KR100803093B1

KR100803093B1 - 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 및 이를 이용한광학순도 에폭사이드의 제조방법

Info

Publication number: KR100803093B1
Application number: KR1020060097390A
Authority: KR
Inventors: 김상진; 강성균; 황영옥; 우정희; 조장천; 강지현; 권개경
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2005-10-07
Filing date: 2006-10-02
Publication date: 2008-02-18
Anticipated expiration: 2026-10-02
Also published as: CN103468658A; CN103468658B; US8030048B2; US20100120102A1; CN101522892B; BRPI0616814A2; KR20070039463A; CN101522892A; ZA200803046B

Abstract

본 발명은 해양 미생물 유래의 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질 및 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 상기 가수분해효소를 사용하여 높은 광학순도를 갖는 에폭사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 광학선택적 가수분해효소 단백질은 약학산업에서 약리활성이 있는 광학순도 에폭사이드를 고효율로 생합성하는데 유용하게 사용될 수 있다.

해양 미생물, 기질 선택성, 에폭사이드 가수분해효소, 광학 선택적, 광학순도 에폭사이드

Description

광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 및 이를 이용한 광학순도 에폭사이드의 제조방법{ENANTIOSELECTIVE EPOXIDE HYDLROLASE AND METHOD FOR PREPARING AN ENANTIOPURE EPOXIDE USING THE SAME}

도 1a는 다양한 에폭사이드 기질의 종류를 나타낸 것이며, A: 스티렌옥사이드(SO), B: 글리시딜 페닐 에티르(GPE), C: 1,2-에폭시헥산(EX), D: 1,2-에폭시부탄(EB)이다.

도 1b는 라세믹 스티렌옥사이드 기질에 대한 에리스로박터 종 JCS358 균주의 가수분해 정도를 GC 컬럼으로 분석하여 도식화한 것이고, a: (S)-스티렌옥사이드이고, b: (R)-스티렌옥사이드이다.

도 2는 라세믹 스티렌옥사이드 기질에 대한 에리스로박터 종 JCS358 균의 반응속도 광학분할(kinetic resolution)을 나타낸 도면으로, ○: (R)-스티렌옥사이드 면적, ●: (S)-스티렌옥사이드 면적,□: 최대 광학순도(enantiomeric excess, %)이다.

도 3a 내지 도 3c는 본 발명에서 분리 및 정제된 EEH1 아미노산 서열과 종래에 알려진 아미노산 서열을 비교분석한 것이다.

도 4a 및 도 4b는 본 발명에서 분리 및 정제된 EEH2 및 EEH3 아미노산 서열과 종래에 알려진 아미노산 서열을 비교분석한 것이다.

도 5는 에폭사이드 가수분해효소의 계통발생학적 분석을 도식화한 것으로서, 비교분석된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 6은 에리스로박터 리토랄리스(litoralis) HTCC2594 균주로부터 분리된 3개의 에폭사이드 가수분해효소를 SDS-PAGE로 나타낸 사진이고, A: 분리된 EEH1, B: 분리된 EEH2 및 EEH3이다.

도 7a 및 도 7b는 분리된 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3 가수분해효소의 활성에 대한 pH 및 온도의 효능을 나타낸 그래프이며, ●: EEH1,○: EEH2, 및 ▼: EEH3이다.

도 8은 라세믹 스티렌옥사이드 기질에 대한 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(EEH1, EEH2 및 EEH3)의 가수분해 활성을 가스 크로마토그래피로 분석하여 도식화한 것이다.

도 9는 노보스핑고비움 아로마티보란스(N. aromativorans)로부터 에폭사이드 가수분해효소를 SDS-PAGE로 분리한 사진이다.

본 발명은 다양한 에폭사이드 기질에 대해 광학선택적 가수분해효소 및 상기 효소를 이용하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학순도 에폭사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

의약품을 포함한 많은 생리활성물질들은 여러 종류의 거울상 이성질체(enantiomer)가 존재하며, 이들 중 특정 이성질체만이 올바른 활성을 보여주고 다른 이성질체는 경우에 따라 심각한 부작용을 유발하는 경우가 많다. 이와 같이, 안정성 및 생리활성의 측면에서 단일 거울상 이성질체의 생산이 중요시되고 있어, 최근 순수한 광학활성물질 합성에 대해 많은 연구가 진행되고 있다.

광학활성물질 합성에 사용될 수 있는 대표적인 합성 중간체로는 광학순도 에폭사이드(enantipure epoxide) 및 인접 디올(vicinal diol) 등이 알려져 있으며(Grogan, et al., FEMS Microbiol. Lett., 141:239-243, 1996 및 Arahira, et al., Eur. J. Biochem., 267:2649-2657, 2000), 반응성이 우수하고 다양한 반응을 유도할 수 있기 때문에, 광학활성 의약품, 농약 및 기능성 식품 합성용 중간체로 널리 사용되고 있다.

특히, 광학순도 에폭사이드는 여러 종류의 키랄화학촉매 및 생촉매를 이용하여 제조할 수 있는데, 특히 라세믹 에폭사이드(racemic epoxide) 기질의 각 이성질체에 대한 에폭사이드 가수분해효소의 선택적 분해능 차이를 이용하여 단일 광학 이성질체만을 제조하는 광학선택적 동력학적 가수분해 기술은 관심의 대상이 되고 있다. 이 방법은 저가의 생촉매를 사용하여 저가의 라세믹 기질로부터 고부가가치의 광학순도 에폭사이드를 제조할 수 있기 때문에 상업화될 가능성이 높은 기술이다. 에폭사이드 가수분해효소는 라세믹 에폭사이드 기질로부터 (R) 또는 (S)-이성질체 중 한 가지 이성질체만을 광학선택적으로 디올로 가수분해하여 제거시키고 나머지 이성질체만을 남겨 광학적으로 순수한 에폭사이드를 제조할 수 있는 효소이다. 또한, (R) 또는 (S)-이성질체에 대한 에폭사이드 가수분해효소의 광학선택성은 미생물의 종류 및 기질 구조에 따라 결정된다.

에폭사이드 가수분해효소(epoxide hydrolyse, EHase; EC 3.3.2.3)는 박테리아, 효모, 곰팡이, 곤충, 식물 및 포유동물 등에서 분리된 유비쿼터스 효소로 알려져 있다(Weijers, et al., J. Mol. Catal. B Enzym., 6:199-214, 1999 및 Archelas, & Furstoss, Curr. Opin. Chem. Biol., 5:112-119, 2001). 상기 효소는 반응속도 광학분할(kinetic resolution)에 의해 광학순도 에폭사이드 생산에 이용될 수 있기 때문에, 여러 개의 에폭사이드 가수분해효소들이 개발되어 왔다(Tokunaga, et al., Science, 277:936-938, 1997).

그러나, 의약품 산업에 있어서 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소는 그 수가 매우 제한되어 있기 때문에, 광학순도 에폭사이드를 생산할 수 있는 새로운 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소가 절실히 요구되어지고 있다.

대부분의 에폭사이드 가수분해효소는 프로테아제, 리파아제, 에스테라제, 디할로게나제 및 페록시다제(Nardini, & Dijkstra, Curr. Opin. Struct. Biol., 9:732-737, 1999)를 포함하는 α/β 가수분해효소 군에 포함된다(Rick, et al,. J. Am. Chem. Soc., 121:7417-7418, 1999). α/β 도메인은 중앙, 평행 또는 α 나선형에 의해 둘러싸인 혼성 β 시트로 이루어져 있다. 이러한 효소의 촉매 친핵성(catalytic nucleophile)은 공유결합된 중간체의 극 전자친화성(polarized electrophile) 기질을 공격하고, 이어 가수분해시키는 특징적인 2단계 과정을 수행한다(Yamada, et al., J. Biol. Chem., 275:23082-23088, 2000). 보존된 촉매성 3가의 α/β 가수분해효소는 친핵성 잔기(Asp 또는 Ser), 아세트산 잔기(Asp 또는 Glu) 및 보존된 히스티딘 잔기로 이루어진 효소들로 포개져 있다. 상기 친핵성은 아미노산-서열 모티프, Sm-X-Nu-Sm(Sm= small residues, X= any residues 및 Nu= nucleophile)에 적합하다. 또 하나의 보존된 아미노산 서열은 효소의 음이온 공(oxyanion hole)을 포함하고 있는 HGXP 모티프이다(Ollis, et al., Protein Eng., 5:197-211, 1992).

