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JP2023120219A - Ａｌａｓ１遺伝子の発現を阻害する組成物および方法 - Google Patents

Ａｌａｓ１遺伝子の発現を阻害する組成物および方法 Download PDF

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Bettencourt Brian
ケビン・フィッツジェラルド
Fitzgerald Kevin
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Querbes William
ロバート・ジェイ・デスニック
J Desnick Robert
マキコ・ヤスダ
Makiko Yasuda
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Abstract

【課題】本発明は、ＡＬＡＳ１遺伝子を標的にする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物と、このようなｄｓＲＮＡ組成物を使用してＡＬＡＳ１の発現を変化させる（例えば阻害する）方法とを提供する。【解決手段】ＡＬＡＳ１の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡであって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記アンチセンス鎖が、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含んでなり、前記アンチセンス鎖が、特定のアンチセンス配列からの少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んでなる、ｄｓＲＮＡである。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６１／８８７２８８号明細書、および２０１４年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／９８３７２０号明細書の優先権を主張する。前述の各出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
配列表
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０１４年１０月２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２０３８－７２０２ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名されて、サイズは１，１０７，４８６バイトである。
本発明は、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現の特異的阻害に関する。
遺伝性ポルフィリン症は、本明細書ではポルフィリン経路とも称される、ヘム生合成経路における特異的酵素の活性欠乏に起因する一群の障害である。ポルフィリン経路の酵素の欠乏は、不十分なヘム産生をもたらし、また高濃度では組織に有毒なポルフィリン前駆体およびポルフィリンの蓄積をもたらす。
遺伝性ポルフィリン症の内、急性間欠性ポルフィリン症（例えば常染色体優性ＡＩＰなどのＡＩＰ）、異型ポルフィリン症（例えば常染色体優性ＶＰなどのＶＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（例えば常染色体優性ＨＣＰなどのコプロポルフィリン症（ｃｏｐｒｏｐｏｐｈｙｒｉａ）またはＨＣＰ）、および５’アミノレブリン酸（δ－アミノレブリン酸またはＡＬＡとしてもまた知られている）デヒドラターゼ欠乏ポルフィリン症（例えば常染色体劣性ＡＤＰなどのＡＤＰ）は、急性肝性ポルフィリン症に分類され、生命に関わり得る急性神経学的発作によって顕在化する。急性発作は、重篤な腹痛、高血圧、頻脈、便秘、運動麻痺、完全麻痺、および痙攣をはじめとする、自律、辺縁、および中枢神経症状によって特徴付けられる。適切に治療されなかった場合、四肢麻痺、呼吸障害、および死亡につながることもある。チトクローム（ｃｙｔｒｏｃｈｒｏｍｅ）Ｐ４５０誘導剤、ダイエット、およびホルモン（ｈｏｒｍｏｎｏａｌ）変化をはじめとする様々な因子が、ヘム生合成経路の最初の酵素であり律速酵素である肝臓の５’－アミノレブリン酸シンターゼ１（ＡＬＡＳ１）の活性を増大させることで、急性発作を誘発し得る。急性ポルフィリン症では、例えばＡＩＰ、ＶＰ、ＨＣＰ、およびＡＤＰのそれぞれの酵素欠乏症は、１つまたは複数の物質（例えばポルフィリンおよび／またはポルフィリン前駆体、例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）の肝臓中の産生および蓄積をもたらし、それは神経毒性であり得て、急性発作発生をもたらし得る。例えば非特許文献１を参照されたい。
急性神発作に対する現行の治療法は、ＡＬＡＳ１の陰性フィードバック阻害のための外来性ヘムを提供して、その結果、ＡＬＡおよびＰＢＧの産生を低下させる、ヘミン（Ｐａｎｈｅｍａｔｉｎ（登録商標）、ＬｕｎｄｂｅｃｋまたはＮｏｒｍｏｓａｎｇ（登録商標）、Ｏｒｐｈａｎ Ｅｕｒｏｐｅ）の静脈内投与である。ヘミンは、特に月経周期におけるホルモン変化から頻繁な発作を経験する急性ポルフィリン症がある女性において、急性発作中の治療のため、そして発作予防のために使用される。患者は概して良好に応答する一方で、その効果は緩慢であり、正常レベルに向けて尿ＡＬＡおよびＰＢＧ濃度を正常化するのには、典型的に２～４日間以上かかる。静脈内ヘミンは迅速に代謝されるので、急性発作を効果的に治療または予防するのに、通常３～４回の輸液が必要である。さらに繰り返しの輸液は、鉄過負荷および静脈炎を引き起こすこともあり、それは辺縁静脈のアクセスを損なうこともある。同所（ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）肝臓移植は治癒的であるが、この処置にはかなりの疾病率および死亡率があり、肝臓ドナーの利用可能性は限られている。
Ｂａｌｗａｎｉ，ＭおよびＤｅｓｎｉｃｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｂｌｏｏｄ，１２０：４４９６－４５０４，２０１２
したがって、より効果的、かつ即効性の安全な代案の治療的アプローチが必要である。このような治療薬を皮下投与によって送達し得れば、輸液および長時間入院の必要がなくなるので、特に有利であろう。
ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）欠乏症、またはヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＨＭＢＳ）欠乏症とも称されるＡＩＰは、最も一般的な急性肝性ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａｓ）である。ＡＩＰの有病率は１００，０００人中に５～１０人と推定され、約５～１０％の患者が症候性である。ＡＩＰは、酵素活性を例えば正常の半分に低下させる、ＨＭＢＳ遺伝子中の変異によって引き起こされる、常染色体優性疾患である。以前に、野生型ＨＭＢＳ活性の約３０％を有するＡＩＰのマウスモデルが、相同組換えによって作成されている。ヒト患者と同様に、これらのマウスでは、フェノバルビタールなどのポルフィリン生成薬を投与すると、肝臓のＡＬＡＳ１活性が増大し、大量の血漿および尿ＡＬＡおよびＰＢＧが蓄積する。したがって急性肝性ポルフィリン症の新規治療薬の効能を評価するのに、これらのマウスは優れたモデルの役割を果たす。
本発明は、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を調節するための、方法およびｉＲＮＡ組成物を説明する。特定の実施形態では、ＡＬＡＳ１特異的ｉＲＮＡを使用して、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現が低下または阻害される。このような阻害は、ポルフィリン症などのＡＬＡＳ１発現関連障害を治療するのに有用であり得る。
したがって本明細書に記載されるのは、細胞中または対象中で（例えばヒト対象などの哺乳類中で）、ＡＬＡＳ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断をもたらす、組成物および方法である。例えばＸ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（Ｄｏｓｓポルフィリン症またはＡＤＰ）、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、先天性赤芽球増殖性ポルフィリン症（ＣＥＰ）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａ ｃｕｔａｎｅａ ｔａｒｄａ）（ＰＣＴ）、遺伝性コプロポルフィリン症（コプロポルフィリン症、またはＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、赤芽球増殖性プロトポルフィリン症（ＥＰＰ）、または乳児期一過性赤血球ポルフィリン症のようなポルフィリン症などの、ＡＬＡＳ１遺伝子発現関連疾患を治療するための組成物および方法についてもまた説明される。いくつかの実施形態では、疾患は、例えばＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）、ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰなどの急性肝性ポルフィリン症である。特定の実施形態では、疾患は、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）またはＡＩＰである。
実施形態では、ポルフィリン症は、例えば急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）、および肝骨髄性ポルフィリン症から選択されるポルフィリン症などの肝性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は、ホモ接合優性肝性ポルフィリン症（例えばホモ接合優性ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰ）または肝骨髄性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は二重ポルフィリン症である。
本明細書の用法では、「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡｉ剤」または「ｉＲＮＡ分子」という用語は、本明細書で定義されるＲＮＡを含有し、例えばＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じて、ＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する作用物質を指す。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、細胞または哺乳類中におけるＡＬＡＳ１の発現阻害をもたらす。
本明細書で取り上げる組成物に含まれるｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１遺伝子（例えばマウスまたはヒトＡＬＡＳ１遺伝子）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である、例えば長さが３０ヌクレオチド以下であり一般に１９～２４ヌクレオチドの領域である領域を有する、ＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有するｄｓＲＮＡを包含する（本明細書で「ＡＬＡＳ１特異的ｉＲＮＡ」とも称される）。代案としては、または組み合わせで、ｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１遺伝子（例えばＡＬＡＳ１遺伝子のヒト変種１または２）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である、長さが３０ヌクレオチド以下であり一般に１９～２４ヌクレオチドの領域である領域を有する、ＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有するｄｓＲＮＡを包含する（本明細書で「ＡＬＡＳ１特異的ｉＲＮＡ」とも称される）。
実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ヒトＡＬＡＳ１領域と実質的に相補的な領域を有するアンチセンス鎖を含んでなる。実施形態では、ヒトＡＬＡＳ１は、ＮＭ＿０００６８８．４（配列番号１）またはＮＭ＿０００６８８．５（配列番号３８２）の配列を有する。実施形態では、ヒトＡＬＡＳ１は、ＮＭ＿１９９１６６．１の配列を有する。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）のアンチセンス配列は、ＡＬＡＳ１転写物ＮＭ＿０００６８８．４上の領域８７１～８９５内（５’および／または３’末端上のどちらかの方向または双方の方向で、プラスマイナス５、４、３、２、または１個のヌクレオチド）を標的とする。実施形態では、アンチセンス配列は、ＡＬＡＳ１転写物ＮＭ＿０００６８８．４上のヌクレオチド８７１～８９３、８７１～８９２、または８７３～８９５を標的とする。実施形態では、アンチセンス配列は、ＡＬＡＳ１転写物ＮＭ＿０００６８８．４上のヌクレオチド８７１～８９３、８７１～８９２、または８７３～８９５と完全に相補的または実質的に相補的な配列を含んでなり、またはそれからなる。
一態様では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含んでなり、該アンチセンス鎖は、ＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５３）またはＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＴＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５４）の配列と３、２または１個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３）個の連続ヌクレオチドを含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖は、ＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５３）またはＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＴＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５４）の配列を含んでなる。実施形態では、センス鎖は、ＣＡＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＣＵＣＡＵＣＵＵＡ（配列番号４１５５）の配列を含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾される。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖および／または（ｉｉ）（ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３のアンチセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖を含んでなる。
一態様では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含んでなり、該アンチセンス鎖は、表２１～４０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列と３つ以下（例えば、０、１または２つ以下）のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３）個の連続ヌクレオチドを含んでなり、または表２１～４０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列の未修飾バージョン（例えば、ヌクレオチドの一部または前部が未修飾であること以外は、同一ヌクレオチド配列を有するバージョン）を含んでなる。一実施形態では、アンチセンス配列は、（ｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３のアンチセンス配列と、３つ以下（例えば、０、１または２つ以下）のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３）個の連続ヌクレオチド、または（ｉｉ）これらの配列のいずれか１つの未修飾バージョンを含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖は、ＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５３）またはＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＴＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５４）と、３つ以下（例えば、０、１または２つ以下）のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３）個の連続ヌクレオチドを含んでなる。一実施形態では、アンチセンス配列は、ＮＭ＿０００６８８．４（配列番号１）の８７１～８９３位を標的とする。実施形態では、センス鎖は、ＣＡＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＣＵＣＡＵＣＵＵＡ（配列番号４１５５）の配列を含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２、３、６、７、８、９、１４、１５、１８または２０のいずれか１つに列挙されるセンスおよび／またはアンチセンス配列でない。
一実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含んでなり、該アンチセンス鎖は、ＡＤ－６０５１９のアンチセンス配列と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、または１ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３）個の連続ヌクレオチドを含んでなる。実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾される。
一実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含んでなり、該アンチセンス鎖は、本明細書に記載されるようなＡＤ－６０４８９のアンチセンス配列またはＡＤ－６０４８９の誘導体と、３つ以下（例えば、０、１または２つ以下）のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３）個の連続ヌクレオチドを含んでなる。実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾され、例えば、ＡＤ－６０４８９の１つまたは複数の（または全ての）ヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾される。実施形態では、ＡＤ－６０４８９の誘導体は、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０９００、ＡＤ－６０９３５、ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６１１９０、ＡＤ－６１１９１、ＡＤ－６０８６５、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０８７６、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６０９０１である。実施形態では、ＡＤ－６０４８９の誘導体はＡＤ－６０５１９である。実施形態では、ＡＤ－６０４８９の誘導体はＡＤ－６１１９３である。
一実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物に対する相補性領域を含んでなり、該アンチセンス鎖は、本明細書に記載されるようなＡＤ－５８６３２の誘導体と、３つ以下（例えば、０、１または２つ以下）のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３）個の連続ヌクレオチドを含んでなる。実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾され、例えば、ＡＤ－５８６３２の１つまたは複数の（または全ての）ヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾される。実施形態では、ＡＤ－５８６３２の誘導体は、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０８８７、ＡＤ－６０９２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０９２４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０９２５、およびＡＤ－６０９２６、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８１９、ＡＤ－６１１４０、ＡＤ－６１１４１、ＡＤ－６１１４２、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６１１４３、ＡＤ－６１１４４、ＡＤ－６１１４５、ＡＤ－６１１４６、ＡＤ－６０８９２、またはＡＤ－６０４１９である。実施形態では、ＡＤ－５８６３２の誘導体は、ＡＤ－６０８１９である。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、０．０１～１ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、０．０５ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、０．０２ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、０．０１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。実施形態では、ＩＣ５０は、本明細書の実施例に記載されるようにして判定される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約１０ｍｇ／ｋｇ未満の単回用量ＥＤ５０を有する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５ｍｇ／ｋｇ未満の単回用量ＥＤ５０を有する。実施形態では、ＥＣ５０は、本明細書の実施例に記載されるようにして判定される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－５８６３２と比較して改善された活性を示す。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－６０４８９と比較して改善された活性を示す。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－５８６３２およびＡＤ－６０４８９と比較して改善された活性を示す。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（例えば、前述のｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０９００、ＡＤ－６０９３５、ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６１１９０、ＡＤ－６１１９１、ＡＤ－６０８６５、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０８７６、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０８８７、ＡＤ－６０９２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０９２４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０９２５、ＡＤ－６０９２６、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８１９、ＡＤ－６１１４０、ＡＤ－６１１４１、ＡＤ－６１１４２、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６１１４３、ＡＤ－６１１４４、ＡＤ－６１１４５、ＡＤ－６１１４６、ＡＤ－６０８９２、またはＡＤ－６０４１９である。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０９００、ＡＤ－６０９３５、ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６１１９０、ＡＤ－６１１９１、ＡＤ－６０８６５、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０８７６、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０８８７、ＡＤ－６０９２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０９２４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０９２５、ＡＤ－６０９２６、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８１９、ＡＤ－６１１４０、ＡＤ－６１１４１、ＡＤ－６１１４２、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６１１４３、ＡＤ－６１１４４、ＡＤ－６１１４５、ＡＤ－６１１４６、ＡＤ－６０８９２、またはＡＤ－６０４１９から選択される、アンチセンス配列（および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾））を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖を含んでなる。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０９００、ＡＤ－６０９３５、ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６１１９０、ＡＤ－６１１９１、ＡＤ－６０８６５、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０８７６、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０８８７、ＡＤ－６０９２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０９２４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０９２５、ＡＤ－６０９２６、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８１９、ＡＤ－６１１４０、ＡＤ－６１１４１、ＡＤ－６１１４２、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６１１４３、ＡＤ－６１１４４、ＡＤ－６１１４５、ＡＤ－６１１４６、ＡＤ－６０８９２、またはＡＤ－６０４１９から選択される、センス配列（および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾））を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖を含んでなる。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５３）またはＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＴＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５４）の配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＣＡＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＣＵＣＡＵＣＵＵＡ（配列番号４１５５）の配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖を含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾される。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０４８９のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＡＤ－６０４８９のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖（センスおよび／またはアンチセンス配列は、ＡＤ－６０４８９のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）を含んでなる。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０５１９のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＡＤ－６０５１９のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖（センスおよび／またはアンチセンス配列は、ＡＤ－６０５１９のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）を含んでなる。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６１１９３のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＡＤ－６１１９３のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖（センスおよび／またはアンチセンス配列は、ＡＤ－６１１９３のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）を含んでなる。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０８１９のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＡＤ－６０８１９のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス配列（センスおよび／またはアンチセンス配列は、ＡＤ－６０８１９のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）を含んでなる。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡが提供され、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖（または対応する未修飾アンチセンス配列）および／または（ｉｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖（または対応する未修飾アンチセンス配列）を含んでなる。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９のアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖および／または（ｉｉ）ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖および／またはセンス鎖が、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９の対応するアンチセンスおよび／またはセンス配列と、１、２、または３つのヌクレオチドが異なること以外は、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９のセンス配列からなるセンス鎖を含んでなる。
ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、およびＡＤ－６０８１９の配列および修飾は、下の表４４に示される。
Figure 2023120219000001
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖および／または（ｉｉ）（ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖のヌクレオチド配列および１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖を含んでなる。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９である。実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）が提供され、ｄｓＲＮＡは、（例えば、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３のヌクレオチド配列および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６１１９３である。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（例えば、ＡＤ－６０４８９のヌクレオチド配列および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６０４８９を含んでなり、またはそれからなる。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（例えば、ＡＤ－６０５１９のヌクレオチド配列および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６０５１９を含んでなり、またはそれからなる。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（例えば、ＡＤ－６１１９３のヌクレオチド配列および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６１１９３を含んでなり、またはそれからなる。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、（例えば、ＡＤ－６０８１９のヌクレオチド配列および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６０８１９を含んでなり、またはそれからなる。
実施形態では、ｄｓＲＮＡ（例えば、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０８１９、または本明細書の表２１～４０のいずれか１つで開示される別のｄｓＲＮＡ）は、肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを抑制して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のサイレンシングを達成するのに効果的である（例えば、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルが、例えば、未処置個体または個体群におけるレベル、例えば、ＰＢＳのみで処置された個体または個体群などの、対照の肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、または２０％以下に低下するように）。実施形態では、肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの抑制におけるｄｓＲＮＡの有効性は、例えば、本明細書の実施例に記載されるようにして、非ヒト霊長類モデルを使用して評価される。
実施形態では、ｄｓＲＮＡ（例えば、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０８１９、または本明細書の表２１～４０のいずれか１つで開示される別のｄｓＲＮＡ）は、循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを抑制して、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％のサイレンシングを達成するのに効果的である（例えば、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルが、例えば、ｄｓＲＮＡによる処置前のレベル、または未処置個体または個体群におけるレベルなどの、対照の循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、または２０％以下に低下するように）。実施形態では、循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの抑制におけるｄｓＲＮＡの有効性は、例えば、本明細書の実施例に記載されるようにして、非ヒト霊長類モデルを使用して評価される。実施形態では、循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、例えば、本明細書またはＳｅｈｇａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ（２０１２年２月９日にＫｅｙｓｔｏｎｅ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓシンポジウムにおいてポスター発表（バンクーバー、２０１２年２月７～１２日）、またはＳｅｈｇａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ，ＲＮＡ，２０：１－７、２０１３年１２月１９日にオンライン公開に記載されるように、循環細胞外ＲＮＡ検出（ｃＥＲＤ）アッセイを使用して評価される。
ｃＥＲＤ法は、あらゆる適切な生物学的サンプルに適用され得る。実施形態では、循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、例えば、血清サンプルなどの血液サンプルを使用して評価される。実施形態では、循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、尿サンプルを使用して評価される。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば、本明細書の表のいずれか１つで開示される、ＡＤ－６０４８９の誘導体である。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－６０４８９と比較して改善された活性を示す。このようないくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡはＡＤ－６０５１９である。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば、本明細書の表のいずれか１つで開示される、ＡＤ－５８６３２の誘導体である。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ－５８６３２と比較して改善された活性を示す。
実施形態では、改善された活性は、例えば本明細書の実施例に記載されるように、例えば生体外アッセイに基づく判定で、より低いＩＣ５０によって示される。
実施形態では、改善された活性は、より低い有効用量で示される。有効用量は、単回用量または複数の反復用量の投与に基づいて、判定されてもよい。実施形態では、有効用量は、単回用量ＥＤ５０に基づいて判定される。実施形態では、有効用量または単回用量ＥＤ５０は、生体内アッセイに基づいて判定される。実施形態では、生体内アッセイは、例えば、ラット、非ヒト霊長類、またはマウスなどの非ヒト動物において実施される。
実施形態では、有効用量は、例えば、本明細書の実施例に記載されるようにして、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベル（例えば、肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルおよび／または循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベル）の低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ａ ｌｅｖｅｌ ｏｆ）を得るのに必要な用量に基づいて判定される。実施形態では、循環ｍＲＮＡは、ｃＥＲＤアッセイを使用して評価される。
実施形態では、有効用量は、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベル（例えば、尿および／または血漿レベル）の低下を得るのに必要な用量に基づいて判定される。
実施形態では、有効用量は、本明細書に記載される、例えば、ポルフィリン症に伴う症状の予防または低下などの特定の治療効果を得るのに必要な用量に基づいて判定される。
実施形態では、改善された活性は、より高い肝臓ｄｓＲＮＡレベルの達成によって示される。実施形態では、ｄｓＲＮＡの単回用量（例えば、１、２．５、３、５、または１０ｍｇ／ｋｇの用量）後に、より高い肝臓レベルが得られる。実施形態では、ｄｓＲＮＡの複数用量（例えば、毎日または毎週２～１０回の１、２．５、３、５、１０ｍｇ／ｋｇの用量）が投与された後に、より高い肝臓レベルが得られる。
一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えばヒトＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ（例えば配列番号１または配列番号３８２に記載のヒトＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ）であるＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの一部と実質的に相補的な領域を有する、ＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を有する、ｄｓＲＮＡを包含する。
一実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡは、少なくとも２つの互いに相補的な配列を含む。ｉＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１転写物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と、実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補性領域は、３０ヌクレオチド以下、および少なくとも１５ヌクレオチド長である。一般に、ｉＲＮＡは１９～２４ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは１９～２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、１９～２１ヌクレオチド長であり、例えば脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）調合物などの脂質製剤形態である（例えばＬＮＰ１１調合物）。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは２１～２３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは２１～２３ヌクレオチド長で、複合体の形態であり、例えば本明細書に記載されるような１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは約１５～約２５ヌクレオチド長であり、別の実施形態では、ｉＲＮＡは約２５～約３０ヌクレオチド長である。ＡＬＡＳ１を標的とするｉＲＮＡは、本明細書に記載される方法などでアッセイすると、ＡＬＡＳ１を発現する細胞との接触時に、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％以上阻害する。一実施形態では、ＡＬＡＳ１を標的にするｉＲＮＡは、安定した核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に調合される。
一実施形態では、本明細書で取り上げるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、表２１～４０のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列と、表２１～４０の対応するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列とを含む。
本明細書で取り上げるｉＲＮＡ分子は、天然に存在するヌクレオチドを含み得て、または少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み得る。実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドとしては、ロックド核酸（ＬＮＡ）、非環式ヌクレオチド、ヘキシトールまたはヘキソース核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、ヌクレオチド上の修飾の１つまたは複数が挙げられる。一実施形態では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドとしては、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を有するヌクレオチド、そして例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはコレステリル誘導体などのリガンドに結合する末端ヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。代案としては、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチドの群から選択されてもよい。このような修飾配列は、例えば、表２１～４０で開示されるセンス配列からなる群から選択される、前記ｉＲＮＡの第１の配列、および表２１～４０で開示される対応するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列に基づき得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、野生型ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物変種を標的とし、別の実施形態では、ｉＲＮＡは、変異転写物（例えばアレル変種を保有するＡＬＡＳ１ ＲＮＡ）を標的とする。例えば、本発明で取り上げるｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１の一塩基多型（ＳＮＰ）などの多型変異体を標的とし得る。別の実施形態では、ｉＲＮＡは、野生型および変異ＡＬＡＳ１転写物の双方を標的とする。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１の特定の転写変異体（例えばヒトＡＬＡＳ１変種１）を標的とする。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、複数の転写物変種（例えばヒトＡＬＡＳ１の変種１および変種２の双方）を標的とする。
一実施形態では、本発明で取り上げるｉＲＮＡは、転写物の５’または３’非翻訳領域など、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物の非コード領域を標的とする。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、例えば炭水化物複合体などの複合体の形態であり、それは本明細書に記載されるように、標的部分および／またはリガンドの役割を果たしてもよい。一実施形態では、複合体は、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に付着する。いくつかの実施形態では、複合体は、例えば二価または三価の分枝リンカーなどのリンカーを介して付着する。
いくつかの実施形態では、複合体は、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含んでなる。このような複合体は、本明細書でＧａｌＮＡｃ複合体とも称される。いくつかの実施形態では、複合体は、例えば肝細胞、例えば肝実質細胞などの特定の細胞に、ＲＮＡｉ剤を標的化する。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、例えば二価または三価の分枝リンカーなどのリンカーを介して付着し得る。特定の実施形態では、複合体は、
Figure 2023120219000002
 である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、例えばＸがＯまたはＳである、以下の概略図に示されるリンカーなどのリンカーを介して、炭水化物複合体に付着する。
Figure 2023120219000003
いくつかの実施形態では、ＸはＯである。いくつかの実施形態では、ＸはＳである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１で定義されて下に示されるＬ９６に共役する。
Figure 2023120219000004
一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、以下の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または全てを有する：
（ｉ）例えば、固相オリゴヌクレオチド合成によって合成されるなど、化学的に合成される；
（ｉｉ）例えば、全てのヌクレオチドが２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆ修飾され、または２’－ＯＭｅおよび２’－Ｆの組み合わせで修飾されるなど、ｄｓＲＮＡ中の全てのヌクレオチドが修飾される；
（ｉｉｉ）全てのヌクレオチドが、３’－５’リン酸ジエステル結合を介して連結される；
（ｉｖ）センス鎖が、２１個のヌクレオチドを含んでなり、またはそれからなる；
（ｖ）アンチセンスセンス鎖（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）が、２３個のヌクレオチドを含んでなり、またはそれからなる；
（ｖｉ）センス鎖の３’末端に平滑末端を有する；
（ｖｉｉ）例えば、アンチセンス鎖の３’末端に２つのヌクレオチドのオーバーハングを有するなど、３’オーバーハングを有する；
（ｖｉｉｉ）３つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含有するリガンドに、共有結合的に付着する；
（ｉｘ）センス鎖の３’末端が、三分岐ＧａｌＮＡｃ部分にコンジュゲートされる（例えば、本明細書で表１に定義されるようにＬ９６と称される）。一実施形態では、３’末端は、リン酸ジエステル結合を介して三分岐ＧａｌＮＡｃ部分と連結する；
（ｘ）１つまたは複数の（例えば、４つの）ホスホロチオエート結合を含んでなる、アンチセンス鎖を有する。一実施形態では、ホスホロチオエート結合は、アンチセンス鎖の３’末端および５’末端に位置する。一実施形態では、２つのホスホロチオエート結合は、３’末端に位置し、２つのホスホロチオエート結合はアンチセンス鎖の５’末端に位置する；
（ｘｉ）１つまたは複数の（例えば、２つの）ホスホロチオエート結合を含んでなるセンス鎖を有する。一実施形態では、１つまたは複数の（例えば、２つの）ホスホロチオエート結合は、センス鎖の５’末端に位置する；
（ｘｉｉ）センス鎖の２１個のヌクレオチドが、アンチセンス鎖の相補的な２１個のヌクレオチドとハイブリダイズする；
（ｘｉｉｉ）２１個のヌクレオチド塩基対、およびアンチセンス鎖の３’末端の２塩基オーバーハングを形成する；
（ｘｉｖ）ＡＤ－６０５１９の配列を有するセンスおよびアンチセンス鎖を含んでなり、またはそれからなる；
（ｘｖ）１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０個または全てのＡＤ－６０５１９センス鎖修飾がある、センス鎖を有する；
（ｘｖｉ）１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０個または全てのＡＤ－６０５１９アンチセンス鎖修飾がある、アンチセンス鎖を有する；または
（ｘｖｉｉ）二本鎖配列および全てのＡＤ－６０５１９修飾を有する。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、以下の構造を有するコンジュゲートの形態である（本明細書では、ＡＤ－６０５１９またはＡＬＮ－６０５１９とも称される）（それぞれ出現順に、配列番号５２３８～５２３９）。
Figure 2023120219000005
一態様では本明細書で提供されるのは、例えば、本明細書に記載されるｉＲＮＡの１つまたは複数と、薬学的に許容できる担体または送達ビヒクルとを含む、医薬組成物などの組成物である。一実施形態では、組成物は、一般にヒト対象である生物において、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するために使用される。一実施形態では、組成物は、例えばＡＩＰなどのポルフィリン症を治療するために使用される。
一態様では、本明細書で提供されるｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であり、前記ｄｓＲＮＡは、１５～３０塩基対長さのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は配列番号１または３８２の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドと相補的である。
さらなる態様では、本明細書で提供されるｉＲＮＡは、アンチセンス鎖と相補的なセンス鎖を含んでなる二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）であり、前記アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物との相補性領域を含んでなり、各鎖は、約１４～約３０個のヌクレオチドを有し、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤は、
式（ＩＩＩ）、
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立して０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は、独立して、修飾または未修飾のいずれかまたはそれらの組み合わせである、０～２５個のヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでなり；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、修飾または未修飾のいずれかまたはそれらの組み合わせである、０～１０個のヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドの３つの同一修飾の１つのモチーフを表し；
Ｎｂ上の修飾は、Ｙ上の修飾と異なり、Ｎｂ’上の修飾は、Ｙ’上の修飾と異なる）
によって表わされる。
実施形態では、センス鎖は、少なくとも１つのリガンドと共役する。
実施形態では、ｉは１であり；ｊは１であり；またはｉおよびｊのどちらも１である。
実施形態では、ｋは１であり；ｌは１であり；またはｋおよびｌのどちらも１である。
実施形態では、ＸＸＸは、Ｘ’Ｘ’Ｘ’と相補的であり、ＹＹＹはＹ’Ｙ’Ｙ’と相補的であり、ＺＺＺはＺ’Ｚ’Ｚ’と相補的である。
実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’末端から１１、１２、および１３位に存在する。
実施形態では、Ｙ’は２’－Ｏ－メチルである。
実施形態では、二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さである。
実施形態では、二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対の長さである。
実施形態では、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さである。
実施形態では、二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対の長さである。
実施形態では、ヌクレオチド上の修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、非環式ヌクレオチド、ヘキシトールまたはヘキソース核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
実施形態では、ヌクレオチド上の修飾は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシル、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
実施形態では、ヌクレオチド上の修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロまたは双方である。
実施形態では、リガンドは炭水化物を含んでなる。
実施形態では、リガンドはリンカーを介して付着する。
実施形態では、リンカーは、二価または三価の分枝リンカーである。
実施形態では、リガンドは、
Figure 2023120219000006
 である。
実施形態では、リガンドおよびリンカーは、
式ＸＸＩＶ、
Figure 2023120219000007
 に示される通りである。
実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に付着する。
実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２１～４０で提供される配列群から選択されるヌクレオチド配列からなり、またはそれを含んでなる。
さらなる態様では、本明細書で提供されるｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であり、前記ｄｓＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物との相補性領域を含んでなり、そのアンチセンス鎖は、表２１～４０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列の１つと、３ヌクレオチド以下異なる、少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドは、表２１～４０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列と比較して、より少い修飾、より多くの修飾、または異なる修飾を有する。
実施形態では、センスおよびアンチセンス配列は、例えば本明細書で提供される実施例で開示されるアッセイを使用した評価で、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または９０％抑制する、本明細書で開示される二本鎖である。
実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現は、例えば、肝臓生検サンプルを使用して評価される、肝臓内のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルに基づいて評価される。実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現は、例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、または尿などの生体液中のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルに基づいて評価される。実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現は、例えば、本明細書またはＳｅｈｇａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ（２０１２年２月９日にＫｅｙｓｔｏｎｅ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓシンポジウムにおいてポスター発表（バンクーバー、２０１２年２月７～１２日）、またはＳｅｈｇａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ，ＲＮＡ，２０：１－７、２０１３年１２月１９日にオンライン公開に記載されるようなｃＥＲＤアッセイなどの循環細胞外ＲＮＡ検出（ｃＥＲＤ）アッセイを使用して、評価される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでなる。
いくつかの実施形態では、少なくともの１つ修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基包含ヌクレオチドからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、相補性領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、相補性領域は、１９～２１ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、相補性領域は、１９ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態では、各鎖は３０ヌクレオチド長以下である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１本の鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１本の鎖は、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ．ｏｆ）を含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖は、２つのヌクレオチドの３’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ．ｏｆ）を含んでなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、リガンドをさらに含んでなる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ＧａｌＮＡｃリガンドである。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ｄｓＲＮＡを肝実質細胞に標的化する。
いくつかの実施形態では、リガンドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に共役する。
いくつかの実施形態では、相補性領域は、表２１～４０に列挙されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列、またはその中でヌクレオチドの一部または全部が未修飾である対応するアンチセンス配列からなる。実施形態では、相補性領域は、配列ＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５３）またはＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＴＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５４）からなる。いくつかの実施形態では、相補性領域は、二本鎖ＡＤ－６０４８９のアンチセンス配列からなる。いくつかの実施形態では、相補性領域は、二本鎖ＡＤ－６０５１９のアンチセンス配列からなる。
実施形態では、相補性領域は、本明細書で提供される実施例で開示されるアッセイを使用した評価で、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または９０％抑制する、本明細書で開示される二本鎖から選択されるアンチセンス配列からなる。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２１～４０から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表２１～４０から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含んでなる。実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２１～４０で開示される二本鎖から選択される、１対の対応するセンスおよびアンチセンス配列を含んでなる。
一態様では、本発明は、本明細書で取り上げるｉＲＮＡの少なくとも１つ（例えばｄｓＲＮＡ）を含有する細胞を提供する。細胞は、一般にヒト細胞などの哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は赤血球系細胞である。別の実施形態では、細胞は肝細胞（例えば肝実質細胞）である。
一態様では本明細書で提供されるのは、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であり、組成物は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含んでなる。
本明細書に記載される医薬組成物の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）が非緩衝溶液中で投与される。実施形態では、非緩衝溶液は例えば注射用水などの生理食塩水または水である。
実施形態では、医薬組成物は、ＡＤ－６０５１９および注射用水を含んでなる。実施形態では、組成物は、例えば、２００ｍｇ／ｍＬなどの約１００～３００ｍｇ／ｍＬのＡＤ－６０５１９を含んでなる。実施形態では、組成物は、例えば、約７．０などの６．０～７．５のｐＨを有する。実施形態では、組成物は、皮下注射用である。実施形態では、医薬組成物は、例えば、０．５５ｍＬなどの約０．３～１ｍＬの容量で、（例えば、２ｍＬガラスバイアルなどのガラスバイアル）容器内に包装される。実施形態では、医薬組成物は、本明細書の実施例に記載されるようなＡＬＮ－ＡＳ１である。
本明細書に記載される医薬組成物の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）が非緩衝溶液中で投与される。実施形態では、緩衝溶液は、酢酸エステル、クエン酸塩、プロラミン、炭酸、またはリン酸またはそれらのあらゆる組み合わせを含んでなる。実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
本明細書に記載される医薬組成物の実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、肝実質細胞に標的化される。
本明細書に記載される医薬組成物の実施形態では、組成物は静脈内投与される。
本明細書に記載される医薬組成物の実施形態では、組成物は皮下投与される。
実施形態では、医薬組成物は、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を肝実質細胞に標的化するリガンド（例えばＧａｌＮＡｃリガンド）を含んでなる、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含んでなる。
実施形態では、医薬組成物は、リガンド（例えばＧａｌＮＡｃリガンド）を含んでなる本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含んでなり、医薬組成物は皮下投与される。実施形態では、リガンドは、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を肝実質細胞に標的化する。
特定の実施形態では、例えば本明細書に記載される組成物である医薬組成物は、脂質製剤を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、例えばＭＣ３製剤であるＬＮＰ製剤中にある。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤は、例えば肝実質細胞のような肝細胞などの特定の細胞に、ＲＮＡｉ剤を標的化する。実施形態では、脂質製剤はＬＮＰ１１製剤である。実施形態では、組成物は静脈内投与される。
別の実施形態では、医薬組成物は、例えば４週間に１回以下、３週間に１回以下、隔週１回以下、または毎週１回以下などの本明細書に記載される投薬計画に従った投与のために調合される。別の実施形態では、医薬組成物の投与は、例えば１、２、３または６ヶ月以上、または１年以上継続し得る。
別の実施形態では、例えばＡＬＡＳ１を標的にするｄｓＲＮＡなどの本発明で取り上げるｉＲＮＡを含有する組成物が、ポルフィリン症（例えばＡＩＰ）またはポルフィリン症の症状（例えば疼痛）を治療することが知られている薬剤である、非ｉＲＮＡ治療薬などと共に投与される。別の実施形態では、例えばＡＩＰを標的にするｄｓＲＮＡなどの本発明で取り上げるｉＲＮＡを含有する組成物が、ヘミンまたはグルコースなどの非ｉＲＮＡ薬剤投与計画（例えばグルコース点滴（例えばＩＶグルコース））と共に投与される。例えば本発明で取り上げるｉＲＮＡは、グルコース、デキストロースまたはエネルギー収支の復元に役立つ同様の治療薬（例えば完全非経口栄養）の前、後、またはそれと同時に投与し得る。本発明で取り上げるｉＲＮＡはまた、ヘム製品（例えばヘミン、アルギン酸ヘム、またはヘムアルブミン）投与の前、後、またはそれと同時に投与し得て、任意選択的にグルコース（例えばＩＶグルコース）などとも組み合わされる。
典型的に、ポルフィリン症の治療のために投与されるグルコースは、静脈内（ＩＶ）投与される。グルコースの静脈内投与は、本明細書で「ＩＶグルコース」と称される。しかしグルコースが別の手段によって投与される、代案の実施形態もまた包含される。
一実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｉＲＮＡが患者に投与され、次に非ｉＲＮＡ剤投与または治療計画（例えばグルコースおよび／またはヘム製品）が患者に実施される（または逆もまた然り）。別の実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｉＲＮＡおよび非ｉＲＮＡ治療薬または治療計画が同時に実施される。
一態様では本明細書で提供されるのは、（ａ）本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を細胞に導入するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞をＡＬＡＳ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞中のＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するステップとを含んでなる、細胞中におけるＡＬＡＳ１発現を阻害する方法である。
一態様では本明細書で提供されるのは、細胞（例えば赤血球系細胞または例えば肝実質細胞などの肝細胞）中におけるＡＬＡＳ１遺伝子の発現を低下させまたは阻害する方法である。方法は、
（ａ）互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞をＡＬＡＳ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞中のＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するステップと
を含み、ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含み；アンチセンス鎖は、ＡＬＡＳ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補性領域を有して、相補性領域は３０ヌクレオチド以下、すなわち１５～３０ヌクレオチド長、一般に１９～２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、ＡＬＡＳ１を発現する細胞に接触すると、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上など、少なくとも１０％阻害する。
細胞中におけるＡＬＡＳ１発現を阻害する前述の方法の実施形態では、細胞は生体外、試験管内、または生体内で処置される。実施形態では、細胞は肝実質細胞である。
実施形態では、細胞は、ＡＬＡＳ１発現関連疾患の治療、予防および／または管理を必要とする対象中に存在する。
実施形態では、疾患はポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は、急性間欠性ポルフィリン症またはＡＬＡデヒドラターゼ欠乏ポルフィリン症である。
実施形態では、ポルフィリン症は、例えば急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）、および肝骨髄性ポルフィリン症から選択されるポルフィリン症などの肝性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は、ホモ接合優性肝性ポルフィリン症（例えばホモ接合優性ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰ）または肝骨髄性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は二重ポルフィリン症である。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現が少なくとも３０％阻害される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０１～１ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する。
特定の実施形態では、細胞（例えば肝実質細胞）は、哺乳類細胞（例えばヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類細胞）である。
一実施形態では、細胞は生体外、試験管内、または生体内で処置される（例えば細胞は、対象（例えばＡＬＡＳ１発現関連疾患の治療、予防および／または管理を必要とする患者）中に存在する。
一実施形態では、対象は、例えばＸ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰまたはＤｏｓｓポルフィリン症）、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、先天性赤芽球増殖性ポルフィリン症（ＣＥＰ）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａ ｃｕｔａｎｅａ ｔａｒｄａ）（ＰＣＴ）、遺伝性のコプロポルフィリン症（コプロポルフィリン症、またはＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、赤芽球増殖性プロトポルフィリン症（ＥＰＰ）、または乳児期一過性赤血球ポルフィリン症などのポルフィリン症のリスクがある、またはポルフィリン症と診断された哺乳類（例えばヒト）である。いくつかの実施形態では、疾患は、例えばＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）、ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰなどの急性肝性ポルフィリン症である。特定の実施形態では、疾患は、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）またはＡＩＰである。
実施形態では、ポルフィリン症は、例えば急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）、および肝骨髄性ポルフィリン症から選択されるポルフィリン症などの肝性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は、ホモ接合優性肝性ポルフィリン症（例えばホモ接合優性ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰ）または肝骨髄性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は二重ポルフィリン症である。
一実施形態では、導入されたｄｓＲＮＡは、細胞中のＡＬＡＳ１遺伝子の発現を低下させまたは阻害する。
一実施形態では、導入されたｄｓＲＮＡは、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現、または１つまたは複数のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばδ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ポルホビリノーゲン（ｐｏｒｐｈｏｐｉｌｉｎｏｇｅｎ）（ＰＢＧ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）、ウロポルフィリノーゲンＩまたはＩＩＩ、コプロポルフィリノーゲンＩまたはＩＩＩ、プロトポルフィリノーゲン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｒｉｎｏｇｅｎ）ＩＸ、およびプロトポルフィリンＩＸ）またはポルフィリン産物または代謝産物レベルを、参照（例えば未処置細胞または非標的化対照ｄｓＲＮＡで処置した細胞）と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上低下させまたは阻害する。理論により拘束されることなく、ＡＬＡＳ１は、ポルフィリン経路の最初の酵素である。したがってＡＬＡＳ１遺伝子の発現を低下させることは、１つまたは複数のポルフィリン前駆体、ポルフィリンまたはポルフィリン産物または代謝産物レベルを低下させと思われる。
その他の態様では、本発明は、ＡＬＡＳ１発現に関連した病理過程（例えばポルフィリン症などのポルフィリン、ポルフィリン前駆体（ｐｒｅｃｕｏｒｓｏｒｓ）に伴う、またはポルフィリン経路欠陥に伴う病理過程）を治療、予防または管理する方法を提供する。一実施形態では、方法は、例えばこのような治療、予防または管理を必要とする患者である対象に、有効量（例えば治療的または予防的有効量）の本明細書で取り上げる１つまたは複数のｉＲＮＡを投与するステップを含む。
一態様では本明細書で提供されるのは、このような治療を必要とする対象に、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）の治療有効量、または本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を含んでなる組成物の治療有効量を投与するステップを含んでなる、ＡＬＡＳ１発現関連疾患を治療および／または予防する方法である。
一態様では本明細書で提供されるのは、このような治療を必要とする対象に、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を投与するステップを含んでなる、ポルフィリン症を治療および／または予防する方法であり、前記ｄｓＲＮＡは、１５～３０塩基対長のセンス鎖とアンチセンス鎖とを含んでなり、アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号３８２の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドと相補的である。
一実施形態では、対象（例えば患者）は、ポルフィリン症を有する。別の実施形態では、対象（例えば患者）には、ポルフィリン症を発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１を標的にするｉＲＮＡの投与は、患者においてＡＬＡＳ１関連疾患の少なくとも１つの症状の重症度を緩和し、または軽減する。
