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JP2022553065A - モグロシドの生合成 - Google Patents

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JP2022553065A
JP2022553065A JP2022523670A JP2022523670A JP2022553065A JP 2022553065 A JP2022553065 A JP 2022553065A JP 2022523670 A JP2022523670 A JP 2022523670A JP 2022523670 A JP2022523670 A JP 2022523670A JP 2022553065 A JP2022553065 A JP 2022553065A
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ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド
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Abstract

Figure 2022553065000001
本発明は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)、スクアレンエポキシダーゼ(ＳＱＥ)および／またはシトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素などの酵素、これら酵素を発現する組み換え宿主細胞およびこのような組み換え細胞を使用して、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドを産生する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月２５日出願の“BIOSYNTHESIS OF MOGROSIDES”なる表題の、米国仮出願６２／９２６,１７０に対する35 U.S.C. § 119(e)下の利益を請求し、その開示を引用により全体として本明細書に包含させる。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介してテキストファイルで提出した配列表の記載
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してASCII形式で提出され、引用により全体として本明細書に包含させる配列表を含む。該ASCIIコピーは、２０２０年１０月２３日に作成し、G091970038WO00-SEQ-FLなる名称であり、８３１KBサイズである。
発明の分野
本発明は、組み換え細胞におけるモグロール前駆体、モグロールおよびモグロシドの産生に関する。
背景
モグロシドは、ククルビタン誘導体の配糖体である。甘味料および糖代替物として高度に需要がある、モグロシドは、シライチア・グロスベノリイ(Siraitia grosvenorii)(ラカンカ)を含む植物果実中で天然に合成されている。抗癌、抗酸化および抗炎症性質がモグロシドに見出されているが、モグロシド生合成に関与する正確な酵素の特徴づけは限られている。さらに、果実からのモグロシド抽出は大きな労働力を要し、モグロシドの構造の複雑さが、デノボ化学合成をしばしば妨げている。
本発明の本質は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質を発現する宿主細胞の提供である。ある態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、(ａ)配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列または配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列に対して２個を超えるアミノ酸置換、欠失または挿入を有しない配列を含むシグナル配列；および(ｂ)Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインを含む配列を含む。
ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列を含む。
ある実施態様において、(ｂ)の配列は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)と少なくとも９０％同一である配列を含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインは野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２～２８に対応する残基を含むおよび／またはＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の触媒ドメインは野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２９～４７３に対応する残基を含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の触媒ドメインを含む配列は、野生型ＣＹＰ５４９１の触媒ドメイン(配列番号２０８の残基２９～４７３)に対して触媒ドメインに１アミノ酸置換、欠失または挿入を含む。
ある実施態様において、アミノ酸置換、欠失または挿入は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の基質結合ドメインに位置する。
ある実施態様において、アミノ酸置換、欠失または挿入は、ヘム基に結合するループに位置する。
ある実施態様において、野生型ＣＹＰ５４９１の配列(配列番号２０８)に対して、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素は、ＣＹＰ５４９１における残基Ｓ４９；Ｖ５７；Ｌ７６；Ａ８５；Ｄ１０７；Ｌ１０９；Ｆ１１２；Ｔ１１７；Ｗ１１９；Ｌ１２０；Ａ１４０；Ｆ１４７；Ｓ１５５；Ｈ１６０；Ｋ１８５；Ｌ２１０；Ｓ２１１；Ｌ２１２；Ａ２８２；Ｄ２９９；Ｖ３５０；Ｔ３５１；Ａ３５３；Ｌ３５４；Ｍ３７６；Ｉ４５８；および／またはＴ４７０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ４９に対応する残基にＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、ＭまたはＬ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＶ５７に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ７６に対応する残基にＩまたはＶ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ８５に対応する残基にＳ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＤ１０７に対応する残基にＰまたはＲ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ１０９に対応する残基にＡ、Ｃ、Ｆ、ＷまたはＹ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＦ１１２に対応する残基にＴまたはＷ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ１１７に対応する残基にＧ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＷ１１９に対応する残基にＲ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ１２０に対応する残基にＨまたはＮ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ１４０に対応する残基にＰ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＦ１４７に対応する残基にＬ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ１５５に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＨ１６０に対応する残基にＥ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＫ１８５に対応する残基にＨ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ２１０に対応する残基にＳ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ２１１に対応する残基にＮ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ２１２に対応する残基にＦ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ２８２に対応する残基にＶ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＤ２９９に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＶ３５０に対応する残基にＦ、Ｉ、ＬまたはＭ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ３５１に対応する残基にＬまたはＭ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ３５３に対応する残基にＧ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ３５４に対応する残基にＶまたはＩ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＭ３７６に対応する残基にＡまたはＣ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＩ４５８に対応する残基にＰ；および／または野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ４７０に対応する残基にＥを含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、さらに上方制御されたスクアレンエポキシダーゼ(ＳＱＥ)、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)および／または少なくとも１個のエポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、上方制御されたスクアレンシンターゼ、下方制御されたラノステロールシンターゼ、少なくとも１個の他のＣ１１ヒドロキシラーゼおよび／または少なくとも２個のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに統合される。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、プラスミドで発現される。
ある実施態様において、複数コピーのＣ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに統合される。
ある実施態様において、スクアレンシンターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、少なくとも１個の他のＣ１１ヒドロキシラーゼ、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のＣＤＳおよび／または少なくとも１個のＥＰＨをコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに統合される。
ある実施態様において、宿主細胞はモグロールを産生する。
ある実施態様において、宿主細胞は対照宿主細胞と比較して、少なくとも１.１倍多いモグロールを産生し、ここで、対照宿主細胞は野生型ＣＹＰ５４９１を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、宿主細胞により産生されない１以上のモグロール前駆体が実質的にない細胞培養培地で培養され得る。
ある実施態様において、宿主細胞は、モグロール／１１－オキソモグロールの２より大きい比をもたらすことができる。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。
本発明のさらなる態様は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素を含む宿主細胞であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)に少なくとも９０％同一であり、ＣＹＰ５４９１における残基に対応する１以上の残基にアミノ酸置換を含む、宿主細胞を提供する。ある実施態様において、１以上の残基は、ＣＹＰ５４９１における残基Ｓ４９；Ｖ５７；Ｌ７６；Ａ８５；Ｄ１０７；Ｌ１０９；Ｆ１１２；Ｔ１１７；Ｗ１１９；Ｌ１２０；Ａ１４０；Ｆ１４７；Ｓ１５５；Ｈ１６０；Ｋ１８５；Ｌ２１０；Ｓ２１１；Ｌ２１２；Ａ２８２；Ｄ２９９；Ｖ３５０；Ｔ３５１；Ａ３５３；Ｌ３５４；Ｍ３７６；Ｉ４５８；および／またはＴ４７０に対応する。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ４９に対応する残基にＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、ＭまたはＬ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＶ５７に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ７６に対応する残基にＩまたはＶ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ８５に対応する残基にＳ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＤ１０７に対応する残基にＰまたはＲ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ１０９に対応する残基にＡ、Ｃ、Ｆ、ＷまたはＹ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＦ１１２に対応する残基にＴまたはＷ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ１１７に対応する残基にＧ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＷ１１９に対応する残基にＲ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ１２０に対応する残基にＨまたはＮ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ１４０に対応する残基にＰ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＦ１４７に対応する残基にＬ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ１５５に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＨ１６０に対応する残基にＥ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＫ１８５に対応する残基にＨ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ２１０に対応する残基にＳ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ２１１に対応する残基にＮ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ２１２に対応する残基にＦ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ２８２に対応する残基にＶ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＤ２９９に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＶ３５０に対応する残基にＦ、Ｉ、ＬまたはＭ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ３５１に対応する残基にＬまたはＭ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ３５３に対応する残基にＧ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ３５４に対応する残基にＶまたはＩ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＭ３７６に対応する残基にＡまたはＣ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＩ４５８に対応する残基にＰ；および／または野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ４７０に対応する残基にＥを含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素は、(ａ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ４９に対応する残基にフェニルアラニン(Ｆ)またはロイシン(Ｌ)；および／または(ｂ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ３５１に対応する残基にメチオニン(Ｍ)を含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素は、配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるシグナル配列を含むＣ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質として発現される。
ある実施態様において、シグナル配列は、配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、さらに上方制御されたスクアレンエポキシダーゼ、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)および／または少なくとも１個のエポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、上方制御されたスクアレンシンターゼ、下方制御されたラノステロールシンターゼ、少なくとも１個の他のＣ１１ヒドロキシラーゼおよび／または少なくとも２個のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに統合されるまたはＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、プラスミドに発現される。
ある実施態様において、複数コピーのＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに統合される。
ある実施態様において、スクアレンシンターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、少なくとも１個の他のＣ１１ヒドロキシラーゼ、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のＣＤＳおよび／または少なくとも１個のＥＰＨをコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列は、宿主細胞のゲノムに統合される。
ある実施態様において、宿主細胞はモグロールを産生する。
ある実施態様において、宿主細胞は、対照宿主細胞と比較して１.１倍多いモグロールを産生し、ここで、対照宿主細胞は野生型ＣＹＰ５４９１を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、宿主細胞により産生されない１以上のモグロール前駆体が実質的にない細胞培養培地で培養され得る。
ある実施態様において、宿主細胞は、モグロール／１１－オキソモグロールの２より大きい比をもたらすことができる。
本発明のさらなる態様は、モグロールを産生する方法を提供する。ある実施態様において、方法は、開示する宿主細胞の何れかの培養を含む。
ある実施態様において、宿主細胞は、スクアレン、２－３－オキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２－３,２２,２３－ジエポキシスクアレン、２４,２５－ジポキシ－ククルビタジエノールおよび２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノールから選択されるモグロール前駆体の存在下で培養される。
ある実施態様において、宿主細胞は、宿主細胞により産生されない１以上のモグロール前駆体が実質的にない培地で培養される。
本発明のさらなる態様は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質を含む宿主細胞であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質がＥＲＧ１１のシグナル配列およびＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインをコードする配列を含む、宿主細胞を提供する。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基３～５０４を含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、配列番号２８０に少なくとも９０％同一である配列を含む。
本発明のさらなる態様は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質であって、ここで、融合タンパク質が、(ａ)配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるシグナル配列およびＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインをコードする配列；または(ｂ)ＥＲＧ１１の最初の２５アミノ酸およびＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインをコードする配列を含むものを提供する。
本発明のさらなる態様は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素と(ａ)モグロールを産生する２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノール；(ｂ)１１－ヒドロキシククルビタジエノールを産生するククルビタジエノール；および／または(ｃ)１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールを産生する２４,２５－エポキシククルビタジエノールを接触させることを含むモグロールを産生する方法であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が配列番号２０８に少なくとも９０％同一であり、配列番号２０８に対して少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、方法を提供する。
ある実施態様において、野生型ＣＹＰ５４９１の配列(配列番号２０８)に比して、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)における残基Ｓ４９；Ｖ５７；Ｌ７６；Ａ８５；Ｄ１０７；Ｌ１０９；Ｆ１１２；Ｔ１１７；Ｗ１１９；Ｌ１２０；Ａ１４０；Ｆ１４７；Ｓ１５５；Ｈ１６０；Ｋ１８５；Ｌ２１０；Ｓ２１１；Ｌ２１２；Ａ２８２；Ｄ２９９；Ｖ３５０；Ｔ３５１；Ａ３５３；Ｌ３５４；Ｍ３７６；Ｉ４５８；および／またはＴ４７０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ４９に対応する残基にＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、ＭまたはＬ； 野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＶ５７に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ７６に対応する残基にＩまたはＶ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ８５に対応する残基にＳ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＤ１０７に対応する残基にＰまたはＲ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ１０９に対応する残基にＡ、Ｃ、Ｆ、ＷまたはＹ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＦ１１２に対応する残基にＴまたはＷ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ１１７に対応する残基にＧ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＷ１１９に対応する残基にＲ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ１２０に対応する残基にＨまたはＮ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ１４０に対応する残基にＰ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＦ１４７に対応する残基にＬ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ１５５に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＨ１６０に対応する残基にＥ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＫ１８５に対応する残基にＨ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ２１０に対応する残基にＳ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ２１１に対応する残基にＮ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ２１２に対応する残基にＦ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ２８２に対応する残基にＶ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＤ２９９に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＶ３５０に対応する残基にＦ、Ｉ、ＬまたはＭ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ３５１に対応する残基にＬまたはＭ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ３５３に対応する残基にＧ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ３５４に対応する残基にＶまたはＩ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＭ３７６に対応する残基にＡまたはＣ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＩ４５８に対応する残基にＰ；および／または野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ４７０に対応する残基にＥを含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素は精製タンパク質である。
