンまたはチロシンにまたはアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、リシン、ロイシン、セリン、トリプトファンまたはチロシンの保存的置換に変異され得る；Ｐ８９はメチオニンまたはセリンにまたはメチオニンまたはセリンの保存的置換に変異され得る；および／またはＬ９２はヒスチジンまたはリシンにまたはヒスチジンまたはリシンの保存的置換に変異され得る；。
当業者は、あらゆるＵＧＴ酵素ついて、例えば、配列のアラインおよび／または二次構造の比較により、どのアミノ酸残基がＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)における特定のアミノ酸残基に対応するかを決定する方法を容易に認識する。非限定的例として、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)とＵ７３Ｃ６(配列番号１０３)の配列アライメント(例えば、Clustal Omegaを使用して実施、例えば、Larkin et al., Bioinformatics. 2007 Nov 1;23(21):2947-8)が図９に提供される。例えば、図９において、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の１２３位に対応するＵ７３Ｃ６(配列番号１０３)における残基はメチオニン(Ｍ)である。他の非限定的例として、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)における１４３位に対応するＵ７３Ｃ６(配列番号１０３)の残基はヒスチジン(Ｈ)である(図９)。他の非限定的例として、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)における２７３位に対応するＵ７３Ｃ６(配列番号１０３)における残基は、フェニルアラニン(Ｆ)である(図９)。
ある実施態様において、ＵＧＴは、表４に示すＵＧＴ９４－２８９－１におけるアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含む。
本発明のＵＧＴは、保存的アミノ酸置換および／または非保存的アミノ酸置換を含み得る。ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える保存的アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える非保存的アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、保存的または非保存的アミノ酸置換は、ＵＧＴタンパク質の保存された領域に位置しない。ある実施態様において、保存的または非保存的アミノ酸置換は、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１の残基８３～９２；残基１７９～１９８；残基Ｎ１４３；残基Ｌ３７４；残基Ｈ２１；または残基Ｄ１２２に対応する領域に位置しない。当業者は、保存的および／または非保存的置換を含むＵＧＴを試験して、該保存的および／または非保存的置換がＵＧＴの活性または機能に影響するか否かを決定することが容易に可能である。
ある実施態様において、ＵＧＴ酵素は、触媒ダイアドの１０オングストローム、９オングストローム８オングストローム、７オングストローム、６オングストローム、５オングストローム、４オングストローム、３オングストローム、２オングストローム以内または１オングストローム以内(各数値間の全数値を含む)に位置するアミノ酸置換を含む。触媒ダイアドは野生型ＵＧＴ９４－２８９－１の残基２１および１２２(例えば、ヒスチジン２１およびアスパラギン酸１２２)に対応し得る。当業者は、あらゆるＵＧＴ酵素ついて、例えば、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)との配列のアラインおよび／または二次構造の比較により、触媒ダイアドの対応位置を決定する方法を容易に認識することは認められる。
ある実施態様において、ＵＧＴ酵素は、ＵＧＴの１以上の構造モチーフに位置するアミノ酸残基でアミノ酸置換を含む。ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＵＧＴの二次構造の非限定的例は、ベータシート４とアルファヘリックス５の間のループ；ベータシート５；ベータシート５とアルファヘリックス６の間のループ；アルファヘリックス６；アルファヘリックス６と７の間のループ；ベータシート１とアルファヘリックス１の間のループ；アルファヘリックス７；アルファヘリックス７と８の間のループ；アルファヘリックス１；アルファヘリックス８；ベータシート８とアルファヘリックス１３の間のループ；アルファヘリックス１７；ベータシート１２とアルファヘリックス１８の間のループ；アルファヘリックス２；ベータシート３とアルファヘリックス３の間のループ；アルファヘリックス３；およびアルファヘリックス３と４の間のループ；ループ８；ベータシート５；ループ１０；アルファヘリックス５；ループ１１；ループ２；アルファヘリックス６；ループ１２；アルファヘリックス１；アルファヘリックス７；ループ１８；アルファヘリックス１４；ループ２６；アルファヘリックス２；ループ６；およびアルファヘリックス３を含む。
ある実施態様において：ループ８に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＳ１２３またはＦ１２４に対応する残基である；ベータシート５に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＮ１４３に対応する残基である；ループ１０に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＴ１４４またはＴ１４５に対応する残基である；アルファヘリックス５に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＶ１４９に対応する残基である；ループ１１に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＹ１７９に対応する残基である；ループ２に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＧ１８に対応する残基である；アルファヘリックス６に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＳ１８０またはＡ１８１に対応する残基である；ループ１２に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＧ１８４、Ａ１８５、Ｖ１８６、Ｔ１８７またはＫ１８９に対応する残基である；アルファヘリックス１に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＹ１９に対応する残基である；アルファヘリックス７に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＨ１９１、Ｋ１９２、Ｇ１９４、Ｅ１９５またはＡ１９８に対応する残基である；ループ１８に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＦ２７６に対応する残基である；アルファヘリックス１４に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＮ３５５に対応する残基である；ループ２６に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＨ３７３またはＬ３７４に対応する残基である；アルファヘリックス２に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＮ４７に対応する残基である；ループ６に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＨ８３、Ｔ８４、Ｔ８５またはＮ８６に対応する残基である；および／またはアルファヘリックス３に位置するアミノ酸残基は、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＰ８９またはＬ９２に対応する残基である。
ある実施態様において、ＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２、１７９～１８９、１～８２、９３～１４２、１４４～１７８、１９９～３７３または３７５～４５３に対応する領域にアミノ酸置換(例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８置換)を含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＮ１４３およびＬ３７４から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、Ｎ１４３に対応する残基は、負電荷Ｒ基、極性非電荷Ｒ基または非極性脂肪族Ｒ基に変異される。ある実施態様において、Ｌ３７４に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷Ｒ基、極性非電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基に変異される。ある実施態様において、ＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－１の残基８３～９２と少なくとも９０％同一またはＵＧＴ９４－２８９－１の残基１７９～１９８と少なくとも９５％同一である領域を含む。ＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－１の残基８３～９２と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一または１００％同一である領域を含み得る。ＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％同一または１００％同一である領域を含み得る。
ある実施態様において、宿主細胞はＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に比してアミノ酸置換を含む領域；および／または野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に比してアミノ酸置換を含む領域を含む。用語「アミノ酸置換」は１アミノ酸置換に限定されず、１を超えるアミノ酸置換を含む実施態様も含むことは認識される。ある実施態様において、宿主細胞はＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ここで、該ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基８３～９２に比して、１を超えないアミノ酸置換を含む領域；および／または野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に対応する領域であって、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)の残基１７９～１９８に比して、１を超えないアミノ酸置換を含む領域を含む。
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)における、Ｈ８３、Ｔ８４、Ｔ８５、Ｎ８６、Ｐ８９、Ｌ９２、Ｙ１７９、Ｓ１８０、Ａ１８１、Ｇ１８４、Ａ１８５、Ｖ１８６、Ｔ１８７、Ｋ１８９、Ｈ１９１、Ｋ１９２、Ｇ１９４、Ｅ１９５またはＡ１９８から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む。