그러나, 에폭사이드 가수분해효소들 중 보존되는 중요서열은 상기 효소의 중요부위에 있는 2개 또는 3개의 아미노산에만 제한되어 있기 때문에, 상동성 분석에 의한 스크리닝을 어렵게 한다.

본 발명자들은 다양한 해양으로부터 에리스로박터 종, 스핑고피식스 종, 노보스핑고비움 종 및 로도박터레일즈 종을 스크리닝하여 선별한 후, 이 균주의 게놈 DNA 서열상에 존재하는 ORF 서열을 비교분석하여 후보 유전자를 선정한 다음, 상기 유전자를 발현시켜 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학선택적 가수분해효소 단백질을 분리 및 정제함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 높은 광학순도로 에폭사이드를 제조할 수 있는, 해양 미생물유래의 광학선택적 에폭사이드 가수분해 효소 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 이용하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학순도 에폭사이드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 다양한 해양으로부터 수득한 퇴적물로부터 다양한 에폭사이드 기질에 대해 광학선택적 가수분해효소 활성을 갖는 에리스로박터속 균주, 스핑고피식스속 균주, 노보스핑고비움속 균주 및 로도박터레일스속 균주, 및 이를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에리스로박터 리토랄리스(Erythrobacter litoralis) 균주로부터 분리 및 정제되고, 1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 30 내지 45kDa; 2) pH 6.5 내지 8.0 및 3) 온도 40 내지 60℃에서 최적 활성을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase) 단백질을 제공한다.

바람직하게는, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 17인 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 단백질은 상기 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 14인 염기서열에 의해 코딩되며, SEQ ID NO: 15를 갖는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16인 염기서열에 의해 코딩되며, 또는 SEQ ID NO: 17을 갖는 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 18인 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 스핑고픽시스 알라스켄시스(Sphingophyxis alaskensis) 균주로부터 분리 및 정제되고, 1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 45 내지 50kDa; 2) pH 7.0 내지 8.0 및 3) 온도 30 내지 40℃에서 최적 활성을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 28인 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO: 29인 염기 서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 노보스핑고비움 아로마티시보란스(Novosphingobium aromaticivorans) 균주로부터 분리 및 정제되고, 1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 40 내지 45kDa; 2) pH 7.0 내지 8.0 및 3) 온도 30 내지 40℃에서 최적 활성을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 30인 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO: 31인 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 로도박터레일스속 균주(Rhodobacterales bacterium) 균주로부터 분리 및 정제되고, 1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 35 내지 40kDa; 2) pH 7.0 내지 8.0 및 3) 온도 30 내지 40℃에서 최적 활성을 갖는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 32인 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는, SEQ ID NO: 32인 염기서열에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 이용하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학순도 에폭사이드 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 에리스로박터 리토랄리스(Erythrobacter litoralis) 균주, 스핑고픽시스 알라스켄시스(Sphingophyxis alaskensis) 균주, 노보스핑고비움 아로마티시보란스(Novosphingobium aromaticivorans) 균주 및 로도박터레일스속 균 주(Rhodobacterales bacterium ) 균주로부터 분리 및 정제된 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 제공한다.

우선, 본 발명에서는 다양한 해양으로부터 에리스로박터 종(Erythrobacter sp.), 스핑고픽시스 종(Sphingopyxis sp.), 노보스핑고비움 종(Novosphingobium sp.) 및 로도박터레일즈 종(Rhodobacterium sp.) 균주를 스크리닝하여 선별한 후, 이 균주의 게놈 DNA 서열상에 존재하는 ORF 서열을 비교분석하여 후보 유전자를 선정한 다음, 상기 유전자를 발현시켜 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학활성을 갖는 광학선택적 가수분해효소 단백질을 분리 및 정제하였다. 구체적으로, 다양한 해양으로부터 수득한 미생물을 대상으로 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학선택적 가수분해효소 활성을 갖는 에리스로박터 종, 스핑고픽시스 종, 노보스핑고비움 종 및 로도박터레일즈 속 균주를 하기 1) 내지 4) 단계로 구성된 스크리닝 방법을 이용하여 선별하였다:

1) 다양한 해양으로부터 대상 시료를 준비하는 단계;

2) 상기 대상 시료를 영양 풍부 배지에 배양하여 양성 균주를 선별하는 단계;

3) 상기에서 선별된 균주의 게놈 DNA 서열상에 존재하는 ORF 서열을 분석한 후, 종래에 알려진 에폭사이드 가수분해효소 아미노산 서열과 비교분석하여 후보 유전자를 선정하는 단계 및

4) 상기에서 선정된 후보 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학선택적 가수분해 활성을 나타내는지 확인하는 단계.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1의 대상 시료는 특별히 제한되는 것은 아니나, 강원도 후진, 경남 울릉도 및 독도, 부산 태종대, 경기 시화 하천 및 일본 가고시마 현과 같은 다양한 해양환경으로부터 수득한 해양 퇴적물(marine sediment), 해면동물(sponge) 및 조류(algae)를 포함하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 대상 시료 중 해양 퇴적물 등은 수득한 후 바로 사용하여 균주를 분리할 수 있으나, 퇴적물을 (반죽한 후) 선택 영양 (풍부) 배지에 농후배양 후(시켜) 균주를 분리할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2의 영양 풍부 배지는 특별히 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 1 중량%의 스티렌옥사이드(SO) 또는 알칸 혼합물(nC8, C10, nC12, nC13, nC14, nC15, nC16, C17, nC18, 및 사이클로헥산, (Sigma사, MO, USA)을 1리터의 해수인 미네랄 염 배지(mineral salt medium, MM2)에 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 3의 균주는 Erythrobacter litoralis, Erythrobacter sp. 2216.25.25, Erythrobacter aquimaris SW-110, Erythrobacter gaetabuli, Alterierythrobacter epoxidivorans, Erythrobacter luteolus SW-109, Erythrobater sp. MBIC3031 및 Erythrobacter longus로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이때, 상기 균주는 보다 상세하게 Erythrobacter litoralis HTCC2594, Erythrobacter sp. AKS329, Erythrobacter sp. aquimaris JCS325, Erythrobacter gaetbuli JCS340 JCS325, Erythrobacter sp. JCS340, Erythrobacter sp. JCS350, Erythrobacter sp. JCS358, Alterierythrobacter sp. JCS350, Erythrobacter aquimaris sp. JCS360, Erythrobacter aquimaris sp. JCS364, Erythrobacter luteolus sp. JCS368, Erythrobacter sp. HJ239, Erythrobacter longus sp. DokDo 15로 이루어진 에리스로박터 속 균주로부터 선택될 수 있으나(표 2 참조), 이에 제한되는 것은 아니며, Erythrobacter litoralis DMS8509 및 Erythrobacter geatbuli KCTC12227 균주를 포함할 수 있다(표 2 참조).

또한, 단계 3의 ORF 서열분석은 Ensoltek의 ProteinFinder(www.ensoltek.com) 및 BLAST 프로그램을 이용하여 분석할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소의 아미노산 서열과 상기에서 선택된 후보 에폭사이드 가수분해효소의 아미노산 서열 분석은 CLUSTAL W 프로그램(Thompson, et al., Nucleic. Acids. 22:4673-4680, 1994)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 단계 3의 후보 유전자로는 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주에서는 SEQ ID NO: 13으로 기재되는 EEH1 유전자, SEQ ID NO: 16으로 기재되는 EEH2 유전자 및 SEQ ID NO: 18로 기재되는 EEH3 유전자를, 스핑고피식스 알라스켄시스 균주에서는 SEQ ID NO: 29로 기재되는 sEEH 유전자를, 노보스핑고비움 아로마티스보란스 균주에서는 SEQ ID NO: 31로 기재되는 nEEH 유전자를, 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주에서는 SEQ ID NO: 33으로 기재되는 rEEH 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 다양한 에폭사이드 기질을 가수분해할 수 있는 ORF 부위 전체 또는 일부 서열을 포함할 수 있다.