本発明のさらなる態様は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質を含む宿主細胞であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質がＫＡＲ２、ＮＣＰ１、ＥＲＰ２、ＲＢＤ２、ＳＮＡ３、ＳＰＣ２、ＮＨＸ１、ＰＧＡ２、ＧＲＸ６、ＹＬＲ４１３Ｗ、ＹＪＬ０６２Ｗ、ＭＳＣ２、ＥＭＣ５、ＣＨＯ２、ＩＦＡ３８、ＳＵＲ２、ＩＰＴ１、ＹＥＴ３、ＹＰＬ１６２Ｃ、ＥＲＧ１１、ＳＲＰ１０２、ＧＵＰ１、ＣＢＲ１またはＹＨＲ１３８Ｃのシグナル配列；およびＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインをコードする配列を含む、宿主細胞を提供する。
本発明のさらなる態様は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質を含む宿主細胞であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０の何れかと少なくとも９０％同一である、宿主細胞を提供する。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０の何れかと少なくとも９８％同一である。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０の何れかと少なくとも９９％同一である。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０の何れかを含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼはＰＧＡ２｜ｄ２３－１２９＿ＣＹＰ５４９１－Ｔ３５１Ｍ(配列番号３０５)である。
本発明のさらなる態様は、開示する宿主細胞の何れかを培養することを含む、方法を提供する。
本発明の限定の各々は、種々の本発明の実施態様を含み得る。それ故に、要素の何れか一つまたは複数要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各態様に包含され得ると見込まれる。この発明は、以下に記載されまたは図面において説明される、構成の詳細および要素の配置にその適用は限定されない。本発明は、他の実施態様が可能であり、種々の方法で実施または実行されることが可能である。また、本明細書において使用される表現および用語は説明の目的のためであり、限定すると考慮されるべきではない。「含む」、「包含する」または「有する」、「含有する」、「関与する」およびその変形の使用は、その前に挙げられた項目およびその均等物ならびにさらなる項目を包含することを意味する。
添付する図面は、正確な比率であることは意図しない。図面は説明のためのみであり、本発明の実施可能性に必要なものではない。明確にする目的で、全ての図面に全ての要素がラベルされていない可能性がある。図面は次のとおりである。
図１Ａ～１Ｂは、モグロール生合成経路の推定概略図である。ＳＱＳはスクアレンシンターゼを示し、ＥＰＤはエポキシダーゼを示し、Ｐ４５０はＣ１１ヒドロキシラーゼを示し、ＥＰＨはエポキシドヒドロラーゼを示し、ＣＤＳはククルビタジエノールシンターゼを示す。
図２Ａ～２Ｃは、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの一般化構造；Ｃ１１ヒドロキシラーゼＣＹＰ５４９１に基づくＣ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質ライブラリーの開発；およびＣ１１ヒドロキシラーゼライブラリープラスミドのデザインを示す、概要を示す。図２Ａは、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの構造を示す。図２Ｂは、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質ライブラリーの開発を示す概要である。図２Ｃは、Ｐ４５０ライブラリープラスミド構造を示す概要である。
図３は、ＣＹＰ５４９１融合タンパク質およびＣＹＰ５４９１変異体スクリーニングのための宿主細胞の開発を示す。図３は、スクリーニング株ゲノムへの複数コピーの野生型ＣＹＰ５４９１の組込みがモグロール産生を促進し、１形質転換体、P450基本株－３は、残りより高い力価を示す株である。
図４Ａ～４Ｂは、モデル化ラノステロールの近位にあり、飽和変異誘発およびスクリーニングに付されたＣＹＰ５４９１の活性部位における残基を示す略図を示す。
図５Ａ～５Ｂは、野生型ＣＹＰ５４９１をコードする対照宿主細胞のモグロール産生に対するＣ１１ヒドロキシラーゼスクリーニングライブラリーのメンバーをコードする宿主細胞によるモグロールの産生を示すグラフを示す。図５Ａは、複数コピーの野生型ＣＹＰ５４９１をコードする対照株(ｔ４０１１７２)と比較した、スクリーニングライブラリーの全メンバーの結果を示す。図５Ｂは、図５Ａに示すグラフの一部の拡大図である。
図６は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼスクリーニングライブラリーからの７１ヒットの二次検証スクリーニングからのモグロール産生の結果を示すグラフである。一次スクリーニングからの結果も比較のために示す。ｙ軸は、複数コピーの野生型ＣＹＰ５４９１をコードする対照宿主細胞に対するモグロール産生の改善倍率を示す。
図７は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)(最も左に示す)と比較した、示すＣＹＰ５４９１変異体、シグナルペプチド－野生型ＣＹＰ５４９１融合タンパク質およびシグナルペプチド－ＣＹＰ５４９１変異体融合タンパク質を含む宿主細胞でのモグロール産生の改善倍率を示す、グラフを示す。
図８は、示す野生型ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ５４９１変異体、シグナルペプチド－野生型ＣＹＰ５４９１融合タンパク質およびシグナルペプチド－ＣＹＰ５４９１変異体融合タンパク質を含む宿主細胞の平均モグロール産生(mg／Ｌ)、平均オキソモグロール産生(mg／Ｌ)および平均モグロール／オキソモグロール比を示すグラフを示す。対照株の結果も示す。
詳細な記載
モグロシドは、例えば、飲料において、天然甘味料として広く使用されている。しかしながら、デノボ合成および天然源からのモグロシド抽出にはしばしば高い製造費と低収量が伴う。本出願は、モグロール(または１１,２４,２５－トリヒドロキシククルビタジエノール)、モグロシドおよびその前駆体を効率的に産生するよう操作された組み換え宿主細胞を記載する。方法は、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)酵素、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素、エポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)酵素、スクアレンエポキシダーゼ(ＳＱＥ)酵素またはこれらの組み合わせの異種発現を含む。本発明は、モグロール産生のための改善されたＣ１１ヒドロキシラーゼの同定を記載する。実施例１～２は、野生型Ｃ１１ヒドロキシラーゼＣＹＰ５４９１に比して、モグロール産生が改善されたＣ１１ヒドロキシラーゼの同定をもたらす、バリアントおよび融合タンパク質を含むＣ１１ヒドロキシラーゼのスクリーニングを記載する。本明細書に記載する酵素および組み換え宿主細胞を、モグロール、モグロシドおよびその前駆体の製造に使用できる。
モグロールおよびモグロシドの合成
図１Ａ～１Ｂは、推定されるモグロール合成経路を示す。経路における初期工程は、スクアレンから２,３－オキシドスクアレンへの変換を含む。図１Ａに示すとおり、２,３－オキシドスクアレンをまずククルビタジエノールに環化し、続いてエポキシ化して２４,２５－エポキシククルビタジエノールを形成しまたは２,３－オキシドスクアレンを２,３,２２,２３－ジオキシドスクアレンにエポキシ化し、次いで２４,２５－エポキシククルビタジエノールに環化する。次に、２４,２５－エポキシククルビタジエノールを、エポキシド加水分解に続く酸化、または酸化に続くエポキシドの加水分解により、モグロール(モグロシドのアグリコン)に変換し得る。図１Ｂに示すとおり、２,３－オキシドスクアレンをまずククルビタジエノールに環化し、次いでシトクロムＰ４５０ Ｃ１１ヒドロキシラーゼにより１１－ヒドロキシククルビタジエノールに変換する。次いで、シトクロムＰ４５０ Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、１１－ヒドロキシククルビタジエノールを１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールに変換し得る。１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールは、エポキシドヒドロラーゼによりモグロールに変換され得る。Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、シトクロムＰ４５０レダクターゼと共に働く(図１Ａ～１Ｂに示していない)。
モグロールは、Ｃ３、Ｃ１１、Ｃ２４およびＣ２５での酸素化により、他のククルビタントリテルペノイド類と区別され得る。モグロールの、例えばＣ３および／またはＣ２４のグリコシル化により、モグロシドが形成され得る。
モグロール前駆体は、スクアレン、２－３－オキシドスクアレン、２,３,２２,２３－ジオキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４,２５－エポキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノール、１１－オキソ－ククルビタジエノールおよび２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノールを含むが、これらに限定されない。用語「ジオキシドスクアレン」を使用して、２,３,２２,２３－ジエポキシスクアレンまたは２,３,２２,２３－ジオキシドスクアレンと言い得る。用語「２,３－エポキシスクアレン」は、用語「２－３－オキシドスクアレン」と相互交換可能に使用され得る。本明細書で使用する、モグロシド前駆体はモグロール前駆体、モグロールおよびモグロシドを含む。
モグロシドの例は、モグロシドＩ－Ａ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩＥ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドII－Ａ２(ＭIIＡ２)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIV、モグロシドIVａ、イソモグロシドIV、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドＶおよびモグロシドVIを含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、産生されるモグロシドは、Ｓｉａｍと称され得るシアメノシドＩである。ある実施態様において、産生されるモグロシドはＭIIIＥである。
他の実施態様において、モグロシドは式１
Figure 2022553065000002
 の化合物である。
ある実施態様において、本明細書に記載する方法は、ＵＳ２０１９／００７１７０５に開示の化合物１～２０を含み、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載され、引用により本明細書に包含される化合物の何れかを産生するのに使用され得る。ある実施態様において、本明細書に記載する方法は、ＵＳ２０１９／００７１７０５に開示の化合物１～２０のバリアントを含み、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載され、引用により本明細書に包含される化合物のバリアントの何れかを産生するのに使用され得る。例えば、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物における１以上のアルファ－グリコシル結合の、１以上のベータ－グリコシル結合への置換を含み得る。ある実施態様において、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物における１以上のベータ－グリコシル結合の、１以上のアルファ－グリコシル結合での置換を含む。ある実施態様において、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、上記式１の化合物である。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素
本発明のある態様は、例えば、モグロールの産生に有用であり得るＣ１１ヒドロキシラーゼを提供する。Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、Ｐ４５０酵素の一種である。本発明で使用される、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、化合物のＣ１１位置にヒドロキシル基を導入できる酵素をいう。ある実施態様において、化合物はモグロール前駆体である。ある実施態様において、化合物はモグロシドである。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、化合物のＣ１１ではない位置へのヒドロキシル基の導入も可能である。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、モグロール前駆体のＣ１１ヒドロキシル化を触媒できるＣ１１ヒドロキシラーゼである。ある実施態様において、モグロール前駆体は、２４,２５－エポキシククルビタジエノールまたは２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノールである。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールを産生できる。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、モグロールを産生できる。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、１１－オキソモグロールを産生できる。ある実施態様において、モグロール前駆体は１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノールである。ある実施態様において、モグロール前駆体は１１－オキソ－ククルビタジエノールである。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、ククルビタジエノールを基質として使用して、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノールを産生する。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノールを基質として使用して、１１－オキソククルビタジエノールを産生する。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、ククルビタジエノールを基質として使用して、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノールを産生し、次いで、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノールを１１－オキソククルビタジエノールに変換する。構造的に、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、一般に図２Ａに示す膜貫通ドメインおよび触媒ドメインを含む。本明細書で使用する「膜貫通ドメイン」は、タンパク質の膜貫通領域を包含するドメインをいう。本明細書で使用する「触媒ドメイン」は、活性部位を含む酵素の領域をいう。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの触媒ドメインは、ヘムに結合できる。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、小胞体(ＥＲ)に局在化する。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼの例は、ＣＹＰ５４９１である。野生型ＣＹＰ５４９１をコードするヌクレオチド配列の非限定的例は、
ATGTGGACTGTCGTGCTCGGTTTGGCGACGCTGTTTGTCGCCTACTACATCCATTGGATTAACAAATGGAGAGATTCCAAGTTCAACGGAGTTCTGCCGCCGGGCACCATGGGTTTGCCGCTCATCGGAGAAACGATTCAACTGAGTCGACCCAGTGACTCCCTCGACGTTCACCCTTTCATCCAGAAAAAAGTTGAAAGATACGGGCCGATCTTCAAAACATGTCTGGCCGGAAGGCCGGTGGTGGTGTCGGCGGACGCAGAGTTCAACAACTACATAATGCTGCAGGAAGGAAGAGCAGTGGAAATGTGGTATTTGGATACGCTCTCCAAATTTTTCGGCCTCGACACCGAGTGGCTCAAAGCTCTGGGCCTCATCCACAAGTACATCAGAAGCATTACTCTCAATCACTTCGGCGCCGAGGCCCTGCGGGAGAGATTTCTTCCTTTTATTGAAGCATCCTCCATGGAAGCCCTTCACTCCTGGTCTACTCAACCTAGCGTCGAAGTCAAAAATGCCTCCGCTCTCATGGTTTTTAGGACCTCGGTGAATAAGATGTTCGGTGAGGATGCGAAGAAGCTATCGGGAAATATCCCTGGGAAGTTCACGAAGCTTCTAGGAGGATTTCTCAGTTTACCACTGAATTTTCCCGGCACCACCTACCACAAATGCTTGAAGGATATGAAGGAAATCCAGAAGAAGCTAAGAGAGGTTGTAGACGATAGATTGGCTAATGTGGGCCCTGATGTGGAAGATTTCTTGGGGCAAGCCCTTAAAGATAAGGAATCAGAGAAGTTCATTTCAGAGGAGTTCATCATCCAACTGTTGTTTTCTATCAGTTTTGCTAGCTTTGAGTCCATCTCCACCACTCTTACTTTGATTCTCAAGCTCCTTGATGAACACCCAGAAGTAGTGAAAGAGTTGGAAGCTGAACACGAGGCGATTCGAAAAGCTAGAGCAGATCCAGATGGACCAATTACTTGGGAAGAATACAAATCCATGACTTTTACATTACAAGTCATCAATGAAACCCTAAGGTTGGGGAGTGTCACACCTGCCTTGTTGAGGAAAACAGTTAAAGATCTTCAAGTAAAAGGATACATAATCCCGGAAGGATGGACAATAATGCTTGTCACCGCTTCACGTCACAGAGATCCAAAAGTCTATAAGGACCCTCATATCTTCAATCCATGGCGTTGGAAGGACTTGGACTCAATTACCATCCAAAAGAACTTCATGCCTTTTGGGGGAGGCTTAAGGCATTGTGCTGGTGCTGAGTACTCTAAAGTCTACTTGTGCACCTTCTTGCACATCCTCTGTACCAAATACCGATGGACCAAACTTGGGGGAGGAAGGATTGCAAGAGCTCATATATTGAGTTTTGAAGATGGGTTACATGTGAAGTTCACGCCAAAAGAATAA(配列番号２０７)
である。
野生型ＣＹＰ５４９１のアミノ酸配列は、
Figure 2022553065000003
 である。
上記配列番号２０８において、下線残基２～２８は、野生型ＣＹＰ５４９１の膜貫通ドメインに対応する。太字で示す残基２９～４７３は、ＣＹＰ５４９１の触媒ドメインに対応する。
当業者は、対照配列として野生型ＣＹＰ５４９１アミノ酸配列を使用して、他のＣ１１ヒドロキシラーゼの膜貫通ドメインおよび／または触媒ドメインを同定できる。例えば、当業者は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの配列と野生型ＣＹＰ５４９１の配列を整列し、野生型ＣＹＰ５４９１配列における関連ドメインに対応するＣ１１ヒドロキシラーゼにおける残基を同定することにより、他のＣ１１ヒドロキシラーゼの膜貫通ドメインおよび／または触媒ドメインを同定できる。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼはＣＹＰ５４９１である。ＣＹＰ５４９１は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００を超える残基に変異を有し得る。ある実施態様において、変異はアミノ酸置換である。ある実施態様において、変異は、図４Ａ～４Ｂに示すＣＹＰ５４９１の残基４８、４９、５７、７６、１０３～１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１８～１２０、２０９～２１２、２１５、２７７、２７８、２８１、２８２、２８５、２８６、３５０～３５５、３７６および／または４５７～４５９から選択される１以上の残基に位置する。
ある実施態様において、１以上の変異は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの基質結合ドメインに対応する領域に位置する。いくつかの例において、１以上の変異は、ヘム基に結合するＣ１１ヒドロキシラーゼにおける構造的ループに位置する。ヘム基に結合するループは、配列番号２０８における残基３５０～３５５に対応するアミノ酸残基を含み得る。いくつかの例において、配列番号２０８における残基２８１、２８２、２８５、２８６および３５０～３５５に対応する１以上の残基が変異される。いくつかの例において、変異はアミノ酸置換である。いくつかの例において、変異は欠失である。いくつかの例において、変異は挿入である。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素をコードする配列は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ４９；Ｖ５７；Ｌ７６；Ａ８５；Ｄ１０７；Ｌ１０９；Ｆ１１２；Ｔ１１７；Ｗ１１９；Ｌ１２０；Ａ１４０；Ｆ１４７；Ｓ１５５；Ｈ１６０；Ｋ１８５；Ｌ２１０；Ｓ２１１；Ｌ２１２；Ａ２８２；Ｄ２９９；Ｖ３５０；Ｔ３５１；Ａ３５３；Ｌ３５４；Ｍ３７６；Ｉ４５８；および／またはＴ４７０に対応する残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素をコードする配列は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ４９に対応する残基にＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、ＭまたはＬ； 野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＶ５７に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ７６に対応する残基にＩまたはＶ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ８５に対応する残基にＳ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＤ１０７に対応する残基にＰまたはＲ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ１０９に対応する残基にＡ、Ｃ、Ｆ、ＷまたはＹ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＦ１１２に対応する残基にＴまたはＷ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ１１７に対応する残基にＧ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＷ１１９に対応する残基にＲ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ１２０に対応する残基にＨまたはＮ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ１４０に対応する残基にＰ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＦ１４７に対応する残基にＬ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ１５５に対応する残基にＡ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＨ１６０に対応する残基にＥ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＫ１８５に対応する残基にＨ;野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ２１０に対応する残基にＳ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ２１１に対応する残基にＮ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ２１２に対応する残基にＦ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ２８２に対応する残基にＶ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＤ２９９に対応する残基にＡに野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＶ３５０に対応する残基にＦ、Ｉ、ＬまたはＭ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ３５１に対応する残基にＬまたはＭ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ３５３に対応する残基にＧ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ３５４に対応する残基にＶまたはＩに野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＭ３７６に対応する残基にＡまたはＣ；野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＩ４５８に対応する残基にＰ；および／または野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ４７０に対応する残基にＥを含む。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼの膜挿入は、Ｎ末端近くに位置する内部非開裂シグナルアンカー配列により指示され得る。一般に、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、ＥＲ膜でＮ内腔－Ｃサイトゾル配向を有し、それにより、シグナル－アンカー配列は、Ｎ末端が内腔に面して、ＥＲ膜に挿入される。Ｃ１１ヒドロキシラーゼのトポロジーは、内部疎水性シグナル－アンカー配列および隣接親水性残基両者により決定され得る。何らかの特定の理論に拘束されないが、内部疎水性シグナル－アンカー配列(膜貫通ドメイン)は、ＥＲシグナル配列、輸送停止配列および／または膜－アンカー配列として機能し得る。Ｃ１１ヒドロキシラーゼの膜配向は、少なくとも一部、内部シグナル－アンカー配列に隣接する親水性アミノ酸に由来し得る。いくつかの例において、最大正味荷電を担持する隣接セグメントが膜の細胞質面に残る。内部シグナル－アンカー配列を有するタンパク質の膜配向は、少なくとも一部、内部疎水性セグメントの長さおよびアミノ酸組成によっても影響を受け得る。例えば、いくつかの例において、長疎水性セグメント(＞２０残基)を有するタンパク質はＮ内腔－Ｃサイトゾル配向を採用する傾向にあり、逆の配向が、いくつかの例において、短疎水性セグメントを有するタンパク質により好まである。