ある実施態様において、Ｈ８３に対応する残基は、極性非電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｔ８４に対応する残基は、非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｔ８５に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷Ｒ基、極性非電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｎ８６に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、極性非電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、正電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｐ８９に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基または極性非電荷Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｌ９２に対応する残基は、正電荷Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｙ１７９は、負電荷Ｒ基、非極性芳香族Ｒ基、正電荷Ｒ基または非極性脂肪族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｓ１８０に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ａ１８１に対応する残基は、正電荷Ｒ基または極性非電荷Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｇ１８４に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、極性非電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、非極性芳香族Ｒ基または正電荷Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ａ１８５に対応する残基は、極性非電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｖ１８６に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、極性非電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、正電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｔ１８７に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、極性非電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、正電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｋ１８９に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、極性非電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、非極性芳香族Ｒ基または正電荷Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｈ１９１に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、極性非電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、正電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｋ１９２に対応する残基は、極性非電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｇ１９４は、負電荷Ｒ基、非極性脂肪族Ｒ基、極性非電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；Ｅ１９５に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷Ｒ基、極性非電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている；および／またはＡ１９８に対応する残基は、極性非電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、非極性芳香族Ｒ基、正電荷Ｒ基または非極性脂肪族Ｒ基を含むアミノ酸に変異されている。
ある実施態様において、ＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＮ１４３およびＬ３７４から選択されるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に、アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、Ｎ１４３に対応する残基は、負電荷Ｒ基、極性非電荷Ｒ基または非極性脂肪族Ｒ基に変異される。ある実施態様において、Ｌ３７４に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷Ｒ基、極性非電荷Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基に変異される。
本発明のＵＧＴは、酸素化部位の何れか(例えば、Ｃ３、Ｃ１１、Ｃ２４およびＣ２５)でモグロールまたはモグロシドのグリコシル化が可能であり得る。ある実施態様において、ＵＧＴは、分岐グリコシル化(例えば、モグロシドのＣ３またはＣ２４での分岐グリコシル化)が可能である。
本発明のＵＧＴのための適当な基質の非限定的例は、モグロールおよびモグロシド(例えば、モグロシドＩＡ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩＥ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)またはモグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、シアメノシドＩ)を含む。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、モグロシドＩＡ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩＥ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドII－Ａ２(ＭIIＡ２)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドIV、モグロシドIVａ、イソモグロシドIVおよび／またはモグロシドＶを産生できる。
ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換の触媒ができる。
ＵＧＴの比活性などの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＵＧＴ(例えば、バリアントＵＧＴ)の比活性などの活性は、単位時間あたりの単位酵素あたりに産生されるグリコシル化モグロシドの量の測定により決定され得る。例えば、比活性などの活性は、１時間あたり酵素１グラムあたりに産生されるグリコシル化モグロシド標的のmmolで測定され得る。活性(例えば、比活性)を測定する方法の非限定的例は、下記実施例に提供される。ある実施態様において、本発明のＵＧＴ(例えば、バリアントＵＧＴ)は、１時間あたり酵素１グラムあたりに産生されるグリコシル化モグロシド標的が少なくとも０.１mmol(例えば、少なくとも１mmol、少なくとも１.５mmol、少なくとも２mmol、少なくとも２.５mmol、少なくとも３、少なくとも３.５mmol、少なくとも４mmol、少なくとも４.５mmol、少なくとも５mmol、少なくとも１０mmol(各数値間の全数値を含む))である比活性などの活性を有し得る。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴの比活性などの活性は、対照ＵＧＴより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍(各数値間の全数値を含む))大きい。ある実施態様において、対照ＵＧＴはＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)である。ある実施態様において、アミノ酸置換を有するＵＧＴに関して、対照ＵＧＴは、アミノ酸置換がない以外同じＵＧＴである。
当業者は、タンパク質に付随する構造的および／または機能的情報に基づき、タンパク質をＵＧＴ酵素として特徴づけされ得ることは認識される。例えば、タンパク質は、モグロールなどのモグロシド前駆体存在下、１以上のモグロシドを産生する能力などの、機能に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。
他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質と既知ＵＧＴ酵素間のパーセント同一性に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、本明細書に記載するＵＧＴ配列の何れかまたは他のＵＧＴ酵素の何れかの配列と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一(各数値間の全数値を含む)であり得る。他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質における、ＵＧＴ酵素と関連する１以上のドメインの存在に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、当分野で知られるＵＧＴ酵素の特徴である糖結合ドメインおよび／または触媒ドメインの存在に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。ある実施態様において、触媒ドメインは、グリコシル化される基質に結合する。
他の実施態様において、タンパク質は、既知ＵＧＴ酵素の三次元構造造と比較する、タンパク質の三次元構造の比較に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、アルファヘリックスドメイン、ベータシートドメインなどの数または位置に基づき、ＵＧＴとして特徴づけされる。ＵＧＴ酵素は合成タンパク質であり得ることは認識される。
ある実施態様において、ＵＧＴは、配列番号１０９の配列を含まない。ある実施態様において、ＵＧＴは、配列番号１０９に９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７９％未満、７８％未満、７７％未満、７６％未満、７５％未満、７４％未満、７３％未満、７２％未満、７１％未満または７０％未満の同一性を含む。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素
本発明の態様は、例えば、モグロールの産生に有用であり得る、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素を提供する。
本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、表８におけるＣ１１ヒドロキシラーゼ配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)、配列番号１１３、１１４、１２９または１３０に示す配列または本明細書に開示するもしくは当分野で知られるあらゆるＣ１１ヒドロキシラーゼ配列と、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(各数値間の全数値を含む)である配列を含み得る。
ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、モグロール前駆体(例えば、ククルビタジエノール、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、２４,２５－ジヒドロキシ－ククルビタジエノールおよび／または２４,２５－エポキシ－ククルビタジエノール)を酸化できる。ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、モグロールの形成を触媒する。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼの比活性などの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により決定され得ることは認識される。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの活性(例えば、比活性)は、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体または産生されるモグロールの濃度として測定され得る。ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、少なくとも０.０００１～０.００１μmol／分／mg、少なくとも０.００１～０.０１μmol／分／mg、少なくとも０.０１～０.１μmol／分／mgまたは少なくとも０.１～１μmol／分／mg(各数値間の全数値を含む)の活性(例えば、比活性)を有する。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの比活性などの活性は、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも１００００倍(各数値間の全数値を含む))大きい。
シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素
本発明の態様は、例えば、モグロールの産生に有用であり得る、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素を提供する。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、ＮＡＤＰＨ：フェリヘモタンパク質オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：ヘムタンパク質オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０オキシドレダクターゼ、Ｐ４５０レダクターゼ、ＰＯＲ、ＣＰＲおよびＣＹＰＯＲとも称される。これらのレダクターゼは、ＮＡＤＰＨからＣ１１ヒドロキシラーゼへの電子移動を触媒することにより、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ活性を助長できる。
本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、表８におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼ配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)、配列番号１１５、１１６、１３１または１３２に示す配列または本明細書に開示するもしくは当分野で知られるあらゆるシトクロムｐ４５０レダクターゼと、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(各数値間の全数値を含む)である配列を含み得る。