一実施形態では、対象は、例えばＸ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（Ｄｏｓｓポルフィリン症）、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、先天性赤芽球増殖性ポルフィリン症（ＣＥＰ）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａ ｃｕｔａｎｅａ ｔａｒｄａ）（ＰＣＴ）、遺伝性のコプロポルフィリン症（コプロポルフィリン症、またはＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、赤芽球増殖性プロトポルフィリン症（ＥＰＰ）、または乳児期一過性赤血球ポルフィリン症のようなポルフィリン症などのＡＬＡＳ１発現関連疾患のリスクがある、または疾患があると診断された哺乳類（例えばヒト）である。さらなる実施形態では、ポルフィリン症は、例えばＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）、ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰなどの急性肝性ポルフィリン症である。いくつかのこのような実施形態では、疾患は、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）またはＡＩＰである。
実施形態では、対象は、ポルフィリン症を有し、または発症するリスクがある。実施形態では、ポルフィリン症は、例えば急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）、および肝骨髄性ポルフィリン症から選択されるポルフィリン症などの肝性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は、ホモ接合優性肝性ポルフィリン症（例えばホモ接合優性ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰ）または肝骨髄性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は二重ポルフィリン症である。
実施形態では、ポルフィリン症、ポルフィリン症の症状、前駆症状、またはポルフィリン症の発作は、本明細書に記載される増悪因子への曝露によって誘導される。いくつかの実施形態では、増悪因子は化学物質曝露である。いくつかの実施形態では、増悪因子は、例えば処方薬または一般市販薬などの薬物である。いくつかの実施形態では、増悪因子は、例えば黄体期のような月経周期の特定の時期などの月経周期である。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物は、ポルフィリン症の急性発作後に投与される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物は、ポルフィリン症の急性発作中に投与される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物は、ポルフィリン症の急性発作を予防するために予防的に投与される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＬＮＰ製剤として調合される。
実施形態（ｅｍｔｏｄｉｍｅｎｔｓ）では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＧａｌＮＡｃ複合体の形態である。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、対象の体重あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＬＮＰ製剤として調合され、０．０５～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、ＧａｌＮＡｃ複合体の形態であり、０．５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体中のｉＲＮＡは、例えば、週１回などの１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、５ｍｇ／ｋｇ以下）未満；例えば、週１回の１ｍｇ／ｋｇ以下、２．５ｍｇ／ｋｇ以下、または５ｍｇ／ｋｇ以下の用量などの用量で投与される。一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体中のｉＲＮＡは、例えば週１回などの約２．５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。一実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体中のｉＲＮＡは、投与皮下される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、ＧａｌＮＡｃ複合体の形態であり、例えば、０～２．５ｍｇ／ｋｇまたは１～２．５ｍｇ／ｋｇなどの０～５ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与される。実施形態では、ｉＲＮＡは毎週投与される。実施形態では、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡと注射用水とを含んでなる組成物として投与される。実施形態では、ｉＲＮＡはＡＤ－６０５１９である。実施形態では、組成物は、例えば、ＡＤ－６０５１９などのｉＲＮＡを約２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでなる。
実施形態では、方法は、対象中でポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを低下させる。
実施形態では、レベルは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低下する。一実施形態では、レベルは、少なくとも３０％低下する。
実施形態では、ポルフィリン前駆体は、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはポルホビリノーゲン（ｐｏｒｐｈｏｐｉｌｉｎｏｇｅｎ）（ＰＢＧ）である。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．０１～１ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する。
実施形態では、本明細書に記載される方法は、
（ｉ）ＡＬＡＳ１関連障害（例えばポルフィリン症）に伴う症状を改善し、
（ｉｉ）対象中においてＡＬＡＳ１発現を阻害し（例えば、ｃＥＲＤアッセイを使用して評価し）、
（ｉｉｉ）対象中においてルフィリン前駆体（例えばＡＬＡまたはＰＢＧ）またはポルフィリンレベルを低下させ、
（ｉｖ）対象中においてポルフィリン症に伴う症状の急性発作の発生頻度を低下させ、または
（ｖ）対象が増悪因子（例えば月経前期または黄体期）に曝露した際に、対象中においてポルフィリン症に伴う症状の急性発作の発生率を低下させる。
実施形態では、方法は、疼痛および／または進行性神経障害を改善する。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物が、投与計画に従って投与される。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物は、ポルフィリン症の急性発作の前、またはその最中に投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、ポルフィリン症の急性発作前に投与される。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物は、前駆症状の間に投与される。実施形態では、前駆症状は、腹痛、悪心、心理学的症状（例えば不安）、情動不安および／または不眠症によって特徴付けられる。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物は、例えば黄体期などの特定の月経周期中に投与される。
実施形態では、方法は、例えば発作の重症度、持続期間、または発生頻度を低下させることで、ポルフィリン症の周期性発作を改善し、または予防する。実施形態では、周期性発作は、増悪因子と関連付けられている。実施形態では、増悪因子は、例えば黄体期のような月経周期の特定の時期などの月経周期である。
実施形態では、対象は、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を有する。実施形態では、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルは、対象からの血漿または尿中で上昇する。実施形態では、対象は、例えば肝性ポルフィリン症などのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがある。実施形態では、対象は無症候性である。実施形態では、対象は、本明細書に記載されるポルフィリン症と関連付けられている遺伝子変化（例えば遺伝子変異）を保有する。実施形態では、対象は、ポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがあり、疼痛（例えば慢性疼痛、例えば慢性神経障害性疼痛）および／または神経障害（例えば進行性神経障害）を患っている。実施形態では、対象は、急性発作に罹患していないが、疼痛（例えば長期神経障害性疼痛のような慢性疼痛などの）および／または神経障害（例えば進行性神経障害）を患っている。実施形態では、疼痛は腹痛である。
実施形態では、対象は、（ａ）ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を有し、（ｂ）疼痛（例えば長期神経障害性疼痛などの慢性疼痛）および／または神経障害（例えば進行性神経障害）を患っている。実施形態では、疼痛は腹痛である。
実施形態では、対象は、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧの血漿レベルおよび／または尿レベルの上昇を有する。実施形態では、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧの上昇レベルには、例えば疼痛（例えば慢性疼痛、例えば長期神経障害性疼痛）または神経障害（例えば進行性神経障害）などのその他の症状が付随する。実施形態では、疼痛は腹痛である。実施形態では、対象は無症候性である。実施形態では、対象は、例えば本明細書に記載される変異などのポルフィリン症と関連付けられている遺伝子変異を有する。
実施形態では、対象は、例えば基準値を超える、またはそれ以上のレベルなどの、上昇したＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリン前駆体レベル（例えば血漿レベルまたは尿レベル）を有する。実施形態では、レベルは、基準値を超える。実施形態では、基準値は、健常人サンプル中の平均レベルを２標準偏差上回る。実施形態では、基準値は、基準上限である。
実施形態では、対象は、基準上限の２倍、３倍、４倍、または５倍を超える、またはそれ以上のＡＬＡおよび／またはＰＢＧの血漿レベルおよび／または尿レベルを有する。本明細書の用法では，「基準上限」は、例えば正常な（例えば野性型）または健康な個人のサンプルなどの、例えばポルフィリン症と関連付けられている遺伝子変異を保有しない個人、および／またはポルフィリン症に罹患していない個人などの、標準試料の９５％信頼区間の上限であるレベルを指す。実施形態では、対象は、基準上限の２～４倍を超える、尿ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを有する。実施形態では、対象は、基準上限の４倍を超える、尿ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを有する。
実施形態では、血漿ＰＢＧの基準値は、０．１２μｍｏｌ／Ｌである。実施形態では、対象はヒトであり、０．１２μｍｏｌ／Ｌ、０．２４μｍｏｌ／Ｌ、０．３６μｍｏｌ／Ｌ、０．４８μｍｏｌ／Ｌ、または０．６０μｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＰＢＧレベルを有する。実施形態では、対象はヒトであり、０．４８μｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＰＢＧレベルを有する。
実施形態では、尿ＰＢＧの基準値は、１．２ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンである。実施形態では、対象はヒトであり、１．２ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、２．４ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、３．６ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、４．８ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、または６．０ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンを超える、またはそれ以上の尿ＰＢＧレベルを有する。実施形態では、対象はヒトであり、４．８ｍｍｏｌ／ｍｏｌを超える、またはそれ以上の血漿ＰＢＧレベルを有する。
実施形態では、血漿ＡＬＡの基準値は、０．１２μｍｏｌ／Ｌである。実施形態では、対象はヒトであり、０．１２μｍｏｌ／Ｌ、０．２４μｍｏｌ／Ｌ、０．３６μｍｏｌ／Ｌ、０．４８μｍｏｌ／Ｌ、または０．６０μｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＡＬＡレベルを有する。実施形態では、対象はヒトであり、０．４８μｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＡＬＡレベルを有する。
実施形態では、尿ＡＬＡの基準値は、３．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンである。実施形態では、対象はヒトであり、３．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、６．２ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、９．３ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、１２．４ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、または１５．５ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンを超える、またはそれ以上の尿ＡＬＡレベルを有する。
実施形態では、方法は、ポルフィリン症の１つまたは複数の徴候または症状を減少させる。実施形態では、対象は、方法は、上昇したＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを低下させる。実施形態では、方法は、疼痛（例えば慢性疼痛、例えば慢性神経障害性疼痛）および／または神経障害（例えば進行性神経障害）を低下させる。実施形態では、疼痛は腹痛である。実施形態では、疼痛は、神経障害性疼痛（例えば急性ポルフィリン症の進行性神経障害に伴う疼痛）である。疼痛の低下としては、例えば疼痛の予防、疼痛発生の遅延、疼痛発生頻度の低下、および／または疼痛重症度の低下が挙げられる。実施形態では、疼痛の低下は、対象の鎮痛剤の使用に基づいて評価される。
実施形態では、方法は、例えば発作の重症度、持続期間、または発生頻度を低下させることで、ポルフィリン症の急性発作を改善しまたは予防する。
実施形態では、方法は、神経損傷を低下させまたは予防する。
実施形態では、方法は、悪化を予防し（例えば異常の発生を予防し）、または例えば筋肉の臨床的測定、および／または例えばＥＭＧおよび／または神経伝導速度のような神経機能の臨床的測定などの臨床的測定の改善をもたらす。
実施形態では、方法は、対象によるヘムの使用を低下させる。
実施形態では、方法は、対象による鎮痛剤の使用を低下させる。
実施形態では、方法は、入院を減少させる。
実施形態では、方法は、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベル（例えば血漿または尿のＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベル）を低下させるのに効果的である。実施形態では、方法は、上昇したＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルに予定された低下を生じるのに効果的である。
実施形態では、予定された低下は、基準値以下の値への低下である。いくつかの実施形態では、基準値は、基準上限である。いくつかの実施形態では、基準値は、標準試料の平均レベルを２標準偏差上回る値である。
実施形態では、方法は、対象中のＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを基準上限の２倍未満のレベルに低下させるのに効果的である。実施形態では、方法は、ＡＬＡレベルを基準上限の２倍未満に低下させるのに効果的である。実施形態では、方法は、ＰＢＧレベルを基準上限の２倍未満に低下させるのに効果的である。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物が、例えば投与計画に従って単回用量または複数用量で投与される。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物が、ポルフィリン症を発症するリスクがある対象に、予防的に投与される。実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物が、思春期の始めに予防的に投与される。実施形態では、対象は、ポルフィリン症と関連付けられている遺伝子変異を保有し、および／またはＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇（例えば血漿または尿のＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇）を有する。実施形態では、変異は、（例えば薬物、ダイエットまたは例えば本明細書で開示される増悪因子のようなその他の増悪因子などの増悪因子に曝露した際に）個人が急性発作を起こしやすくする。実施形態では、変異は、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）レベルの上昇と関連付けられている。実施形態では、変異は、慢性疼痛（例えば慢性神経障害性疼痛）および／または神経障害（例えば進行性神経障害）と関連付けられている。
実施形態では、変異は、ＡＬＡＳ１遺伝子の変異である。実施形態では、変異は、ＡＬＡＳ１遺伝子プロモータの変異、またはＡＬＡＳ１遺伝子の上流または下流領域の変異である。実施形態では、変異は、ＡＬＡＳ１と相互作用する転写因子またはその他の遺伝子の変異である。実施形態では、変異は、ヘム生合成経路中の酵素をコードする遺伝子の変異である。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡまたはそのコンジュゲート）またはｉＲＮＡを含んでなる組成物は、皮下投与される。実施形態では、ｉＲＮＡは、ＧａｌＮＡｃ複合体の形態である。実施形態では、ｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、０．５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、週１回などの１ｍｇ／ｋｇ以下、２．５ｍｇ／ｋｇ以下、または５ｍｇ／ｋｇ以下の用量などの週１回の１０ｍｇ／ｋｇ未満（例えば、５ｍｇ／ｋｇ以下）の用量で投与される。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、週１回などの約２．５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。
実施形態では、治療される対象は無症候性であり、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を有する。実施形態では、対象は、例えばＡＩＰなどのポルフィリン症を有する。実施形態では、患者は、再発性ポルフィリン症性発作を患っている。
実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ＡＤ－６０５１９）は、例えば、０．１、０．３５、１．０、または２．５ｍｇ／ｋｇなどの５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。実施形態では、ｉＲＮＡ（例えば、ＡＤ－６０５１９）は、例えば、週間用量などの反復用量で投与される。
一実施形態では、対象は無症候性であり、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を有して、ｉＲＮＡ（例えば、ＡＤ－６０５１９）が、例えば、０．１、０．３５、１．０、または２．５ｍｇ／ｋｇなどの単回用量で；または例えば、数週間（例えば、４週間）にわたる、１および２．５ｍｇ／ｋｇの反復週間用量でで投与される。
一実施形態では、対象は、例えば、ＡＩＰ患者など、ＡＩＰを有して、ｉＲＮＡ（例えば、ＡＤ－６０５１９）が、毎週１～２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
実施形態では、その中で、ｉＲＮＡが最初により頻繁に投与されて、より低頻度の投与がそれに続く、治療計画が用いられる。実施形態では、ｉＲＮＡは、最初に、数日間にわたり（例えば、２、３、４、５、６、または７日間など２～１４日にわたり）、１日１回投与される。実施形態では、ｉＲＮＡは、引き続いて週１回投与される。実施形態では、ｉＲＮＡは、引き続いて隔週１回投与される。実施形態では、ｉＲＮＡは、引き続いて、ポルフィリン症徴候または症状の１つまたは複数を低減させるのに効果的な頻度で、投与される。
一態様では本明細書で提供されるのは、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇がある対象を治療する方法であり、方法は、対象に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を投与するステップを含んでなり、前記ｄｓＲＮＡは、１５～３０塩基対長のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、アンチセンス鎖は、配列番号１または配列番号３８２の少なくとも１５個の連続ヌクレオチドと相補的である。
一態様では本明細書で提供されるのは、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇がある対象を治療する方法であり、方法は、本明細書に記載されるように、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含んでなる組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含んでなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを低下させるのに効果的である。いくつかの実施形態では、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルは、例えば基準上限などの基準値未満、またはそれ以下になるように低下される。
実施形態では、治療される対象は無症候性であり、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を有する。実施形態では、対象は、例えばＡＩＰなどのポルフィリン症を有する。
実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、０．１、０．３５、１．０、または２．５ｍｇ／ｋｇなどの５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、週間用量などの反復用量で投与される。
別の態様では、本発明は、細胞（例えば赤血球系細胞、または例えば肝実質細胞などの肝細胞）中のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを低下させる方法を提供する。一実施形態では、細胞は生体外、試験管内、または生体内で処置される（例えば細胞は、対象（例えばＡＬＡＳ１発現関連疾患の治療、予防および／または管理を必要とする患者）中に存在する。方法は、細胞に、例えば本明細書で開示されるｉＲＮＡの１つまたは複数などのＡＬＡＳ１を標的にするｉＲＮＡの１つまたは複数の有効量を接触させ、それによって接触前レベルと比較して、細胞中のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを低下させ；または細胞が位置する対象中のその他の細胞、組織、または体液中のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを低下させるステップを含んでなる。このような方法を使用して、例えばＡＩＰまたはＡＬＡデヒドラターゼ欠乏ポルフィリン症のようなポルフィリン症などのＡＬＡＳ１発現関連障害を治療し得る（例えば重症度を改善し得る）。
一実施形態では、接触させるステップは、生体外、試験管内、または生体内で実施される。例えば細胞は、例えばポルフィリン症のリスクがある、またはポルフィリン症と診断された哺乳類（例えばヒト）などの対象中に存在し得る。一実施形態では、ポルフィリン症は急性肝性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は、例えば急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）、および肝骨髄性ポルフィリン症から選択されるポルフィリン症などの肝性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は、ホモ接合優性肝性ポルフィリン症（例えばホモ接合優性ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰ）または肝骨髄性ポルフィリン症である。実施形態では、ポルフィリン症は二重ポルフィリン症である。
一態様では本明細書で提供されるのは、細胞中のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを低下させるのに有効な量で、細胞に、本明細書に記載されるｉＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）を接触させるステップを含んでなる、細胞中のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡまたはＰＢＧ）レベルを低下させる方法である。
実施形態では、細胞は肝実質細胞である。実施形態では、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体は、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ポルホビリノーゲン（ｐｏｒｐｈｏｐｉｌｉｎｏｇｅｎ）（ＰＢＧ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）、ウロポルフィリノーゲンＩまたはＩＩＩ、コプロポルフィリノーゲンＩまたはＩＩＩ、プロトポルフィリノーゲン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｒｉｎｏｇｅｎ）ＩＸ、またはプロトポルフィリンＩＸである。実施形態では、ポルフィリン前駆体はＡＬＡまたはＰＢＧである。
一実施形態では、細胞は赤血球系細胞である。さらなる実施形態では、細胞は肝細胞（例えば肝実質細胞）である。
一態様では本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるように、少なくとも１本のｉＲＮＡ（例えばａｄｓＲＮＡ）鎖をコードするベクターである。
一態様では本明細書で提供されるのは、少なくとも１本のｄｓＲＮＡ鎖をコードするベクターであり、前記ｄｓＲＮＡはＡＬＡＳ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部との相補性領域を含んでなり、前記ｄｓＲＮＡは３０塩基対長以下であり、前記ｄｓＲＮＡは前記ｍＲＮＡを切断の標的にする。
実施形態では、相補性領域は少なくとも１５ヌクレオチド長である。
実施形態では、相補性領域は少なくとも１９～２１ヌクレオチド長である。一態様では、本発明は、細胞中のＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するためのベクターを提供する。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるｉＲＮＡを含んでなる。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるｉＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結する、少なくとも１つの制御配列を含む。一実施形態では、ベクターは、少なくとも１本のＡＬＡＳ１ ｉＲＮＡ鎖を含んでなる。
一態様では本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるベクターを含んでなる細胞である。一態様では本明細書で提供されるのは、細胞中のＡＬＡＳ１遺伝子発現を阻害するベクターを含有する細胞である。ベクターは、本明細書に記載されるｉＲＮＡの１つの少なくとも１本の鎖をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結する、制御配列を含む。一実施形態では、細胞は肝細胞（例えば肝実質細胞）である。別の実施形態では、細胞は赤血球系細胞である。
別の態様では、対象において循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルをアッセイする方法が提供され、前記方法は、対象からの生物学的液状サンプル（例えば、血液サンプル（例えば、血清または血漿サンプル）、脳脊髄液状サンプル、または尿中のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを検出し（例えば、測定し）、前記生体液サンプルは、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを含んでなり、それによって対象において循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルをアッセイするステップを含んでなる。
別の態様では、対象において循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルをアッセイする方法が提供され、前記方法は、（ｉ）ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを含んでなる、対象からの生物学的液状サンプル（例えば、血液または血漿サンプル）からのＲＮＡ（例えば、細胞外ＲＮＡ）を提供するステップと；（ｉｉ）ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡからＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡを得るステップと；（ｉｉｉ）ＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡをＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡまたはその一部に相補的な核酸（例えば、プローブおよび／またはプライマー）に接触させて、それによって反応混合物を生成するステップと；（ｉｖ）反応混合物中のＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡレベルを検出し（例えば、測定し）、それによって対象において循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルをアッセイするステップとを含んでなり、ＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡレベルは、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの指標となる。
実施形態では、前記生体液サンプルは、血液サンプルである。実施形態では、前記生体液サンプルは、血清サンプルである。実施形態では、前記生体液サンプルは、尿サンプルである。
実施形態では、（ｔｈｅ ｔｈｅ）方法は、ＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは５’－ＲＡＣＥを含んでなる。
実施形態では、前記核酸は、プローブまたはプライマーである。
実施形態では、前記核酸は、検出可能部分を含んでなり、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、検出可能部分の量の検出によって判定される。
実施形態では、前記方法は、対象から生体液サンプルを得るステップをさらに含んでなる。実施形態では、生体液サンプルは、組織から分離され、エキソソームを含有する。これらの方法の実施形態では、ポルフィリン症治療の有効性は、基準値と比較した、対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの比較に基づいて評価される。
実施形態では、ポルフィリン症治療に応答する、基準値と比較した、対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの低下は、ポルフィリン症治療が効果的であることを示唆する。実施形態では、基準値は、ポルフィリン症治療に先だつ、対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルである。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。
本発明の様々な実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明のその他の特性、目的、および利点は、説明と図面から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、ヘム生合成経路を描写する。 図２Ａおよび図２Ｂは、ヘム代謝における遺伝的誤りと関連付けられている、特定のポルフィリン症を要約した表を示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、ヘム代謝における遺伝的誤りと関連付けられている、特定のポルフィリン症を要約した表を示す。 図３Ａおよび図３Ｂは、ヒトＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ配列転写（参照配列ＮＭ＿０００６８８．４（ＧＩ：４０３１６９４２、２０１１年１１月１９日記録）、配列番号１）を描写する。 図３Ａおよび図３Ｂは、ヒトＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ配列転写（参照配列ＮＭ＿０００６８８．４（ＧＩ：４０３１６９４２、２０１１年１１月１９日記録）、配列番号１）を描写する。 図４Ａおよび図４Ｂは、ヒトＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ配列転写（参照配列ＮＭ＿０００６８８．５（ＧＩ：３６２９９９０１１、２０１２年４月１日記録）、配列番号３８２）を描写する。 図４Ａおよび図４Ｂは、ヒトＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ配列転写（参照配列ＮＭ＿０００６８８．５（ＧＩ：３６２９９９０１１、２０１２年４月１日記録）、配列番号３８２）を描写する。 図５は、ＰＢＳ対照と比較した、マウスＡＬＡＳ１（ｍＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡの抑制における、ｓｉＲＮＡ ＡＤ－５３５５８の用量応答を示す。ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）ＡＤ－１９５５対照の結果もまた、示される。 図６は、ＰＢＳ対照と比較した、ラットにおけるＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制における、ｓｉＲＮＡ ＡＤ－５３５５８の用量応答を示す。ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）ＡＤ－１９５５対照の結果もまた、示される。 図７は、ＰＢＳ対照と比較した、ｓｉＲＮＡ ＡＤ－５３５５８によるマウスＡＬＡＳ１（ｍＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡ抑制の永続性を示す。 図８は、実験群（ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ）および対照群（ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ）における、ベースラインの、およびフェノバルビタール処置後の、血漿ＡＬＡレベル（μＭ単位）の平均値±標準偏差を示す。 図９は、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡおよび対照（ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ）処置を受けた動物における、ベースラインの、およびフェノバルビタール処置後の、個々の動物の血漿ＡＬＡレベル（μＭ単位）を示す（ｓｈｏｗｓ ｓｈｏｗｓ）。 図１０は、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡおよび対照（ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ）処置を受けた動物における、ベースラインの、およびフェノバルビタール処置後の、血漿ＡＬＡレベル（μＭ単位）の平均値±標準偏差を示す。 図１１は、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡおよび対照（ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ）処置を受けた動物における、ベースラインの、およびフェノバルビタール処置後の、個々の動物の血漿ＰＢＧレベル（μＭ単位）を示す（ｓｈｏｗｓ ｓｈｏｗｓ）。 図１２は、選択された代表的な実験（ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ）および対照（ＰＢＳ）動物における、ベースラインの、およびフェノバルビタール処置後の、肝臓の相対的ｍＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを示す。 図１３は、マウス肝臓組織におけるｍＡＬＡＳ１発現に対する、（ＰＢＳ対照と比較した）３種のＧａｌＮＡｃ共役ｍＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの効果を示す。 図１４は、フェノバルビタール投与、およびＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ処置または対照ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ処置後における、血漿ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを経時的に示す。 図１５は、マウスＡＩＰフェノバルビタール誘導モデルにおける、血漿ＡＬＡおよび血漿ＰＢＧレベルに対する、ＧａｌＮＡｃ共役ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの効果を示す。 マウスＡＩＰフェノバルビタール誘導モデルにおける、血漿ＡＬＡおよびＰＢＧレベルに対する、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの用量依存効果を示す。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを投与された動物では、投与されたｓｉＲＮＡの用量（０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、または１．０ｍｇ／ｋｇ）が、水平軸上に示される。 上部パネルは、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡによるＡＬＡおよびＰＢＧ抑制を試験するために使用された、実験デザインを示す。下部パネルは、ベースラインにおける、対照（Ｌｕｃ）条件における、およびＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡによる処置に続く、０週目、２週目、および４週目における、血漿ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを示す。 ＡＩＰ動物モデルにおける、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡまたはヘミンによる治療効果を比較するために使用された、実験デザイン（上部）と、血漿ＡＬＡ（μｍｏｌ／Ｌ）レベル（中央）および血漿ＰＢＧ（μｍｏｌ／Ｌ）レベル（下部）に関する結果を示す。 ＰＢＳ対照で処置された動物と比較した、３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５８６３２で処置された動物における、相対ｍＲＮＡレベル（ＡＬＡＳ１／ＧＡＰＤＨ）を示す。 ラットＡＩＰモデルにおける、ＡＤ－５８６３２ ＡＬＡＳ１ ＧａｌＮＡｃ複合体の用量応答効果を調べるために使用された、実験デザインを示す。 ラットＡＩＰモデルにおける、肝臓ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ（上部グラフ）の相対レベルと、肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ（下部グラフ）の相対レベルを示す。動物群は、４つの処置の１つを受けた：（１）フェノバルビタール（ＰＢ）処置のみ、（２）フェノバルビタールおよびポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）ｓｉＲＮＡ処置、（３）フェノバルビタール、ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、および３０ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ、（４）フェノバルビタール、ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、および１０ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ。 ラットＡＩＰモデルにおける、クレアチニンレベルと比較した、尿ＰＢＧ（上部パネル）およびＡＬＡ（下部パネル）レベルを示す。動物群は、４つの処置の１つを受けた：（１）フェノバルビタール（ＰＢ）処置のみ、（２）フェノバルビタールおよびポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）ｓｉＲＮＡ処置、（３）フェノバルビタール、ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、および３０ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ、（４）フェノバルビタール、ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、および１０ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ。 ３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回ボーラス投与との対比で、６ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの１日用量を５回投与されたラット群における、ＰＢＳ対照と比較した、ＡＤ－５８６３２によるＡＬＡＳ－１ ｍＲＮＡの抑制を示す。 １０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの週間用量を４回投与されたラット群における、ＰＢＳ対照と比較した、ＡＤ－５８６３２によるＡＬＡＳ－１ ｍＲＮＡの抑制を示す。 ＡＤ－５８６３２による、および５本の１９／１９量体二本鎖による、ＡＬＡＳ－１ ｍＲＮＡの抑制を示す。 最良の２つの１９量体に対する、鎖長およびオーバーハングの効果の評価の結果を示す。 実施例３４に記載されるＮＨＰ試験の各処置群について、肝臓内（左側バー）および血清中（右側バー）のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 ３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５８６３２またはＡＤ－６０４８９を投与されたラット群における、ＰＢＳ対照と比較した、ＡＬＡＳ－１ ｍＲＮＡの抑制を示す。 非ヒト霊長類中の肝臓ｍＲＮＡの抑制における、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－５８６３２およびＡＤ－６０４８９の有効性を調べるために使用された、実験デザインを示す。 １．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－５８６３２またはＡＤ－６０４８９による処置に続く、非ヒト霊長類の肝臓ｍＲＮＡの用量依存的抑制を示す。 非ヒト霊長類試験における、肝臓生検から、およびｃＥＲＤアッセイから得られたｍＲＮＡ抑制結果の比較を示す。 非ヒト霊長類試験における、ｃＥＲＤアッセイを使用して評価されたｍＲＮＡ抑制の経時変化を示す。水平軸は、試験日に従った時間を示す。 ＰＢＳを投与された、または示されるｓｉＲＮＡ二本鎖の１つの５ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与されたラットにおける、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を示す。 示されるｓｉＲＮＡの５ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与されたラットにおける、ｓｉＲＮＡの肝臓濃度を示す。 （上部）ＡＤ－６０９２５およびＡＤ－６０９２６の治療効果を調べるために使用された、実験デザインを示す。（下部）（１）ＡＦ１１－ＰＢＧＤ、（２）ＡＦ１１－ＰＢＧＤおよびＰＢ、（３）ＡＦ－１１ＰＢＧＤ、ＰＢ、および３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０９２５、または（４）ＡＦ１１－ＰＢＧＤ、ＰＢ、およびＡＤ－６０９２６で処置されたラットにおける、ラットＡＬＡＳ１／ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの相対レベルを示す。 （１）ＡＦ１１－ＰＢＧＤ、（２）ＡＦ１１－ＰＢＧＤおよびＰＢ、（３）ＡＦ－１１ＰＢＧＤ、ＰＢ、および３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０９２５、または（４）ＡＦ１１－ＰＢＧＤ、ＰＢ、およびＡＤ－６０９２６で処置されたラットにおける、尿ＰＢＧ（上部）および尿ＡＬＡ（下部）の相対レベルを示す。 （１）ＡＦ１１－ＰＢＧＤ、（２）ＡＦ１１－ＰＢＧＤおよびＰＢ、（３）ＡＦ－１１ＰＢＧＤ、ＰＢ、および３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０９２５、または（４）ＡＦ１１－ＰＢＧＤ、ＰＢ、およびＡＤ－６０９２６で処置されたラットにおける、経時的な尿ＰＢＧ（上部）および尿ＡＬＡ（下部）の相対レベルを示す。矢印は、ＰＢが投与された時点を示す。 ＰＢＳまたは示されるｓｉＲＮＡの１つの２．５ｍｇ／ｋｇの用量を４回投与されたラットにおける、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡの相対レベルを示す。 ＰＢＳまたは示されるｓｉＲＮＡの１つの２．５ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与されたラットにおける、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡの相対レベルを示す。 （上部）ＰＢＳまたは示されるｓｉＲＮＡの１つの３ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与されたラットにおける、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡの相対レベルを示す。（下部）肝臓内のｓｉＲＮＡ濃度を示す。 （上部）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、およびＡＤ－６０９０１による、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡの抑制を示す。（下部）肝臓内のｓｉＲＮＡ濃度を示す。 ＰＢＳまたは示されるｓｉＲＮＡの１つの２．５ｍｇ／ｋｇの単回用量で処置されたラットにおける、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡの相対レベルを示す。 ２週間にわたり、ＰＢＳ、または示されるｓｉＲＮＡの１つの２．５ｍｇ／ｋｇの用量で週２回処置されたラットにおける、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡの相対レベルを示す。 （上部）ＡＤ－６０５１９の複数回の隔週投与の治療効果を調べるために使用された、実験デザインの概略図を示す。（下部）（ｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡおよび６用量のＰＢＳ、（ｉｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および６用量のＰＢＳ、（ｉｉｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および６用量の２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、または（ｉｖ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および６用量の５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９で処置されたラットにおける、尿ＰＢＧおよび尿ＡＬＡの抑制を描写するグラフを示す。 （ｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡおよび６用量のＰＢＳ（ベースライン）、（ｉｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および６用量のＰＢＳ（生理食塩水）、（ｉｉｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および６用量の２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、または（ｉｖ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および６用量の５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９で処置されたマウスＡＩＰモデルにおける、血清ＰＢＧ（上側グラフ）および血清ＡＬＡ（下側グラフ）の抑制を描写するグラフを示す。 （上部）ＡＤ－６０５１９の複数回の毎週投与の治療効果を調べるために使用された、実験デザインの概略図を示す。（下部）（ｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡおよび４用量のＰＢＳ、（ｉｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および４用量のＰＢＳ、（ｉｉｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および４用量の３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、（ｉｖ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および４用量の１ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、または（ｖ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および４用量の０．３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９で処置されたラットにおける、ラットＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ（ｒＡＬＡＳ１／ＧＡＰＤＨ）の相対レベルを描写するグラフを示す。 （ｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡおよび４用量のＰＢＳ、（ｉｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および４用量のＰＢＳ、（ｉｉｉ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および４用量の３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、（ｉｖ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および４用量の１ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、または（ｖ）ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、ＰＢ、および４用量の０．３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９で処置されたラットにおける、尿ＰＢＧ（上側グラフ）および尿ＡＬＡ（下側グラフ）のレベルを描写するグラフを示す。 その中で、肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡおよび循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制におけるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体の効果が調べられる、非ヒト霊長類試験のデザインを示す概略図である。 ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体による処置に続く、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における肝臓ｍＲＮＡ抑制を示すグラフである。 その中で、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体による処置の効果が調べられる試験過程における様々な時点の、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの正規化血清レベルを示すグラフである。水平軸の日数は、図４８の概略図の日数に対応する。 尿ｃＥＲＤを使用してＡＬＡＳ１抑制をモニターするラット単回投与試験で評価された、正規化ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを示す（投与前レベルの割合として示される）。 その中で、肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡおよび循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制におけるＡＤ－６０５１９の多回投与および単回投与効果が調べられる、非ヒト霊長類試験のデザインを示す概略図である。 試験２４日目（多回投与群）または試験４日目（単回投与群）における、平均相対肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベル（ＰＢＳ対照の％）を示す棒グラフである。 多回投与群（上部グラフ、２４日目までの結果を示す）および単回投与群（下部グラフ、２２日目までの結果を示す）について、ｃＥＲＤを使用して評価された、正規化血清ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベル（投与前レベルの割合として示される）を示すグラフである。 試験４日目（単回投与群）または試験２４日目（多回投与群）における、肝臓ｍＲＮＡ、血清ｍＲＮＡ、および尿ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。個々の動物のデータおよび各群の平均値が示される。 多回投与群について、ｃＥＲＤを使用して評価された、８週間後の正規化血清ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベル（投与前レベルの割合として示される）を示すグラフである。各図形データ点は、３つの動物サンプルの群平均の残留ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ±群標準偏差を表す。 ＡＬＮ－６０５１９（本明細書ではＡＤ－６０５１９とも称される）の構造の概略図である。図５７は、それぞれ出現順に、配列番号５２３８～５２３９を開示する。 ＡＩＰ患者または健常ボランティア（ＮＨＶ）のどちらかから得られた対応血清または尿サンプル中で評価された、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを示す。血清または尿中のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、ｃＥＲＤ法を使用して測定された。ＡＩＰ患者ＡおよびＢでは、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの経時的変動にアクセスするために、第２の血清および尿サンプルのセットが採取された。
ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。本明細書では、ｉＲＮＡと、細胞または哺乳類におけるＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するためにそれらを使用する方法とが記載され、その中でｉＲＮＡはＡＬＡＳ１遺伝子を標的とする。ポルフィリン症（例えばＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰまたはＤｏｓｓポルフィリン症）、急性間欠性ポルフィリン症、先天性赤芽球増殖性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａ ｃｕｔａｎｅａ ｔａｒｄａ）、遺伝性のコプロポルフィリン症（コプロポルフィリン症）、異型ポルフィリン症、赤芽球増殖性プロトポルフィリン症（ＥＰＰ）、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、および乳児期一過性赤血球ポルフィリン症）などのＡＬＡＳ１発現関連障害のための組成物および方法もまた提供される。
ポルフィリン症は遺伝し、または本明細書でポルフィリン経路とも称されるヘム生合成経路における、特定酵素の活性低下または亢進によって引き起こされる後天性疾患であり得る（図１を参照されたい）。ポルフィリンは、主要ヘム前駆体である。ポルフィリンおよびポルフィリン前駆体としては、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ポルホビリノーゲン（ｐｏｒｐｈｏｐｉｌｉｎｏｇｅｎ）（ＰＢＧ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）、ウロポルフィリノーゲンＩまたはＩＩＩ、コプロポルフィリノーゲンＩまたはＩＩＩ、プロトポルフィリノーゲン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｒｉｎｏｇｅｎ）ＩＸ、およびプロトポルフィリンＩＸが挙げられる。ヘムは、ヘモグロビン、ミオグロビン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼの、および呼吸およびＰ４５０肝臓チトクロームをはじめとするチトクロームの、不可欠な部分である。ヘムは、ほとんどのまたは全てのヒト細胞で合成される。ヘムの約８５％は、主にヘモグロビンのために、赤血球系細胞中で産生される。残りのヘムの大部分は、肝臓で産生され、その８０％はチトクローム合成のために使用される。ポルフィリン経路中の特定酵素の欠乏は、不十分なヘム産生をもたらし、また高濃度では細胞または臓器機能に有毒であり得るポルフィリン、前駆体および／またはポルフィリンの蓄積ももたらす。
ポルフィリン症は、神経学的合併症（「急性」）、肌の問題（「皮膚」）またはその両者によって現れることもある。ポルフィリン症は、ポルフィリンまたはそれらの前駆体の過剰産生および蓄積の原発部位によって、分類されてもよい。肝性ポルフィリン症では、ポルフィリンおよびポルフィリン前駆体が肝臓で優勢に過剰産生されるのに対し、赤芽球増殖性ポルフィリン症では、ポルフィリンが骨内の赤血球系細胞で過剰産生される。急性または肝性ポルフィリン症は、神経系機能障害および神経性症状発現をもたらし、それは中枢および辺縁神経系の双方に影響を及ぼし得て、例えば疼痛（例えば腹痛および／または慢性神経障害性疼痛）、嘔吐、神経障害（例えば急性神経障害、進行性神経障害）、筋力低下、痙攣、精神障害（例えば幻覚、うつ病不安、妄想症）、心不整脈、頻脈、便秘、および下痢などの症状をもたらす。皮膚性または赤芽球増殖性ポルフィリン症は、主に皮膚に影響を及ぼして、有痛性であり得る光過敏症、火ぶくれ、壊死、掻痒感、腫脹、および前頭部などの領域における発毛増大などの症状を引き起こす。皮膚病変の引き続く感染は、骨および組織の損失、ならびに瘢痕、損なわれた美観、および指（例えば手指、足指）の欠損をもたらし得る。ほとんどのポルフィリン症は、ヘム生合成経路内の酵素をコードする変異によって引き起こされる。ヘム代謝における遺伝的誤りと関連付けられているポルフィリン症の概要が、図２に提供される。
全てのポルフィリン症が遺伝的とは限らない。例えば肝臓病患者は、肝機能不全の結果としてポルフィリン症を発症することもあり、乳児期における赤血球ポルフィリン症（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｒｐｈｒｉａ）の一過性形態（乳児期一過性赤血球ポルフィリン症）が記述されている（クロフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ），Ｒ．Ｉ．ら著，Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９５年８月；３３（２ Ｐｔ ２）：３３３－６を参照されたい）。ＰＣＴがある患者は、正常な酵素よりも活性が低いＯＲＯ－Ｄ酵素形成のために、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ（ＵＲＯ－Ｄ）活性欠乏を起こし得る（フィリプス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ら著．ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），９８：３１７９－３１８５，２００１年を参照されたい）。
急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）（ポルホビリノーゲン（ＰＢＧ）デアミナーゼ欠乏、またはヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＨＭＢＳ）欠乏とも称される）は、最も一般的なタイプの急性肝性ポルフィリン症である。その他の各種急性肝性ポルフィリン症としては、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、およびＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）が挙げられる。急性肝性ポルフィリン症は、例えばバルワニ（Ｂａｌｗａｎｉ），Ｍおよびデスニック（Ｄｅｓｎｉｃｋ），Ｒ．Ｊ．，ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），１２０：４４９６－４５０４，２０１２年で説明される。
ＡＩＰは、典型的に、酵素ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧデアミナーゼ）の欠乏によって特徴付けられる常染色体優性疾患であり；この酵素は、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＨＭＢシンターゼまたはＨＭＢＳ）としてもまた知られている。ＰＢＧデアミナーゼは、ヘム生合成経路の３番目の酵素であり（図１を参照されたい）、直鎖テトラピロールであるヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）への、ポルホビリノーゲン分子の頭尾縮合を触媒する。ＰＢＧデアミナーゼの異なるイソ型をコードする、選択的スプライスによる転写物変種について記述されている。ＰＢＧデアミナーゼ遺伝子中の変異は、ＡＩＰと関連付けられている。このような変異は、ＰＢＧデアミナーゼ量の低下、および／またはＰＢＧデアミナーゼ活性の低下をもたらすこともある（罹患した個人は、典型的にＰＢＧデアミナーゼ活性に約５０％の低下を有する）。
ＡＩＰおよびその他の急性肝性ポルフィリン症の病態生理の少なくとも２つの異なるモデルがある（例えばリン（Ｌｉｎ）ＣＳ－Ｙら著．，クリニカル ニューロフィジオロジ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ），２０１１年；１２２：２３３６－４４を参照されたい）。１つのモデルによると、ＰＢＧデアミナーゼ欠乏に起因するヘム産生の低下は、エネルギー不全および軸索変性を引き起こす。別の、目下、より支持されているモデルによると、ポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよびＰＢＧ）の沈積は、神経毒性をもたらす。
ＡＩＰは、特定の集団中で１０，０００人に１人程度に高い、有病率を有することが分かっている（例えばスウェーデン北部；フロデルス（Ｆｌｏｄｅｒｕｓ） Ｙら著Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ．２００２年；６２：２８８－９７を参照されたい）。英国を除く、米国およびヨーロッパの一般集団の有病率は、１０，０００人に１人から、２０，０００人に１人程度と推定される。臨床疾患は、ＡＩＰに伴うことが知られている変異を保有する個人の約１０～１５％のみに現れる。しかし浸透度は、特定の変異（例えばＷ１９８Ｘ変異）がある個人の４０％程度に高い。ＡＩＰは、典型的に、思春期前には潜在性である。症状は、男性よりも女性でより一般的である。疾患の有病率は、その不完全な浸透度と長い潜伏期のために、恐らくは過小評価されている。米国では、発作を少なくとも１回起こしたことがある患者が、約２０００人いると推定される。フランス、スウェーデン、英国、およびポーランドでは、約１５０の活性再発性症例があると推定され；これらの患者の大部分は若年女性であり、年齢中央値は３０才である。例えば２０１２年１１月１日にオンライン公開された、エルダ（Ｅｌｄｅｒ）ら著，Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．を参照されたい。
ＡＩＰは、例えば、内臓、辺縁、自律、および中枢神経系に影響を及ぼす。ＡＩＰ症状は変動し、胃腸症状（例えば重症で局在のはっきりしない腹痛、悪心／嘔吐、便秘、下痢、腸閉塞）、尿症状（排尿障害、尿貯留／失禁、または例えば濃い赤色の尿などの色の濃い尿）、神経症状（例えば感覚性神経障害、運動神経障害（例えば脳神経に影響を及ぼし、および／または腕または脚の脱力感をもたらす）、痙攣、神経障害性疼痛（例えば慢性神経障害性疼痛などの進行性神経障害に伴う疼痛）、神経精神症状（例えば精神錯乱、不安、撹拌、幻覚、ヒステリー、譫妄、感情鈍麻、うつ病、恐怖症、精神病、不眠症、傾眠、昏睡）、自律神経系障害（例えば頻脈、高血圧、および／または不整脈などの心血管症状（ｓｙｓｍｐｔｏｍｓ）、ならびに例えば循環カテコールアミンレベル、発汗、情動不安、および／または振戦の増大などのその他の症状をもたらす）、脱水、および電解質異常が含まれる。最も一般的な症状は、腹痛および頻脈である。神経学的顕在化としては、運動および自律神経障害、および痙攣が挙げられる。患者は、頻繁に慢性神経障害性疼痛を有して、進行性神経障害を発症する。再発性発作がある患者は、前駆症状を有することが多い。重度の発作後に、恒久的な麻痺が起きることもある。即座に治療されない重度の発作からの回復は、数週間または数ヶ月かかることもある。急発作は、例えば電解質不均衡からの呼吸筋肉麻痺または心血管破損のために、致命的なこともある（例えばその内容全体を参照によって援用する、サンネル（Ｔｈｕｎｅｌｌ）Ｓ．ヒドロキシメチルビランシンターゼ欠乏（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｂｉｌａｎｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）２００５年９月２７日［２０１１年９月１日に更新］．Ｉｎ：パゴン（Ｐａｇｏｎ）ＲＡ，バード（Ｂｉｒｄ）ＴＤ，ドラン（Ｄｏｌａｎ）ＣＲ，ら著，編者 ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（登録商標）［インターネット］．シアトル（ワシントン州）：ワシントン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ），シアトル；１９９３－（以下、サンネル（Ｔｈｕｎｅｌｌ）（１９９３））を参照されたい。）ヘミン治療法が利用できるようになる前には、ＡＩＰ疾患がある患者の最高２０％が、病気のために死亡した。
ＡＩＰ遺伝子を保有する個人では、肝細胞がんのリスクが増大する。再発性発作がある個人では、肝細胞がんのリスクは特に重篤であり、５０才以降では、リスクは一般集団のほぼ１００倍を超える。
急性ポルフィリン症の発作は、内因性または外因性要因によって誘発されることもある。このような要因が発作を誘発する機構としては、例えば肝臓のＰ４５０酵素に対する要求の増大、および／または肝臓のＡＬＡＳ１活性の誘導が挙げられる。肝臓のＰ４５０酵素に対する要求の増大は、肝臓の遊離ヘムの低下をもたらし、その結果、肝臓のＡＬＡＳ１の合成を誘導する。
増悪因子としては、空腹時（またはクラッシュダイエットや長距離運動競技などに起因する、低下したまたは不十分なカロリー摂取量のその他の形態）、代謝ストレス（例えば感染症、外科手術、国際飛行機旅行、および心理学的ストレス）、内因性ホルモン（例えばプロゲステロン）、喫煙、脂質可溶性外来性化学物質（例えばタバコの煙、特定の処方薬、有機溶媒、殺生剤、アルコール飲料の成分中に存在する化学物質をはじめとする）、内分泌因子（例えば生殖ホルモン（女性は月経前期間中に増悪を経験することもある）、合成エストロゲン、プロゲステロン、排卵誘発剤、およびホルモン代替療法）が挙げられる。例えばサンネル（Ｔｈｕｎｅｌｌ）（１９９３）を参照されたい。
急性肝性ポルフィリン症（例えばＡＩＰ、ＨＣＰ、ＡＤＰ、およびＶＰ）では、例えば、アルコール、バルビツレート系薬物、カルバマゼピン、カリソプロドール、クロナゼパム（高用量）、ダナゾール、ジクロフェナクおよび場合によりその他のＮＳＡＩＤＳ、麦角、エストロゲン、エトクロルビノール（Ｅｔｈｙｃｌｏｒｖｙｎｏｌ）、グルテチミド、グリセオフルビン、メフェニトイン、メプロバメート（またメブタメートおよびチブタメート（ｔｙｂｕｔａｍａｔｅ））、メチプリロン、メトクロプラミド（Ｍｅｔｏｄｏｐｒａｍｉｄｅ）、フェニトイン、プリミドン、プロゲステロンおよび合成プロゲスチン、ピラジナミド、ピラゾロン（アミノピリンおよびアンチピリン）、リファンピン、スクシンイミド（エトサクシミドおよびメトサクシミド）、スルホンアミド抗生物質、およびバルプロ酸をはじめとする、１０００種を超える薬剤が禁忌である。
ＡＩＰの他覚的微候としては、急性発作中の尿の変色（尿が赤色または赤褐色に見えることもある）、そして急性発作中のＰＢＧおよびＡＬＡの尿中濃度の増大が挙げられる。分子遺伝学的検査は、罹患した個人の９８％以上で、ＰＢＧデアミナーゼ（ＨＭＢＳとしてもまた知られている）遺伝子に変異を同定する。サンネル（Ｔｈｕｎｅｌｌ）（１９９３）。
ポルフィリン症（ｐｏｒｐｈｒｉａ）の診断は、家族歴の評価、尿、血液、または便中のポルフィリン前駆体レベルのアセスメント、および／または酵素活性およびＤＮＡ変異解析のアセスメントを伴い得る。ポルフィリン症の鑑別診断は、発作中に（例えばクロマトグラフィーおよび蛍光光度法によって）尿、糞便、および／または血漿中のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡ、ＰＢＧ）の個々のレベルを測定することで、ポルフィリン症のタイプを判定することを伴ってもよい。ＡＩＰの診断は、赤血球ＰＢＧデアミナーゼ活性が、正常レベルの５０％以下であることを確立することによって確認され得る。変異のＤＮＡ検査は、患者およびリスクのある血縁者において実施されてもよい。ＡＩＰの診断は、典型的に、特定の原因（ｃａｕｓｔａｔｉｖｅ）遺伝子変異（例えばＨＭＢＳ変異）を同定するＤＮＡ検査によって確認される。
ＡＩＰの急性発作の現行の管理は、入院、症状のモニタリング、および安全でない薬剤の除去を伴う。急性発作の処置は、例えば腹痛、痙攣、脱水／低ナトリウム血症、悪心／嘔吐、頻脈／高血圧、尿貯留／腸閉塞をはじめとする急性症状（ｓｙｓｍｐｔｏｍｓ）を管理して治療するために、典型的に入院を要する。例えば腹痛は麻薬鎮痛剤で処置してもよく、痙攣は痙攣予防措置で、場合により（多数の抗痙攣薬剤は禁忌であるが）薬剤で処置してもよく、悪心／嘔吐剤は例えばフェノチアジンで処置してもよく、頻脈／高血圧は例えばβ遮断薬で処置してもよい。処置としては、安全でない薬剤の休薬、呼吸機能ならびに筋肉強度および神経学的状態のモニタリングが挙げられる。軽度の発作（例えば不全麻痺または低ナトリウム血症がないもの）は、少なくとも１日あたり３００ｇの静脈内１０％グルコースで処置してもよいが、次第にヘミンが即座に投与されるようになってきている。重症の発作は、典型的にはできる限り速やかに静脈内ヘミン（４～１４日間にわたり毎日３～４ｍｇ／ｋｇ）で処置し、ＩＶヘミンの効果が現れるのを待つ間、ＩＶグルコースによって処置する。典型的に、発作はＩＶヘミンで４日間処置され、ＩＶヘミン投与を待つ間、ＩＶグルコースで処置される。ヘミン投与開始に続いて３～４日以内に、通常は、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルの低下による、付随する臨床的改善がある。
ヘミン（Ｐａｎｈｅｍａｔｉｎ（登録商標）または注射用ヘミン、以前はヘマチンとして知られていた）は、米国内で使用が認可された唯一のヘム製品であり、希少医薬品法下で認可された最初の薬剤である。Ｐａｎｈｅｍａｔｉｎ（登録商標）は、加工赤血球（ＰＲＢＣ）に由来するヘミンであり、塩化物リガンドのある第二鉄イオン（ヘムＢ）を含有するプロトポルフィリンＩＸである。ヘムは、ポルフィリンの肝臓および／または骨髄合成を制限するように作用する。肝性ポルフィリン症の急性発症がある患者において、ヘミンが症状改善を生じる正確な機序は、解明されていない；しかしその作用は、ポルフィリン／ヘム生合成経路の速度を制限する酵素である、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼの（フィードバック）阻害に起因すると思われる。２０１０年１０月のＰａｎｈｅｍａｔｉｎ（登録商標）製品ラベル、Ｌｕｎｄｂｅｃｋ，Ｉｎｃ．を参照されたい。ＡＬＡシンターゼの阻害は、ＡＬＡおよびＰＢＧ、ならびにポルフィリンおよびポルフィリン中間体の産生低下をもたらすはずである。
ヘム製品（例えば、ヘミン）の欠点としては、臨床症状に対する遅延性の効果と、発作再燃の防止ができないことが挙げられる。ヘム（例えば、ヘミン）投与に伴う有害反応としては、静脈炎（例えば、血栓静脈炎）、静脈アクセス障害、抗凝血（または、凝固障害）、血小板減少症、腎機能停止、または鉄過負荷が挙げられ、それは特に、再発性発作のために複数クールのヘミン処置を要する患者において起こり得る。静脈炎を予防するため、再発性発作がある患者では、アクセス用の留置静脈カテーテルが必要である。高用量では、腎障害が起こり得る。まれに報告される副作用としては、発熱、痛み、倦怠感、溶血、アナフィラキシー（ａｎａｐｈａｌａｘｉｓ）、および循環虚脱が挙げられる。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ），Ｋ．Ｅ．，ヒトポルフィリン症の治療と予防へのアプローチ（Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｏｒｐｈｙｒｉａｓ），ポルフィリンハンドブック（Ｔｈｅ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）：ポルフィリンの医学的側面（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ），編者カール（Ｋａｒｌ）Ｍ．カディッシュ（Ｋａｄｉｓｈ），ケビン（Ｋｅｖｉｎ）Ｍ．スミス（Ｓｍｉｔｈ），ロジャー・ギラード（Ｒｏｇｅｒ Ｇｕｉｌａｒｄ）（２００３）（以下、アンダーソン）を参照されたい。
ヘムは、静脈内投与のために安定した形態で調製するのが困難である。それは中性ｐＨで不溶性であるが、ｐＨ８以上で、ヘム水酸化物として調製され得る。Ａｎｄｅｒｓｏｎ。Ｐａｎｈｅｍａｔｉｎは、凍結乾燥ヘミン製剤である。凍結乾燥ヘミンが、静脈内投与のために可溶化されると、分解産物が迅速に生成し；これらの分解産物は、点滴部位における一過性抗凝固効果、および静脈炎の原因である。アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）。ヘムアルブミンおよびアルギン酸ヘム（Ｎｏｒｍｏｓａｎｇ、ヘミンのヨーロッパバージョン）はより安定しており、血栓静脈炎を引き起こすことが潜在的により少ない。しかしアルギン酸ヘムは、米国では使用が認可されていない。Ｐａｎｈｅｍｉｎは、滅菌水でなく３０％ヒトアルブミン中で可溶化することで、点滴のために安定化させてもよいが；アルブミンには血管内容積増大効果があり、またヒト血液から単離されることから、治療コストならびに病原体リスクを増大させる。例えば、上記のアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）を参照されたい。
急性発作の成功裏の治療は、再燃を予防せずまたは遅延させない。ヘミンそれ自体が、ヘムオキシゲナーゼ誘導に起因する再発性発作を引き起こし得るか否かという疑問がある。それでもなお、いくつかの地域（特にフランス）では、多重再発性発作がある若い女性が、予防を達成する目的で、ヘミンの毎週投与で治療されている。
肝臓移植に関する限定的経験は、それが成功すれば、ＡＩＰの効果的治療法であることを示唆する。ヨーロッパでは、ヒト患者においておよそ１２件の移植が実施されており、効果は治癒的でありまたは様々である。肝臓移植は、ＡＬＡおよびＰＢＧの正常な排出を復元して、急性発作を予防し得る。例えばダル（Ｄａｒ），Ｆ．Ｓ．ら著 Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｄｉｓ．Ｉｎｔ．，９（１）：９３－９６（２０１０）を参照されたい。さらにＡＩＰ患者の肝臓を別の患者に移植した場合（「ドミノ移植」）、移植を受けた患者がＡＩＰを発症することもある。
急性ポルフィリン症の長期臨床作用には、例えばポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）上昇などの神経毒性効果による、進行性神経障害に起因することもある慢性神経障害性疼痛がある。神経毒性効果は、例えば、改変ＧＡＢＡシグナル伝達および／または鉄媒介性酸化および反応性酸素化学種（ＲＯＳ）の生成などの毒性ヘム中間体生成と関連付けられ得る。患者は、急性発作に先だってまたはその最中に、神経障害性疼痛に悩まされることもある。高齢患者は、加齢に伴って神経障害性疼痛の増大を経験することもあり、それに対して様々な麻酔薬が典型的に処方される。急性肝性ポルフィリン症患者において、筋電図異常および伝導時間低下が実証されている。注目すべきことに、ＡＩＰ（ＰＢＧデアミナーゼ欠乏）がある未処置非誘導性マウスは進行性運動神経障害を発症し、それは恐らくはポルフィリン前駆体（ＡＬＡ＆ＰＢＧ）レベルの恒常的上昇、ポルフィリンおよび／またはヘム欠乏に起因する、進行性四頭筋神経軸索変性および損失を引き起こすことが示されている（リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）ら著，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０３（８）：１１２７－１１３４，１９９９）。急性ポルフィリン症（例えばＡＤＰ、ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰ）患者では、無症候性患者において、および発作間の症候性患者においてポルフィリン前駆体（ＡＬＡおよびＰＢＧ）レベルが上昇することが多い。したがってＡＬＡＳ１の発現および／または活性レベルを低下させることによる、ポルフィリン前駆体の低下および正常なヘム生合成の回復は、慢性および進行性神経障害の発症を予防および／または最小化することが期待される。治療、例えば長期治療（例えば本明細書に記載されるｉＲＮＡによる周期的治療、例えば本明細書に記載される投与計画に従った治療、例えば毎週または隔週の治療）は、ポルフィリン前駆体、ポルフィリン、ポルフィリン産物またはそれらの代謝産物レベルの上昇を有する、急性ポルフィリン症患者におけるＡＬＡＳ１発現を継続的に低下させ得る。このような治療を必要に応じて提供し、個々の患者の症状（例えば疼痛および／または神経障害）を予防し、またはその発生頻度または重症度を低下させ、および／またはポルフィリン前駆体、ポルフィリン、ポルフィリン産物または代謝産物レベルを低下させてもよい。
