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CN105200098A - 一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 - Google Patents

一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 Download PDF

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CN105200098A
CN105200098A CN201510375211.8A CN201510375211A CN105200098A CN 105200098 A CN105200098 A CN 105200098A CN 201510375211 A CN201510375211 A CN 201510375211A CN 105200098 A CN105200098 A CN 105200098A
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魏喜换
谢新开
陶军华
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Abstract

本发明公开了一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，所述方法利用含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组酿酒酵母或其制备的UDP-葡萄糖基转移酶，在葡萄糖基供体存在的情况下，催化瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D生成瑞鲍迪甙M，所述重组酿酒酵母通过以下方法构建：在质粒中引入强启动子得到载体质粒，将UDP-葡萄糖基转移酶基因通过酶切位点插入到所述载体质粒上置于所述启动子控制之下得到表达载体，然后转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母。本发明的方法利用安全性高的重组酿酒酵母进行催化生产，生产的UDP-葡萄糖基转移酶表达量、活性更高，生产的瑞鲍迪甙M可以直接作为食品添加剂使用，生产周期短，产量提高，成本较低。

Description

一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法
技术领域
本发明属于生物工程制酶领域，具体涉及一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法。
背景技术
甜味剂是一类广泛应用于食品、饮料及糖果生产的食品添加剂，其既可以在食品的生产过程中添加，也可以在家庭烘焙时经过适当稀释作为蔗糖的替代品使用。甜味剂包括天然甜味剂和人工甜味剂，前者如蔗糖、高果糖玉米糖浆、蜜糖等，后者如阿斯巴甜、糖精等。甜菊糖是一类从植物甜菊中提取出来的天然甜味剂，目前已被广泛用在食品及饮料中。甜菊的提取物中含有包含瑞鲍迪甙在内的多种甜菊糖，天然提取的甜菊糖不同的批次成分差异较大，需要后续的提纯。目前商业化的产品瑞鲍迪甙A包含一些其它的甜菊糖如瑞鲍迪甙C，D及F等。提取的方法制备的甜菊糖通常还有混有一些杂质，有可能对其使用范围造成一定的影响。瑞鲍迪甙M相较于瑞鲍迪甙A具有优势，但其在甜菊叶中的含量极少，且只在甜菊Morita植株中被检测到(2010，J.Appl.Glycosci.,57,199-209)。目前尚未有瑞鲍迪甙M的商业化生产。
中国专利文献CN103397064A公开了一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法利用大肠杆菌制备的UDP-葡萄糖基转移酶或含有UDP-葡萄糖基转移酶的大肠杆菌，在葡萄糖基供体存在的情况下，催化瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D生成瑞鲍迪甙M。上述方法中，所利用的生产UDP-葡萄糖基转移酶的基因工程菌--大肠杆菌并不是安全的菌株(GRAS，generalregardedassafe)，其在培养过程中会产生毒素，生产的瑞鲍迪甙M不能直接应用，并且大肠杆菌为原核生物，UDP-葡萄糖基转移酶的基因来自于真核生物，因为真核生物和原核生物的蛋白表达过程的复杂程度不同，用原核细菌表达真核来源的酶，会影响酶的活性。酿酒酵母是公认安全的菌株，但是在酵母菌中表达外源基因的表达量较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中含有UDP-葡萄糖基转移酶的大肠杆菌在制备瑞鲍迪甙M的过程中因工程菌自身产生毒素使生产的瑞鲍迪甙M存在安全问题，提供一种通过公认安全菌株酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法可以较低的成本，较短的周期生产出高纯度的瑞鲍迪甙M产品。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，利用含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组酿酒酵母或其制备的UDP-葡萄糖基转移酶，在葡萄糖基供体存在的情况下，催化瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D生成瑞鲍迪甙M，所述重组酿酒酵母通过以下方法构建：在质粒中引入强启动子得到载体质粒，将UDP-葡萄糖基转移酶基因通过酶切位点插入到所述载体质粒上置于所述强启动子控制之下得到表达载体，然后转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊(Steviarebaudiana)的UGT-A和/或来自水稻(Oryzasativa)的UGT-B。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述UGT-A的氨基酸序列与序列表中SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有至少60％的一致性；所述来自水稻的UGT-B的氨基酸序列与序列表中SEQIDNO.3所示氨基酸序列具有至少60％的一致性。