ある実施態様において、本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、モグロール前駆体(例えば、ククルビタジエノール、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、２４,２５－ジヒドロキシ－ククルビタジエノールおよび／または２４,２５－エポキシ－ククルビタジエノール)の酸化を促進できる。ある実施態様において、本発明のＰ４５０レダクターゼは、モグロール前駆体またはモグロールの形成を触媒する。
シトクロムＰ４５０レダクターゼの活性(例えば、比活性)は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、組み換えシトクロムＰ４５０レダクターゼの活性(例えば、比活性)は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ存在下、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体または産生されるモグロールの濃度として測定され得る。ある実施態様において、本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、少なくとも０.０００１～０.００１μmol／分／mg、少なくとも０.００１～０.０１μmol／分／mg、少なくとも０.０１～０.１μmol／分／mgまたは少なくとも０.１～１μmol／分／mg(各数値間の全数値を含む)の活性(例えば、比活性)を有する。
ある実施態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼの活性(例えば、比活性)は、対照シトクロムＰ４５０レダクターゼより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも１００００倍(各数値間の全数値を含む)大きい。
エポキシドヒドロラーゼ酵素(ＥＰＨ)
本発明の態様は、例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールから２４－２５ジヒドロキシ－ククルビタジエノールへの変換または１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールからモグロールへの変換に有用であり得る、エポキシドヒドロラーゼ酵素(ＥＰＨ)を提供する。ＥＰＨは、エポキシドを２個のヒドロキシルに変換できる。
本発明のＥＰＨは、表８におけるＥＰＨ配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)、配列番号１１７～１２５または１３３～１４１に示す配列または本明細書に開示するもしくは当分野で知られるあらゆるＥＰＨ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(各数値間の全数値を含む)である配列を含み得る。
ある実施態様において、組み換え本発明のＥＰＨは、ククルビタジエノール化合物におけるエポキシドの加水分解(例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールにおけるエポキシドの加水分解)を促進できる。ある実施態様において、本発明のＥＰＨは、モグロール前駆体(例えば、２４－２５ジヒドロキシ－ククルビタジエノール)の形成を触媒する。
ＥＰＨの活性(例えば、比活性)は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＥＰＨの活性(例えば、比活性)は、産生されるモグロール前駆体(例えば、２４－２５ジヒドロキシ－ククルビタジエノール)またはモグロールの濃度として測定され得る。ある実施態様において、組み換え本発明のＥＰＨは、少なくとも１～１００μg／Ｌ、少なくとも１００～１０００μg／Ｌ、少なくとも１～１００mg／Ｌ、少なくとも１００～１０００mg／Ｌ、少なくとも１～１０ｇ／Ｌまたは少なくとも１０～１００ｇ／Ｌ(各数値間の全数値を含む)の産生を可能とする。
ある実施態様において、ＥＰＨの活性(例えば、比活性)は、対照ＥＰＨより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍(各数値間の全数値を含む))大きい。
スクアレンエポキシダーゼ酵素(ＳＱＥ)
本発明の態様は、スクアレン(例えば、スクアレンまたは２－３－オキシドスクアレン)を酸化して、スクアレンエポキシド(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３,２２－２３－ジエポキシスクアレン)を産生できる、スクアレンエポキシダーゼ(ＳＱＥ)を提供する。ＳＱＥは、スクアレンモノオキシゲナーゼとも称され得る。
本発明のＳＱＥは、表８におけるＳＱＥ配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)、配列番号１２６～１２８または１４２～１４４に示す配列または本明細書に開示するもしくは当分野で知られるあらゆるＳＱＥ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(各数値間の全数値を含む)である配列を含み得る。
ある実施態様において、本発明のＳＱＥは、スクアレン化合物におけるエポキシド形成(例えば、スクアレンまたは２,３－オキシドスクアレンのエポキシ化)を促進できる。ある実施態様において、本発明のＳＱＥは、モグロール前駆体(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３,２２－２３－ジエポキシスクアレン)の形成を促進する。
組み換えＳＱＥの比活性などの活性は、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３,２２－２３－ジエポキシスクアレン)の濃度として測定され得る。ある実施態様において、本発明のＳＱＥは、少なくとも０.００００００１μmol／分／mg(例えば、少なくとも０.０００００１μmol／分／mg、少なくとも０.００００１μmol／分／mg、少なくとも０.０００１μmol／分／mg、少なくとも０.００１μmol／分／mg、少なくとも０.０１μmol／分／mg、少なくとも０.１μmol／分／mg、少なくとも１μmol／分／mg、少なくとも１０μmol／分／mgまたは少なくとも１００μmol／分／mg(各数値間の全数値))の比活性などの活性を有する、
ある実施態様において、ＳＱＥの比活性などの活性は、対照ＳＱＥより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍(数値間の全数値を含む))大きい。
バリアント
本発明の態様は、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼおよびＥＰＨおよびＳＱＥ酵素など、記載される組み換えポリペプチドの何れかをコードするポリヌクレオチドに関する。本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列のバリアントも、本発明により包含される。バリアントは、参照配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性(数値間の全数値を含む)を共有し得る。
特に断らない限り、用語「配列同一性」は、当分野で知られるとおり、配列比較(アライメント)により決定した、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係をいう。ある実施態様において、配列同一性は、配列の全長にわたり決定されるが、他の実施態様において、配列同一性は、配列領域にわたり決定される。
同一性は、一連の２以上の残基(例えば、核酸またはアミノ酸残基)間のマッチ数により決定される、２個の配列間の配列関連性の程度ともいい得る。同一性は、特定の数学的モデル、アルゴリズムまたはコンピュータープログラムにより処理されるギャップアライメント(あるならば)を伴う２以上の配列の小さいほうの間の同一マッチのパーセントを測定する。
関連ポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、当業者に知られる方法の何れかにより容易に計算され得る。２個の配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)の「パーセント同一性」は、例えば、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変したKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して決定され得る。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ(登録商標)およびＸＢＬＡＳＴ(登録商標)プログラム(バージョン２.０)に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ(登録商標)タンパク質サーチは、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、単語長＝３で実施して、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２配列間にギャップが存在するとき、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ(登録商標)を、例えば、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載のとおり実施できる。ＢＬＡＳＴ(登録商標)およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ(登録商標)プログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴ(登録商標)およびＮＢＬＡＳＴ(登録商標))のデフォルトパラメータを使用できまたはパラメータを当業者により理解されるとおり適切に調整できる。
使用され得る他の局所アライメント技術は、例えば、Smith-Watermanアルゴリズム(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197)に基づく。使用され得る一般的包括的アライメント技術は、例えば、動的計画法に基づく、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453)である。
さらに最近、Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm(ＦＯＧＳＡＡ)が開発され、これは、Needleman-Wunschアルゴリズムを含む他の最適包括的アライメント方法より速く、核酸およびアミノ酸配列の包括的アライメントを作成するとされている。ある実施態様において、２個のポリペプチドの同一性を、２個のアミノ酸配列をアラインし、同一アミノ酸数を計算し、アミノ酸配列の一方の長さで除すことにより決定する。ある実施態様において、２個の核酸の同一性を、２個のヌクレオチド配列をアラインし、同一ヌクレオチド数を計算し、核酸の一方の長さで除すことにより決定する。
複数配列アライメントのために、Clustal Omega(Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)を含むコンピュータープログラムが使用され得る。
核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、当業者に知られる何らかの方法を使用して、本明細書に開示の配列および／または特許請求の範囲に記載する配列などの参照配列と特定のパーセント同一性を有することが判明し得ることは認識される。異なるアルゴリズムは、ある１組の配列で異なるパーセント同一性値となり得る。本発明の特許請求の範囲は、参照配列に対するパーセント同一性があるアルゴリズムについてデフォルトパラメータおよび／または一般に当業者により使用されるパラメータを使用して計算された配列を含むことは理解される。
本明細書で使用する、配列「Ｘ」における残基(例えば核酸残基またはアミノ酸残基)は、配列ＸおよびＹを当分野で知られるアミノ酸配列アライメントツールを使用してアラインしたとき、配列「Ｘ」における該残基が異なる配列「Ｙ」における「ｚ」のカウンターパート位置にあるならば、該配列「Ｙ」における「ｚ」位または残基(例えば核酸残基またはアミノ酸残基)に対応するという。
バリアント配列は相同配列であり得る。本明細書で使用する、相同配列は、特定のパーセント同一性(例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％パーセント同一性(各数値間の全数値を含む))を共有する配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)である。相同配列は、パラロガス配列、オルソロガス配列または収斂進化に起因する配列を含むが、これらに限定されない。パラロガス配列は、種のゲノム内の遺伝子の重複に起因し、一方オルソロガス配列は、種分化事象後分岐する。２つの異なる種は、独立して進化しているかもしれないが、各々、収斂進化の結果として、他方の種からの配列と特定のパーセント同一性を有する配列を含み得る。