ポルフィリン症治療のために使用し得る、新規治療薬を同定する必要性が存在する。上で考察したように、ヘム製品（例えば、ヘミン）などの既存の治療薬は、多数の欠点を有する。例えば臨床症状に対するヘミンの影響は、遅延性で、高価であり、副作用を有することもある（例えば血栓静脈炎、抗凝血、血小板減少症、鉄過負荷、腎機能停止）。本明細書で記載されるような新規治療薬は、より迅速に作用し、静脈炎を誘発せず、皮下投与の利便性を提供し、再発性発作を成功裏に予防し、疼痛（例えば慢性神経障害性疼痛）および／または進行性神経障害を予防または改善し、および／またはヘミンと関連付けられている特定の悪影響（例えば鉄過負荷、肝細胞がんのリスク増大）を引き起こさないことで、これらの欠点および満たされていない患者の要求に対処し得る。
ＡＩＡがある患者としては、再発性発作を患っている患者、および急性散発型発作を患っている患者が挙げられる。再発性発作を患っている患者（ｐａｔｅｉｎｔｓ）では、約５～１０％が、再発性断続的発作（年間２～３回の発作）または再発性発作（年間＞４回の発作）を有する。これらの患者では肝臓移植が検討され、または予防的なヘム（例えば、ヘミン）点滴が投与される見込みが高い。再発性発作患者は、長期の入院、アヘン剤常習癖、および／または静脈網毒性のために、生活の質が劣化する可能性が高い。長期のヘム投与は、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）を誘導し得る。したがって、患者にヘムをやめさせることは困難であり得て、患者によっては、より頻繁な治療が必要である。そのため、臨床医（ｃｌｉｎｉｃｉａｌｓ）によっては、ヘムの使用を最も重篤な発作に限定する。したがって、耐容性がより良い、便利で効果的な予防法および治療法に対する、満たされていない必要性がある。
急性発作を患っている患者に対して、臨床ガイドラインは、できるだけ早期のヘムの投与を提言する。しかし、診断および即時可用薬物の不足の難題を考えると、投与は遅延することもある。ヘム（例えば、ヘミン）の効果の緩慢な開始と、その乏しい耐容性は、改善までの時間を遅延させる。ヘムの投与後でさえも、重篤な腹痛の持続は、数日間にわたる患者へのアヘン剤投与を要求し得る。
ヘムの投与遅延または増悪因子への継続的曝露は、運動神経障害および付随症状（例えば、脱力感、不全麻痺）をはじめとする、より重篤な合併症をもたらし得る。呼吸不全および麻痺は、重症例で起こり得る。神経学的症状からの回復は、解決するためにはるかにより長い時間がかかり得る。したがって、急性発作の文脈で、より迅速な作用開始とより良い耐容性を有する治療法が必要である。
ｍＲＮＡサイレンシングのための標的としてのＡＬＡＳ１の薬理学的妥当性評価は、少なくとも以下の知見によって支持される：ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡは、発作中に強力に上方制御される；パンヘマチンは、ＡＬＡＳ－１を下方制御する；および培養中の肝細胞へのヘムの添加は、ＡＬＡＳ－１ ｍＲＮＡの低下をもたらす。いくつかの知見はまた、肝臓を標的とすることで、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制が達成され得ることを示唆する。例えば、肝臓移植は、治癒的であり；肝臓由来代謝産物は、発作を駆動することが示されている（例えば、Ｄａｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ Ｄｉｓ Ｉｎｔ．９：９３－６（２０１０）；Ｄｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １５４：５７１－２（２０１１）；および Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２３：２２０１－２２０９（２００９）を参照されたい。したがって、ｉＲＮＡ組成物を使用する、例えば、肝臓中のＡＬＡＳ１発現の低下が、ポルフィリン症を治療するために使用され得る。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ組成物は、ポルフィリン症の予防法および急性期治療のために使用され得る。例えば、ｉＲＮＡ組成物が再発性発作状況で予防的に使用されて、ＡＬＡＳ１発現の長期または慢性的抑制が誘導され得て（ＡＬＡ／ＰＢＧの長期または慢性的抑制がもたらされる）、ひいては発作を駆動する再発性ＡＬＡＳ１上方制御が鈍らされる。このような予防的治療は、発作の回数および重症度を低下させ得る。急性発作状況においては、ｉＲＮＡ組成物の投与は、例えば、ＡＬＡ／ＰＢＧレベルを低下させることで、急性発作を治療し得る。
本開示は、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を調節するための方法およびｉＲＮＡ組成物を提供する。特定の実施形態では、ＡＬＡＳ１特異的ｉＲＮＡを使用して、ＡＬＡＳ１の発現が低下または阻害され、その結果ＡＬＡＳ１遺伝子の発現低下がもたらされる。ＡＬＡＳ１遺伝子の発現低下は、１つまたは複数のポルフィリン前駆体、ポルフィリン、またはポルフィリン産物または代謝産物レベルを低下させてもよい。ＡＬＡＳ１遺伝子の発現低下、ならびに関連した１つまたは複数のポルフィリン前駆体および／またはポルフィリンレベルの低下は、例えばポルフィリン症などのＡＬＡＳ１発現関連障害を治療するのに有用であり得る。
本明細書で取り上げる組成物のｉＲＮＡは、３０ヌクレオチド長以下、すなわち１５から３０ヌクレオチド長、一般に１９～２４ヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、その領域は、ＡＬＡＳ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である（本明細書で「ＡＬＡＳ１特異的ｉＲＮＡ」とも称される）。このようなｉＲＮＡの使用は、例えばＡＬＡデヒドラターゼ欠乏ポルフィリン症（Ｄｏｓｓポルフィリン症または鉛ポルフィリン症（ｐｌｕｍｂｏｐｏｒｐｈｙｒｉａ）としても知られる）または急性間欠性ポルフィリン症のようなポルフィリン症などの、哺乳類におけるＡＬＡＳ１発現に伴う病態と関係があるとされる遺伝子のｍＲＮＡ標的化分解を可能にする。非常に低い投与量のＡＬＡＳ１特異的ｉＲＮＡは、特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介して、ＡＬＡＳ１遺伝子発現の顕著な阻害をもたらし得る。ＡＬＡＳ１を標的にするｉＲＮＡは、特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介して、例えば細胞ベースのアッセイ中で、ＡＬＡＳ１遺伝子発現の顕著な阻害をもたらし得る。したがってこれらのｉＲＮＡをはじめとする方法および組成物は、ポルフィリン症（例えば、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（Ｄｏｓｓポルフィリン症）、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、先天性赤芽球増殖性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａ ｃｕｔａｎｅａ ｔａｒｄａ）、遺伝性コプロポルフィリン症（コプロポルフィリン症）、異型ポルフィリン症、赤芽球増殖性プロトポルフィリン症（ＥＰＰ）、および乳児期一過性赤血球ポルフィリン症）などのＡＬＡＳ１発現関連病理過程を治療するのに有用である。
以下の説明は、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡ含有組成物をどのように製造し使用するか、ならびにこの遺伝子の発現によって引き起こされ、または調節される、疾患および障害を治療するための組成物および方法を開示する。本発明で取り上げる医薬組成物の実施形態は、薬学的に許容できる担体と共に、３０ヌクレオチド長以下、一般に１９～２４ヌクレオチド長の領域を含んでなるアンチセンス鎖を有するｉＲＮＡを含み、その領域は、ＡＬＡＳ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。本発明で取り上げる組成物実施形態はまた、３０ヌクレオチド長以下、一般に１９～２４ヌクレオチド長であり、ＡＬＡＳ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である相補性領域を有する、アンチセンス鎖を有するｉＲＮＡも含む。
したがっていくつかの態様では、ＡＬＡＳ１ ｉＲＮＡと薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物、組成物を使用してＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害する方法、および医薬組成物を使用してＡＬＡＳ１発現関連障害を治療する方法が、本発明で取り上げられる。
Ｉ．定義
便宜のため、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語と語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用法と、本節で提供されるその定義との間に明白な矛盾がある場合、本節の定義が優先されるものとする。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」は、通常、それぞれ塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチの塩基対形成特性を実質的に変更することなしに、その他の部分によって置き換えられてもよいことを十分承知している。制限を意図しない例として、その塩基としてイノシンを含んでなるヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成してもよい。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換えてもよい。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げられる組成物および方法に適する。
本明細書の用法では、「ＡＬＡＳ１」（ＡＬＡＳ－１；δ－アミノレブリン酸シンターゼ１；δ－ＡＬＡシンターゼ１；５’－アミノレブリン酸シンターゼ１；ＡＬＡＳ－Ｈ；ＡＬＡＳＨ；ＡＬＡＳ－Ｎ；ＡＬＡＳ３；ＥＣ２．３．１．３７；非特異的ミトコンドリア性５－アミノレブリン酸シンターゼ；ＡＬＡＳ；ＭＩＧ４；ＯＴＴＨＵＭＰ０００００２１２６１９；ＯＴＴＨＵＭＰ０００００２１２６２０；ＯＴＴＨＵＭＰ０００００２１２６２１；ＯＴＴＨＵＭＰ０００００２１２６２２；転移誘起タンパク質４；ＥＣ２．３．１としてもまた知られている）は、哺乳類ヘム生合成経路中の第１の酵素であり、典型的に律速酵素である、核がコードするミトコンドリア酵素を指す。ＡＬＡＳ１は、グリシンのスクシニルＣｏＡとの縮合を触媒して、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を生成する。ヒトＡＬＡＳ１遺伝子は、広範に発現されて、染色体３ｐ２１．１上に見られ、典型的に６４０個のアミノ酸の配列をコードする。対照的に、イソ酵素をコードするＡＬＡＳ－２遺伝子は、赤血球中のみで発現されて、Ｘｐ１１．２１染色体（ｃｈｒｏｍｏｘｏｍｅ）上に見られ、典型的に５５０個のアミノ酸の配列をコードする。本明細書の用法では、「ＡＬＡＳ１タンパク質」は、あらゆる種（例えばヒト、マウス、非ヒト霊長類）からのＡＬＡＳ１のあらゆるタンパク質変種、ならびにＡＬＡＳ１活性を保持するそのあらゆる変異体および断片を意味する。同様に、「ＡＬＡＳ１転写物」は、あらゆる種（例えばヒト、マウス、非ヒト霊長類）からのＡＬＡＳ１のあらゆる転写変異体を指す。ヒトＡＬＡＳ１ｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿０００６８８．４（図３Ａおよび図３Ｂ；配列番号１）にある。別のヒトＡＬＡＳ１ｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿０００６８８．５（図４Ａおよび図４Ｂ；配列番号３８２）にある。コードされた成熟ＡＬＡＳ１タンパク質レベルは、ヘムによって調節され、高レベルのヘムがミトコンドリア中の成熟酵素を下方制御する一方で、低レベルのヘムは上方制御する。同一タンパク質をコードする、選択的スプライスによる複数の変種が同定されている。
本明細書の用法では、「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ」、「ｉＲＮＡ剤」、または「ＲＮＡｉ剤」という用語は、本明細書で定義されるＲＮＡを含有し、例えばＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じて、ＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する作用物質を指す。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１発現の阻害をもたらす。ＡＬＡＳ１発現の阻害は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの低下、またはＡＬＡＳ１タンパク質レベルの低下に基づいて評価されてもよい。本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡをはじめとする、ＡＬＡＳ１遺伝子の転写中に形成される、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。配列の標的部分は、その部分またはその近辺における、ｉＲＮＡ指向切断のための基質としての役割を果たすのに、少なくとも十分長い。例えば標的配列は、例えば１５～３０ヌクレオチド長など、一般に９～３６ヌクレオチド長であり、その間の部分的な範囲を全て含む。非限定的例として、標的配列は、１５～３０ヌクレオチド、１５～２６ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１５～２２ヌクレオチド、１５～２１ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチド、１５～１９ヌクレオチド、１５～１８ヌクレオチド、１５～１７ヌクレオチド、１８～３０ヌクレオチド、１８～２６ヌクレオチド、１８～２３ヌクレオチド、１８～２２ヌクレオチド、１８～２１ヌクレオチド、１８～２０ヌクレオチド、１９～３０ヌクレオチド、１９～２６ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、１９～２２ヌクレオチド、１９～２１ヌクレオチド、１９～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、２０～２６ヌクレオチド、２０～２５ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド、２０～２３ヌクレオチド、２０～２２ヌクレオチド、２０～２１ヌクレオチド、２１～３０ヌクレオチド、２１～２６ヌクレオチド、２１～２５ヌクレオチド、２１～２４ヌクレオチド、２１～２３ヌクレオチド、または２１～２２ヌクレオチドであり得る。
本明細書の用法では、「配列を含んでなる鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって記載される、ヌクレオチド鎖を含んでなるオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、当業者には理解されるであろうように、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間と、それに続く洗浄を含んでもよい、ストリンジェントな条件であり得る。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用されてもよい。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、２つの配列の相補性試験に最適な条件のセットを判定することができる。
例えば本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ内などのｉＲＮＡ内の相補性配列としては、第１のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第２のヌクレオチド配列を含んでなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、塩基対合が挙げられる。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で、第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは例えばＲＩＳＣ経路を通じた遺伝子発現阻害など、それらの究極的用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最高３０塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の、しかし一般的には５、４、３または２つ以下のミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含んでなるｄｓＲＮＡがあって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含んでなる場合、それは本明細書に記載される目的で、なおも「完全に相補的」と称されてもよい。
「相補的」配列は、本明細書の用法では、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りは、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから生成される塩基対もまた含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、本明細書において、それらの使用状況から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間で、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列間で、マッチする塩基について使用され得る。
本明細書の用法では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えばＡＬＡＳ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ）の連続部分と実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列が、ＡＬＡＳ１をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。例えばポリヌクレオチドは、配列が、ＡＬＡＳ１をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的であれば、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、本明細書の用法では、標的ＲＮＡに関して「センス」および「アンチセンス」配向を有するとされる、２本の逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含んでなる、ハイブリダイズ二本鎖領域を有する、ＲＮＡ分子または分子複合体を含むｉＲＮＡを指す。二本鎖領域は、例えばＲＩＳＣ経路を通じた、所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にするあらゆる長さであり得るが、例えば１５～３０塩基対の長さなどの典型的に９～３６塩基対の長さの範囲である。９～３６塩基対の間の二本鎖を考察すると、二本鎖は、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６などのこの範囲内のあらゆる長さ、および１５～３０塩基対、１５～２６塩基対、１５～２３塩基対、１５～２２塩基対、１５～２１塩基対、１５～２０塩基対、１５～１９塩基対、１５～１８塩基対、１５～１７塩基対、１８～３０塩基対、１８～２６塩基対、１８～２３塩基対、１８～２２塩基対、１８～２１塩基対、１８～２０塩基対、１９～３０塩基対、１９～２６塩基対、１９～２３塩基対、１９～２２塩基対、１９～２１塩基対、１９～２０塩基対、２０～３０塩基対、２０～２６塩基対、２０～２５塩基対、２０～２４塩基対、２０～２３塩基対、２０～２２塩基対、２０～２１塩基対、２１～３０塩基対、２１～２６塩基対、２１～２５塩基対、２１～２４塩基対、２１～２３塩基対、または２１～２２塩基対をはじめとするが、これに限定されるものではない、その間のあらゆる部分的範囲であり得る。ダイサーおよび類似酵素を用いたプロセッシングによって、細胞中で作成されるｄｓＲＮＡは、一般に１９～２２塩基対の範囲の長さである。ｄｓＤＮＡの二本鎖領域の１本の鎖は、標的ＲＮＡの領域と実質的に相補的な配列を含んでなる。二本鎖構造を形成する２本の鎖は、少なくとも１つの自己相補的領域を有する単一ＲＮＡ分子に由来し得て、または２つ以上の別個のＲＮＡ分子から生成され得る。二本鎖領域が、単一分子の２本の鎖から生成される場合、分子は、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とそれぞれのその他の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの一本鎖（本明細書で「ヘアピンループ」と称される）によって隔てられる、二本鎖領域を有し得る。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含んでなり得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含んでなり得る。ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は、必ずしもそうである必要はないが、共有結合的に連結され得る。２本の鎖が、ヘアピンループ以外の手段によって共有結合的に連結される場合、結合構造は「リンカー」と称される。「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上述したようなｄｓＲＮＡに言及するために、本明細書で使用される。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために、細胞または生物に導入された「一本鎖ｓｉＲＮＡ」であってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼアルゴノート２を結合し、それは次に、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に１５～３０個のヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡのデザインおよび試験は、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，１０１，３４８号明細書、およびリマ（Ｌｉｍａ）ら著，（２０１２）セル（Ｃｅｌｌ）１５０：８８３－８９４に記載される。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれでも（例えば表２、３、６、７、８、９、１４、１５、１８、および２０または表２１～４０で提供される配列）、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用してもよく、またはリマ（Ｌｉｍａ）ら著，（２０１２）セル（Ｃｅｌｌ）１５０：８８３－８９４に記載される方法によって化学的に修飾して使用してもよい。
別の態様では、ＲＮＡ剤は「一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子」である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列と相補的である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡと塩基対を形成して翻訳機構を物理的に妨害することにより、化学量論的様式で翻訳を阻害し得る。ディアス（Ｄｉａｓ），Ｎ．ら著，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照されたい。代案としては、一本鎖アンチセンス分子は、標的とハイブリダイズ（ｈｙｄｒｉｄｉｚｉｎｇ）して、ＲＮａｓｅＨ切断事象を通じて標的を切断することで、標的ｍＲＮＡを阻害する。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１０～約３０ヌクレオチド長であってもよく、標的配列と相補的な配列を有する。例えば一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、例えば表２、３、６、７、８、９、１４、１５、１８、および２０または表２１～４０のいずれか１つで提供される配列などの、本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか１つからの、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続ヌクレオチドである配列を含んでなってもよい。
当業者は、「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語が、天然に発現されまたは見られるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の、１つまたは複数のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類似体または誘導体を含んでなる、ＲＮＡの類似体および誘導体もまた包含することを認識する。厳密に言えば「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基とリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は、１、２または３個のリン酸塩部分があるリボヌクレオシドである。しかし「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」という用語は、本明細書の用法では同等物と見なし得る。ＲＮＡは、例えば本明細書で以下に記載されるように、核酸塩基構造中で、リボース構造中で、またはリボースリン酸主鎖構造中で修飾され得る。しかしリボヌクレオシド類似体または誘導体を含んでなる分子は、二本鎖を形成する能力を保たなくてはならない。非限定的実施例として、ＲＮＡ分子はまた、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｔｉｄｅ）、５’ホスホロチオエート基を含んでなるヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結する末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、非環式ヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、２’－アミノ修飾ヌクレオシド、２’－アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホロアミダートまたは非天然塩基包含ヌクレオシド、またはそのあらゆる組み合わせをはじめとするが、これに限定されるものではない、少なくとも１つの修飾リボヌクレオシドを含み得る。代案としては、ＲＮＡ分子は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０以上の、最高でｄｓＲＮＡ分子の全長の修飾リボヌクレオシドを含んでなり得る。修飾は、ＲＮＡ分子中のこのような複数の各修飾リボヌクレオシドで同じでなくてもよい。一実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物中での使用が検討される修飾ＲＮＡは、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）であり、それは必要な二本鎖構造を形成する能力を有し、例えばＲＩＳＣ経路を通じた標的ＲＮＡの特異的分解を可能にし、またはそれを媒介する。
一態様では、修飾リボヌクレオシドはデオキシリボヌクレオシドを含む。このような場合、ｉＲＮＡ剤は、例えばデオキシヌクレオシドオーバーハング、またはｄｓＲＮＡの二本鎖部分内の１つまたは複数のデオキシヌクレオシドをはじめとする、１つまたは複数のデオキシヌクレオシドを含んでなり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、例えば、片方または双方の鎖内で、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％以上（しかし１００％ではない）のデオキシリボヌクレオシドのデオキシリボヌクレオシド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｅｓ）百分率を構成する。その他の実施形態では、「ｉＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ分子（例えば、天然二本鎖ＤＮＡ分子または１００％デオキシヌクレオシド含有ＤＮＡ分子）を包含しない。一態様では、ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する、一本鎖ＲＮＡを含む。理論による拘束は望まないが、細胞に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡに分解される（シャープ（Ｓｈａｒｐ）ら著、ジーンズアンドデベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．）、２００１年、第１５巻、ｐ．４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるダイサーは、ｄｓＲＮＡをプロセスして、特徴的な２塩基３’オーバーハングがある１９～２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（バーンシュタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）ら著、２００１年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４０９巻、ｐ．３６３）。次にｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に組み込まれ、１つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が、標的認識を誘導できるようにする（ニカネン（Ｎｙｋａｎｅｎ）ら著、２００１年、セル（Ｃｅｌｌ）、第１０７巻、ｐ．３０９）。適切な標的ｍＲＮＡとの結合に際して、ＲＩＳＣ内の１つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘発する（エルバシャー（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら著、２００１年、ジーンズアンドデベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．）、第１５巻、ｐ．１８８）。したがって一態様では、本発明は、ＲＩＳＣ複合体形成を促進して、標的遺伝子のサイレンシングをもたらす、一本鎖ＲＮＡに関する。
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えばｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端がその他の鎖の５’末端を越えて伸び、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含んでなり得て；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含んでなり得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含んでなり得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあってもよい。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に、１～１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に、１～１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
本明細書でｄｓＲＮＡに関して用いられる「平滑化された」または「平滑末端化された」という用語は、ｄｓＲＮＡの所与の末端に不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がない、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。ｄｓＲＮＡ末端の片方または双方が、平滑化され得る。ｄｓＲＮＡの双方の末端が平滑化されている場合、ｄｓＲＮＡは平滑末端化されたと言われる。明確化のために言うと、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、双方の末端が平滑化されたｄｓＲＮＡであり、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖である。
「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えば標的配列と実質的に相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡ鎖を指す。本明細書の用法では、「領域相補性」という用語は、例えば本明細書で定義される標的配列などの配列と、実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあってもよい。一般に、最も耐容されるミスマッチは、例えば５’および／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド内などの末端領域にある。
「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域と、実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ鎖を指す。
本明細書の用法では、一実施形態では、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定した核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡなどの核酸またはそれからｉＲＮＡが転写されるプラスミドを含んでなる還元性水性内部を覆う、脂質の小胞を意味する。ＳＮＡＬＰは、例えば米国特許出願公開第２００６０２４００９３号明細書、米国特許出願公開第２００７０１３５３７２号明細書、および国際公開第２００９０８２８１７号パンフレットに記載される。これらの出願は、その全体が参照により援用される。
「細胞に導入する」は、ｉＲＮＡに関する場合は、当業者には理解されるように、細胞中への取り込みまたは吸収を容易にし、またはもたらすことを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、助力を受けない拡散性または活性細胞過程を通じて、または助剤または装置によって生じ得る。この用語の意味は、生体外の細胞に限定されず；ｉＲＮＡはまた、細胞が生きている生物の一部である場合にも、「細胞に導入され」得る。このような場合、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば生体内送達のために、ｉＲＮＡを組織部位に注射し、または全身投与し得る。生体内送達はまた、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，０３２，４０１号明細書および米国特許第５，６０７，６７７号明細書、および米国特許公開第２００５／０２８１７８１号明細書に記載されるものなどのβ－グルカン送達系によることもできる。細胞への生体外導入は、電気穿孔およびリポフェクションなどの当該技術分野で公知の方法を含む。さらなるアプローチは、本明細書で以下に記載され、または当該技術分野で公知である。
本明細書の用法では、「の発現を調節する」という用語は、対照細胞中のＡＬＡＳ１の発現と比較した、本明細書に記載されるｉＲＮＡ組成物で処置された細胞中におけるＡＬＡＳ１遺伝子発現の少なくとも部分的「阻害」または部分的「活性化」を指す。対照細胞としては、未処置細胞、または非標的化対照ｉＲＮＡで処置された細胞が挙げられる。
「活性化する」、「高める」、「の発現を上方制御する」、「の発現を増大させる」などの用語は、それらがＡＬＡＳ１遺伝子に言及する限りにおいて、本明細書で、その中でＡＬＡＳ１遺伝子が転写される、第１の細胞または細胞群から単離されまたはその中で検出されてもよい、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ量の増大によって顕在化する、ＡＬＡＳ１遺伝子発現の少なくとも部分的活性化に言及し、第１の細胞または細胞群は、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現が増大するように処置されている。
一実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％活性化される。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子は、本発明で取り上げるｉＲＮＡ投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％活性化される。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％以上活性化される。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子発現は、未処置細胞中における発現と比較して、本明細書に記載されるｉＲＮＡで処置された細胞中で、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上増大される。小型ｄｓＲＮＡによる発現の活性化は、例えば、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、リ（Ｌｉ）ら著，２００６年、米国アカデミー科学紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）．１０３：１７３３７－４２、および米国特許第２００７０１１１９６３号明細書および米国特許第２００５２２６８４８号明細書に記載される。
「発現停止する」、「の発現を阻害する」、「の発現を下方制御する」、「の発現を抑制する」などの用語は、それらがＡＬＡＳ１遺伝子に言及する限りにおいて、本明細書で、例えばＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現、ＡＬＡＳ１タンパク質発現、またはＡＬＡＳ１遺伝子発現と機能的に連結した別のパラメータ（例えば血漿または尿中のＡＬＡまたはＰＢＧ濃度）に基づく評価による、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制に言及する。例えばＡＬＡＳ１発現の阻害は、その中でＡＬＡＳ１遺伝子が転写され、対照と比較してＡＬＡＳ１遺伝子発現が阻害されるように処置された、第１の細胞または細胞群から単離されまたはその中で検出されてもよい、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ量の低下によって顕在化してもよい。対照は、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない、第２の細胞または細胞群（対照細胞）であってもよい。阻害の程度は、通常は、例えば、
Figure 2023120219000008
 のように、対照レベルの百分率として表される。
代案としては、阻害の程度は、例えばＡＬＡＳ１遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または１つまたは複数のポルフィリンレベルなどの、ＡＬＡＳ１遺伝子発現と機能的に連結したパラメータ低下の観点から示されてもよい。ＡＬＡＳ１遺伝子の発現と機能的に連結したパラメータの低下は、同様に、対照レベルの百分率として表されてもよい。原則的に、ＡＬＡＳ１遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム工学によって、ＡＬＡＳ１を発現するあらゆる細胞中で、あらゆる適切なアッセイによって判定してもよい。しかし所与のｉＲＮＡが、ＡＬＡＳ１遺伝子発現を特定程度に阻害するかどうか、ひいては本発明に包含されるかどうかを判定するために、参照が必要な場合は、下の実施例で提供されるアッセイが、このような参照になるであろう。
例えば場合によっては、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現は、本発明で取り上げるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子は、本発明で取り上げるｉＲＮＡ投与によって、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上抑制される。
本明細書の用法では、ＡＬＡＳ１発現の文脈で、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置」などの用語は、ＡＬＡＳ１発現に関連した病理過程（例えばポルフィリン症など、ポルフィリンにまたはポルフィリン経路欠陥に伴う病理過程）の軽減または緩和を指す。本発明の文脈では、それが（ＡＬＡＳ１発現に関連した病理過程以外の）以下に列挙される別の病状のいずれかに関する限りにおいて、「処置する」、「処置」などという用語は、このような病状に伴う少なくとも１つの症状を予防、軽減または緩和すること、またはこのような病状の進行または予期される進行を遅延または逆転させることを意味する。例えば本明細書で取り上げる方法は、ポルフィリン症を治療するのに用いた場合に、ポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状（例えば疼痛）を緩和または予防し、ポルフィリン症に伴う発作の重症度または発生頻度を低下させ、憎悪条件への曝露に際してポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状の発作が起きる可能性を低下させ、ポルフィリン症に伴う発作を短縮し、および／またはポルフィリン症に伴う病状（例えば肝細胞がんまたは神経障害（例えば進行性神経障害））を発症するリスクを低下させるのに役立ってもよい。したがって、文脈上明白に別段の記載がない限り、「治療する」、「治療」などという用語は、例えばＡＬＡＳ１発現関連障害および／または障害症状の予防などの予防法を包含することが意図される。
「低下させる」とは、疾病マーカまたは症状の文脈で、このようなレベルの統計的にまたは臨床的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上であり得て、典型的に、このような疾患がない個人の正常範囲内にあると、一般に認められたレベルに低下する。
本明細書の用法では「治療有効量」および「予防有効量」という語句は、ＡＬＡＳ１発現に関連した治療、予防、または病理過程管理において、治療効果を提供する量を指す。治療的に有効な特定量は、通常の開業医によって容易に判定され得て、例えば病理過程タイプ、患者の病歴および年齢、病理過程段階、およびその他の薬剤の投与などの、当該技術分野で公知の要因次第で変動してもよい。
本明細書の用法では、「医薬組成物」は、薬理学的有効量のｉＲＮＡと薬学的に許容できる担体とを含んでなる。本明細書の用法では、「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」とは、意図される薬理学的、治療的または予防的結果を生じるのに効果的なｉＲＮＡの量を指す。例えばＡＬＡＳ１発現関連疾患を治療する方法において（例えばポルフィリン症を治療する方法において）、有効量としては、ポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状を低下させるのに有効な量、発作発生頻度を低下させるのに有効な量、増悪因子への曝露に際して起きるポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状の発作可能性を低下させるのに有効な量、またはポルフィリン症に伴う病状（例えば神経障害（例えば進行性神経障害）、肝細胞がん）を発症するリスクを低下させるのに有効な量が挙げられる。例えば疾患または障害に伴う測定可能パラメータに少なくとも１０％の低下があれば所与の臨床治療が効果的と見なされる場合、その疾患または障害のための治療薬の治療有効量は、パラメータに少なくとも１０％の低下をもたらすのに必要な量である。例えばＡＬＡＳ１を標的にするｉＲＮＡの治療有効量は、ＡＬＡＳ１タンパク質レベルを例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％などのあらゆる測定可能量に低下させ得る。
「薬学的に許容できる担体」という用語は、治療薬投与のための担体を指す。このような担体としては、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。用語は、細胞培養培地を明確に除外する。経口的に投与される薬剤では、薬学的に許容可能な担体としては、薬学的に許容可能な賦形剤などの不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、平滑剤、甘味剤、着香剤、着色剤および保存料が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、および乳糖が挙げられる一方で、コーンスターチおよびアルギン酸が適切な崩壊剤である。結合剤としては、デンプンおよびゼラチンが挙げられる一方で、存在する場合、平滑剤は、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸または滑石である。必要に応じて、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングして、胃腸管内の吸収を遅延させてもよい。製剤に含まれる作用物質については、本明細書で以下にさらに詳しく説明する。
数値または数値範囲に言及する場合、「約」という用語は、言及される数値または数値範囲が、実験的変動内（または統計学的実験誤差内）の近似値であることを意味し、したがって数値または数値範囲は、例えば記述される数または数値範囲から、１％～１５％変動してもよい。
ＩＩ．ｉＲＮＡ剤
本明細書に記載されるのは、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡ剤である。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、細胞または対象中で（例えばポルフィリン症を有するヒトなどの哺乳類中で）、ＡＬＡＳ１遺伝子発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、ｄｓＲＮＡは、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な相補性領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性領域は３０ヌクレオチド長以下、一般に１９～２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、ＡＬＡＳ１遺伝子を発現する細胞との接触に際して、例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法による、またはウエスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法によるアッセイで、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を少なくとも１０％阻害する。一実施形態ではｉＲＮＡ剤は、細胞または哺乳類中で、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を活性化する。ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、初代培養肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代培養細胞などの細胞培養中の、または対象からの生物学的サンプル中のＡＬＡＳ１遺伝子の発現は、ｂＤＮＡまたはＴａｑＭａｎアッセイなどによってＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを測定することで、または例えば、ウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用して、免疫蛍光分析などによってタンパク質レベルを測定することで、アッセイし得る。
ｄｓＲＮＡは２本のＲＮＡ鎖を含み、それは十分に相補的であり、その中でｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である、相補性領域を含む。標的配列は、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせると、２本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に相補的な領域を含む。一般に二本鎖構造は、１５～３０、より一般的には１８～２５、なおもより一般的には１９～２４、最も一般的には１９～２１塩基対の長さである。同様に、標的配列との相補性領域は、１５～３０、より一般的には１８～２５、なおもより一般的には１９～２４、最も一般的には１９～２１ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５～２０ヌクレオチド長であり、別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは２５～３０ヌクレオチド長である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のＲＮＡ分子の一部であり、それはｍＲＮＡ分子であることが多い。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「部分」は、ＲＮＡｉ指向切断（すなわちＲＩＳＣ経路を通じた切断）の基質として十分長い、ｍＲＮＡ標的の連続配列である。９塩基対程度に短い二本鎖を有するｄｓＲＮＡは、状況によっては、ＲＮＡｉ指向ＲＮＡ切断を媒介し得る。ほとんどの場合、標的は、少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば１５～３０ヌクレオチド長である。
当業者はまた、二本鎖領域が、例えば１５～３０塩基対など、例えば９～３６塩基対の二本鎖領域などのｄｓＲＮＡの主要機能部分であることを認識するであろう。したがって一実施形態では、それがプロセッシングされて、例えば所望のＲＮＡを切断標的とする１５～３０塩基対などの機能的二本鎖になる限りでは、３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって当業者は、一実施形態では、今度は、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは天然ｍｉＲＮＡでない。別の実施形態では、ＡＬＡＳ１発現を標的化するのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大型のｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞中で生じない。
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含んでもよい。ｄｓＲＮＡは、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるものなどの自動化ＤＮＡ合成機の使用によって、以下でさらに考察されるように、当該技術分野で公知の標準法によって合成され得る。一実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子はヒトＡＬＡＳ１遺伝子である。別の実施形態では、ＡＬＡＳ１遺伝子は、マウスまたはラットＡＬＡＳ１遺伝子である。
特定の実施形態では、第１の配列は、例えば、表２１～４０中などの本明細書で開示されるセンス配列を含む、ｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２の配列は、例えば、表２１～４０中などの本明細書で開示されるアンチセンス配列を含む、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖である。
特定の実施形態では、第１の配列は、表２または表３からのセンス配列をはじめとするｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２の配列は、表２または表３からのアンチセンス配列をはじめとするｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖である。実施形態では、第１の配列は、表２、３、６、７、８、９、１４、または１５からのセンス配列をはじめとするｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２の配列は、表２、３、６、７、８、９、１４、または１５からのアンチセンス配列をはじめとするｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖である。実施形態では、第１の配列は、表２、３、６、７、８、９、１４、１５、１８または２０からのセンス配列をはじめとするｄｓＲＮＡのセンス鎖であり、第２の配列は、表２、３、６、７、８、９、１４、１５、１８または２０からのアンチセンス配列をはじめとするｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖である。
一態様では、ｄｓＲＮＡは、少なくともセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含み得て、それによってセンス鎖は、例えば、表２１～４０中などの本明細書で提供されるセンス配列から選択され、センス鎖に対応するアンチセンス鎖は、例えば、表２１～４０中などの本明細書で提供されるアンチセンス配列から選択される。
一態様では、ｄｓＲＮＡは、少なくともセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含み得て、センス鎖は、表２および３で提供される配列群から選択されて、表２および３から選択されるセンス鎖のアンチセンス鎖に対応する。さらなる態様では、ｄｓＲＮＡは、少なくともセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含み得て、センス鎖は、表２、３、６、７、８、９、１４、および１５で提供される配列群から選択されて、表２、３、６、７、８、９、１４、および１５から選択されるセンス鎖のアンチセンス鎖に対応する。さらなる態様では、ｄｓＲＮＡは、少なくともセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含み得て、センス鎖は、表２、３、６、７、８、９、１４、１５、１８、および２０で提供される配列群から選択されて、表２、３、６、７、８、９、１４、１５、１８、および２０から選択されるセンス鎖のアンチセンス鎖に相当する。
実施形態では、ｉＲＮＡは、（例えば、前述のｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾を含む）ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０９００、ＡＤ－６０９３５、ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６１１９０、ＡＤ－６１１９１、ＡＤ－６０８６５、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０８７６、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０８８７、ＡＤ－６０９２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０９２４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０９２５、ＡＤ－６０９２６、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８１９、ＡＤ－６１１４０、ＡＤ－６１１４１、ＡＤ－６１１４２、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６１１４３、ＡＤ－６１１４４、ＡＤ－６１１４５、ＡＤ－６１１４６、ＡＤ－６０８９２、またはＡＤ－６０４１９である。実施形態では、ｉＲＮＡは、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０９００、ＡＤ－６０９３５、ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６１１９０、ＡＤ－６１１９１、ＡＤ－６０８６５、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０８７６、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０８８７、ＡＤ－６０９２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０９２４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０９２５、ＡＤ－６０９２６、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８１９、ＡＤ－６１１４０、ＡＤ－６１１４１、ＡＤ－６１１４２、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６１１４３、ＡＤ－６１１４４、ＡＤ－６１１４５、ＡＤ－６１１４６、ＡＤ－６０８９２、またはＡＤ－６０４１９のアンチセンス配列から選択される、（１つまたは複数の（例えば、全ての修飾）をはじめとする）アンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖を含んでなる。実施形態では、ｉＲＮＡは、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０９００、ＡＤ－６０９３５、ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６１１９０、ＡＤ－６１１９１、ＡＤ－６０８６５、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０８７６、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０８８７、ＡＤ－６０９２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０９２４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０９２５、ＡＤ－６０９２６、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８１９、ＡＤ－６１１４０、ＡＤ－６１１４１、ＡＤ－６１１４２、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６１１４３、ＡＤ－６１１４４、ＡＤ－６１１４５、ＡＤ－６１１４６、ＡＤ－６０８９２、またはＡＤ－６０４１９から選択される、センス配列（および／または１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾））を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖を含んでなる。
実施形態では、ｉＲＮＡは、（ｉ）ＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＵまたはＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＴＵＵＣＵＧＧＵの配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＣＡＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＣＵＣＡＵＣＵＵＡの配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖を含んでなる。実施形態では、アンチセンス鎖および／またはセンス鎖の１つまたは複数のヌクレオチドは、本明細書に記載されるように修飾される。
実施形態では、ｉＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０４８９のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＡＤ－６０４８９のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖（および／またはＡＤ－６０４８９のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾）を含んでなる。
実施形態では、ｉＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０５１９のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＡＤ－６０５１９のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖（および／またはＡＤ－６０４８９のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾）を含んでなる。
実施形態では、ｉＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６１１９３のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＡＤ－６１１９３のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖（および／またはＡＤ－６０４８９のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾）を含んでなる。
実施形態では、ｉＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０８１９のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖、および／または（ｉｉ）ＡＤ－６０８１９のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス配列（および／またはＡＤ－６０４８９のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の１つまたは複数の（例えば、全ての）修飾）を含んでなる。
実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現を阻害するためのｉＲＮＡが提供され、ｄｓＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９のアンチセンス配列を含んでなり、またはそれからなるアンチセンス鎖（または対応する未修飾アンチセンス配列）および／または（ｉｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９のセンス配列を含んでなり、またはそれからなるセンス鎖（または対応する未修飾アンチセンス配列）を含んでなる。実施形態では、ｉＲＮＡは、（ｉ）ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９のアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖および／または（ｉｉ）ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖および／またはセンス鎖が、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９の対応するアンチセンスおよび／またはセンス配列と、１、２、または３つのヌクレオチドが異なること以外は、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、またはＡＤ－６０８１９のセンス配列からなるセンス鎖を含んでなる。
ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、およびＡＤ－６０８１９の配列および修飾は、本明細書で開示される表４４に示される。
一実施形態では、ｉＲＮＡは、ＡＬＮ－６０５１９である。ＡＬＮ－６０５１９は、３つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基を含有するリガンドに共有結合する、化学的に合成された二本鎖オリゴヌクレオチドである（図５７に示される）。一実施形態では、ＡＬＮ－６０５１９の全てのヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆ修飾されて、３’－５’リン酸ジエステル結合を介して連結され、したがってオリゴヌクレオチドの糖－リン酸骨格を形成する。ＡＬＮ－６０５１９のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、２１個および２３個のヌクレオチドを含有する。ＡＬＮ－６０５１９のセンス鎖の３’末端は、リン酸ジエステル結合を介して三分岐ＧａｌＮＡｃ部分（Ｌ９６と称される）にコンジュゲートされる。アンチセンス鎖は、３’末端に２つおよび５’末端に２つの４つのホスホロチオエート結合を含有する。ＡＬＮ－６０５１９のセンス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含有する。ＡＬＮ－６０５１９のセンス鎖の２１個のヌクレオチドは、アンチセンス鎖の相補的な２１個のヌクレオチドとハイブリダイズし、したがって２１個のヌクレオチド塩基対とアンチセンス鎖の３’末端の２つの塩基オーバーハングとを形成する。ＡＬＮ－６０５１９のセンス鎖およびアンチセンス鎖の２つの一本鎖は、５’－ヒドロキシル基がジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）エーテルとして保護される、標準ホスホラミダイト化学反応を用いて、従来の固相オリゴヌクレオチド合成によって合成され得る。各鎖は、保護されたヌクレオシドホスホラミダイトの逐次の付加によって、３’末端から５’末端に向けて構築され得る。
これらの態様では、２配列の一方は２配列の他方に相補的であり、配列の１つは、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現によって生じるｍＲＮＡ配列と実質的に相補的である。したがってｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、１つ目のオリゴヌクレオチドは、本明細書においてセンス鎖と説明され、２つ目のオリゴヌクレオチドは、センス鎖に対応するアンチセンス鎖と説明される。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
当業者は、２０～２３塩基対、特に２１塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している（エルバシル（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら著，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７－６８８８）。しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造が、同様に効果的であり得ることを見出している。上述の実施形態では、本明細書中の表で提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最低限２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている、本明細書に記載される配列の１つを有するより短い二本鎖が、上で説明したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であってもよいことは、合理的に予想され得る。したがって本明細書に記載される配列の１つからの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続ヌクレオチドの部分的配列を有し、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害する能力が、完全長配列を含んでなるｄｓＲＮＡの５、１０、１５、２０、２５、または３０％の阻害を超えない範囲で異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって意図される。
さらに本明細書の表で提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断に対する感受性が高いＡＬＡＳ１転写物の部位を同定する。したがって本発明は、このような配列の１つ内を標的とするｉＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書の用法では、ｉＲＮＡが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、ｉＲＮＡはＲＮＡ転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＡＬＡＳ１遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結する、表２、３、６、７、８、９、１４、１５、１８、２０および表２１～４０で本明細書に提供される配列の１つからの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般に１５～３０ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的ＲＮＡの切断を誘導する適合性には、幅広い多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的ＲＮＡ配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」（非限定的例として２１個のヌクレオチド）を実際にまたは比喩的に（例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする）配置させて、標的配列の役割を果たしてもよいサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の系統的合成、および（本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知のアッセイを使用した）至適に機能する配列を同定する試験と相まって、ｉＲＮＡ剤で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定し得る。したがって例えば本明細書の表中で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に、連続的に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。
さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的ＲＮＡよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらのおよび作成された配列を試験することにより、例えば本明細書の表中で同定される、あらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび／または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する（例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など）ことで、このような最適化配列を調節し得る。
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３個以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の５’または３’末端のいずれかから、最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばＡＬＡＳ１遺伝子領域に相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ剤ＲＮＡ鎖では、ＲＮＡ鎖は、一般に、中心的な１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。ＡＬＡＳ１遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるｉＲＮＡの有効性の検討は、特にＡＬＡＳ１遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１～４ヌクレオチドの、一般に１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有する、ｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端対応物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有する。さらに別の実施形態では、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡのＲＮＡを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、「核酸化学の現行のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、ボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ），Ｓ．Ｌ．ら編、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州ニューヨークなどに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって合成および／または修飾されてもよい。修飾としては、例えば（ａ）例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）および３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；（ｂ）例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；（Ｃ）糖の修飾（例えば２’位または４’位における、または非環式糖）または糖の置換；ならびに（ｄ）リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本発明において有用なＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。特定の実施形態では、修飾ＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル３’－５’結合、それらの２’－５’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が３’－５’から５’－３’、または２’－５’から５’－２’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェート）が挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。
上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；米国特許第４，４６９，８６３号明細書；米国特許第４，４７６，３０１号明細書；米国特許第５，０２３，２４３号明細書；米国特許第５，１７７，１９５号明細書；米国特許第５，１８８，８９７号明細書；米国特許第５，２６４，４２３号明細書；米国特許第５，２７６，０１９号明細書；米国特許第５，２７８，３０２号明細書；米国特許第５，２８６，７１７号明細書；米国特許第５，３２１，１３１号明細書；米国特許第５，３９９，６７６号明細書；米国特許第５，４０５，９３９号明細書；米国特許第５，４５３，４９６号明細書；米国特許第５，４５５，２３３号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７６，９２５号明細書；米国特許第５，５１９，１２６号明細書；米国特許第５，５３６，８２１号明細書；米国特許第５，５４１，３１６号明細書；米国特許第５，５５０，１１１号明細書；米国特許第５，５６３，２５３号明細書；米国特許第５，５７１，７９９号明細書；米国特許第５，５８７，３６１号明細書；米国特許第５，６２５，０５０号明細書；米国特許第６，０２８，１８８号明細書；米国特許第６，１２４，４４５号明細書；米国特許第６，１６０，１０９号明細書；米国特許第６，１６９，１７０号明細書；米国特許第６，１７２，２０９号明細書；米国特許第６、２３９，２６５号明細書；米国特許第６，２７７，６０３号明細書；米国特許第６，３２６，１９９号明細書；米国特許第６，３４６，６１４号明細書；米国特許第６，４４４，４２３号明細書；米国特許第６，５３１，５９０号明細書；米国特許第６，５３４，６３９号明細書；米国特許第６，６０８，０３５号明細書；米国特許第６，６８３，１６７号明細書；米国特許第６，８５８，７１５号明細書；米国特許第６，８６７，２９４号明細書；米国特許第６，８７８，８０５号明細書；米国特許第７，０１５，３１５号明細書；米国特許第７，０４１，８１６号明細書；米国特許第７，２７３，９３３号明細書；米国特許第７，３２１，０２９号明細書；および米国特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有するその他のものが挙げられる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｉＲＮＡ中で使用することが適切でありまたは検討されるその他のＲＮＡ模倣体中では、ヌクレオチド単位の主鎖である、糖およびヌクレオシド間連結の双方が、新規の基で置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１年、第２５４巻、ｐ．１４９７～１５００にある。
本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、および－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－［天然リン酸ジエステル主鎖は－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１～Ｃ１０アルキル、またはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１～約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしてもまた知られている）（マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら著、ヘルベチカ キミカ アクタ（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第７８巻、ｐ．４８６～５０４）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’－ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、およびこれもまた以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２である。