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述UGT-A的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，所述UGT-B的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.3所示。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述酶切位点为HindIII和XbaI。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述强启动子为ADH2或TEF1。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述质粒为pYES2。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述载体质粒的构建方法为：在质粒内部引入AgeI酶切位点，通过AgeI/HindIII位点引入强启动子。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4742。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述葡萄糖基供体为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，将重组酿酒酵母在细胞通透剂作用下形成重组酿酒酵母透性细胞用于催化。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，将重组酿酒酵母进行培养，于冰浴中超声波破碎，将破碎液离心，收集上清液冻干，获得UGT-A或UGT-B的冻干粉用于催化。
上述制备瑞鲍迪甙M的方法中，所述催化的反应在温度4℃～50℃以及pH5.0～9.0的水相体系中进行。
由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：
1、本发明提供的利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，通过制备高安全性的重组酿酒酵母制备UDP-葡萄糖基转移酶的进行催化生产，生产的瑞鲍迪甙M安全性高，可以直接作为食品添加剂使用。
2、本发明提供的利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，采用酿酒酵母作为工程菌，在质粒pYES2上通过AgeI/HindIII酶切位点引入强启动子ADH2或TEF1，替换pYES2质粒上原有的Gal启动子，通过HindIII和XbaI位点插入来源于真核生物的UDP-葡萄糖基转移酶基因构建表达载体，UDP-葡萄糖基转移酶基因位于强启动子控制下，在酿酒酵母BY4742培养过程中不需要诱导可以直接表达，节省了发酵时间和步骤，并且相对于原核工程菌生产的UDP-葡萄糖基转移酶活性更高，UDP-葡萄糖基转移酶催化底物的转化率最高为90％，经纯化，生产的瑞鲍迪甙M纯度大于99％。
3、本发明提供的利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，生产的瑞鲍迪甙M安全性好、纯度高，不用后续处理，直接用于食品添加剂，从而显著缩短了生产周期，提高了产量，降低了成本。
附图说明
下面将通过附图和具体实施方式进行一步说明本发明。
图1为制备的瑞鲍迪甙M的1HNMR图。
具体实施方式
以下瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙M分别简称RebA、RebD和RebM，三者的结构式分别参见式I、II和III。
本发明主要提供四条合成RebM的路线：
路线一：
路线二：
路线三：
路线四：
根据本发明，所用的UGT-A或UGT-B可以酶冻干粉形式存在或存在于重组酵母细胞中。
UGT-A或UGT-B的获得方法如下：
利用分子克隆技术、基因工程技术获得UGT-A或UGT-B的重组酿酒酵母表达菌株，然后将重组酿酒酵母发酵，制备得到含有UGT-A或UGT-B的重组细胞，或者制备得到UGT-A或UGT-B的冻干粉。
本发明所述的分子克隆技术和基因工程技术如无特殊说明均是已知的。分子克隆技术可参见《分子克隆实验指南》第三版(J.沙姆布鲁克著,2005)。
采用基因工程技术构建本发明重组菌株的表达步骤如下：
(1)根据UGT-A、UGT-B或SUS的氨基酸序列或者UGT-A、UGT-B或SUS基因的核苷酸序列合成UGT-A、UGT-B或SUS基因片段，连入pUC57载体；
(2)通过PCR、双酶切、连接，将各基因片段插入重组质粒pEZADH2、pEZTEF1、pEZADH1相应的酶切位点中，使各基因置于不同启动子的控制之下；
(3)将表达载体转化进入酿酒酵母BY4742中，得到UGT-A或UGT-B或SUS的重组酿酒酵母表达菌株。
利用含有UGT-A或UGT-B的重组酿酒酵母表达菌株制备含有UGT-A或UGT-B的重组细胞，或者UGT-A或UGT-B的冻干粉。
上述方法的具体步骤见下述实施例。
实施例1制备含UGT-A的重组酿酒酵母细胞
根据pYES2质粒序列，设计引物pYES2-AgeI-F(GATGATCCACTAGTAACCGGTAGAAGCCGCCG)和pYES2-AgeI-R(CGGCGGCTTCTACCGGTTACTAGTGGATCATC)，通过扩环PCR，在pYES2质粒内部引入AgeI切点，得到质粒pYES2-AgeI。
以INVSc2基因组为模板，设计引物ADH2-F(CACTAGTAACCGGTGCAAAACGTAGGGGC)和ADH2-R(GTCCAGCCCAAGCTTGTATTACGATATAG)，PCR扩增得到ADH2启动子基因片段，切胶回收。将得到的基因片段AgeI/HindIII酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pYES2-AgeI对应酶切位点，得到pEZADH2质粒。