ある実施態様において、ポリペプチドバリアント(例えば、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはＳＱＥバリアント)は、対照ポリペプチド(例えば、対照ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはＳＱＥ)と二次構造(例えば、アルファヘリックス、ベータシート)を共有するドメインを含む。ある実施態様において、ポリペプチドバリアント(例えば、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはＳＱＥバリアント)は、対照ポリペプチド(例えば、対照ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはＳＱＥ)と三次構造を共有する。非限定的例として、バリアントポリペプチドは、対照ポリペプチドと比較して低い一次配列同一性(例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満配列同一性)を有するが、１以上の二次構造(例えば、ループ、アルファヘリックスまたはベータシートを含むが、これらに限定されない)を共有するかまたは対照ポリペプチドと同じ三次構造を有し得る。例えば、ループは、ベータシートとアルファヘリックス間、２個のアルファヘリックス間または２個のベータシート間に位置し得る。相同性モデリングを使用して、２以上の三次構造を比較し得る。
当業者に知られる多様な方法により、ヌクレオチド配列に変異を付し得る。例えば、変異を、ＰＣＲ指向変異、Kunkel(Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985)の方法による部位特異的変異誘発、ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成、遺伝子編集ツールまたはタグ(例えば、ＨＩＳタグまたはＧＦＰタグ)挿入などの挿入により付し得る。変異は、例えば、当分野で知られる何らかの方法により産生される、置換、欠失および転座を含み得る。変異を産生する方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, 2010などの参考書に見られ得る。
ある実施態様において、バリアントを産生する方法は、循環置換を含む(Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25)。循環置換の非限定的例は、実施例５および図７に提供される。循環置換において、ポリペプチドの直鎖状一次配列が環状化(例えば、配列のＮ末端とＣ末端の結合による)され、ポリペプチドを異なる位置で切断(「破壊」)し得る。故に、新規ポリペプチドの直鎖状一次配列は、直鎖状配列アライメント方法(例えば、Clustal OmegaまたはＢＬＡＳＴ)により決定して、低配列同一性(例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満(各数値間の全数値を含む))を有し得る。しかしながら、２個のタンパク質の位相的分析は、２個のポリペプチドの三次構造が類似または相違することを確認し得る。特定の理論に拘束されないが、対照ポリペプチドの循環置換により作製し、対照ポリペプチドと類似する三次構造を有するバリアントポリペプチドは、類似する機能的特徴(例えば、酵素活性、酵素動力学、基質特異性または産物特異性)を有し得る。ある場合、循環置換は二次構造、三次構造または四次構造を変え、異なる機能的特徴(例えば、酵素活性が増加または低減、異なる基質特異性または異なる産物特異性)の酵素を生じ得る。例えば、Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25参照。
循環置換を受けたタンパク質で、タンパク質の直鎖状アミノ酸配列は、循環置換を受けていない対照タンパク質と異なることは認識される。しかしながら、循環置換を受けたタンパク質のどの残基が、循環置換を受けていない対照タンパク質における残基に対応するか、例えば、配列をアラインし、保存されたモチーフを決定するおよび／または、例えば、相同性モデリングにより、タンパク質の構造または予測構造の比較により、当業者は容易に決定できる。
ある実施態様において、目的の配列と本明細書に記載の対照配列のパーセント同一性を決定するアルゴリズムは、これら配列間の循環置換の存在を説明する。循環置換の存在は、例えば、RASPODOM(Weiner et al., Bioinformatics. 2005 Apr 1;21(7):932-7)を含む、当分野で知られる何らかの方法を使用して検出され得る。ある実施態様において、循環置換の存在は、目的の配列と本明細書に記載の配列のパーセント同一性前に補正される(例えば、少なくとも１つの配列におけるドメインが再配列される)。本発明の特許請求の範囲は、対照配列に対するパーセント同一性が、配列の循環置換の可能性を考慮した後、計算されている配列を含むと理解される。
本明細書に開示する組み換えＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨおよびスクアレンエポキシダーゼの機能的バリアントも、本発明により包含される。例えば、機能的バリアントは、１以上の同じ基質(例えば、モグロール、モグロシドまたはその前駆体)と結合するか、１以上の同じ産物(例えば、モグロール、モグロシドまたはその前駆体)を産生し得る。機能的バリアントは、当分野で知られる何らかの方法を使用して、同定され得る。例えば、上記Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを、既知機能を有する相同タンパク質の同定に使用し得る。
推定される機能的バリアントは、機能的にアノテートされたドメインを有するポリペプチドのサーチによっても同定され得る。Pfam(Sonnhammer et al., Proteins. 1997 Jul;28(3):405-20)を含むデータベースを使用して、特定のドメインを有するポリペプチドを同定し得る。例えば、オキシドスクアレンシクラーゼ中で、さらなるＣＤＳ酵素が、ある場合、配列番号７４の１２３位に対応するロイシン残基を有するポリペプチドのサーチにより同定され得る。このロイシン残基は、ＣＤＳ酵素の産物特異性決定と関連付けられている；この残基の変異は、例えば、産物としてシクロアルテノールまたはパルケオールをもたらす(Takase et al., Org Biomol Chem. 2015 Jul 13(26):7331-6)。
さらなるＵＧＴ酵素が、例えば、ＵＤＰＧＴドメイン(PROSITE accession number PS00375)を有するポリペプチドのサーチにより、同定され得る。
相同性モデリングも、機能に影響することなく、変異しやすいアミノ酸残基の同定に使用され得る。このような方法の非限定的例は、位置特異的スコアマトリックス(ＰＳＳＭ)およびエネルギー最小化プロトコールの使用を含み得る(例えば、下記実施例５参照)。例えば、Stormo et al., Nucleic Acids Res. 1982 May 11;10(9):2997-3011参照。
ＰＳＳＭは、野生型と単一点変異体の間の差異を決定する、ロゼッタエネルギー関数の計算と対合され得る。特定の理論に拘束されないが、潜在的に安定化する変異が、タンパク質操作(例えば、機能的ホモログの産生)で望まれる。ある実施態様において、潜在的に安定化する変異は、－０.１未満(例えば、－０.２未満、－０.３未満、－０.３５未満、－０.４未満、－０.４５未満、－０.５未満、－０.５５未満、－０.６未満、－０.６５未満、－０.７未満、－０.７５未満、－０.８未満、－０.８５未満、－０.９未満、－０.９５未満または－１.０未満)のロゼッタエネルギー単位(Ｒ.ｅ.ｕ.)のΔΔＧｃａｌｃ値を有する。例えば、Goldenzweig et al., Mol Cell. 2016 Jul 21;63(2):337-346. doi: 10.1016/j.molcel.2016.06.012参照。
ある実施態様において、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはＳＱＥコード配列は、対照コード配列に対応する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００を超える位置に変異を含む。ある実施態様において、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはＳＱＥコード配列は、対照コード配列に対してコード配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９,１００またはそれ以上のコドンに変異を含む。当業者には理解されるとおり、コドン内の変異は、遺伝暗号の縮重により、該コドンによりコードされるアミノ酸を変化させるかもしれないし、させないかもしれない。ある実施態様において、コード配列における１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、コード配列のアミノ酸配列を変えない。
ある実施態様において、組み換えＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはＳＱＥ配列における１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変える。ある実施態様において、１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して組み換えポリペプチドのアミノ酸配列を変え、対照ポリペプチドに対してポリペプチドの活性を変える(増強または低減)。
本明細書に記載する組み換えポリペプチドの何れかの、比活性を含む活性は、日常的な方法を使用して測定され得る。非限定的例として、組み換えポリペプチドの活性を、その基質特異性、生産される産物、生産される産物の濃度またはこれらの何らかの組み合わせの測定により決定し得る。本明細書で使用する、組み換えポリペプチドの「比活性」は、単位時間あたりある量(例えば、濃度)の組み換えポリペプチドにより産生される特定の産物の量(例えば、濃度)をいう。
組み換えポリペプチドコード配列における変異は、前記ポリペプチドの機能的に等価なバリアント、例えば、ポリペプチドの活性を保持するバリアントを提供するための保存的アミノ酸置換をもたらし得ることも当業者は認識する。本明細書で使用する、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的電荷もしくはサイズ特徴または機能的活性を変えないアミノ酸置換をいう。
ある場合、アミノ酸は、そのＲ基(例えば、表１参照)により特徴づけられる。例えば、アミノ酸は、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、非極性芳香族Ｒ基または極性非電荷Ｒ基を含み得る。非極性脂肪族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンを含む。正電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む。負電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。非極性、芳香族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む。極性非電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。
ポリペプチドの機能的に等価なバリアントの非限定的例は、本明細書に開示のタンパク質のアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含み得る。アミノ酸の保存的置換は、次の群内のアミノ酸間でなされる置換である：(ａ)Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；(ｂ)Ｆ、Ｙ、Ｗ；(ｃ)Ｋ、Ｒ、Ｈ；(ｄ)Ａ、Ｇ；(ｅ)Ｓ、Ｔ；(ｆ)Ｑ、Ｎ；および(ｇ)Ｅ、Ｄ。保存的アミノ酸置換のさらなる非限定的例を表１に提供する。
ある実施態様において、バリアントポリペプチドの調製時、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０を超える残基を変え得る。ある実施態様において、アミノは保存的アミノ酸置換により置換される。
Figure 0007498708000002
所望の性質および／または活性を有する組み換えポリペプチドバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、ポリペプチドのコード配列の改変により行い得る。同様に、ポリペプチドの機能的に等価なバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、一般に組み換えポリペプチド(例えば、ＵＧＴ、ＣＤＳ、Ｐ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはスクアレンエポキシダーゼ)のコード配列の改変により行う。
宿主細胞における核酸の発現
本発明の態様は、酵素、その機能的修飾体およびバリアントをコードする遺伝子の組み換え発現ならびにそれに関連する使用に関する。例えば、本明細書に記載する方法を、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生に使用され得る。