その他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、１つまたは複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の）非環式ヌクレオチド（またはヌクレオシド）を含んでなる。特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の双方は、鎖あたり５つ未満の非環式ヌクレオチド（例えば、鎖あたり４、３、２、または１つの非環式ヌクレオチド）を含む。１つまたは複数の非環式ヌクレオチドは、例えば、ｉＲＮＡ剤のセンスまたはアンチセンス鎖の、またはその双方の鎖の二本鎖領域；センスまたはアンチセンス鎖の、またはその双方の鎖の、５’末端、３’末端、５’および３’末端の双方に見られる。一実施形態では、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドは、センスまたはアンチセンス鎖、またはその双方の１～８位に存在する。一実施形態では、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のアンチセンス鎖の５’末端から４～１０位（例えば、６～８位）に見られる。別の実施形態では、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤の３’末端オーバーハングの片方または双方に見られる。
「非環式ヌクレオチド」または「非環式ヌクレオシド」という用語は、本明細書の用法では、例えば、非環式リボースなどの非環式糖を有する、任意のヌクレオチドまたはヌクレオシドを指す。代表的非環式ヌクレオチドまたはヌクレオシドとしては、例えば、天然または修飾核酸塩基（例えば、本明細書に記載されるような核酸塩基）などの核酸塩基が挙げられる。特定の実施形態では、リボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、またはＣ５）のいずれかの間の結合は、独立してまたは組み合わせで、ヌクレオチドに不在である。一実施形態では、例えば、非環式２’－３’－セコ－ヌクレオチドモノマーなど、リボース環のＣ２－Ｃ３炭素間の結合が不在である。その他の実施形態では、Ｃ１－Ｃ２、Ｃ３－Ｃ４、またはＣ４－Ｃ５間の結合が不在である（例えば、１’－２’、３’－４’または４’－５’－セコヌクレオチドモノマー）。代表的非環式ヌクレオチドは、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，３１４，２２７号明細書で開示される。例えば、非環式ヌクレオチドとしては、米国特許第８，３１４，２２７号明細書の図面１～２のモノマーＤ～Ｊのいずれかが挙げられる。一実施形態では、非環式ヌクレオチドとしては、以下のモノマーが挙げられる：
Figure 2023120219000009
 （式中、塩基は、例えば、天然または修飾核酸塩基（例えば、本明細書に記載されるような核酸塩基）などの核酸塩基である）。
特定の実施形態では、非環式ヌクレオチドは、例えば、特に、リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ、コレステロールリガンド）、アルキル、ポリアミン、糖、ポリペプチドなどの別の部分に、非環式ヌクレオチドを共役させることで、修飾または誘導体化され得る。
その他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤としては、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドおよび１つまたは複数のＬＮＡ（例えば、本明細書に記載されるようなＬＮＡ）が挙げられる。例えば、１つまたは複数の非環式ヌクレオチドおよび／または１つまたは複数のＬＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその双方に存在し得る。１本の鎖の非環式ヌクレオチドの数は、対向する鎖のＬＮＡの数と同一であるかまたは異なり得る。特定の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、二本鎖領域または３’オーバーハングに位置する５つ未満のＬＮＡ（例えば、４、３、２、または１つのＬＮＡ）を含んでなる。その他の実施形態では、１つまたは２つのＬＮＡは、センス鎖の二本鎖領域または３’オーバーハングに位置する。代案としては、または組み合わせで、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、二本鎖領域または３’オーバーハング中に、５つ未満の非環式ヌクレオチド（例えば、４、３、２、または１つの非環式ヌクレオチド）を含んでなる。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’オーバーハング中の１つまたは２つのＬＮＡと、（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から４～１０位（例えば、６～８位））のアンチセンス鎖の二本鎖（ｓｔａｎｄｅｄ）領域中の１つまたは２つの非環式ヌクレオチドとを含んでなる。
その他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤中の（単独で、または１つまたは複数のＬＮＡに加えて）１つまたは複数の非環式ヌクレオチドの組み入れは、以下の１つまたは複数（または全て）をもたらす：（ｉ）オフターゲット効果の低下；（ｉｉ）ＲＮＡｉ中のパッセンジャー鎖関与の低下；（ｉｉｉ）その標的ｍＲＮＡに対するガイド鎖の特異性の増大；（ｉｖ）マイクロＲＮＡオフターゲット効果の低下；（ｖ）安定性の増大；または（ｖｉ）ｉＲＮＡ分子の耐分解性の増大。
その他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用し、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン；５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニルウラシルおよびシトシン；６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５－ハロ、具体的には５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン；８－アザグアニンおよび８－アザアデニン；７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、「生化学、バイオテクノロジー、および医学における修飾ヌクレオシド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、ヘルデヴィン（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ），Ｐ．編、ウィリーＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、２００８年で開示されるもの；「高分子科学と工学のコンサイス百科事典（Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、ｐ．８５８～８５９、クルシュヴィッツ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ），Ｊ．Ｌ編、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９０年で開示されるもの、エングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）ら著、アンゲヴァンテ ケミー（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ），国際版（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、１９９１年、第３０巻、ｐ．６１３によって開示されるもの、およびサングヴィ（Ｓａｎｇｈｖｉ），Ｙ Ｓ．著、第１５章、「ｄｓＲＮＡの研究および応用（ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ｐ．２８９～３０２、クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．およびルブルー（Ｌｅｂｌｅｕ），Ｂ．編、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、１９９３年によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンをはじめとする、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃増大させることが示されており（サングヴィ（Ｓａｎｇｈｖｉ），Ｙ．Ｓ．著、クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．およびルブルー（Ｌｅｂｌｅｕ），Ｂ．編、「ｄｓＲＮＡの研究および応用（ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、ボカラトン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）、１９９３年、ｐ．２７６～２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、ならびにそのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書、およびこれもまた参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，７５０，６９２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つまたは複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の）ロックド核酸（ＬＮＡ）（本明細書では「ロックドヌクレオチド」とも称される）が含まれるように、修飾され得る。一実施形態では、ロックド核酸は、その中でリボース部分が、例えば、２’および４’炭素などの追加の架橋結合を含んでなる、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、３’エンド立体構造内で、リボースを事実上「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加は、血清中でｓｉＲＮＡの安定性を増大させて、熱安定性を増大させ、オフターゲット効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、それぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；米国特許第６，６７０，４６１号明細書；米国特許第６，７９４，４９９号明細書；米国特許第６，９９８，４８４号明細書；米国特許第７，０５３，２０７号明細書；米国特許第７，０８４，１２５号明細書；米国特許第；７，３９９，８４５号明細書；および米国特許第８，３１４，２２７号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。代表的なＬＮＡとしては、２’、４’－Ｃメチレンビシクロヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されるものではない（例えばＷｅｎｇｅｌらに付与された、国際公開第００／６６６０４号パンフレット、および国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照されたい）。
その他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤としては、１つまたは複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の）Ｇ形クランプヌクレオチドが挙げられる。Ｇ形クランプヌクレオチドは、修飾されたシトシンアナログであり、修飾は、二本鎖内の相補的グアニンのワトソン・クリック面およびフーグスティーン面の双方に、水素結合能力を与え、例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１－８５３２を参照されたい。オリゴヌクレオチド内の単一Ｇ形クランプアナログ置換は、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする場合に、実質的に増大されたらせん熱安定性および不一致識別をもたらし得る。ｉＲＮＡ分子中へのこのようなヌクレオチドの組み入れは、核酸標的、相補配列、またはテンプレート鎖に対する、増大された親和力および特異性をもたらし得る。
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが挙げられる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットにある。
ｉＲＮＡモチーフ
一実施形態では、センス鎖配列は、
式（Ｉ）、
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
（Ｉ）
（式中、
ｉおよびｊは、それぞれ独立して０または１であり；
ｐおよびｑは、それぞれ独立して０～６であり；
各Ｎａは、独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでなり；
各Ｎｂは、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ＮｐおよびＮｑは、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＮｂおよびＹは、同一修飾を有せず；
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドの３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）によって表わされてもよい。好ましくはＹＹＹは、全て２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互のパターンの修飾を含んでなる。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位、またはその近くに生じる。例えばＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、センス鎖の切断部位またはその近傍にＹＹＹモチーフが生じ得る（例えば５’末端の最初のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択的に、二本鎖領域内の５’末端の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、６、７、８；７、８、９；８、９、１０；９、１０、１１；１０、１１，１２；または１１、１２、１３位に生じ得る）。
一実施形態では、ｉが１でｊは０であり、またはｉが０でｊは１であり、またはｉおよびｊのどちらも１である。したがってセンス鎖は、
式、
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｂ）；
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｃ）；または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｄ）
によって表わされ得る。
センス鎖が、式（Ｉｂ）によって表わされる場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｃ）によって表わされる場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が、式（Ｉｄ）によって表わされる場合、Ｎｂは、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、互いに同一であるか、または異なってもよい。
別の実施形態では、ｉが０でｊは０であり、センス鎖は、
式、
５’Ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－Ｎｑ３’
（Ｉａ）
によって表わされてもよい。
センス鎖が、式（Ｉａ）によって表わされる場合、各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖の配列は、
式（ＩＩ）、
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’３’
（ＩＩ）
（式中、
ｋおよびｌは、それぞれ独立して０または１であり；
ｐ’およびｑ’は、それぞれ独立して０～６であり；
各Ｎａ’は、独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでなり；
各Ｎｂ’は、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し；
各Ｎｐ’およびＮｑ’は、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
Ｎｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有せず；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドの３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表わされてもよい。
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互のパターンの修飾を含んでなる。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位で、またはその近くで生じる。例えばＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端の最初のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択的に、二本鎖領域内の５’末端の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、９、１０、１１；１０、１１、１２；１１、１２、１３；１２、１３、１４位に、またはアンチセンス鎖の１３、１４、１５位に生じ得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位に生じる。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－ＯＭｅ修飾されたヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋが１でｌは０であり、またはｋが０でｌは１であり；またはｋおよびｌのどちらも１である。
したがってアンチセンス鎖は、
式、
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’
（ＩＩｄ）
によって表わされ得る。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）によって表わされる場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含んでなる、オリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなる、オリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）によって表わされる場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含んでなる、オリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなる、オリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）によって表わされる場合、Ｎｂ’は、独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含んでなる、オリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなる、オリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
別の実施形態では、ｋが０でｌは０であり、アンチセンス鎖は、
式、
５’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’３’
（Ｉａ）
によって表わされてもよい。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’のそれぞれは、互いに同一であるか、または異なってもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシル、または２’－フルオロで修飾されてもよい。例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’は、特に、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表してもよい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔである場合、５’末端の最初のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択的に、二本鎖領域内の５’末端の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の９、１０、および１１位に生じるＹＹＹモチーフを含有してもよい；Ｙは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端における翼状修飾として、ＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有してもよい。ＸＸＸおよびＺＺＺは、それぞれ独立して２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端のヌクレオチド最初のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択的に、二本鎖領域内の５’末端の最初の対合ヌクレオチドから数え始めて、鎖の１１、１２、１３位に生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有してもよく；Ｙ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の反対側の末端における翼状修飾として、Ｘ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有してもよく；およびＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（ＩＤ）のいずれか１つによって表わされるセンス鎖は、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）のいずれか１つによって表わされるアンチセンス鎖と、それぞれ二本鎖を形成する。
したがって本発明の方法で使用されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなってもよく、各鎖は１４～３０個のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、
式（ＩＩＩ）、
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
（式中、
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立して０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含んでなり；
各ＮｂおよびＮｂ’は、独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表し；
そのそれぞれが存在してもまたはしなくてもよい、各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は、それぞれ独立して、３個の連続ヌクレオチドの３つの同一修飾の１つのモチーフを表す）
によって表わされる。
一実施形態では、ｉが０でｊは０であり；またはｉが１でｊは０であり；またはｉが１でｊは０であり；またはｉおよびｊのどちらも０である。またはｉおよびｊのどちらも１である。別の実施形態では、ｋが０でありｌは０であり；またはｋが１でｌは０であり；ｋが０でｌは１であり；またはｋおよびｌのどちらも０である。またはｋおよびｌのどちらも１である。
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組み合わせとしては、以下の式が挙げられる。
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）として表される場合、各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）として表される場合、各Ｎｂは、独立して、１～１０、１～７、１～５または１～４個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は、独立して、２～２０、２～１５、または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂａｎｄＮｂ’のそれぞれは、独立して、交互のパターンの修飾を含んでなる。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）中のＸ、Ｙ、およびＺのそれぞれは、互いに同一であるかまたは異なってもよい。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表わされる場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対形成してもよい。代案としては、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を生成し；または全ての３つのＹヌクレオチドは、対応するＹ’ヌクレオチドとの塩基対を生成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）によって表わされる場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対形成してもよい。代案としては、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を生成し；または全ての３つのＺヌクレオチドは、対応するＺ’ヌクレオチドとの塩基対を生成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）によって表わされる場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つは、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対形成してもよい。代案としては、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つは、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を生成し；または全ての３つのＸヌクレオチドは、対応するＸ’ヌクレオチドとの塩基対を生成する。
一実施形態では、Ｙヌクレオチド上の修飾はＹ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、Ｚヌクレオチド上の修飾はＺ’ヌクレオチド上の修飾と異なり、および／またはＸヌクレオチド上の修飾はＸ’ヌクレオチド上の修飾と異なる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表わされる場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表わされる場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾で、Ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合によって、隣接するヌクレオチドと連結する。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表わされる場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾で、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合によって隣接するヌクレオチドと連結し、センス鎖は二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体と共役する。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）によって表わされる場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾で、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合によって隣接するヌクレオチドと連結し、センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含んでなり、センス鎖は二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体と共役する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）によって表わされる場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾で、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合によって隣接するヌクレオチドと連結し、センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含んでなり、センス鎖は二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体と共役する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表わされる少なくとも２つの二本鎖を含有する多量体であり、二本鎖はリンカーによって結合する。リンカーは、切断可能または非切断不能であり得る。任意選択的に、多量体は、リガンドをさらに含んでなる。二本鎖のそれぞれは、同一遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的にし得る；または二本鎖のそれぞれは、２つの異なる標的部位で同一遺伝子を標的にし得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表わされる３、４、５、６本以上の二本鎖を含有する多量体であり、二本鎖はリンカーによって結合する。リンカーは、切断可能または非切断不能であり得る。任意選択的に、多量体は、リガンドをさらに含んでなる。二本鎖のそれぞれは、同一遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的にし得る；または二本鎖のそれぞれは、同一遺伝子を２つの異なる標的部位で標的にし得る。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）によって表わされる２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端、３’末端の片方または両方で互いに連結し、リガンドと任意選択的に共役する。薬剤のそれぞれは、同一遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的にし得る；または薬剤のそれぞれは、同一遺伝子を２つの異なる標的部位で標的にし得る。
ｉＲＮＡ複合体
本明細書で開示されるｉＲＮＡ剤は、複合体の形態であり得る。複合体は、例えばセンスまたはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端などの、ｉＲＮＡ分子中のあらゆる適切な位置に付着してもよい。複合体は、任意選択的に、リンカーを介して付着する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体と化学的に連結し、それは例えば活性、細胞分布または細胞内取り込みに影響を及ぼす（例えば促進する）ことで、機能性をもたらしてもよい。このような部分としては、コレステロール部分（レツィンガ（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら著，米国科学アカデミー紀要，１９８９，８６：６５５３－６５５６）、コール酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著，バイオオーガニック＆メディシナルケミストリーレターズ（Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．），１９９４年，４：１０５３－１０６０）、例えばベリル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎら著，ニューヨークアカデミーオブサイエンス紀要（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），１９９２年，６６０：３０６－３０９；マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著，バイオオーガニック＆メディシナルケミストリーレターズ（Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．），１９９３年，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（オベルハウザ（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ）ら著，ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），１９９２年，２０：５３３－５３８）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（セゾン・ベモアラス（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら著，欧州分子生物学機構ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ），１９９１年，１０：１１１１－１１１８；カバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ）ら著，ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．），１９９０年，２５９：３２７－３３０；シュヴァルチュク（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ）ら著，ビオシミ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ），１９９３年，７５：４９－５４）、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネートなどのリン脂質（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著，テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．），１９９５年，３６：３６５１－３６５４；シア（Ｓｈｅａ）ら著，ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．），１９９０年，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著，ヌクレオシド＆ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ），１９９５年，１４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著，テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．），１９９５年，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（ミシュラ（Ｍｉｓｈｒａ）ら著，ビオキミカ ビオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ），１９９５年，１２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）ら著，ジャーナル オブ ファーマコロジ エクスペリメンタル セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．），１９９６年，２７７：９２３－９３７）などの脂質部分が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。いくつかの実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型（例えば肝実質細胞などの肝細胞）、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。典型的なリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
いくつかの実施形態では、リガンドは、１つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含んでなる、ＧａｌＮＡｃリガンドである。ＧａｌＮＡｃリガンドの追加的複合体な説明は、炭水化物複合体と題された節に提供される。
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えばがん細胞、内皮細胞、または骨細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ－κＢ活性化因子であり得る。
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）の機能を果たす。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含んでなるオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含んでなる、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチドは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドを使用することで、合成されてもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、このような当該技術分野で公知の合成のためのその他のあらゆる手段を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。
本発明のリガンド共役オリゴヌクレオチド、およびリガンド分子を有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、適切なＤＮＡ合成機上で、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既に結合部分を有するリガンド－ヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを有する基本単位を使用して、組み立てられてもよい。
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンド共役オリゴヌクレオチドが生成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
脂質複合体
一実施形態では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と典型的に結合し得る。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化を増大させ、またはその中への輸送を増大させ得て、および／または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用され得る。
例えば複合体の標的組織への結合を制御する（例えば阻害する）などの調節のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。ＨＳＡにより弱く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するために使用し得る。
一実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。例えばリガンドは、非腎臓組織への複合体の分布を向上させるように、十分な親和性でＨＳＡに結合し得る。しかし親和性は、典型的に、ＨＳＡリガンド結合が逆転し得ないほどには強力でない。
別の実施形態では、脂質ベースのリガンドは、複合体の腎臓への分布を向上させるように、ＨＳＡに弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、またはがん細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
細胞透過剤
別の態様では、リガンドは、らせん細胞透過剤などの細胞透過剤である。一実施形態では、薬剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸の使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、典型的にα－らせん剤であり、親油性および疎油性相を有し得る。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似した、定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５～５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号３３６７）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３３６８））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３３６９））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３３７０））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ－ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（ラム（Ｌａｍ）ら著，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３５４：８２－８４，１９９１年）。典型的に、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に係留される、ペプチドまたはペプチド模倣剤は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチド、またはＲＧＤ模倣体などの、細胞標的化ペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ－アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的にする。
ＲＧＤペプチド部分を使用して、例えば内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞のような腫瘍細胞などの特定の細胞型を標的にし得る（ジッツマン（Ｚｉｔｚｍａｎｎ）ら著，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９－４３，２００２年）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓をはじめとする、多様なその他の組織の腫瘍へのｄｓＲＮＡ剤の標的化を容易にし得る（アオキ（Ａｏｋｉ）ら著．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３－７８７，２００１年）。典型的に、ＲＧＤペプチドは、腎臓へのｉＲＮＡ剤の標的化を容易にする。ＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であり得て、例えばグリコシル化またはメチル化によって修飾して、特定組織の標的化を容易にし得る。例えばグリコシル化ＲＧＤペプチドは、αＶｓ３を発現する腫瘍細胞に、ｉＲＮＡ剤を送達し得る（ハブネル（Ｈａｕｂｎｅｒ）ら著，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６－３３６，２００１年）。
「細胞透過ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過ペプチドは、例えばα－らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ－３７またはセロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸のみを含有するペプチド（例えばＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）を含み得る。例えば細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（シメオニ（Ｓｉｍｅｏｎｉ）ら著、ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第３１巻、ｐ．２７１７～２７２４、２００３年）。
炭水化物複合体
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含んでなる。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子を有する（直鎖、分枝または環状であり得る）１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；またはその一部として各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子をそれぞれ有する（直鎖、分枝または環状であり得る）１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分を有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、Ｃ５以上（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
一実施形態では、炭水化物複合体は、単糖を含んでなる。一実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。ＧａｌＮＡｃ複合体は、例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，１０６，０２２号明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体は、ｉＲＮＡを特定の細胞に標的化するリガンドの役割を果たす。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体は、例えば、肝細胞（例えば肝実質細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体のためのリガンドの役割を果たすことで、ｉＲＮＡを肝細胞に標的化する。
いくつかの実施形態では、炭水化物複合体は、１つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでなる。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、例えば二価または三価の分枝リンカーなどのリンカーを介して付着してもよい。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体は、センス鎖の３’末端と共役する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体は、例えば本明細書に記載されるリンカーなどのリンカーによって、ｉＲＮＡ剤と（例えばセンス鎖の３’末端と）共役する。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体は、
Figure 2023120219000010
 である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、例えばＸがＯまたはＳである、以下の概略図に示される通りなリンカーを介して、炭水化物複合体に付着する。
Figure 2023120219000011
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１で定義されて下に示されるＬ９６に共役する。
Figure 2023120219000012
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は、
Figure 2023120219000013
Figure 2023120219000014
Figure 2023120219000015
Figure 2023120219000016
Figure 2023120219000017
 からなる群から選択される。
本明細書に記載される実施形態で使用するために別の代表的炭水化物複合体としては、
Figure 2023120219000018
 （式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）
が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、炭水化物複合体は、ＰＫ調節因子および／または細胞透過ペプチドなどであるが、これに限定されるものではない、上述の１つまたは複数の追加的なリガンドをさらに含んでなる。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物と共役する。本発明の組成物および方法のリンカーと共役するｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例としては、
Figure 2023120219000019
Figure 2023120219000020
Figure 2023120219000021
 （式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）
が挙げられるが、これに限定されるものではない。
リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分を共有結合するなど、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合；または酸素またはイオウなどの原子；ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位；または、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル，アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリールなどであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含んでなり、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環式で中断されまたは終結され得て、式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。一実施形態では、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８個の原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６、または８～１６個の原子である。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩ）～（ＸＸＸＩＶ）のいずれかで示される構造群から選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役する。
Figure 2023120219000022
 式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０～２０の各出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なり得て；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって、中断または終結され得て；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
Figure 2023120219000023
 またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、リガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である。三価の共役ＧａｌＮＡｃ誘導体は、
式（ＸＸＸＶ）、
Figure 2023120219000024
 （式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれを表すように選択し得る）第１の標準状態下で、対象の血液中よりも、または（例えば血液または血清中で見られる条件を模倣し、またはそれを表すように選択し得る）第２の標準状態下よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍迅速に切断する。
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１～７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともある。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または約１００倍より迅速に切断される。
酸化還元切断可能連結基
一実施形態において、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。一実施形態では、候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。別の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
リン酸ベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含んでなる。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞中のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
酸切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含んでなる。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞中では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基；置換アルキル基；またはジメチルペンチルまたはｔ－ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
エステルベースの切断可能連結基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含んでなる。エステルベースの切断可能連結基は、細胞中でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ペプチドベースの切断可能連結基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含んでなる。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞中でペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレン間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まれない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８ａｎｄ５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書：米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含み得る。
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、例えばｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってＲＮａｓｅ Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、そして必要ならば当該技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出し得る。
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（クボ（Ｋｕｂｏ），Ｔ．ら著、バイオケミカル＆バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）、２００７年、第３６５巻、第１号、ｐ．５４～６１；レッツンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要１９８９年、第８６巻、ｐ．６５５３）、コール酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、バイオオーガニック メディカルケミストリー レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．）、１９９４年、第４巻、ｐ．１０５３）、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオールなどのチオエーテル（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、ニューヨークアカデミーオブサイエンス紀要（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９９２年、第６６０巻、ｐ．３０６；マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、バイオオーガニック メディカルケミストリー レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．）、１９９３年、第３巻、ｐ．２７６５）、チオコレステロール（オーバーハウザー（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ）ら著、ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９２年、第２０巻、ｐ．５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（セゾン－ベーモアラス（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ）ら著、欧州分子生物学機構ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ）．、１９９１年、第１０巻、ｐ．１１１；カバノフ（Ｋａｂａｎｏｖ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、１９９０年、第２５９巻、ｐ．３２７；スビナルチャク（Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ）ら著、ビオシミ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）、１９９３年、第７５巻、ｐ．４９）、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネートなどのリン脂質（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、１９９５年、第３６巻、ｐ．３６５１；シア（Ｓｈｅａ）ら著、ニュークレイックアシッドリサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１９９０年、第１８巻、ｐ．３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、ヌクレオシド＆ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１９９５年、第１４巻、ｐ．９６９）、またはアダマンタン酢酸（マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ）ら著、テトラヘドロン レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、１９９５年、第３６巻、ｐ．３６５１）、パルミチル部分（ミシュラ（Ｍｉｓｈｒａ）ら著、ビオキミカ ビオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１９９５年、第１２６４巻、ｐ．２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（クルック（Ｃｒｏｏｋｅ）ら著、ジャーナル オブ ファーマコロジ エクスペリメンタル セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）、１９９６年、第２７７巻、ｐ．９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合する分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施してもよい。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
ｉＲＮＡ送達
それを必要とする対象へのｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。生体内送達は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含んでなる組成物を対象に投与することで直接実施し得る。代案としては、送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施し得る。これらの代替形態について以下で論じる。
直接送達
一般に、核酸分子のあらゆる送達方法をｉＲＮＡで使用するために、適応させ得る（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、アクタール（Ａｋｈｔａｒ）Ｓ．およびジュリアン（Ｊｕｌｉａｎ）ＲＬ．著、１９９２年、トレンズ イン セルバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２巻、第５号、ｐ．１３９～１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。しかしｉＲＮＡ分子を生体内に成功裏に送達するために検討することが重要な、３つの要素がある：（ａ）送達される分子の生物学的安定性、（２）非特異的効果の防止、および（３）送達される分子の標的組織内蓄積。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織（非限定的例として腫瘍）中への直接注射または移植などの局所投与によって、または調製品を局所的に投与にすることで、最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被ることもある、または作用物質を分解することもある、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（トレンティーノ（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ），ＭＪ．ら著、２００４年、レティーナ（Ｒｅｔｉｎａ）、第２４巻、ｐ．１３２～１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（ライヒ（Ｒｅｉｃｈ），ＳＪ．ら著、２００３年、モレキュラービジョン（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．）、第９巻、ｐ．２１０～２１６）、ＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（ピル（Ｐｉｌｌｅ），Ｊ．ら著、２００５年、モレキュラー セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第１１巻、ｐ．２６７～２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（キム（Ｋｉｍ），ＷＪ．ら著、２００６年、モレキュラー セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第１４巻、ｐ．３４３～３５０；リー（Ｌｉ），Ｓ．ら著、２００７年、モレキュラー セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）第１５巻、ｐ．５１５～５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（ドーン（Ｄｏｒｎ），Ｇ．ら著、２００４、ニュークレイック アシッズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ） ３２：ｅ４９；タン（Ｔａｎ），ＰＨ．ら著、２００５年、ジーン セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、第１２巻、ｐ．５９～６６；マキムラ（Ｍａｋｉｍｕｒａ），Ｈ．ら著、２００２年、ＢＭＣニューロサイエンス（ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、第３巻、ｐ．１８；シシュキナ（Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ），ＧＴ．ら著、２００４年、ニューロサイエンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、第１２９巻、ｐ．５２１～５２８；タッカー（Ｔｈａｋｋｅｒ），ＥＲ．ら著、２００４年、米国科学アカデミー紀要、第１０１巻、ｐ．１７２７０～１７２７５；アカネヤ（Ａｋａｎｅｙａ），Ｙ．ら著、２００５年、ジャーナル オブ ニューロフィジオロジ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．）、第９３巻、ｐ．５９４～６０２）、および鼻腔内投与による肺への（ハワード（Ｈｏｗａｒｄ），ＫＡ．ら著、２００６年、モレキュラー セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第１４巻、ｐ．４７６～４８４；チャン（Ｚｈａｎｇ），Ｘ．ら著、２００４年、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２７９巻、ｐ．１０６７７～１０６８４；ビトコ（Ｂｉｔｋｏ），Ｖ．ら著、２００５年、ネイチャー メディスン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第１１巻、ｐ．５０～５５）局所性送達の成功が示されている。疾患を治療するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド－およびエキソ－ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。
ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。ｉＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載される脂質または炭水化物基などのその他の基との化学的結合によって修飾され得る。このような複合体を使用して、例えば肝細胞、例えば肝実質細胞などの特定の細胞に、ｉＲＮＡを標的化し得る。例えば、ＧａｌＮＡｃ複合体または脂質（例えばＬＮＰ）製剤を使用して、例えば肝実質細胞のような肝細胞などの特定の細胞に、ｉＲＮＡを標的化し得る。
コレステロールなどの親油性基は、細胞内取り込みを向上させ、分解を防止する。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（サウチェック（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ），Ｊ．ら著、２００４年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４３２巻、ｐ．１７３～１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（マクナマラ（ＭｃＮａｍａｒａ），ＪＯ．ら著、２００６年、ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第２４巻、ｐ．１００５～１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばキム（Ｋｉｍ）ＳＨ．ら著、２００８年、ジャーナル オブ コントロールド リリース（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）、第１２９巻、第２号、ｐ．１０７～１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、ソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ），ＤＲ．ら著、２００３年、ジャーナル オブ モレキュラー バイオトロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ）、第３２７巻、ｐ．７６１～７６６；フェルマ（Ｖｅｒｍａ），ＵＮ．ら著、２００３年、クリニカル キャンサー リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第９巻、ｐ．１２９１～１３００；ア－ノルド（Ａｒｎｏｌｄ），ＡＳら著、２００７年、ジャーナル オブ ハイパーテンション（Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．）、第２５巻、ｐ．１９７～２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのものの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（ソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ），ＤＲ．ら著、２００３年，前出；フェルマ（Ｖｅｒｍａ），ＵＮ．ら著、２００３年，前出），オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ），“安定な核酸ー脂質粒子（ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ）”（ツィマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ），ＴＳ．ら著、２００６年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４４１巻、ｐ．１１１～１１４）、カルジオリピン（チェン（Ｃｈｉｅｎ），ＰＹ．ら著、２００５年、キャンサー ジーン セラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）、第１２巻、ｐ．３２１～３２８；パル（Ｐａｌ），Ａ．ら著、２００５年、インターナショナル ジャーナル オブ オンコロジー（Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．）、第２６巻、ｐ．１０８７～１０９１）、ポリエチレンイミン（ボネ（Ｂｏｎｎｅｔ）ＭＥ．ら著、２００８年、ファーマスーティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．）、８月１６日オンライン先行発表；アイグナー（Ａｉｇｎｅｒ），Ａ．著、２００６年、ジャーナル オブ バイオメディスン＆バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、ｐ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（リュ－（Ｌｉｕ），Ｓ．著、２００６年、モレキュラー ファーマコロジ（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．）、第３巻、ｐ．４７２～４８７）、およびポリアミドアミン（トナリア（Ｔｏｍａｌｉａ），ＤＡ．ら著、２００７年、バイオケミカル ソサエティ トランザクション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．）、第３５巻、ｐ．６１～６７；ヨー（Ｙｏｏ），Ｈ．ら著、１９９９年、ファーマスーティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．）、第１６巻、ｐ．１７９９～１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
ｉＲＮＡをコードするベクター
別の態様では、ＡＬＡＳ１遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えばクチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ），Ａら著、ＴＩＧ．、１９９６年、第１２巻、ｐ．５～１０；スキラーン（Ｓｋｉｌｌｅｒｎ），Ａ．，ら著に付与されたＰＣＴ国際公開第００／２２１１３号パンフレット；コンラッド（Ｃｏｎｒａｄ）に付与されたＰＣＴ国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびコンラッド（Ｃｏｎｒａｄ）に付与された米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（ガスマン（Ｇａｓｓｍａｎｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要１９９５年、第９２巻、ｐ．１２９２）。
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復として発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、典型的にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。例えば脊椎動物細胞などの真核生物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有する。ｉＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる、患者から外植された対象細胞への投与とそれに続く患者への再導入による、または所望の標的細胞への導入を可能にするその他のあらゆる手段による、全身性送達であり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクトアミン）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞に形質移入し得る。１週間以上の期間にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的化する、ｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数脂質形質移入もまた、本発明により検討される。ベクターの宿主細胞への成功裏の導入は、様々な既知の方法を使用してモニターし得る。例えば一過性形質移入は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光性マーカなど、レポーターによって示し得る。生体外における細胞への安定した形質移入は、形質移入細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定環境要素（例えば抗生物質および薬剤）耐性を提供するマーカを使用して、確実にし得る。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、必要に応じて、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれてもよい。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、以下にさらに詳しく記載する。
ｉＲＮＡを送達するのに有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節因子（プロモータ、エンハンサーなど）を含む。調節因子は、構成的または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択し得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば循環グルコースレベル、またはホルモンなどの特定の生理学的制御因子に感受性の誘導性制御配列を使用して、正確に調節し得る（ドチェルティ（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ）ら著、１９９４年、ＦＡＳＥＢジャーナル、第８巻、ｐ．２０～２４）。細胞または哺乳類におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適するこのような誘導性発現系としては、例えばエクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される用途に基づいて、適切な調節／プロモータ配列を選択できる。
特定の実施形態では、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用し得る。例えばレトロウイルスベクターを使用し得る（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら著、メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第２１７巻、ｐ．５８１～５９９、１９９３年を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を容易にする、１つまたは複数のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターに関してより詳しくは、例えば化学療法により高い耐性を示す幹細胞を生成するために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用を記載する、ボーゼン（Ｂｏｅｓｅｎ）ら著、バイオセラピー（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、第６巻、ｐ．２９１～３０２、１９９４年にある。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の参考文献は、クラウス（Ｃｌｏｗｅｓ）ら著、ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第９３巻、ｐ．６４４～６５１、１９９４年；キエム（Ｋｉｅｍ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第８３巻、ｐ．１４６７～１４７３、１９９４年；サルモンズ（Ｓａｌｍｏｎｓ）およびグンズバーグ（Ｇｕｎｚｂｅｒｇ）著、ヒューマン ジーン セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第４巻、ｐ．１２９～１４１、１９９３年；およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）著、カレント オピニオン イン ジェネティクス＆ディベロップメント（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．）、第３巻、ｐ．１１０～１１４、１９９３年である。使用が検討されるレンチウイルスベクターとしては、例えば参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；米国特許第５，６６５，５５７号明細書；および米国特許第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