何らかの特定の理論に拘束されないが、植物Ｃ１１ヒドロキシラーゼのＮ末端は、いくつかの例において、発生期ポリペプチドの正確な係留の指示に関与し得る。出芽酵母(S. cerevisiae)を含む他の宿主細胞において、しかしながら、いくつかの例において、植物Ｃ１１ヒドロキシラーゼのＮ末端は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼがＥＲを標的とするのに十分ではないかもしれない。
本明細書に開示するとおり、酵母細胞を含む宿主細胞における異種Ｃ１１ヒドロキシラーゼの活性は、天然Ｎ末端配列を、正確な折り畳みおよび係留を促進するための他のＣ１１ヒドロキシラーゼまたはＥＲ－膜結合タンパク質からの配列で置き換えることにより改善され得る。
ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、「Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合体」である。用語「Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合体」は、本出願で用語「Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質」と相互交換可能に使用され、他の配列に融合したＣ１１ヒドロキシラーゼまたはその一部をいう。Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合体の非限定的配置は、図２Ｂに示す。例えば、宿主細胞で内因性に発現されてもされなくてもよいＥＲ膜タンパク質のＮ末端領域を、目的のＣ１１ヒドロキシラーゼタンパク質の一部に融合し得る。ある実施態様において、ＥＲ膜タンパク質の膜貫通ドメインにＮ末端であるアミノ酸残基を含む領域を、膜貫通ドメインおよび／またはＣ１１ヒドロキシラーゼタンパク質のＣ末端ドメインに融合し得る。ある実施態様において、膜貫通ドメインにＮ末端であるアミノ酸残基を含む領域およびＥＲ膜タンパク質の膜貫通ドメインを、目的のＣ１１ヒドロキシラーゼの触媒ドメインタンパク質と融合する。融合タンパク質の文脈での用語「膜貫通ドメイン」および「触媒ドメイン」は、対照タンパク質の膜貫通ドメインまたは触媒ドメイン全体または対照タンパク質の膜貫通ドメインまたは触媒ドメインの一部もしくはフラグメントをいうことは理解される。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼタンパク質の一部および他のタンパク質からのシグナルペプチドまたは合成シグナルペプチドを含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２～２８を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基３～２８を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２９～４７３を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２～４７３を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基３～４７３を含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２～２８に対応するが、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２～２８に対応するアミノ酸に少なくとも１個の変異を含む、配列を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基３～２８に対応するが、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基３～２８に対応するアミノ酸に少なくとも１個の変異を含む、配列を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２９～４７３に対応するが、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２９～４７３に対応するアミノ酸に少なくとも１個の変異を含む、配列を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２～４７３に対応するが、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２９～４７３に対応するアミノ酸に少なくとも１個の変異を含む、配列を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質は、は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基３～４７３に対応するが、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２９～４７３に対応するアミノ酸に少なくとも１個の変異を含む、配列を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合体は、野生型ＣＹＰ５４９１の残基２９～４７３に対応する配列を含み、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２９～４７３に対応するアミノ酸に１変異含む。ある実施態様において、変異はアミノ酸置換、欠失または挿入である。
いくつかの例において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００を超える残基に変異を有する配列を含む。ある実施態様において、変異はアミノ酸置換、欠失または挿入である。ある実施態様において、変異は、ＣＹＰ５４９１の残基４８、４９、５７、７６、１０３～１０７、１０９、１１０、１１２、１１３、１１８～１２０、２０９～２１２、２１５、２７７、２７８、２８１、２８２、２８５、２８６、３５０～３５５、３７６および／または４５７～４５９から選択される１以上の残基に位置する。
シグナルペプチド
本明細書で使用する「シグナルペプチド」または「シグナル配列」は、タンパク質のターゲティングを促進する局在化シグナルをいう。例えば、真核生物および原核生物における共翻訳経路において、シグナル認識粒子(ＳＲＰ)は、リボソームにより翻訳され、リボソーム発生期ポリペプチドを膜(例えば、原形質膜または小胞体膜)に存在するＳＲＰ受容体に向ける、タンパク質のシグナルペプチドに結合する。ある実施態様において、ＳＲＰにより認識されるシグナルペプチドを、ＳＲＰ依存性シグナル配列と称する。ある実施態様において、シグナルペプチドは、アルファらせん構造を採用する。ある実施態様において、シグナルペプチドは５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０または６０～７０アミノ酸長である。ある実施態様において、シグナル配列は５～８０アミノ酸長である。ある実施態様において、シグナルペプチドは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０アミノ酸長である。ある実施態様において、シグナルペプチドは、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０または６０～７０疎水性アミノ酸を含む。ある実施態様において、シグナル配列は、５～８０疎水性アミノ酸長を含む。ある実施態様において、シグナルペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０疎水性アミノ酸を含む。疎水性アミノ酸の非限定的例は、アラニン(Ａｌａ)、バリン(Ｖａｌ)、ロイシン(Ｌｅｕ)、イソロイシン(Ｉｌｅ)、フェニルアラニン(Ｐｈｅ)、メチオニン(Ｍｅｔ)、チロシン(Ｔｙｒ)およびトリプトファン(Ｔｒｐ)を含む。いくつかの例において、シグナルペプチドは、ＥＲ局在化シグナルである。ある実施態様において、シグナルペプチドは、輸送停止配列としても機能する。ある実施態様において、シグナルペプチドは膜－アンカー配列としても機能する。
本明細書で使用する「ＳＲＰ依存性タンパク質」は、ＳＲＰおよび膜に向けるためのＳＲＰ受容体に依存するタンパク質である。いくつかの例において、膜は小胞体(ＥＲ)膜である。出芽酵母(S. cerevisiae)からのＳＲＰ依存性タンパク質の非限定的例は、ＡＩＭ２０、ＡＬＧ１、ＡＬＧ５、ＡＮＰ１、ＡＵＲ１、ＢＰＴ１、ＣＡＸ４、ＣＢＲ１、ＣＤＣ５０、ＣＨＯ２、ＣＰＴ１、ＣＵＥ４、ＣＷＨ４３、ＤＡＰ２、ＤＵＲ３、ＥＲＤ２、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ２４、ＥＲＧ２５、ＥＲＧ４、ＥＲＧ５、ＥＲＰ２、ＥＲＰ４、ＥＲＶ４１、ＦＥＴ３、ＦＴＨ１、ＦＴＲ１、ＧＡＡ１、ＧＤＡ１、ＧＥＴ１、ＧＰＩ１３、ＧＰＩ１４、ＧＰＩ１７、ＧＰＩ１９、ＧＰＴ２、ＧＲＸ６、ＧＵＰ１、ＨＲＤ１、ＨＸＴ２、ＨＸＴ３、ＩＦＡ３８、ＩＰＴ１、ＫＡＲ２、ＫＲＥ２７、ＫＴＲ６、ＬＡＳ２１、ＭＡＭ３、ＭＣＨ１、ＭＥＰ１、ＭＥＰ２、ＭＥＰ３、ＭＮＮ１１、ＭＳＣ２、ＭＳＣ７、ＮＣＰ１、ＮＤＣ１、ＮＨＸ１、ＮＮＦ２、ＯＣＨ１、ＯＳＴ４、ＰＥＸ３、ＰＧＡ２、ＰＧＡ３、ＰＨＯ８、ＰＨＯ８８、ＰＨＳ１、ＰＩＮ２、ＰＫＲ１、ＰＭＴ１、ＰＯＭ３３、ＲＢＤ２、ＲＴＮ１、ＲＴＮ２、ＳＭＦ３、ＳＮＡ３、ＳＮＡ４、ＳＮＬ１、ＳＰＣ１、ＳＰＣ２、ＳＲＰ１０２、ＳＳＨ１、ＳＴＥ１４、ＳＴＥ６、ＳＵＲ１、ＳＵＲ２、ＴＭＮ３、ＴＭＳ１、ＴＳＣ３、ＴＶＰ１５、ＴＹＷ１、ＶＡＮ１、ＶＣＸ１、ＶＭＡ１６、ＶＭＡ２１、ＶＭＡ３、ＶＰＳ６８、ＶＲＧ４、ＶＴＣ１、ＹＡＲ０２８Ｗ、ＹＢＲ２８７Ｗ、ＹＢＴ１、ＹＣＦ１、ＹＤＬ１２１Ｃ、ＹＤＲ３０７Ｗ、ＹＥＲ０５３Ｃ－Ａ、ＹＥＴ１、ＹＥＴ３、ＹＨＲ０４５Ｗ、ＹＨＲ１３８Ｃ、ＹＫＬ０６３Ｃ、ＹＬＲ０５０Ｃ、ＹＬＲ４１３Ｗ、ＹＭＬ０１８Ｃ、ＹＭＲ１３４Ｗ、ＹＭＲ２２１Ｃ、ＹＮＬ１４６Ｗ、ＹＯＬ０１９Ｗ、ＹＯＰ１、ＹＰＬ１６２Ｃ、ＹＰＲ０９１Ｃ、ＹＲＯ２、ＺＲＣ１およびＺＲＴ２を含む。表１は、ＳＲＰ依存性タンパク質の非限定的例からのシグナルペプチドの開始および終了アミノ酸位置を示す。
Figure 2022553065000004
シグナルペプチド配列の非限定的例を配列番号２０９～２３２に提供する。Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合は、配列番号２０９～２３２から選択されるシグナルペプチド配列(表４)、本明細書に開示するシグナルペプチド配列または表１に列記するシグナルペプチド配列に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(間の全数値を含む)であるシグナルペプチド配列を含み得る。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合は、配列番号２０９～２３２から選択されるシグナルペプチド配列(表４)；表１に列記するシグナルペプチド配列；または本明細書に開示する何れかのシグナルペプチド配列に比して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２アミノ酸置換、欠失または挿入を含むシグナルペプチド配列を含み得る。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合は、配列番号２０９～２３２から選択されるシグナルペプチド配列(表４)；表１に列記するシグナルペプチド配列；または本明細書に開示する何れかのシグナルペプチド配列に比して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２アミノ酸以下の置換、欠失または挿入を含む、シグナルペプチド配列を含み得る。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合は、配列番号２０９～２３２から選択されるシグナルペプチド配列(表４)；表１に列記するシグナルペプチド配列；または本明細書に開示する何れかのシグナルペプチド配列に比して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１または６２アミノ酸置換、欠失または挿入を含むシグナルペプチド配列を含む。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合は、配列番号２０９～２３２から選択されるシグナルペプチド配列(表４)；表１に列記するシグナルペプチド配列；または本明細書に開示する何れかのシグナルペプチド配列に比して１アミノ酸置換、欠失または挿入を含むシグナルペプチド配列を含む。
本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼまたはＣ１１ヒドロキシラーゼ融合体は、表４、５または７における配列または本明細書に開示する何れかのＣ１１ヒドロキシラーゼまたはＣ１１ヒドロキシラーゼ融合体または配列番号１１３～１１４、１２９～１３０または２５７～３１６から選択される配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(間の全数値を含む)である配列を含み得る。
本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼまたはＣ１１ヒドロキシラーゼ融合体は、表３に開示する１以上の点変異を含み得る。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合は、ＥＲＧ１１からのシグナルペプチドを含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合体は、ＥＲＧ１１からの最初の２５アミノ酸残基および野生型ＣＹＰ５４９１からの残基３～４７３を含む。このＥＲＧ１１ Ｎ末端－ＣＹＰ５４９１融合体のアミノ酸配列は、配列番号２８０として提供する。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼまたはＣ１１ヒドロキシラーゼ融合は、Ｔ３５１Ｍ点変異を含む。
ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、モグロール前駆体(例えば、ククルビタジエノール、２４,２５－ジヒドロキシ－ククルビタジエノールおよび／または２４,２５－エポキシ－ククルビタジエノール(または２４,２５－エポキシククルビタジエノールまたは２４,２５－エポキシククルビタジエノール))の酸化が可能である。ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、モグロールの形成を触媒する。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、ククルビタジエノールを基質として使用して、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノールを産生する。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノールを基質として使用して、モグロールを産生する。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは２４,２５－エポキシククルビタジエノールを使用して、１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールを産生する。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼの比活性などの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により決定され得ることは認識される。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの活性(例えば、比活性)は、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体または産生されるモグロールの濃度として測定され得る。ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、少なくとも０.０００１～０.００１μmol／分／mg、少なくとも０.００１～０.０１μmol／分／mg、少なくとも０.０１～０.１μmol／分／mgまたは少なくとも０.１～１μmol／分／mg(各数値間の全数値を含む)の活性(例えば、比活性)を有する。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの比活性などの活性は、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも１００００倍(各数値間の全数値を含む))大きい。ある実施態様において、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼは野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)である。
何らかの特定の理論に拘束されないが、ある実施態様において、ＣＹＰ５４９１の機能は、ＣＹＰ５４９１が副産物として１１－オキソモグロール(または１１－オキソ－モグロール)を産生するため、モグロール生合成経路の律速段階であり得る。ある実施態様において、野生型ＣＹＰ５４９１の活性部位周囲のアミノ酸の１以上の変異は、モグロールの産生を増加させ得る。ある実施態様において、野生型ＣＹＰ５４９１の活性部位周囲の１以上のアミノ酸の変異は、モグロール対オキソモグロール比を増加させ得る。
ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、少なくとも１.１、少なくとも１.２、少なくとも１.３、少なくとも１.４、少なくとも１.５、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも１００(各数値間の全数値を含む)のモグロール対オキソモグロール比を生ずる。
ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼと比較して、モグロールを増加させる。ある実施態様において、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼは野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)である。
ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼと比較して、少なくとも１.１倍、少なくとも１.２倍、少なくとも１.３倍、少なくとも１.４倍、少なくとも１.５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、少なくとも２５倍、少なくとも２６倍、少なくとも２７倍、少なくとも２８倍、少なくとも２９倍、少なくとも３０倍、少なくとも３１倍、少なくとも３２倍、少なくとも３３倍、少なくとも３４倍、少なくとも３５倍、少なくとも３６倍、少なくとも３７倍、少なくとも３８倍、少なくとも３９倍、少なくとも４０倍、少なくとも４１倍、少なくとも４２倍、少なくとも４３倍、少なくとも４４倍、少なくとも４５倍、少なくとも４６倍、少なくとも４７倍、少なくとも４８倍、少なくとも４９倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、少なくとも９５倍または少なくとも１００倍またはそれ以上のモグロールを産生する(各数値間の全数値を含む)。ある実施態様において、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼは野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)である。
シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素
本発明の態様は、例えば、モグロールの産生に有用であり得る、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素を提供する。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、ＮＡＤＰＨ：フェリヘモタンパク質オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：ヘムタンパク質オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０オキシドレダクターゼ、Ｐ４５０レダクターゼ、ＰＯＲ、ＣＰＲおよびＣＹＰＯＲとも称される。これらのレダクターゼは、ＮＡＤＰＨからＣ１１ヒドロキシラーゼへの電子移動を触媒することにより、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ活性を助長できる。
本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、表６または表７におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼ配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)または本明細書に開示するもしくは当分野で知られる何れかのＰ４５０レダクターゼ配列または配列番号１１５、１１６、１３１、１３２、３９８～３９９および４０７～４０８から選択される配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(間の全数値を含む)である配列を含み得る。
ある実施態様において、本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、モグロール前駆体(例えば、ククルビタジエノール、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、２４,２５－ジヒドロキシ－ククルビタジエノールおよび／または２４,２５－エポキシ－ククルビタジエノール)の酸化を促進できる。ある実施態様において、シトクロム本発明のＰ４５０レダクターゼは、モグロール前駆体またはモグロールの形成を触媒する。
シトクロムＰ４５０レダクターゼの比活性などの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により決定され得ることは認識される。ある実施態様において、このような活性は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ存在下、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体または産生されるモグロールの濃度として測定され得る。ある実施態様において、本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、少なくとも０.０００１～０.００１μmol／分／mg、少なくとも０.００１～０.０１μmol／分／mg、少なくとも０.０１～０.１μmol／分／mgまたは少なくとも０.１～１μmol／分／mg(各数値間の全数値を含む)の比活性などの活性を有する。
ある実施態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼの比活性などの活性は、対照シトクロムＰ４５０レダクターゼより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも１００００倍(各数値間の全数値を含む))大きい。
エポキシドヒドロラーゼ酵素(ＥＰＨ)
本発明の態様は、例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールから２４－２５ジヒドロキシ－ククルビタジエノールへの変換または１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールからモグロールへの変換に有用であり得る、エポキシドヒドロラーゼ酵素(ＥＰＨ)を提供する。ＥＰＨは、エポキシドを２個のヒドロキシルに変換できる。
本発明のＥＰＨは、表６または表７におけるＥＰＨ配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)または本明細書に開示されるもしくは当分野で知られるＥＰＨ配列の何れかまたは配列番号１１７～１２５、１３３～１４１、４０１～４０２および４１０～４１１から選択される配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(間の全数値を含む)である配列を含み得る。
ある実施態様において、組み換え本発明のＥＰＨは、ククルビタジエノール化合物におけるエポキシドの加水分解(例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールにおけるエポキシドの加水分解)を促進できる。ある実施態様において、本発明のＥＰＨは、モグロール前駆体(例えば、２４－２５ジヒドロキシ－ククルビタジエノール)の形成を触媒する。
ＥＰＨの比活性などの活性、当業者に知られるあらゆる手段により決定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＥＰＨの比活性などの活性は、モグロール前駆体(例えば、２４－２５－ジヒドロキシ－ククルビタジエノール)の濃度または産生されるモグロールとして測定され得る。ある実施態様において、２４,２５－ジヒドロキシ－ククルビタジエノールを含むモグロール前駆体の濃度を、絶対力価ではなく、例えば、クロマトグラムの正規化ピーク面積の点で測定する。ある実施態様において、正規化ピーク面積の使用は、モグロール前駆体の分析標品がないとき、有用である。
スクアレンエポキシダーゼ酵素(ＳＱＥ)