遺伝子を含むポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドに関する用語「異種」は、用語「外来性」および用語「組み換え」と相互交換可能に使用され、生物系に人工的に供給されているポリヌクレオチド；生物系内で修飾されているポリヌクレオチド；または発現または制御が生物系内で操作されているポリヌクレオチドをいう。宿主細胞に導入されるまたは発現される異種ポリヌクレオチドは、宿主細胞と異なる生物または種由来のポリヌクレオチドであり得るかまたは合成ポリヌクレオチドであり得るかまたは宿主細胞と同じ生物または種でまた内因性に発現されるポリヌクレオチドであり得る。例えば、宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドは、宿主細胞で天然ではない位置である；安定的または一過性に宿主細胞で組み換え発現される；宿主細胞内で修飾される；宿主細胞内で選択的に編集される；天然に存在するコピー数と異なるコピー数で宿主細胞内で発現される；またはポリヌクレオチドの発現を制御する制御領域の操作によるなど、宿主細胞内で天然ではない方法で発現されるとき、異種とみなされる。ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドであるが、発現が該ポリヌクレオチドの発現を天然では制御しないプロモーターにより駆動される。他の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドであり、その発現は該ポリヌクレオチドの発現を天然で制御するプロモーターにより駆動されるが、該プロモーターまたは他の制御領域が修飾される。ある実施態様において、プロモーターは、組み換えにより活性化または抑制される。例えば、遺伝子編集ベースの技術を使用して、内因性ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの、内因性プロモーターを含むプロモーターからの発現を制御し得る。例えば、Chavez et al., Nat Methods. 2016 Jul; 13(7): 563-567参照。異種ポリヌクレオチドは、対照ポリヌクレオチド配列と比較して野生型配列または変異体配列を含み得る。
本明細書に記載するＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはＳＱＥなどの組み換えポリペプチドの何れかをコードする核酸を、当分野で知られる何れかの方法により何れかの適切なベクターに組み込み得る。例えば、ベクターは、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター)を含むが、これらに限定されない発現ベクター、一過性発現に適するあらゆるベクター、構成的発現に適するあらゆるベクターまたは誘導型発現に適するあらゆるベクター(例えば、ガラクトース誘導型またはドキシサイクリン誘導型ベクター)であり得る。組み換えポリペプチド(例えば、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨまたはスクアレンエポキシダーゼ)の発現のためのベクターの非限定的例は、下の実施例１に記載される。
ある実施態様において、ベクターは、細胞で自律的に複製する。ベクターは、１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含み、本明細書に記載の遺伝子を含む核酸の挿入およびライゲートのために制限エンドヌクレアーゼにより切断され、細胞で複製できる組み換えベクターが産生され得る。ベクターは、一般にＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。クローニングベクターは、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する、用語「発現ベクター」または「発現構築物」は、酵母細胞などの宿主細胞における特定の核酸の転写を可能とする一連の特定の核酸要素を有する、組み換えまたは合成により産生された、核酸構築物をいう。ある実施態様において、本明細書に記載する遺伝子の核酸配列を、制御配列と操作可能に結合し、ある実施態様において、ＲＮＡ転写物として発現されるように、クローニングベクターに挿入される。ある実施態様において、ベクターは、組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を同定するための、本明細書に記載する選択可能マーカーなどの１以上のマーカーを含む。ある実施態様において、本明細書に記載する遺伝子の核酸配列は再コード化される。再コード化は、再コード化されていない対照配列に比して、遺伝子産物の産生を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％(各数値間の全数値を含む))増加させ得る。
コード配列および制御配列は、コード配列と制御配列が共有結合され、コード配列の発現または転写が該制御配列の影響または制御下にあるならば、「操作可能に結合」または「操作可能に連結」されたという。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されるならば、コード配列および制御配列は、５’制御配列におけるプロモーターの導入がコード配列を翻訳させるならばおよびコード配列と制御配列の間の結合の性質が、(１)フレームシフト変異の導入をもたらす、(２)プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力を妨害するまたは(３)対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害することがないならば、操作可能に結合または連結されたという。
ある実施態様において、本明細書に記載するタンパク質の何れかをコードする核酸は、制御配列(例えば、エンハンサー配列)の制御下にある。ある実施態様において、核酸は、プロモーターの制御下発現される。プロモーターは、天然プロモーター、例えば、内因性状況で遺伝子のプロモーターであり、該遺伝子の発現の通常の制御を提供する。あるいは、プロモーターは、遺伝子の天然プロモーターと異なるプロモーター、例えば、その内因性状況における遺伝子のプロモーターと異なるプロモーターである。本明細書で使用する、「異種プロモーター」または「組み換えプロモーター」は、天然ではないまたは通常関連していないまたは操作可能に結合したＤＮＡ配列の転写を天然でもしくは通常制御しない、プロモーターである。ある実施態様において、ヌクレオチド配列は異種プロモーターの制御下にある。
ある実施態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターである。真核生物プロモーターの非限定的例は、当業者に知られるとおり、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１ ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＧＡＬ３、ＧＡＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ２５、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＵＰ１－１、ＥＮＯ２およびＳＯＤ１を含む(例えば、Addgene website: blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region参照)。ある実施態様において、プロモーターは、原核生物プロモーター(例えば、バクテリオファージまたは細菌プロモーター)である。バクテリオファージプロモーターの非限定的例は、Ｐｌｓ１ｃｏｎ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６およびＰＬを含む。細菌プロモーターの非限定的例は、Ｐｂａｄ、ＰｍｇｒＢ、Ｐｔｒｃ２、Ｐｌａｃ／ａｒａ、ＰｔａｃおよびＰｍを含む。
ある実施態様において、プロモーターは誘導型プロモーターである。本明細書で使用する、「誘導型プロモーター」は、分子の存在または不在により制御されるプロモーターである。誘導型プロモーターの非限定的例は、化学制御プロモーターおよび物理制御プロモーターを含む。化学制御プロモーターについて、転写活性は、アルコール、テトラサイクリン、ガラクトース、ステロイド、金属または他の化合物などの１以上の化合物により制御される。物理制御プロモーターについて、転写活性は、光または温度などの現象により制御され得る。テトラサイクリン制御プロモーターの非限定的例は、ヒドロテトラサイクリン(ａＴｃ)応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系(例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質(ｔｅｔＲ)、テトラサイクリンオペレーター配列(ｔｅｔＯ)およびテトラサイクリントランスアクティベーター融合タンパク質(ｔＴＡ))を含む。ステロイド制御プロモーターの非限定的例は、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーターに基づくプロモーターを含む。金属制御プロモーターの非限定的例は、メタロチオネイン(金属イオンを結合および隔離するタンパク質)遺伝子に由来するプロモーターを含む。病因制御プロモーターの非限定的例は、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール(ＢＴＨ)により誘導されるプロモーターを含む。温度／熱誘導型プロモーターの非限定的例は、ヒートショックプロモーターを含む。光制御プロモーターの非限定的例は、植物細胞の光反応性プロモーターを含む。ある実施態様において、誘導型プロモーターはガラクトース誘導型プロモーターである。ある実施態様において、誘導型プロモーターは、１以上の生理学的条件(例えば、ｐＨ、温度、放射、浸透圧、食塩水勾配、細胞表面結合または１以上の外因性もしくは内因性誘導剤の濃度)により誘導される。外因性インデューサーまたは誘導剤の非限定的例は、アミノ酸およびアミノ酸アナログ、サッカライドおよび多糖、核酸、タンパク質転写アクティベーターおよびリプレッサー、サイトカイン、毒素、石油ベースの化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモンまたはこれらの何らかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。本明細書で使用する、「構成的プロモーター」は、遺伝子の連続的転写を可能とする非制御プロモーターをいう。構成的プロモーターの非限定的例は、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＥＮＯ２およびＳＯＤ１を含む。
当業者に知られる他の誘導型プロモーターまたは構成的プロモーターも考慮される。
遺伝子発現に必要な制御配列の厳密な性質は種または細胞型により変わり得るが、一般に、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含む。特に、このような５’非転写制御配列は、操作可能に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。制御配列は、エンハンサー配列または上流アクティベーター配列も含み得る。本明細書に開示するベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列を含み得る。制御配列はターミネーター配列も含み得る。ある実施態様において、ターミネーター配列は、転写中のＤＮＡ遺伝子の終わりを示す。宿主細胞における本明細書に記載する１以上の遺伝子の発現に適する１以上の適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
発現に必要な要素を含む発現ベクターは市販され、当業者に知られる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012参照)。
ある実施態様において、宿主細胞への組み換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの導入は、ポリヌクレオチドのゲノム統合をもたらす。ある実施態様において、宿主細胞は、ゲノムにおいて、本明細書に記載する組み換えポリペプチドの何れかをコードするポリヌクレオチド配列などのポリヌクレオチド配列を少なくとも１コピー、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも１１コピー、少なくとも１２コピー、少なくとも１３コピー、少なくとも１４コピー、少なくとも１５コピー、少なくとも１６コピー、少なくとも１７コピー、少なくとも１８コピー、少なくとも１９コピー、少なくとも２０コピー、少なくとも２１コピー、少なくとも２２コピー、少なくとも２３コピー、少なくとも２４コピー、少なくとも２５コピー、少なくとも２６コピー、少なくとも２７コピー、少なくとも２８コピー、少なくとも２９コピー、少なくとも３０コピー、少なくとも３１コピー、少なくとも３２コピー、少なくとも３３コピー、少なくとも３４コピー、少なくとも３５コピー、少なくとも３６コピー、少なくとも３７コピー、少なくとも３８コピー、少なくとも３９コピー、少なくとも４０コピー、少なくとも４１コピー、少なくとも４２コピー、少なくとも４３コピー、少なくとも４４コピー、少なくとも４５コピー、少なくとも４６コピー、少なくとも４７コピー、少なくとも４８コピー、少なくとも４９コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも６０コピー、少なくとも７０コピー、少なくとも８０コピー、少なくとも９０コピー、少なくとも１００コピーまたはそれ以上(各数値間のあらゆる数値を含む)含む。
宿主細胞
本発明のタンパク質または酵素の何れかを、宿主細胞で発現させ得る。本明細書で使用する、用語「宿主細胞」は、モグロール、モグロシドおよびその前駆体の産生に使用する酵素をコードするポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを発現させるために使用され得る細胞をいう。