상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 4의 발현벡터로는 통상의 알려진 벡터를 사용할 수 있으며, 예를들어, pET-24a(+) 벡터를 사용할 수 있다.

또한, 단계 4의 가수분해 활성은 반응 혼합물로부터 추출된 에폭사이드 추출물 및 비-추출된 디올(diol)의 분광학적 양을 자외선 분광기로 측정하는 디올 분석법 및 가스 크로마토그래피(GC)를 이용한 방법으로 측정할 수 있다.

상기와 같은 스크리닝 방법으로 다양한 해양으로부터 4개의 후보 균주를 선별한 후, 각각의 균주로부터 다양한 에폭사이드 기질에 대해 높은 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 분리 및 정제하였다. 에폭사이드 가수분해 효소 단백질의 분리 및 정제는 통상의 단백질 효소 분리 및 정제기술을 적용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 에폭사이드 가수분해효소의 발현을 위해 LB medium에 Kanamycin (50 ug/ml)이 첨가된 medium에서 seed culture 한 후 동일한 main medium에 1% 접종하여 3시간 배양 후 IPTG를 최종 1mM의 농도로 첨가하여 발현하였다. 발현후, 순수분리의 용이를 위해 His-Tag이라는 oligopeptide를 접합시켰고, His tag 분리는 Talon resin (Clontech, Co.)를 이용하여 분리하였다.

또한, 상기에서 분리 및 정제된 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 코딩하는 유전자를 동정하기 위하여, 상기 균주의 게놈 DNA 서열상에 있는 ORF 서열을 분석한 결과, 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주에서는 1.122bp(EEH1, SEQ ID NO: 14), 870bp(EEH2, SEQ ID NO: 16) 및 888bp(EEH3, SEQ ID NO: 18)로 이루어진 세 개의 유전자를 분리하였다.

스핑고피식스 알라스켄시스에서는 sEEH 유전자(SEQ ID NO: 29)를, 노보스핑고비움 아로마티시보란스에서는 nEEH 유전자(SEQ ID NO: 31)를 그리고 로도박터레일스속 균주 HTCC2654에서는 rEEH 유전자(SEQ ID NO: 33)를 각각 분리할 수 있었다. 또한, 상기 유전자를 각각 pET-24a (+) 발현벡터에 클로닝 한 후 BL21-CodonPlus (DE3)-RP (Novagen) 균주에 각각 도입하여 SDS-PAGE로 전기영동시킨 결과, 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주로부터는 41kDa(rEEH1, SEQ ID NO: 13), 33.4kDa(rEEH2, SEQ ID NO: 15) 및 34.5 kDa(rEEH3, SEQ ID NO: 17), 스핑고피식스 알라스켄시스로부터는 49kDa(sEEH, SEQ ID NO: 28), 노보스핑고비움 아로마티시보란스부터는 43kDa(nEEH, SEQ ID NO: 30) 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654로부터는 36kDa(rEEH, SEQ ID NO: 32)의 분자량을 가진 에폭사이드 가수분해효소를 분리할 수 있었다(도 9).

한편, 본 발명의 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 가수분해효소 단백질은 상기 Erythrobacter litoralis HTCC2594 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 것이 바람직하다:

1) SDS-PAGE로 측정시 분자량이 30 내지 45kDa;

2) 최적 pH는 6.5 내지 8.0 및

3) 최적 온도는 40 내지 60℃.

이때, 상기 균주로부터 분리된 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3 가수분해효소의 분자량은 각각 41kDa(SEQ ID NO: 13), 33.4kDa(SEQ ID NO: 15) 및 34.5kDa(SEQ ID NO: 17)인 것이 바람직하며(도 6A 및 6B 참조), 최적 pH는 각각 6.5(rEEH1), 7.5(rEEH2) 및 8.0(rEEH3)인 것이 바람직하며(도 7A 참조), 최적 온도는 50℃(rEEH1), 55℃(rEEH2) 및 45℃(rEEH3)인 것이 바람직하다(도 7B 참조).

또한, 본 발명의 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 가수분해효소 단백질은 상 기 스핑고픽시스 알라스켄시스 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 것이 바람직하다:

1) SDS-PAGE로 측정시 분자량이 45 내지 50kDa;

2) 최적 pH는 7 내지 8.0 및

3) 최적 온도는 30 내지 40℃.

이때, 상기 균주로부터 분리된 sEEH 가수분해효소의 분자량은 49kDa(SEQ ID NO: 28)인 것이 바람직하고(도 9 참조), 최적 pH는 각각 약 7인 것이 바람직하며, 최적 온도는 30-40℃인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 가수분해효소 단백질은 상기 노보스핑고비움 아로마티시보란스 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 것이 바람직하다:

1) SDS-PAGE로 측정시 분자량은 40 내지 45kDa;

2) 최적 pH는 7 내지 8.0 및

3) 최적 온도는 30 내지 40℃.

이때, 상기 균주로부터 분리된 nEEH 가수분해효소의 분자량은 43kDa(SEQ ID NO: 30)인 것이 바람직하고(도 9 참조), 최적 pH는 각각 7.0-8.0인 것이 바람직하며, 최적 온도는 30-40℃인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 광학선택적 가수분해 활성을 갖는 가수분해효소 단백질은 상기 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주로부터 분리 및 정제되고, 하기 1) 내지 3)의 특징을 갖는 것이 바람직하다:

1) SDS-PAGE로 측정시 분자량 35 내지 40kDa;

2) 최적 pH 7 내지 8.0 및

3) 최적 온도 30 내지 40℃.

이때, 상기 균주로부터 분리된 rEEH 가수분해효소의 분자량은 36kDa(SEQ ID NO: 32)인 것이 바람직하고(도 9 참조), 최적 pH는 각각 7-8인 것이 바람직하며, 최적 온도는 30-40℃인 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 일례로서, 2-100 mM racemic styrene oxide를 EEH1, EEH2, EEH3, sEEH, nEEH, rEEH 정제된 단백질이나, recombinant plasmid가 함유된 E.coli 혹은 wild type strain을 이용하여 각각의 단백질의 상기 표기된 최적조건에서 반응시킨 후(GC분석에 의해 확인), 일정한 시간후에 나온 에폭사이드를 사용하는 방법이 있다.

본 발명에 따른 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소의 기질인 에폭사이드는 특별히 제한되는 것은 아니나, 스티렌옥사이드(styrene oxide, SO), 글리시딜 페닐 에테르(glycidyl phenyl ether, GPE), 에피클로로하이딘(epichlorohydrin, ECH), 에피플루오로하이딘(epifluorohydrin, EF), 1,2-에폭시부탄(1,2-epoxybutane, EB) 및 1,2-에폭시헥산(1,2-epoxyhexane, EX)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또한, 상기 가수분해효소는 SEQ ID NO: 13인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 15인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 17인 아미노산 서열을 가지며, pH 6.5 내지 8.0 및 온도 40 내지 60℃에서 상기 가수분해반응을 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 가수분해효소는 SEQ ID NO: 28인 아미노산 서열, SEQ ID NO: 30인 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 32인 아미노산 서열을 가지며, pH 7.0 내지 8.0 및 온도 30 내지 40℃에서 상기 가수분해반응을 수행하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective EHase)-생산용 균주의 스크리닝(screening)

<1-1> 재료 및 시약

본 발명에 사용된 에폭사이드(epoxide)는 도 1a에 기재하였다. 이때, 라세믹스티렌옥사이드(racemic styrene oxide)는 Fluka사에서, pure (R)-/(S)-스티렌옥사이드 및 나머지 라세믹스티렌옥사이드는 Aldrich사에서 각각 구입하였다. 키랄덱스 감마-사이클로덱스트린 틀리플루오로아세틸(chiraldex gamma-cyclodextrin trifluoroacetyl, G-TA) 모세관 GC 컬럼은 Astec사(Whippany, NJ)에서, 균주 배양에 사용된 다른 배지 조성물들은 Merk사 및 Difco사에서 구입하였다.