本発明の態様は、スクアレン(例えば、スクアレンまたは２－３－オキシドスクアレン)を酸化してスクアレンエポキシド(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３,２２－２３－ジエポキシスクアレン)を産生する、ＳＱＥを提供する。ＳＱＥは、スクアレンモノオキシゲナーゼとも称され得る。
本発明のＳＱＥは、表６または表７におけるＳＱＥ配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)または本明細書に開示されるもしくは当分野で知られるＳＱＥの何れかまたは配列番号１２６～１２８、１４２～１４４、４０４または４１３から選択される配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一(間の全数値を含む)である配列を含み得る。
ある実施態様において、本発明の組み換えＳＱＥは、スクアレン化合物のエポキシド形成を促進できる(例えば、スクアレンまたは２,３－オキシドスクアレンのエポキシ化)。ある実施態様において、本発明のＳＱＥは、モグロール前駆体(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３,２２－２３－ジエポキシスクアレン)または２４,２５－ジエポキシ－ククルビタジエノール)の形成を測定できる。
組み換えＳＱＥの活性は、対照酵素より改善された、正規化クロマトグラムピーク面積により、２－３,２２－２３－ジエポキシククルビタジエノールおよび／またはジヒドロキシククルビタジエノールの増加レベルの決定により、測定され得る。ある実施態様において、対照酵素は、表６におけるＥＲＧ１(配列番号４１３)である。ある実施態様において、組み換えＳＱＥの比活性などの活性は、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３,２２－２３－ジエポキシスクアレンまたは２４,２５－ジエポキシ－ククルビタジエノール)の濃度として測定され得る。
特定の理論に拘束されないが、宿主細胞におけるＳＱＥの発現は、モグロール前駆体(例えば、エポキシ－ククルビタジエノール、スクアレン－ジオキシドおよび２,３－オキシドスクアレン)の産生を増加させ得る。
ある実施態様において、ＳＱＥの発現に付随する毒性の可能性は、軽減される。非限定的例として、毒性を低減する方法は、ＥＰＨおよび／またはＣ１１ヒドロキシラーゼを含む下流酵素とシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現の増加を含み得る。特定の理論に拘束されないが、ＥＰＨおよび／またはＣ１１ヒドロキシラーゼとシトクロムＰ４５０レダクターゼの発現は、エポキシド分子のジヒドロキシククルビタジエノールまたはモグロールへの変換の促進により、毒性を低減し得る。ある実施態様において、毒性低減は、１以上のＵＧＴ発現を含む。特定の理論に拘束されないが、１以上のＵＧＴの発現は、グリコシル化化合物産生の増加により、毒性を軽減し得る。
ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素
本発明の態様は、例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールなどのククルビタジエノール化合物の産生に有用であり得る、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素を提供する。ＣＤＳは、オキシドスクアレン(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレン)から２４－２５－エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールなどのククルビタジエノール化合物の形成を触媒できる。
ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号７４の１２３位に対応する残基にロイシンを有し、これは、引用により全体として本明細書に包含させる、Takase et al. Org. Biomol. Chem., 2015,13, 7331-7336に記載のとおり、他のオキシドスクアレンシクラーゼと区別する。
本発明のＣＤＳは、表８における核酸またはアミノ酸配列、配列番号１～８０から選択される配列または本明細書に開示するもしくは当分野で知られる何れかの他のＣＤＳ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一(間の全数値を含む)である配列を含み得る。
ある実施態様において、ＣＤＳ酵素はAquAagaCDS16(配列番号４３)、CSPI06G07180.1(配列番号５２)またはA0A1S3CBF6(配列番号４９)に対応する。
ある実施態様において、ＣＤＳ酵素をコードする核酸配列は、出芽酵母(S. cerevisiae)を含む特定の宿主細胞における発現のために再コード化され得る。ある実施態様において、ＣＤＳ酵素をコードする再コード化核酸配列は、配列番号３４に対応する。
ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、基質としてオキシドスクアレン(例えば、２,３－オキシドスクアレンまたは２,３,２２,２３－ジエポキシスクアレン)を使用できる。ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、ククルビタジエノール化合物(例えば、２４－２５－エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール)を産生できる。ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、オキシドスクアレン(例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２,３；２２,２３－ジエポキシスクアレン)からククルビタジエノール化合物(例えば、２４－２５－エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール)の形成を触媒する。
ＣＤＳの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＣＤＳの活性は、産生されたククルビタジエノールの正規化ピーク面積として測定され得る。ある実施態様において、この活性は、任意単位で測定される。ある実施態様において、本発明のＣＤＳの比活性などの活性は、対照ＣＤＳより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍(各数値間の全数値を含む)大きい。
当業者は、タンパク質に付随する構造的および／または機能的情報に基づき、ＣＤＳ酵素としてタンパク質を特徴づけできることは認識される。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、基質としてオキシドスクアレン(例えば、２,３－オキシドスクアレンまたは２,３,２２,２３－ジエポキシスクアレン)を使用して、ククルビタジエノール化合物(例えば、２４,２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール)を産生する能力などの機能に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。ある実施態様において、タンパク質は、少なくとも一部、配列番号７４の１２３位に対応する位置のロイシン残基の存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。
ある実施態様において、ククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)酵素をコードする異種遺伝子を発現する組み換え宿主細胞は、異種遺伝子を発現しない同じ組み換え宿主細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％多くククルビタジエノール化合物を産生する。
他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質と既知ＣＤＳ酵素のパーセント同一性に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、本明細書に記載のＣＤＳ配列の何れかまたは他のＣＤＳ酵素の何れかの配列と、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一(各数値間の全数値を含む)であり得る。他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質における、ＣＤＳ酵素と関連する１以上のドメインの存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、当分野で知られるＣＤＳ酵素の基質溝および／または活性部位腔特徴の存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけられる。ある実施態様において、活性部位腔は、この溝へのゲートとして作用し、該腔から水を排除することを助ける、残基を含む。ある実施態様において、活性部位は、基質のエポキシドを開環するプロトンドナーとして、そして環化過程を触媒する残基を含む。
他の実施態様において、タンパク質は、既知ＣＤＳ酵素の三次元構造に対応する、タンパク質の三次元構造の比較に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。ＣＤＳ酵素は合成タンパク質であり得ることが認識される。
ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ(ＵＧＴ)酵素
本発明の態様は、例えば、モグロシド(例えば、モグロシドＩ－Ａ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩ－Ｅ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドII－Ａ２(ＭIIＡ２)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドIV、モグロシドIVａ、イソモグロシドIV、モグロシドＶまたはモグロシドVI)の産生に有用であり得る、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素(ＵＧＴ)を提供する。
本明細書で使用するＵＧＴは、ＵＴＰ－糖からのグリコシル基の化合物(例えば、モグロシドまたはモグロール)への付加を触媒できる、酵素である。構造的に、ＵＧＴはしばしばＵＤＰＧＴ(Prosite: PS00375)ドメインおよび触媒ダイアドを含む。非限定的例として、当業者は、ＵＧＴ配列をＵＧＴ９４－２８９－１(ラカンカであるシライチア・グロスベノリイからの野生型ＵＧＴ配列)とアラインし、該ＵＧＴにおけるＵＧＴ９４－２８９－１のヒスチジン２１(Ｈ２１)およびアスパラギン酸１２２(Ｄ１２２)に対応する２残基を同定することにより、該ＵＧＴにおける触媒ダイアド(catalytic dyad)を同定し得る。
ＵＧＴ９４－２８９－１のアミノ酸配列は次のとおりである。
MDAQRGHTTTILMFPWLGYGHLSAFLELAKSLSRRNFHIYFCSTSVNLDAIKPKLPSSSSSDSIQLVELCLPSSPDQLPPHLHTTNALPPHLMPTLHQAFSMAAQHFAAILHTLAPHLLIYDSFQPWAPQLASSLNIPAINFNTTGASVLTRMLHATHYPSSKFPISEFVLHDYWKAMYSAAGGAVTKKDHKIGETLANCLHASCSVILINSFRELEEKYMDYLSVLLNKKVVPVGPLVYEPNQDGEDEGYSSIKNWLDKKEPSSTVFVSFGSEYFPSKEEMEEIAHGLEASEVHFIWVVRFPQGDNTSAIEDALPKGFLERVGERGMVVKGWAPQAKILKHWSTGGFVSHCGWNSVMESMMFGVPIIGVPMHLDQPFNAGLAEEAGVGVEAKRDPDGKIQRDEVAKLIKEVVVEKTREDVRKKAREMSEILRSKGEEKMDEMVAAISLFLKI(配列番号１０９)。
ＵＧＴ９４－２８９－１をコードする核酸配列の非限定的例は次のとおりである。
ATGGACGCGCAACGCGGACATACGACTACCATCCTGATGTTTCCGTGGTTGGGGTACGGCCACCTTAGTGCATTCCTCGAATTAGCCAAGAGCTTGTCGCGTAGGAACTTTCATATTTATTTCTGTTCCACATCTGTCAATTTAGATGCTATAAAACCCAAACTACCATCATCTTCAAGTTCCGATTCTATTCAGCTTGTAGAGTTATGCTTGCCTTCCTCGCCAGACCAACTACCCCCACACCTGCATACAACTAATGCTCTACCTCCACATCTAATGCCTACCCTGCACCAGGCCTTTTCAATGGCAGCTCAACATTTTGCAGCTATATTACATACTTTAGCACCGCACTTGTTAATCTATGATTCGTTCCAGCCTTGGGCGCCACAATTGGCCAGCTCTCTTAACATTCCTGCTATTAATTTTAATACCACGGGTGCCAGTGTGCTAACAAGAATGTTACACGCGACTCATTACCCATCTTCAAAGTTCCCAATCTCCGAATTTGTTTTACATGATTATTGGAAAGCAATGTATTCAGCAGCTGGTGGTGCTGTTACAAAAAAGGACCATAAAATAGGAGAAACCTTGGCAAACTGTTTACACGCTTCTTGCTCGGTAATTCTGATCAATTCATTCAGAGAGTTGGAAGAAAAATACATGGATTACTTGTCTGTCTTACTAAACAAGAAAGTTGTGCCCGTGGGTCCGCTTGTTTATGAGCCAAACCAAGATGGCGAAGACGAAGGTTATAGTTCGATAAAGAATTGGCTCGATAAAAAGGAGCCCTCCTCAACTGTCTTTGTTTCCTTCGGGTCCGAATATTTTCCGTCCAAAGAAGAAATGGAAGAAATTGCCCATGGCTTGGAGGCTAGCGAGGTACACTTTATTTGGGTCGTTAGATTCCCACAAGGAGACAATACTTCTGCAATTGAAGATGCCCTTCCTAAGGGTTTTCTTGAGCGAGTGGGCGAACGTGGAATGGTGGTTAAGGGTTGGGCTCCTCAGGCCAAAATTTTGAAACATTGGAGCACAGGCGGTTTCGTAAGTCATTGTGGATGGAATAGTGTTATGGAGAGCATGATGTTTGGTGTACCCATAATAGGTGTTCCGATGCATTTAGATCAACCATTTAATGCAGGGCTCGCGGAAGAAGCAGGAGTAGGGGTAGAGGCTAAAAGGGACCCTGATGGTAAGATACAGAGAGATGAAGTCGCTAAACTGATCAAAGAAGTGGTTGTCGAAAAAACGCGCGAAGATGTCAGAAAGAAGGCTAGGGAAATGTCTGAAATTTTACGTTCGAAAGGTGAGGAAAAGATGGACGAGATGGTTGCAGCCATTAGTCTCTTCTTGAAGATATAA(配列番号９３)。
当業者は、あらゆるＵＧＴ酵素ついて、例えば、配列のアラインおよび／または二次構造の比較により、どのアミノ酸残基がＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)における特定のアミノ酸残基に対応するかを決定する方法を容易に認識する。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、表９における配列または配列番号８１～１１２から選択される配列または本明細書に開示のもしくは当分野で知られる何れかのＵＧＴ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一(間の全数値を含む)である配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)を含み得る。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を含み得る。本発明のＵＧＴは、保存的アミノ酸置換および／または非保存的アミノ酸置換を含み得る。ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える保存的アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える非保存的アミノ酸置換を含む。ある実施態様において、保存的または非保存的アミノ酸置換は、ＵＧＴタンパク質の保存された領域に位置しない。ある実施態様において、保存的または非保存的アミノ酸置換は、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１の残基８３～９２；残基１７９～１９８；残基Ｎ１４３；残基Ｌ３７４；残基Ｈ２１；または残基Ｄ１２２に対応する領域に位置しない。当業者は、保存的および／または非保存的置換を含むＵＧＴを試験して、該保存的および／または非保存的置換がＵＧＴの活性または機能に影響するか否かを決定することが容易に可能である。
置換を含むアミノ酸残基は、例えば、Ｓ１２３；Ｆ１２４；Ｎ１４３；Ｔ１４４；Ｔ１４５；Ｖ１４９；Ｙ１７９；Ｇ１８；Ｓ１８０；Ａ１８１；Ｇ１８４；Ａ１８５；Ｖ１８６；Ｔ１８７；Ｋ１８９；Ｙ１９；Ｈ１９１；Ｋ１９２；Ｇ１９４；Ｅ１９５；Ａ１９８；Ｆ２７６；Ｎ３５５；Ｈ３７３；Ｌ３７４；Ｎ４７；Ｈ８３；Ｔ８４；Ｔ８５；Ｎ８６；Ｐ８９；および／またはＬ９２から選択される、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸である。このようなアミノ酸置換の非限定的例は、次の物を含む：Ｓ１２３はアラニン、システイン、グリシンもしくはバリンにまたはアラニン、システイン、グリシンもしくはバリンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｆ１２４はチロシンにまたはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｎ１４３はアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、スレオニンもしくはバリンにまたはアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、セリン、スレオニンもしくはバリンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｔ１４４はアラニン、システイン、アスパラギンもしくはプロリンにまたはアラニン、システイン、アスパラギンもしくはプロリンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｔ１４５はアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンもしくはセリンにまたはアラニン、システイン、グリシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンもしくはセリンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｖ１４９はシステイン、ロイシンもしくはメチオニンにまたはシステイン、ロイシンもしくはメチオニンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｙ１７９はグルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、バリンもしくはトリプトファンにまたはグルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、バリンもしくはトリプトファンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｇ１８はセリンにまたはセリンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｓ１８０はアラニンもしくはバリンにまたはアラニンもしくはバリンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ａ１８１はリシンもしくはスレオニンにまたはリシンもしくはスレオニンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｇ１８４はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニンもしくはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ａ１８５はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、スレオニン、トリプトファンもしくはチロシンにまたはシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、スレオニン、トリプトファンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｖ１８６はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、トリプトファンもしくはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、トリプトファンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｔ１８７はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｋ１８９はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンにまたはｔｈｅｒｅｏｆｏｆアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｙ１９はフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシンもしくはバリンにまたはフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシンもしくはバリンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｈ１９１はアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンにまたはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｋ１９２はシステインもしくはフェニルアラニンにまたはシステインもしくはフェニルアラニンの何れらかの保存的置換体に変異され得る；Ｇ１９４はアスパラギン酸、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、セリンもしくはトリプトファンにまたはアスパラギン酸、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、セリンもしくはトリプトファンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｅ１９５はアラニン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンもしくはチロシンにまたはアラニン、イソロイシン、リシン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ａ１９８はシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンもしくはチロシンにまたはシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｆ２７６はシステインもしくはグルタミンにまたはシステインもしくはグルタミンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｎ３５５はグルタミンもしくはセリンにまたはその何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｈ３７３はリシン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、バリンもしくはチロシンにまたはリシン、ロイシン、メチオニン、アルギニン、バリンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｌ３７４はアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンにまたはアラニン、システイン、フェニルアラニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｎ４７はグリシンにまたはグリシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｈ８３はグルタミンもしくはトリプトファンにまたはグルタミンもしくはトリプトファンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｔ８４はチロシンにまたはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｔ８５はグリシン、リシン、プロリン、セリンもしくはチロシンにまたはグリシン、リシン、プロリン、セリンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｎ８６はアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、リシン、ロイシン、セリン、トリプトファンもしくはチロシンにまたはアラニン、システイン、グルタミン酸、イソロイシン、リシン、ロイシン、セリン、トリプトファンもしくはチロシンの何れかの保存的置換体に変異され得る；Ｐ８９はメチオニンもしくはセリンにまたはメチオニンもしくはセリンの何れかの保存的置換体に変異され得る；および／もしくはＬ９２はヒスチジンもしくはリシンにまたはヒスチジンもしくはリシンの何れかの保存的置換体に変異され得る。
ある実施態様において、ＵＧＴ酵素は、触媒ダイアドの１０オングストローム、９オングストローム８オングストローム、７オングストローム、６オングストローム、５オングストローム、４オングストローム、３オングストローム、２オングストローム以内または１オングストローム以内(各数値間の全数値を含む)に位置するアミノ酸置換を含む。触媒ダイアドは野生型ＵＧＴ９４－２８９－１の残基２１および１２２(例えば、ヒスチジン２１およびアスパラギン酸１２２)に対応し得る。当業者は、あらゆるＵＧＴ酵素ついて、例えば、ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)との配列のアラインおよび／または二次構造の比較により、触媒ダイアドの対応位置を決定する方法を容易に認識することは認められる。