真核生物細胞または原核生物細胞を含む、あらゆる適当な宿主細胞を、本明細書に開示するＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨおよびＳＱＥを含む組み換えポリペプチドの何れかの産生に使用できる。適当な宿主細胞は、真菌細胞(例えば、酵母細胞)、細菌細胞(例えば、大腸菌細胞)、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む動物細胞を含むが、これらに限定されない。
適当な酵母宿主細胞は、カンジダ、エシェリキア、ハンセヌラ、サッカロミセス(例えば、出芽酵母)、シゾサッカロマイセス、ピキア、クルイベロマイセス(例えば、クルイベロマイセス・ラクチス)およびヤロウイアを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、酵母細胞がハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・カールスベルゲンシス、サッカロミセス・ディアスタティックス、サッカロミセス・ノルベンシス、サッカロミセス・クルイベリ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コダマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・ケルクウム、ピキア・ピジェペリ、ピキア・スティピティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・アングスタ、クルイベロミセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンスまたはヤロウイア・リポリティカである。
ある実施態様において、酵母株は工業的多数体酵母株である。真菌細胞の他の非限定的例は、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、リゾプス属、アクレモニウム属、アカパンカビ属、ソルダリア属、マグナポルテ属、アロミセス属、ウスティラゴ属ボトリチス属、およびトリコデルマ属から得られた細胞を含む。
ある実施態様において、宿主細胞はクラミドモナス(例えば、クラミドモナス・ラインハルトチイ)およびフォルミディウム(P.sp.ATCC29409)などの藻類細胞である。
他の実施態様において、宿主細胞は原核生物細胞である。適当な原核生物細胞は、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定細菌細胞を含む。宿主細胞は、アグロバクテリウム、アリシクロバチルス、アナバエナ、アナシスティス、アシネトバクター、アシドサーマス、アートロバクター、アゾバクター、バチルス、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、ブチリビブリオ、ブフネラ、カンペストリス、カンプリオバクター、クロストリジウム、コリネバクテリウム、クロマチウム、コプロコッカス、エシェリキア、エンテロコッカス、エンテロバクター、エルウィニア、フソバクテリウム、フィーカリバクテリウム、フランシセラ、フラボバクテリウム、ゲオバチルス、ヘモフィルス、ヘリコバクター、クレブシエラ、ラクトバチルス、ラクトコッカス、イリオバクター、マイクロコッカス、ミクロバクテリウム、メソリゾビウム、メチロバクテリウム、メチロバクテリウム、マイコバクテリウム、ナイセリア、パントエア、シュードモナス、プロクロロコッカス、ロドバクター、ロドシュードモナス、ロドシュードモナス、ロゼブリア、ロドスピリルム、ロドコッカス、セネデスムス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、シネコッカス、サッカロモノスポラ、サッカロポリスポラ、スタフィロコッカス、セラチア、サルモネラ、シゲラ、サーモアナエロバクテリウム、トロフェリマ、ツラレンシス、テメキュラ、サーモシネココッカス、サーモコッカス、ウレアプラズマ、キサントモナス、キシレラ、エルシニアおよびザイモモナスを含むが、これらに限定されない属のものであり得る。
ある実施態様において、細菌宿主細胞は、アグロバクテリウム属(例えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アグロバクテリウム・リゾゲネス、アグロバクテリウム・ルビ)、アルスロバクター属(例えば、アルスロバクター・アウレッセンス、アルスロバクター・シトレウス、アルスロバクター・グロビフォルミス、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミナス、アルスロバクター・マイソレンス、アルスロバクター・ニコチアナエ、アルスロバクター・パラフィネウス、アルスロバクター・プロトフォルミアエ、アルスロバクター・ロゼオパラフィナス、アルスロバクター・スルフレウス、アルスロバクター・ウレアファシエンス)またはバシラス属(例えば、バシラス・チューリンゲンシス、バシラス・アントラシス、バシラス・メガテリウム、バシラス・スブチリス、バシラス・レンタス、バシラス・サーキュランス、バシラス・プミラス、バシラス・ラクタス、バシラス・コアギュランス、バシラス・ブレビス、バシラス・フィルムス、バシラス・アルカオフィウス、バシラス・リヒェニフォルミス、バシラス・クラウジ、バシラス・ステアロテルモフィルス、バシラス・ハロデュランスおよびバシラス・アミロリクエファシエンス)のものである。具体的実施態様において、宿主細胞は、バシラス・スブチリス、バシラス・プミラス、バシラス・リヒェニフォルミス、バシラス・メガテリウム、バシラス・クラウジ、バシラス・ステアロテルモフィルスおよびバシラス・アミロリクエファシエンスを含むが、これらに限定されない工業的バシラス属である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・テタニＥ８８、クロストリジウム・リツセブレンス、クロストリジウム・サッカロブチリカム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ベイジェリンキー)。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的コリネバクテリウム族(例えば、コリネバクテリウム・グルタミナム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム)。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的エシェリキア属(例えば、大腸菌)である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的エルウィニア属(例えば、エルウィニア・ウレドボラ、エルウィニア・カロトボラ、エルウィニア・アナナス、エルウィニア・ハービコラ、エルウィニア・プンクタタ、エルウィニア・テレウス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的パントエア属(例えば、パントエア・シトレア、パントエア・アグロメランス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的シュードモナス属(例えば、シュードモナス・プイチダ、シュードモナス・エアルギノーザ、シュードモナス・メバロニ)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的ストレプトコッカス属(例えば、ストレプトコッカス・エキシミレス、ストレプトコッカス・ピオゲネシス、ストレプトコッカス・ウベリス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的ストレプトマイセス属(例えば、ストレプトマイセス・アンボファシエンス、ストレプトマイセス・アクロモゲネス、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス、ストレプトマイセス・アウレウス、ストレプトマイセス・フンギシジカス、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・リビダンス)である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的ザイモモナス属(例えば、ザイモモナス・モビリス、ザイモモナス・リポリティカ)である。
本発明はまた哺乳動物細胞、例えば、ヒト(２９３、ＨｅＬａ、ＷＩ３８、ＰＥＲ.Ｃ６およびボーズ黒色腫細胞を含む)、マウス(３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｓｐ２／０を含む)、ハムスター(ＣＨＯ、ＢＨＫ)、サル(ＣＯＳ、ＦＲｈＬ、Ｖｅｒｏ)およびハイブリドーマ細胞株を含む多様な動物細胞型での使用に適する。
本発明はまた多様な植物細胞型での使用に適する。
本明細書で使用する用語「細胞」は、単一細胞または同じ細胞株もしくは種に属する細胞集団などの細胞集団をいい得る。単数表現「細胞」の使用は、細胞集団ではなく、明示的に単一の細胞をいうと解釈されてはならない。
宿主細胞は、野生型カウンターパートに比して遺伝子修飾を含み得る。非限定的例として、宿主細胞(例えば、出芽酵母)は、次の遺伝子：ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ (ＨＭＧ－ＣｏＡ)レダクターゼ(ＨＭＧ１)、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ(アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼ)(ＥＲＧ１０)、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ(ＨＭＧ－ＣｏＡ)シンターゼ(ＥＲＧ１３)、ファルネシル－ジホスフェートファルネシルトランスフェラーゼ(スクアレンシンターゼ)(ＥＲＧ９)の１以上の低減または不活性化のために修飾されてよく、スクアレンエポキシダーゼ(ＥＲＧ１)を過発現するよう修飾されてよくまたはラノステロールシンターゼ(ＥＲＧ７)を下方制御するよう修飾されてよい。例えば、下記実施例１および２参照。
遺伝子発現の低減および／または遺伝子不活性化は、遺伝子の欠失、遺伝子への点変異導入、遺伝子短縮化、遺伝子への挿入導入、遺伝子へのタグもしくは融合の導入または遺伝子の選択的編集を含むが、これらに限定されない何れかの適当な方法で達成され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)ベースの方法が使用され得る(例えば、Gardner et al., Methods Mol Biol. 2014;1205:45-78)または周知遺伝子編集技術が使用され得る。非限定的例として、遺伝子を、遺伝子置換(例えば、選択マーカーを含むマーカーで)により欠失させ得る。遺伝子を、トランスポゾン系の使用により切断することもできる(例えば、Poussu et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33(12): e104参照)。
本明細書に記載する組み換えポリペプチドの何れかをコードするベクターを、当分野で知られる何れかの方法を使用して適当な宿主細胞に導入し得る。酵母形質転換プロトコールの非限定的例は、引用によりその全体として本明細書に包含させる、Gietz et al., Yeast transformation can be conducted by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Mol Biol. 2006;313:107-20に記載される。宿主細胞を、当業者により理解される何らかの適当な条件下で培養し得る。例えば、当分野で知られるあらゆる培地、温度およびインキュベーション条件が使用され得る。誘導型ベクターを担持する宿主細胞について、細胞を、発現を促進する適切な誘導剤と培養し得る。
本明細書に開示の細胞のいずれも、核酸の接触および／または統合前、途中および／または、あらゆるタイプ(リッチまたは最小)およびあらゆる組成の培地で培養できる。培養条件または培養過程は、当業者により理解されるとおり、慣用の実験により最適化され得る。ある実施態様において、選択培地は種々の成分が添加される。ある実施態様において、補助的成分の濃度および量は、最適化される。ある実施態様において、培地および増殖条件(例えば、ｐＨ、温度など)の他の態様は、慣用の実験により最適化される。ある実施態様において、培地に１以上の補助的成分を添加する頻度および細胞を培養する時間は最適化される。
本明細書に記載する細胞の培養は、当分野で知られ、かつ使用される培養容器で実施できる。ある実施態様において、通気した反応器(例えば、撹拌タンクリアクター)を細胞の培養に使用する。ある実施態様において、バイオリアクターまたは発酵槽を細胞の培養に使用する。故に、ある実施態様において、細胞は、発酵で使用される。本明細書で使用する、用語「バイオリアクター」および「発酵槽」は相互交換可能に使用され、生存生物、生存生物の一部または精製酵素が関与する、生物学的、生化学的および／または化学的反応が行われるハウジングまたは部分的ハウジングをいう。「大規模バイオリアクター」または「工業的規模バイオリアクター」は、商業的または準商規模で生産物を産生するのに使用するバイオリアクターをいう。大規模バイオリアクターは、一般に数リットル、数百リットル、数千リットルまたはそれ以上の範囲の体積を有する。