<1-2> 대상 시료 준비

해양 퇴적물(marine sediment), 해면동물(sponge) 및 조류(algae)는 후 진(depth, ~20m; 37o 51' N, 129o 45' E), 울릉도(depth, ~758.7m; 38o 00' N, 131o 27' E), 태종대(depth, ~20m; 35o 14' N, 129o 45' E), 시화(Yellow Sea, Korea) 및 가고시마현(depth, 100~200 m; 31o 90' N, 130o 48' E)으로부터 수득하였다. 이때, 상기 퇴적물은 집게(grab), 주상채니기(core sampler) 및 스쿠버 다이빙과 같은 방법으로 수득한 후 본 발명의 대상 시료로 사용하였다. 구체적으로, 상기 대상 시료 중 0.3g의 차가운 퇴적물을 반죽한 후 영양 풍부 배양액에 배양하여 균주를 분리하였다. 또한, 본 발명에 사용된 모든 시료는 법적 관련기관의 동의하에 수득하였다.

<1-3> 균주 분리

영양 풍부 배지는 1%의 스티렌옥사이드(SO) 또는 알칸 혼합물(nC8, C10, nC12, nC13, nC14, nC15, nC16, C17, nC18, 및 사이클로헥산, Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)을 1리터의 해수인 미네랄 염 배지(MM2)에 혼합하여 제조하였다(Ferrara-Guerrero, et al., Handbook of methods in microbial ecology. Lewis Publishers, Florida, p9-19, 1993). 25℃에서 7일간 배양하여 클론들을 분리하였다. 또한, 연속적인 접종 및 25℃의 ZoBell 아가(agar)에 접종하여 상기에서 분리된 클론들로부터 균주를 분리하여 본 발명에 이용하였다.

<1-4> 균주 배양

E. litoralis HTCC2594 균주는 0.5% 펩톤, 0.1% 효모 추출물 및 75% 해수(pH 7.5)로 구성된 30℃의 ZoBell 2216E 배지에서 1일간 배양하였다. 스핑고피식스 알라스켄시스(Sphingopyxis alaskensis) 및 노보스핑고비움 마로마티시보란 스(Novosphingobium aromaticivorans) 균주는 0.5% 펩톤, 0.3% 효모 추출물로 구성된 30℃의 중성 배지에서 배양하였고, 로도박테레일스속 균주(Rhodobacterales bacterium) HTCC2654 균주는 25℃의 marine 배지 2216(Difco)에서 배양하였다. 또한, 상기 균주는 20% 글리세롤이 함유된 ZoBell 2216E 액체 배지에 현탁시킨 후 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. DH5α 및 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 박테리아 세포(Stratagene, LaJolla, CA)는 각각 플라스미드 증식 및 유전자 발현용 균주로서 사용하였고, 적합한 항생제가 첨가된 37℃ Luria-Bertani(LB) 배지에서 배양하였다.

<1-5> 에폭사이드 가수분해효소 생산용 균주의 동정

상기와 같은 방법으로, 본 실시예에서는 해양에서 수득한 시료로부터 총 181종의 균주를 분리할 수 있었고, 이 중 31종이 스티렌옥사이드 기질에 대해 가수분해할 수 있음을 분광학적 분석으로 확인하였다(표 1). 또한, 상기 균주의 광학선택적 가수분해효소 활성을 가스 크로마토그래피로 측정한 결과, (R)-에폭사이드 중 하나인 스티렌옥사이드를 선택적으로 가수분해할 수 있는 최종 1종인 JCS 358 균주를 선별할 수 있었다(표 1 및 도 1b).

[표 1]

광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 생산용 해양 미생물 균주의 스크리닝 및 분리된 균주의 16S rRNA 유전자 서열 분석

a α-pro: α-프로테오박테리아; b γ- pro: γ- 트로테오박테리아; c G.P: 그램-양성균 및 d CFB: 사이토파가-플라보박테리아-박테로이드(Cytophaga -Flavobacteria-Bacteroides)

<1-6> JCS 358 균주의 16S rRNA 서열 분석

한편, 본 실시예에서는 상기 균주의 게놈 DNA 서열상에 있는 16S rRNA 유전자의 서열을 분석하여 그 특징을 조사하였다. 구체적으로, 상기 균주의 게놈 DNA를 주형으로 SEQ ID NO: 2(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3', 27F)로 기재되는 정방향 프라 이머 및 SEQ ID NO: 3(5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3', 1518R)으로 기재되는 역방향 프라이머를 이용한 PCR 방법(Weisburg, et al., J. Bacteriaol., 173:697-703, 1991)으로 SEQ ID NO: 1로 기재되는 JCS 358 균주의 16S rRNA 서열을 증폭하였고, BigDye terminator kit(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 자동화 서열분석기로 상기 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 상기 JCS 358 균주는 에리스로박터 종 중 하나인 에리스로박터 개트불리(E.gaetbuli)와 약 98%의 염기서열 상동성을 보였다(표 2). 특히, 에리스로박터 종은 해수, 퇴적물 및 갯벌과 같은 다양한 해양에서 서식하는 호기성 종속영양생물인 α-프로테오박테리아로 알려져 있기 때문에, 본 실시예에서는 에폭사이드 기질에 대한 광학선택적 가수분해 활성이 에리스로박터 종에서 일반적으로 발생하는지 조사하기 위하여, KORDI 수탁기관 또는 세포배양기관(Anzai, et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 50:1563-1589, 2000; Denner, et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52:1655-1661, 2002; Shiba & Simidu, Int. J. Syst. Bacteriol., 32:211-217, 1982; Yoon, et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 53:1169-1174, 2003 및 Yurkov, et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 44:427-434, 1994)으로부터 수득한 다양한 해양에서 분리된 9개의 추가적인 에리스로박터 종에 대해 가수분해 활성을 측정하였다.

그 결과, 표 2에서와 같이 10개 종 중 7개의 종(AKS 329, JCS 325, JCS 340, JCS 350, JCS 358, JCS 360 및 JCS 364)에서 스티렌옥사이드 기질에 대해 높은 광학선택성 ee값을 가지며 가수분해효소 활성을 나타내었다. 한편, 7개의 에리스로 박터 종에 있어서, 대부분은 (R)-스티렌옥사이드 기질에 대해 반응속도 선호도를 보였다. 이는, 에리스로박터 종이 에폭사이드 기질을 분해할 수 있을 뿐 아니라 에폭사이드와 연관된 새로운 효소를 찾는데 매우 중요한 인자가 될 수 있음을 의미한다.

[표 2]

다양한 에폭사이드 기질에 대한 에리스로박터 종의 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 활성

a ee(%): 최대광학 순도.

b abs. Conf.: 배양 후 남아있는 에폭사이드를 나타내는 절대적인 형태.

c AD: 가수분해된 (S)- 및 (R)-광학순도.

d X: 검출되지 않은 에폭사이드가수분해효소.

e ND: 미결정.

<1-7> 다양한 에폭사이드 기질에 대한 에리스로박터 종의 가수분해 활성 측정

반응 혼합물로부터 추출된 에폭사이드 추출물 및 비-추출된 디올(diol)의 분광학적 양을 자외선 분광기를 이용하여 측정하였다(Bhatnagar et al., J. Biochem. Biophys. Methods., 50:1-13, 2001). 우선, 분리된 균주를 30ml의 ZoBell 배지에서 25℃, 24시간 동안 진탕 배양한 후, 상등액을 4℃, 4300g에서 20분간 원심분리하여 제거하였다. 전체 세포는 10 mM의 인산완충용액(pH 6.8)으로 2번 세척한 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamid, DMF)가 함유된 4 mM의 스티렌옥사이드와 10mM의 인산염(pH 6.8) 용액에 현탁시킨 0.04g의 전체 세포를 혼합하여 30℃에서 15분간 반응시켰다. 상기 반응액에 40ul의 NaIO4 농축액(DMF에 200 mM의 NaIO4를 함유)을 첨가한 후 2분간 voretxing함으로써 반응액내 생성된 diol과의 산화반응을 실시하였다. 반응액과 현탁되어 있는 세포는 16,500g에서 90초 동안 원심분리하여 제거하였고, 반응 상등액을 취한 후 분광기를 이용하여 290nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

또한, 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 활성은 가스 크로마토그래피(GC)를 이용하여 측정하였다. 즉, 자외선 분광기로 측정된 에폭사이드 가수분해효소 활성이 있는 0.2g의 전체 세포를 1ml의 100mM Tris-HCl(pH 8.0)이 함유된 10ml의 바이알에 함유된 2mM의 스티렌옥사이드와 혼합하여 30℃에서 15시간 동안 반응시켰 다. 상기 반응 혼합물을 2ml의 헥산으로 추출한 후, 이 추출물을 GC 시스템인 키랄덱스 감마-사이클로덱스트린 트리플루오로아세틸 컬럼(0.25 mm ID, 30 m length; Astec, Adv., Tech., USA; van Loo et al., 2004)을 장착한 FID 검출기(Hewlett-Packard, Avondale, PA, USA)로 측정하였다. 라세믹스티렌옥사이드에 대한 GC 분석에 있어서, 오븐, 주입기 및 검출기의 온도는 각각 90℃, 220℃ 및 230℃이다. 또한, 도 1a에 기재된 다른 에폭사이드 기질에 대한 가수분해도 상기와 유사한 방법으로 측정하였다.