ある実施態様において、ＵＧＴ酵素は、ＵＧＴの１以上の構造モチーフに位置するアミノ酸残基でアミノ酸置換を含む。ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるＵＧＴの二次構造の非限定的例は、ベータシート４とアルファヘリックス５の間のループ；ベータシート５；ベータシート５とアルファヘリックス６の間のループ；アルファヘリックス６；アルファヘリックス６と７の間のループ；ベータシート１とアルファヘリックス１の間のループ；アルファヘリックス７；アルファヘリックス７と８の間のループ；アルファヘリックス１；アルファヘリックス８；ベータシート８とアルファヘリックス１３の間のループ；アルファヘリックス１７；ベータシート１２とアルファヘリックス１８の間のループ；アルファヘリックス２；ベータシート３とアルファヘリックス３の間のループ；アルファヘリックス３；およびアルファヘリックス３と４の間のループ；ループ８；ベータシート５；ループ１０；アルファヘリックス５；ループ１１；ループ２；アルファヘリックス６；ループ１２；アルファヘリックス１；アルファヘリックス７；ループ１８；アルファヘリックス１４；ループ２６；アルファヘリックス２；ループ６；およびアルファヘリックス３を含む。
ある実施態様において、ＵＧＴは、Ｎ１４３およびＬ３７４から選択される野生型ＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、Ｎ１４３に対応する残基は負荷電Ｒ基、極性非荷電Ｒ基または非極性脂肪族Ｒ基に変異される。ある実施態様において、Ｌ３７４に対応する残基は、非極性脂肪族Ｒ基、正荷電Ｒ基、極性非荷電Ｒ基または非極性芳香族Ｒ基に変異される。
本発明のＵＧＴは、酸素化部位の何れか(例えば、Ｃ３、Ｃ１１、Ｃ２４およびＣ２５)でモグロールまたはモグロシドのグリコシル化が可能であり得る。ある実施態様において、ＵＧＴは、分岐グリコシル化(例えば、モグロシドのＣ３またはＣ２４での分岐グリコシル化)が可能である。
本発明のＵＧＴのための適当な基質の非限定的例は、モグロールおよびモグロシド(例えば、モグロシドＩＡ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩＥ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)またはモグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、シアメノシドＩ)を含む。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、モグロシドＩＡ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩＥ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドII－Ａ２(ＭIIＡ２)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドIV、モグロシドIVａ、イソモグロシドIVおよび／またはモグロシドＶを産生できる。
ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭIIＡ１；ＭＩＥ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIIIＡ１；ＭＩＡ１からＭIIＥ；ＭIIＡ１からＭIII；ＭIIIＡ１からシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIII；ＭIIIからシアメノシドＩ；ＭIIＥからＭIIＥ；および／またはＭIIIＥからシアメノシドＩの変換の触媒ができる。
ＵＧＴの比活性などの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＵＧＴ(例えば、バリアントＵＧＴ)の比活性などの活性は、単位時間あたりの単位酵素あたりに産生されるグリコシル化モグロシドの量の測定により決定され得る。例えば、比活性などの活性は、１時間あたり酵素１グラムあたりに産生されるグリコシル化モグロシド標的のmmolで測定され得る。ある実施態様において、本発明のＵＧＴ(例えば、バリアントＵＧＴ)は、１時間あたり酵素１グラムあたりに産生されるグリコシル化モグロシド標的が少なくとも０.１mmol(例えば、少なくとも１mmol、少なくとも１.５mmol、少なくとも２mmol、少なくとも２.５mmol、少なくとも３、少なくとも３.５mmol、少なくとも４mmol、少なくとも４.５mmol、少なくとも５mmol、少なくとも１０mmol(各数値間の全数値を含む))である比活性などの活性を有し得る。
ある実施態様において、本発明のＵＧＴの比活性などの活性は、対照ＵＧＴより少なくとも１.１倍(例えば、少なくとも１.３倍、少なくとも１.５倍、少なくとも１.７倍、少なくとも１.９倍、少なくとも２倍、少なくとも２.５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍(各数値間の全数値を含む))大きい。ある実施態様において、対照ＵＧＴはＵＧＴ９４－２８９－１(配列番号１０９)である。ある実施態様において、アミノ酸置換を有するＵＧＴに関して、対照ＵＧＴは、アミノ酸置換がない以外同じＵＧＴである。
当業者は、タンパク質に付随する構造的および／または機能的情報に基づき、タンパク質をＵＧＴ酵素として特徴づけされ得ることは認識される。例えば、タンパク質は、モグロールなどのモグロシド前駆体存在下、１以上のモグロシドを産生する能力などの、機能に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。
他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質と既知ＵＧＴ酵素間のパーセント同一性に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、本明細書に記載するＵＧＴ配列の何れかまたは他のＵＧＴ酵素の何れかの配列と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一(各数値間の全数値を含む)であり得る。他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質における、ＵＧＴ酵素と関連する１以上のドメインの存在に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、当分野で知られるＵＧＴ酵素の特徴である糖結合ドメインおよび／または触媒ドメインの存在に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。ある実施態様において、触媒ドメインは、グリコシル化される基質に結合する。
他の実施態様において、タンパク質は、既知ＵＧＴ酵素の三次元構造造と比較する、タンパク質の三次元構造の比較に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、アルファヘリックスドメイン、ベータシートドメインなどの数または位置に基づき、ＵＧＴとして特徴づけされる。ＵＧＴ酵素は合成タンパク質であり得ることは認識される。
ある実施態様において、ＵＧＴは、配列番号１０９の配列を含まない。ある実施態様において、ＵＧＴは、配列番号１０９に９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７９％未満、７８％未満、７７％未満、７６％未満、７５％未満、７４％未満、７３％未満、７２％未満、７１％未満または７０％未満の同一性を含む。
バリアント
本発明の態様は、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳおよびＵＧＴ酵素など、記載される組み換え核酸の何れかをコードするポリヌクレオチドに関する。本明細書に記載する核酸またはアミノ酸配列のバリアントも、本発明により包含される。バリアントは、参照配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性(数値間の全数値を含む)を共有し得る。
特に断らない限り、用語「配列同一性」は、当分野で知られるとおり、配列比較(アライメント)により決定した、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係をいう。ある実施態様において、配列同一性は、対照配列などの配列の全長にわたり決定されるが、他の実施態様において、配列同一性は、配列領域にわたり決定される。ある実施態様において、配列同一性は、配列(例えば、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＵＧＴまたはＣＤＳ配列)のある領域(例えば、アミノ酸または核酸のストレッチ、例えば、活性部位にわたる配列)にわたり決定される。例えば、ある実施態様において、配列同一性は、対照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％にわたる領域で決定される。
同一性は、特定の数学的モデル、アルゴリズムまたはコンピュータープログラムにより処理されるギャップアライメント(あるならば)を伴う２以上の配列の小さいほうの間の同一マッチのパーセントを測定する。
関連ポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、当業者に知られる方法の何れかにより容易に計算され得る。２個の配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)の「パーセント同一性」は、例えば、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変したKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して決定され得る。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ(登録商標)およびＸＢＬＡＳＴ(登録商標)プログラム(バージョン２.０)に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ(登録商標)タンパク質サーチは、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、単語長＝３で実施して、この明細書に記載するタンパク質と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２配列間にギャップが存在するとき、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ(登録商標)を、例えば、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載のとおり実施できる。ＢＬＡＳＴ(登録商標)およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ(登録商標)プログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴ(登録商標)およびＮＢＬＡＳＴ(登録商標))のデフォルトパラメータを使用できまたはパラメータを当業者により理解されるとおり適切に調整できる。
使用され得る他の局所アライメント技術は、例えば、Smith-Watermanアルゴリズム(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) 「Identification of common molecular subsequences」。 J. Mol. Biol. 147:195-197)に基づく。使用され得る一般的包括的アライメント技術は、例えば、動的計画法に基づく、Needleman-Wunschアルゴリズム(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) 「A general method applicable to the search for similarities in the amino acid配列s of two proteins」。 J. Mol. Biol. 48:443-453)である。
さらに最近、Fast Optimal Global配列 Alignment Algorithm(ＦＯＧＳＡＡ)が開発され、これは、Needleman-Wunschアルゴリズムを含む他の最適包括的アライメント方法より速く、核酸およびアミノ酸配列の包括的アライメントを作成するとされている。ある実施態様において、２個のポリペプチドの同一性を、２個のアミノ酸配列をアラインし、同一アミノ酸数を計算し、アミノ酸配列の一方の長さで除すことにより決定する。ある実施態様において、２個の核酸の同一性を、２個のヌクレオチド配列をアラインし、同一ヌクレオチド数を計算し、核酸の一方の長さで除すことにより決定する。
複数配列アライメントのために、Clustal Omega(Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)を含むコンピュータープログラムが使用され得る。
好ましい実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変したKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990を使用して配列同一性を決定するとき、本明細書に開示のおよび／または請求の範囲に引用された配列などの対照配列と、特定のパーセント同一性を有することが判明する(例えば、ＢＬＡＳＴ(登録商標)、ＮＢＬＡＳＴ(登録商標)、ＸＢＬＡＳＴ(登録商標)またはＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ(登録商標)プログラムで、各プログラムのデフォルトパラメータを使用)。
ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、デフォルトパラメータを使用する、Smith-Watermanアルゴリズム(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197)またはNeedleman-Wunschアルゴリズム(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453)を使用して配列同一性を決定するとき、本明細書に開示のおよび／または請求の範囲に引用された配列などの対照配列と、特定のパーセント同一性を有することが判明する。
ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、デフォルトパラメータを使用する、Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm(FOGSAA)を使用して配列同一性を決定するとき、本明細書に開示のおよび／または請求の範囲に引用された配列などの対照配列と、特定のパーセント同一性を有することが判明する。
ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、デフォルトパラメータを使用する、Clustal Omega(Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)を使用して配列同一性を決定するとき、本明細書に開示のおよび／または請求の範囲に引用された配列などの対照配列と、特定のパーセント同一性を有することが判明する。
本明細書で使用する、配列「Ｘ」における残基(例えば核酸残基またはアミノ酸残基)は、配列ＸおよびＹを当分野で知られるアミノ酸配列アライメントツールを使用してアラインしたとき、配列「Ｘ」における該残基が異なる配列「Ｙ」における「ｎ」のカウンターパート位置にあるならば、該配列「Ｙ」における「ｎ」位または残基(例えば核酸残基またはアミノ酸残基)に対応するという。
バリアント配列は相同配列であり得る。本明細書で使用する、相同配列は、特定のパーセント同一性(例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％パーセント同一性(各数値間の全数値を含む))を共有する配列(例えば、核酸またはアミノ酸配列)である。相同配列は、パラロガス配列またはオルソロガス配列を含むが、これらに限定されない。パラロガス配列は、種のゲノム内の遺伝子の重複に起因し、一方オルソロガス配列は、種分化事象後分岐する。
ある実施態様において、ポリペプチドバリアント(例えば、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＵＧＴまたはＣＤＳバリアント)は、対照ポリペプチド(例えば、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳまたはＵＧＴ)と二次構造(例えば、アルファヘリックス、ベータシート)を共有するドメインを含む。ある実施態様において、ポリペプチドバリアント(例えば、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳまたはＵＧＴバリアント)は、対照ポリペプチド(例えば、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳまたはＵＧＴ)と三次構造を共有する。非限定的例として、バリアントポリペプチドは、対照ポリペプチドと比較して低い一次配列同一性(例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満配列同一性)を有するが、１以上の二次構造(例えば、ループ、アルファヘリックスまたはベータシートを含むが、これらに限定されない)を共有するかまたは対照ポリペプチドと同じ三次構造を有し得る。例えば、ループは、ベータシートとアルファヘリックス間、２個のアルファヘリックス間または２個のベータシート間に位置し得る。相同性モデリングを使用して、２以上の三次構造を比較し得る。
当業者に知られる多様な方法により、ヌクレオチド配列に変異を付し得る。例えば、変異を、ＰＣＲ指向変異、Kunkel(Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985)の方法による部位特異的変異誘発、ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成、ＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集ツールまたはタグ(例えば、ＨＩＳタグまたはＧＦＰタグ)挿入などの挿入により付し得る。変異は、例えば、当分野で知られる何らかの方法により産生される、置換、欠失および転座を含み得る。変異を産生する方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, 2010などの参考書に見られ得る。
ある実施態様において、バリアントを産生する方法は、循環置換を含む(Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25)。循環置換において、ポリペプチドの直鎖状一次配列が環状化(例えば、配列のＮ末端とＣ末端の結合による)され、ポリペプチドを異なる位置で切断(「破壊」)し得る。故に、新規ポリペプチドの直鎖状一次配列は、直鎖状配列アライメント方法(例えば、Clustal OmegaまたはＢＬＡＳＴ)により決定して、低配列同一性(例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満(各数値間の全数値を含む))を有し得る。しかしながら、２個のタンパク質の位相的分析は、２個のポリペプチドの三次構造が類似または相違することを確認し得る。特定の理論に拘束されないが、対照ポリペプチドの循環置換により作製し、対照ポリペプチドと類似する三次構造を有するバリアントポリペプチドは、類似する機能的特徴(例えば、酵素活性、酵素動力学、基質特異性または産物特異性)を有し得る。ある場合、循環置換は二次構造、三次構造または四次構造を変え、異なる機能的特徴(例えば、酵素活性が増加または低減、異なる基質特異性または異なる産物特異性)の酵素を生じ得る。例えば、Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25参照。
循環置換を受けたタンパク質で、タンパク質の直鎖状アミノ酸配列は、循環置換を受けていない対照タンパク質と異なることは認識される。しかしながら、循環置換を受けたタンパク質のどの残基が、循環置換を受けていない対照タンパク質における残基に対応するか、例えば、配列をアラインし、保存されたモチーフを決定するおよび／または、例えば、相同性モデリングにより、タンパク質の構造または予測構造の比較により、当業者は容易に決定できる。
本明細書に開示する組み換えＣ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳおよびＵＧＴの機能的バリアントも、本発明により包含される。例えば、機能的バリアントは、１以上の同じ基質(例えば、モグロール、モグロシドまたはその前駆体)と結合するか、１以上の同じ産物(例えば、モグロール、モグロシドまたはその前駆体)を産生し得る。機能的バリアントは、当分野で知られる何らかの方法を使用して、同定され得る。例えば、上記Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを、既知機能を有する相同タンパク質の同定に使用し得る。
推定される機能的バリアントは、機能的にアノテートされたドメインを有するポリペプチドのサーチによっても同定され得る。Pfam(Sonnhammer et al., Proteins. 1997 Jul;28(3):405-20)を含むデータベースを使用して、特定のドメインを有するポリペプチドを同定し得る。例えば、オキシドスクアレンシクラーゼ中で、さらなるＣＤＳ酵素が、ある場合、配列番号７４の１２３位に対応するロイシン残基を有するポリペプチドのサーチにより同定され得る。このロイシン残基は、ＣＤＳ酵素の産物特異性決定と関連付けられている；この残基の変異は、例えば、産物としてシクロアルテノールまたはパルケオールをもたらす(Takase et al., Org Biomol Chem. 2015 Jul 13(26):7331-6)。
さらなるＵＧＴ酵素が、例えば、ＵＤＰＧＴドメイン(PROSITE accession number PS00375)を有するポリペプチドのサーチにより、同定され得る。
相同性モデリングも、機能に影響することなく変異しやすいアミノ酸残基の同定に使用し得る。このような方法の非限定的例は、位置特異的スコアリングマトリクス(ＰＳＳＭ)およびエネルギー最小化プロトコールの使用を含み得る。
位置特異的スコアリングマトリクス(ＰＳＳＭ)は、位置的重み行列を使用して、コンセンサス配列(例えば、モチーフ)を同定する。ＰＳＳＭは核酸またはアミノ酸配列で実施できる。配列を整列し、方法は、特定の位置の特定の残基(例えば、アミノ酸またはヌクレオチド)で観察される頻度および分析する配列数を考慮する。例えば、Stormo et al., Nucleic Acids Res. 1982 May 11;10(9):2997-3011参照。ある位置での特定の残基の観察の可能性を計算できる。特定の理論に拘束されないが、配列における高可変性の位置(例えば、ＰＳＳＭスコア≧０)は、機能的ホモログの産生のために、変異しやすい。
ＰＳＳＭは、野生型と単一点変異体の間の差異を決定する、ロゼッタエネルギー関数の計算と対合させ得る。ロゼッタエネルギー関数は、この差異を(ΔΔＧｃａｌｃ)として計算する。ロゼッタ関数で、変異残基と周囲原子の間の結合相互作用を使用して、変異がタンパク質安定性を増加させるかまたは減少させるかを決定する。例えば、ＰＳＳＭスコアで好都合として指定された変異(例えばＰＳＳＭスコア≧０)を、その後ロゼッタエネルギー関数を使用して分析して、変異のタンパク質安定性に対する影響の可能性を決定できる。特定の理論に拘束されないが、潜在的に安定化する変異が、タンパク質操作(例えば、機能的ホモログの産生)で望まれる。ある実施態様において、潜在的に安定化する変異は、－０.１未満(例えば、－０.２未満、－０.３未満、－０.３５未満、－０.４未満、－０.４５未満、－０.５未満、－０.５５未満、－０.６未満、－０.６５未満、－０.７未満、－０.７５未満、－０.８未満、－０.８５未満、－０.９未満、－０.９５未満または－１.０未満)のロゼッタエネルギー単位(Ｒ.ｅ.ｕ.)のΔΔＧｃａｌｃ値を有する。例えば、Goldenzweig et al., Mol Cell. 2016 Jul 21;63(2):337-346. doi: 10.1016/j.molcel.2016.06.012参照。
ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳまたはＵＧＴコード配列は、対照コード配列に対応する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００を超える位置に変異を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳまたはＵＧＴコード配列は、対照コード配列に比してコード配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のコドンに変異を含む。当業者には理解されるとおり、コドン内の変異は、遺伝暗号の縮重により、該コドンによりコードされるアミノ酸を変化させるかもしれないし、させないかもしれない。ある実施態様において、コード配列における１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、コード配列のアミノ酸配列を変えない。
ある実施態様において、組み換えＣ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳまたはＵＧＴ配列における１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変える。ある実施態様において、１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して組み換えポリペプチドのアミノ酸配列を変え、対照ポリペプチドに対してポリペプチドの活性を変える(増強または低減)。
本明細書に記載する組み換えポリペプチドの何れかの、比活性を含む活性は、日常的な方法を使用して測定され得る。非限定的例として、組み換えポリペプチドの活性を、その基質特異性、生産される産物、生産される産物の濃度またはこれらの何らかの組み合わせの測定により決定し得る。本明細書で使用する、組み換えポリペプチドの「比活性」は、単位時間あたりある量(例えば、濃度)の組み換えポリペプチドにより産生される特定の産物の量(例えば、濃度)をいう。
組み換えポリペプチドコード配列における変異は、前記ポリペプチドの機能的に等価なバリアント、例えば、ポリペプチドの活性を保持するバリアントを提供するための保存的アミノ酸置換をもたらし得ることも当業者は認識する。本明細書で使用する、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的電荷もしくはサイズ特徴または機能的活性を変えないアミノ酸置換をいう。
ある場合、アミノ酸は、そのＲ基(例えば、表１参照)により特徴づけられる。例えば、アミノ酸は、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、非極性芳香族Ｒ基または極性非電荷Ｒ基を含み得る。非極性脂肪族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンを含む。正電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む。負電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。非極性、芳香族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む。極性非電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。