バイオリアクターの非限定的例は、撹拌タンク発酵槽、回転混合デバイスで撹拌されているバイオリアクター、ケモスタット、振盪デバイスで撹拌されているバイオリアクター、気泡ポンプ発酵槽、充填床リアクター、固定床リアクター、流動床バイオリアクター、波誘発撹拌を用いるバイオリアクター、遠心性バイオリアクター、ローラーボトルおよび中空繊維バイオリアクター、ローラー装置(例えばベンチトップ、カート搭載および／または自動化改変種)、垂直積層プレート、スピナーフラスコ、撹拌またはロッキングフラスコ、振盪多ウェルプレート、ＭＤボトル、Ｔ－フラスコ、Ｒｏｕｘボトル、多表面組織培養プロパゲーター、修飾発酵槽および被覆ビーズ(例えば、細胞接着阻止のために血清タンパク質、ニトロセルロースまたはカルボキシメチルセルロースで被覆されたビーズ)を含む。
ある実施態様において、バイオリアクターは、細胞(例えば、酵母細胞)が動いている液体および／または気泡と接触する細胞培養系を含む。ある実施態様において、細胞または細胞培養物は懸濁液で増殖される。他の実施態様において、細胞または細胞培養物は、固相担体に結合される。担体系の非限定的例は、マイクロ担体(例えば、多孔性または非多孔性であり得るポリマースフェア、マイクロビーズおよびマイクロディスク)、特定の化学基(例えば、三級アミン基)で荷電された架橋ビーズ(例えば、デキストラン)、非多孔性ポリマー繊維に捕捉された細胞を含む２Ｄマイクロ担体、３Ｄ担体(例えば、担体繊維、中空繊維、多カートリッジリアクターおよび多孔性繊維を含み得る半透膜)、イオン交換能が低減したマイクロ担体、封入細胞、キャピラリーおよび凝集体を含む。ある実施態様において、担体は、デキストラン、ゼラチン、ガラスまたはセルロースなどの材料から製作される。
ある実施態様において、工業的規模過程を、連続的、半連続的または非連続的モードで操作する。操作モードの非限定的例は、バッチ、流加、拡張バッチ、反復バッチ、排出／充填、回転壁、回転フラスコおよび／または潅流モードの操作である。ある実施態様において、バイオリアクターは、基質ストック、例えば炭水化物源の連続的または半連続的補充および／またはバイオリアクターからの生成物の連続的または半連続的分離を可能にする。
ある実施態様において、バイオリアクターまたは発酵槽は、反応パラメータを測定および／または調節するためのセンサーおよび／または制御系を含む。反応パラメータの非限定的例は、生物学的パラメータ(例えば、増殖速度、細胞サイズ、細胞数、細胞密度、細胞型または細胞状態など)、化学パラメータ(例えば、ｐＨ、酸化還元電位、反応基質および／または生成物濃度、酸素濃度およびＣＯ２濃度などの溶解ガス濃度、栄養素濃度、代謝物濃度、オリゴペプチド濃度、アミノ酸濃度、ビタミン濃度、ホルモン濃度、添加剤濃度、血清濃度、イオン強度、イオン濃度、相対湿度、モル濃度、モル浸透圧濃度、他の化学物質、例えば緩衝剤、アジュバントまたは反応副産物の濃度)、物理的／機械的パラメータ(例えば、密度、伝導性、撹拌の程度、圧力および流速、剪断応力、剪断速度、粘性、色、濁度、光吸収、混合速度、変換速度ならびに温度、光強度／質などの熱力学パラメータなど)を含む。本明細書に記載のパラメータを測定するセンサーは、関連する機械および電子分野の当業者に周知である。本明細書に記載のセンサーからの入力に基づきバイオリアクターのパラメータを調節する制御系は、バイオリアクター工学の分野の当業者に周知である。
ある実施態様において、方法はバッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)を含む。バッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)の一般的懸念は、酸素およびグルコースのレベルを含む。例えば、バッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)は、酸素およびグルコースを限定してよく、よって、ある実施態様において、株が適切に設計された流加発酵において実行する能力は過小評価されている。また、最終産物(例えば、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド前駆体またはモグロシド)は、溶解度、毒性、細胞蓄積および分泌の観点で基質(例えば、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド前駆体またはモグロシド)とある程度異なり得て、ある実施態様において異なる発酵力学を有し得る。
本明細書に記載する方法は、組み換え細胞、細胞ライセートまたは単離組み換えポリペプチド(例えば、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨおよびスクアレンエポキシダーゼ)を使用する、モグロール前駆体(例えば、スクアレン、２,３－オキシドスクアレンまたは２４－２５エポキシ－ククルビタジエノール)、モグロールまたはモグロシド(例えば、ＭＩＡ１、ＭＩＥ１、ＭIIＡ１、ＭIIＡ２、ＭIIIＡ１、ＭIIＥ、ＭIII、シアメノシドＩ、モグロシドIV、イソモグロシドIV、ＭIIIＥおよびモグロシドＶ)の産生を包含する。
本明細書に開示の組み換え細胞の何れかにより産生されたモグロール前駆体(例えば、スクアレン、２,３－オキシドスクアレンまたは２４－２５エポキシ－ククルビタジエノール)、モグロール、モグロシド(例えば、ＭＩＡ１、ＭＩＥ、ＭIIＡ１、ＭIIＡ２、ＭIIIＡ１、ＭIIＥ、ＭIII、シアメノシドＩ、モグロシドIV、イソモグロシドIV、ＭIIIＥおよびモグロシドＶ)は、当分野で知られる何らかの方法を使用して同定および抽出され得る。マススペクトロメトリー(例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ)は、同定方法の非限定的例であり、目的の化合物の抽出の一助として使用し得る。
本明細書において使用する表現および用語は、説明の目的であり、限定としてみなしてはならない。本明細書における「含む」、「包含する」、「有する」、「含有する」、「関与する」などの用語および／またはこれらのバリエーションは、その前に挙げられた項目ならびにさらなる項目を包含することを意味する。
本発明を次の実施例によりさらに説明し、これは、決してさらなる限定と解釈されてはならない。本明細書をとおして引用する全引用文献(文献引用文献、登録特許、公開特許出願および同時係属特許出願)の内容全体は、引用により明示的に本明細書に包含させる。
実施例１. ＣＤＳ酵素の同定および機能的特徴づけ
想定されるＣＤＳ酵素のライブラリーを設計した。ライブラリーは、ＣＤＳにより類似するよう修飾したいくつかのオキシドスクアレンシクラーゼ配列を含んだ。
ラカンカＣＤＳを発現する対照株により産生される産物は、ＮＭＲによりククルビタジエノールとして同定され、この産物のヒドロキシル化により、モグロールが産生されることを確認した。想定されるＣＤＳ酵素を、２,３－オキシドスクアレンのククルビタジエノールへの環化を触媒する活性酵素を同定するために評価した。想定されるＣＤＳライブラリーから計５０６構築物を、操作した出芽酵母スクリーニング株へのライブラリーの形質転換により試験した。出芽酵母スクリーニング株は、切断ＨＭＧ１遺伝子；ＥＲＧ１０、ＥＲＧ１３、ＥＲＧ９およびＥＲＧ１遺伝子過発現；およびＥＲＧ７遺伝子下方制御からなった。推定されるＣＤＳをコードする遺伝子を、ｐＥＳＣ－ＵＲＡプラスミドで発現させ、４％ガラクトース含有ＳＣ－ＵＲＡでの培養により発現を誘導した。ククルビタジエノールをＧＣ－ＭＳを使用して測定した。
４０ＣＤＳがスクリーニングで活性を示すことが示された(表２)。これらＣＤＳは、以前同定されなかったＣＤＳおよび操作したＣＤＳを含んだ。新たに発見された酵素のいくつかは、ラカンカからの以前に特徴づけられたＣＤＳ(配列番号７３)を発現する対照株からのククルビタジエノールの産生と比較して、ククルビタジエノールの２倍以上の産生を示した。配列番号３３は、配列番号７３をコードするポリヌクレオチド配列の非限定的例である。
それ故に、２,３－オキシドスクアレンをククルビタジエノールに環化する種々の酵素が同定され、特徴づけされた。
Figure 0007498708000003
同定された酵素はククルビタジエノールを産生すると結論付けられた。新たに発見された酵素により産生された産物のＧＣ－ＭＳスペクトルは、出芽酵母におけるラカンカＣＤＳで産生されたククルビタジエノールに極めて類似した。この結果はＧＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳおよびＮＭＲで確認した。これら酵素から製造されたククルビタジエノールは、ラカンカＣＤＳから製造されたククルビタジエノールと同一の保持時間、イオン化パターンおよび質量および断片化パターンを有した。
実施例２. 推定されるＵＧＴ酵素の同定および機能的特徴づけ
この実施例は、モグロールおよびモグロシド前駆体をグリコシル化モグロシドに変換できるＵＧＴを同定するための、ＵＧＴライブラリーの設計およびスクリーニングを記載する。具体的に、ライブラリーは、種々のグルコース単位を有するモグロシドを産生するためにモグロールのＣ３およびＣ２４ヒドロキシル基でグリコシル化するＵＧＴを同定することを目的とした。計１,０５９の想定されるＵＧＴを得た。
ＵＧＴライブラリーを試験するために、インビトロアッセイが開発された。ＵＧＴを担持するプラスミドを、出芽酵母ＣＥＮ.ＰＫ ΔＧＡＬ８０に形質転換した。ＵＧＴライブラリーを、計８基質モグロール、モグロシドＩ－Ａ１、モグロシドＩ－Ｅ１、モグロシドII－Ａ１、モグロシドII－Ｅ、モグロシドIII、モグロシドIII－Ａ１およびモグロシドIII－Ｅを使用して、このアッセイでスクリーニングした。細胞ライセートを５０μMの基質と３０℃で２４時間インキュベートし、その後反応停止させた。産物形成を、反応停止後、ＬＣ－ＭＳで試験した。モグロールおよびモグロシド標品のＬＣ－ＭＳプロファイルを図２に示す。
このスクリーニングに基づき、モグロシドＩ－Ａ１およびシアメノシドＩを含む既知モグロシド産物を産生するＵＧＴを同定した(図３Ａ～３Ｂ)。このスクリーニングから同定された株を、次いでさらなるスクリーニングで試験した(図４Ａ～４Ｂ、表３)。
Figure 0007498708000004
実施例３. ＵＧＴのさらなる特徴づけ
実施例２に記載のスクリーニングから同定した１６のＵＧＴ中１３を、大腸菌で組み換えにより発現させ、６ｘＨｉｓタグを使用して精製した。これら精製ＵＧＴのタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイにより決定した。１３のＵＧＴ比活性を、５０μMの各基質とＵＧＴを５分間、３０℃でインキュベートすることにより決定した。反応停止させ、産物濃度をＬＣ－ＭＳにより定量した(図４)。比活性を、産物濃度を酵素濃度および反応時間で除すことにより計算した。測定した比活性は、０.０１～５.５３mmol産物／(ｇ ＵＧＴ×時間)であり、平均１.１４であった。
実施例４. ＵＧＴ９４－２８９－１のタンパク質工学
出芽酵母株ｔ８５０２４(ＵＧＴ９４－２８９－１をコードする再コード化ポリヌクレオチドを発現)を得て、６－１＆２－１グリコシル化反応を触媒させた。しかしながら、この酵素は、これら反応を高速で触媒しなかった。
各ＵＧＴ配列がＵＧＴ９４－２８９－１配列に比して単一アミノ酸置換を含むＵＧＴ配列のライブラリーを設計した。ＵＧＴ配列のライブラリーを、６－１＆２－１グリコシル化の活性増強について試験した。ライブラリーは８９３メンバーを含んだ。変異する位置を、触媒ダイアド(Ｈｉｓ２１／Ａｓｐ１２２)への近位(４.５オングストローム以内)に基づきまたは基質分子との予測相互作用に基づき、選択した。ＵＧＴ９４－２８９－１の相同性モデルを図５に示す。
野生型酵素(ＵＧＴ９４－２８９－１)より活性が改善した２１８の変異がインビトロスクリーニングで同定された(表４)。変異ＵＧＴ９４－２８９－１遺伝子を担持するプラスミドを出芽酵母ＣＥＮ.ＰＫ ΔＧＡＬ８０に形質転換した。ＵＧＴ変異ライブラリーを試験するために、実施例２のインビトロアッセイを実施した。計３基質 － モグロシドII－Ａ１、モグロシドIIIおよびモグロシドII－Ｅ － を、このアッセイを使用してＵＧＴ変異ライブラリーで試験した。
これらグリコシル化工程の活性を増強する多数の変異が同定された(表４)。表４において、ＭIIＡ１はモグロシドII－Ａ１を示し、ＭIIＥはモグロシドII－Ｅを示し、ＭIIIＡ１はモグロシドIII－Ａ１を示し、ＭIIIはモグロシドIIIを示し、ＭIIIＥはモグロシドIII－Ｅを示し、ＳｉａｍはシアメノシドＩを示す。同定された変異含有ＵＧＴのサブセット(Ｎ１４３Ｖ、Ｎ１４３Ｉ、Ｌ３７４Ｎ、Ｌ３７４ＹおよびＬ３７４Ｗ)を大腸菌で発現させ、精製した。Ｎ１４３Ｖ、Ｎ１４３Ｉ＆Ｌ３７４Ｎは、野生型タンパク質を超える、それぞれモグロシドII－Ａ１からモグロシドIII－Ａ１およびモグロシドIIIからシアメノシドＩへの反応の比活性の４～８倍および１２～１６倍増強が判明した。Ｌ３７４ＹおよびＬ３７４Ｗは、モグロシドII－ＥからモグロシドIII－Ｅ反応の比活性を、それぞれ野生型の１３倍および２８倍増強した。これらの観察は、一般に出芽酵母スクリーニングにおける観察と合う(表４)。さらに、Ｎ１４３Ｖ変異が、野生型ＵＧＴまたは他の変異体では観察されなかった活性である、シアメノシドＩからモグロシドＶを産生することが観察された。
ＵＧＴ９４－２８９－１における構造モチーフの非限定的例および構造モチーフの配列を表５に示す。
Figure 0007498708000005
Figure 0007498708000006
Figure 0007498708000007
Figure 0007498708000008
Figure 0007498708000009

Figure 0007498708000010

Figure 0007498708000011
Figure 0007498708000012
Figure 0007498708000013

Figure 0007498708000014
Figure 0007498708000015
Figure 0007498708000016
Figure 0007498708000017
Figure 0007498708000018