根据序列表中SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，基因合成UGT-A基因片段，连入pUC57载体获得PUC57-UGT-A(苏州金唯智生物技术有限公司)。以pUC57-UGT-A为模板，PCR获得UGT-A基因，两端分别加上HindIII和XbaI酶切位点，将UGT-A基因片段用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pEZADH2对应酶切位点，得到pEZADH2-UGT-A质粒，将质粒转化酵母BY4742菌株，得到重组菌EZ-A。
挑取平板单克隆至SC-Ura+2％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h，以2％比例将EZ-A菌种接种到50mlYPD+1％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h。离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，获得含UGT-A的重组细胞。
实施例2制备UGT-A冻干粉
将实施例1中制得的UGT-A的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，10min)，收集上清液冻干24h，获得UGT-A的冻干粉。
实施例3制备含UGT-A的重组酿酒酵母透性细胞
方法一：称取实施例1中制得的UGT-A的重组细胞1g湿菌体，重悬至20ml75mmol咪唑-0.1mol/LKCl-10mmol/LMgCl2+1ml甲苯：无水乙醇(v/v)＝1：4，25℃，160rpm摇床震荡15min，离心收集细胞(4,000rpm，10min)，浓缩10倍重悬到0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，获得UGT-A重组酿酒酵母透性细胞用于催化。
方法二：挑取平板单克隆至SC-Ura+2％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h，以2％比例将EZ-A菌种接种到50mlYPD+1％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h后，添加20％TritonX-100(V/V)500ul，继续震荡培养2h，离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，获得含UGT-A的重组酿酒酵母透性细胞用于催化。
实施例4制备含UGT-B的重组酿酒酵母细胞
根据pYES2质粒序列，设计引物设计引物pYES2-AgeI-F(GATGATCCACTAGTAACCGGTAGAAGCCGCCG)和pYES2-AgeI-R(CGGCGGCTTCTACCGGTTACTAGTGGATCATC)，通过扩环PCR，在pYES2质粒内部引入AgeI切点，得到质粒pYES2-AgeI。
以INVSc2基因组为模板，设计引物TEF1-F(CCACTAGTAACCGGTCACACACCATAGCTTC)和TEF1-R(GTCCAGCCCAAGCTTTGTAATTAAAACTTAG)，PCR扩增得到TEF1启动子基因片段，切胶回收。将得到的基因片段AgeI/HindIII酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pYES2-AgeI对应酶切位点，得到pEZTEF1质粒。
根据序列表中SEQIDNO.4所示的核苷酸序列，基因合成UGT-B基因片段，连入pUC57载体获得PUC57-UGT-B(苏州金唯智生物技术有限公司)。以pUC57-UGT-B为模板，PCR获得UGT-B基因，两端分别加上HindIII和XbaI酶切位点，将UGT-B基因片段用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pEZTEF1对应酶切位点，得到pEZTEF1-UGT-B质粒，将质粒转化酵母BY4742菌株，得到重组菌EZ-B。
挑取平板单克隆至SC-Ura+2％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h，以2％比例将EZ-B菌种接种到50mlYPD+2％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h。离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，获得含UGT-B的重组细胞。
实施例5制备UGT-B冻干粉
将实施例4中制得的UGT-B的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，10min)，收集上清液冻干24h，获得UGT-B的冻干粉。
实施例6制备含UGT-B的重组酿酒酵母透性细胞
方法一：称取实施例4中制得的UGT-B的重组细胞将1g湿菌体，重悬至20ml75mmol咪唑-0.1mol/LKCl-10mmol/LMgCl2+1ml甲苯：无水乙醇(v/v)＝1：4，25℃，160rpm摇床震荡15min，离心收集细胞(4,000rpm，10min)，浓缩10倍重悬到0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，获得UGT-B重组酿酒酵母透性细胞用于催化。
方法二：挑取平板单克隆至SC-Ura+2％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h，以2％比例将EZ-B菌种接种到50mlYPD+1％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h后，添加20％TritonX-100(V/V)500ul，继续震荡培养2h，离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，获得含UGT-B的重组酿酒酵母透性细胞用于催化。
实施例7制备含SUS的重组酿酒酵母细胞
根据pYES2质粒序列，设计引物pYES2-AgeI-F(GATGATCCACTAGTAACCGGTAGAAGCCGCCG)和pYES2-AgeI-R(CGGCGGCTTCTACCGGTTACTAGTGGATCATC)，通过扩环PCR，在pYES2质粒内部引入AgeI切点，得到质粒pYES2-AgeI。