ポリペプチドの機能的に等価なバリアントの非限定的例は、本明細書に開示のタンパク質のアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含み得る。アミノ酸の保存的置換は、次の群内のアミノ酸間でなされる置換である：(ａ)Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；(ｂ)Ｆ、Ｙ、Ｗ；(ｃ)Ｋ、Ｒ、Ｈ；(ｄ)Ａ、Ｇ；(ｅ)Ｓ、Ｔ；(ｆ)Ｑ、Ｎ；および(ｇ)Ｅ、Ｄ。保存的アミノ酸置換のさらなる非限定的例を表２に提供する。
ある実施態様において、バリアントポリペプチドの調製時、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０を超える残基を変え得る。ある実施態様において、アミノは保存的アミノ酸置換により置換される。
Figure 2022553065000005
所望の性質および／または活性を有する組み換えポリペプチドバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、ポリペプチドのコード配列の改変により行い得る。同様に、ポリペプチドの機能的に等価なバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、一般に組み換えポリペプチドのコード配列の改変により行う。
宿主細胞における核酸の発現
本発明の態様は、酵素、その機能的修飾体およびバリアントをコードする遺伝子の組み換え発現ならびにそれに関連する使用に関する。例えば、本明細書に記載する方法を、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生に使用され得る。
遺伝子を含むポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドに関する用語「異種」は、用語「外来性」および用語「組み換え」と相互交換可能に使用され、生物系に人工的に供給されているポリヌクレオチド；生物系内で修飾されているポリヌクレオチド；または発現または制御が生物系内で操作されているポリヌクレオチドをいう。宿主細胞に導入されるまたは発現される異種ポリヌクレオチドは、宿主細胞と異なる生物または種由来のポリヌクレオチドであり得るかまたは合成ポリヌクレオチドであり得るかまたは宿主細胞と同じ生物または種でまた内因性に発現されるポリヌクレオチドであり得る。例えば、宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドは、宿主細胞で天然ではない位置である；安定的または一過性に宿主細胞で組み換え発現される；宿主細胞内で修飾される；宿主細胞内で選択的に編集される；天然に存在するコピー数と異なるコピー数で宿主細胞内で発現される；またはポリヌクレオチドの発現を制御する制御領域の操作によるなど、宿主細胞内で天然ではない方法で発現されるとき、異種とみなされる。ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドであるが、発現が該ポリヌクレオチドの発現を天然では制御しないプロモーターにより駆動される。他の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドであり、その発現は該ポリヌクレオチドの発現を天然で制御するプロモーターにより駆動されるが、該プロモーターまたは他の制御領域が修飾される。ある実施態様において、プロモーターは、組み換えにより活性化または抑制される。例えば、遺伝子編集ベースの技術を使用して、内因性ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの、内因性プロモーターを含むプロモーターからの発現を制御し得る。例えば、Chavez et al., Nat Methods. 2016 Jul; 13(7): 563-567参照。異種ポリヌクレオチドは、対照ポリヌクレオチド配列と比較して野生型配列または変異体配列を含み得る。
本明細書に記載するＣ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳまたはＵＧＴなどの組み換えポリペプチドの何れかをコードする核酸を、当分野で知られる何れかの方法により何れかの適切なベクターに組み込み得る。例えば、ベクターは、ウイルスベクター(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター)を含むが、これらに限定されない発現ベクター、一過性発現に適するあらゆるベクター、構成的発現に適するあらゆるベクターまたは誘導型発現に適するあらゆるベクター(例えば、ガラクトース誘導型またはドキシサイクリン誘導型ベクター)であり得る。
ある実施態様において、ベクターは、細胞で自律的に複製する。ベクターは、１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含み、本明細書に記載の遺伝子を含む核酸の挿入およびライゲートのために制限エンドヌクレアーゼにより切断され、細胞で複製できる組み換えベクターが産生され得る。ベクターは、一般にＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。クローニングベクターは、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する、用語「発現ベクター」または「発現構築物」は、酵母細胞などの宿主細胞における特定の核酸の転写を可能とする一連の特定の核酸要素を有する、組み換えまたは合成により産生された、核酸構築物をいう。ある実施態様において、本明細書に記載する遺伝子の核酸配列を、制御配列と操作可能に結合し、ある実施態様において、ＲＮＡ転写物として発現されるように、クローニングベクターに挿入される。ある実施態様において、ベクターは、組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を同定するための、本明細書に記載する選択可能マーカーなどの１以上のマーカーを含む。
ある実施態様において、本明細書に記載する遺伝子の核酸配列は再コード化される。再コード化は、再コード化されていない対照配列に比して、遺伝子産物の産生を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％(各数値間の全数値を含む))増加させ得る。
コード配列および制御配列は、コード配列と制御配列が共有結合され、コード配列の発現または転写が該制御配列の影響または制御下にあるならば、「操作可能に結合」されたという。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されるならば、コード配列および制御配列は、５’制御配列におけるプロモーターの導入がコード配列を翻訳させるならばおよびコード配列と制御配列の間の結合の性質が、(１)フレームシフト変異の導入をもたらす、(２)プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力を妨害するまたは(３)対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害することがないならば、操作可能に結合されたという。
ある実施態様において、本明細書に記載するタンパク質の何れかをコードする核酸は、制御配列(例えば、エンハンサー配列)の制御下にある。ある実施態様において、核酸は、プロモーターの制御下発現される。プロモーターは、天然プロモーター、例えば、内因性状況で遺伝子のプロモーターであり、該遺伝子の発現の通常の制御を提供する。あるいは、プロモーターは、遺伝子の天然プロモーターと異なるプロモーター、例えば、その内因性状況における遺伝子のプロモーターと異なるプロモーターである。
ある実施態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターである。真核生物プロモーターの非限定的例は、当業者に知られるとおり、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１,ＴＰＩ１ ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＧＡＬ３、ＧＡＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ２５、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＵＰ１－１、ＥＮＯ２、ｐＡＯＸ１、ｐＧＡＰ１およびＳＯＤ１を含む(例えば、Addgene website: blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region参照)。ある実施態様において、プロモーターは、原核生物プロモーター(例えば、バクテリオファージまたは細菌プロモーター)である。バクテリオファージプロモーターの非限定的例は、Ｐｌｓ１ｃｏｎ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６およびＰＬを含む。細菌プロモーターの非限定的例は、Ｐｂａｄ、ＰmgｒＢ、Ｐｔｒｃ２、Ｐｌａｃ／ａｒａ、ＰｔａｃおよびＰｍを含む。
ある実施態様において、プロモーターは誘導型プロモーターである。本明細書で使用する、「誘導型プロモーター」は、分子の存在または不在により制御されるプロモーターである。誘導型プロモーターの非限定的例は、化学制御プロモーターおよび物理制御プロモーターを含む。化学制御プロモーターについて、転写活性は、アルコール、テトラサイクリン、ガラクトース、ステロイド、金属または他の化合物などの１以上の化合物により制御される。物理制御プロモーターについて、転写活性は、光または温度などの現象により制御され得る。テトラサイクリン制御プロモーターの非限定的例は、ヒドロテトラサイクリン(ａＴｃ)応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系(例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質(ｔｅｔＲ)、テトラサイクリンオペレーター配列(ｔｅｔＯ)およびテトラサイクリントランスアクティベーター融合タンパク質(ｔＴＡ))を含む。ステロイド制御プロモーターの非限定的例は、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーターに基づくプロモーターを含む。金属制御プロモーターの非限定的例は、メタロチオネイン(金属イオンを結合および隔離するタンパク質)遺伝子に由来するプロモーターを含む。病因制御プロモーターの非限定的例は、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール(ＢＴＨ)により誘導されるプロモーターを含む。温度／熱誘導型プロモーターの非限定的例は、ヒートショックプロモーターを含む。光制御プロモーターの非限定的例は、植物細胞の光反応性プロモーターを含む。ある実施態様において、誘導型プロモーターはガラクトース誘導型プロモーターである。ある実施態様において、誘導型プロモーターは、１以上の生理学的条件(例えば、ｐＨ、温度、放射、浸透圧、食塩水勾配、細胞表面結合または１以上の外因性もしくは内因性誘導剤の濃度)により誘導される。外因性インデューサーまたは誘導剤の非限定的例は、アミノ酸およびアミノ酸アナログ、サッカライドおよび多糖、核酸、タンパク質転写アクティベーターおよびリプレッサー、サイトカイン、毒素、石油ベースの化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモンまたはこれらの何らかの組み合わせを含む。
ある実施態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。本明細書で使用する、「構成的プロモーター」は、遺伝子の連続的転写を可能とする非制御プロモーターをいう。構成的プロモーターの非限定的例は、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１,ＴＰＩ１、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＥＮＯ２、ｐＧＡＰ１およびＳＯＤ１を含む。
当業者に知られる他の誘導型プロモーターまたは構成的プロモーターも考慮される。
遺伝子発現に必要な制御配列の厳密な性質は種または細胞型により変わり得るが、一般に、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含む。特に、このような５’非転写制御配列は、操作可能に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。制御配列は、エンハンサー配列または上流アクティベーター配列も含み得る。本明細書に開示するベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列を含み得る。制御配列はターミネーター配列も含み得る。ある実施態様において、ターミネーター配列は、転写中のＤＮＡ遺伝子の終わりを示す。宿主細胞における本明細書に記載する１以上の遺伝子の発現に適する１以上の適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
発現に必要な要素を含む発現ベクターは市販され、当業者に知られる(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012参照)。
ある実施態様において、組み換えポリペプチドの何れかをコードする核酸の導入は、核酸のゲノム組込みをもたらす。ある実施態様において、宿主細胞は、ゲノムにおいて、組み換えポリペプチドの何れかをコードするヌクレオチド配列を少なくとも１コピー、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも１１コピー、少なくとも１２コピー、少なくとも１３コピー、少なくとも１４コピー、少なくとも１５コピー、少なくとも１６コピー、少なくとも１７コピー、少なくとも１８コピー、少なくとも１９コピー、少なくとも２０コピー、少なくとも２１コピー、少なくとも２２コピー、少なくとも２３コピー、少なくとも２４コピー、少なくとも２５コピー、少なくとも２６コピー、少なくとも２７コピー、少なくとも２８コピー、少なくとも２９コピー、少なくとも３０コピー、少なくとも３１コピー、少なくとも３２コピー、少なくとも３３コピー、少なくとも３４コピー、少なくとも３５コピー、少なくとも３６コピー、少なくとも３７コピー、少なくとも３８コピー、少なくとも３９コピー、少なくとも４０コピー、少なくとも４１コピー、少なくとも４２コピー、少なくとも４３コピー、少なくとも４４コピー、少なくとも４５コピー、少なくとも４６コピー、少なくとも４７コピー、少なくとも４８コピー、少なくとも４９コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも６０コピー、少なくとも７０コピー、少なくとも８０コピー、少なくとも９０コピー、少なくとも１００コピーまたはそれ以上(各数値間のあらゆる数値を含む)含む。
いくつかの例において、宿主細胞は、少なくとも２個の異なるＣ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳまたはＵＧＴを含む。
いくつかの例において、宿主細胞は、上方制御されたスクアレンシンターゼ、上方制御されたＳＱＥ、下方制御されたラノステロールシンターゼ、少なくとも１個のＣ１１ヒドロキシラーゼ、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のＣＤＳおよび少なくとも１個のＥＰＨを含む。いくつかの例において、宿主細胞は、上方制御されたＳＱＥ、少なくとも１個のＣＤＳ、少なくとも１個のエポキシドヒドロラーゼ、少なくとも１個のＣ１１ヒドロキシラーゼおよび／または少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。いくつかの例において、宿主細胞は、上方制御されたＳＱＥ、少なくとも１個のＣＤＳ、少なくとも１個のＣ１１ヒドロキシラーゼおよび少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。いくつかの例において、宿主細胞は、さらに少なくとも１個のエポキシドヒドロラーゼを含む。いくつかの例において、宿主細胞は、２個の異なるＣ１１ヒドロキシラーゼおよび２個の異なるシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む。いくつかの例において、スクアレンシンターゼはＥＲＧ９である。いくつかの例において、スクアレンエポキシダーゼはＥＲＧ１である。いくつかの例において、ラノステロールシンターゼはＥＲＧ７である。いくつかの例において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼはＣＹＰ１７９８である。いくつかの例において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは本明細書に記載される何れかのＣ１１ヒドロキシラーゼである。いくつかの例において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼはＰＧＡ２｜ｄ２３－１２９＿ＣＹＰ５４９１－Ｔ３５１Ｍ(配列番号３０５)である。いくつかの例において、エポキシドヒドロラーゼはＥＰＨ３である。いくつかの例において、エポキシドヒドロラーゼはＥＰＨ２である。いくつかの例において、シトクロムＰ４５０レダクターゼはＡｔＣＰＲ１である。いくつかの例において、シトクロムＰ４５０レダクターゼはＣＰＲ４４９７である。ある実施態様において、宿主細胞は、ＡｔＣＰＲ１およびＣＰＲ４４９７を含む。いくつかの例において、シトクロムＰ４５０レダクターゼはＣＰＲ４４９７である。いくつかの例において、ＣＤＳはＳｉｒａｉｔｉａ ＣＤＳ(ｓｇＣＤＳ)または配列番号６６である。
いくつかの例において、宿主細胞は、上方制御されたＥＲＧ９、上方制御されたＥＲＧ１；下方制御されたＥＲＧ７；少なくとも１(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０)コピーのＣＹＰ１７９８をコードするヌクレオチド配列；少なくとも１(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０)コピーのＡｔＣＰＲ１をコードするヌクレオチド配列；少なくとも１(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０)コピーのＣＰＲ４４９７をコードするヌクレオチド配列；少なくとも１(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０)コピーのｓｇＣＤＳをコードするヌクレオチド配列；少なくとも１(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０)コピーのＥＰＨ３をコードするヌクレオチド配列；および／または少なくとも１(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０)コピーのａｔＥＰＨ２をコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、ＣＹＰ１７９８、ＡｔＣＰＲ１、ＣＰＲ４４９７、ｓｇＣＤＳ、ＥＰＨ３、ａｔＥＰＨ２、ＥＲＧ９、ＥＲＧ１およびＥＲＧ７の非限定的例を提供する表６参照。
本明細書で使用する「上方制御された」酵素は、対照と比較して発現が増加した酵素である。酵素の発現は、当業者に知られるあらゆる手段を使用して、上方制御され得る。ある実施態様において、酵素の発現は、酵素の発現を制御するための特異的プロモーターの選択および／または酵素のプロモーターの改変により上方制御される。ある実施態様において、酵素の発現は、宿主細胞における酵素の複数コピー発現により上方制御される。ある実施態様において、宿主細胞における酵素の発現は、対照宿主細胞に比して上方制御される。ある実施態様において、対照宿主細胞は、酵素をコードする異種核酸を含まない宿主細胞である。ある実施態様において、対照宿主細胞は、酵素をコードする異種核酸を１コピー含む宿主細胞である。ある実施態様において、対照宿主細胞は、酵素が上方制御されている対照宿主細胞より酵素をコードする異種核酸を少ないコピーで含む、宿主細胞である。ある実施態様において、対照宿主細胞は、酵素が上方制御されている対照宿主細胞と異なるプロモーターで酵素の発現が制御される、宿主細胞である。ある実施態様において、酵素の発現は、対照に対して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％または少なくとも１,０００％上方制御される。
宿主細胞
本発明のタンパク質または酵素の何れかを、宿主細胞で発現させ得る。用語「宿主細胞」は、モグロール、モグロシドおよびその前駆体の産生に使用する酵素をコードするポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを発現させるために使用され得る細胞をいう。
真核生物細胞または原核生物細胞を含む、あらゆる適当な宿主細胞を、本明細書に開示するＣ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳおよびＵＧＴを含む組み換えポリペプチドの何れかの産生に使用できる。適当な宿主細胞は、真菌細胞(例えば、酵母細胞)、細菌細胞(例えば、大腸菌細胞)、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む動物細胞を含むが、これらに限定されない。
適当な酵母宿主細胞は、カンジダ、エシェリキア、ハンセヌラ、サッカロミセス(例えば、出芽酵母)、シゾサッカロマイセス、ピキア、クルイベロマイセス(例えば、クルイベロマイセス・ラクチス)およびヤロウイアを含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、酵母細胞がハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・カールスベルゲンシス、サッカロミセス・ディアスタティックス、サッカロミセス・ノルベンシス、サッカロミセス・クルイベリ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コダマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・ケルクウム、ピキア・ピジェペリ、ピキア・スティピティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・アングスタ、クルイベロミセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンスまたはヤロウイア・リポリティカである。
ある実施態様において、酵母株は工業的多数体酵母株である。真菌細胞の他の非限定的例は、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、リゾプス属、アクレモニウム属、アカパンカビ属、ソルダリア属、マグナポルテ属、アロミセス属、ウスティラゴ属ボトリチス属、およびトリコデルマ属から得られた細胞を含む。
ある実施態様において、宿主細胞はクラミドモナス(例えば、クラミドモナス・ラインハルトチイ)およびフォルミディウム(P.sp.ATCC29409)などの藻類細胞である。
他の実施態様において、宿主細胞は原核生物細胞である。適当な原核生物細胞は、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定細菌細胞を含む。宿主細胞は、アグロバクテリウム、アリシクロバチルス、アナバエナ、アナシスティス、アシネトバクター、アシドサーマス、アートロバクター、アゾバクター、バチルス、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、ブチリビブリオ、ブフネラ、カンペストリス、カンプリオバクター、クロストリジウム、コリネバクテリウム、クロマチウム、コプロコッカス、エシェリキア、エンテロコッカス、エンテロバクター、エルウィニア、フソバクテリウム、フィーカリバクテリウム、フランシセラ、フラボバクテリウム、ゲオバチルス、ヘモフィルス、ヘリコバクター、クレブシエラ、ラクトバチルス、ラクトコッカス、イリオバクター、マイクロコッカス、ミクロバクテリウム、メソリゾビウム、メチロバクテリウム、メチロバクテリウム、マイコバクテリウム、ナイセリア、パントエア、シュードモナス、プロクロロコッカス、ロドバクター、ロドシュードモナス、ロドシュードモナス、ロゼブリア、ロドスピリルム、ロドコッカス、セネデスムス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、シネコッカス、サッカロモノスポラ、サッカロポリスポラ、スタフィロコッカス、セラチア、サルモネラ、シゲラ、サーモアナエロバクテリウム、トロフェリマ、ツラレンシス、テメキュラ、サーモシネココッカス、サーモコッカス、ウレアプラズマ、キサントモナス、キシレラ、エルシニアおよびザイモモナスを含むが、これらに限定されない属のものであり得る。
ある実施態様において、細菌宿主細胞は、アグロバクテリウム属(例えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アグロバクテリウム・リゾゲネス、アグロバクテリウム・ルビ)、アルスロバクター属(例えば、アルスロバクター・アウレッセンス、アルスロバクター・シトレウス、アルスロバクター・グロビフォルミス、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミナス、アルスロバクター・マイソレンス、アルスロバクター・ニコチアナエ、アルスロバクター・パラフィネウス、アルスロバクター・プロトフォルミアエ、アルスロバクター・ロゼオパラフィナス、アルスロバクター・スルフレウス、アルスロバクター・ウレアファシエンス)またはバシラス属(例えば、バシラス・チューリンゲンシス、バシラス・アントラシス、バシラス・メガテリウム、バシラス・スブチリス、バシラス・レンタス、バシラス・サーキュランス、バシラス・プミラス、バシラス・ラクタス、バシラス・コアギュランス、バシラス・ブレビス、バシラス・フィルムス、バシラス・アルカオフィウス、バシラス・リヒェニフォルミス、バシラス・クラウジ、バシラス・ステアロテルモフィルス、バシラス・ハロデュランスおよびバシラス・アミロリクエファシエンス)のものである。具体的実施態様において、宿主細胞は、バシラス・スブチリス、バシラス・プミラス、バシラス・リヒェニフォルミス、バシラス・メガテリウム、バシラス・クラウジ、バシラス・ステアロテルモフィルスおよびバシラス・アミロリクエファシエンスを含むが、これらに限定されない工業的バシラス属である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的クロストリジウム属(例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・テタニＥ８８、クロストリジウム・リツセブレンス、クロストリジウム・サッカロブチリカム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ベイジェリンキー)。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的コリネバクテリウム族(例えば、コリネバクテリウム・グルタミナム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム)。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的エシェリキア属(例えば、大腸菌)である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的エルウィニア属(例えば、エルウィニア・ウレドボラ、エルウィニア・カロトボラ、エルウィニア・アナナス、エルウィニア・ハービコラ、エルウィニア・プンクタタ、エルウィニア・テレウス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的パントエア属(例えば、パントエア・シトレア、パントエア・アグロメランス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的シュードモナス属(例えば、シュードモナス・プイチダ、シュードモナス・エアルギノーザ、シュードモナス・メバロニ)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的ストレプトコッカス属(例えば、ストレプトコッカス・エキシミレス、ストレプトコッカス・ピオゲネシス、ストレプトコッカス・ウベリス)である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的ストレプトマイセス属(例えば、ストレプトマイセス・アンボファシエンス、ストレプトマイセス・アクロモゲネス、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス、ストレプトマイセス・アウレウス、ストレプトマイセス・フンギシジカス、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・リビダンス)である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的ザイモモナス属(例えば、ザイモモナス・モビリス、ザイモモナス・リポリティカ)である。