Figure 0007498708000019
Figure 0007498708000020
Figure 0007498708000021
実施例５. さらなるＵＧＴの同定および特徴づけ
この実施例は、さらなるＵＧＴ酵素のＵＧＴ酵素のさらなる工学および同定を記載する。
ＵＧＴの工学は、タンパク質配列の循環置換を含んだ。代表的ＵＧＴであるＵＧＴ９４－２８９－１の予測構造(図５)は、Ｎ末端およびＣ末端が柔軟であり、ごく接近していることを示す(７～１０Ａ、図６)。循環置換させるために、元のＮ末端およびＣ末端を互いに融合し、新規末端をタンパク質構造内の他の位置に導入した(図７)。
２つのライブラリーをスクリーニングした。一方はＵＧＴの循環置換バージョン配列を含んだ。他方はさらなる推定されるＵＧＴ配列を含んだ。スクリーニングに使用した出芽酵母株は、ＣＤＳ、２個のＥＰＨ、変異体Ｃ１１－ヒドロキシラーゼ融合タンパク質、２個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、上方制御ＳＱＥ、２個の一次ＵＧＴおよび２個のトランスポーターノックアウトを含んだ。同じ株の２個の異なる生物学的反復をスクリーニングに使用した。生物学的反復はバックグラウンド１およびバックグラウンド２と称する。ＵＧＴをコードするプラスミドを、スクリーニング株に形質転換した。形質転換体を、前培養培地に接種し、接種培地の一定量を産生プレートにその後移した。
産生プレートのインキュベーション後、モグロシド産生をＬＸ４多重化カラム配置のthermo QQQ TSQ-Quantiva ESIを使用して評価した。モグロール主鎖のグリコシル化のクラス(Ｍ、ＭＩ、ＭII、ＭIII、ＭIV、ＭＶ)の選択イオンモニタリング(ＳＩＭ)の質量は次のとおりであった。それぞれ５３５.４ｇ／mol(Ｍ)、６９７.４７ｇ／mol(ＭＩ)、７９９.５１ｇ／mol(ＭII)、９６１.５６ｇ／mol(ＭIII)、１１２３.６１ｇ／mol(ＭIV)および１２８５.６８ｇ／mol(ＭＶ)。ＭＩは、１グルコース部分の産物を示し、ＭIIは２グルコース部分の産物を示し、ＭIIIは３グルコース部分の産物を示し、ＭIVは４グルコース部分の産物を示し、ＭＶは５グルコース部分の産物を示す。ＭＩおよびＭIIは二次ＵＧＴの基質と考えられ、ＭIII、ＭIVおよびＭＶは二次ＵＧＴの産物と考えられた。これらの選択イオンモニタリング(ＳＩＭ)強度を、次いで内部標準に対して正規化し、次のＭＩＡ１、ＭIIＡ１、ＭIIIＡ１、シアメノシドおよびＭＶのサロゲートについて校正した。ＵＧＴ９４－２８９－１ Ｎ１４３Ｉを陽性対照として使用した。陰性対照株は二次ＵＧＴを発現しなかった。
各ＵＧＴを担持する株により産生されるＭＩ、ＭII、ＭIII、ＭIVおよびＭＶのパーセンテージを、陽性対照株と比較した。ＭＩ、ＭII、ＭIII、ＭIVおよびＭＶの画分は、産生された産物の総量からの各タイプの量に対応する。
酵素を次の基準に基づきＵＧＴ活性を有する(ヒット)と指定した。循環置換ＵＧＴライブラリーについて、ＭIVの平均画分(各陽性対照株のＭIV画分の２標準偏差)より多いＭIVの画分(ＭIV画分)を生ずるならば、酵素をヒットと考えた。このカットオフを使用して、活性と兼ね合いがある折り畳みおよび安定性が改善した構造バリアントを同定した。生物学的反復の両者に陽性である構築物のみをヒットと考えた。表６は、ＭIVおよびＭＶ画分のデータを示す。
推定されるＵＧＴのライブラリーについて、陰性対照株の最大観察値を２標準偏差を超え、陽性対照株の平均より大きいならば、酵素を各産物(ＭIII、ＭIVおよびＭＶについてヒットと考えた。表７は、ＭIII、ＭIVおよびＭＶ画分のデータを提供する。
Figure 0007498708000022
Figure 0007498708000023
実施例６：ＵＧＴのさらなるタンパク質操作
この実施例は、ＵＧＴ酵素のさらなる操作を記載する。ＵＧＴ変異ライブラリーを、位置特異的スコアマトリックス(ＰＳＳＭ)およびエネルギー最小化プロトコール(Goldenzweig et al., Mol Cell. 2016 Jul 21;63(2):337-346)に基づき構築した。このアプローチで、ＵＧＴの近接ホモログをＢＬＡＳＴサーチにより決定した。これらのホモログをアラインし、位置特異的スコアマトリックス(ＰＳＳＭ)を多重配列アライメントから計算した(図８)。図８の５３位および５７位などの大きな配列可変性を特徴とする位置を、変異の位置として選択した。潜在的アミノ酸変化のプールを、ＰＳＳＭにおいて観察されたものから選択した。例えば、５２位を、ＰＳＳＭにおいてその値でみられたアミノ酸である、Ｌ、Ｉ、ＭまたはＶに変異させた(図８)。変異体プールをさらに減少させるため、タンパク質安定性に対する全潜在的置換の影響を、ロゼッタを使用して評価した。ライブラリー構築のために使用した変異のプールは、高度に可変の位置で安定性の有意な増強をするＰＳＳＭ内で観察される置換を含んだ(Goldenzweig et al., Mol Cell. 2016 Jul 21;63(2):337-346)。ライブラリーを、ＵＧＴ活性を有する酵素の同定のためにスクリーニングする。
実施例７：モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドを産生するための異種酵素の組み合わせの発現
本発明の組み換えタンパク質を組み合わせて使用して、モグロール前駆体(例えば、２－３－オキシドスクアレン、２,３,２２,２３－ジオキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４,２５－エポキシククルビタジエノール、２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノール)、モグロールまたはモグロシド(例えば、モグロシドＩ－Ａ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩ－Ｅ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIV、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドＶおよびモグロシドVI)を産生する。
例えば、モグロールを産生するために、スクアレンエポキシダーゼ、ＣＤＳ、エポキシドヒドロラーゼおよびシトクロムＰ４５０などの酵素をコードする遺伝子を、宿主細胞で発現させた。ある場合、シトクロムＰ４５０レダクターゼも酵母細胞で発現させる。適当なスクアレンエポキシダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼの非限定的例は、下記表８に示す。ＣＤＳの非限定的例は表２に提供される。モグロールはＬＣ－ＭＳを使用して定量される。ＵＧＴはモグロシドを産生するために宿主細胞でさらに発現される。
あるいは、組み換えタンパク質を宿主細胞から精製し、モグロールを宿主細胞の外で産生する。組み換えタンパク質をスクアレンを含む反応緩衝液に逐次的にまたは同時に加える。
Figure 0007498708000024
等価物
当業者は、本明細書に記載する特定の本発明の実施態様の多くの等価物を認識するかまたは、常套的なものを超えない試験を使用して、確認できる。このような等価物は次の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書に開示される特許文献を含む全引用文献は、全体として、特に本明細書で引用される開示について引用により本明細書に包含される。

Claims (19)

  1. ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、該異種ポリヌクレオチド配列が配列番号３と少なくとも９０％同一であるおよび／または異種ポリヌクレオチドによりコードされるＣＤＳのアミノ酸配列が配列番号４３と少なくとも９０％同一であり、そしてここで、該宿主細胞がククルビタジエノール化合物を産生する、宿主細胞。
  2. 該ＣＤＳが配列番号７３の１２３位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基にロイシンを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. 該ＣＤＳ酵素が基質溝および活性部位腔を含む、請求項１または２に記載の宿主細胞。
  4. 該宿主細胞がＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、エポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)、ラノステロールシンターゼ、および／またはスクアレンエポキシダーゼをコードする１以上の異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１－３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  5. 該宿主細胞が酵母細胞、植物細胞または細菌細胞である、請求項１－４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  6. 該宿主細胞が、サッカロミセス細胞、ヤロウイア細胞、または大腸菌細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
  7. 該宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシエ細胞またはヤロウイア・リポリティカ細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
  8. 該宿主細胞が対照に比して少なくとも１０％、２０％、または３０％以上のククルビタジエノール化合物を生産し、ここで該対照が、配列番号３３に対応するポリヌクレオチドによりコードされるラカンカＣＤＳを発現する宿主細胞である、請求項１－７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  9. 該ＣＤＳがアミノ酸モチーフＤＱＧＷＬ（配列番号３３５）を含む、請求項１－８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  10. 該ＣＤＳが、アミノ酸モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ（配列番号３３６）を含む、請求項１－９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  11. 該ＣＤＳが、アミノ酸モチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ（配列番号３３７）を含む、請求項１－１０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  12. （ａ）該ＣＤＳが、アミノ酸モチーフＤＱＧＷＬ（配列番号３３５）を含み、かつアミノ酸モチーフＤＱＧＷＬ（配列番号３３５）が、配列番号７３における残基４７９－４８３に対応するＣＤＳにおける残基に位置する；
    （ｂ）該ＣＤＳが、アミノ酸モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ（配列番号３３６）を含み、かつアミノ酸モチーフＧＨＷＡＮＤＬＧＧＰ（配列番号３３６）が、配列番号７３における残基１１７－１２６に対応するＣＤＳにおける残基に位置する；および／または
    （ｃ）該ＣＤＳが、アミノ酸モチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ（配列番号３３７）を含み、かつアミノ酸モチーフＣＷＧＶＣＹＴＹＡＧＷ（配列番号３３７）が、配列番号７３における残基６１２－６２２に対応するＣＤＳにおける残基に位置する、
    請求項９－１１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  13. 該ＣＤＳのアミノ酸配列が配列番号４３を含む、請求項１－１２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  14. 該宿主細胞が、ラノステロールシンターゼ(ＥＲＧ７)を下方制御するようさらに修飾されている、請求項１－１３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  15. 請求項１－１４のいずれか一項に記載の宿主細胞とオキシドスクアレンを接触させ、それにより、ククルビタジエノール化合物を産生することを含む、ククルビタジエノール化合物を産生する方法。
  16. ククルビタジエノール化合物を単離することを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. オキシドスクアレンが２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレンである、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. ククルビタジエノール化合物が、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノール、またはククルビタジエノールである、請求項１５または１６に記載の方法。
  19. ククルビタジエノール化合物が、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノール、またはククルビタジエノールである、請求項１－１４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
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