アデノウイルもまた、ｉＲＮＡの送達で使用するために検討される。アデノウイルは、例えば気道上皮に遺伝子を送達するために、特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルは気道上皮に天然で感染して、軽症の疾患を引き起こす。アデノウイルスベースの送達系その他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルは、非分裂細胞に感染できる利点を有する。コザルスキー（Ｋｏｚａｒｓｋｙ）およびウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、カレント オピニオン イン ジェネティクス＆ディベロップメント（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）第３巻、ｐ．４９９～５０３、１９９３年は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示する。バウト（Ｂｏｕｔ）ら著、ヒューマン ジーン セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第５巻、ｐ．３～１０、１９９４年は、遺伝子をアカゲザルの気道上皮に移入するための、アデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルの使用のその他の事例は、ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５２巻、ｐ．４３１～４３４、１９９１年；ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、第６８巻、ｐ．１４３～１５５、１９９２年；マストランジェリ（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ）ら著、ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第９１巻、ｐ．２２５～２３４、１９９３年；国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；およびワン（Ｗａｎｇ）ら著、ジーン セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、第２巻、ｐ．７７５～７８３、１９９５年にある。本発明で取り上げるｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、シァ（Ｘｉａ）Ｈら著、２００２年、ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．）、第２０巻、ｐ．１００６～１０１０に記載される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ：Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）ベクターの使用もまた、検討される（ワルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら著、ソサエティ フォー エクスペリメンタル バイオロジー＆メディスン論文集（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、第２０４巻、ｐ．２８９～３００、１９９３年；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモータ、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータのいずれかを有する、組換えＡＡＶベクターからの２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げるｄｓＲＮＡを発現するのに適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞に送達する方法は、その開示全体を参照によって本明細書に援用する、サムルスキー（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）Ｒら著、１９８７年、ジャーナル オブ ヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６１巻、ｐ．３０９６～３１０１；フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）Ｋ Ｊら著、１９９６年、ジャーナル オブ ヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ）、第７０巻、ｐ．５２０～５３２；サムルスキー（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）Ｒら著、１９８９年、ジャーナル オブ ヴァイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、第６３巻、ｐ．３８２２～３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載される。
別の典型的なウイルスベクターは、例えば、修飾ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニアなどのワクシニアウイルス、鶏痘またはカナリア痘などのアビポックスなどのポックスウイルスである。
ウイルスベクターの親和性は、必要に応じて、その他のウイルスからの外被タンパク質またはその他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることで、または異なるウイルスからのカプシドタンパク質で置換することで、修飾し得る。例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によって、レンチウイルスベクターをシュードタイピングし得る。ＡＡＶベクターは、ベクターを遺伝子操作して、異なるカプシドタンパク質血清型を発現させることで、異なる細胞を標的化するようにできる；例えばその開示全体を参照によって本明細書に援用する、ラビノビッツ（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ）Ｊ Ｅら著、２００２年、ジャーナル オブ ヴァイロロジー（Ｊ Ｖｉｒｏｌ）、第７６巻、ｐ．７９１～８０１を参照されたい。
ベクターの医薬品は、許容される希釈剤中のベクターを含み得て、またはその中に遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放マトリックスを含み得る。代案としては、例えばレトロウイルスベクターなどの完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞から無傷で生成され得る場合、医薬品は遺伝子送達系を生成する１つまたは複数の細胞を含み得る。
ＩＩＩ．ｉＲＮＡ含有医薬組成物
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現または活性に関連した疾患または障害（例えばポルフィリン経路が関与する疾患）を治療するのに有用な、ｉＲＮＡを含有する。このような医薬組成物は、送達様式に基づいて調合される。例えば組成物は、例えば静脈内（ＩＶ）送達などの、非経口送達による全身投与のために調合され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物（例えばＬＮＰ製剤）は、静脈内送達のために調合される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物（例えばＧａｌＮＡｃ複合体を含んでなる組成物）は、皮下送達のために調合される。
本明細書で取り上げる医薬組成物は、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与される。一般にｉＲＮＡの適切な用量は、１日あたり受容者の体重１キログラムあたり０．０１～２００．０ミリグラムの範囲、一般に１日あたり体重１キログラムあたり１～５０ｍｇの範囲である。例えばｄｓＲＮＡは、単回用量あたり０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与し得る。医薬組成物は、毎日１回投与してもよく、またはｉＲＮＡは、一日を通して適切な間隔で、２、３回以上の部分用量として投与してもよく、または持続注入または放出制御製剤を通じた送達さえも使用して、投与してもよい。その場合、各部分用量に含有されるｉＲＮＡは、１日あたり総用量を達成するために、対応してより少量でなくてはならない。投薬単位はまた、例えば数日間にわたってｉＲＮＡの徐放を提供する、従来型の徐放性製剤を使用して、数日間にわたる送達のために配合し得る。徐放性製剤は当該技術分野で周知であり、特に、本発明の作用物質で使用し得る、特定部位への作用物質送達のために有用である。この実施形態では、投薬単位は、相当する複数の１日量を含有する。
ＡＬＡＳ１レベルに対する単回投与の効果は、引き続く用量が、３、４、または５日間以下の間隔で、または１、２、３、または４週間以下の間隔で投与されるように、長期にわたり得る。
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、および存在するその他の疾患をはじめとするが、これに限定されるものではない、特定の要因が、対象を効果的に治療するのに要求される用量およびタイミングに影響してもよいことを理解するであろう。さらに治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期は、本明細書の他の箇所で記述されるように、従来の手順を使用して、または適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて、推定し得る。
マウス遺伝学における進歩は、ＡＬＡＳ１発現に関連した病理過程などの、様々なヒト疾患（例えばポルフィリン症などのポルフィリンに、またはポルフィリン経路欠陥に伴う病理過程）を研究するためのいくつかのマウスモデルを作り出した。ｉＲＮＡの生体内試験のために、ならびに治療有効用量および／または効果的投与計画を判定するために、このようなモデルを使用し得る。
適切なマウスモデルは、例えばヒトＡＬＡＳ１を発現する導入遺伝子を含有するマウスである。ノックイン変異（例えばヒトにおける急性肝性ポルフィリン症と関連付けられている変異）を有するマウスを使用して、治療有効用量および／または投与持続期間を判定し得る。本発明は、本発明で取り上げるｉＲＮＡ化合物を含む、医薬組成物および製剤もまた含む。本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与されてもよい。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または輸液；例えば埋め込みデバイスを通じた、真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。
ｉＲＮＡは、赤血球産生組織などの特定組織を標的にする様式で、送達し得る。例えばｉＲＮＡは、骨髄、肝臓（例えば肝臓の実質細胞）、リンパ腺、脾臓、肺（例えば肺胸膜）または脊椎に送達し得る。一実施形態では、ｉＲＮＡは骨髄に送達される。
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましいこともある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用なこともある。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されてもよく、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成してもよい。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成してもよい。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
リポソーム製剤
薬物の調合のために研究され使用されているマイクロエマルション以外にも、多数の組織化界面活性剤の構造が存在する。これらとしては、単層、ミセル、二重層、および小胞が挙げられる。リポソームなどの小胞は、薬物送達の観点から、それらの特異性とそれらが提供する作用持続時間のために、高い注目を集めている。本発明での用法では、「リポソーム」という用語は、球状二重層または二重層群に配列された両親媒性脂質から構成される、小胞を意味する。
リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞である。水性部分は、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれる。
無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。したがって高度に変形可能でこのような細孔を通過できる、リポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる；天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームは、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化した薬剤を代謝および分解から保護し得る（ロゾフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
リポソームは、作用部位への活性成分の移行および送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているので、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜と一体化し始めて、リポソームと細胞の融合が進むにつれて、リポソーム内容物は、そこで活性薬剤が作用してもよい細胞中に出される。
リポソーム製剤は、多数の薬剤の送達様式として、大規模な研究の焦点である。局所投与において、リポソームがその他の製剤に優るいくつかの利点を提示する証拠が、上がってきている。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収と結びつく副作用の低下、所望の標的における投与薬剤の蓄積増大、および親水性および疎水性双方の多種多様な薬剤を皮膚内投与する能力が挙げられる。
いくつかの報告は、リポソームが、皮膚内に高分子量ＤＮＡをはじめとする作用物質を送達する能力を詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量ＤＮＡをはじめとする化合物が、皮膚に投与されている。用途の大部分は、表皮上層の標的化をもたらした。
リポソームは、２つの広範なクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電したＤＮＡ分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する（ワン（Ｗａｎｇ）ら著、バイオケミカル＆バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１９８７年、第１４７巻、ｐ．９８０～９８５）。
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成せず、むしろそれを封入する。ＤＮＡと脂質は、どちらも同様の荷電を持つため、複合体形成でなく反発が起きる。それでもなおいくらかのＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で細胞単層に、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞中で検出された（チョウ（Ｚｈｏｕ）ら著、ジャーナル オブ コントロールド リリース（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）、１９９２年、第１９巻、ｐ．２６９～２７４）。
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から生成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから生成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から生成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から生成される。
いくつかの研究が、皮膚へのリポソーム製剤の局所送達を評価している。インターフェロン含有リポソームのモルモット皮膚への塗布が、皮膚ヘルペスによる傷の減少をもたらしたのに対し、別の手段によるインターフェロン送達（例えば溶液としてまたはエマルションとしての）は無効であった（ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら著、ジャーナル オブ ドラッグ ターゲンティング（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）、１９９２年、第２巻、ｐ．４０５～４１０）。さらに追加的な研究が、水性系を使用したインターフェロン投与と比較して、リポソーム製剤の一部としてのインターフェロン投与の有効性を試験し、リポソーム製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた（デュプレシ（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ）ら著、アンチバイラル リサーチ（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９２年、第１８巻、ｐ．２５９～２６５）。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含んでなる系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含んでなる非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（フー（Ｈｕ）ら著、Ｓ．Ｔ．Ｐ．ファーマ サイエンス（Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．）、１９９４年、第４巻、第６号、ｐ．４６６）。
リポソームはまた、「立体的安定化」リポソームを含み、この用語は本明細書の用法では、１つまたは複数の特殊化された脂質を含んでなるリポソームを指し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、改善された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、その中で、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含んでなり、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論による拘束も望まないが、当該技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の改善は、細網内皮系（ＲＥＳ：ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｓｙｓｔｅｍ）細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（アレン（Ａｌｌｅｎ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ），１９８７年、第２２３巻、ｐ．４２；ウー（Ｗｕ）ら著、キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９３年、第５３巻、ｐ．３７６５）。
１つまたは複数の糖脂質を含んでなる様々なリポソームが、当該技術分野で公知である。パパハジョポロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）ら著、ニューヨークアカデミーオブサイエンス紀要（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、１９８７年、第５０７巻、ｐ．６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、ギャビゾン（Ｇａｂｉｚｏｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要、１９８８年、第８５巻、ｐ．６９４９によって詳しく説明された。どちらもアレン（Ａｌｌｅｎ）らに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンと、（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含んでなる、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（ウェブ（Ｗｅｂｂ）ら）は、スフィンゴミエリンを含んでなるリポソームを開示する。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含んでなるリポソームは、国際公開第９７／１３４９９（リム（Ｌｉｍ）ら）号パンフレットで開示される。
１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含んでなる多数のリポソーム、およびそれらの調製法は、当該技術分野で公知である。スナモト（Ｓｕｎａｍｏｔｏ）ら（日本化学会欧文誌（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．）、１９８０年、第５３巻、ｐ．２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン系洗剤２Ｃ１２１５Ｇを含んでなる、リポソームについて記載した。イルム（Ｉｌｌｕｍ）ら著、ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、１９８４年、第１６７巻、ｐ．７９は、ポリマーグリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングが、顕著に改善された血液半減期をもたらすことを記述した。ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）のカルボン酸基の付加によって修飾された合成リン脂質は、シアーズ（Ｓｅａｒｓ）（米国特許第４，４２６，３３０号明細書および米国特許第４，５３４，８９９号明細書）によって記載される。クリバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）ら（ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．）、１９９０年、第２６８巻、ｐ．２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアリン酸塩によって誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含んでなるリポソームが、血液循環半減期に著しい増大を有することを実証する実験を記載した。ブルム（Ｂｌｕｍｅ）ら（バイオキミカ エ バイオフィジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）、１９９０年、第１０２９巻、ｐ．９１）は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組み合わせから生成される、例えばＤＳＰＥ－ＰＥＧなどのその他のＰＥＧ－誘導体化リン脂質に、このような観察を広げた。共有結合したＰＥＧ部分を外面に有するリポソームは、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）に付与された欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号明細書および国際公開第９０／０４３８４号パンフレットに記載される。１～２０モルパーセントのＰＥＧ誘導体化ＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、ウードル（Ｗｏｏｄｌｅ）ら（米国特許第５，０１３，５５６号明細書および米国特許第５，３５６，６３３号明細書）、およびマーティン（Ｍａｒｔｉｎ）ら（米国特許第５，２１３，８０４号明細書および欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号明細書）によって記載される。いくつかのその他の脂質－ポリマー複合体を含んでなるリポソームは、（どちらもマーティン（Ｍａｒｔｉｎ）らに付与された）国際公開第９１／０５５４５号パンフレットおよび米国特許第５，２２５，２１２号明細書、および国際公開第９４／２００７３号パンフレット（ザリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）ら）で開示される。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含んでなるリポソームは、国際公開第９６／１０３９１号パンフレット（チョイ（Ｃｈｏｉ）ら）に記載される。米国特許第５，５４０，９３５号明細書（ミヤザキ（Ｍｉｙａｚａｋｉ）ら）および米国特許第５，５５６，９４８号明細書（タガワ（Ｔａｇａｗａ）ら）は、それらの表面を機能的部分でさらに誘導体化し得る、ＰＥＧ含有リポソームを記載する。
核酸を含んでなるいくつかのリポソームは、当該技術分野で公知である。ティエリ（Ｔｈｉｅｒｒｙ）らに付与された国際公開第９６／４００６２号パンフレットは、高分子量核酸をリポソーム中にカプセル化する方法を開示する。タガワ（Ｔａｇａｗａ）らに付与された米国特許第５，２６４，２２１号明細書は、タンパク質結合リポソームを開示し、このようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含んでもよいと主張する。ラーマン（Ｒａｈｍａｎ）らに付与された米国特許第５，６６５，７１０号明細書は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定の方法を記載する。ラブ（Ｌｏｖｅ）らに付与された国際公開第９７／０４７８７号パンフレットは、ｒａｆ遺伝子標的化ｄｓＲＮＡを含んでなるリポソームを開示する。
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明されてもよい。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作成するために、通常は界面活性剤である表面縁活性化剤を標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
界面活性剤には、（マイクロエマルションをはじめとする）エマルションおよびリポソームなどの製剤における、幅広い応用がある。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としてもまた知られている）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８８年、ｐ．２８５。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８８年、ｐ．２８５）。
核酸脂質粒子
一実施形態では、本発明で取り上げるＡＬＡＳ１ ｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、またはその他の核酸－脂質粒子を形成する。本明細書の用法では、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰをはじめとする、安定核酸－脂質粒子を指す。本明細書の用法では、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含んでなる核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的に、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えばＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて長期循環寿命を示し、遠位部位（例えば部位投与から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身的用途のために極めて有用である。ＳＰＬＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。本発明の粒子は、典型的に約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的に約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的に約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的に約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本発明の核酸－脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸－脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
一実施形態では脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲である。
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％または約４０モル％を構成してもよい。
別の実施形態では、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、参照によって本明細書に援用する、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載される。
一実施形態では、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍのおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物をはじめとするが、これに限定されるものではない、アニオン性脂質または中性脂質であってもよい。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であってもよい。
粒子凝集を阻害する共役結合脂質は、例えば制限なしに、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）をはじめとする、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、またはその混合物であってもよい。ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であってもよい。粒子凝集を妨げる共役結合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％または約２モル％であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に調合される。
ＬＮＰ０１
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（参照によって本明細書に援用する２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（例えばＬＮＰ０１粒子）を調製し得る。エタノール中の各原液は、以下のように調製し得る。１３３ｍｇ／ｍｌのＮＤ９８；２５ｍｇ／ｍｌのコレステロール；１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ－セラミドＣ１６。次にＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６原液を例えば４２：４８：１０モル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５～４５％で、最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭになるように、（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合し得る。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布次第で、結果として得られたナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネート膜（例えば１００ｎｍカットオフ）を通して押出し得る。場合によっては、押出ステップは省き得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４など、約ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で交換し得る。
Figure 2023120219000025
ＬＮＰ０１製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載される。
追加的な例示的脂質ｄｓＲＮＡ製剤が、以下の表に提供される。
Figure 2023120219000026
Figure 2023120219000027
Figure 2023120219000028
ＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含んでなる製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年４月１５日に出願された、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載される。
ＸＴＣ含有製剤は、例えば、参照によって本明細書に援用する、２００９年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日に出願された米国仮特許出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日に出願された米国仮特許出願第号明細書；２００９年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２２８，３７３号明細書；２００９年９月３日に出願された米国仮特許出願第６１／２３９，６８６号明細書；および２０１０年１月２９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４に記載される。
ＭＣ３含有製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、２００９年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２４４，８３４号明細書；２００９年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／１８５，８００号明細書；および２０１０年６月１０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／２８２２４に記載される。
ＡＬＮＹ－１００含有製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、２００９年１１月１０日に出願された、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第０９／６３９３３号明細書に記載される。
Ｃ１２－２００含有製剤は、参照によって本明細書に援用する、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書、および２０１０年５月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７に記載される。
カチオン性脂質の合成
例えば本発明で取り上げる核酸－脂質粒子で使用されるカチオン性脂質などの化合物のいずれもが、実施例でより詳細に記載される方法をはじめとする、既知の有機合成技術によって調製され得る。特に断りのない限り、全ての置換基は、以下に定義するとおりである。
「アルキル」は、１～２４個の炭素原子を含有する、直鎖または分枝、非環式または環式、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどが挙げられ；他方、飽和分枝アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ；他方、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
アルケニルは、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されるようなアルキルを意味する。アルケニルには、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓの双方の異性体が含まれる。代表的な直鎖および分枝アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどが挙げられる。
「アルキニル」は、隣接する炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上で定義されるようなあらゆるアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分枝アルキニルとしては、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１ブチニルなどが挙げられる。
「アシル」は、以下に定義するとおり、炭素が結合点でオキソ基によって置換される、あらゆるアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および－Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。
「複素環」は、下の複素環のいずれかがベンゼン環に融合する二環をはじめとする、窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される１または２個のヘテロ原子を含有する、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかの５～７員環単環、または７～１０員環二環、複素環を意味し、窒素およびイオウヘテロ原子は酸化されていてもいなくてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもいなくてもよい。複素環は、あらゆるヘテロ原子または炭素原子を介して付着し得る。複素環としては、以下に定義されるヘテロアリールが挙げられる。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプルイミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
「置換されていてもいなくてもよいアルキル」、「置換されていてもいなくてもよいアルケニル」、「置換されていてもいなくてもよいアルキニル」、「置換されていてもいなくてもよいアシル」、および「置換されていてもいなくてもよい複素環」という用語は、置換される場合、少なくとも１つの水素原子が置換基で置換されていることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置き換えられる。この点において、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、－ＣＮ、－ＯＲｘ、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ ，－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ、および－ＳＯｎＮＲｘＲｙが挙げられ、ｎは０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは同一であるかまたは異なり、独立して水素、アルキルまたは複素環であり、前記アルキルおよび複素環置換基のそれぞれは、１つまたは複数のオキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲｘ、複素環、－ＮＲｘＲｙ、－ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ ，－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘ、および－ＳＯｎＮＲｘＲｙによってさらに置換されていてもよい。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる方法は、保護基の使用を要し得る。保護基の手順は、当業者に良く知られている（例えば「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、グリーン（Ｇｒｅｅｎ），Ｔ．Ｗ．ら著、Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９９９年を参照されたい）。簡単に述べると、本発明の文脈では、保護基は、官能基の望まれない反応性を低下させまたは排除する、あらゆる基である。保護基は官能基に付加されて、特定の反応中にその反応性をマスクし、次に除去されて元の官能基を曝露し得る。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望まれない反応性を低下させまたは排除する、あらゆる基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を使用して、付加して除去し得る。
式Ａの合成
一実施形態では、本発明で取り上げる核酸脂質粒子は、
式Ａ、
Figure 2023120219000029
 （式中、
Ｒ１およびＲ２は、独立してそれぞれ任意選択的に置換される、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、Ｒ３およびＲ４は、独立して低級アルキルであり、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって任意選択的に置換される複素環を形成し得る）
のカチオン性脂質を使用して調合される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）である。一般に、上の式Ａの脂質は、特に断りのない限り全ての置換基が上で定義されるとおりである、以下の反応スキーム１または２によって作成されてもよい。
スキーム１
Figure 2023120219000030
 脂質Ａは、スキーム１に従って調製され得て、式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、それぞれ任意選択的に置換され得る、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、Ｒ３およびＲ４は、独立して、低級アルキルであり、またはＲ３およびＲ４は、一緒になって任意選択的に置換される複素環を形成し得る。ケトン１および臭化物２は購入され、または当業者に知られている方法に従って調製され得る。１および２の反応は、ケタール３をもたらす。ケタール３をアミン４で処理して、式Ａの脂質を得る。式Ａの脂質は、式５（式中、Ｘは、ハロゲン、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などから選択されるアニオン対イオンである）の有機塩によって、対応するアンモニウム塩に変換し得る。
スキーム２
Figure 2023120219000031
 代案としては、ケトン１出発原料は、スキーム２に従って調製され得る。グリニャール試薬６およびシアン化物７は購入され、または当業者に知られている方法に従って調製され得る。６と７の反応は、ケトン１をもたらす。ケトン１の対応する式Ａの脂質への変換は、スキーム１に記載されるとおりである。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（すなわち（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸）の調製は、次のとおりであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（０．５３ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で、続いて希釈水性炭酸水素ナトリウムで洗浄した。無水硫酸マグネシウム上で有機画分を乾燥させ、濾過して、回転蒸発器上で溶媒を除去した。１～５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を使用して、残留物をシリカゲルカラム（２０ｇ）に通過させた。精製産物を含有する画分を合わせて溶媒を除去し、無色の油（０．５４ｇ）を得た。
ＡＬＮＹ－１００の合成
以下のスキーム３を使用して、ケタール５１９［ＡＬＮＹ－１００］の合成を実施した。
Figure 2023120219000032
５１５の合成
ニ頚ＲＢＦ（１Ｌ）内の撹拌される２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２モル）懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６モル）の溶液を０ ０Ｃにおいて窒素雰囲気下で緩慢に添加した。添加完了後、反応混合物を室温に加温し、次に加熱して４時間還流した、反応の進捗は、ＴＬＣによってモニターした。反応完了（ＴＬＣによる）後、混合物を０ ０Ｃに冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液の注意深い添加によってクエンチした。反応混合物を室温で４時間撹拌し、濾過した。残留物をＴＨＦで良く洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃ＨＣｌで希釈して、室温で２０分間撹拌した。揮発度（ｖｏｌａｔｉｌｉｔｉｅｓ）を真空下で揮散して、５１５の塩酸塩を白色固体として得た。収量：７．１２ｇ １Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ），５．６８（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｍ，１Ｈ），２．６６－２．６０（ｍ，２Ｈ），２．５０－２．４５（ｍ，５Ｈ）．
５１６の合成
２５０ｍＬニ頚ＲＢＦ内の１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌される溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９モル）を添加して、窒素雰囲気下で０ ０Ｃに冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ－（ベンジルオキシ－カルボニルオキシ）－スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７モル）の緩慢な添加後、反応混合物が室温に暖まるまで放置した。反応完了後（ＴＬＣによる２～３時間）、混合物を１ＮのＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。次に無水Ｎａ２ＳＯ４上で有機層を乾燥し、溶媒を蒸発させて粗製物を得て、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、５１６を粘着性塊として得た。収量：１１ｇ（８９％）．１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６－７．２７（ｍ，５Ｈ），５．６９（ｓ，２Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｂｒ．，１Ｈ）２．７４（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），２．３０－２．２５（ｍ，２Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ ［Ｍ＋Ｈ］－２３２．３（９６．９４％）．
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成
室温において、５００ｍＬ一頚ＲＢＦ内で、シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４モル）を２２０ｍＬアセトンと水（１０：１）の溶液中に溶解し、それにＮ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２モル）を添加し、ｔｅｒｔ－ブタノール中の４．２ｍＬの７．６％ＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８モル）溶液がそれに続いた。反応完了後（約３時間）、固体Ｎａ２ＳＯ３の添加によって混合物をクエンチし、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈して、水（２×１００ｍＬ）で洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）、最後に鹹水（１×５０ｍＬ）が続いた。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、真空中で溶媒を除去した。粗製物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製からジアステレオマー混合物を得て、それを予備ＨＰＬＣによって分離した。
収量：－６ｇ粗製
５１７Ａ－ピーク－１（白色固体）、５．１３ｇ（９６％）．１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９－７．３１（ｍ，５Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．７８－４．７３（ｍ，１Ｈ），４．４８－４．４７（ｄ，２Ｈ），３．９４－３．９３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．７２－１．６７（ｍ，４Ｈ）．ＬＣ－ＭＳ－［Ｍ＋Ｈ］－２６６．３，［Ｍ＋ＮＨ４＋］－２８３．５存在，ＨＰＬＣ－９７．８６％．立体化学はＸ線によって確認された。
５１８の合成
化合物５０５の合成について記載されるものと類似の手順を使用して、化合物５１８を無色の油として得た（１．２ｇ、４１％）。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５－７．３３（ｍ，４Ｈ），７．３０－７．２７（ｍ，１Ｈ），５．３７－５．２７（ｍ，８Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．５８－４．５７（ｍ，２Ｈ），２．７８－２．７４（ｍ，７Ｈ），２．０６－２．００（ｍ，８Ｈ），１．９６－１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３７－１．２５（ｂｒ ｍ，３６Ｈ），０．８７（ｍ，６Ｈ）．ＨＰＬＣ－９８．６５％．
化合物５１９の合成の基本手順：
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１ｅｑ）溶液をＴＨＦ中のＬＡＨ（１Ｍ，２ｅｑ）氷冷溶液に、滴下して添加した。添加完了後、混合物を４０℃で０．５時間加熱し、次に氷浴上で再度冷却した。混合物を飽和水性Ｎａ２ＳＯ４によって注意深く加水分解し、次にセライトを通して濾過して油に濃縮した。カラムクロマトグラフィーから、純粋な５１９を無色の油として得た（１．３ｇ、６８％）。１３Ｃ ＮＭＲ＝１３０．２，１３０．１（ｘ２），１２７．９（ｘ３），１１２．３，７９．３，６４．４，４４．７，３８．３，３５．４，３１．５，２９．９（ｘ２），２９．７，２９．６（ｘ２），２９．５（ｘ３），２９．３（ｘ２），２７．２（ｘ３），２５．６，２４．５，２３．３，２２６，１４．１；エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２（Ｍ＋Ｈ）＋の分子量＋計算値６５４．６、測定値６５４．６。
標準法または押出のない方法のいずれかによって調製された製剤は、同様の様式で特性解析し得る。例えば製剤は、典型的に外観検査によって特徴付けられる。それらは凝集体または沈降物を含まない、白みがかった半透明溶液であるべきである。脂質－ナノ粒子の粒度および粒度分布は、例えばＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ），米国）を使用して、光散乱によって測定し得る。粒度は、４０～１００ｎｍなど、約２０～３００ｎｍであるべきである。粒度分布は、単峰型分布であるべきである。製剤ならびに封入画分中の総ｄｓＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使用して推定された。調合されたｄｓＲＮＡのサンプルを例えば０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００などの配合破壊性界面活性剤の存在または不在下で、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合色素と共にインキュベートし得る。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準曲線と比較して、界面活性剤含有サンプルからのシグナルによって判定し得る。封入画分は、総ｄｓＲＮＡ含量から、「遊離」ｄｓＲＮＡ含量（界面活性剤不在下のシグナルにより測定される）を減じて求められる。封入ｄｓＲＮＡ百分率は、典型的に＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤では、粒度は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。適切な範囲は、典型的に、少なくとも約５０ｎｍから少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍから少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍから少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましいことがある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ））、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書詳細に記載される。
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含んでもよく、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有してもよい。
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成されてもよい。
好都合には単位剤形で提示されてもよい、本発明で取り上げられる医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製されてもよい。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。
本発明で取り上げられる組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合されてもよい。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合されてもよい。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有してもよい。懸濁液は、安定剤もまた含有してもよい。
追加的な製剤
エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９；ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５；ブロック（Ｂｌｏｃｋ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第２巻、ｐ．３３５；ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら著、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、マック パブリッシング（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルベニア州イートン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）、１９８５年、ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含んでなる、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであってもよい。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在してもよい、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有してもよい。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在してもよい。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含んでなる複数エマルションであってもよい。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であってもよい。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれてもよい、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類されてもよい：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ），Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９を参照されたい）。
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デＮッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２８５；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含んでなる。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類されてもよい：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク，リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２８５を参照されたい）。
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（ブロック（Ｂｌｏｃｋ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．３３５；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持してもよい、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であってもよい。
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５；イドソン（Ｉｄｓｏｎ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義されてもよい（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．編、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（レング（Ｌｅｕｎｇ）および（シャー）著、「薬剤の制御放出：ポリマーおよび凝集体系（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ），Ｍ．編、１９８９年、ＶＣＨパブリッシャーズ（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク、ｐ．１８５～２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３～５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（ショット（Ｓｃｈｏｔｔ）著、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、マック パブリッシング（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルベニア州イートン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）、１９８５年、ｐ．２７１）。
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えば「アンセルの医薬剤形と薬剤送達系（Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アレン（Ａｌｌｅｎ），ＬＶ．、ポポビッチ（Ｐｏｐｏｖｉｃｈ）ＮＧ．、およびアンセル（Ａｎｓｅｌ）ＨＣ．、２００４年、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第８版）、ニューヨーク州ニューヨーク；ロソフ（Ｒｏｓｏｆｆ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．２４５；ブロック（Ｂｌｏｃｋ）著、「医薬剤形（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）」より、リーバーマン（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ）、リーガ（Ｒｉｅｇｅｒ）およびバンカー（Ｂａｎｋｅｒ）編、１９８８年、マルセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク、第１巻、ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１－プロパノール、および１－ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製されてもよく、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であってもよいが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８－Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；コンスタンティニディス（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ）ら著、ファーマスーティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９４年、第１１巻、ｐ．１３８５～１３９０；リチェル（Ｒｉｔｓｃｈｅｌ）著、メソッズ＆ファインディングス イン エクスペリメンタル＆クリニカル ファーマコロジ（Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９９３年、第１３巻、ｐ．２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第 ７，１５７，０９９号明細書；コンスタンティニディス（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ）ら著、ファーマスーティカル リサーチ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９４年、第１１巻、ｐ．１３８５；ホー（Ｈｏ）ら著、ジャーナル オブ ファーマスーティカル サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）、１９９６年、第８５巻、ｐ．１３８～１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することが多い。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利なこともある。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高めてもよい。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類されてもよい。（リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過することがあることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類されてもよい（例えばマルムステン（Ｍａｌｍｓｔｅｎ），Ｍ．著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ニューヨーク州ニューヨーク、２００２年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
界面活性剤：本発明との関連で、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えばマルムステン（Ｍａｌｍｓｔｅｎ），Ｍ．著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ニューヨーク州ニューヨーク、２００２年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ－４３などのペルフルオロ化合物エマルションタカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら著、ジャーナル オブ ファーマシ＆ファーマコロジ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９８８年、第４０巻、ｐ．２５２）が挙げられる。
脂肪酸：浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１～２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばトィトゥ（Ｔｏｕｉｔｏｕ），Ｅ．ら著、「薬送達の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、マサチューセッツ州、ダンバース（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、２００６年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０年、第７巻、ｐ．１～３３；エルハリリ（Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ）ら著、ジャーナル オブ ファーマシ＆ファーマコロジ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９９２年、第４４巻、ｐ．６５１～６５４を参照されたい）。
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばマルムステン（Ｍａｌｍｓｔｅｎ），Ｍ．著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、ニューヨーク州ニューヨーク、２００２年，ブラントン（Ｂｒｕｎｔｏｎ）著、第３８章、「グッドマン＆ギルマンの治療学の薬理学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、第９版より、ハードマン（Ｈａｒｄｍａｎ）ら編、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク、１９９６年、ｐ．９３４～９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏ－２４，２５－ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばマルムステン（Ｍａｌｍｓｔｅｎ），Ｍ．著、「薬物送達における界面活性剤およびポリマー（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、インフォルマ ヘルスケア（Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）、ニューヨーク州ニューヨーク、２００２年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２；スウィンヤード（Ｓｗｉｎｙａｒｄ）著、第３９章、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１８版より、ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、マック パブリッシング（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、ペンシルベニア州イートン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）、１９９０年、ｐ．７８２～７８３；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０年、第７巻、ｐ．１～３３；ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら著、ジャーナル オブ エクスペリメンタル セラピューティックス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）、１９９２年、第２６３巻、ｐ．２５；ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）ら著、ジャーナル オブ ファーマスーティカル サイエンス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）、１９９０年、第７９巻、ｐ．５７９～５８３を参照されたい）。
キレート化剤：本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（ジャレット（Ｊａｒｒｅｔｔ），Ｊ．著、クロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．）、１９９３年、第６１８巻、ｐ．３１５～３３９）。 適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９、およびβ－ジケトン（エナミン）のＮ－アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばカダレ（Ｋａｔｄａｒｅ），Ａ．ら著、「製薬、バイオテクノロジー、および薬物送達のための賦形剤の開発（Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、マサチューセッツ州ダンバース（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、２００６年；リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２；ムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０年、第７巻、ｐ．１～３３；ブール（Ｂｕｕｒ）ら著、ジャーナル オブ コントロールド リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．）、１９９０年、第１４巻、４３～５１を参照されたい）。
非キレート化非界面活性剤：本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばムラニシ（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ）、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９０年、第７巻、ｐ．１～３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（リー（Ｌｅｅ）ら著、治療薬剤送達システムの批判的な批評（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１９９１年、ｐ．９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（ヤマシタ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ）ら著、ジャーナル オブ ファーマシ＆ファーマコロジ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）、１９８７年、第３９巻、ｐ．６２１～６２６）が挙げられる。
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明医薬およびその他の組成物に添加してもよい。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（ジュンイチ（Ｊｕｎｉｃｈｉ）らに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（ロロ（Ｌｏｌｌｏ）らに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、ＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）；スイス、グレンツァヒャー通り（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（スイス、グレンツァヒャー通り（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、ＤＯＳＰＥＲ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（スイス、グレンツァヒャー通り（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、またはＦｕｇｅｎｅ（スイス、グレンツァヒャー通り（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、Ｔｆｘ（商標）－２０ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、Ｔｆｘ（商標）－５０ Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（オズバイオサイエンス（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；フランス，マルセイユ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（オズバイオサイエンス（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；フランス，マルセイユ（Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ））、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；米国マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ））、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（インビボゲン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）））、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）；米国カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（ビオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ）；米国マサチューセッツ州タウントン（Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））、ＰｌａｓＦｅｃｔ（ビオライン（Ｂｉｏｌｉｎｅ）；米国マサチューセッツ州タウントン（Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ））、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂブリッジインターナショナル（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ））、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂブリッジインターナショナル（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ））、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂブリッジインターナショナル（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ））が挙げられる。
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２－ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用されてもよい。
担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４－アセトアミド－４’－イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（ミヤオ（Ｍｉｙａｏ）ら著、ＤｓＲＮＡリサーチ＆ディベロップメント（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．）、１９９５年、第５巻、ｐ．１１５～１２１；タカムラ（Ｔａｋａｋｕｒａ）ら著、ＤｓＲＮＡ＆ニュークレイック アシッド ドラッグ ディベロップメント（ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．）、１９９６年、第６巻、ｐ．１７７～１８３。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であってもよく、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含んでもよい。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有してもよい。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有してもよい。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有してもよく、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有してもよい。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、必要に応じて、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能する１つまたは複数の生物剤を含む。このような生物剤の例としては、ＡＬＡＳ１と少なくとも１つのＡＬＡＳ１結合パートナーとの相互作用を妨げる、薬剤が挙げられる。
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を測定するための細胞培養物または実験的動物中において、標準薬学的手順によって判定され得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、典型的である。
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動してもよい。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養中で測定されるＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
上で考察したように、本発明で取り上げるｉＲＮＡは、それらの投与に加えて、ＡＬＡＳ１発現に関連した疾患または障害治療で効果的な、その他の既知の薬剤と組み合わせて投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
ＡＬＡＳ１遺伝子発現関連疾患を治療する方法
本発明は、特に、ＡＬＡＳ１発現を阻害するための、および／またはＡＬＡＳ１発現に関連した疾患、障害、または病理過程を治療するための、ＡＬＡＳ１を標的にするｉＲＮＡの使用に関する。
本明細書の用法では、「ＡＬＡＳ１発現関連障害」、「ＡＬＡＳ１発現関連疾患」、「ＡＬＡＳ１発現関連病理過程」などは、その中でＡＬＡＳ１発現が変化（例えば上昇）し、１つまたは複数のポルフィリンレベルが変化（例えば上昇）し、ヘム生合成経路（ポルフィリン経路）中の１つまたは複数の酵素レベルまたは活性が変化する、あらゆる病状、障害、または疾患、またはヘム生合成経路に病理学的変化をもたらすその他の機構（ｍｅｃｈｉｓｍｓ）を含む。例えば、その中でポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡまたはＰＢＧ）レベルが上昇する病状（例えば特定のポルフィリン症）、またはその中でヘム生合成経路酵素に欠陥がある病状（例えば特定のポルフィリン症）を治療するために、ＡＬＡＳ１遺伝子を標的にするｉＲＮＡ、またはその組み合わせを使用してもよい。ＡＬＡＳ１発現関連障害としては、例えば、Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（Ｄｏｓｓポルフィリン症）、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、先天性赤芽球増殖性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症（ｐｒｏｐｈｙｒｉａ ｃｕｔａｎｅａ ｔａｒｄａ）、遺伝性コプロポルフィリン症（コプロポルフィリン症）、異型ポルフィリン症、赤芽球増殖性プロトポルフィリン症（ＥＰＰ）、および乳児期一過性赤血球ポルフィリン症が挙げられる。