本発明はまた哺乳動物細胞、例えば、ヒト(２９３、ＨｅＬａ、ＷＩ３８、ＰＥＲ.Ｃ６およびボーズ黒色腫細胞を含む)、マウス(３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｓｐ２／０を含む)、ハムスター(ＣＨＯ、ＢＨＫ)、サル(ＣＯＳ、ＦＲｈＬ、Ｖｅｒｏ)およびハイブリドーマ細胞株を含む多様な動物細胞型での使用に適する。
本発明はまた多様な植物細胞型での使用に適する。
本明細書で使用する用語「細胞」は、単一細胞または同じ細胞株もしくは種に属する細胞集団などの細胞集団をいい得る。単数表現「細胞」の使用は、細胞集団ではなく、明示的に単一の細胞をいうと解釈されてはならない。
宿主細胞は、野生型カウンターパートに比して遺伝子修飾を含み得る。非限定的例として、宿主細胞(例えば、出芽酵母)は、次の遺伝子：ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ (ＨＭＧ－ＣｏＡ)レダクターゼ(ＨＭＧ１)、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ(アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼ)(ＥＲＧ１０)、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ(ＨＭＧ－ＣｏＡ)シンターゼ(ＥＲＧ１３)、ファルネシル－ジホスフェートファルネシルトランスフェラーゼ(スクアレンシンターゼ)(ＥＲＧ９)の１以上の低減または不活性化のために修飾されてよく、スクアレンエポキシダーゼ(ＥＲＧ１)を過発現するよう修飾されてよくまたはラノステロールシンターゼ(ＥＲＧ７)を下方制御するよう修飾されてよい。
遺伝子発現低減および／または遺伝子不活性化は、遺伝子欠失、内因性遺伝子への点変異導入および／または内因性遺伝子短縮化を含むが、これらに限定されない、あらゆる適当な方法により達成され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)ベースの方法が使用され得る(例えば、Gardner et al., Methods Mol Biol. 2014;1205:45-78)または周知遺伝子編集技術が使用され得る。非限定的例として、遺伝子を、遺伝子置換(例えば、選択マーカーを含むマーカーで)により欠失させ得る。遺伝子を、トランスポゾン系の使用により切断することもできる(例えば、Poussu et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33(12): e104参照)。
本明細書に記載する組み換えポリペプチドの何れかをコードするベクターを、当分野で知られる何れかの方法を使用して適当な宿主細胞に導入し得る。酵母形質転換プロトコールの非限定的例は、引用によりその全体として本明細書に包含させる、Gietz et al., Yeast transformation can be conducted by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Mol Biol. 2006;313:107-20に記載される。宿主細胞を、当業者により理解される何らかの適当な条件下で培養し得る。例えば、当分野で知られるあらゆる培地、温度およびインキュベーション条件が使用され得る。誘導型ベクターを担持する宿主細胞について、細胞を、発現を促進する適切な誘導剤と培養し得る。
本明細書に開示の細胞のいずれも、核酸の接触および／または統合前、途中および／または、あらゆるタイプ(リッチまたは最小)およびあらゆる組成の培地で培養できる。培養条件または培養過程は、当業者により理解されるとおり、慣用の実験により最適化され得る。ある実施態様において、選択培地は種々の成分が添加される。ある実施態様において、補助的成分の濃度および量は、最適化される。ある実施態様において、培地および増殖条件(例えば、ｐＨ、温度など)の他の態様は、慣用の実験により最適化される。ある実施態様において、培地に１以上の補助的成分を添加する頻度および細胞を培養する時間は最適化される。
本明細書に記載する細胞の培養は、当分野で知られ、かつ使用される培養容器で実施できる。ある実施態様において、通気した反応器(例えば、撹拌タンクリアクター)を細胞の培養に使用する。ある実施態様において、バイオリアクターまたは発酵槽を細胞の培養に使用する。故に、ある実施態様において、細胞は、発酵で使用される。本明細書で使用する、用語「バイオリアクター」および「発酵槽」は相互交換可能に使用され、生存生物、生存生物の一部または精製酵素が関与する、生物学的、生化学的および／または化学的反応が行われるハウジングまたは部分的ハウジングをいう。「大規模バイオリアクター」または「工業的規模バイオリアクター」は、商業的または準商規模で生産物を産生するのに使用するバイオリアクターをいう。大規模バイオリアクターは、一般に数リットル、数百リットル、数千リットルまたはそれ以上の範囲の体積を有する。
バイオリアクターの非限定的例は、撹拌タンク発酵槽、回転混合デバイスで撹拌されているバイオリアクター、ケモスタット、振盪デバイスで撹拌されているバイオリアクター、気泡ポンプ発酵槽、充填床リアクター、固定床リアクター、流動床バイオリアクター、波誘発撹拌を用いるバイオリアクター、遠心性バイオリアクター、ローラーボトルおよび中空繊維バイオリアクター、ローラー装置(例えばベンチトップ、カート搭載および／または自動化改変種)、垂直積層プレート、スピナーフラスコ、撹拌またはロッキングフラスコ、振盪多ウェルプレート、ＭＤボトル、Ｔ－フラスコ、Ｒｏｕｘボトル、多表面組織培養プロパゲーター、修飾発酵槽および被覆ビーズ(例えば、細胞接着阻止のために血清タンパク質、ニトロセルロースまたはカルボキシメチルセルロースで被覆されたビーズ)を含む。
ある実施態様において、バイオリアクターは、細胞(例えば、酵母細胞)が動いている液体および／または気泡と接触する細胞培養系を含む。ある実施態様において、細胞または細胞培養物は懸濁液で増殖される。他の実施態様において、細胞または細胞培養物は、固相担体に結合される。担体系の非限定的例は、マイクロ担体(例えば、多孔性または非多孔性であり得るポリマースフェア、マイクロビーズおよびマイクロディスク)、特定の化学基(例えば、三級アミン基)で荷電された架橋ビーズ(例えば、デキストラン)、非多孔性ポリマー繊維に捕捉された細胞を含む２Ｄマイクロ担体、３Ｄ担体(例えば、担体繊維、中空繊維、多カートリッジリアクターおよび多孔性繊維を含み得る半透膜)、イオン交換能が低減したマイクロ担体、封入細胞、キャピラリーおよび凝集体を含む。ある実施態様において、担体は、デキストラン、ゼラチン、ガラスまたはセルロースなどの材料から製作される。
ある実施態様において、工業的規模過程を、連続的、半連続的または非連続的モードで操作する。操作モードの非限定的例は、バッチ、流加、拡張バッチ、反復バッチ、排出／充填、回転壁、回転フラスコおよび／または潅流モードの操作である。ある実施態様において、バイオリアクターは、基質ストック、例えば炭水化物源の連続的または半連続的補充および／またはバイオリアクターからの生成物の連続的または半連続的分離を可能にする。
ある実施態様において、バイオリアクターまたは発酵槽は、反応パラメータを測定および／または調節するためのセンサーおよび／または制御系を含む。反応パラメータの非限定的例は、生物学的パラメータ(例えば、増殖速度、細胞サイズ、細胞数、細胞密度、細胞型または細胞状態など)、化学パラメータ(例えば、ｐＨ、酸化還元電位、反応基質および／または生成物濃度、酸素濃度およびＣＯ２濃度などの溶解ガス濃度、栄養素濃度、代謝物濃度、オリゴペプチド濃度、アミノ酸濃度、ビタミン濃度、ホルモン濃度、添加剤濃度、血清濃度、イオン強度、イオン濃度、相対湿度、モル濃度、モル浸透圧濃度、他の化学物質、例えば緩衝剤、アジュバントまたは反応副産物の濃度)、物理的／機械的パラメータ(例えば、密度、伝導性、撹拌の程度、圧力および流速、剪断応力、剪断速度、粘性、色、濁度、光吸収、混合速度、変換速度ならびに温度、光強度／質などの熱力学パラメータなど)を含む。本明細書に記載のパラメータを測定するセンサーは、関連する機械および電子分野の当業者に周知である。本明細書に記載のセンサーからの入力に基づきバイオリアクターのパラメータを調節する制御系は、バイオリアクター工学の分野の当業者に周知である。
ある実施態様において、方法はバッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)を含む。バッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)の一般的懸念は、酸素およびグルコースのレベルを含む。例えば、バッチ発酵(例えば、振盪フラスコ発酵)は、酸素およびグルコースを限定してよく、よって、ある実施態様において、株が適切に設計された流加発酵において実行する能力は過小評価されている。また、最終産物(例えば、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド前駆体またはモグロシド)は、溶解度、毒性、細胞蓄積および分泌の観点で基質(例えば、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド前駆体またはモグロシド)とある程度異なり得て、ある実施態様において異なる発酵動態を有し得る。
本明細書に記載する方法は、組み換え細胞、細胞ライセートまたはＣ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、ＣＤＳおよびＵＧＴを含む単離組み換えポリペプチドを使用する、モグロール前駆体(例えば、スクアレン、２,３－オキシドスクアレンまたは２４－２５エポキシ－ククルビタジエノール)、モグロールまたはモグロシド(例えば、ＭＩＡ１、ＭＩＥ１、ＭIIＡ１、ＭIIＡ２、ＭIIIＡ１、ＭIIＥ、ＭIII、シアメノシドＩ、モグロシドIV、イソモグロシドIV、ＭIIIＥおよびモグロシドＶ)の産生を包含する。
本明細書に開示の組み換え細胞の何れかにより産生されたモグロール前駆体(例えば、スクアレン、２,３－オキシドスクアレンまたは２４－２５エポキシ－ククルビタジエノール)、モグロール、モグロシド(例えば、ＭＩＡ１、ＭＩＥ、ＭIIＡ１、ＭIIＡ２、ＭIIIＡ１、ＭIIＥ、ＭIII、シアメノシドＩ、モグロシドIV、イソモグロシドIV、ＭIIIＥおよびモグロシドＶ)は、当分野で知られる何らかの方法を使用して同定および抽出され得る。マススペクトロメトリー(例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ)は、同定方法の非限定的例であり、目的の化合物の抽出の一助として使用し得る。
本明細書において使用する表現および用語は、説明の目的であり、限定としてみなしてはならない。本明細書における「含む」、「包含する」、「有する」、「含有する」、「関与する」などの用語および／またはこれらのバリエーションは、その前に挙げられた項目ならびにさらなる項目を包含することを意味する。
本発明を次の実施例によりさらに説明し、これは、決してさらなる限定と解釈されてはならない。本明細書をとおして引用する全引用文献(文献引用文献、登録特許、公開特許出願および同時係属特許出願)の内容全体は、引用により明示的に本明細書に包含させる。
実施例１：モグロール産生のためのＣ１１ヒドロキシラーゼの同定
Ｃ１１ヒドロキシラーゼスクリーニングライブラリーの開発
モグロール産生に有用であり得るＣ１１ヒドロキシラーゼを同定するためのスクリーニングを実施した。１,１９０タンパク質を含むライブラリーを、標的産物モグロールについてインビボでスクリーニングした。ライブラリーは、単一置換変異およびシグナル認識粒子(ＳＲＰ)依存性シグナルペプチドおよび膜貫通ドメイン(ＴＭ)－ＣＹＰ５４９１融合体を含む、ＣＹＰ５４９１のバリアントを含んだ(例えば、図２Ｂに記載)。ライブラリーは、ＣＹＰ５４９１の近縁ホモログも含んだ。
ＣＹＰ５４９１の活性部位をターゲティングする単一置換変異について、３７残基がモデル化ラノステロール周辺で同定された(図４Ａ～４Ｂ)。ラノステロールはモグロールに化学的に類似し、ＣＹＰ５４９１相同性モデルの活性部位においてモデル化された。ラノステロールと相互作用するまたは相互作用を促進すると仮定された残基を、系統的変異導入法のために選択した。これら残基の飽和変異誘発を実施した。タンパク質安定化変異は、ロゼッタによる安定化効果を有することが示された単一アミノ酸置換を含んだ。ロゼッタ安定化変異を作るために変異させるべき位置を同定するために、複数配列アラインメントにおける保存に基づき、位置を選択した。ロゼッタエネルギー計算を使用して、コンピュータで観察変異をスクリーニングした。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼライブラリープラスミド構造を図２Ｃに示す。プロモーター(約７００bp)およびターミネーター(約２５０bp)を、ゲノム組込みのための相同性アームとして使用した。
出芽酵母(S. cerevisiae)宿主細胞を、スクリーニングに使用した。宿主細胞基本株を、ＣＹＰ１７９８、ＡｔＣＰＲ１、ＣＰＲ４４９７、ｓｇＣＤＳ、ＥＰＨ３およびａｔＥＰＨ２の１以上のコピーを発現するならびにＥＲＧ９およびＥＲＧ１の発現を上方制御するおよびＥＲＧ７の発現を下方制御するように操作した。基本株は、ゲノムに統合された数コピーのｐＰＧＫ１＿Ｘ＿ｔＳＳＡ１も有した。「Ｘ」は、２４bpであり、配列GATGCACGAGCGCAACGCTCACAA(配列番号４１５)を有するＦ－Ｃｐｈ１認識部位に対応する。
ＣＹＰ５４９１を、Ｐ４５０スクリーニングの陽性対照として使用した。図３に示す対照株は、複数コピーのＣＹＰ５４９１を含む。対照株は、ＣＤＳ、ＥＰＨ、２個のシトクロムＰ４５０レダクターゼおよび上方制御されたＳＱＥも含む。ＣＹＰ５４９１のコピーがない基本株を陰性対照として使用した。P450基本株－１をライブラリースクリーニングに使用した。
試験する各候補Ｃ１１ヒドロキシラーゼについて、複数コピーの候補Ｃ１１ヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチド配列を、出芽酵母(S. cerevisiae)宿主細胞のゲノムに統合させた。細胞をＬｉＡｃ媒介形質転換を使用して、目的の構築物で形質転換した。
スクリーニング結果
Ｃ１１ヒドロキシラーゼスクリーニングライブラリーの候補は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)を含む対照基本株によるモグロールの産生より１.２倍を超えるモグロールを候補が産生したならば、ヒットと見なした。図５Ａに示すとおり、Ｃ１１ヒドロキシラーゼスクリーニングライブラリーにおける複数候補が、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の２倍を超えるモグロール産生をもたらした。図５Ｂは、ヒットと見なしたライブラリーの６６メンバーを示す。６６ヒットおよびこのスクリーニングで対照株に類似した性能であった５個のさらなる候補を、その後、４複製で他のライブラリースクリーニングした。対照株に類似した性能であったさらなる候補を、アッセイ検証のために加えた。初期スクリーニングのヒットを確認した(例えば、下表３参照)。
図６は、２つのスクリーニング間の比較を示す。トップヒットは、両スクリーニングで一致した。
活性部位変異体について、ヒットは、２０の特有の位置で同定され、うち６か所は少なくとも２個の変異で同定された。変異ホットスポットは、活性部位入口付近およびヘム基周囲で同定された。これら実験において、残基は、その残基で置換を有する複数の異なるバリアントが活性利益を示したならば、変異ホットスポットと指定した。野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)に対するＣＹＰ５４９１活性部位変異体のモグロール産生増加倍率の測定を表３に示す。
表４は、シグナルペプチドおよびＣＹＰ５４９１融合体の核酸およびアミノ酸配列ならびに野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)に対するＣＹＰ５４９１融合体のモグロール産生増加倍率を示す。
ＥＲＧ１１からのシグナルペプチドを含むＣＹＰ５４９１融合体が、本スクリーニングにおいてヒットとして同定された。ＣＹＰ５４９１融合体は、ＥＲＧ１１からの最初の２５アミノ酸残基および野生型ＣＹＰ５４９１からの残基３～４７３を含んだ。このＥＲＧ１１ Ｎ末端－ＣＹＰ５４９１融合体のアミノ酸配列を配列番号２８０として提供する。
Figure 2022553065000006
Figure 2022553065000007
Figure 2022553065000008
＊ヌクレオチド配列(nt)は、各配列の最後に停止コドン(「ｔａａ」)をさらに含み、それは示していない。
実施例２. 変異体ＣＹＰ５４９１融合体の産生および特徴づけ
シグナルペプチドおよび点変異ストラテジーを合わせて、変異体ＣＹＰ５４９１融合体が、野生型ＣＹＰ５４９１融合体および変異体ＣＹＰ５４９１タンパク質単独に比してＣ１１ヒドロキシラーゼ活性を増加させるか否かを決定した。実施例１に記載するＣ１１ヒドロキシラーゼスクリーニングにおいて、ヒットの＞８０％は、活性部位単一変異体およびシグナルペプチド最適化デザインからであった。上位２個のシグナルペプチド融合体および上位３個の点変異を合わせて、６個の新しい変異体融合体を産生した。各変異体融合体は、別々に、実施例１に記載する基本宿主細胞株で試験した。複数コピーの各変異体融合体を宿主細胞のゲノム株に統合した。変異体ＣＹＰ５４９１融合体のアミノ酸およびヌクレオチド配列を下表５に示す。表５において、シグナルペプチド「|P53903|PGA2|Processing of GAS1 and ALP protein 2|d23-129」は、ＰＧＡ２のシグナルペプチド(ＰＧＡ２の残基１～２２(UniprotKB Accession No. P53903)を融合に使用したことを意味し、一方シグナルペプチド「|Q07451|YET3|Endoplasmic reticulum transmembrane protein 3|d7-203」は、ＹＥＴ３のシグナルペプチド(ＹＥＴ３の残基１～６(UniprotKB Accession No. Q07451))を融合に使用したことを意味した。表５の「融合」カラムにおけるアミノ酸置換は、野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)における示すアミノ酸に対応する残基でのアミノ酸置換を意味する。
図７は、ＰＧＡ２またはＹＥＴ３のシグナルペプチドが、点変異Ｔ３５１Ｍを含むＣＹＰ５４９１タンパク質の活性をさらに改善することを示す。
Ｃ１１ヒドロキシラーゼ基本株－３が基本株－１、基本株－２または対照株より高いモグロールへの流動を示したため、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ基本株－３を、点変異またはシグナルペプチドがＣＹＰ５４９１の特異性を変化するかの決定に使用した。図８に示すとおり、点変異Ｔ３５１Ｍは、モグロール／オキソモグロール比を増加させ、点変異Ｔ３５１Ｍがモグロールを産生する活性および特異性を改善することを示す。
基本株－３のバックグラウンドにＴ３５１Ｍと共にＰＧＡ２ ｄ ２３－１２９／ＹＥＴ３ ｄ ７－２０３シグナルペプチドを含む変異体Ｐ４５０融合体は、９６ウェルプレートアッセイにおいて、プラスミド担持対照株より約２倍高いモグロール力価をもたらした。対照株は、ＣＤＳ、２個のＥＰＨ、Ｃ１１－ヒドロキシラーゼ、２個のシトクロムＰ４５０レダクターゼおよび上方制御されたＳＱＥを含む。
実施例３：モグロール前駆体、モグロールまたはモグロシドを産生するための組み換えタンパク質の組み合わせ
本発明の組み換えタンパク質を、組み合わせて使用して、モグロール前駆体(例えば、２－３－オキシドスクアレン、２,３,２２,２３－ジオキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４、２５－エポキシククルビタジエノール、２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノール)、モグロールまたはモグロシド(例えば、モグロシドＩ－Ａ１(ＭＩＡ１)、モグロシドＩ－Ｅ(ＭＩＥ)、モグロシドII－Ａ１(ＭIIＡ１)、モグロシドIII－Ａ１(ＭIIIＡ１)、モグロシドII－Ｅ(ＭIIＥ)、モグロシドIII(ＭIII)、シアメノシドＩ、モグロシドIV、モグロシドIII－Ｅ(ＭIIIＥ)、モグロシドＶおよびモグロシドVI)を産生する。
例えば、モグロールを産生するために、ＳＱＥ、ＣＤＳ、ＥＰＨおよびＣ１１ヒドロキシラーゼなどの酵素をコードする遺伝子を酵母細胞で発現させる。いくつかの例において、シトクロムＰ４５０レダクターゼも酵母細胞で発現させる。適当なＳＱＥ、ＥＰＨ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼおよびシトクロムＰ４５０レダクターゼの非限定的例を、表４～７に提供する。ＣＤＳの非限定的例を表８に提供する。モグロールをＬＣ－ＭＳを使用して、定量できる。酵母細胞でＵＧＴをさらに発現させて、モグロシドを産生する。ＵＧＴの非限定的例を表９に提供する。
あるいは、組み換えタンパク質を宿主細胞から精製して、モグロールを宿主細胞の外で産生する。組み換えタンパク質を、スクアレンを含む反応緩衝液に逐次的にまたは同時に加える。
実施例４：本発明に関連する核酸およびタンパク質配列
Figure 2022553065000009
Figure 2022553065000010
Figure 2022553065000011
Figure 2022553065000012
Figure 2022553065000013
等価物
当業者は、本明細書に記載する特定の本発明の実施態様の多くの等価物を認識するかまたは、日常的を超えない実験を使用して確認できる。このような等価物は、添付する特許請求の範囲に包含されることが意図される。
本明細書に開示する特許文献を含む多くの引用文献は、特に、本明細書で参照されている開示について、引用により全体として本明細書に包含させる。
本明細書に開示する配列は、分泌シグナルを含むことも含まないこともあることは認識される。本明細書に開示される配列は、分泌シグナルを伴うまたは伴わないバージョンを包含する。本明細書に開示するタンパク質配列は、開始コドン(Ｍ)を含んでまたは含まずに記載され得ることも理解される。本明細書に開示する配列は、開始コドンを伴うまたは伴わないバージョンを含む。したがって、いくつかの例においてアミノ酸ナンバリングは、開始コドンを含むタンパク質配列に対応するかもしれず、一方他の例において、アミノ酸ナンバリングは、開始コドンを含まないタンパク質配列に対応するかもしれない。本明細書に記載する配列は、停止コドンを含んでまたは含まずに記載され得ることも理解される。本明細書に記載する配列は、停止コドンを伴うまたは伴わないバージョンを含む。本発明のある態様は、本明細書に記載する配列およびそのフラグメントを含む宿主細胞を含む。

Claims (53)

  1. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質を発現する宿主細胞であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が
    ａ)
    (ｉ)配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列；または
    (ii)配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列にして２個までのアミノ酸置換、欠失または挿入を有する配列
    を含むシグナル配列；および
    ｂ)Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインを含む配列
    を含む、宿主細胞。
  2. シグナル配列が配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列を含む、請求項１の宿主細胞。
  3. (ｂ)における配列が野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１または２の宿主細胞。
  4. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインが野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２～２８に対応する残基を含む、請求項１～３の何れかの宿主細胞。
  5. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の触媒ドメインを含む配列が野生型ＣＹＰ５４９１の触媒ドメイン(配列番号２０８の残基２９～４７３)に比して触媒ドメインに１アミノ酸置換、欠失または挿入を含む、請求項１～４の何れかの宿主細胞。
  6. アミノ酸置換、欠失または挿入がＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の基質結合ドメインに位置する、請求項５の宿主細胞。
  7. アミノ酸置換、欠失または挿入がヘム基に結合するループに位置する、請求項６の宿主細胞。
  8. 野生型ＣＹＰ５４９１の配列(配列番号２０８)に比して、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素がＣＹＰ５４９１における残基Ｓ４９；Ｖ５７；Ｌ７６；Ａ８５；Ｄ１０７；Ｌ１０９；Ｆ１１２；Ｔ１１７；Ｗ１１９；Ｌ１２０；Ａ１４０；Ｆ１４７；Ｓ１５５；Ｈ１６０；Ｋ１８５；Ｌ２１０；Ｓ２１１；Ｌ２１２；Ａ２８２；Ｄ２９９；Ｖ３５０；Ｔ３５１；Ａ３５３；Ｌ３５４；Ｍ３７６；Ｉ４５８；および／またはＴ４７０に対応する残基にアミノ酸置換を含む、請求項１～７の宿主細胞。