상기와 같은 방법으로, 도 1a의 다양한 에폭사이드 기질에 대해 상기 10개 종의 가수분해효소 활성을 측정한 결과, 표 2에서와 같이 스티렌옥사이드 기질에 대한 광학선택적 가수분해효소 활성 외에, 상기 7개의 에리스로박터 종은 다양한 ee값을 가지면서 (S)-GPE를 선택적으로 가수분해할 수 있었다. 한편, 스티렌옥사이드 및 GPE와는 달리, 1,2-에폭시헥산(EX) 및 1.2-엑폭시부탄(EB)의 (R)- 및 (S)-에폭사이드는 대부분의 종에 의해 동일하게 가수분해됨을 확인할 수 있었다(표 2).

구체적으로, 반응 혼합물로부터 추출된 에폭사이드 추출물 및 비-추출된 디올(diol)의 분광학적 양을 자외선 분광기를 이용하여 측정하였다(Bhatnagar et al., J. Biochem. Biophys. Methods., 50:1-13, 2001). 우선, 분리된 균주를 30ml의 ZoBell 배지에서 25℃, 24시간 동안 진탕 배양한 후, 상등액을 4℃, 4300g에서 20분간 원심분리하여 제거하였다. 전체 세포는 10 mM의 인산완충용액(pH 6.8)으로 2번 세척한 후, 디메틸포름아미드(dimethylformamid, DMF)가 함유된 4 mM의 스티렌옥사이드와 10mM의 인산염(pH 6.8) 용액에 현탁시킨 0.04g의 전체 세포를 혼합하여 30℃에서 15분간 반응시켰다. 상기 반응액에 40ul의 NaIO4 농축액(DMF에 200 mM의 NaIO4를 함유)을 첨가한 후 2분간 voretxing함으로써 반응액내 생성된 diol과의 산화반응을 실시하였다. 반응액과 현탁되어 있는 세포는 16,500g에서 90초 동안 원심분리하여 제거하였고, 반응 상등액을 취한 후 분광기를 이용하여 290nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.

또한, 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 활성은 가스 크로마토그래피(GC)를 이용하여 측정하였다. 즉, 자외선 분광기로 측정된 에폭사이드 가수분해효소 활성이 있는 0.2g의 전체 세포를 1ml의 100mM Tris-HCl(pH 8.0)이 함유된 10ml의 바이알에 함유된 2mM의 스티렌옥사이드와 혼합하여 30℃에서 15시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 2ml의 헥산으로 추출한 후, 이 추출물을 GC 시스템인 키랄덱스 감마-사이클로덱스트린 트리플루오로아세틸 컬럼(0.25 mm ID, 30 m length; Astec, Adv., Tech., USA; van Loo et al., 2004)을 장착한 FID 검출기(Hewlett-Packard, Avondale, PA, USA)로 측정하였다. 라세믹스티렌옥사이드에 대한 GC 분석에 있어서, 오븐, 주입기 및 검출기의 온도는 각각 90℃, 220℃ 및 230℃이다. 또한, 도 1a에 기재된 다른 에폭사이드 기질에 대한 가수분해도 상기와 유사한 방법으로 측정하였다.

이처럼, 도 1a의 다양한 에폭사이드 기질에 대해 상기 10개 종의 가수분해효소 활성을 측정한 결과, 표 2에서와 같이 스티렌옥사이드 기질에 대한 광학선택적 가수분해효소 활성 외에, 상기 7개의 에리스로박터 종은 다양한 ee값을 가지면서 (S)-GPE를 선택적으로 가수분해할 수 있었다. 한편, 스티렌옥사이드 및 GPE와는 달리, 1,2-에폭시헥산(EX) 및 1.2-엑폭시부탄(EB)의 (R)- 및 (S)-에폭사이드는 대부분의 종에 의해 동일하게 가수분해됨을 확인할 수 있었다(표 2).

<1-8> 에리스로박터 종 JCS 358 균주에 의한 라세믹 스티렌옥사이드의 반응속도 광학분할(kinetic resolution)

2 mM 라세믹스티렌옥사이드의 반응속도 광학분할은 30℃의 배치모드(batch mode)에 있는 에리스로박터 종 JCS 358 균주를 이용하여 수행하였다. 라세믹 스티렌옥사이드의 초기 농도는 2 mM이며, 0.2g의 전체 세포를 이용하였다. 24시간 배양 후, 상기 반응 혼합물을 주기적으로 제거하였고, 남은 에폭사이드는 헥산으로 추출한 후 GC로 분석하였다.

그 결과, 도 2에서와 같이 JCS 358 균주에 의한 라세믹 스티렌옥사이드의 반응속도 광학분할이 수행됨을 관찰하였다. 즉, (R)-스티렌옥사이드 기질에 대한 가수분해 비율은 (S)-스티렌옥사이드 기질에 대한 가수분해 비율에 비해 반응속도가 빨랐으며, 16시간 후 (S)-스티렌옥사이드의 광학순도가 0에서 99%까지 증가함을 관찰할 수 있었다. 이때, (S)-스티렌옥사이드에 대한 광학순도의 최종 산출양은 약 10%였다(이론적 산출량은 약 50%). 그러나, 2 mM 스티렌옥사이드 기질에 대한 상기 균주의 반응속도 광학분할에 16시간이 소요된다는 것은 에리스로박터 JCS 358 균주에서 생산된 에폭사이드 가수분해효소의 내재적 효율성이 라세믹 스티렌옥사이드의 효율적인 반응속도 광학분할에 불충분하다는 것을 의미한다.

<실시예 2>

에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주로부터 에폭사이드 가수분해효소 유전자의 동정 및 계통발생학적 분석

<2-1> 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균의 ORF 서열 분석

에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주로부터 에폭사이드 가수분해효소의 유전자를 동정하기 위하여, Moore foundation(www.moore.org)으로 분석한 상기 균주의 게놈 DNA 서열상에 있는 개방해독틀(ORF)에 상응하는 서열(Sm-X-Nu-X-Sm-Sm 모티프 및 H-G-X-P)을 Ensoltek의 ProteinFinder(www.ensoltek.com) 및 BLAST 프로그램을 이용하여 분석하였다. 또한, 후보 에폭사이드 가수분해효소의 아미노산 서열과 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소 아미노산 서열을 CLUSTAL W 프로그램(Thompson, et al., Nucleic. Acids. 22:4673-4680, 1994)으로 분석하였다.

한편, 상기 후보 균주에 있어서 본질적인 에폭사이드 가수분해효소 활성-부위가 존재하는지 통상적인 방법으로 측정하였다. 이를 위해, 링-개방 타이로신, HGXP 및 Sm-X-Nu-X-Sm-Sm(Sm= small residues, X= any residues 및 Nu= nucleophile) 모티프가 포함된 서열이 선택되었고, 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소 서열과 비교분석하였다.