本明細書の用法では、本明細書に記載される方法に従って治療される「対象」としては、例えば哺乳類などのヒトまたは非ヒト動物が挙げられる。哺乳類は、例えば齧歯類（例えばラットまたはマウス）または霊長類（例えばサル）であってもよい。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、対象は、ＡＬＡＳ１発現関連障害に罹患しており（例えばポルフィリン症と診断され、またはポルフィリン症の１つまたは複数の症状を経験しており、ポルフィリン症に伴う変異の保因者である）、またはＡＬＡＳ１発現関連障害を発症するリスクがある（例えばポルフィリン症の家族歴がある対象、またはポルフィリン症と関連付けられている遺伝子変異の保因者である対象）。
急性肝性ポルフィリン症をはじめとするポルフィリン症の分類は、例えば、バルワニ（Ｂａｌｗａｎｉ），Ｍ．＆デスニック（Ｄｅｓｎｉｃｋ），Ｒ．Ｊ．，ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），１２０（２３）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ） 初版論文，７月１２日，１０２；ＤＯＩ １０．１１８２／ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）－２０１２－０５－４２３１８６としてオンライン出版、に記載される。バルワイン（Ｂａｌｗａｉｎ）＆デスニック（Ｄｅｓｎｉｃｋ）に記載されるように、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）は常染色体優性ポルフィリン症であり、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）は常染色体劣性である。稀に、ＡＩＰ、ＨＣＰ、およびＶＰは、ホモ接合優性形態として存在する。これに加えて、単一肝臓皮膚ポルフィリン症で、肝骨髄性ポルフィリン症としてもまた知られている、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）の稀なホモ接合劣性形態がある。これらのポルフィリン症の臨床および検査特性は、下の表１１に記載される。
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いくつかの実施形態では、対象は、例えば肝性ポルフィリン症、例えばＡＩＰ、ＨＣＰ、ＶＰ、ＡＤＰ、または肝骨髄性ポルフィリン症などのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがある。
いくつかの実施形態では、ポルフィリン症は、急性肝性ポルフィリン症であり、例えば急性肝性ポルフィリン症は、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、およびＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）から選択される。
いくつかの実施形態では、ポルフィリン症は、例えば少なくとも２つのポルフィリン症などの二重ポルフィリン症である。いくつかの実施形態では、二重ポルフィリン症は、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、異型ポルフィリン症（ＶＰ）、およびＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｈｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症（ＡＤＰ）から選択される、２種以上のポルフィリン症を含んでなる。
いくつかの実施形態では、ポルフィリン症は、ホモ接合優性肝性ポルフィリン症（例えばホモ接合優性ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰ）または肝骨髄性ポルフィリン症である。いくつかの実施形態では、ポルフィリン症は、ＡＩＰ、ＨＣＰ、ＶＰ、または肝骨髄性ポルフィリン症、またはそれらの組み合わせ（例えば二重ポルフィリン症）である。実施形態では、ＡＩＰ、ＨＣＰ、またはＶＰは、ヘテロ接合優勢またはホモ接合優性のいずれかである。
実施形態では、対象は、例えばＡＤＰなどのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがあり、ＡＬＡおよび／またはコプロポルフィリンＩＩＩレベルの上昇（例えば尿レベルの上昇）を示す。実施形態では、対象は、例えばＡＤＰなどのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがあり、赤血球Ｚｎ－プロトポルフィリンレベルの上昇を示す。
実施形態では、対象は、例えばＡＩＰなどのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがあり、ＡＬＡ、ＰＢＧ、および／またはウロポルフィリンレベルの上昇（例えば尿レベルの上昇）を示す。
実施形態では、対象は、例えばＨＣＰなどのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがあり、ＡＬＡ、ＰＢＧ、および／またはコプロポルフィリンＩＩＩレベルの上昇（例えば尿レベルの上昇）を示す。実施形態では、対象は、例えばＨＣＰなどのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがあり、コプロポルフィリンＩＩＩレベルの上昇（例えば便レベルの上昇）を示す。
実施形態では、対象は、例えばＶＰなどのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがあり、ＡＬＡ、ＰＢＧ、および／またはコプロポルフィリンＩＩＩレベルの上昇（例えば尿レベルの上昇）を示す。
実施形態では、対象は、例えばＨＣＰなどのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがあり、コプロポルフィリンＩＩＩおよび／またはプロトポルフィリンレベルの上昇（例えば便レベルの上昇）を示す。
実施形態では、対象は、例えばＰＣＴなどのポルフィリン症（例えば肝骨髄性ポルフィリン症）を有し、またはそれを発症するリスクがあり、ウロポルフィリンおよび／またはポルフィリン－７－カルボン酸レベルの上昇（例えば尿レベルの上昇）を示す。実施形態では、対象は、例えばＰＣＴなどのポルフィリン症（例えば肝骨髄性ポルフィリン症）を有し、またはそれを発症するリスクがあり、ウロポルフィリンおよび／またはポルフィリン－７－カルボン酸レベルの上昇（例えば便レベルの上昇）を示す。
ポルフィリン症と関連付けられている変異としては、ヘム生合成経路（ポルフィリン経路）中の酵素をコードする遺伝子、またはヘム生合成経路中の遺伝子の発現を変化させる遺伝子におけるあらゆる変異が挙げられる。多数の実施形態において、対象は、ポルフィリン経路の酵素に、１つまたは複数の変異（例えばＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｄｒａｔａｓｅ）またはＰＢＧデアミナーゼの変異）を保有する。いくつかの実施形態では、対象は、急性ポルフィリン症（例えばＡＩＰ、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｄｒａｔａｓｅ）欠乏ポルフィリン症）に罹患している（ｓｕｆｆｅｒｅｉｎｇ）。
場合によっては、急性肝性ポルフィリン症（例えばＡＩＰ）がある患者、または急性肝性ポルフィリン症（例えばＡＩＰ）と関連付けられている変異を保有するが、無症候性である患者は、健常人と比較してＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を有する。例えば、フロデルス（Ｆｌｏｄｅｒｕｓ），Ｙ．ら著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２（４）：７０１－７０７，２００６；サルド（Ｓａｒｄｈ）ら著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，４６（４）：３３５－３４９，２００７年を参照されたい。このような症例では、患者が発作を有せず、または発作を起こしたことがない場合であっても、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルは上昇し得る。このようないくつかの症例では、患者はその他の点では完全に無症候性である。このようないくつかの症例では、患者は、例えば慢性疼痛であり得る（例えば慢性神経障害性疼痛）神経障害性疼痛などの疼痛に悩まされる。場合によっては、患者は神経障害を有する。場合によっては、患者は進行性神経障害を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルの上昇を有する。ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルは、当該技術分野で公知の方法、または本明細書に記載される方法を使用して評価し得る。例えば尿（ｕｒｉｎｇ）および血漿のＡＬＡおよびＰＢＧレベル、ならびに尿および血漿のポルフィリンレベルを評価する方法は、その内容全体を本明細書に援用する、フロデルス（Ｆｌｏｄｅｒｕｓ），Ｙ．ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２（４）：７０１－７０７，２００６；およびサルド（Ｓａｒｄｈ）ら著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，４６（４）：３３５－３４９，２００７年で開示される。
いくつかの実施形態では、対象は、例えばポルフィリン症のマウスモデルなどのポルフィリン症の動物モデルである（例えばリンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）ら著 Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１９５－１９９，１９９６に記載されるような変異マウス）。いくつかの実施形態では、対象は、例えば本明細書に記載されるようなポルフィリン症がある、またはそれを発症するリスクがあるヒトなどのヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、ポルフィリン症の急性発作を有しない。いくつかの実施形態では、対象は、発作を起こしたことがない。いくつかの実施形態では、患者は、慢性疼痛に悩まされている。いくつかの実施形態では、患者は、神経損傷を有する。実施形態では、対象は、ＥＭＧ変化および／または神経伝導速度の変化を有する。いくつかの実施形態では、対象は無症候性である。いくつかの実施形態では、対象は、ポルフィリン症を発症するリスクがあり（例えばポルフィリン症と関連付けられている遺伝子変異を保有する）、無症候性である。いくつかの実施形態では、対象は以前に急性発作を起こしたことがあるが、治療時点では無症候性である。
いくつかの実施形態では、対象は、ポルフィリン症を発症するリスクがあり、ポルフィリン症の発症を予防するために、予防的に治療される。いくつかの実施形態では対象は、例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルの上昇を有する。いくつかの実施形態では、予防的治療は、思春期に開始される。いくつかの実施形態では、治療は、例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベル（例えば血漿レベルまたは尿レベル）を低下させる。いくつかの実施形態では、治療は、例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルの上昇の発生を予防する。いくつかの実施形態では、治療は、例えば疼痛または神経損傷などのポルフィリン症に伴う症状の発症を予防し、または頻度または重症度を低下させる。
いくつかの実施形態では、例えば対象からの血漿または尿サンプル中で、例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルが上昇している。いくつかの実施形態では、例えば対象からのサンプル中の例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体の絶対レベルに基づいて、例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルが、対象中で評価される。いくつかの実施形態では、例えば対象からのサンプル中の例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体の相対レベルに基づいて、例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルが、対象中で評価される。いくつかの実施形態では、相対レベルは、例えば対象からのサンプル中のクレアチニンレベルなどの、別のタンパク質または化合物レベルと比較される。いくつかの実施形態では、サンプルは尿サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは血漿サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは便サンプルである。
例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体の上昇レベルは、例えば対象が、基準値を超える、またはそれ以上の、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベル（例えば血漿または尿のＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベル）を有することを示すことで、確立され得る。ポルフィリン症治療の専門知識がある医師は、例えばポルフィリン症を診断し、または対象にポルフィリン症を発症するリスクがあるかどうかを判定する目的で、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）レベルが上昇しているかどうかを判定でき、例えば対象には急性発作の素因、または例えば慢性疼痛（例えば神経障害性疼痛）および神経障害（例えば進行性神経障害）などのポルフィリン症に伴う病変の素因があってもよい。
本明細書の用法では、「基準値」は、疾病状態にない時点の対象からの値、または正常なまたは健康な対象からの値、または例えば一群の正常なまたは健康な対象（例えばポルフィリン症と関連付けられている変異を保有しない対象群、および／またはポルフィリン症に伴う症状に罹患していない対象群）などの標準試料または集団からの値を指す。
いくつかの実施形態では、基準値は、同一個人の疾患前レベルである。いくつかの実施形態では、基準値は、標準試料または集団のレベルである。いくつかの実施形態では、基準値は、標準試料または集団の平均値または中央値である。いくつかの実施形態では、基準値は、標準試料または集団の平均値を２標準偏差上回る値である。いくつかの実施形態では、基準値は、標準試料または集団の平均値を２．５、３、３．５、４、４．５、または５標準偏差上回る値である。
対象が、例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルの上昇を有するいくつかの実施形態では、対象は、基準値よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを有する。いくつかの実施形態では、対象は、例えば基準値よりも少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍高い、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを有する。
いくつかの実施形態では、基準値は、基準上限である。本明細書の用法では，「基準上限」は、例えば正常な（例えば野性型）または健康な個人の集団などの、例えばポルフィリン症と関連付けられている遺伝子変異を保有しない個人、および／またはポルフィリン症に罹患していない個人などの、標準試料または集団の９５％信頼区間の上限であるレベルを指す。したがって基準下限は、同一９５％信頼区間の下限であるレベルを指す。
対象が、例えば、例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体の血漿レベルまたは尿レベルなどのレベルの上昇を有するいくつかの実施形態では、レベルは、例えば基準上限などの基準値の２倍、３倍、４倍、または５倍以上である。いくつかの実施形態では、対象は、基準上限の４倍を超える、例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体の尿レベルを有する。
いくつかの実施形態では、基準値は、フロデルス（Ｆｌｏｄｅｒｕｓ），Ｙ．ら著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２（４）：７０１－７０７，２００６年またはサルド（Ｓａｒｄｈ）ら著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，４６（４）：３３５－３４９，２００７年で提供される値である。いくつかの実施形態では、基準値は、サルド（Ｓａｒｄｈ）らの表１で提供される値である。
いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、４．８ｍｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＰＢＧレベルを有する。特定の実施形態では、対象ｈばヒトであり、約３、４、５、６、７、または８ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンを超える、またはそれ以上の尿ＰＢＧレベルを有する。
実施形態では、血漿ＰＢＧの基準値は、０．１２μｍｏｌ／Ｌである。実施形態では、対象はヒトであり、０．１０μｍｏｌ／Ｌ、０．１２μｍｏｌ／Ｌ、０．２４μｍｏｌ／Ｌ、０．３６μｍｏｌ／Ｌ、０．４８μｍｏｌ／Ｌ、または０．６０μｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＰＢＧレベルを有する。実施形態では、対象はヒトであり、０．４８μｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＰＢＧレベルを有する。
実施形態では、尿ＰＢＧの基準値は、１．２ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンである。実施形態では、対象はヒトであり、１．０ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、１．２ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、２．４ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、３．６ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、４．８ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、または６．０ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンを超える、またはそれ以上の尿ＰＢＧレベルを有する。実施形態では、対象はヒトであり、４．８ｍｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＰＢＧレベルを有する。
実施形態では、血漿ＡＬＡの基準値は、０．１２μｍｏｌ／Ｌである。実施形態では、対象はヒトであり、０．１０μｍｏｌ／Ｌ、０．１２μｍｏｌ／Ｌ、０．２４μｍｏｌ／Ｌ、０．３６μｍｏｌ／Ｌ、０．４８μｍｏｌ／Ｌ、または０．６０μｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＡＬＡレベルを有する。実施形態では、対象はヒトであり、０．４８μｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ＡＬＡレベルを有する。
実施形態では、尿ＡＬＡの基準値は、３．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンである。実施形態では、対象はヒトであり、２．５ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、３．１ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、６．２ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、９．３ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、１２．４ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン、または１５．５ｍｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンを超える、またはそれ以上の尿ＡＬＡレベルを有する。
実施形態では、血漿ポルフィリンの基準値は、１０ｎｍｏｌ／Ｌである。実施形態では、対象はヒトであり、１０ｎｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ポルフィリンレベルを有する。実施形態では、対象はヒトであり、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ポルフィリンレベルを有する。対象はヒトであり、４０ｎｍｏｌ／Ｌを超える、またはそれ以上の血漿ポルフィリンレベルを有する。実施形態では、尿ポルフィリンの基準値は、２５μｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニンである。実施形態では、対象はヒトであり、２５μｍｏｌ／ｍｏｌを超える、またはそれ以上の血漿ＰＢＧレベルを有する。実施形態では、対象はヒトであり、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０μｍｏｌ／ｍｏｌクレアチニン以上の尿ポルフィリンレベルを有する。
いくつかの実施形態では、対象は、健常人サンプル中の個人の９９％よりも大きな、例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体の血漿レベルまたは尿レベルなどのレベルを有する。
いくつかの実施形態では、対象は、例えば健常人サンプル中の平均レベルを２標準偏差上回る血漿レベルまたは尿レベルなどのＡＬＡまたはＰＢＧレベルを有する。
いくつかの実施形態では、対象は、健常人（例えばポルフィリン症と関連付けられている変異を保有しない対象）の平均レベルの１．６倍以上の尿レベルＡＬＡを有する。いくつかの実施形態では、対象は、健常人の平均レベルの２または３倍である、ＡＬＡの血漿レベルを有する。いくつかの実施形態では、対象は、健常人の平均レベルの４倍以上である、ＰＢＧの尿レベルを有する。いくつかの実施形態では、対象は、健常人の平均レベルの４倍以上である、ＰＢＧの血漿レベルを有する。
いくつかの実施形態では、方法は、例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧなどのポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを低下させるのに効果的である。実施形態では、方法は、例えばＡＬＡまたはＰＢＧなどの上昇したポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルに所定の低下を生じるのに効果的である。いくつかの実施形態では、所定の低下は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の低下である。いくつかの実施形態では、所定の低下は、例えば疼痛または再発性発作などの症状を予防または改善するのに効果的な低下である。
いくつかの実施形態では、所定の低下は、少なくとも１、２、３標準偏差以上の低下であり、標準偏差は、例えば本明細書に記載される標準試料などの標準試料からの値に基づいて判定される。
いくつかの実施形態では、所定の低下は、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを、基準値（例えば本明細書に記載される基準値）未満のレベルまたはそれ以下のレベルにする低下である。
いくつかの実施形態では、記載される方法に従って治療される対象は、例えば慢性疼痛などの疼痛に悩まされている。いくつかの実施形態では、対象は、例えばＡＩＰのような急性肝性ポルフィリン症などのポルフィリン症を有し、またはそれを発症するリスクがある。実施形態では、方法は、例えば疼痛の重症度を低下させ、または疼痛を治癒することで、疼痛を治療するのに効果的である。実施形態では、方法は、神経損傷を低下させまたは予防するのに効果的である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象は、（ａ）ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を有し、（ｂ）例えば慢性疼痛などの疼痛に悩まされている。実施形態では、方法は、上昇したＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを低下させるのに、および／または例えば疼痛重症度を低下させ、または疼痛を治癒することで、疼痛を治療するのに効果的である。
いくつかの実施形態では、対象は、ＡＬＡＳ１発現関連障害モデルの役割を果たす動物である。
いくつかの実施形態では、対象は、ポルフィリン症モデルの役割を果たす動物（例えば１つまたは複数の変異で遺伝子修飾された動物である。いくつかの実施形態では、ポルフィリン症はＡＩＰであり、対象はＡＩＰの動物モデルである。このような一実施形態では、対象は、例えばリンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）ら著，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１９５－１９９，１９９６に記載されるマウスなどの、ポルホビリノーゲンデアミナーゼを欠いている遺伝子修飾されたマウス、またはＹａｓｕｄａ，Ｍ．，Ｙｕ，Ｃ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｃｌａｖｅｒｏ，Ｓ．，Ｅｄｅｌｍａｎｎ，Ｗ．，Ｇａｎ，Ｌ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ｄ．，＆ Ｄｅｓｎｉｃｋ，Ｒ．Ｊ．Ａｃｕｔｅ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｐｏｒｐｈｙｒｉａ：Ａ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｔｈａｔ ｍｉｍｉｃｓ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．（２０１１年１０月１４日のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｐｒｏｇｒａｍ Ｎｏ．１３０８Ｆにおける発表論文抄録；ｉｃｈｇ２０１１．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｓｈｏｗｄｅｔａｉｌ．ｐｌ？ａｂｓｎｏ＝２１１６７で２０１２年４月４日にオンラインアクセス）に記載されるホモ接合Ｒ１６７Ｑマウスであり；これらの参考文献はどちらもその内容全体を本明細書に援用する。ヒトにおいて、ホモ接合優勢ＡＩＰを引き起こす変異のために、いくつかのノックインモデルが作り出されている。用いられる変異としては、例えば、ＰＢＧデアミナーゼ中のＲ１６７Ｑ、Ｒ１７３Ｑ、およびＲ１７３Ｗが挙げられる。生存可能なホモ接合体は、Ｒ１６７Ｑ／Ｒ１７６ＱおよびＲ１６７Ｑ／Ｒ１７３Ｑを含み、そのどちらも、ヒトホモ接合優勢ＡＩＰにおける表現型に類似した、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルの恒常的上昇を示す；いくつかの実施形態では、このような生存可能なホモ接合ＡＩＰマウスモデルが対象である。
一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象（例えばヒト対象または患者）には、例えばポルフィリン症などのＡＬＡＳ１発現関連障害を発症するリスクがあり、または障害があると診断されている。いくつかの実施形態では、対象は、１つまたは複数のポルフィリン症状の１つまたは複数の急性発作に罹患している対象である。別の実施形態では、対象は、ポルフィリン症の１つまたは複数の症状（例えば神経障害性疼痛などの疼痛、および／または例えば進行性神経障害などの神経障害）に慢性的に罹患している対象である。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載される遺伝子変化（例えば変異）を保有するが、その他の点では無症候性である。いくつかの実施形態では、対象は、以前、本明細書に記載されるヘム製品（例えばヘミン、アルギン酸ヘム、またはヘムアルブミン）で治療されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って治療される対象（例えばＡＩＰなどのポルフィリン症がある対象）は、前駆症状を最近経験しており、または目下経験している。いくつかのこのような実施形態では、対象には、例えば本明細書に記載されるｉＲＮＡなどの併用療法、およびポルフィリン症またはその関連症状に対して効果的であることが知られている１つまたは複数の追加的な治療薬（例えばグルコースおよび／または本明細書に記載されるヘミンなどのヘム製品）が投与される。
一実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、グルコースまたはデキストロースと組み合わせて投与される。例えば生理食塩水中の１０～２０％デキストロースが、静脈内に投与されてもよい。典型的に、グルコースが投与される場合、少なくとも３００ｇの１０％グルコースが毎日静脈内投与される。ｉＲＮＡ（例えばＬＮＰ製剤中のｉＲＮＡ）もまた、グルコースまたはデキストロースを投与するのに使用される同一輸液の一部として静脈内投与してもよく、またはグルコースまたはデキストロースの投与前、投与中、または投与後に投与される別の輸液として、静脈内投与してもよい。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、別の投与経路（例えば皮下）によって投与される。さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡは、完全非経口栄養法と組み合わせて投与される。ｉＲＮＡは、完全非経口栄養法の投与前、投与中、または投与後に投与してもよい。
一実施形態では、ｉＲＮＡは、ヘム製品（例えばヘミン、アルギン酸ヘム、またはヘムアルブミン）と組み合わせて投与される。さらなる実施形態では、ｉＲＮＡは、ヘム製品およびグルコース、ヘム製品およびデキストロース、またはヘム製品および完全非経口栄養法と組み合わせて投与される。
「前駆症状」は、本明細書の用法では、個々の対象が急性発作を発症する直前に経験する、あらゆる症状を含む。前駆症状の典型的な症状としては、例えば腹痛、悪心、頭痛、心理学的症状（例えば不安）、情動不安および／または不眠症が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、前駆症状中に疼痛（例えば腹痛および／または頭痛）を経験する。いくつかの実施形態では、対象は、前駆症状中に悪心を経験する。いくつかの実施形態では、対象は、前駆症状中に心理学的症状（例えば不安）を経験する。いくつかの実施形態では、対象は、前駆症状中に落ち着きがなくなりおよび／または不眠症に悩まされる。
ポルフィリン症の急性「発作」は、典型的に、ポルフィリン症と関連付けられている変異（例えばポルフィリン経路中の酵素をコードする遺伝子の変異）を保有する患者において、ポルフィリン症の１つまたは複数の症状の発症を伴う。
特定の実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｉＲＮＡの投与は、本明細書に記載される１つまたは複数のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）レベルの低下をもたらす。低下は、あらゆる適切な対照または基準値と比較して判定されてもよい。例えば１つまたは複数のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルの低下は、例えば治療前の（例えば治療直前の）レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上の低下として、個々の対象中で確立されてもよい。ポルフィリン前駆体、ポルフィリン、またはポルフィリン代謝産物レベルの低下は、当該技術分野で公知のいずれかの方法を使用して測定してもよい。例えば尿または血漿中のＰＢＧおよび／またはＡＬＡレベルは、ワトソン－シュヴァルツ試験、イオン交換クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して評価してもよい。例えばサンネル（Ｔｈｕｎｅｌｌ）（１９９３）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、対象中において、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを低下させるのに効果的である。対象中のＡＬＡまたはＰＢＧレベルは、例えばＡＬＡまたはＰＢＧの絶対レベルに基づいて、または対象からのサンプル中のＡＬＡまたはＰＢＧの相対レベルに基づいて（例えばクレアチニンレベルなどの別のタンパク質または化合物レベルと比較して）評価し得る。いくつかの実施形態では、サンプルは尿サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは血漿サンプルである。
特定の実施形態では、ＡＬＡＳ１を標的とするｉＲＮＡは、例えば、ポルフィリン症を、またはポルフィリン症の症状を治療するのに効果的であることが知られている別の治療薬などの、１つまたは複数の追加的な治療薬と組み合わせて投与される。例えば、別の治療薬は、グルコース（例えばＩＶグルコース）またはヘム製品（例えばヘミン、アルギン酸ヘム、またはヘムアルブミン）であってもよい。追加治療は、ｉＲＮＡの投与前、投与後、または投与と同時に投与してもよい。
ｉＲＮＡおよび追加的な治療薬は、例えば静脈内に、同一組成物中で組み合わせて投与し得て、または追加的な治療薬は、別個の組成物の一部として、または本明細書に記載される別の方法によって投与し得る。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡの投与、または１つまたは複数の追加的な治療薬（例えばグルコース、デキストロースなど）と組み合わされたｉＲＮＡの投与は、（例えば急性発作がもはや起きないように予防することで、または例えば１年あたりでより少ない発作が起きるなど、特定期間内に起きる発作回数を低下させることで）急性発作の発生頻度を低下させる。いくつかのこのような実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば毎日、毎週、隔週、または毎月などの定期的投与計画に従って投与される。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、ポルフィリン症の急性発作後に投与される。いくつかのこのような実施形態では、ｉＲＮＡは、例えばＬＮＰ製剤などの脂質製剤を含んでなる組成物である、組成物中にある。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、ポルフィリン症の急性発作中に投与される。いくつかのこのような実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば脂質製剤（例えばＬＮＰ製剤）を含んでなる組成物である、またはＧａｌＮＡｃ複合体を含んでなる組成物である、組成物中にある。
いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、（例えば発作に伴う１つまたは複数の徴候または症状を改善することで）発作の重症度を低下させるのに効果的である。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、発作持続期間を短縮するのに効果的である。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、発作を止めるのに効果的である。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、ポルフィリン症を予防するために予防的に投与される。いくつかのこのような実施形態では、ｉＲＮＡは、例えばＧａｌＮＡｃ複合体を含んでなる組成物などのＧａｌＮＡｃ複合体の形態である。いくつかの実施形態では、予防的な投与は、増悪因子暴露または増悪因子発生の前、その最中、またはその後である。いくつかの実施形態では、対象には、ポルフィリン症を発症するリスクがある。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは前駆症状中に投与される。いくつかの実施形態では、前駆症状は、疼痛（例えば頭痛および／または腹痛）、悪心、心理学的症状（例えば不安）、情動不安および／または不眠症によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば黄体期などの月経周期の特定段階中に投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、発作（例えば前駆症状に伴う、および／または例えば黄体期などの月経周期の特定段階のような増悪因子に伴う再発性発作）を予防するのに効果的である。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、発作の発生頻度を低下させるのに効果的である。実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、（例えば発作に伴う１つまたは複数の徴候または症状を改善することで）発作の重症度を低下させるのに効果的である。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、発作持続期間を短縮するのに効果的である。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、発作を止めるのに効果的である。
いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、例えば神経障害性疼痛などの疼痛を予防し、または発生頻度または重症度を低下させるのに効果的である。
いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与は、神経障害を予防し、またはその発生頻度または重症度を低下させるのに効果的である。
ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの投与効果は、例えば適切な対照との比較によって、確立され得る。例えば急性発作の発生頻度の低下、ならびに１つまたは複数のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルの低下は、例えば適切な対照群と比較した発生頻度低下として、ＡＩＰ患者群中で確立されてもよい。対照群（例えばクロスオーバーデザイン中の類似個体群または同一個体群）としては、例えば未治療集団、従来のポルフィリン症治療薬で治療された集団（例えばＡＩＰの従来の治療薬としては、グルコース、ヘミン、またはその双方が挙げられる）；任意選択的に１つまたは複数の従来のポルフィリン症治療薬（例えばグルコース、例えばＩＶグルコース）と組み合わされた、プラセボまたは非標的化ｉＲＮＡで治療された集団が挙げられる。
本明細書の用法では、ポルフィリン症を発症する「リスクがある」対象としては、ポルフィリン症の家族歴、および／または１つまたは複数の再発性または慢性ポルフィリン症の症状の病歴がある対象、および／またはヘム生合成経路の酵素をコードする遺伝子中に遺伝子変化（例えば変異）を保有する対象、および例えばポルフィリン症に伴うことが知られている変異などの遺伝子変化を保有する対象が挙げられる。
実施形態では、変異などの変化は、（例えば薬物、ダイエットまたは例えば本明細書で開示される増悪因子のようなその他の増悪因子などの増悪因子に曝露した際に）個人が急性発作を起こしやすくする。実施形態では、変異などの変化は、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）レベルの上昇と関連付けられている。実施形態では、変異などの変化は、慢性疼痛（例えば慢性神経障害性疼痛）および／または神経障害（例えば進行性神経障害）と関連付けられている。実施形態では、例えば変異などの変化は、ＥＭＧおよび／または神経伝導速度変化と関連付けられている。
実施形態では、変化は、ＡＬＡＳ１遺伝子の変異である。実施形態では、変化は、ＡＬＡＳ１遺伝子プロモータの変異、またはＡＬＡＳ１遺伝子の上流または下流領域の変異である。実施形態では、変化は、ＡＬＡＳ１と相互作用する転写因子またはその他の遺伝子の変異である。実施形態では、変化は、例えばヘム生合成経路中の酵素をコードする遺伝子の変異などの変化である。
いくつかの実施形態では、対象は、本明細書に記載される遺伝子変化（例えばポルフィリン症に伴うことが知られている遺伝子変異）を有する。いくつかのこのような実施形態では、対象は、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベル（例えば尿または血漿レベル）の上昇を有する。いくつかのこのような実施形態では、対象は、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を有しない。実施形態では、対象は本明細書に記載される遺伝子変化を有し、および例えば慢性疼痛ＥＭＧ変化、神経伝導速度変化、および／またはその他のポルフィリン症に伴う症状などのその他の症状を有する。実施形態では、対象は遺伝子変化を有するが、急性発作に悩まされていない。
実施形態では、対象は、ＡＩＰ、ＨＣＰ、ＶＰ、またはＡＤＰと関連付けられている変異を有する。
いくつかの実施形態では、ポルフィリン症はＡＩＰである。いくつかのこのような実施形態では、対象は、ＰＢＧデアミナーゼ遺伝子に、例えば少なくとも１つの変異などの変化を有する。例えばヒドリンカ（Ｈｒｄｉｎｋａ），Ｍ．ら著Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５（Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ１１９－１３６（２００６）で報告されるように、多数のＰＢＧデアミナーゼ変異が当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＢＧデアミナーゼ変異についてヘテロ接合性である。別の実施形態では、対象は、ＰＢＧデアミナーゼ変異についてホモ接合性である。ホモ接合性の対象は、ＰＢＧデアミナーゼ遺伝子に、２つの同一変異または２つの異なる変異を保有してもよい。
いくつかの実施形態では、ポルフィリン症はＨＣＰである。いくつかのこのような実施形態では、対象は、酵素コプロポルフィリノーゲンＩＩＩオキシダーゼをコードする遺伝子に、例えば少なくとも１つの変異などの変化を有する。
いくつかの実施形態では、ポルフィリン症はＶＰである。いくつかのこのような実施形態では、対象は、プロトポルフィリノーゲン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｒｉｎｏｇｅｎ）オキシダーゼをコードする遺伝子に、例えば少なくとも１つの変異などの変化を有する。
実施形態では、ポルフィリン症は、例えば常染色体劣性ＡＤＰなどのＡＤＰである。いくつかのこのような実施形態では、対象は、ＡＬＡデヒドラターゼ（ｄｅｙｄｒａｔａｓｅ）をコードする遺伝子に、例えば少なくとも１つの変異などの変化を有する。
本明細書で提供される治療法は、ポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状を改善し、ポルフィリン症に伴う発作の発生頻度を低下させ、増悪因子への曝露に際してポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状の発作が起きる可能性を低下させ、またはポルフィリン症に伴う病状（例えば神経障害（例えば進行性神経障害）、肝細胞がん）を発症するリスクを低下させるのに役立ってもよい。さらに、本明細書で提供される方法は、１つまたは複数のポルフィリン前駆体、ポルフィリンおよび／または関連ポルフィリン産物または代謝産物レベルを低下させるのに役立ってもよい。ポルフィリン前駆体またはポルフィリン（ｐｏｒｈｙｒｉｎ）レベルは、例えば尿、血液、糞便、脳脊髄液、または組織サンプルなどのあらゆる生物学的サンプル中で測定されてもよい。サンプルは、対象内に存在してもよく、または対象から得られ、または対象から抽出されてもよい。いくつかの実施形態では、ポルフィリン症はＡＩＰであり、ＰＢＧおよび／またはＡＬＡレベルが低下される。いくつかの実施形態では、ポルフィリン産物または代謝産物は、ポルホビリン、ポルホビリノーゲン、またはウロポルフィリンである。ポルフィリン産物または代謝産物レベルの低下は、当該技術分野で公知のあらゆる方法を使用して測定してもよい。例えば尿または血漿中のＰＢＧおよび／またはＡＬＡレベルは、ワトソン－シュヴァルツ試験、イオン交換クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー質量分析法を使用して評価してもよい。例えばサンネル（Ｔｈｕｎｅｌｌ）（１９９３）を参照されたい。
本明細書に記載される方法は、ポルフィリン症（例えばＡＩＰのような急性肝性ポルフィリン症）に罹患している、またはポルフィリン症を発症するリスクがある対象中で、ポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）の上昇した慢性的レベルを低下させるのにもまた、役立ってもよい。ポルフィリン前駆体の血漿および尿レベル（例えば慢性的レベル上昇）を評価する方法としては、例えばＨＰＬＣ質量分析法およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。ポルフィリン前駆体レベルは、例えばクレアチニンなどの別のタンパク質または化合物と比較したレベルとして表されてもよい。例えばフロデルス（Ｆｌｏｄｅｒｕｓ），Ｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２（４）：７０１－７０７，２００６年；サルド（Ｓａｒｄｈ）ら著，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，４６（４）：３３５－３４９，２００７年を参照されたい。
「増悪因子」は、本明細書の用法では、ポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状の急性発作を誘発することもある内因性または外因性要因を指す。増悪因子としては、空腹時（またはクラッシュダイエットや長距離運動競技などに起因する、低下したまたは不十分なカロリー摂取量のその他の形態）、代謝ストレス（例えば感染症、外科手術、国際飛行機旅行、および心理学的ストレス）、内因性ホルモン（例えばプロゲステロン）、喫煙、脂質可溶性外来性化学物質（例えばタバコの煙、特定の処方薬、有機溶媒、殺生剤、アルコール飲料の成分中に存在する化学物質をはじめとする）、内分泌因子（例えば生殖ホルモン（女性は月経前期間中に増悪を経験することもある）、合成エストロゲン、プロゲステロン、排卵誘発剤、およびホルモン代替療法）が挙げられる。例えばサンネル（Ｔｈｕｎｅｌｌ）（１９９３）を参照されたい。一般的増悪因子としては、チトクロームＰ４５０誘導剤およびフェノバルビタールが挙げられる。
ポルフィリン症に伴う症状としては、腹痛または痙性腹痛、頭痛、神経系異常によって引き起こされる影響、そして発疹、水疱形成、および皮膚瘢痕（光線皮膚炎）を引き起こす光感受性が挙げられる。特定の実施形態では、ポルフィリン症はＡＩＰである。ＡＩＰの症状としては、胃腸症状（例えば重症で局在のはっきりしない腹痛、悪心／嘔吐、便秘、下痢、腸閉塞）、尿症状（排尿障害、尿貯留／失禁、または色の濃い尿）、神経症状（例えば感覚性の神経障害、運動神経障害（例えば脳神経に影響を及ぼし、および／または腕または脚の脱力感をもたらす）、痙攣、神経障害性疼痛、進行性神経障害、頭痛、神経精神症状（例えば精神錯乱、不安、撹拌、幻覚、ヒステリー、譫妄、感情鈍麻、うつ病、恐怖症、精神病、不眠症、傾眠、昏睡）、自律神経系障害（例えば頻脈、高血圧、および／または不整脈などの心血管症状（ｓｙｓｍｐｔｏｍｓ）、ならびに例えば循環カテコールアミンレベル増大、発汗、情動不安、および／または振戦などのその他の症状をもたらす）、脱水、および電解質異常が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１を標的にするｉＲＮＡが、上記症状の１つまたは複数を緩和するのに役立ってもよい別の治療薬と共に（例えば前、後、または同時に）投与される。腹痛は、例えば麻薬鎮痛剤で治療してもよく、痙攣は、例えば抗痙攣薬剤で治療してもよく、悪心／嘔吐は、例えばフェノチアジンで治療してもよく、頻脈／高血圧は、例えばβ遮断薬で治療してもよい。
「低下」（または「増大」）という用語は、例えば統計的に有意な変化などの測定可能変化を指すことが意図される。変化は、例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上の変化であってもよい（例えば、例えばｉＲＮＡが提供されない場合の基準値である基準値と比較した低下（または増大））。
本発明は、例えば疾患を治療するために目下用いられているものなどの、既知の医薬品および／または既知の治療法などの、その他の医薬品および／またはその他の治療法と組み合わされた、例えばＡＬＡＳ１発現関連障害を治療するための、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物の使用にさらに関する。一実施形態では、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物は、ヘム製品（例えば本明細書に記載されるヘミン、アルギン酸ヘム、またはヘムアルブミン）と併せて、および／または静脈内グルコース輸液と併せて投与し得る。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡまたはその医薬組成物が、例えば急性ポルフィリン症の予期される発作の症状を予防または改善するために、予防的に使用される。予防的な使用は、増悪因子への対象の曝露または予期される曝露に従って、時期設定されてもよい。本明細書に記載されるように、増悪因子は、急性発作を誘発することが知られているあらゆる内因性または外因性要因であってもよい。例えば月経前期は、内因性増悪因子であり、チトクロームＰ４５０誘導剤は外因性増悪因子である。
ＡＬＡＳ１発現関連障害（例えばＡＩＰなどのポルフィリン症）の治療有効量は、治療される疾患のタイプ、症状の重症度、治療される対象、対象の性別、年齢および全身状態、投与様式などに左右される。いかなる場合も、適切な「有効量」は、通例の実験法を使用して、当業者によって測定され得る。このようなパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することで、治療または予防有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＡＬＡＳ１を標的にするｉＲＮＡまたはその医薬組成物の投与との関連で、ＡＬＡＳ１発現関連障害「に対して効果的」とは、臨床的に適切な様式での投与が、例えば個々の患者に、または例えば患者の統計学的に顕著な部分などの患者の少なくとも一部に、有益な効果をもたらすことを意味する。有益な効果としては、例えば症状の予防または低下、またはその他の効果が挙げられる。有益な効果としては、例えば症状の改善（例えば重症度または発生頻度の低下）、発作の重症度または発生頻度の低下、関連疾患（例えば神経障害（例えば進行性神経障害）、肝細胞がん）発症リスクの低下、増悪因子耐性能力の改善、生活の質の改善、ＡＬＡＳ１発現の低下、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）レベル（例えば血漿または尿レベル）の低下、または特定タイプの疾患治療に精通している医者によって、プラスであると一般に認められているその他の効果が挙げられる。
病態の１つまたは複数のパラメータに統計的に有意な改善などの改善がある場合、またはさもなければ予期される症状悪化または発症の欠如によって、治療または予防効果は明らかである。一例として、疾患の測定可能なパラメータにおける、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上などの少なくとも１０％の好ましい変化は、効果的な治療を示唆し得る。所与のｉＲＮＡ薬剤またはその薬剤の配合物の有効性はまた、当該技術分野で公知の所与の疾患のための実験動物モデルを使用して、判定し得る。実験的動物モデルを使用する場合、治療の効能は、マーカ（例えば血漿または尿ＡＬＡまたはＰＢＧ）または症状に、統計的に有意な低下が観察された場合に証明される。
患者には、治療量のｉＲＮＡを投与し得る。治療量は、例えば０．０５～５０ｍｇ／ｋｇであり得る。例えば治療量は、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、または２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡであり得る。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば本明細書に記載されるＬＮＰ製剤などの脂質製剤として調合される。いくつかのこのような実施形態では、治療量は、例えば０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、または５．０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなど、０．０５～５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、例えばＬＮＰ製剤である脂質製剤は、静脈内投与される。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、または２５分間などを超える時間にわたる、静脈輸液によって投与し得る。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるＧａｌＮＡｃ複合体の形態である。いくつかのこのような実施形態では、治療量は、例えば０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡなど、０．５～５０ｍｇである。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ複合体は皮下投与される。
いくつかの実施形態では、投与は、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月以上などにわたり、日周、隔週（すなわち２週毎）で、定期的に繰り返される。最初の治療計画の後に、治療は、より低い頻度で行い得る。例えば３ヶ月にわたる隔週の投与後、６ヶ月または１年以上にわたり毎月１回の投与を反復し得る。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２回分以上の用量で投与される。いくつかの実施形態では、引き続く投与の回数または量は、例えばＡＬＡＳ遺伝子抑制、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧ）レベルの低下などの所望の効果の達成、または例えばポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状（例えば疼痛、例えば神経障害性疼痛）の低下または予防、および／またはポルフィリン症に伴う発作の予防または発作の発生頻度および／または重症度低下などの、治療的または予防的効果の達成に左右される。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、スケジュールに従って投与される。例えばｉＲＮＡ剤は、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、または週に５回、投与してもよい。いくつかの実施形態では、スケジュールは、例えば１時間毎、４時間毎、６時間毎、８時間毎、１２時間毎、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、毎週、隔週、または毎月などの、規則的間隔の投与を伴う。実施形態では、ｉＲＮＡ剤が毎週または隔週投与されて、例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの低下、疼痛低下、および／または急性発作予防などの所望の効果が達成される。
実施形態では、スケジュールは、狭い間隔での投与と、それに続く薬剤が投与されないより長い期間を伴う。例えばスケジュールは、比較的短期間（例えば約６時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、または約７２時間毎）で投与される最初の投与セットと、その間ｉＲＮＡ剤が投与されない、それに続く（例えば約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、または約８週間）などのより長い期間を伴ってもよい。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤を最初に１時間毎に投与して、後により長い間隔で（例えば毎日、毎週、隔週、または毎月）投与する。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤を最初に毎日投与して、後により長い間隔で（例えば毎週、隔週、または毎月）投与する。特定の実施形態では、より長い間隔は、経時的に増大され、または所望の効果の達成に基づいて決定される。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、急性発作中に毎日１回投与され、投与の８日目に開始する毎週の投薬がそれに続く。別の特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、第１週目に隔日投与され、投与の８日目に開始する毎週の投薬がそれに続く。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えば増悪因子に伴う周期性発作などの再発性発作を予防し、または重症度または発生頻度を低下させるために投与される。いくつかの実施形態では、増悪因子は月経周期である。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば黄体期のような月経周期の特定段階など、例えば月経周期などの増悪因子に伴う周期性発作などの再発性発作を予防し、または重症度または発生頻度を低下させるために、例えば定期的に繰り返し投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、治療される患者の月経周期の特定段階中に、またはホルモンレベルに基づいて（例えば月経周期の特定段階に伴うホルモンレベルに基づいて）、投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日目（または月経周期がより長い対象では、それ以降の日）などの月経周期の特定の１日または複数日に投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば月経周期の１４～２８日目（月経周期が２８日間より長い対象では、その後）の１日または複数日などの、黄体期中に投与される。いくつかの実施形態では、対象の排卵が評価され（例えばＬＨなどの排卵に伴うホルモンを検出する血液または尿検査を使用して）、ｉＲＮＡが排卵後に所定の間隔で投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、排卵直後に投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、排卵の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８日後に投与される。これらのスケジュールのいずれでも、任意選択的に、１回または複数回、繰り返してもよい。反復回数は、例えばＡＬＡＳ１遺伝子抑制などの所望の効果の達成、および／または例えばポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状を低下させまたは予防して、ポルフィリン症に伴う発作の発生頻度を低下させるなどの治療的または予防的効果の達成に左右されてもよい。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の最初の用量が投与され、ＡＬＡまたはＰＢＧレベルが、最初の用量の投与に続いて、例えば２、４、８、１２、または２４時間後など、１～４８時間にわたり検査される。いくつかの実施形態では、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルが低下した（例えば正常化など所定の低下が達成された）場合、および／または（例えば患者が無症候性になるように）ポルフィリン症に伴う症状（例えば疼痛）が改善された場合、それ以上の用量は投与されない一方で、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルが低下しなかった場合（例えば正常化など所定の低下が達成されなかった場合）、ＡＬＡまたはＰＢＧのさらなる用量が投与される。いくつかの実施形態では、最初の用量の１２、２４、３６、４８、６０、または７２時間後にさらなる用量が投与される。いくつかの実施形態では、最初の用量が、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを低下させるのに効果的でない場合、さらなる用量は修正され、例えば増大されて、ＡＬＡまたはＰＢＧレベルに所望の低下が達成される（例えば正常化などの所定の低下）。
いくつかの実施形態では、所定の低下は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％の低下である。いくつかの実施形態では、所定の低下は、例えば疼痛、前駆症状、または再発性発作などの症状を予防または改善するのに効果的な低下である。
いくつかの実施形態では、所定の低下は、少なくとも１、２、３標準偏差以上の低下であり、標準偏差は、例えば本明細書に記載される標準試料などの標準試料からの値に基づいて判定される。
いくつかの実施形態では、所定の低下は、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを、基準値（例えば本明細書に記載される基準値）未満のレベルまたはそれ以下のレベルにする低下である。
本明細書の用法では、ＡＬＡまたはＰＢＧレベルの「正常化」（または「正常な」または「正常化された」レベル）は、健常人、無症候性の個人（例えば疼痛を経験していない、および／または神経障害に罹患していない個人）、またはポルフィリン症に伴う変異を有しない個人について予測範囲内にある、ＡＬＡまたはＰＢＧのいずれか、または双方のレベル（例えば尿および／または血漿レベル）を指す。例えばいくつかの実施形態では、正常化されたレベルは、正常な平均値の２標準偏差内である。いくつかの実施形態では、正常化されたレベルは、例えばポルフィリン症に伴う遺伝子変異を保有しない健常人または個人のサンプルである、適切な対照サンプルの９５％信頼区間内などの、正常基準範囲内である。いくつかの実施形態では、対象のＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベル（例えば尿および／または血漿ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベル）は、周期的にモニターされ、基準値を超えてレベルが増大した場合は、ｉＲＮＡ剤のさらなる用量が投与される。
ｉＲＮＡの投与は、例えば患者の細胞、組織、血液、尿またはその他の区画中などのＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％以上低下させてもよい。ｉＲＮＡ投与は、例えば１つまたは複数のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベル（例えばＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベル）などの、ＡＬＡＳ１遺伝子発現に伴う産物レベルを低下させてもよい。ｉＲＮＡ剤投与はまた、ＡＩＰの急性発作中に、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの上方制御を阻害しまたは妨げてもよい。
ｉＲＮＡの全用量の投与前に、５％輸液用量などのより少ない用量を患者に投与して、アレルギー反応、または脂質レベルまたは血圧の増大などの悪影響についてモニターし得る。別の実施例では、患者は、望ましくない効果についてモニターし得る。
ＡＬＡＳ１遺伝子発現を調節する方法
さらに別の態様では、本発明は、例えば細胞中または対象中で、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を調節する（例えば阻害または活性化する）方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、生体外、試験管内、または生体内にある。いくつかの実施形態では、細胞は赤血球系細胞または肝実質細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象（例えばヒトなどの哺乳類）中にある。いくつかの実施形態では、対象（例えばヒト）には、上述したようなＡＬＡＳ１発現関連疾患のリスクがある、または疾患があると診断されている。
一実施形態では、方法は、細胞中のＡＬＡＳ１遺伝子の発現を低下させるのに有効な量で、細胞に、本明細書に記載されるｉＲＮＡを接触させるステップを含む。「接触させる」とは、本明細書の用法では、細胞に直接接触させ、ならびに細胞に間接的に接触させることを含む。例えば対象中の細胞（例えば赤血球系細胞、または肝実質細胞などの肝細胞）は、ｉＲＮＡを含んでなる組成物を対象に投与 （例えば静脈内または皮下投与）した際に、接触されてもよい。
ＡＬＡＳ１遺伝子の発現は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの発現レベル、ＡＬＡＳ１タンパク質、またはＡＬＡＳ１遺伝子の発現レベルと機能的に連結したパラメータ（例えばポルフィリンレベルまたはポルフィリン症に関連した症状の発生率または重症度）のレベルに基づいて評価してもよい。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１の発現は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、０．００１～０．０１ｎＭ、０．００１～０．１０ｎＭ、０．００１～１．０ｎＭ、０．００１～１０ｎＭ、０．０１～０．０５ｎＭ、０．０１～０．５０ｎＭ、０．０２～０．６０ｎＭ、０．０１～１．０ｎＭ、０．０１～１．５ｎＭ、０．０１～１０ｎＭの範囲のＩＣ５０を有する。ＩＣ５０値は、例えば非標的化ｉＲＮＡのＩＣ５０などの適切な対照値に対して、正規化してもよい。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞に、本明細書に記載されるｉＲＮＡを導入して、ＡＬＡＳ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたり細胞を保ち、それによって細胞中のＡＬＡＳ１遺伝子発現を阻害するステップを含む。
一実施形態では、方法は、例えば標的ＡＬＡＳ１遺伝子の発現が、例えば１週間、２週間、３週間、または４週間以上など、少なくとも２、３、４日間以上の長期間にわたり低下するように、哺乳類に、ＡＬＡＳ１を標的とするｉＲＮＡを含んでなる組成物などの本明細書に記載される組成物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１発現の低下は、最初の投与の１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、または２４時間以内に検出可能である。
別の実施形態では、方法は、標的ＡＬＡＳ１遺伝子の発現が、未治療動物と比較して、例えば少なくとも１０％増大するように、本明細書に記載される組成物を哺乳類に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１の活性化は、例えば１週間、２週間、３週間、４週間以上など、例えば少なくとも２、３、４日間以上の長期間にわたって起きる。理論による拘束は望まないが、ｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ転写物を安定化し、ゲノム中のプロモータと相互作用し、および／またはＡＬＡＳ１発現の阻害物質を阻害することで、ＡＬＡＳ１発現を活性化し得る。
本発明で取り上げる方法および組成物に有用なｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１遺伝子の（一次またはプロセシング）ＲＮＡを特異的に標的とする。ｉＲＮＡを使用してこれらのＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書の他の箇所に記載されるようにして調製され実施され得る。
一実施形態では、方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与するステップを含み、ｉＲＮＡは、治療される哺乳類のＡＬＡＳ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む。治療される生物が、ヒトなどの哺乳類である場合、組成物は、経口、腹腔内、または頭蓋内（例えば脳室内、脳実質内およびクモ膜下腔内）をはじめとする非経口経路、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（煙霧剤）、経鼻、直腸、および局所（バッカルおよび舌下をはじめとする）投与をはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の任意の手段によって投与してもよい。
特定の実施形態では、組成物は静脈輸液または注射によって投与される。いくつかのこのような実施形態では、組成物は、静脈輸液のための脂質調合ｓｉＲＮＡ（例えばＬＮＰ１１製剤などのＬＮＰ製剤）を含んでなる。特定の実施形態では、ポルフィリン症の急性発作を治療および／または予防する（例えば発作の重症度または発生頻度を低下させる）ために、このような組成物を使用してもよい。
別の実施形態では、組成物は皮下投与される。いくつかのこのような実施形態では、組成物は、ＧａｌＮＡｃリガンドに共役するｉＲＮＡを含んでなる。特定の実施形態では、ポルフィリン症の急性発作を治療または予防（例えば発作の重症度または発生頻度を低下させる）するために、このような組成物を使用してもよい。
ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを低下させる方法
別の態様では、本発明は、例えば細胞中でまたは対象中で、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルを低下させる方法を提供する。
いくつかの実施形態では、細胞は、生体外、試験管内、または生体内にある。いくつかの実施形態では、細胞は赤血球系細胞または肝実質細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は肝実質細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象（例えばヒトなどの哺乳類）中にある。
いくつかの実施形態では、対象（例えばヒト）には、本明細書に記載されるようなポルフィリン症のリスクがあり、またはポルフィリン症と診断されている。いくつかの実施形態では、方法は、（例えばポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状を改善し、ポルフィリン症に伴う発作の発生頻度を低下させ、増悪因子への曝露に際してポルフィリン症に伴う１つまたは複数の症状発作が起きる可能性を低下させ、またはポルフィリン症に伴う病状（例えば神経障害（例えば進行性神経障害）、肝細胞がん）を発症するリスクを低下させることで、本明細書に記載されるポルフィリン症を治療するのに効果的である。一実施形態では、方法は、細胞中、または別の関連細胞または細胞群中、または対象中で、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えばＡＬＡまたはＰＢＧ）レベルを低下させるの十分な量で、細胞に、本明細書に記載されるＲＮＡｉを接触させるステップを含む。「接触させる」とは、本明細書の用法では、細胞に直接接触させ、ならびに細胞に間接的に接触させることを含む。例えば対象中の細胞（例えば赤血球系細胞、または肝実質細胞などの肝細胞）は、ＲＮＡｉを含んでなる組成物を対象に投与（例えば静脈内または皮下投与）した際に、接触されてもよい。「別の関連細胞または細胞群」とは、本明細書の用法では、接触の結果として、その中でポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルが低下するあらゆる細胞または細胞群を含む。例えば細胞は、対象内に存在する組織の一部（例えば対象内に存在する肝細胞）であってもよく、ＲＮＡｉを対象内の細胞に接触させる（例えば対象内に存在する１つまたは複数の肝細胞に接触させる）ことは、別の関連細胞または細胞群（例えば対象の神経細胞）中で、または対象の組織または体液流体（例えば対象の尿、血液、血漿、または脳脊髄液）中で、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルに低下をもたらしてもよい。
いくつかの実施形態では、ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体は、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、ポルホビリノーゲン（ｐｏｒｐｈｏｐｉｌｉｎｏｇｅｎ）（ＰＢＧ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）、ウロポルフィリノーゲンＩＩＩ、コプロポルフィリノーゲンＩＩＩ、プロトポルフィリノーゲン（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｒｉｎｏｇｅｎ）ＩＸ、およびプロトポルフィリンＩＸからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポルフィリン前駆体はＡＬＡである。いくつかの実施形態では、ポルフィリン前駆体はＰＢＧである。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを低下させる。ポルフィリンまたはポルフィリン前駆体レベルは、本明細書に記載されるように、および当該技術分野で公知のように、測定されてもよい。
ＲＮＡｉ活性のアッセイおよびモニタリング方法
別の態様では、本発明は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルのアッセイおよびモニタリング方法を提供する。肝臓内のＲＮＡｉ活性は、組織内のｍＲＮＡレベルまたは５’ＲＡＣＥ生成物を検出することで、または循環分泌タンパク質のレベルを検出することで、モニターされ得る。
代案としては、または組み合わせで、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの循環細胞外レベルは、例えば、ｃＥＲＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；循環細胞外ＲＮＡ検出）アッセイによって検出され得る。いくつかの実施形態では、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、例えば、血清または尿サンプルなどの体液サンプル中で検出され得る。いくつかの実施形態では、エキソソームは、起源組織に由来するｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含有する異なる細胞型（ｃｅｌｌｓ ｔｙｐｅｓ）から、体液中に脱落する。このようなエキソソームを使用して、循環内のＲＮＡｉレベルがモニターされ得る。一実施形態では、例えば、本明細書に記載されるｉＲＮＡで処置された対象からの血清または尿サンプルなどのサンプルは、低速スピンによって精製され得て、約１６０，０００ｇで約２時間のスピンがそれに続き、ペレットが形成される。ＲＮＡは、抽出され分析されて、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルが測定され得る。代表的な方法およびアッセイは、その内容が参照により援用される、国際公開第２０１２／１７７９０６号パンフレットとして公開された、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４３５８４号明細書で開示される。
したがって、対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを検出するためのアッセイまたは方法が、提供される。アッセイまたは方法は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを含んでなる、対象からの生物学的液状サンプル（例えば、尿、血液または血漿サンプル）からのＲＮＡ（例えば、細胞外ＲＮＡ）を提供するステップと；サンプル中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを検出するステップとを含む。
一実施形態（ｅｍｂｅｄｍｅｎｔ）では、アッセイまたは方法は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡからＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡを得るステップと；ＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡをＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡまたはその一部に相補的な核酸（例えば、プローブおよび／またはプライマー）に接触させて、それによって反応混合物を生成するステップと；反応混合物中のＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡレベルを検出し（例えば、測定し）、それによって対象において循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルをアッセイするステップとを含み、ＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡレベルは、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの指標となる。
一実施形態では、アッセイまたは方法は、対象から生体液サンプルを得るステップを含み、生物学的サンプルは組織から分離され、生物学的サンプルはエキソソームを含有する。アッセイまたは方法は、生物学的サンプル中のＲＮＡレベルの検出をさらに含み得て、ＲＮＡは対象の組織内遺伝子から発現されて、エキソソームは生物学的サンプル中のＲＮＡレベルの検出に先だって、生物学的サンプルから精製されない。
実施形態では、前記生体液サンプルは、血液サンプルである。実施形態では、前記生体液サンプルは、血清サンプルである。別の実施形態では、生体液サンプルは、尿サンプルである。
実施形態では、（ｔｈｅ ｔｈｅ）方法は、ＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは５’－ＲＡＣＥを含んでなる。
実施形態では、前記核酸は、プローブまたはプライマーである。
実施形態では、前記核酸は、検出可能部分を含んでなり、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、検出可能部分の量の検出によって判定される。
実施形態では、前記方法は、対象から生体液サンプルを得るステップをさらに含んでなる。
これらの方法の実施形態では、ポルフィリン症治療の有効性は、基準値と比較した、対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの比較に基づいて評価される。
実施形態では、ポルフィリン症治療に応答する、基準値と比較した、対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの低下は、ポルフィリン症治療が効果的であることを示唆する。実施形態では、基準値は、ポルフィリン症治療に先だつ、対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルである。