  9. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が
    ａ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ４９に対応する残基にＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、ＭまたはＬ；
    ｂ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＶ５７に対応する残基にＡ；
    ｃ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ７６に対応する残基にＩまたはＶ；
    ｄ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ８５に対応する残基にＳ；
    ｅ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＤ１０７に対応する残基にＰまたはＲ；
    ｆ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ１０９に対応する残基にＡ、Ｃ、Ｆ、ＷまたはＹ；
    ｇ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＦ１１２に対応する残基にＴまたはＷ；
    ｈ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ１１７に対応する残基にＧ；
    ｉ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＷ１１９に対応する残基にＲ；
    ｊ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ１２０に対応する残基にＨまたはＮ；
    ｋ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ１４０に対応する残基にＰ；
    ｌ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＦ１４７に対応する残基にＬ；
    ｍ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ１５５に対応する残基にＡ；
    ｎ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＨ１６０に対応する残基にＥ；
    ｏ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＫ１８５に対応する残基にＨ；
    ｐ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ２１０に対応する残基にＳ；
    ｑ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ２１１に対応する残基にＮ；
    ｒ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ２１２に対応する残基にＦ；
    ｓ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ２８２に対応する残基にＶ；
    ｔ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＤ２９９に対応する残基にＡ；
    ｕ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＶ３５０に対応する残基にＦ、Ｉ、ＬまたはＭ；
    ｖ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ３５１に対応する残基にＬまたはＭ；
    ｗ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ３５３に対応する残基にＧ；
    ｘ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ３５４に対応する残基にＶまたはＩ；
    ｙ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＭ３７６に対応する残基にＡまたはＣ；
    ｚ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＩ４５８に対応する残基にＰ；および／または
    ａａ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ４７０に対応する残基にＥを含む、
    請求項８の宿主細胞。
  10. 宿主細胞がさらに上方制御されたスクアレンエポキシダーゼ、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)および／または少なくとも１個のエポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)を含む、請求項１～９の何れかの宿主細胞。
  11. 宿主細胞が上方制御されたスクアレンシンターゼ、下方制御されたラノステロールシンターゼ、少なくとも１個の他のＣ１１ヒドロキシラーゼおよび／または少なくとも２個のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む、請求項１０の宿主細胞。
  12. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに統合される、請求項１～１１の何れかの宿主細胞。
  13. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列がプラスミドで発現される、請求項１～１２の何れかの宿主細胞。
  14. 複数コピーのＣ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに統合される、請求項１２の宿主細胞。
  15. スクアレンシンターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、少なくとも１個の他のＣ１１ヒドロキシラーゼ、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のＣＤＳおよび／または少なくとも１個のＥＰＨをコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに統合される、請求項１０～１４の何れかの宿主細胞。
  16. 宿主細胞がモグロールを産生する、請求項１０～１５の何れかの宿主細胞。
  17. 宿主細胞が対照宿主細胞と比較して、少なくとも１.１倍多いモグロールを産生し、ここで、対照宿主細胞が野生型ＣＹＰ５４９１を含む、請求項１０～１６の何れかの宿主細胞。
  18. 宿主細胞が宿主細胞により産生されない１以上のモグロール前駆体が実質的にない細胞培養培地で培養され得る、請求項１６または１７の宿主細胞。
  19. 宿主細胞がモグロール／１１－オキソモグロールの２より大きい比をもたらすことができる、請求項１６～１８の何れかの宿主細胞。
  20. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１７～１９の何れかの宿主細胞。
  21. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素を含む宿主細胞であって、該Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)に少なくとも９０％同一であり、ＣＹＰ５４９１における残基Ｓ４９；Ｖ５７；Ｌ７６；Ａ８５；Ｄ１０７；Ｌ１０９；Ｆ１１２；Ｔ１１７；Ｗ１１９；Ｌ１２０；Ａ１４０；Ｆ１４７；Ｓ１５５；Ｈ１６０；Ｋ１８５；Ｌ２１０；Ｓ２１１；Ｌ２１２；Ａ２８２；Ｄ２９９；Ｖ３５０；Ｔ３５１；Ａ３５３；Ｌ３５４；Ｍ３７６；Ｉ４５８；および／またはＴ４７０に対応する１以上の残基にアミノ酸置換を含むものである、宿主細胞。
  22. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が
    ａ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ４９に対応する残基にＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、ＭまたはＬ；
    ｂ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＶ５７に対応する残基にＡ；
    ｃ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ７６に対応する残基にＩまたはＶ；
    ｄ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ８５に対応する残基にＳ；
    ｅ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＤ１０７に対応する残基にＰまたはＲ；
    ｆ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ１０９に対応する残基にＡ、Ｃ、Ｆ、ＷまたはＹ；
    ｇ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＦ１１２に対応する残基にＴまたはＷ；
    ｈ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ１１７に対応する残基にＧ；
    ｉ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＷ１１９に対応する残基にＲ；
    ｊ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ１２０に対応する残基にＨまたはＮ；
    ｋ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ１４０に対応する残基にＰ；
    ｌ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＦ１４７に対応する残基にＬ；
    ｍ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ１５５に対応する残基にＡ；
    ｎ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＨ１６０に対応する残基にＥ；
    ｏ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＫ１８５に対応する残基にＨ；
    ｐ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ２１０に対応する残基にＳ；
    ｑ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＳ２１１に対応する残基にＮ；
    ｒ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ２１２に対応する残基にＦ；
    ｓ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ２８２に対応する残基にＶ；
    ｔ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＤ２９９に対応する残基にＡ；
    ｕ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＶ３５０に対応する残基にＦ、Ｉ、ＬまたはＭ；
    ｖ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ３５１に対応する残基にＬまたはＭ；
    ｗ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＡ３５３に対応する残基にＧ；
    ｘ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＬ３５４に対応する残基にＶまたはＩ；
    ｙ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＭ３７６に対応する残基にＡまたはＣ；
    ｚ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＩ４５８に対応する残基にＰ；および／または
    ａａ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)のＴ４７０に対応する残基にＥを含む、
    請求項２１の宿主細胞。
  23. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が
    ａ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ４９に対応する残基にフェニルアラニン(Ｆ)またはロイシン(Ｌ)；および／または
    ｂ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ３５１に対応する残基にメチオニン(Ｍ)を含む、請求項２２の宿主細胞。
  24. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるシグナル配列を含むＣ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質として発現される、請求項２１～２３の何れかの宿主細胞。
  25. シグナル配列が配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列を含む、請求項２４の宿主細胞。
  26. 宿主細胞がさらに上方制御されたスクアレンエポキシダーゼ、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のククルビタジエノールシンターゼ(ＣＤＳ)および／または少なくとも１個のエポキシドヒドロラーゼ(ＥＰＨ)を含む、請求項２１～２５の何れかの宿主細胞。
  27. 宿主細胞が上方制御されたスクアレンシンターゼ、下方制御されたラノステロールシンターゼ、少なくとも１個の他のＣ１１ヒドロキシラーゼおよび／または少なくとも２個のシトクロムＰ４５０レダクターゼを含む、請求項２６の宿主細胞。
  28. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに統合されるまたはＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列がプラスミドに発現される、請求項２１～２７の何れかの宿主細胞。
  29. 複数コピーのＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに統合される、請求項２８の宿主細胞。
  30. スクアレンシンターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、少なくとも１個の他のＣ１１ヒドロキシラーゼ、少なくとも１個のシトクロムＰ４５０レダクターゼ、少なくとも１個のＣＤＳおよび／または少なくとも１個のＥＰＨをコードする少なくとも１個のヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムに統合される、請求項２７～２９の何れかの宿主細胞。
  31. 宿主細胞がモグロールを産生する、請求項２６～３０の何れかの宿主細胞。
  32. 宿主細胞が対照宿主細胞と比較して１.１倍多いモグロールを産生し、ここで、対照宿主細胞が野生型ＣＹＰ５４９１を含む、請求項２６～３１の何れかの宿主細胞。
  33. 宿主細胞が宿主細胞により産生されない１以上のモグロール前駆体が実質的にない細胞培養培地で培養され得る、請求項２６～３２の何れかの宿主細胞。
  34. 宿主細胞がモグロール／１１－オキソモグロールの２より大きい比をもたらすことができる、請求項３１～３３の何れかの宿主細胞。
  35. 請求項１～３４の何れかの宿主細胞を培養することを含む、モグロールを産生する方法。
  36. 宿主細胞がスクアレン、２－３－オキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２－３、２２,２３－ジエポキシスクアレン、２４,２５－エポキシ－ククルビタジエノールおよび２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノールから選択されるモグロール前駆体の存在下で培養される、請求項３５の方法。
  37. 宿主細胞が宿主細胞により産生されない１以上のモグロール前駆体が実質的にない培地で培養される、請求項３５の方法。
  38. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質を含む宿主細胞であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質がＥＲＧ１１のシグナル配列およびＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインをコードする配列を含むものである、宿主細胞。
  39. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基３～５０４を含む、請求項３８の宿主細胞。
  40. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が配列番号２８０に少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項３８または３９の宿主細胞。
  41. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質であって、ここで、該融合タンパク質が
    ａ)配列番号２２６、配列番号２２０または配列番号２０９～２１９、２２１～２２５または２２７～２３２から選択される配列と少なくとも９０％同一であるシグナル配列およびＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインをコードする配列；または
    ｂ)ＥＲＧ１１の最初の２５アミノ酸およびＣ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインをコードする配列
    を含むものである、タンパク質。
  42. モグロールを産生する方法であって、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素と
    (ａ)モグロールを産生するための２４,２５－ジヒドロキシククルビタジエノール；
    (ｂ)１１－ヒドロキシククルビタジエノールを産生するためのククルビタジエノール；および／または
    (ｃ)１１－ヒドロキシ－２４,２５－エポキシククルビタジエノールを産生するための２４,２５－エポキシククルビタジエノール
    を接触させることを含み、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が配列番号２０８に少なくとも９０％同一であり、配列番号２０８に比して少なくとも１個のアミノ酸置換を含むものである、方法。
  43. 野生型ＣＹＰ５４９１の配列(配列番号２０８)に比して、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)における残基Ｓ４９；Ｖ５７；Ｌ７６；Ａ８５；Ｄ１０７；Ｌ１０９；Ｆ１１２；Ｔ１１７；Ｗ１１９；Ｌ１２０；Ａ１４０；Ｆ１４７；Ｓ１５５；Ｈ１６０；Ｋ１８５；Ｌ２１０；Ｓ２１１；Ｌ２１２；Ａ２８２；Ｄ２９９；Ｖ３５０；Ｔ３５１；Ａ３５３；Ｌ３５４；Ｍ３７６；Ｉ４５８；および／またはＴ４７０に対応する残基にアミノ酸置換を含む、請求項４２の方法。
  44. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が
    ａ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ４９に対応する残基にＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、ＭまたはＬ；
    ｂ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＶ５７に対応する残基にＡに
    ｃ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ７６に対応する残基にＩまたはＶに
    ｄ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ８５に対応する残基にＳに
    ｅ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＤ１０７に対応する残基にＰまたはＲに
    ｆ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ１０９に対応する残基にＡ、Ｃ、Ｆ、ＷまたはＹに
    ｇ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＦ１１２に対応する残基にＴまたはＷに
    ｈ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ１１７に対応する残基にＧに
    ｉ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＷ１１９に対応する残基にＲに
    ｊ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ１２０に対応する残基にＨまたはＮに
    ｋ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ１４０に対応する残基にＰに
    ｌ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＦ１４７に対応する残基にＬに
    ｍ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ１５５に対応する残基にＡに
    ｎ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＨ１６０に対応する残基にＥに
    ｏ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＫ１８５に対応する残基にＨに
    ｐ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ２１０に対応する残基にＳに
    ｑ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＳ２１１に対応する残基にＮに
    ｒ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ２１２に対応する残基にＦに
    ｓ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ２８２に対応する残基にＶに
    ｔ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＤ２９９に対応する残基にＡに
    ｕ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＶ３５０に対応する残基にＦ、Ｉ、ＬまたはＭに
    ｖ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ３５１に対応する残基にＬまたはＭに
    ｗ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＡ３５３に対応する残基にＧに
    ｘ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＬ３５４に対応する残基にＶまたはＩに
    ｙ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＭ３７６に対応する残基にＡまたはＣに
    ｚ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＩ４５８に対応する残基にＰにおよび／または
    ａａ)野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)におけるＴ４７０に対応する残基にＥを含む、
    請求項４２または４３の宿主細胞。
  45. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素が精製タンパク質である、請求項４２～４４の何れかの方法。
  46. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質を含む宿主細胞であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が
    ａ)ＫＡＲ２、ＮＣＰ１、ＥＲＰ２、ＲＢＤ２、ＳＮＡ３、ＳＰＣ２、ＮＨＸ１、ＰＧＡ２、ＧＲＸ６、ＹＬＲ４１３Ｗ、ＹＪＬ０６２Ｗ、ＭＳＣ２、ＥＭＣ５、ＣＨＯ２、ＩＦＡ３８、ＳＵＲ２、ＩＰＴ１、ＹＥＴ３、ＹＰＬ１６２Ｃ、ＥＲＧ１１、ＳＲＰ１０２、ＧＵＰ１、ＣＢＲ１またはＹＨＲ１３８Ｃのシグナル配列；および
    ｂ)Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の膜貫通ドメインおよび触媒ドメインをコードする配列
    を含むものである、宿主細胞。
  47. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質を含む宿主細胞であって、ここで、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０の何れかと少なくとも９０％同一であるものである、宿主細胞。
  48. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０の何れかと少なくとも９８％同一である、請求項４７の宿主細胞。
  49. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０の何れかと少なくとも９９％同一である、請求項４７または４８の宿主細胞。
  50. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ融合タンパク質が配列番号３０５または３０８、配列番号２５７～２８０または配列番号３０６～３０７または配列番号３０９～３１０の何れかを含む、請求項４７～４９の何れかの宿主細胞。
  51. 配列がＰＧＡ２｜ｄ２３－１２９＿ＣＹＰ５４９１－Ｔ３５１Ｍ(配列番号３０５)である、請求項５０の宿主細胞。
  52. 請求項４６～５１の何れかの宿主細胞を培養することを含む、方法。
  53. Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素の触媒ドメインが野生型ＣＹＰ５４９１(配列番号２０８)の残基２９～４７３に対応する残基を含む、請求項１～２０の何れかの宿主細胞。
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