상기 분석결과를 도 3a 내지 도 3c에 나타냈다. 즉, 도3a 내지 도 3c는 분리 및 정제된 EEH1 아미노산 서열과 종래에 알려진 아미노산 서열을 비교분석한 것으로서, 비교분석된 단백질 번호는 하기와 같다:

EPH1(Rhodotorula glutinis), AAF64646;

Ephx1(Rattus norvegivcu), P07687;

EPHX1(Homo sapiens), AAH08291;

Eph1 (Xanthophyllomyces dendrorhous), AAF18956;

hyl1 (Aspergillus niger), CAB59813;

EEH1 (Erythrobacter litoralis HTCC2594).

도 4a 및 4b는 본 발명에서 분리 및 정제된 EEH2 및 EEH3 아미노산 서열과 종래에 알려진 아미노산 서열을 비교분석한 것으로서, 비교분석된 단백질 번호는 하기와 같다:

Homo sapiens(EPHX2, Human sEH), AAH11628;

Rattus norvegicus(Ephx2, Rat sEH), CAA46211;

Solanum tuberosum(pEHSt, potato sEH), AAA81890;

Glycine max(sEHGm, soybean sEH), CAA55293;

Bradyrhizobium japonicum(ephA), BAC46379;

Erythrobacter litoralis HTCC2594(EEH2);

Erythrobacter litoralis HTCC2594(EEH3).

상기와 같이 에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주의 ORF 서열을 분석한 결과, 1.122bp(eeh1, SEQ ID NO: 14), 870bp(eeh2, SEQ ID NO: 16) 및 888bp(eeh3, SEQ ID NO: 18)로 이루어진 세 개의 유전자를 선별할 수 있었다. 또한, 대부분의 에폭사이드 가수분해효소는 공유된 Sm-X-Nu-X-Sm-Sm 모티프, 촉매성 3가 원소 및 음이온 공을 가지고 있었다(도 3a-c 및 도 4a-b). 구체적으로, EEH1 유전자는 사람의 미립자 에폭사이드 가수분해효소와 약 35%의 상동성을 보였고, GGD173WGS 모 티프, 촉매성 3가 원소(Asp173, Glu324 및 His351) 및 음이온 공 HGXP(HGW99P)을 가지고 있었다(도 3a 내지 3c). 반면, EEH2 및 EEH3 유전자는 Sm-X-Nu-X-Sm-Sm 모티프(eeh2에 대해서는 VHD107YGV 및 eeh3에 대해서는 AHD106WGA), 촉매성 3가 원소(eeh2에 대해서는 Asp107, Glu250 및 His269; eeh3에 대해서는 Asp106, Glu251 및 His270) 및 에폭사이드 가수분해효소(Arahira et al., 2000; Kaneko et al., 2002; Knehr et al., 1993; Stapleton et al., 1994 및 Strausberg et al., 2002; 도 4)에 보존된 음이온 공 HGXP(eeh2에 대해서는 HGY42P 및 eeh3에 대해서는 HGF38P)를 가진 용해성 에폭사이드 가수분해효소와 상동성을 보였다(도 4a 및 4b).

<2-2> 계통발생학적 분석(phylogenetic analysis)

에폭사이드 가수분해효소의 계통발생학적 분석을 위하여, SwissProt 또는 EMBL 단백질 데이터베이스로부터 입수한 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소 서열을 본 발명의 eeh1, eeh2 및 eeh3 서열과 비교분석하였다. 계통발생학적 거리는 Clustal W 프로그램을 이용하여 측정하였고, 계통발생학적 트리는 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 3.1 소프트웨어(The Biodesign Institute, Tempe, AZ; Kumar et al., 2004)를 이용하여 작성하였다. 얻어진 결과를 도 5에 나타냈다. 도 5는 에폭사이드 가수분해효소의 계통발생학적 분석을 도식화한 것으로서, 비교분석된 아미노산 서열은 하기와 같다:

Rhodotorula glutinis (AAF64649);

Rattus norvegivcu (P07687);

Homo sapiens(AAH08291);

Xanthophyllomyces dendrorhous(AAF18956);

Aspergillus niger(CAB59813);

Homo sapiens(AAH11628);

Rattus norvegicus(CCA46211);

Solanum tuberosum(AAA81890);

Glycine max(CAA55293);

Agrobactrium radiobacter sEEH(O31243);

Corynebacterium sp. sEEH(O52866);

Haloalkane dehalogenase(P22643).

도 5에서와 나타낸 바와 같이, 로도토룰라 글루티니스(EPH1; Visser et al., 2000), 래터스 노르베지쿠스(Ephx1, Rat mEH; Falany et al., 1987), 호모 사피엔스(EPHX1, Human mEH; Strausberg et al., 2002), 잔토필로마이세스 덴드로로우스(Eph1; Visser et al., 1999), 아스펠길루스 니거(hyl1; Arand et al., 1999), 호모 사피엔스(EPHX2, Human sEH; Strausberg et al., 2002), 레터스 노르베지쿠스(Ephx2, Rat sEH; Knehr et al., 1993), 솔라눔 투베로섬(pEHSt, potato; sEH; Stapleton et al., 1994), 글리신 멕스 max (sEHGm, soybean sEH; Arahira et al., 2000), 애그로박트리움 라디오박터 sEH(Rink et al.,1997), 코리네박테리움 종 sEH(Misawa et al., 1998) 및 할로아켄 디할로게네이즈(Janssen et al., 1989)로부터 기존에 알려진 에폭사이드 가수분해효소를 갖고 있는 3개의 ORF를 neighbor-joining 방법을 근간으로 계통발생학적 분석을 수행하였다.

그 결과, eeh1은 미립자 에폭사이드 가수분해효소를 가진 군에 속하는 반면, eeh2 및 eeh3는 용해성 에폭사이드 가수분해효소와 연관되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 5). 따라서, 본 발명의 에리스로박터 litorails HTCC2594 균주의 ORF는 에폭사이드 기질에 대해 가수분해 활성을 가진 에폭사이드 가수분해효소임을 알 수 있다.

<2-3> eeh 유전자 클로닝

에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주의 ORF 서열을 내에 있는 eeh 유전자를 클로닝하기 위하여, 우선, 하기와 같은 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 상기 균주의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이때, 제한효소인 NdeI과 XhoI/NotI를 각각 프라이머 양끝에 붙였으며, eeh1, eeh2 및 eeh3 유전자의 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 하기 표 3에 나타낸 것과 같다.

[표 3]

에리스로박터 litoralis HTCC2594 균주의 ORF 서열 내에 있는 eeh 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머 서열

명칭	서열	SEQ ID NO:
eeh1F (정방향)	5'-CGACCCGG CATATG AGCGAGATCAGGCCCTTCGTTCT-3'	4
eeh1R (역방향)	5'-CTCCACAT CTCGAG TCGCATGAGTGAAAAACAGGCGCG-3'	5
eeh2F (정방향)	5'-CGACCCGG CATATG GCCGGACCAAGCCTGGGCGAATGG-3'	6
eeh2R (역방향)	5'-CTCCACAT CTCGAG GCGTGCGAGCCAATCCAGCGTCACGC-3'	7
eeh3F (정방향)	5'-CGACCCGG CATATG CCCGATCCTGCGAGCGGGATT-3'	8
eeh3R (역방향)	5'-CTCCACAT GCGGCC GCGGATGCCGGAGCGGGCTTAGG-3'	9
eeh1RX (역방향)	5`- CTCCACAT CTCGAG CTATCGCATGAGTGAAAAACAGGC-3`	10
eeh2RX (역방향)	5`- CTCCACAT CTCGAG TTAGCGTGCGAGCCAATCCAGCGTCACGC -3`	11
eeh3RX (역방향)	5`- CTCCACAT GCGGCC GCTCAGGATGCCGGAGCGGGCTTAG -3`	12

상기 표 3에서, 상기 정방향 및 역방향 프라이머의 밑줄친 부분은 각각 NdeI 및 XhoI/NotI 부위를 가리키며, 히스티딘-태그가 없는 EEH1, EEH2 및 EEH3 유전자 의 발현을 위하여, 상기 표 3에 기재한 eeh1RX, eeh2RX 및 eeh3RX 역방향 프라이머를 제작하였다. PCR 반응 후, NdeI 및 XhoI/NotI 제한효소 부위를 가진 증폭된 단편을 NdeI/XhoI 또는 NdeI/NotI 부위를 가진 pET-24a (+) 벡터에 연결한 후, 이 재조합 발현벡터를 DH5α에 형질전환시켰고, 상기 재조합 발현벡터의 발현을 BL21-CodonPlus (DE3)-RP (Novagen) 균주에 도입하여 발현 유무를 확인하였다.