特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似したまたは同等の方法および材料を、本発明で取り上げるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験で使用し得るが、適切な方法および材料は下述のとおりである。本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その内容全体を参照によって援用する。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先される。これに加えて、材料、方法、および実施例は、例証のみを意図し、制限は意図されない。
実施例１．ｓｉＲＮＡ合成
試薬供給元
試薬の供給元が本明細書で具体的に示されない場合、このような試薬は、分子生物学用途の品質／純度規格の分子生物学用試薬のあらゆる供給業者から得られてもよい。
オリゴヌクレオチド合成。
オリゴヌクレオチドは、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機上で合成される。市販の制御孔ガラス固体担体（ｄＴ－ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）および標準保護基があるＲＮＡホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチルＮ６－ベンゾイル－２’－Ｔ－ブチルジメチルシリル－アデノシン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ４－アセチル－２’－Ｔ－ブチルジメチルシリル－シチジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチル（ｉｓｏｂｕｔｒｙｌ）－２’－Ｔ－ブチルジメチルシリル－グアノシン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホラミダイト、および５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－Ｔ－ブチルジメチルシリル－ウリジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をオリゴヌクレオチド合成のために使用した。２’－Ｆホスホラミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ４－アセチル－２’－フルロ－シチジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチル－ホスホラミダイトおよび５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－２’－フルロ－ウリジン－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピル－２－シアノエチル－ホスホラミダイトは、（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入される。１０％ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍの濃度で使用されたグアノシンを除く全てのホスホラミダイトは、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．２Ｍの濃度で使用される。１６分間のカップリング／リサイクル時間が、使用される。活性化剤は、５－エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり；ＰＯ－酸化ではヨウ素／水／ピリジンが使用され、ＰＳ－酸化ではＰＡＤＳ（２％）ｉｎ２，６－ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）が使用される。
３’－リガンド共役結合鎖は、対応するリガンドを含有する固体支持体を使用して合成される。例えばヒドロキシプロリノール－コレステロールホスホラミダイトから、配列中へのコレステロール単位の導入が実施される。コレステロールは、６－アミノヘキサノエート結合を介してｔｒａｎｓ－４－ヒドロキシプロリノールに係留されて、ヒドロキシプロリノール－コレステロール部分が得られる。５’－末端Ｃｙ－３およびＣｙ－５．５（フルオロフォア）標識ｉＲＮＡは、バイオサーチ テクノロジーズ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から購入された、対応するＱｕａｓａｒ－５７０（Ｃｙ－３）ホスホラミダイトから合成される。５’末端および／または内部位置へのリガンドの共役結合は、適切に保護されたリガンド－ホスホラミダイト基本単位を使用することで得られる。５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール活性化剤存在下で、無水ＣＨ３ＣＮ中の０．１Ｍホスホラミダイト溶液を、固体支持体結合オリゴヌクレオチドに、１５分間の長時間にわたりカップリングさせる。ヌクレオチド間亜リン酸エステルのリン酸エステルへの酸化は、報告される（１）標準的なヨウ素－水を使用して、またはｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いて、１０分間の酸化待機時間で、共役結合オリゴヌクレオチドを処理して、行われる。ホスホロチオエートは、ＤＤＴＴ（ＡＭケミカルズ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入）、ＰＡＤＳおよびまたはビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬などのイオウ転移試薬を使用して、亜リン酸エステルをホスホロチオエートに酸化することでに導入される。コレステロールホスホラミダイトは施設内で合成され、ジクロロメタン中の０．１Ｍの濃度で使用される。コレステロールホスホラミダイトのカップリング時間は、１６分間である。
脱保護Ｉ（核酸塩基脱保護）
合成完了後、支持体を１００ｍＬガラスボトル（ＶＷＲ）に移す。８０ｍＬのエタノール性アンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］混合物を５５℃で６．５時間用いて、塩基とリン酸基の同時脱保護により、オリゴヌクレオチドを支持体から切断する。氷上でボトルを短時間冷却し、次にエタノール性アンモニア混合物を新しい２５０ｍＬボトル内に濾過する。ＣＰＧを２×４０ｍＬ量のエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄する。次に混合物の体積をｒｏｔｏ－ｖａｐで約３０ｍＬに減少させる。次に混合物をドライアイス上で凍結し、ｓｐｅｅｄ ｖａｃ上で真空乾燥する。
脱保護ＩＩ（２’－ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン－ＨＦおよびＤＭＳＯ（３：４：６）に再懸濁し、６０℃で９０分間加熱して、２’位置のブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。次に反応を５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムでクエンチし、ｐＨを６．５に調節する。オリゴヌクレオチドは、精製まで冷凍庫で保存する。
分析
オリゴヌクレオチドは、精製に先だって高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって分析され、緩衝液およびカラムの選択は、配列および／または結合リガンドの性質に左右される。
ＨＰＬＣ精製
リガンド結合オリゴヌクレオチドは、逆相分取ＨＰＬＣによって精製される。非結合オリゴヌクレオチドは、施設内で充填されたＴＳＫゲルカラム上のアニオン交換ＨＰＬＣによって精製される。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）、および１０％ＣＨ３ＣＮ、１Ｍ ＮａＢｒ中の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ｂ）である。完全長オリゴヌクレオチド含有画分をプールして脱塩し、凍結乾燥する。ほぼ０．１５ ＯＤの脱塩したオリゴヌクレオチドを水で１５０μＬに希釈し、次にＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析のための特殊バイアル内にピペットで移す。次に化合物をＬＣ－ＥＳＭＳおよびＣＧＥによって分析する。
ｓｉＲＮＡ調製
ｓｉＲＮＡの一般的調製のために、等モル量のセンスおよびアンチセンス鎖を１×ＰＢＳ中で５分間９５℃に加熱し、室温に緩慢に冷却する。二本鎖の完全性はＨＰＬＣ分析によって確認される。
核酸配列は、標準命名法と、特に表１の略語を使用して、下に示される。
Figure 2023120219000034
Figure 2023120219000035
Figure 2023120219000036
Figure 2023120219000037
１Ｌ９６の化学構造は次のとおり：
Figure 2023120219000038
実施例２．ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡデザインおよび合成
実験法
バイオインフォマティクス
転写物
ｓｉＲＮＡデザインを実施して、ＮＣＢＩ遺伝子データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）でアノテートされたヒト、アカゲザル（アカゲザル（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ）、マウス、およびラットＡＬＡＳ１転写物を標的にするｓｉＲＮＡを同定した。デザインは、ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑコレクションからの以下の転写物を使用した：Ｈｕｍａｎ－ＮＭ＿０００６８８．４（ｓｅｅＦＩＧ．３）、ＮＭ＿１９９１６６．１；Ｒｈｅｓｕｓ－ＸＭ＿００１０９０４４０．２、ＸＭ＿００１０９０６７５．２；Ｍｏｕｓｅ－ＮＭ＿０２０５５９．２；Ｒａｔ－ＮＭ＿０２４４８４．２。高度な霊長類／齧歯類配列多様性のために、ｓｉＲＮＡ二本鎖は、二本鎖整合ヒトおよびアカゲザル転写物のみ；ヒト、アカゲザル、マウス、およびラット転写物のみ；およびマウスおよびラット転写物のみを含有するバッチをはじめとするが、これに限定されるものではない、いくつかの別個のバッチでデザインされた。大部分のｓｉＲＮＡ二本鎖は、各デザインバッチ（上記）で考察された、列挙されたヒト転写物およびその他の種の転写物と１００％の同一性を共有するようにデザインされた。場合によっては（表８を参照されたい）、アンチセンス鎖：標的ｍＲＮＡ相補的塩基対がＧＣまたはＣＧ対合であれば、二本鎖とｍＲＮＡ標的間のミスマッチは、最初のアンチセンス（最後のセンス）位置で許容された。これらの場合、二本鎖は、最初のアンチセンス：最後のセンス対に、ＵＡまたはＡＵ対を使用してデザインされた。したがって二本鎖は相補性を保ったが、標的（Ｕ：Ｃ、Ｕ：Ｇ、Ａ：Ｃ、またはＡ：Ｇ）に関してミスマッチであった。これらの１８本の「ＵＡ交換」二本鎖が、ヒト／アカゲザル／マウス／ラットセットの一部としてデザインされた（表８の配置の欄で「Ｃ１９Ｕ」、「Ｇ１９Ｕ」、「Ｃ１９Ａ」、または「Ｇ１９Ａ」の標識がある二本鎖を参照されたい）。
ｓｉＲＮＡデザイン、特異性、および効能予測
全ての可能な１９量体の予測された特異性は、各配列から予測された。次に７ヌクレオチドよりも長い反復を欠いている、候補１９量体を選択した。これらの１５１０の候補ヒト／アカゲザル、１１４ヒト／アカゲザル／マウス／ラット、および７１７マウス／ラットｓｉＲＮＡは、ｐｙｔｈｏｎスクリプト「ＢｒｕｔｅＦｏｒｃｅ．ｐｙ」中で実装される網羅的な「総当たり攻撃」アルゴリズムを使用する、適切なトランスクリプトーム（ヒト、アカゲザル、イヌ、マウス、またはラットＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿およびＸＭ＿ｒｅｃｏｒｄｓセットと定義される）に対する包括的検索で、使用した。次にスクリプトは、転写物オリゴアラインメントを構文解析して、ｓｉＲＮＡとあらゆる可能な「オフターゲット」転写物とのミスマッチの配置および数に基づいて、スコアを作成した。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の５’末端から２～９位で、ｓｉＲＮＡの「シード」領域内の差を強調した。総当たり攻撃検索からの各オリゴ転写物対には、個々のミスマッチスコアを加算することで、ミスマッチスコアが与えられ；２～９位のミスマッチは２．８と見なされ、１０～１１位の切断部位のミスマッチは１．２と見なされ、領域１２～１９のミスマッチは１．０と見なされた。さらに３つの異なる、各オリゴのシード由来六量体に由来する七量体および八量体の発生頻度を比較することで、オフターゲット予測を実施した。５’開始点に対する２～７位からの六量体を使用して、２つの七量体および１つの八量体を作成した。本発明者らは、六量体に３’Ａを付加することで「七量体１」を作成し；本発明者らは、六量体に５’Ａを付加することで「七量体２」を作成し；本発明者らは、六量体の５’および３’末端の双方にＡを付加することで八量体を作成した。ヒト、アカゲザル、マウス、またはラット３’ＵＴＲｏｍｅ（ＮＣＢＩのＲｅｆｓｅｑデータベースからのトランスクリプトームの部分配列と定義され、コード領域末端「ＣＤＳ」は明確に画定されている）中の八量体および七量体の発生頻度は、事前に計算された。八量体発生頻度は、八量体頻度範囲からの中央値を使用して、七量体発生頻度について正規化した。次に（（３×正規化八量体数）＋（２×七量体２数）＋（１×七量体１数））の合計を計算することで、「ｍｉｒＳｅｅｄＳｃｏｒｅ」を計算した。
ｓｉＲＮＡ鎖の双方は、計算スコアに従って特異性カテゴリーに割り当てられた。３を超えるスコアは高度に特異的であり、３に等しいスコアは特異的であり、２．２～２．８のスコアは中程度に特異的であると認定された。本発明者らは、アンチセンス鎖の特異性によってソートした。次に本発明者らは、そのアンチセンスオリゴが、１位のＧＣを欠いており、１３および１４位の双方にＧを欠いており、シード領域に３つ以上のＵまたはＡを有する（高い予測効能がある二本鎖の特徴）二本鎖を選択した。
アンチセンス１９量体を３’方向に追加的な４ヌクレオチド延長することで、センスおよびアンチセンス鎖上でそれぞれ２１および２３ヌクレオチド長の候補ＧａｌＮａｃ共役二本鎖をデザインした（標的転写物との完全相補性は維持された）。センス鎖は、アンチセンス２３量体の最初の２１ヌクレオチドの逆相補体として規定された。全ての２３ヌクレオチドにわたって、全ての選択種転写物との完全一致を維持する二本鎖が選択された。
ｓｉＲＮＡ配列選択
合計９０のセンスおよび９０アンチセンス由来ヒト／アカゲザル、４０のセンスおよび４０のアンチセンス由来ヒト／アカゲザル／マウス／マウス／ラット、および４０のセンスおよび４０のアンチセンス由来マウス／ラットｓｉＲＮＡ １９量体オリゴが合成され、二本鎖に形成された。合計４５のセンスおよび４５アンチセンス由来ヒト／アカゲザル２１／２３量体オリゴが合成されて、４５本のＧａｌＮａｃ共役二本鎖が生成された。
変性二本鎖のセンスおよびアンチセンス鎖の配列は表２に示され、未修飾二本鎖センスおよびアンチセンス鎖の配列は表３に示される。
ＡＬＡＳ１配列の合成
ＡＬＡＳ１配列は、１または０．２ｕｍｏｌ規模のいずれかで、ＭｅｒＭａｄｅ １９２合成機上で合成した。形質移入試薬を使用して、試験管内スクリーニングのための２’－Ｏ－メチル修飾がある一本鎖を作成した。細胞中の自由取り込みのための２１～２３量体デザイン中で、センス鎖上に２’Ｆおよび２’－Ｏ－メチル修飾を含有する配列がある３’ＧａｌＮＡｃ複合体を作成した。一覧中の全ての２１量体配列について、以下に詳述されるように「エンドライト」化学反応を適用した。
・センス鎖中の全てのピリミジン（シトシンおよびウリジン）は、２’－Ｏ－メチル塩基（２’－Ｏ－メチルＣおよび２’－Ｏ－メチルＵ）を含有した。
・アンチセンス鎖中では、（５’位置に向けて）リボＡヌクレオシドに隣接するピリミジンは、それらの対応する２－Ｏ－メチルヌクレオシドで置換された。
・センスおよびアンチセンス配列の双方の３’末端に、２塩基ｄＴｓｄＴ伸長が導入された
・配列ファイルをテキストファイルに変換し、それをＭｅｒＭａｄｅ １９２合成ソフトウェアへのロードに適合させた
ＧａｌＮＡｃ共役センス鎖および相補的アンチセンス配列では、２’Ｏ－メチルヌクレオシドがあるリボ核酸と組み合わせて、２’Ｆおよびその他の修飾ヌクレオシドが導入された。合成は、センス鎖のためのＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ担体、およびアンチセンス鎖のため汎用修飾ＣＰＧ担体上で実施された。
合成、切断および脱保護：
ＡＬＡＳ１配列の合成は、ホスホラミダイト化学を使用する、固体担持オリゴヌクレオチド合成を使用した。２１量体エンドライト配列では、デオキシチミジンＣＰＧを固体担体として使用した一方で、ＧａｌＮＡｃ複合体では、センス鎖のためのＧａｌＮＡｃ固体担体およびアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｓｅｎｓｅ）鎖のための普遍的ＣＰＧを使用した。
上記配列の合成は、９６ウェルプレート上で、１または０．２ｕｍ規模のいずれかで実施された。アミダイト溶液は０．１Ｍ濃度で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性化剤として使用した。
合成配列は、最初のステップではメチルアミン、第２のステップではフッ化物試薬を使用して、９６ウェルプレート内で切断して脱保護した。ＧａｌＮＡｃおよび２’Ｆヌクレオシド含有配列では、脱保護条件が修正された。切断および脱保護後の配列は、アセトン：エタノール（８０：２０）混合物を使用して沈殿させ、ペレットを０．２Ｍナトリウム酢酸緩衝液に再懸濁した。各配列からのサンプルをＬＣ－ＭＳで分析して同一性を確認し、ＵＶで分析して定量化し、選択されたサンプルセットをＩＥＸクロマトグラフィーで分析して純度を判定した。
精製および脱塩：
ＡＬＡＳ１配列を沈殿させ、セファデックスカラムを使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム上で精製した。ＡＬＡＳ１ｅｓｓは、環境温度で稼働させた。サンプル注入および収集は、９６ウェル（１．８ｍＬ深型ウェル）プレート内で実施した。完全長配列に対応する単一ピークを、溶出剤中に収集した。脱塩したＡＬＡＳ１配列は、濃度（Ａ２６０でのＵＶ測定による）および純度（イオン交換ＨＰＬＣによる）について分析した。次に相補的一本鎖を１：１の化学量論比で合わせて、ｓｉＲＮＡ二本鎖を形成させた。
Figure 2023120219000039
Figure 2023120219000040
Figure 2023120219000041
Figure 2023120219000042
Figure 2023120219000043
Figure 2023120219000044
実施例３．ＡＬＡＳ１ノックダウン活性についてのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖の試験管内スクリーニング
試験管内でＡＬＡＳ１発現をノックダウンする能力について、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖をスクリーニングした。
試験管内スクリーニング
細胞培養および形質移入
５％ＣＯ２雰囲気中３７℃において、１０％ＦＢＳ添加ＭＥＭ（ＡＴＣＣ）中でＨｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をコンフルエンス近くまで培養した後、トリプシン処理によってプレートから遊離させた。９６ウェルプレート内で、ウェルあたり５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に、ウェルあたり１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ；カタログ番号１３７７８－１５０）を添加して室温で１５分間インキュベートし、形質移入を実施した。次に約２×１０４個のＨｅｐ３Ｂ細胞を含有する、８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。ＲＮＡ精製に先だって、細胞を２４または１２０時間のいずれかにわたり培養した。単回投与実験を１０ｎＭおよび０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で実施し、用量応答実験を１０、１．６７、０．２７、０．０４６、０．００７７、０．００１３、０．０００２１、０．００００４ｎＭの最終二本鎖濃度で実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、パーツ番号：６１０－１２）を使用した全ＲＮＡ単離：
細胞を収集して１５０μｌの溶解／結合緩衝液溶解し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、処理全体にわたり同一であった）。１０マイクロリットルの磁性ビーズと８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに入れて、１分間混合した。磁性スタンドを使用して磁性ビーズを捕捉し、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解細胞を残留ビーズに入れて、５分間混合した。上清を除去した後、磁性ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄して、１分間混合した。ビーズを再度捕捉して、上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉して上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加して、５℃で７０分間混合した。ビーズを磁石上に５分間捕捉した。４０μｌの上清を除去して、別の９６ウェルプレートに入れた。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成
反応あたり、１０μｌの全ＲＮＡ中に、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰｓ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μｌのＨ２Ｏのマスター混合物を添加した。ｃＤＮＡは、以下のステップを通じて、Ｂｉｏ－ＲａｄＣ－１０００またはＳ－１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して作成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）中のウェルあたり、０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのＡＬＡＳ１ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｈｓ００１６７４４１＿ｍ１）、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを使用して、ＲｏｃｈｅＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内で、リアルタイムＰＣＲを実施した。各二本鎖は、それぞれ２つの生物学的複製で、２つの独立した形質移入中で試験し、要約表で特に断りのない限り、各形質移入は複製でアッセイした。
相対的倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５で形質移入された細胞または模擬形質移入細胞で実施したアッセイに、正規化した。ＸＬＦｉｔを使用した４パラメータ適合モデルを使用して、ＩＣ５０を計算し、同一投与範囲にわたって、ＡＤ－１９５５または未感作細胞で形質移入された細胞に、またはそれ自身の最低用量に正規化した。
ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖による内因性ＡＬＡＳ１発現の試験管内ノックダウン
表４は、ＡＬＡＳ１修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖による、Ｈｅｐ３Ｂ細胞中におけるＡＬＡＳ１のノックダウンを図示する（表２を参照されたい）。サイレンシングは、陰性（ルシフェラーゼ）対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ－１９５５と比較して、残存する分割ＲＮＡメッセージとして発現される。データは、１０ｎＭまたは０．１ｎＭの各ｓｉＲＮＡの形質移入に続いて、上述したように作成された。ＡＬＡＳ１ＴａｑＭａｎプローブＨｓ００１６７４４１＿ｍ１を使用して、ｑＰＣＲを実施した。
Figure 2023120219000045
Figure 2023120219000046
Figure 2023120219000047
試験管内スクリーニングにおける選択ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖のＩＣ５０
表５は、ＡＬＡＳ１修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖による、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系中で内因的に発現されるＡＬＡＳ１のノックダウンから判定された、選択ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖のＩＣ５０を図示する（表２を参照されたい）。データは、上述したように、各ｓｉＲＮＡ二本鎖の形質移入に続いて、２４または１２０時間後に作成された。この実施例において、ＡＬＡＳ１サイレンシングは、陰性対照として使用された非標的化ｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ ＡＤ－１９５５と比較して、残存する分割ｍＲＮＡメッセージとして発現される。複製形質移入実験からのデータを使用して、単一ラインを適合させて、ＩＣ５０を判定した。二本鎖（例えばＡＤ－５３５４１．１、ＡＤ－５３５４２．１、およびＡＤ－５３５４７．１）のいくつかは、２４時間後に約０．０３ｎＭ程度に低いＩＣ５０を有した。多数の二本鎖は、２４時間後に０．１ｎＭ未満のＩＣ５０を有し（例えばＡＤ－５３５３４．１、ＡＤ－５３５３６．１、ＡＤ－５３５４０．１、ＡＤ－５３５４１．１、ＡＤ－５３５４２．１、ＡＤ－５３５４７．１、ＡＤ－５３５４８．１、ＡＤ－５３５５０．１、ＡＤ－５３５５２．１）、これらの一部はまた、１２０時間後に０．１ｎＭ未満のＩＣ５０を有した（例えばＡＤ－５３５３４．１、ＡＤ－５３５４０．１、ＡＤ－５３５４１．１、ＡＤ－５３５４２．１、ＡＤ－５３５４７．１、ＡＤ－５３５５２．１）。
Figure 2023120219000048
実施例４．ＬＮＰとして調合されたマウス／ラットＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを使用した生体内サイレンシング
修飾二本鎖ＡＤ－５３５５８の配列は、下の表６で示される。
Figure 2023120219000049
この二本鎖は、ＬＮＰ１１製剤として調合された（上の表１０を参照されたい）。ＬＮＰ配合ＡＤ－５３５５８ ｓｉＲＮＡは、マウス（Ｎ＝２５匹；群あたり５匹）と、ラット（Ｎ＝２０匹；群あたり４匹）の生体内で試験し、生体内でＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを発現停止することが確認された。結果は、図５および図６で示される。
図５は、ｓｉＲＮＡが、マウス中で用量応答効果を実証したことを示す。ｓｉＲＮＡを１ｍｇ／ｋｇで投与すると、マウスＡＬＡＳ１（ｍＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡの発現は約７８％低下し；ｓｉＲＮＡを０．３ｍｇ／ｋｇで投与すると、マウスＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡは約６０％低下し；ｓｉＲＮＡを０．１ｍｇ／ｋｇで投与すると、マウスＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡは約４９％低下した。これらの低下は、ＰＢＳ対照と比較して表された。ＡＤ－１９５５ＬＵＣ対照もまた、図５に示される通りに用いられた。
同様に、図６は、ｓｉＲＮＡが、ラット中で用量応答効果を実証したことを示す。ｓｉＲＮＡを１ｍｇ／ｋｇで投与すると、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡの発現は約７０％低下し；ｓｉＲＮＡを０．３ｍｇ／ｋｇで投与すると、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡは約６２％低下し；ｓｉＲＮＡを０．１ｍｇ／ｋｇで投与すると、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡは約３４％低下した。
サイレンシングの永続性はまた、マウスでも試験した（Ｎ＝１５；１時点あたり３匹。結果は、図７で示され、ＡＤ－５３５５８が少なくとも９日間にわたり、ｍＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを約８０％抑制したことを示す。少なくとも約５０％の抑制が、少なくとも１４日間持続した。
実施例５．ＡＩＰの動物モデルにおけるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの効能
ＡＤ－５３５５８ ＬＮＰ１１製剤（先の実施例に記載されるマウス／ラットＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ）の効果をＡＩＰのマウスモデルで調べた。ＰＢＧＤノックアウトは、生存不能である（－／－、０％活性）。ヘテロ接合ＰＢＧＤノックアウトマウス（＋／－、約５０％活性）は入手できるが、完全な生化学的表現型を有さず、したがってヒト疾患表現型を再現しない。したがって、Ｔ１（＋／－）プロモータ中断およびＴ２（－／－）スプライス部位改変を含む、Ｔ１／Ｔ２アレルがある複合ヘテロ接合体であるＡＩＰのマウスモデルが開発された。これらのマウスは、野生型レベルの約３０％である肝臓の残留ＰＢＧＤ活性と、正常なまたはわずかに上昇したベースライン血漿ＡＬＡおよびＰＢＧレベルとを有することが示されている。マウスは、若年期には正常に見え、加齢に伴ってわずかにより緩慢で失調性になることが分かった。６ヶ月齢までに、マウスは、病理学的検査で、運動協調性と筋力の障害、および軸索変性を発症することが実証された。マウスモデルの病理学調査は、高齢マウスにおける、軸索変性、および運動協調性と筋力の障害を示した。尿および血漿ＡＬＡおよびＰＢＧは、フェノバルビタールの連続腹腔内投与によって、顕著に増大することが分かった（リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）ら著，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：１９５－２１９およびリンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）ら著，（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０３：１１２７－３４を参照されたい）。マウスは、肝臓におけるＡＡＶ媒介性ＰＢＧＤ発現によってレスキューされた（Ｙａｓｕｄａら著（２０１０），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１：１７－２２およびＵｎｚｕら著（２０１１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２：２４３－５０）。
１日目に、マウスに、１ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝５）またはＬＵＣ ＡＤ－１９５５対照（Ｎ＝３）を静脈内注射によって投与した。３回のフェノバルビタール注射を投与して（２、３、および４日目に毎日１回の注射）、肝臓のＡＬＡＳ１と、ポルフィリン前駆体であるＡＬＡおよびＰＢＧとを誘導した。５日目に血漿および一晩尿標本を採取して、代謝産物レベルをＬＣ－ＭＳによって測定した。代謝産物レベルをＬＣ－ＭＳによって血漿中で評価し、尿中でもまた評価した。１日目の最初の処置前に、代謝産物のベースラインレベルを評価した。結果は、図８～１２および表１２および１３で示される。
図８および図９は、血漿ＡＬＡレベルをμＭ単位で示す。ベースラインＡＬＡレベルは低く（Ｎ＝４）、フェノバルビタール処置は、対照ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ処置動物（Ｎ＝３）において、血漿ＡＬＡレベルに顕著な増大を誘発した。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡによる処置は、図８に示される通りに血漿ＡＬＡ（Ｎ＝５）誘導を阻害した。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡｈは、試験された個々の動物のそれぞれで、血漿ＡＬＡの誘導をブロックするのに一貫して効果的であった（図９を参照されたい）。これらの結果は、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ処置が、このＡＩＰ動物モデルにおけるフェノバルビタール誘発性急性発作に伴う、血漿ＡＬＡの増大を予防するのに効果的であったことを示す。
図１０および図１１は、血漿ＰＢＧレベルをμＭ単位で示す。ベースラインＰＢＧレベルは低く（Ｎ＝４）、フェノバルビタール処置は、対照ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ処置動物（Ｎ＝３）において、血漿ＰＢＧレベルに顕著な増大を誘発した。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡによる処置は、図１０に示される通りに血漿ＰＢＧ（Ｎ＝５）誘導を阻害した。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡｈは、試験された個々の動物のそれぞれで、血漿ＰＢＧの誘導をブロックするのに一貫して効果的であった（図１１を参照されたい）。これらの結果は、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ処置が、このＡＩＰ動物モデルにおけるフェノバルビタール誘発性急性発作に伴う、血漿ＰＢＧの増大を予防するのに効果的であったことを示す。
表１２および１３は、ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝２）対照（ＣＴＲはＰＢＳ緩衝液処置動物を指す、Ｎ＝１）およびＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ（Ｎ＝５）処置動物における、ベースラインおよびフェノバルビタール処置後の尿ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを示す。
Figure 2023120219000050
Figure 2023120219000051
フェノバルビタール処置は、ＬＵＣ ｓｉＲＮＡ処置マウス対照において、尿ＡＬＡ（ベースラインレベルの約９倍）およびＰＢＧ（ベースラインレベルの約１９倍）に、強力な増大（約２５～３０倍の増大）を誘発したのに対し、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ処置動物ではこのような増大は観察されなかった。したがって、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、尿ＡＬＡおよびＰＢＧのフェノバルビタール誘発性増大をブロックした。これらの結果は血漿測定値と一致し、このＡＩＰ動物モデルにおける、フェノバルビタール誘発性急性発作に伴う尿代謝産物（ＡＬＡおよびＰＢＧ）の増大を予防するのに、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ処置が効果的であることを示す。
さらなる実験（図１２）では、フェノバルビタール処置が、マウスモデルの肝臓中におけるＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現に、大きな増大（約２５倍）を誘発することが分かった。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ投与は、このＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ誘導を完全にブロックした。これらの結果は、ＡＩＰの動物モデルにおいて、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡが効果的であることのさらなる証拠を提供する。
まとめると、本実施例で提供される結果は、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡが、急性肝性ポルフィリン症ＡＩＰの動物モデルにおける急性発作の治療に、効果的であることを示す。血漿ＡＬＡレベル、血漿ＰＢＧレベル、尿ＡＬＡレベル、尿ＰＢＧレベル、および肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現レベルをはじめとする複数の成果の測定が、この結論を支持する。
実施例６．ＧａｌＮＡｃ共役マウスＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを使用した生体内サイレンシング
本実施例に記載される実験では、３種のＧａｌＮＡｃ共役ｓｉＲＮＡの生体内効能を調べた（表７を参照されたい）。これらのｓｉＲＮＡは、実施例２に記載されるものなどの方法によって、デザインされ生成された。
Figure 2023120219000052
マウス（Ｎ＝４０；実験条件あたりＮ＝４）は、ＰＢＳ投与群、または３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ皮下投与群に分割した。ＰＢＳ対照と比較した、ｍＡＬＡＳ１／ｍＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルは、投与の７２時間後に肝細胞中で判定した。結果は、図１３に示される。ｓｉＲＮＡ ＡＤ－５６２１１およびＡＤ－５６１７３について、明瞭な用量応答効果はなかった。対照的に、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－５７９２９は、ｍＡＬＡＳ１発現の阻害において用量応答効果を示した。これらの結果は、ＡＬＡＳ１ＧａｌＮＡｃ複合体が、生体内でＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの発現を阻害するのに効果的であり、用量応答効果を示したことを実証する。
実施例７．ヒトｓｉＲＮＡ
実施例２に記載されるようにして、追加的なヒトｓｉＲＮＡがデザインされ生成された。それらの予測効能に基づいて、上位４５位のｓｉＲＮＡが選択された。これらの４５個のｓｉＲＮＡの配列は、表８および添付の配列表に提供される（例えば、それぞれ、奇数配列の１つに対応するセンス配列は配列番号３９１～５５１として同定され、偶数配列の１つに対応するアンチセンス配列は配列番号３９２～５５２として同定される）。表８は、国際公開第号２０１３／１５５２０４Ａ２パンフレットで開示される。国際公開第２０１３／１５５２０４号パンフレットの内容および表８をはじめとする配列表は、参照により明示的に援用される。
実施例８．ヒトｓｉＲＮＡ
追加的な１９量体ヒトｓｉＲＮＡが作成された。これらのｓｉＲＮＡの配列は、表９および添付の配列表に提供される（例えば、それぞれ、奇数配列の１つに対応するセンス配列は配列番号５５３～３３６５として同定され、偶数配列の１つに対応するアンチセンス配列は配列番号５５４～３３６６として同定される）。表９は、国際公開第号２０１３／１５５２０４Ａ２パンフレットで開示される。国際公開第２０１３／１５５２０４号パンフレットの内容および表９をはじめとする配列表は、参照により明示的に援用される。これらのｓｉＲＮＡは、本明細書に記載される方法および／または当該技術分野で公知の方法を使用して、効能について試験し得る。
実施例９．急性期治療パラダイムにおけるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを使用したポルフィリン前駆体抑制
ＡＩＰマウスモデル（実施例５を参照されたい）を使用して、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡが、例えばヒトポルフィリン症患者が急性発作を起こした場合に存在するような、既に上昇したＡＬＡおよびＰＢＧレベルを低下させる、急性期治療パラダイムとして（ａｎ ａｎ）機能するかどうかを調べた。最後のフェノバルビタール投与の１２時間後の１ｍｇ／ｋｇ用量でのＡＤ－５３５５８ ＬＮＰ１１製剤 ｓｉＲＮＡの投与が、マウス血漿中でＡＬＡおよびＰＢＧの双方のレベルを迅速に低下させたのに対し、ＬＵＣ対照処置動物では、レベルは上昇し続けた（図１４）。これらの結果は、ＡＬＡＳ ｓｉＲＮＡが、急性発作の治療に効果的であることを示す。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを低下させ、さらなる増大を予防するのに効果的である。
図１４で観察され得るように、ＡＬＡＳ ｓｉＲＮＡは、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルの低下において、迅速な開始効果を有する。効果の開始は、ｓｉＲＮＡ投与後の数時間以内に起こった。血漿ＡＬＡに対する効果は、ｓｉＲＮＡ投与の４時間以内に観察され得た（図１４を参照されたい；ｓｉＲＮＡは、フェノバルビタールの最終投与の１２時間後に投与され、対照と比較した血漿ＡＬＡの低下は、フェノバルビタールの最終投与の１６時間後に観察され得る）。血漿ＰＢＧに対する効果は、ｓｉＲＮＡ投与の８時間以内に観察され得た（図１４を参照されたい；ｓｉＲＮＡは、フェノバルビタールの最終投与の１２時間後に投与され、対照と比較した血漿ＡＬＡの低下は、フェノバルビタールの最終投与の２０時間後に観察され得る）。
実施例１０．ＡＬＡＳ１を標的とするｓｉＲＮＡ
実施例２に記載されるようにして、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを標的とするさらなる未修飾および修飾ｓｉＲＮＡ配列をデザインし生成した。修飾二本鎖の試験管内活性は、下述するように試験した。
方法
脂質媒介形質移入
９６ウェルプレートの個々のウェル内で、５μｌの各ｓｉＲＮＡ二本鎖に、ウェルあたり１４．８μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、カタログ番号１３７７８－１５０）を添加することで、Ｈｅｐ３Ｂ、ＰＭＨ、および初代培養カニクイザル肝実質細胞の形質移入を実施した。次に混合物を室温で２０分間インキュベートした。次に適切な細胞数を含有する、抗生物質なしの８０μｌの完全成長培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞をＲＮＡ精製に先だって、２４時間培養した。
修飾ＧａｌＮＡｃについて、１ｕＭ、５００ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、および０．２ｎＭの最終二本鎖濃度で、単回投与実験を実施した。
自由取り込み形質移入
冷凍保存初代培養カニクイザル肝実質細胞（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍ００３０５５－Ｐ）を使用直前に３７℃の水浴内で解凍し、ＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ（播種）培地（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｚ９９０２９）中に０．２６ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。形質移入中に、ウェルあたり２５，０００個の細胞で、ＢＤ ＢｉｏＣｏａｔ ９６ウェルコラーゲンプレート（ＢＤ、３５６４０７）上に細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気内で３７℃で培養した。自由取り込み実験は、９６ウェル（９６ｗ）プレートに、ウェルあたり１０μｌのＰＢＳ中のｓｉＲＮＡ二本鎖を添加することで実施した。次に細胞型について適切な細胞数を含有する９０μｌの完全成長培地を、ｓｉＲＮＡに添加した。細胞をＲＮＡ精製に先だって、２４時間培養した。１μＭ、５００ｎＭ、２０ｎＭ、および１０ｎＭの最終二本鎖で、単回投与実験を実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、パーツ番号：６１０－１２）を使用した全ＲＮＡ単離
細胞を収集して１５０μｌの溶解／結合緩衝液溶解し、次にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、処理全体にわたり同一であった）。１０マイクロリットルの磁性ビーズと８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに入れて、１分間混合した。磁性スタンドを使用して磁性ビーズを捕捉し、ビーズをかき乱すことなく上清を除去した。上清を除去した後、溶解細胞を残留ビーズに入れて、５分間混合した。上清を除去した後、磁性ビーズを１５０μｌの洗浄液緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉して、上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉して上清を除去した。次にビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉して上清を除去した。最後に、ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加して、５℃で７０分間混合した。ビーズを磁石上に５分間捕捉した。４５μｌの上清を除去して、別の９６ウェルプレートに入れた。
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キットを使用したｃＤＮＡ合成（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号４３６８８１３）
反応あたり２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰｓ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、および３．２μｌのＨ２Ｏのマスター混合物を作成した。等容積マスター混合物およびＲＮＡは、試験管内スクリーニングのために、１２μｌの最終容積に、生体内スクリーニングサンプルのために、２０μｌの最終容積に混合した。ｃＤＮＡは、以下のステップを通じて、Ｂｉｏ－ＲａｄＣ－１０００またはＳ－１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して作成した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、および４℃での保持。
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェル（３８４ｗ）プレート（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号０４８８７３０１００１）のウェルあたり、２μｌのＨ２Ｏ、０．５μｌのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｈｅｐ３Ｂ細胞用カタログ番号４３２６３１７Ｅ、マウス初代培養肝細胞用カタログ番号３５２３３９Ｅ、またはカニクイザル初代培養肝細胞用特注プローブ）、０．５μｌのＣ５ ＴａｑＭａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｈｅｐ３Ｂ細胞用カタログ番号Ｈｓ００１６７４４１＿ｍ１、または初代マウス肝実質細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｔｙｅｓ）用Ｍｍ００４５７８７９＿ｍ１、またはカニクイザル初代培養肝細胞用特注プローブ）、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスター混合物（Ｒｏｃｈｅ；カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスター混合物に、２μｌのｃＤＮＡを添加した。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを使用して、ＲｏｃｈｅＬＣ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）内でリアルタイムＰＣＲを実施した。試験管内スクリーニングでは、特に断りのない限り、各二本鎖を２つの生物学的複製で試験して、各リアルタイムＰＣＲは二重技術的複製で実施した。生体内スクリーニングでは、各二本鎖を１つまたは複数の実験で（群あたり３匹のマウス）試験し、および各リアルタイムＰＣＲを二重技術的複製で試験した。
ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの相対的倍数変化を計算するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ－１９５５で形質移入された細胞または模擬形質移入細胞で実施したアッセイに、正規化した。ＸＬＦｉｔを使用した４パラメータ適合モデルを使用して、ＩＣ５０を計算し、同一投与範囲にわたって、ＡＤ－１９５５で形質移入された細胞に、またはそれ自身の最低用量に正規化した。
ＡＤ－１９５５のセンスおよびアンチセンス配列は、次の通り：
センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号３６８２）
アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号３６８３）。
修飾および未修飾ｓｉＲＮＡ一本鎖および二本鎖配列は、それぞれ表１４および表１５に提供される。
Figure 2023120219000053
Figure 2023120219000054
Figure 2023120219000055
Figure 2023120219000056
Figure 2023120219000057
Figure 2023120219000058
Figure 2023120219000059
試験管内アッセイの結果は、表１６に提供される。表１６はまた、各ｓｉＲＮＡの標的化学種を記述する。
Figure 2023120219000060
Figure 2023120219000061
表１７は、選択ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖のＩＣ５０を図示する。ＩＣ５０は、各ＡＬＡＳ１変性ｓｉＲＮＡ二本鎖の形質移入に続いて２４時間後に、Ｈｅｐ３Ｂ細胞系中において、内因性発現したＡＬＡＳ１のノックダウンから判定した（表１４を参照されたい）。ＡＤ－５８８８２、ＡＤ－５８８７８、ＡＤ－５８８８６、ＡＤ－５８８７７、ＡＤ－５９１１５、ＡＤ－５８８５６、およびＡＤ－５９１２９をはじめとする少なくとも７本の二本鎖が、０．１ｎｍ未満のＩＣ５０を一貫して実証し、これらの二本鎖が、ＡＬＡＳ１発現の抑制に、特に効果的であったことが示唆された。
Figure 2023120219000062
実施例１１．ＡＩＰフェノバルビタール誘導マウスモデル中のＡＬＡＳ１－ＧａｌＮＡｃ活性
ＡＩＰマウスモデルを使用して、ＡＬＡＳ１－ＧａｌＮＡｃ複合体であるｓｉＲＮＡの効果を調べた。ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＡＤ－５８６３２の配列を有した（表２０を参照されたい）。
Figure 2023120219000063
ＡＩＰマウスは、処置されず（ベースライン）、または１日目に、生理食塩水、または２０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＡＳ１－ＧａｌＮＡｃ複合体を皮下注射された。２、３、および４日目に、マウスは、処置されないままであり（ベースライン）、またはフェノバルビタールのＩＰ注射で処置された。５日目に血漿を採取し、ＬＣ－ＭＳアッセイを使用して、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを評価した。図１５に示される通りに、ＡＬＡＳ１－ＧａｌＮＡｃ複合体は、血漿ＡＬＡおよびＰＢＧの生産をそれぞれ約８４および８０％鈍らせた。これらの結果は、このＡＩＰ動物モデルにおけるフェノバルビタール誘発性急性発作に伴う血漿ＡＬＡおよびＰＢＧ双方の増大を予防するのに、ＡＬＡＳ１－ＧａｌＮＡｃ複合体での治療が効果的であったことを示す。
実施例１２．ＡＬＡＳ１を標的としてＡＬＡＳ１発現を阻害するさらなるｓｉＲＮＡ
実施例２に記載されるようにして、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを標的とするさらなる修飾ｓｉＲＮＡ配列をデザインし生成した。配列は、表１８に提供される。修飾二本鎖の試験管内活性は、下述するように試験した。
Figure 2023120219000064
Figure 2023120219000065
Figure 2023120219000066
Figure 2023120219000067
Figure 2023120219000068
ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制におけるｓｉＲＮＡの試験管内活性は、形質移入試薬としてリポフェクタミン２０００を使用して形質移入されたＨｅｐ３Ｂ細胞中で、単回投与スクリーニングにおいて試験した。単回投与実験を１０ｎＭの二本鎖濃度で実施して、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイによって分析した。結果は表１９で示され、残留ｍＲＮＡ％として表される。
Figure 2023120219000069
Figure 2023120219000070
Figure 2023120219000071
Figure 2023120219000072
Figure 2023120219000073
Figure 2023120219000074
Figure 2023120219000075
試験された２３２本の二本鎖が、この単回投与アッセイにおいて、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを様々な程度に抑制した。このアッセイによると、少なくとも４本の二本鎖（ＡＤ－５９４５３、ＡＤ－５９３９５、ＡＤ－５９４７７、およびＡＤ－５９４９２）はＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを８５％以上抑制し、３９本の二本鎖はＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを８０％以上抑制し、１０１本の二本鎖はＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを７０％以上抑制し、１５２本の二本鎖はＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを５０％以上抑制した。対照的に、いくつかの二本鎖は、このアッセイにおいて顕著な抑制を示さなかった。
実施例１３．ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを使用したポルフィリン前駆物質ＡＬＡおよびＰＢＧの用量反応性阻害
ＡＩＰのマウスモデルにおいて、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの用量応答効果が調べられた（実施例５を参照されたい）。このモデルは、３～４日間にわたる１日１回のフェノバルビタール注射による誘導に続いて、約３０％の残留ＰＢＧＤ活性、基底ＡＬＡおよびＰＢＧレベルの約２倍の増大、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルの約３０～１００倍の増大を示す。高齢動物は、軸索変性および運動機能障害を有する。
本実施例で使用されるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、ＡＦ１１製剤中のＡＤ－５３５５８二本鎖であった。１日目に、マウスには、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．０５ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡまたはＬｕｃＡＤ－１９５５対照が、静脈注射によって投与された。３回のフェノバルビタール注射が投与されて（２、３、および４日目に毎日１回の注射）、肝臓ＡＬＡＳ１と、ポルフィリン前駆体であるＡＬＡおよびＰＢＧとが誘導された。５日目に血漿および一晩尿標本が採取され、代謝産物レベルがＬＣ－ＭＳによって測定された。ＡＬＡおよびＰＢＧの基線レベルは、１日目の最初の処置に先だって測定された。結果は、図１６に示される。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを用量依存様式で阻害した。血漿ＡＬＡレベルに対する抑制効果は、０．０５ｍｇ／ｋｇ程度に低いＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ用量で観察され、血漿ＰＢＧレベルに対する抑制効果は、０．１ｍｇ／ｋｇ程度に低いｓｉＲＮＡ用量で見られた。
実施例１４．ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを使用したポルフィリン前駆物質ＡＬＡおよびＰＢＧの持続性阻害
ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの効果の持続性が、ＡＩＰマウスモデルにおいて調べられた（実施例５を参照されたい）。本実施例で使用されるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、ＡＦ１１製剤中のＡＤ－５３５５８二本鎖であった。この実験の実験デザインおよび結果は、図１７に示される。１日目に、マウスには、１ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡまたはＬｕｃＡＤ－１９５５対照が静脈注射によって投与された。３回のフェノバルビタール注射が、０週目（２、３、および４日目に１日１回の注射）、２週目（１５、１６、および１７日目に１日１回の注射）、４週目（２９、３０、および３１日目に１日１回の注射）に投与されて、肝臓ＡＬＡＳ１およびポルフィリン前駆体ＡＬＡおよびＰＢＧが誘導された。血漿および一晩尿標本が、５、１８、および３２日目に採取され、代謝産物レベルがＬＣ－ＭＳによって測定された。ＡＬＡおよびＰＢＧの基線レベルは、１日目の最初の処置に先だって測定された。
図１７に示されるように、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、血漿ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを低下させる持続的効果を有した。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ投与は、血漿ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを少なくとも２週間抑制した。これらの結果は、高いＡＬＡおよびＰＢＧレベルを低下させるための治療において、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡが効果的であり、したがって例えば、予防法で使用されて、慢性的に上昇したＡＬＡおよびＰＢＧレベルを低下させて、再発性ポルフィリン症性の発作を予防し得ることを示唆する。
実施例１５．ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡはヘミン処置と比較してより迅速な作用開始を提供する
ＡＩＰのマウスモデルにおいて、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡによる処置の効果が、ヘミン処置の効果と比較された（実施例５を参照されたい）。本実施例で使用されるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、ＡＦ１１製剤中のＡＤ－５３５５８二本鎖であった。この実験の実験デザインおよび結果は、図１８に示される。フェノバルビタール（ＰＢ）およびジエチルジチオカルバメート（ＤＤＣ）は、１、２、および３日目に投与された。ＤＤＣは、フェノバルビタールのように、ヘム要求量を増大させてＡＬＡ／ＰＢＧ代謝産物誘導の延長を助ける、別のｐ４５０誘導物質である。
４ｍｇ／ｋｇの用量のヘミン、２ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ、または対照処置が、ＰＢおよびＤＤＣの最終投与の８時間後に静脈内に投与された。
図１８に示されるように、治療効果の開始は、ヘミン処置と比較してＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ処置でより迅速であった。ＡＬＡおよびＰＢＧレベルの低下には、臨床症状の迅速な改善が伴うと予測されることから、ｓｉＲＮＡ処置によるＡＬＡおよびＰＢＧの迅速な低下は、ｓｉＲＮＡが急性発作の効果的処置であることを示唆する。
実施例１６．ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＤ－５８６３２の効果
ＡＤ－５８６３２は、実施例１１で開示される２１／２３量体である。ＡＤ－５８６３２は、ヒト転写物ＮＭ＿０００６８８．４を標的とし、マウス、ラット、およびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）ｍＲＮＡ転写物と交差反応性である。ＡＤ－５８６３２は、約４５個の化合物のスクリーニングから同定された、唯一の交差反応性２１／２３量体であった。この二本鎖に関するさらなる実験が、本実施例に記載される。
ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制におけるＡＤ－５８６３２の用量依存効果
ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡと比較したＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制におけるＡＤ－５８６３２の用量応答効果が、ラットで調べられた。３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇの用量が試験された。ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡのレベルは、最終投与の７２時間後に肝臓内で測定された。ＡＤ－５８６３２は、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを用量依存様式で抑制した（図１９を参照されたい）。ＡＤ－５８６３２は、約１０ｍｇ／ｋｇの単回用量ＥＤ５０を有した。
ラットＡＩＰモデルにおけるＡＤ－５８６３２の効果
ＡＤ－５８６３２ ＡＬＡＳ１ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートｓｉＲＮＡの用量応答効果が、ラットでさらに調べられた。このモデルでは、ＬＮＰ中のｓｉＲＮＡが使用されて、フェノバルビタール（ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔｏｌ）でヘム要求（ｄｅｍａｉｎｄ）が誘導されるのに先立って、特に肝臓内でＰＢＧＤレベルがノックダウンされた。ラットＡＩＰモデルは、３日間にわたる毎日のフェノバルビタール注射による誘導に際して、肝臓内の一過性ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡノックダウンを示し、約１５％の残留ＰＢＧＤ ｍＲＮＡを有して、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルは約１０～５０倍の増大を示す。
実験デザインは、図２０に示される。４つのラット群が、試験された。１つの群は、示される時点においてフェノバルビタール（ＰＢ）のみで処置された。第２の群は、フェノバルビタールおよびポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）ｓｉＲＮＡで処置された。第３の群は、フェノバルビタール、ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、および３０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを投与された。第４の群は、フェノバルビタール、ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡ、および１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを投与された。図２０に示されるように、ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡは、１日目に静脈内に投与された。ＡＬＡＳ１ ＧａｌＮＡｃ ｓｉＲＮＡは、４日目に投与された。フェノバルビタール注射は、４、５、６、および７日目に投与された。尿は、７日目に開始して８日目に終了する２４時間にわたり採取された。肝臓ＰＢＧＤ ｍＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ、およびＡＬＡＳ－１ ｍＲＮＡレベルは、ＤＮＡアッセイを使用して８日目に評価された。尿中のＰＢＧおよびＡＬＡレベルは、ＬＣ－ＭＳを使用して判定された。
ｍＲＮＡ結果は、図２１に示される。ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡは、ＰＢＧＤ ｍＲＮＡレベルを低下させたが、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは低下させなかった。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを用量依存様式で低下させた（図２１を参照されたい）。ＡＬＡおよびＰＢＧ結果は、図２２に示される。ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡは、ＡＬＡおよびＰＢＧレベルを用量依存様式で低下させた（図２２を参照されたい）。
実施例１７．ＡＤ－５８６３２の分割投与
ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＤ－５８６３２の有効性が、２つの別々の分割投与パラダイムで調べられた。これらの各試験では、メスＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットが使用された。ラットはＳＣＬＲ（１２時間点灯および１２時間消灯の光サイクル部屋）内に収容されて、最終注射の７２時間後に殺処分された。分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイを使用して、肝臓内のＡＬＡＳ１およびＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルが測定された。
１日用量５回対ボーラス投与１回のパラダイム
第１のパラダイムでは、ラット群には、５回のｓｉＲＮＡ投与（毎日１回）、または５回の個々の投与の合計と同じ総濃度を有する単回ボーラス投与のどちらかが与えられた。具体的には、ラットは、以下の処置条件の１つに割り当てられた：（１）１日１回６ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの５日間にわたる皮下注射、（２）１日１回２ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの５日間にわたる皮下注射、（３）１日１回１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの５日間にわたる皮下注射、（４）３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回ボーラス投与の皮下注射、（５）１０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回ボーラス投与の皮下注射、（６）５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回ボーラス投与の皮下注射、または（７）ＰＢＳ対照処置。
結果は、図２３に示される。このパラダイムでは、ｓｉＲＮＡの単回ボーラス投与が、５日間にわたる同一濃度のｓｉＲＮＡの反復投与よりも大きなＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を提供した。これは、試験された全ての用量にあてはまった。
４週間にわたる週１回投与
第２のパラダイムでは、ラットは、４週間にわたり週１回、３つの用量（１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇ）の１つで、ｓｉＲＮＡを皮下注射された。対照群は、ＰＢＳを注射された。
結果は、図２４に示される。単回投与と比較して、４回の１０ｍｇ／ｋｇの週間用量を提供することは、達成された最大のノックダウンを改善した（ＥＤ５０は単回投与で１０ｍｇ／ｋｇである）。対照的に、１週間に５および２．５ｍｇ／ｋｇの多回投与は、このパラダイムでサイレンシングを改善しなかった。
実施例１８．より短いセンスおよびアンチセンス鎖があるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの同定および試験
さらなる実験が実施されて、ｓｉＲＮＡ二本鎖を１９－１９量体に短縮させることの効果が探索された。ヒト（ｈ）（ＮＭ＿０００６８８．４）、アカゲザル（ｒｈ）（ＸＭ＿００１０９０４４０．２）、マウス（ｍ）（ＮＭ＿０２０５５９．２）、およびラット（ｒ）（ＮＭ＿０２４４８４．２）ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ転写物と結合する、５本の新しい交差反応性１９－１９量体二本鎖がさらに同定された。これらの二本鎖のいずれも、２１／２３量体ＡＤ－５８６３２程には優れた結果を示さなかった（図２５を参照されたい）。
最良の２つの１９－１９量体（ＡＤ－５９１１５およびＡＤ－５９１２５）に対する、長さおよびオーバーハング変更の効果が調べられた（図２６および２７）。修飾配列は、表２１に示される。
Figure 2023120219000076
オーバーハングは、効力を改善した。それらはまた、さらなる構造活性相関（ＳＡＲ）試験（ａｔｔｏ齧歯類のｐｏｓ２３における１つの不一致）のために、さらなる誘導体配列（ＡＤ－６００９５をベースとするＡＤ－６０４８９）も提供した。
実施例１９．ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体ＡＤ－６０４８９およびＡＤ－５８６３２の効果
さらなるＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ二本鎖ＡＤ－６０４８９の効果が調べられ、ＡＤ－５８６３２の効果と比較された。これらの二本鎖の配列は、表２２Ａに示される。ＡＤ－６０４８９は、アンチセンス配列の３’末端に齧歯類ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡとの単一不一致を有する。したがって、ＡＤ－５８６３２は、ヒト、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）、マウス、およびラット配列と完全に相補的であるのに対し、ＡＤ－６０４８９は、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）配列のみと完全に相補的である。
Figure 2023120219000077
ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制は、図２８に示される。ＡＤ－５８６３２と比較して、ＡＤ－６０４８９は、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでより効果的な抑制を提供し、ＥＤ５０に約２倍の改善を示した。ＡＤ－６０４８９の単回用量ＥＤ５０は、約５ｍｇ／ｋｇであった。
実施例２０．非ヒト霊長類試験におけるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体ＡＤ－６０４８９およびＡＤ－５８６３２の効果
肝臓ｍＲＮＡの抑制におけるＡＤ－５８６３２およびＡＤ－６０４８９の有効性が、非ヒト霊長類で調べられた。実験デザインは、図２９に示される。２ｍＬ／ｋｇの容量中のｓｉＲＮＡの用量（５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または１．２５ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ対照は、５日間にわたり毎日、次に３週間にわたり隔日、皮下投与された。ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡサイレンシングは、１５日目に採取された肝生検から得られた肝臓組織内で評価された。生検は、血清採取後、１０回目の投与に先だって採取された（図２９を参照されたい）。
循環細胞外ＲＮＡ検出（ｃＥＲＤ）法（実施例２１を参照されたい）のための血清サンプルは、－１０、－３、７、１５、２３、３１、および４３日目に採取された。血清は、臨床化学パネルのために－３、６、３０、および４３日目に採取された。臨床化学パネルは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルのアセスメントを含んだ。
ＡＤ－５８６３２およびＡＤ－６０４８９は、肝臓内のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを用量依存様式で抑制した（図３０を参照されたい）。ＡＤ－６０４８９は、ＡＤ－５８６３２よりも高い有効性を示した。例えば、試験された最低用量（１．２５ｍｇ／ｋｇ）では、ＡＤ－６０４８９が、相対的ＡＬＡＳ１メッセージを対照レベルの約４２％に抑制したのに対し、ＡＤ－５８６３２は、この用量ではわずかな抑制しか示さなかった。２．５ｍｇ／ｋｇでは、ＡＤ－６０４８９が、相対的ＡＬＡＳ１メッセージを対照レベルの約２６％に抑制したのに対し、ＡＤ－５８６３２は、相対的ＡＬＡＳ１メッセージを対照レベルの約６４％に抑制した。５ｍｇ／ｋｇでは、ＡＤ－６０４８９が、相対的ＡＬＡＳ１メッセージを対照レベルの約２１％に抑制した（ｓｕｐｐｒｅｓｅｄ）のに対し、ＡＤ－５８６３２は、相対的ＡＬＡＳ１メッセージを対照レベルの約５５％に抑制した。
臨床化学結果は、ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡを使用したＡＬＡＳ１の持続性のノックダウンが、安全であり良好に耐えられたことを示した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、またはＡＬＰの上昇は、観察されなかった。
実施例２１．ｃＥＲＤアッセイを使用して評価された非ヒト霊長類試験におけるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体ＡＤ－６０４８９およびＡＤ－５８６３２の効果
ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体ＡＤ－６０４８９およびＡＤ－５８６３２の効果が、循環細胞外ＲＮＡ検出（ｃＥＲＤ）法を使用して、非ヒト（ｎｕｍａｎ）霊長類において評価された。この方法は、例えば、Ｓｅｈｇａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ（２０１２年２月９日にＫｅｙｓｔｏｎｅ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｍａｌｌ ＲＮＡｓシンポジウムにおいてポスター発表（バンクーバー、２０１２年２月７～１２日）、およびＳｅｈｇａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ ｉｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＲＮＡ，ＲＮＡ，２０：１－７、２０１３年１２月１９日にオンライン公開に記載される。図２９に示されるように、循環細胞外ＲＮＡ検出（ｃＥＲＤ）法のための血清サンプルは、－１０、－３、７、１５、２３、３１、および４３日目に採取された。
ｃＥＲＤアッセイのためには、血清サンプルが氷上で解凍された。３７５～４００μＬの８Ｍ ＬｉＣｌが、超遠心機（ＵＣ）管内の３～３．５ｍＬの血清に添加されて、４℃の温度で少なくとも１時間インキュベートされた。スピン中に管壁が崩壊するのを防止するために、約１ｃｍの乾燥空間を管上部に残して、ＰＢＳが各ＵＣ管の上部に添加された。管は乾燥されて、氷上のインキュベートからのあらゆる凝結が除去された。ドラフト内のＭＣ５５ローターにサンプルが装入されて、サンプルは１５０，０００～２００，０００ｇで１００～１２０分間にわたり遠心脱水された。上清はペレットから廃棄された。１ｍＬのＴｒｉｚｏｌがＵＣ管内のペレットに添加され、管はボルテックスされて、内容物は１．５ｍＬ微量遠心管に移された。各管に２００μＬのクロロホルムが添加され、管は数回反転されて混合された。一度に１つのサンプルが調製された。サンプルは、４℃、１３，０００ＲＰＭで、１０～２０分間遠心沈殿された。上部水相（約５００μＬ容量）は、新鮮な１．５ｍＬ管に移された。等容積の１００％イソプロパノール、１μＬの直鎖アクリルアミド（ａｃｒｙｌａｍｉｎｄ）（４°）、および１／１０の容量の３Ｍ ＮａｏＡｃ ｐＨ５．５以下が、各サンプルに添加された（典型的に５００μＬのイソプロパノールおよび５０μＬのＮａｏＡｃ）。サンプルは、４℃、１３，０００ＲＰＭで、１０分間遠心沈殿された。上清は、保留された。ペレットは、氷冷７０％ＥｔＯＨで２回洗浄され（各５００μＬの洗浄液）、各洗浄後に、４℃、１３，０００ＲＰＭで約５分間遠心脱水された。ペレットは約５分間風乾されて、次に２０μＬのＮＦ Ｈ２Ｏに再懸濁された。ｃＤＮＡ反応中で、１０μＬが使用された。再懸濁ＲＮＡは、－８０℃で保存された。
結果
ｃＥＲＤアッセイを使用して評価された血清ｍＲＮＡノックダウンは、肝生検から得られた結果と相関した。図３１を参照されたい。ＡＬＡＳ１は血清タンパク質ではないので、これは驚くべき結果である。本明細書で提供されるｃＥＲＤアッセイは、循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡをモニタリングできるようにする。これは、例えば、技術的に困難であり費用がかかる連続肝生検をすることなく、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡのレベルが経時的に測定され得るという利点を有する。
ｍＲＮＡノックダウンの動態は、ｃＥＲＤアッセイ結果を使用して判定された。図３２を参照されたい。ＡＤ－６０４８９は、わずか１．２５ｍｇ／ｋｇの用量であってさえも、５０％を超えるノックダウンを達成した。
実施例２２．ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの安全性試験
以下の安全性試験は、ＡＬＡＳ１の持続性ノックダウンが安全であり、良好に耐えられたことを示す。
非ヒト霊長類試験
上述されるように（実施例２０を参照されたい）、非ヒト霊長類試験では、ＡＤ－６０４８９およびＡＤ－５８６３２の投与後に、ＡＬＴ、ＡＳＴ、またはＡＬＰの上昇は観察されなかった。
ラット試験
ラットでは、ＡＤ－５８６３２について４週間の試験が実施された。ｓｉＲＮＡは、試験の１週目には５日間にわたり毎日１０ｍｇ／ｋｇで、次に２～４週目には隔日１０ｍｇ／ｋｇで投与された。総曝露量は、１４０ｍｇであった。有害な臨床徴候または体重変化は、観察されなかった。血液学または凝固パラメータにおける試験項目関連変化は、観察されなかった。さらに、有害な病理像は、観察されなかった。脾臓内に最小の極小の空胞形成があり、腎臓内に極小の嚢下線維症があった。
マウス試験
マウスでは、Ｐ４５０ ｍＲＮＡが、ＡＬＡＳ１ノックダウン後に評価された。ＡＬＡＳ１ ＬＮＰ製剤投与の４８時間後に、Ｃｙｐ２ｂ１０に軽微な用量依存的増大が観察された。これは１６８時間で解消した。
実施例２３．構造活性相関試験を使用したさらなる有効性ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの同定
本明細書のその他の実施例に記載される試験をはじめとする構造活性相関（ＳＡＲ）試験が実施されて、例えば、ＡＤ－５８６３２およびＡＤ－６０４８９などの既に同定されたものに由来する、さらなる有効性ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡが同定された。化学修飾の効果が調べられた。化学修飾としては、１）２’－Ｏ－メチル対２’－フルオロ修飾、２）２’Ｕｆ（２’フルオロ修飾）の低下、３）ＰＳ（ホスホロチオエート）の付加、４）内部ｄＴの使用、および／または５）グリコール核酸（ＧＮＡ）が挙げられる。理論による拘束は望まないが、修飾は、例えば、１）ＲＩＳＣ負荷のより良い解放または増強、または２）より良い触媒標的結合を通じて、効力を高め得る。修飾はまた、複数用量が投与される場合に、化合物が蓄積してより良く機能できるように、安定性を増強し得る。