以INVSc2基因组为模板，设计引物ADH1-F(TCCACTAGTAACCGGTCTCCCTAACATGTAGG)和ADH1-R(GTCCAGcccAAGCTTAGTTGATTGTATGC)，PCR扩增得到ADH1启动子基因片段，切胶回收。将得到的基因片段AgeI/HindIII酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pYES2-AgeI对应酶切位点，得到pEZADH1质粒。
根据序列表中SEQIDNO.5所示的氨基酸序列或SEQIDNO.6所示的核苷酸序列，基因合成SUS基因片段，连入pUC57载体获得PUC57-SUS(苏州金唯智生物技术有限公司)。以pUC57-SUS为模板，PCR获得SUS基因，两端分别加上HindIII和XbaI酶切位点，将SUS基因片段用限制性内切酶HindIII和XbaI酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pEZADH1对应酶切位点，得到pEZADH1-SUS质粒，将质粒转化酵母BY4742菌株，得到重组菌EZ-S。
挑取平板单克隆至SC-Ura+2％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h，以2％比例将EZ-S菌种接种到50mlYPD+2％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h。离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，获得含SUS的重组细胞用于催化。
实施例8制备SUS冻干粉
将实施例7中制得的SUS的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，10min)，收集上清液冻干24h，获得SUS的冻干粉。
实施例9制备含SUS的重组酿酒酵母透性细胞
方法一：称取实施例7中制得的SUS的重组细胞将1g湿菌体，重悬至20ml75mmol咪唑-0.1mol/LKCl-10mmol/LMgCl2+1ml甲苯：无水乙醇(v/v)＝1：4，25℃，160rpm摇床震荡15min，离心收集细胞(4,000rpm，10min)，浓缩10倍重悬到0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，获得SUS重组酿酒酵母透性细胞用于催化。
方法二：挑取平板单克隆至SC-Ura+2％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h，以2％比例将EZ-S菌种接种到50mlYPD+1％葡萄糖培养基，30℃，200rpm震荡培养48h后，添加20％TritonX-100(V/V)500ul，继续震荡培养2h，离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，获得含SUS的重组酿酒酵母透性细胞用于催化。
实施例10以RebD为底物酶法合成RebM
在反应体系中依次加入100mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，0.224gUDP，34.2g蔗糖，0.2gRebD，UGT-A冻干粉1g以及SUS冻干粉0.4g，混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应18h。反应结束后，取300μl反应液加入600μl3％甲酸水混匀，10,000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测(色谱条件：色谱柱：Agilenteclipsesb-C184.6X150mm；检测波长：210nm；流动相：甲醇：水＝68％﹕32％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃)。RebD的转化率为90％以上。经树脂分离、结晶等后处理纯化后得到RebM0.1g，纯度大于99％，其1HNMR图如图1所示。
实施例11以RebA为底物酶法合成RebM
在反应体系中依次加入100mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，0.18gUDP，41.04g蔗糖，0.2gRebA，UGT-A和UGT-B以及SUS冻干粉分别2g、1g和0.5g，混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应18h。反应结束后，取300μl反应液加入600μl3％甲酸水混匀，10,000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测(色谱条件：色谱柱：Agilenteclipsesb-C184.6X150mm；检测波长：210nm；流动相：甲醇：水＝68％﹕32％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃)。RebA的转化率为50％以上。经树脂分离、结晶等后处理纯化后得到RebM0.09g，纯度大于99％。
实施例12以RebD为底物全细胞合成RebM
在反应体系中依次加入100mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，0.54gUDP-G，0.1gRebD，UGT-A全细胞1g，混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应18h。反应结束后，取300μl反应液加入600μl3％甲酸水混匀，10,000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测(色谱条件：色谱柱：Agilenteclipsesb-C184.6X150mm；检测波长：210nm；流动相：甲醇：水＝68％﹕32％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃)。RebD的转化率为90％以上。经树脂分离、结晶等后处理纯化后得到RebM0.09g，纯度大于99％。