<2-4> eeh 유전자 발현

상기 실시예 <2-3>에서 제조한 eeh 유전자 발현벡터가 실질적으로 세포에서 발현되는지 확인하기 위하여, 상기 형질전환체를 37℃에서 배양한 후 600nm에서 O.D값이 0.4 내지 0.6이 됐을 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 3시간 배양한 후, 상기 세포를 5,000g에서 20분간 원심분리하여 수득하였고, 수득한 세포를 용액[50 mM phosphate (pH 7.0), 0.5 M KCl 및 10% glycerol]에 현탁시켜 분쇄기로 균질화하였다. 세포 분쇄물은 HisㆍBind Purification Kit(Novagen)을 이용하여 15,000g에서 30분간 원심분리시켜 제거하였다.

용해성 단편은 결합용액[500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 7.0), 5 mM 이미다졸)으로 평형상태를 유지한 Ni-nitrilotriacetic(Ni-NTA) 컬럼에 적재하였다. 세척용액[500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 7.0), 60 mM 이미다졸]으로 세척한 후, 결합된 효소를 용출용액[500 mM NaCl, 20 mM phosphate (pH 7.0), 1 M 이미다졸]으로 용출하였고, 50 mM 인산화용액(pH 7.0)으로 투석하였다. 단백질 정제는 Laemmli(1970)에 기재된 방법으로 SDS-PAGE를 실시하여 분리하였다. 단백질 농도는 표준 단백질인 BSA와 함께 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 이용한 Bradford 방법으 로 측정하였다(Bradford, 1976).

그 결과, 분리된 재조합 효소의 분자량이 각각 41kDa(rEEH1, SEQ ID NO: 13), 33.4kDa(rEEH2, SEQ ID NO: 15) 및 34.5 kDa(rEEH3, SEQ ID NO: 17)임을 확인할 수 있었다(도 6a 및 6b).

<2-5> 에폭사이드 가수분해효소 활성에 대한 pH 및 온도의 효능

에폭사이드 가수분해효소 활성에 대한 pH 효능은 50 mM의 아세트산 나트륨-아세트산 용액(pH 4.0 및 pH 6.0), 50 mM의 MES 용액(pH 6.0 - 7.0), 50 mM의 인산화용액(pH 7.0 - 9.0) 및 50 mM의 글라이신용액(pH 9.0 및 pH 10.0)을 이용하여 측정하였고, 최적 반응온도는 pH 7.5, 10℃ 내지 70℃ 범위에서 에폭사이드 가수분해효소 활성을 측정하였다.

에폭사이드 가수분해효소(rEEH1, rEEH2 및 rEEH3)의 활성에 대한 pH의 효능을 pH 4.0 내지 10.0에서 다양하게 측정한 결과, 스티렌옥사이드 기질에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 최적 활성은 pH 6.5, pH 7.5 및 pH 8.0에서 각각 나타났다(도 7a). 즉, 에폭사이드 가수분해효소는 대부분 중성 pH에서는 안정적이나, pH 6.0 이하에서는 불안정함을 알 수 있다.

또한, 에폭사이드 가수분해효소(rEEH1, rEEH2 및 rEEH3)의 활성에 대한 온도의 효능을 10 내지 70℃ 범위에서 분석한 결과, 스티렌옥사이드 기질에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 가수분해 효율은 50℃, 55℃ 및 45℃에서 각각 최대치를 나타냈다(도 7b). 즉, 온도에 따른 에폭사이드 가수분해효소의 활성은 10 내지 50℃에서는 증가하다가, 최적온도 이상에서는 현저하게 감소됨을 알 수 있다(도 7b).

<실시예 3>

스핑고픽시스 알라스켄시스( Sphingopyxis alaskensis ), 노보스핑고비움 아로마티시보란스( Novosphingobium aromaticivorans ) 및 로도박터레일스속 균주(Rhodobacterales) HTCC2654 균주로부터 에폭사이드 가수분해효소 유전자 클로닝 및 발현 측정

상기 <실시예 2>와 같은 방법으로, 스핑고픽시스 아라스켄시스, 노보스핑고비움 아로마티시보란스 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주의 ORF 서열을 분석한 후, 하기와 표 4에 기재된 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 상기 균주로부터 에폭사이드 가수분해효소 활성을 가진 유전자를 각각 클로닝하였다:

[표 4]

스핑고픽시스 아라스켄시스, 노보스핑고비움 아로마티시보란스 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주의 ORF 서열로부터 에폭사이드 가수분해효소 유전자를 클로닝하기 위한 프라이머 서열

명칭	서열	SEQ ID NO:
SPF1 (정방향)	5`-CGACCCGGCATATGTCCCCCGCCAAATCAATTTCGC-3`	19
SPRH1 (역방향)	5`-CTCCACATGCGGCCGCCTTCTTCTCGCGCAAGGGG-3`	20
NVF1 (정방향)	5`-CGACCCGGCATATGAATGTTGCGCCTTTCGTTGTCG-3`	21
NVRH1 (역방향)	5`-CTCCACATGCGGCCGCGCACATCAGGGAAAACGCGG-3`	22
RBF2 (정방향)	5`-CGACCCGGCATATGAACGACAAGACCTTTATCGAGACGAACGGC-3`	23
RBRH2 (역방향)	5`-CTCCACATCTCGAGTTACAAGGCTGAAAAGAACACTCGCAAATC-3`	24
SPRNH1(역방향)	5`-CTCCACATGCGGCCGCTCACTTCTTCTCGCGCAAGGG-3	25
NVRNH1(역방향)	5`-CTCCACATGCGGCCGCCTAGCACATCAGGGAAAACGCG-3`	26
BRNH2(역방향)	5`-CTCCACATCTCGAGTCAAAGCGTGGCGAGCCAGTCGATGA-3`	27

상기 표 4에서, 밑줄친 부분은 각각 정방향 프라이머에서는 NdeI 부위를, 역방향 프라이머에서는 XhoI/NotI 부위를 가리킨다. 또한, 히스티딘-태그가 없는 sEEH, nEEH 및 rEEH 유전자의 발현을 위해, 상기 표 4에 기재된, SPRNH1(SEQ ID NO: 25), NVRNH1(SEQ ID NO: 26), 및 RBRNH2 (SEQ ID NO: 27)의 역방향 프라이머를 제작하였다.

그 결과, 스핑고피식스 알라스켄시스로부터는 seeh 유전자(SEQ ID NO: 29), 노보스핑고비움 아로마티시보란스로부터는 neeh 유전자(SEQ ID NO: 31) 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654로부터는 reeh 유전자(SEQ ID NO: 33)를 각각 분리할 수 있었다.

또한, 상기 유전자를 pET-24a (+) 발현벡터에 클로닝 한 후 BL21-CodonPlus (DE3)-RP(Novagen) 균주에 각각 도입하여 SDS-PAGE로 전기영동시킨 결과, 49kDa(sEEH, SEQ ID NO: 28), 43kDa(nEEH, SEQ ID NO: 30) 및 36kDa(rEEH, SEQ ID NO: 32)의 분자량을 가진 에폭사이드 가수분해효소를 관찰할 수 있었다(도 9). 또한, sEEH, nEEH 및 rEEH의 최적 활성은 중성 pH 및 친온성(30-40℃)에서 나타났다.