場合によってはその他の二本鎖（例えば、ＡＤ－５８６３２および／またはＡＤ－６０４８９）と比較して改善された活性が観察された（表２２Ｂを参照されたい）一方で、その他の事例では、同様の活性（表２３を参照されたい）または活性低下（表２４）が観察された。これらの事例は、１５０を超えるｓｉＲＮＡのスクリーニングに基づく例としてのみ提示される。ＳＡＲ試験のさらなる例証が、本明細書で提供される。
Figure 2023120219000078
Figure 2023120219000079
Figure 2023120219000080
実施例２４．ＡＤ－５８６３２の生体外構造活性相関試験
ＡＤ－５８６３２、およびＡＤ－５８６３２のｓｉＲＮＡ誘導体が生成されて、いくつかのｓｉＲＮＡが生体外で活性についてスクリーニングされた。化学修飾の略称は、表１に提供される。
１０ｎＭおよび０．１ｎＭのｓｉＲＮＡの生体外活性
ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制におけるｓｉＲＮＡの生体外活性が、形質移入試薬としてリポフェクタミン２０００を使用して形質移入されたＨｅｐ３Ｂ細胞内で（ｉｎ ｉｎ）試験された。実験は、示されるｓｉＲＮＡ濃度（例えば、０．１ｎＭ、１０ｎＭ）で実施され、形質移入の２４時間後に、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイによって分析された。結果は、陰性対照として使用された非標的ｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ ＡＤ－１９５５と比較した、残留ｍＲＮＡパーセントとして表される。
ｓｉＲＮＡの配列および生体外試験の結果は、表２５、表２６、および表２７に提供される。
Figure 2023120219000081
Figure 2023120219000082
Figure 2023120219000083
Figure 2023120219000084
Figure 2023120219000085
Figure 2023120219000086
上の表で示されるように、この生体外スクリーニングにおいて、１０ｎＭの濃度で最大ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制（２０％未満のｍＲＮＡが残留するような８０％を超える抑制）を提供したｓｉＲＮＡは、ＡＤ－５８６３２、ＡＤ－６０４７２、ＡＤ－６０４２３、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０４２３、ＡＤ－６０４１７、ＡＤ－６０４６６、ＡＤ－６０４７３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０４４８、ＡＤ－６０４６０、ＡＤ－６０４１１、ＡＤ－６０４８１、ＡＤ－６０４８６、ａｎｄＡＤ－６０４５３、ＡＤ－６０４８０、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０４７７、ＡＤ－６０４６１、ＡＤ－６０４７０、ＡＤ－６０４６７、ＡＤ－６０４８２、ＡＤ－６０４４６、ＡＤ－６０５５５、ＡＤ－６０４５４、ＡＤ－６０４６９、およびＡＤ－６０４６３を含んだ。さらに、この生体外スクリーニングにおいて、０．１ｎＭ濃度で、最大ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制（３０％未満のｍＲＮＡが残留するように７０％を超える抑制）を提供したｓｉＲＮＡは、ＡＤ－６０４２３、ＡＤ－５８６３２、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０４２３、ＡＤ－６０４６６、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０４３８、ＡＤ－６０４４８、ＡＤ－６０４６０、ＡＤ－６０４７３、ＡＤ－６０４１１、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０４７２、ＡＤ－６０４７７、ＡＤ－６０４１７、ＡＤ－６０４８０、ＡＤ－６０４８２、ＡＤ－６０４２１、ＡＤ－６０５６０、ＡＤ－６０４３３、ＡＤ－６０４８１、ＡＤ－６０４７５、ＡＤ－６０５５５、ＡＤ－６０４３７、ＡＤ－６０５５０、ＡＤ－６０４１５、ＡＤ－６０４６３、およびＡＤ－６０４４３を含んだ。
下の表で示されるように、さらなるｓｉＲＮＡの試験は、１０ｎＭ濃度で、ＡＤ－５８６３２、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０４２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０４８０、ＡＤ－６０４６０、およびＡＤ－６０４６６の二本鎖が、８０％を超える抑制を提供し、０．１ｎＭ濃度で、ＡＤ－５８６３２、ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０４２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０４８０、ＡＤ－６０４６０、およびＡＤ－６０４６６の二本鎖が、３０％を超える抑制を提供したことを明らかにした。
Figure 2023120219000087
Figure 2023120219000088
Figure 2023120219000089
Figure 2023120219000090
Figure 2023120219000091
生体外活性に基づくＩＣ５０
上に記載される実験と同様に、さらなる用量応答実験が、１０ｎＭ、１．６６６６７ｎＭ、０．２７７７７８ｎＭ、０．０４６２９６ｎＭ、０．００７７１６ｎＭ、０．００１２８６ｎＭ、０．０００２１４ｎＭ、および３．５７Ｅ－０５ｎＭの最終二本鎖濃度で実施されて、ＩＣ５０値が計算された。
Figure 2023120219000092
Figure 2023120219000093
Figure 2023120219000094
表２８に示されるように、ＡＤ－６０８４５、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８４９、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４８、ＡＤ－６０８２２、ＡＤ－６０８２６、ＡＤ－６０８１９、およびＡＤ－６０４６０の二本鎖は、０．０１ｎＭ未満のＩＣ５０を有した。
ＡＤ－６０８４５、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８４９、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４８、ＡＤ－６０８２２、ＡＤ－６０８２６、ＡＤ－６０８１９、およびＡＤ－６０４６０、ＡＤ－６０８４１、ＡＤ－６０８４２、ＡＤ－６０８４６、ＡＤ－６０８４７、ＡＤ－６０８３８、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－５８６３２０、ＡＤ－６０８４４、ＡＤ－６０８５０、およびＡＤ－６０８３０の二本鎖は、０．０２ｎＭ未満のＩＣ５０を有した。
ＡＤ－６０８４５、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８４９、ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４８、ＡＤ－６０８２２、ＡＤ－６０８２６、ＡＤ－６０８１９、およびＡＤ－６０４６０、ＡＤ－６０８４１、ＡＤ－６０８４２、ＡＤ－６０８４６、ＡＤ－６０８４７、ＡＤ－６０８３８、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－５８６３２０、ＡＤ－６０８４４、ＡＤ－６０８５０、ＡＤ－６０８３０、ＡＤ－６０４２３、ＡＤ－６０８３４、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８２５、ＡＤ－６０８３７、ＡＤ－６０８２３、ＡＤ－６０８２４、ＡＤ－６０８４０、ＡＤ－６０８２９、ＡＤ－６０８９３、ＡＤ－６０８３２、およびＡＤ－６０８２７の二本鎖は、０．０５ｎＭ未満のＩＣ５０を有した。
実施例２５．ＡＤ－５８６３２の生体内構造活性相関試験
ＡＤ－５８６３２親ｓｉＲＮＡの誘導体が生成されて、ラット生体内でスクリーニングされた。スクリーニングされたｓｉＲＮＡの配列は、下の表に提供される。
Figure 2023120219000095
Figure 2023120219000096
５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回用量が投与された。ｓｉＲＮＡの投与に続いて５日目に、ｂＤＮＡアッセイを使用して、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡおよびラットＧＡＰＤＨ（ｒＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのｍＲＮＡ測定が実施され、ｑＰＣＲを使用して薬剤の組織レベルが判定された。結果は、図３３および図３４に提供される。図３３に示されるように、スクリーニングされた少なくとも１０本の二本鎖（ＡＤ－６０４０５、ＡＤ－６０８８７、ＡＤ－６０９２３、ＡＤ－６０４３４、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０９２４、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０９２５、およびＡＤ－６０９２６）が、ＡＤ－５８６３２と比較して改善されたＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を示した。さらに、図３４に示されるように、これらの二本鎖（ＡＤ－６０９２６を除く）は、ＡＤ－５８６３２よりも高い肝臓濃度を達成した。
実施例２６．ラットＡＩＰモデルにおけるＡＤ－６０９２５およびＡＤ－６０９２６の有効性
ＡＤ－６０９２５およびＡＤ－６０９２６（先の実施例に記載される）の治療効果が、ラットＡＩＰモデルで調べられた。実験デザインは、図３５の上部に示される。ラットは、図３５に示される時点において、ＰＢＳ、または３ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１－ＧａｌＮＡｃ ｓｉＲＮＡ ｔ．ｉ．ｗ．、フェノバルビタール（ＰＢ）、およびＡＦ１１ ＬＮＰ製剤（ＡＦ１１－ＰＢＧＤ）中のＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡで処置された。対照ラットには、フェノバルビタール誘導なしで、ＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡのみが投与された。
結果は、図３５、図３６、および図３７に示される。フェノバルビタール投与は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現を誘導し、対照と比較して尿中のＰＢＧおよびＡＬＡのレベルを増大させた。週３回の合計８用量の３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０９２５またはＡＤ－６０９２６による処置は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ（図３５）、尿ＰＢＧ（図３６および図３７、上部）、および尿ＡＬＡ（図３６および図３７、下部）、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ、尿ＰＢＧ、およびＡＬＡのフェノバルビタール誘導性増大を抑制した。治療効果の経時変化は、図３７に示される。矢印は、ＰＢが投与された時点を示す。ｓｉＲＮＡ処置は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ、尿ＰＢＧ、およびＡＬＡの（ｉｎ ｉｎ）フェノバルビタール誘導性増大を妨げた。
ＡＤ－６０９２５およびＡＤ－６０９２６の双方が、ＡＩＰの治療効果治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を示した。ＡＤ－６０９２５は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ、尿ＡＬＡ、および尿ＰＢＧの抑制において、ＡＤ－６０９２６よりもさらに効果的であった。
実施例２７．ＡＤ－５８６３２のさらなる生体内構造活性相関試験
ＡＤ－５８６３２親ｓｉＲＮＡの誘導体が生成されて、ラット生体内でスクリーニングされた。
生体内スクリーニング、パートＩ
スクリーニングされたｓｉＲＮＡの配列は、下の表に提供される。
Figure 2023120219000097
Figure 2023120219000098
ラットは、２週間にわたり隔週（週２回）で、４用量の２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを投与された。ｓｉＲＮＡの最終用量の投与に続いて７２時間目に動物を殺処分し、ｂＤＮＡアッセイを使用して、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡおよびラットＧＡＰＤＨ（ｒＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのレベルを測定した。
図３８に示されるように、試験された少なくとも４つのｓｉＲＮＡ（ＡＤ－６０８２０、ＡＤ－６０８４３、ＡＤ－６０８１９、およびＡＤ－６１１４０）は、ＡＤ－５８６３２と比較して改善されたＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を示した。
生体内スクリーニング、パートＩＩ
スクリーニングされたｓｉＲＮＡの配列は、下の表に提供される。
Figure 2023120219000099
ラットには、２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回用量が投与された。ｓｉＲＮＡの投与に続いて７２時間目に、ｂＤＮＡアッセイを使用して、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡおよびラットＧＡＰＤＨ（ｒＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのｍＲＮＡ測定が実施された。
図３９に示されるように、ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６１１４１、ＡＤ－６１１４２、ＡＤ－６０８３５、ＡＤ－６０８３９、ＡＤ－６１１４３、ＡＤ－６１１４４、ＡＤ－６１１４５、およびＡＤ－６１１４６は、ＡＤ－５８６３２と比較して改善されたＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を示した。この実験で最大抑制を提供したｓｉＲＮＡは、ＡＤ－６０８３５であった。
実施例２８．ＡＤ－６０４８９の生体外構造活性相関試験
ＡＤ－６０４８９、およびＡＤ－６０４８９のｓｉＲＮＡ誘導体が生成されて、いくつかのｓｉＲＮＡが生体外で活性についてスクリーニングされた。ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制におけるｓｉＲＮＡの生体外活性は、実施例２４に記載されるようにして試験された。ｓｉＲＮＡの配列および生体外試験結果は、下の表に提供される。
Figure 2023120219000100
Figure 2023120219000101
Figure 2023120219000102
Figure 2023120219000103
Figure 2023120219000104
Figure 2023120219000105
その結果が上の表に示される生体外スクリーニングにおいて、１０ｎＭ濃度で、最大ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制（２０％未満のｍＲＮＡが残留するような８０％を超える抑制）を提供したｓｉＲＮＡは、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５９２、ＡＤ－６０５９１、ＡＤ－６０５１３、ＡＤ－６０５０７、ＡＤ－６０５８７、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５９３、ＡＤ－６０５８３、ＡＤ－６０５２４、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０５０６、およびＡＤ－６０５８２を含んだ。
その結果が上の表に示される生体外スクリーニングにおいて、０．１ｎＭ濃度で、最大ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制（７０％未満のｍＲＮＡが残留するような３０％を超える抑制）を提供したｓｉＲＮＡは、ＡＤ－６０５９２、ＡＤ－６０５９１、ＡＤ－６０５９３、ＡＤ－６０５８７、ＡＤ－６０５８３、ＡＤ－６０５８９、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５０７、ＡＤ－６０５８５、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１３、ＡＤ－６０５８２、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５４１、ＡＤ－６０５７０、ＡＤ－６０５８４、ＡＤ－６０５６９、ＡＤ－６０５５８、ＡＤ－６０５７３、ＡＤ－６０５５６、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０５２３、ＡＤ－６０５６６、およびＡＤ－６０５４４を含んだ。
下の表で示されるように、さらなるｓｉＲＮＡの試験は、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５０７、ＡＤ－６０５１３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５８３、ＡＤ－６０５９１、ＡＤ－６０５９２、およびＡＤ－６０５９３の二本鎖が、１０ｎＭ濃度で８０％を超える抑制を提供し、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５０７、ＡＤ－６０５１３、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０５８３、ＡＤ－６０５９１、ＡＤ－６０５９２、およびＡＤ－６０５９３の二本鎖が、０．１ｎＭ濃度で３０％を超える抑制を提供したことを明らかにした。
Figure 2023120219000106
Figure 2023120219000107
Figure 2023120219000108
Figure 2023120219000109
Figure 2023120219000110
Figure 2023120219000111
Figure 2023120219000112
上の表で示されるように、いくつかの二本鎖は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制において有効性を示した。ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６０８５９、ＡＤ－６０８６３、ＡＤ－６０８５４、ＡＤ－６０８８２、ＡＤ－６０８７４、ＡＤ－６０８８３、ＡＤ－６０８７５、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５９３、ＡＤ－６０８５３、ＡＤ－６０８７７、ＡＤ－６０８７８、ＡＤ－６０８７１、およびＡＤ－６０８７３の二本鎖は、０．０１ｎＭ未満のＩＣ５０を有した。ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６０８５９、ＡＤ－６０８６３、ＡＤ－６０８５４、ＡＤ－６０８８２、ＡＤ－６０８７４、ＡＤ－６０８８３、ＡＤ－６０８７５、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５９３、ＡＤ－６０８５３、ＡＤ－６０８７７、ＡＤ－６０８７８、ＡＤ－６０８７１、ＡＤ－６０８７３、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５９２、ＡＤ－６０８９４、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０８７０、ＡＤ－６０８６２、ＡＤ－６０８５８、ＡＤ－６０５９２、ＡＤ－６０５９１、ＡＤ－６０８７２、ＡＤ－６０８６６、ＡＤ－６０９０５、ＡＤ－６０８５７、ＡＤ－６０５１３、およびＡＤ－６０８６１の二本鎖は、０．０２ｎＭ未満のＩＣ５０を有した。ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６０８５９、ＡＤ－６０８６３、ＡＤ－６０８５４、ＡＤ－６０８８２、ＡＤ－６０８７４、ＡＤ－６０８８３、ＡＤ－６０８７５、ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５９３、ＡＤ－６０８５３、ＡＤ－６０８７７、ＡＤ－６０８７８、ＡＤ－６０８７１、ＡＤ－６０８７３、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５９２、ＡＤ－６０８９４、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０８７０、ＡＤ－６０８６２、ＡＤ－６０８５８、ＡＤ－６０５９２、ＡＤ－６０５９１、ＡＤ－６０８７２、ＡＤ－６０８６６、ＡＤ－６０９０５、ＡＤ－６０８５７、ＡＤ－６０５１３、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０５８３．２、ＡＤ－６０９０２．１、ＡＤ－６０８８１．１、ＡＤ－６０５１９．２、ＡＤ－６０５０７．２、ＡＤ－６０５９１．３、ＡＤ－６０８５１．１、ＡＤ－６０８９６．１、およびＡＤ－６０５３７．２の二本鎖は、０．０５ｎＭ未満のＩＣ５０を有した。
実施例２９．ＡＤ－６０４８９の生体内構造活性相関試験
ＡＤ－６０４８９親ｓｉＲＮＡの誘導体が生成されて、ラット生体内でスクリーニングされた。
ＡＤ－６０４８９誘導体の生体内スクリーニング１
スクリーニングされたｓｉＲＮＡの配列は、下の表に提供される。
Figure 2023120219000113
ラットには、３ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回用量が投与された。ｓｉＲＮＡの投与に続いて５日目に、ｂＤＮＡアッセイを使用して、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡおよびラットＧＡＰＤＨ（ｒＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのｍＲＮＡ測定が実施され、ｑＰＣＲを使用して薬剤（ｓｉＲＮＡ）の組織レベルが判定された。
図４０（上部）に示されるように、ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６０５０１、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、ＡＤ－６０９００、およびＡＤ－６０９３５は、ＡＤ－６０４８９と比較して改善されたＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を示した。ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６０９０１、ＡＤ－６０４９５、およびＡＤ－６０９３５は、ＡＤ－６０４８９よりも高い肝臓レベルを達成した（図４０下部を参照されたい）。したがって、改善されたＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を提供した二本鎖のほとんどが、より高い肝臓レベルもまた達成した。
少なくとも二本鎖ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、およびＡＤ－６０９０１では、肝臓内のより高いｓｉＲＮＡレベルがより大きなＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制と関連したように、有効性がｓｉＲＮＡの肝臓レベルと相関した（図４１を参照されたい）。
ＡＤ－６０４８９誘導体の生体内スクリーニング２
スクリーニングされたｓｉＲＮＡの配列は、下の表に提供される。
Figure 2023120219000114
Figure 2023120219000115
ラットには、２．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの単回用量が投与された。ｓｉＲＮＡの投与に続いて５日間目に、ｂＤＮＡアッセイを使用して、ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡおよびラットＧＡＰＤＨ（ｒＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのｍＲＮＡ測定が実施された。
図４２に示されるように、ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６０８７９、ＡＤ－６１１９０、ＡＤ－６１１９１、ＡＤ－６０８６５、ＡＤ－６０８６１、ＡＤ－６０８７６、ＡＤ－６１１９３、およびＡＤ－６０５１９は、ＡＤ－６０４８９と比較して改善されたＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を示した。
実施例３０．多回投与は効力を改善する
ｓｉＲＮＡの複数用量を投与する効果を調べるために、２週間にわたり週２回、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＰＢＳまたはｓｉＲＮＡ（ＡＤ－５８６３２、ＡＤ－６０９２５、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０４４５、ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４８９、ＡＤ－６０５１９、またはＡＤ－６０９０１）がラット（ｎ＝グループあたり３匹）に投与された。ラットＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡおよびラットＧＡＰＤＨ（ｒＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡのレベルは、ｂＤＮＡアッセイを使用して評価された。
Figure 2023120219000116
図４３に示されるように、ＡＤ－５８６３２誘導体ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６０８９２、ＡＤ－６０４１９、ＡＤ－６０４４５、およびＡＤ－６０９２５は、親ＡＤ－５８６３２と比較して改善されたＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を示した。さらに、ＡＤ－６０４８９誘導体ｓｉＲＮＡ ＡＤ－６０５１９およびＡＤ－６０９０１は、親ＡＤ－６０４８９と比較して改善されたＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制を示した。
実施例３１．ＡＤ－６０５１９およびＡＤ－６０４８９の多回投与試験
ラットＡＩＰモデルにおいてＡＤ－６０５１９の治療効果が調べられた。実験デザインは、図４４（上部）に示される。ラットは、３週間にわたり週２回、ＰＢＳ、または２．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇのどちらかのＡＬＡＳ１－ＧａｌＮＡｃ ｓｉＲＮＡで処置された。図４４に示される時点で、フェノバルビタール（Ｐｈｅｎｏｂａｒｂ）およびＡＦ１１ ＬＮＰ製剤中のＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡが投与された。対照群には、フェノバルビタール誘導なしで、ＰＢＳおよびＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡのみが投与された。尿は、試験の１８～１９日目に採取された。
結果は、図４４（下部）に示される。フェノバルビタールおよびＰＢＳの投与は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現を誘導し、ＰＢＳのみと比較して、尿中のＰＢＧおよびＡＬＡレベルを増大させた（図４４を参照されたい）。週２回の合計６用量の２．５または５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９による処置は、尿ＰＢＧおよび尿ＡＬＡのフェノバルビタール誘導性増大を抑制した（図４４）。これらの結果は、２．５ｍｇ／ｋｇ程度に低い反復用量で投与された場合に、ＡＤ－６０５１９が、ＡＬＡおよびＰＢＧを抑制するのに効果的であることを示す。特に、ＡＤ－６０５１９は、ラットＡＩＰモデルにおける急性発作と関連付けられている、尿ＰＢＧおよびＡＬＡレベル増大を低下させるのに効果的であった。
同一実験デザインを使用しているが、マウスモデルであるさらなる試験では（図４４上部の概略図を参照されたい）、血清ＰＢＧおよびＡＬＡのフェノバルビタール誘導性増大の抑制における、ＡＤ－６０５１９およびＡＤ－６０４８９の治療効果が調べられた。ＰＢＳ（「生理食塩水」）対照群では、フェノバルビタールの投与は、ＰＢＳのみと比較して、血清ＰＢＧおよびＡＬＡレベルを増大させた（図４５を参照されたい）。週２回の合計６用量の２．５または５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９またはＡＤ－６０４８９による処置は、血清ＰＢＧおよび血清ＡＬＡのフェノバルビタール誘導性増大を抑制した（図４４）。これらの結果は、ＡＤ－６０５１９およびＡＤ－６０４８９の双方が、２．５ｍｇ／ｋｇ程度に低い反復用量で投与された場合に、ＡＬＡおよびＰＢＧを抑制するのに効果的であることを示す。特に、ＡＤ－６０５１９およびＡＤ－６０４８９は、急性発作と関連付けられている、血清ＰＢＧおよびＡＬＡ増大を低下させるのに効果的であった。
本実施例の処置は、フェノバルビタール誘導に先だって投与されたので、これらの結果は、ＡＤ－６０５１９およびＡＤ－６０４８９が予防的な効果を有したことを示唆する。
実施例３２．さらなるｓｉＲＮＡ配列
以下のＡＤ－５８６３２誘導体（表３９）およびＡＤ－６０４８９誘導体（表４０）ｓｉＲＮＡ配列もまた、生成された。
Figure 2023120219000117
Figure 2023120219000118
実施例３３．ＡＤ－６０５１９のさらなる多回投与試験
実施例３１で使用されたラットＡＩＰモデルにおいて、ＡＤ－６０５１９の治療効果が調べられた。実験デザインは、図４６（上部）に示される。ラットは、４週間にわたり週１回、ＰＢＳまたは３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇのＡＬＡＳ１－ＧａｌＮＡｃ ｓｉＲＮＡで処置された（０日目、７日目、１４日目、および２１日目の処置）。図４６に示される時点で、フェノバルビタール（Ｐｈｅｎｏｂａｒｂ）およびＡＦ１１ ＬＮＰ製剤中のＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡが投与された。対照群には、フェノバルビタール誘導なしで、ＰＢＳおよびＰＢＧＤ ｓｉＲＮＡのみが投与された。尿は、試験の２５日目に採取された。
結果は、図４６（下部）および図４７に示される。フェノバルビタールおよびＰＢＳの投与は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現を誘導し、ＰＢＳのみと比較して、尿中のＰＢＧおよびＡＬＡレベルを増大させた。合計４用量週１回の３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または０．３ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９による処置は、ラット肝臓内のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルのフェノバルビタール誘導性増大を用量依存様式で抑制した（図４６を参照されたい）。（ラット肝臓ＡＬＡＳ１（ｒＡＬＡＳ１）ｍＲＮＡのレベルは、ラットＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルと比較して表される。）尿ＰＢＧおよび尿ＡＬＡのレベルはまた、用量依存的治療効果を示した。
ＡＤ－６０５１９の反復される毎週投与は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ発現を抑制するのに、そしてラットＡＩＰモデルの誘導性急性発作と関連付けられている高いＡＬＡおよびＰＢＧレベルを低下させるのに、効果的であった。これらの治療効果は、用量依存的であった。これらの結果は、ＡＤ－６０５１９が、発作に先だって投与された場合に、予防的に機能することを例証する。
実施例３４．非ヒト霊長類におけるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体の多回投与効果
肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡおよび循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制におけるＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体の効果が、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）で調べられた。ＧａｌＮＡｃ複合体ＡＤ－５８６３２、ＡＤ－６０５１９、ＡＤ－６１１９３、およびＡＤ－６０８１９が用いられた。研究デザインは、表４１および図４８に示される。
Figure 2023120219000119
各群は、２ｍｇ／ｍｌの投与容量のＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの複数回の皮下投与を受けた。グループ１（Ｎ＝３）は、１、２、３、４、５、８、１１、１５、１８、２２、および２５日目に、２．５ｍｇ／ｋｇの１．２５ｍｇ／ｍｌ ＡＤ－５８６３２を投与された。グループ２（Ｎ＝３）は、１、２、３、４、５、８、１１、１５、１８、２２、および２５日目に、１．２５ｍｇ／ｋｇの０．６２５ｍｇ／ｍｌ ＡＤ－６０５１９を投与された。グループ３（Ｎ＝３）は、１、２、３、４、５、８、１１、１５、１８、２２、および２５日目に、２．５ｍｇ／ｋｇの１．２５ｍｇ／ｍｌ ＡＤ－６０５１９を投与された。グループ４（Ｎ＝３）は、１、２、３、４、５、１１、１８、および２５日目に、２．５ｍｇ／ｋｇの１．２５ｍｇ／ｍｌ ＡＤ－６０５１９を投与された。グループ５（Ｎ＝３）は、１、２、３、４、５、１１、１８、および２５日目に、５ｍｇ／ｋｇの２．５ｍｇ／ｍｌ ＡＤ－６０５１９を投与された。グループ６（Ｎ＝３）は、１、２、３、４、５、８、１１、１５、１８、２２、および２５日目に、２．５ｍｇ／ｋｇの１．２５ｍｇ／ｍｌ ＡＤ－６１１９３を投与された。グループ７（Ｎ＝３）は、１、２、３、４、５、８、１１、１５、１８、２２、および２５日目に、２．５ｍｇ／ｋｇの１．２５ｍｇ／ｍｌ ＡＤ－６０８１９を投与された。
循環細胞外ＲＮＡ検出（ｃＥＲＤ）アッセイ（実施例２１を参照されたい）のための血清サンプルは、－３、７、１３、２１、２７、３９、４６、および６０日目に採取された（図４８で「ＰＤ採取」は、血清が採取された日を示す）。血清は、臨床化学パネルのために、－３および６日目に採取された。臨床化学パネルは、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルのアセスメントを含んだ。ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡサイレンシングは、２１日目に採取された肝生検から得られた肝臓組織内で評価された（図４８を参照されたい）。生検は、血清採取後に採取された。
肝臓内ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの抑制
試験２１日目の肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、図４９に示される。結果は、ＰＢＳで処置された対照群で観察された平均レベルの百分率として示される。結果は、各処置群の平均値として示される。
図４９に報告されるこれらの結果は、ＰＢＳ処置を投与された対照動物と比較して、肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを抑制するのに、全ての処置条件が効果的であったことを示す。処置は、約２０％～８０％の範囲のｍＲＮＡサイレンシングを達成した（対照レベルの約８０％～２０％の範囲のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルに相当する）。ＡＤ－５８６３２を投与された個々の動物は、約２０～５０％のサイレンシングを示し、サイレンシングの平均レベルは、約４０％であった（ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、平均して対照レベルの約６０％であった）。用いられた全ての投与スケジュールで、ＡＤ－６０５１９は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを抑制するのに非常に効果的であった。ＡＤ－６０５１９を投与された個々の動物は、約６０％～８０％のサイレンシングを示した（ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、対照レベルの約２０％～４０％であった）。平均して、ＡＤ－６０５１９治療計画は、約６５％～７５％のサイレンシングを達成した。本明細書で開示されるように、ＡＤ－６０５１９はＡＤ－６０４８９の誘導体である。ＡＤ－６０４８９に関する同様の結果が、実施例２０に記載されて図３０に示される。さらに、ＡＤ－６１１９３（ＡＤ－６０４８９の誘導体）およびＡＤ－６０８１９（ＡＤ－５８６３２の誘導体）もまた、５０％を超えるサイレンシングを達成した。本実施例および実施例２０で報告されたサイレンシングレベル（例えば約２０％～８０％）が、「非誘導」状態であってさえも獲得されたことは、注目に値し；例えば、ＡＬＡＳ１レベルが急性的にまたは慢性的に上昇している場合などの誘導状態では（例えば、ＡＩＰなどの急性肝性ポルフィリン症などのポルフィリン症を有し、またはそのリスクがある患者では）、例えば、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの正常または発作前レベルへの低下などのより低レベルのサイレンシングが、治療効果を達成するのに十分であり得ることが期待される。
循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの抑制
図５０は、試験全体にわたり、血清サンプルが得られた各時点における、循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベル（平均および標準偏差）を示す。循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ結果は、試験されたｓｉＲＮＡのそれぞれ（ＡＤ６０５１９、ＡＤ－６１１９３、ＡＤ－６０８１９、およびＡＤ－５８６３２）による多回投与処置に続く、ｍＲＮＡサイレンシングの有効性を示す。全ての群で、循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡに対する最大抑制効果は、２５日目のｓｉＲＮＡの最終投与に続いて、２７日目に観察された。全ての処置群で、処置休止後数週間にわたり、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは徐々に増大して、６０日目の最終測定までにベースラインに戻った。
循環ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの最も顕著な抑制（ほぼ８０％の最大のサイレンシング）は、グループ３（２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９ＱＤ×５、ＢＩＷ×３）およびグループ５（５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、ＱＤ×５ＱＷ×３）で観察された。グループ２（１．２５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、ＱＤ×５、ＢＩＷ×３）、グループ４（２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０５１９、ＱＤ×５、ＱＷ×３）、グループ７（２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０８１９、ＱＤ×５、ＢＩＷ×３）、およびグループ６（２．５ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６１１９３、ＱＤ×５、ＢＩＷ×３）もまた、優れた抑制を示し、最大のサイレンシング（２７日目）は５０％を超えた。グループ１でも、顕著なサイレンシング（２７日目に３０％を超える）が達成された。
これらの結果は、肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ結果に一致して、ＡＤ－６０５１９の強力な活性を立証する。１．２５ｍｇ／ｋｇ程度に低い用量レベルでは、ＡＤ－６０５１９は、６５～７５％のサイレンシングを提供した。
循環および肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベル間の相関
図２７は、肝臓内（左側バー）および血清中（右側バー）のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを示す。肝臓および血清で測定された相対的ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの間には良好な相関があり、これらの測定値が一貫性がある結果を提供することが示される。
実施例３５．ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制の持続期間をモニターするための尿ｃＥＲＤアッセイを使用したＡＤ－６０５１９およびＡＤ－６０５８９のラット単回投与試験
ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃ複合体ＡＤ－６０４８９およびＡＤ－６０５１９を使用して、単回投与試験がラットで実施された。ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの発現阻害におけるこれらのＧａｌＮＡｃ複合体の有効性は、循環細胞外ＲＮＡ検出アッセイと共に、尿のアセスメントを使用してモニターされた。アッセイは、尿サンプルが使用されたこと以外は、実施例２１および３４で使用されたアッセイと同様であった。尿サンプルは、凍結乾燥され濃縮された。凍結乾燥尿は、４ｍｌ ｄＨ２Ｏに再懸濁されてボルテックスされた。次に、サンプルは４，０００×ｇで１０～２０分間遠心分離されて、あらゆる壊死組織片がペレット化された。残りの工程は、実施例２１に記載されるものと同様であった。
ラット群は、１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ－６０４８９またはＡＤ－６０５１９の単回用量を投与された。試験全体に及ぶ様々な時点におけるＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの正規化レベルは、図５１に示される。「０時間」として示される時点は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの投与直前のベースライン投与前尿サンプル採取のためのものである。引き続く時点の結果は、投与前レベルの割合として表される。
図５１に示される結果を見ても分かるように、ＡＤ－６０５１９は、ＡＤ－６０４８９と比較して改善された効力を提供した。その最大値で、ＡＤ－６０５１９の単回用量が約８０％までの抑制を提供したのに対し、ＡＤ－６０４８９によって提供された抑制は、約６０％であった。ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制における、これらのＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡの単回１０ｍｇ／ｋｇ投与の効果は、約２１日間持続した。これらの結果は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルをモニタリングするための尿ｃＥＲＤアッセイの有効性を示す。
実施例３６．非ヒト霊長類におけるＡＤ－６０５１９の薬理学的効果
ＡＬＡＳ１ ｓｉＲＮＡ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＤ－６０５１９の効果のさらなる試験が、非ヒト霊長類において実施された。試験は、毎週投与対隔週投与の効果、負荷量使用対負荷量不使用、および単回投与に続くＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡサイレンシングの動態を調べた。試験のデザインは、表４２および図５２に示される。
Figure 2023120219000120
各群は、表４２に記載されるＡＤ－６０５１９の１回または複数回の皮下投与を受けた。グループ１（ｎ＝３）は、８週間にわたり週１回、０．１２５ｍｌ／ｋｇの投与容量で２．５ｍｇ／ｋｇを投与された（用量は、投与日１、８、１５、２２、２９、３６、４３、および５０に投与された）。グループ２（ｎ＝３）は、８週間にわたり週１回、０．２５ｍｇ／ｍｌの投与容量で５ｍｇ／ｋｇを投与された（用量は、投与日１、８、１５、２２、２９、３６、４３、および５０に投与された）。グループ３（ｎ＝３）は、３日間にわたり１日１回、０．２５ｍｌ／ｋｇの投与容量で５ｍｇ／ｋｇの負荷量を投与され、７週間にわたり週１回、０．２５ｍｌ／ｋｇの投与容量で５ｍｇ／ｋｇの維持量がそれに続いた（用量は、１、２、３、８、１５、２２、２９、３６、４３、および５０日目に投与された）。グループ４（ｎ＝３）は、３日間にわたり１日１回、０．２５ｍｌ／ｋｇの投与容量で５ｍｇ／ｋｇの負荷量を投与され、７週間にわたり週１回、０．１２５ｍｌ／ｋｇの投与容量で２．５ｍｇ／ｋｇの維持量がそれに続いた（用量は、１、２、３、８、１５、２２、２９、３６、４３、および５０日目に投与された）。グループ５（ｎ＝３）は、８週間にわたり週２回、０．２５ｍｌ／ｋｇの投与容量で５ｍｇ／ｋｇを投与された（用量は、投与日１、４、８、１１、１５、１８、２２、２５、２９、３２、３６、３９、４３、４６、５０、および５３に投与された）。グループ６（ｎ＝３）は、１日目に０．０５ｍｌ／ｋｇの投与容量で、１ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与された。グループ７（ｎ＝３）は、１日目に０．５ｍｌ／ｋｇの投与容量で、１０ｍｇ／ｋｇの単回用量を投与された。
血清サンプル（図５２に「ＰＤ採取」と記載される）、血漿サンプル（図５２に「ＰＫ採取」と記載される）、および尿サンプルは、図５２および表４３に示されるように採取された。尿および血清サンプルには、ｃＥＲＤアッセイが実施された。肝生検日に採取された全ての血液および尿サンプルは、肝生検に先だって採取された。
Figure 2023120219000121
肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ結果は、図５３に示される。全ての試験条件で、有意なＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制が得られた。ＡＤ－６０５１９を使用した多回投与計画全体で、最高７５～８０％のＡＬＡＳ１サイレンシングが達成された。単回投与の３日後に、１ｍｇ／ｋｇの単回投与では約１５％のサイレンシングが達成され、１０ｍｇ／ｋｇの単回投与では約７０％のサイレンシングが達成された（図５３を参照されたい）。グループ７では投与の３日後に、グループ１では４回目の投与の２日後に評価されるように、グループ１および７からのデータの比較は、単回投与（グループ７）後に、同一累積量（３０ｍｇの投与）の複数投与（グループ１）との対比で、動態に軽微な差異があったことを明らかにする。特に、単回用量後に、より大きなサイレンシングが観察された（グループ７の平均約７０％のサイレンシング対グループ１の平均約４５％のサイレンシング）。図５４を参照されたい。この種の結果はまた、ラット試験でも観察された。
２２日目までの血清ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ結果が、図５４（上部）に示される。肝臓ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ、血清ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ、および血漿ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの間の相関は、図５５に示される。これらの結果は、肝臓、血清、および尿ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの間の良好な相関を示す。結果はまた、ＡＤ－６０５１９の強力な活性を実証する、さらなる証拠も提供する。５５～７５％のサイレンシングは、全ての多回用量投与計画にわたり、全ての用量レベルで（ａｔ ａｔ）観察された。負荷量（グループ３および４のように３日間にわたる１日１回）の投与は、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡのわずかにより迅速な下方制御をもたらした。毎週（グループ１および２）または隔週用量（グループ５）用量（ｂｉｗｅｅｋｌｙ ｄｏｓｅｓ（ｇｒｏｕｐ ５）ｄｏｓｅｓ）を投与されたグループは、究極的に、同等のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制レベルを示し、経時的蓄積が持続性のノックダウンを提供することを示した。
単回投与後のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡサイレンシングの動態を示す結果は、図５４（下部）に示される。１ｍｇ／ｋｇグループでは、６日目までに約２０％のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡの抑制が観察された。１０ｍｇ／ｋｇグループでは、４日目までに迅速な約７０％のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ低下があり、２２日目（投与の２１日後）にはベースラインの２０％内に回復した。血清ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルは、それぞれ１ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの単回投与に続いて、約２週間または４週間後にベースラインに戻った。
ＡＤ－６０５１９投与の８週間後までの血清ＡＬＡＳ ｍＲＮＡの完全経時変化は、図５６に示される。全てのグループが、ＡＬＮ－ＡＳ１投与に続いて５から８週間後に、８０％のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制の最大値に達した。週に３回の１日用量があるグループ（ＱＤ×３）は、第１週目に１回のみ投与されたグループ（ＱＷ×８）よりも、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ抑制のより迅速な開始を有した。全ての動物は、最終投与のおよそ３０～４０日後に、ベースラインＡＬＡＳ１レベルに戻った。
実施例３７．ｓｉＲＮＡ医薬品の製造
ＡＬＮ－６０５１９（図５７）は、３つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基を含有するリガンドに共有結合する、化学的に合成された二本鎖のオリゴヌクレオチドである。全てのヌクレオチドは、２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆ修飾され、３’－５’リン酸ジエステル結合を介して連結され、したがってオリゴヌクレオチドの糖－リン酸骨格を形成する。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、２１個および２３個のヌクレオチドを含有する。センス鎖の３’末端は、リン酸ジエステル結合を介して、三分岐ＧａｌＮＡｃ部分（Ｌ９６と称される）にコンジュゲートされる。アンチセンス鎖は、３’末端に２つおよび５’末端に２つの４つのホスホロチオエート結合を含有する。センス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエート結合を含有する。センス鎖の２１個のヌクレオチドは、アンチセンス鎖の相補的な２１個のヌクレオチドとハイブリダイズし、したがって２１個のヌクレオチド塩基対とアンチセンス鎖の３’末端の２つの塩基オーバーハングとを形成する。２つの一本鎖であるセンス鎖およびアンチセンス鎖は、５’－ヒドロキシル基がジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）エーテルとして保護される、標準ホスホラミダイト化学反応を用いて、従来の固相オリゴヌクレオチド合成によって合成された。各鎖は、保護されたヌクレオシドホスホラミダイトの逐次の付加によって、３’末端から５’末端に向けて構築された。
本明細書ではＡＬＮ－６０５１９とも称されるＡＤ－６０５１９は、本明細書でＡＬＮ－ＡＳ１と称される、皮下使用のための注射用溶液として調合された。ＡＬＮ－６０５１９は、注射用水（ＷＦＩ）に溶解されて、ｐＨが補正された（目標７．０）。ＡＬＮ－６０５１９の濃度が判定され、ＷＦＩを添加することで補正された。次に、およそ２００ｍｇ／ｍＬの最終濃度の溶液が濾過滅菌されて、２ｍＬのＩ型ガラスバイアル内に充填された。０．５ｍＬの医薬品の取り出しを可能にするために、およそ０．５５ｍＬの充填容量が選択された。
実施例３８．ｃＥＲＤ法を使用したＡＩＰ患者または健常ボランティアにおける血清または尿ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの測定
ＡＬＮ－ＡＳ１による非ヒト霊長類薬理学試験は、血清または尿中のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを測定するための循環細胞外ＲＮＡ検出（ｃＥＲＤ）法が、堅固で再現可能であることを示した。ｃＥＲＤアッセイはまた、ＡＩＰ患者および健常ボランティアからの血清および尿中のＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルを測定するのにも使用された。ＡＩＰ患者では、健常ボランティアと比較して、血清ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルが一般に増大し、疾患病態生理においてＡＬＡＳ１誘導が果たす役割と一致した（図５８）。重要なことには、同一患者内の血清および尿中のＡＬＡＳ１のレベルは、互いに相関した。尿および血清が反復採取された２人の患者では、ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルが経時的に一貫していた。まとめると、これらのデータは、ＡＩＰ患者をはじめとするヒト対象からの血清および尿サンプル中でＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡ測定され得て、ＡＬＮ－ＡＳ１の薬力学活性を追跡するのに、ｃＥＲＤ法が有用であることを示唆する。
実施例３９．代表的な臨床試験
ヒト試験を実施して、無症候性高度排出者（ＡＳＨＥ）（本明細書に記載されるような高レベルのＡＬＡおよび／またはＰＢＧを有する患者）であるＡＩＰ患者、または再発性発作を有するＡＩＰ患者に、単回用量および複数用量として投与された場合の、ＡＬＮ－ＡＳ１の安全性および耐容性が判定され得る。
二次的な目的としては、ＡＬＮ－ＡＳ１に関する血漿および尿ＰＫの特性決定、ならびに血漿および尿ＡＬＡおよびＰＢＧレベルの双方に対するＡＬＮ－ＡＳ１の影響の投与後アセスメントが挙げられる。エキソソーム中のｍＲＮＡを測定するｃＥＲＤアッセイが使用されて、血清（または血漿）および尿５－アミノレブリン酸シンターゼ（ＡＬＡＳ－１ ｍＲＮＡ）が測定される。
無症候性高度排出者では、ＡＬＮ－ＡＳ１が、例えば、０．１、０．３５、１．０、または２．５ｍｇ／ｋｇの単回用量で、または例えば、１および２．５ｍｇ／ｋｇの反復される週間用量で、数週間にわたり（例えば、４週間にわたり）投与される。比較として、対照（例えば、プラセボ）処置が投与される。薬剤の安全性、薬物動態学、そしてＡＬＡおよびＰＢＧレベルに対する効果が評価される。例えば、ＡＩＰ患者における後続の試験のために、ＡＬＡおよびＰＢＧを正常基準範囲内に低下させるＡＬＮ－ＡＳ１の用量（例えば、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧを２×基準値上限未満のレベルに正常化する用量）が選択され得る。
ＡＩＰ患者では、投与前の慣らし期間（例えば、１２週間）内に、発作率およびベースライン症状が評価される。患者には、例えば、毎週１～２．５ｍｇ／ｋｇの用量でＡＬＮ－ＡＳ１が投与される。薬剤の安全性、薬物動態学、そしてＡＬＡおよびＰＢＧレベルに対する効果が評価される。さらに、発作回数、ヘム使用、鎮痛剤使用、および入院の変化がモニターされる。
均等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

Claims (59)

  1. ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記アンチセンス鎖が、ＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物（例えば、配列番号１）に対する相補性領域を含んでなり、前記アンチセンス鎖が、ＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５３）またはＵＡＡＧＡＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＴＵＵＣＵＧＧＵ（配列番号４１５４）のアンチセンス配列からの少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んでなる、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
  2. ＡＬＡＳ１の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、前記アンチセンス鎖がＡＬＡＳ１ ＲＮＡ転写物（例えば、配列番号１）に対する相補性領域を含んでなり、前記アンチセンス鎖が、（ｉ）表２１～４０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列、または（ｉｉ）表２１～４０のいずれか１つに列挙されるアンチセンス配列の未修飾バージョン（配列番号４１７２～５２３７）からの少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含んでなる、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
  3. 前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含んでなる、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
  4. 前記二本鎖領域の長さが１７～２３ヌクレオチド対である、請求項１～３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  5. 少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含んでなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  6. 各鎖が２６ヌクレオチド長以下である、請求項１～５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  7. 少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、および任意選択的に１つまたは複数の５’－ホスホロチオエート基、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
  8. リガンドをさらに含んでなる、請求項１～７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡであって、任意選択的に前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされている、ｄｓＲＮＡ。
  9. 前記リガンドが炭水化物を含んでなる、請求項８に記載のｄｓＲＮＡであって、任意選択的に前記リガンドがＧａｌＮＡｃリガンドである、ｄｓＲＮＡ。
  10. 前記リガンドが、
    Figure 2023120219000122
     である、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ。
  11. 前記リガンドが、二価または三価の分枝リンカーを介して付着する、請求項８～１０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  12. 前記リガンドおよびリンカーが、式ＸＸＩＶ、
    Figure 2023120219000123
     に示されるようである、請求項１１に記載のｄｓＲＮＡ。
  13. 前記ｄｓＲＮＡが、
    Figure 2023120219000124
     で示されるように、リンカーを介してリガンドＬ９６にコンジュゲートされている、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ。
  14. 前記リガンドが、前記ｄｓＲＮＡを肝実質細胞に標的化する、請求項８～１３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  15. 前記ｄｓＲＮＡが、表２１～４０に列挙されるセンス配列から選択されるセンス配列からなるセンス鎖と、表２１～４０に列挙されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含んでなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  16. 前記ｄｓＲＮＡが、１ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．０２ｎＭ未満、または０．０１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  17. 前記ｄｓＲＮＡが、約１０ｍｇ／ｋｇ未満または約５ｍｇ／ｋｇ未満の単回用量ＥＤ５０を有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  18. 前記ｄｓＲＮＡが、ＡＤ－５８６３２またはＡＤ－６０４８９と比較して改善された活性を示す、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡであって、任意選択的に前記ｄｓＲＮＡが、表２１～４０に列挙されるｄｓＲＮＡから選択される、ｄｓＲＮＡ。
  19. 前記センス鎖が、ＣＡＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＣＵＣＡＵＣＵＵＡ（配列番号４１５５）の配列を含んでなり、またはそれからなる、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  20. 請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （ｉ）前記アンチセンス鎖がＡＤ－６０５１９のアンチセンス配列を含んでなり、前記アンチセンス配列がＡＤ－６０５１９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなり；
    （ｉｉ）前記アンチセンス鎖がＡＤ－６０５１９のアンチセンス配列からなり、前記アンチセンス配列がＡＤ－６０５１９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなり；
    （ｉｉｉ）前記センス鎖がＡＤ－６０５１９のセンス配列を含んでなり、前記センス配列がＡＤ－６０５１９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなり；
    （ｉｖ）前記センス鎖がＡＤ－６０５１９のセンス配列からなり、前記センス配列がＡＤ－６０５１９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなり；
    （ｖ）前記センス鎖がＡＤ－６０５１９のセンス配列を含んでなり、前記アンチセンス鎖がＡＤ－６０５１９のアンチセンス配列を含んでなり、前記センスおよびアンチセンス配列がＡＤ－６０５１９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなり、または
    （ｖｉ）前記センス鎖がＡＤ－６０５１９のセンス配列からなり、前記アンチセンス鎖がＡＤ－６０５１９のアンチセンス配列からなり、前記センスおよびアンチセンス配列がＡＤ－６０５１９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなる、ｄｓＲＮＡ。
  21. 請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （ｉ）前記アンチセンス鎖がＡＤ－６０４８９のアンチセンス配列を含んでなり、および／または前記センス鎖がＡＤ－６０４８９のセンス配列を含んでなり、前記アンチセンスおよび／またはセンス配列がＡＤ－６０４８９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなり、または
    （ｉｉ）前記アンチセンス鎖がＡＤ－６０４８９のアンチセンス配列からなり、および／または前記センス鎖がＡＤ－６０４８９のセンス配列からなり、前記アンチセンスおよび／またはセンス配列がＡＤ－６０４８９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなる、ｄｓＲＮＡ。
  22. 請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （ｉ）前記アンチセンス鎖がＡＤ－６１１９３のアンチセンス配列を含んでなり、および／または前記センス鎖がＡＤ－６１１９３のセンス配列を含んでなり、前記アンチセンスおよび／またはセンス配列がＡＤ－６１１９３の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなり、または
    （ｉｉ）前記アンチセンス鎖がＡＤ－６１１９３のアンチセンス配列からなり、および／または前記センス鎖がＡＤ－６１１９３のセンス配列からなり、前記アンチセンスおよび／またはセンス配列がＡＤ－６１１９３の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなる、ｄｓＲＮＡ。
  23. 請求項２に記載のｄｓＲＮＡであって、
    （ｉ）前記アンチセンス鎖がＡＤ－６０８１９のアンチセンス配列を含んでなり、および／または前記センス鎖がＡＤ－６０８１９のセンス配列を含んでなり、前記アンチセンスおよび／またはセンス配列がＡＤ－６０８１９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなり、または
    （ｉｉ）前記アンチセンス鎖がＡＤ－６０８１９のアンチセンス配列からなり、および／または前記センス鎖がＡＤ－６０８１９のセンス配列からなり、前記アンチセンスおよび／またはセンス配列がＡＤ－６０８１９の全ての修飾ヌクレオチドを含んでなる、ｄｓＲＮＡ。
  24. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の少なくとも１本のｄｓＲＮＡ鎖をコードする、ベクター。
  25. 請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡまたは請求項２４に記載のベクターを含んでなる、細胞。
  26. 請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを含んでなる、ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  27. ｄｓＲＮＡが非緩衝生理食塩水または水溶液中で投与される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. 前記組成物が皮下投与に適する、請求項２６または２７に記載の医薬組成物。
  29. （ａ）請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを細胞に導入するステップと、
    （ｂ）ステップ（ａ）の細胞をＡＬＡＳ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって前記細胞中の前記ＡＬＡＳ１遺伝子の発現を阻害するステップと
    を含んでなる、細胞中でＡＬＡＳ１発現を阻害する方法であって、任意選択的に前記ＡＬＡＳ１の発現が、少なくとも２０％または少なくとも３０％阻害される、方法。
  30. 細胞を細胞（例えば、肝実質細胞）内のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えば、ＡＬＡまたはＰＢＧ）のレベルを低下させるのに有効な量で、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡに接触させるステップを含んでなる、細胞内のポルフィリンまたはポルフィリン前駆体のレベルを低下させる方法。
  31. （ｉ）請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ、または
    （ｉｉ）請求項２６～２８のいずれか一項に記載の組成物
    の治療有効量をこのような治療を必要とする対象に投与して、それによってポルフィリン症を治療するステップを含んでなる、ポルフィリン症を治療する方法。
  32. 前記対象が、ポルフィリン症の発症リスクがあり、またはポルフィリン症と診断される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ポルフィリン症が、急性間欠性ポルフィリン症またはＡＬＡデヒドラターゼ欠乏ポルフィリン症である、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. （ｉ）前記ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含んでなる組成物が、ポルフィリン症の急性発作後に投与され、（ｉｉ）前記ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含んでなる組成物が、ポルフィリン症の急性発作中に投与され、または（ｉｉｉ）前記ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含んでなる組成物が予防的に投与されて、ポルフィリン症の急性発作が予防される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ｄｓＲＮＡが、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの対象体重の用量などの０．０５～５０ｍｇ／ｋｇの対象体重の用量で投与される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法が、
    （ｉ）前記対象においてポルフィリンまたはポルフィリン前駆体（例えば、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはポルフォビリノーゲン（ｐｏｒｐｈｏｐｉｌｉｎｏｇｅｎ）（ＰＢＧ））レベルを低下させて、任意選択的に前記レベルが少なくとも３０％低下され、および／または
    （ｉｉ）前記対象においてＡＬＡＳ１発現を阻害する、方法。
  37. 請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法であって、前記方法が、（ｉ）ＡＬＡＳ１関連障害（例えばポルフィリン症）に伴う症状を改善し、（ｉｉ）前記対象においてポルフィリン症に伴う症状の急性発作の頻度を低下させ、および／または（ｉｉｉ）前記対象が、例えば、月経前期などの増悪因子に曝露した際に、前記対象においてポルフィリン症に伴う症状の急性発作の発生率を低下させる、方法。
  38. 前記ｄｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含んでなる組成物が、例えば、毎週、隔週、または毎月などの投与計画に従って投与される、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の請求の方法。
  39. 前記ｄｓＲＮＡが、例えば、前駆症状中などのポルフィリン症の急性発作前に投与される、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記対象が、高いレベル（例えば、血漿または尿レベル）のＡＬＡおよび／またはＰＢＧを有する、請求項３１～３９のいずれか一項に記載の請求の方法であって、任意選択的に前記対象が、慢性疼痛を患っている、方法。
  41. ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの上昇を低下させる、請求項３１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記方法が、疼痛、神経障害、および／または神経損傷を減少させまたは予防する、請求項３１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記方法が、ポルフィリン症の急性発作を予防する、請求項３１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ｄｓＲＮＡまたは前記ｄｓＲＮＡを含んでなる組成物が、反復投与される、請求項３１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. （ｉ）請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ、または
    （ｉｉ）請求項２６～２８のいずれか一項に記載の組成物
    の治療有効量をこのような治療を必要とする対象に投与するステップを含んでなる、高レベルのＡＬＡおよび／またはＰＢＧがある対象を治療する方法であって、任意選択的に、前記方法が、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを低下させるのに効果的である、方法。
  46. ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルの増大を有する対象を治療する方法であって、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを少なくとも１０週間にわたり週１回、１ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ投与し、それによって前記対象において、ＡＬＡおよび／またはＰＢＧレベルを低下させるステップを含んでなる、方法。
  47. 複数の再発性発作を患っているＡＩＰがあるヒト患者を治療する方法であって、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡを少なくとも６ヶ月間にわたり２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、それによって前記患者を治療するステップを含んでなり、任意選択的に前記方法が、
    （ｉ）発作発生頻度を低下させ、
    （ｉｉ）ヘマチン使用を低下させ、
    （ｉｉｉ）入院を減少させ、および／または
    （ｉｖ）生活の質を改善する、方法。
  48. 対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡのレベルをアッセイする方法であって、
    ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを含んでなる、前記対象からの生物学的液状サンプル（例えば、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、または尿サンプル）中でＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡのレベルを検出し（例えば、測定し）、
    それによって前記対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルをアッセイするステップを含んでなる、方法。
  49. 対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡのレベルをアッセイする方法であって、
    （ｉ）ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡを含んでなる、前記対象からの生物学的液状サンプル（例えば、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、または尿サンプル）からＲＮＡ（例えば、細胞外ＲＮＡ）を提供するステップと；
    （ｉｉ）前記ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡからＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡを得るステップと；
    （ｉｉｉ）前記ＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡを前記ＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡまたはその一部に相補的な核酸（例えば、プローブおよび／またはプライマー）に接触させて、それによって反応混合物を生成するステップと；
    （ｉｖ）前記反応混合物中の前記ＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡレベルを検出し（例えば、測定し）、前記ＡＬＡＳ１ ｃＤＮＡレベルが、前記ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの指標となるステップと、
    を含んでなり、それによって前記対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルをアッセイする方法において、
    任意選択的に、
    （ａ）前記方法が、ＰＣＲ、ｑＰＣＲまたは５’－ＲＡＣＥを含んでなり、
    （ｂ）前記核酸がプローブまたはプライマーであり、および／または
    （ｃ）前記核酸が検出可能部分を含んでなり、前記検出可能部分の量の検出によって、前記ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルが判定される、方法。
  50. ポルフィリン症治療の有効性が、前記対象中の循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルと基準値との比較に基づいて評価される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ポルフィリン症治療に応答する、前記基準値と比較した、前記対象中の前記循環細胞外ＡＬＡＳ１ ｍＲＮＡレベルの低下が、前記ポルフィリン症治療が有効であることを示唆する、請求項４９に記載の方法。
  52. 対象から生体液サンプルを得るステップをさらに含んでなる、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法であって、任意選択的に前記生体液サンプルが組織から分離され、前記生体液サンプルがエキソソームを含有する、方法。
  53. 請求項２０に記載のｄｓＲＮＡと注射用水とを含んでなる、組成物。
  54. 約２００ｍｇ／ｍＬの請求項２０に記載のｄｓＲＮＡを含んでなる、請求項５３に記載の組成物。
  55. 例えば、約７．０などの６．０～７．５のｐＨを有する、請求項５３または５４に記載の組成物。
  56. 皮下注射のために調合される、請求項５３～５５のいずれか一項に記載の組成物。
  57. ポルフィリン症（例えば、ＡＩＰ）または高レベルのＡＬＡおよび／またはＰＢＧを有する対象を治療する方法であって、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に皮下投与するステップを含んでなる、方法。
  58. 前記組成物が、例えば、２．５ｍｇ／ｋｇ以下の用量または１～２．５ｍｇ／ｋｇの用量などの０～５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記組成物が、毎週投与される、請求項５８に記載の方法。
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