实施例13以RebA为底物全细胞合成RebM
在反应体系中依次加入100mL0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，1.08gUDP-G，0.1gRebA，UGT-A和UGT-B全细胞分别2g和1g，混合均匀后置于37℃水浴，200rpm搅拌反应18h。反应结束后，取300μl反应液加入600μl3％甲酸水混匀，10,000rpm离心5min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测(色谱条件：色谱柱：Agilenteclipsesb-C184.6X150mm；检测波长：210nm；流动相：甲醇：水＝68％﹕32％；流速：1.0mL/min；柱温：30℃)。RebA的转化率为40％以上。经树脂分离、结晶等后处理纯化后得到RebM0.04g，纯度大于99％。
实施例14RebM的分离纯化方法
500ml反应液加1.5L去离子水，55℃加热1小时并超声处理，6700转/分钟离心30分钟，上清液为样品A。离心后沉淀加500ml水，55℃加热0.5小时并超声处理，6700转/分钟离心30分钟，上清液为样品B。将样品A及样品B混合后得到样品C，将样品C用大孔吸附树脂(AB-8)分离。先用水冲洗4个柱体积，再用70％乙醇洗脱3.5个柱体积，得到RebM粗品溶液。将上述粗品溶液减压蒸馏(40-50℃)至溶液剩余约50mL，9900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀加20mL水洗涤，9900rpm离心10分钟，弃上清液。沉淀用50％乙醇水溶液悬浮，加热至65℃溶解，加入等体积的水至乙醇浓度为25％。逐渐冷却至室温，析出固体后，抽滤并真空干燥，得到纯度大于99％的RebM样品。
实施例15
UDP-葡萄糖基转移酶基因在不同的启动子的质粒、宿主菌中催化制备RebM过程中，底物的转化率如表1-2所示，葡萄糖基供体为UDP-G。
表1为UDP-葡萄糖基转移酶基因在pYES2、Gal启动子作用下、不同宿主菌中催化制备RebM过程中底物的转化率
表2为UDP-葡萄糖基转移酶基因在含有不同启动子的pYES2质粒下、在CEN.PK2-1C或BY4742中催化制备RebM过程中底物的转化率
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (13)

1.一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，利用含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组酿酒酵母或其制备的UDP-葡萄糖基转移酶，在葡萄糖基供体存在的情况下，催化瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D生成瑞鲍迪甙M，其特征在于，所述重组酿酒酵母通过以下方法构建：在质粒中引入强启动子得到载体质粒，将UDP-葡萄糖基转移酶基因通过酶切位点插入到所述载体质粒上置于所述强启动子控制之下得到表达载体，然后转化酿酒酵母，得到重组酿酒酵母。
2.根据权利要求1所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A和/或来自水稻的UGT-B。
3.根据权利要求2所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述UGT-A的氨基酸序列与序列表中SEQIDNO.1所示氨基酸序列具有至少60％的一致性；所述来自水稻的UGT-B的氨基酸序列与序列表中SEQIDNO.3所示氨基酸序列具有至少60％的一致性。
4.根据权利要求3所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述UGT-A的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示，所述UGT-B的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.3所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述酶切位点为HindIII和XbaI。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述强启动子为ADH2或TEF1。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述质粒为pYES2。
8.根据权利要求7所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述载体质粒的构建方法为：在质粒内部引入AgeI酶切位点，通过AgeI/HindIII位点引入强启动子。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述酿酒酵母为酿酒酵母BY4742。
10.根据权利要求1-9任一项所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述葡萄糖基供体为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系。
11.根据权利要求1-10任一项所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，将重组酿酒酵母在细胞通透剂作用下形成重组酿酒酵母透性细胞用于催化。
12.根据权利要求1-11任一项所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，将重组酿酒酵母进行培养，于冰浴中超声波破碎，将破碎液离心，收集上清液冻干，获得UGT-A或UGT-B的冻干粉用于催化。
13.根据权利要求1-12任一项所述的制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于，所述催化的反应在温度4℃～50℃以及pH5.0～9.0的水相体系中进行。
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