<실시예 4>

반응속도 매개변수(kinetic parameter) 결정 및 기질 선택성

rEEH1, rEEH2, rEEH3, sEEH, nEEH 및 rEEH의 반응속도 매개변수는 기질로 (R)- 또는 (S)-스티렌옥사이드를 이용하여 각각 GC로 분석하였다. 구체적으로, 100ul의 분리된 에폭사이드 가수분해효소를 1ml의 100mM 칼륨인산화용액(pH 8.0)이 함유된 10ml의 바이알내에 존재하는 다양한 농도의 (R)- 또는 (S)-스티렌옥사이드와 혼합하였고, 30℃의 200rpm에서 흔들어 배양하였다. 상기 반응물은 2ml의 헥산으로 추출하였고, 스티렌옥사이드에 대한 최대 광학순도[ee; ee= 100 X (S- R)/(S+R)]는 키랄덱스 감마-사이클로덱스트린 트리플루오로아세틸(G-TA) 모세관 GC 컬럼을 이용하여 분석하였다. 분석결과를 표 5 및 도 8에 나타냈다. 도 8은 라세믹 스티렌옥사이드 기질에 대한 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소(rEEH1, rEEH2 및 rEEH3)의 가수분해 활성을 가스 크로마토그래피로 분석하여 도식화한 것이다:

직선(solid line): 스티렌옥사이드,

굵은 직선(Bold solid line): rEEH1이 첨가된 스티렌옥사이드,

긴 띄줄(long dashed line): rEEH2이 첨가된 스티렌옥사이드,

점선(dotted line): rEEH3이 첨가된 라세틱 스티렌옥사이드.

그 결과, (R)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH1의 VmaxR 및 KmR는 각각 2.5 umol/min 및 2.9 mM인 반면, (S)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH1의 VmaxS 및 KmS는 각각 1.18umol/min 및 2.3mM임을 확인하였다(표 5 및 도 8). 이는, (R)-스티렌옥사이드가 (S)-스티렌옥사이드에 비해 보다 빠르게 가수분해됨을 의미한다. 즉, 이성질체(enantiomer)를 보다 빠르게 가수분해할 수 있다는 것은 rEEH1가 광학선택적이라는 것을 의미한다. 이와 달리, (S)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH3의 VmaxS 및 KmS는 각각 0.43 umol/min 및 3.71 mM인 반면, (R)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH3의 VmaxR 및 KmR는 각각 0.29 umol/min 및 2.61 mM임을 확인하였다(표 5 및 도 8). 이는, rEEH3가 (R)-스티렌옥사이드 보다는 (S)-스티렌옥사이드에 대해 보다 선택적으로 가수분해할 수 있음을 의미한다. 한편, (S)-스티렌옥사이드에 대한 rEEH2의 VmaxS 및 KmS는 각각 0.12 umol/min 및 6.18 mM인 반면, (R)-스티렌옥사이드에 대해 rEEH2의 VmaxR 및 KmR는 각각 0.11 umol/min 및 5.49 mM임을 확인하였다(표 5 및 도 8). 이는, rEEH2가 (S)-스티렌옥사이드와 (R)-스티렌옥사이드 모두에서 같은 비율로 가수분해시킨다는 것을 의미한다.

또한, rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 촉매 효율성(kcat/Km)에 있어서, rEEH1의 가수분해 활성은 rEEH2 및 rEEH3의 활성에 비해 대략 6 내지 55배 정도 우세함을 나타내었다(표 5). 이는, rEEH1이 전체 세포의 광학선택적 활성에 주도적으로 작용한다는 것을 의미한다.

[표 5]

(R)- 및 (S)-스티렌옥사이드 가수분해에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 반응속도 매개변수

또한, 도 1의 다양한 에폭사이드 기질에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 기질 선택성은 표 6와 같다. 즉, rEEH1는 C-1 부위에 있는 부피가 큰 링을 가진 단일치환된 에폭사이드에 대해 광학선택적으로 가수분해시키는 반면, 지방족 사슬을 가진 (R)- 및 (S)-단일치환된 에폭사이드 양쪽에서는 유사한 비율로 가수분해시킴을 알 수 있다. 반면, rEEH3는 C-1 부위 및 스티렌옥사이드에서 광학선택적으로 지방족 에폭사이드를 가수분해시켰으나, 광학선택적 다양성은 보이지 않았다.

[표 6]

다양한 에폭사이드 기질에 대한 rEEH1, rEEH2 및 rEEH3의 광학선택적 가수분해효소 활성

* N.D: 미결정

또한, 반응속도 매개변수는 시그마 플롯 프로그램을 이용한 비-선형 회귀분석으로 예측하였으며, 도 1의 다양한 기질에 대해서도 rEEH1, rEEH2, rEEH3, nEEH, rEEH 및 sEEH의 반응속도 매개변수를 측정하였다. 그 결과, 표 7에서와 같이 rEEH 는 (R)-광학순도 스티렌옥사이드를 선택적으로 가수분해시키는 반면, nEEH 및 sEEH는 광학선택성이 매우 낮음을 알 수 있다.

[표 7]

(R)- 및 (S)-스티렌옥사이드에 대한 각 균주로부터 분리된 효소의 반응속도 매개변수

Enzyme and enantionmer	Parameter value
	Km	V max	Kcat	Kcat/Km
(S)-enantionmer	(mM)	(umole/min/mg)	(S-1)	(S-1 /mM)
Spa	5.25± 0.3	12.1	10.08	1.92
Novob	4± 0.3	18.67	12.96	3.24
RHc	4.1± 0.3	11.26	6.7	1.63
(R)- enantionmer
Spa	4± 0.3	8.9	7.42	1.86
Novob	6± 0.3	40.0	27.8	4.63
RHc	5.2± 0.3	54.08	32	6.16

상기 표에서, a , b , c : 스핑고픽시스 알라스켄시스, 노보스핑고비움 아로마티시보란스 및 로도박터레일스속 균주 HTCC2654 균주로부터 각각 분리된 효소.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 에리스로박터(Erythrobacter) 종, 스핑고피식스(Sphingophyxis) 종, 노보스핑고비움(Novosphingobium) 종 및 로도박터레일즈(Rhodobacterales) 속 균주로부터 분리 및 정제된 광학선택적 가수분해효소 활성을 가진 단백질은 약학산업에서 약리활성이 있는 광학순도 에폭사이드를 고효율로 생합성하는데 유용하게 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

에리스로박터 리토랄리스(Erythrobacter litoralis) 균주로부터 분리 및 정제되고, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 갖는, 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
제1항에 있어서, SEQ ID NO: 14의 염기 서열에 의해 코딩되는 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
제1항에 있어서, 상기 가수분해효소 단백질의 기질은 스티렌옥사이드(styrene oxide, SO), 글리시딜 페닐 에테르(glycidyl phenyl ether, GPE), 에피클로로하이딘(epichlorohydrin, ECH), 에피플루오로하이딘(epifluorohydrin, EF), 1,2-에폭시부탄(1,2-epoxybutane, EB) 및 1,2-에폭시헥산(1,2-epoxyhexane, EX)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질.
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SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 스티렌옥사이드, 및 글리시딜 페닐 에테르(glycidyl phenyl ether, GPE)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기질과 반응시켜, 상기 기질을 광학선택적으로 가수분해시키는 단계를 포함하는,

광학순도 스티렌옥사이드 또는 글리시딜 페닐 에테르 제조 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 33인 염기서열에 의해 코딩되는 것인, 제조 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 단백질을 에폭사이드와 반응시켜, 상기 에폭사이드를 광학선택적으로 가수분해시키는 단계를 포함하는, 광학순도 에폭사이드 제조 방법.
제 13항에 있어서, 상기 에폭사이드는 α-메틸스티렌 옥사이드(methylstyrene oxide), 스티렌 옥사이드(styrene oxide), 글리시딜 페닐 에테르(glycidyl phenyl ether, GPE), 에피클로로하이딘(epichlorohydrin), 에피플루오로하이딘(epifluorohydrin), 1,2-에폭시부탄(1,2-epoxybutane) 및 1,2-에폭시헥산(1,2-epoxyhexane)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 광학순도 에폭사이드 제조 방법.
제 13항에 있어서, 상기 가수분해효소는 pH 6.5 내지 8.0 및 온도 40 내지 60℃에서 상기 가수분해반응을 수행하는 것인, 광학순도 에폭사이드 제조 방법.
제11항에 있어서, 상기 가수분해는 pH 7.0 내지 8.0 및 온도 30 내지 40 ℃에서 수행되는 것인 제조 방법.