HUP0401860A2 - Borélesztő karbamidbontásának módosítása - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya a mikrobiális biokémia körébe tartozik. A találmánytárgyát egy bizonyos szempontból szénhidrátok etilalkoholt eredményezőfermentációjára képes szervezetek nitrogénlebontást magában foglalóbiokémiai reakcióútjainak manipulációja képezi. A találmány bizonyosmegvalósítási módjai szerint pedig a találmány tárgyát bor és másfermentációs termékek előállításához szükséges kultúrák és folyamatokképezik. Ó

Description

KÖZTr~ f TELI PELLai^ / a

Borélesztő karbamidbontásának módosítása

A találmány tárgya a mikrobiális biokémia körébe tartozik. A találmány tárgyát egy bizonyos szempontból szénhidrátok etilalkoholt eredményező fermentációjára képes szervezetek nitrogénlebontást magában foglaló biokémiai reakcióútjainak manipulációja képezi. A találmány bizonyos megvalósítási módjai szerint pedig a találmány tárgyát bor és más fermentációs termékek előállításához szükséges kultúrák és folyamatok képezik.

Az arginin a szőlőmustban előforduló leggyakoribb aminosavak egyike [Henschke és Jiranek (1993)]. Az arginin élesztősejtbejuttatásáért feltételezhetően a GAP1 gén által kódolt általános aminosav-permeáz [Jauniaux ás Grenson (1985)] vagy a CAN1 gén által kódolt arginin-permeáz [Hoffmann (1985)] a felelős. A Saccharomyces cerevisiae-ben az arginint a CÁRI gén terméke, az argináz karbamiddá és omitinné bontja le [Middelhoven (1964); Sumrada és Cooper (1982)].

A DUR1,2 gén kettős funkciójú karbamid-karboxiláz - allofanát-hidroláz enzimet kódol (Durl,2; karbamid-amidoliáz), amely a karbamidot ammóniává és széndioxiddá bontja le. Az enzimben elkülönülten kódolt, zöld algákból származó karbamid-karboxiláz funkció a következő reakciót katalizálja: ATP + karbamid + CO₂ = ADP + foszfát + karbamid-1-karboxilát [EC 6.3.4.6; szisztematikus elnevezés: karbamid:széndioxid-ligáz (ADP-t képző); egyéb elnevezések: ureáz (ATP-hidrolizáló), karbamid-karboxiláz (hidrolizáló); ATP-karbamid amidoliáz; CAS regisztrációs szám: 9058-98-4; Roon és mtsai. (1970); Roon és Levenberg (1972); Sumrada és Cooper (1982)]. Az enzimben szintén elkülönülten kódolt, zöld algákból származó allofanát-hidroláz funkció a következő reakciót katalizálja: karbamid-1-karboxilát + jj₂O = 2 CO₂ + 2 NH₃ [EC 3.5.1.54; szisztematikus elnevezés: karbamid- 1-karboxilát-amidohidroláz; egyéb elnevezések: allofanát-liáz; CAS regisztrációs szám: 79121-96-3; Matiz és mtsai. (1982); Roon és mtsai. (1972); Sumrada és Cooper (1982)].

A Saccharomyces cerevisiae DUR1,2 génje a szőlőmustban jelen lévő előnyben részesített nitrogénforrások által nitrogén katabolit elnyomásnak („nitrogen catabolite repression”, NCR) van kitéve [Genbauffe és Cooper (1991)]. A le nem bontott karbamidot az élesztősejtek az erjedő szőlőmustba választják ki. A kiválasztott karbamid a mustban reakcióba léphet az etanollal, aminek eredményeként etil-karbamát keletkezik. Ez a vegyület számos kísérleti állatban különféle jó- és rosszindulatú daganatokat volt képes előidézni [Mirvisch (1968)], így az emberi egészségre potenciálisan veszélyes anyagnak tekinthető.

• · · ·· ·· ·· ··

-2Egy bizonyos szempontból a találmány azzal a felismeréssel függ össze, hogy a Saccharomyces cerevisiae karbamid-karboxiláz és allofanát-hidroláz aktivitást kódoló DUR1,2 génjének nitrogén katabolit repressziója módosításával szabályozható az erjedő szőlőmust, bor vagy desztillált ital karbamid-koncentrációja. Ennek megfelelően a találmány tárgyát egy szempontból karbamidbontó enzimatikus aktivitást kódoló, fermentációs körülmények között expresszált gén nitrogén katabolit repressziójának csökkentése érdekében transzformált élesztőgomba-törzsek képezik. Az élesztőgomba-törzs például a karbamidbontó enzimatikus aktivitást hordozó kódoló szekvenciát magában foglaló rekombináns nukleinsavval, vagy a karbamidbontó enzimatikus aktivitás fermentációs körülmények közötti expressziójához adaptált promoterrel transzformálható. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a Saccharomyces cerevisiae DUR1.2 promoterrel és kódoló szekvenciákkal homológ, természetes vagy módosított szekvenciák alkalmazására kerül sor. A találmány szerinti élesztőgomba-törzsek és nukleinsavak például fermentált alkoholos italok, pl. bor és egyéb fermentációs termékek előállítására vehetők igénybe.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírását ismertetjük.

Az 1. ábrán a DUR1,2 génnek a DUR1,2 kódoló szekvenciája kezdeténél végződő 5’ régiója látható. Az ábrán bemutatott információ a Saccharomyces cerevisiae Π. kromoszóma teljes közzétett kromoszóma-szekvenciájából származik (Genbank LOCUS NC 001134, ACCESSION NC_001134, REGION: komplement (635670..643177), VERSION NC 001134, GI: 14270686; Feldmann, H., Aigle, M., Aljinovic, G., Andre, B., Baclet, M. C., Barthe, C., Baur, A., Becam, A. M., Biteau, N., Boles, E. és mtsai.: „Complete DNA sequence of yeast chromosome II”, EMBO J. 13, 5795 (1994); Goffeau, A., Barrell, B. G., Bussey, H., Davis, R. W„ Dujon, B., Feldmann, H., Galibert, F., Hoheisel, J. D., Jacq, C., Johnston, M., Louis, E. J., Mewes, H. W., Murakami, Y., Philippsen, P., Tettelin, H. és Oliver, S. G.: „Life with 6000 genes”, Science 274, 546 (1996)].

A 2. ábrán a DUR1,2 gén 5’ régiója DUR1,2 ATG kezdőkodonnál végződő részének szekvenciája látható. Két feltételezett NCR elem GATAA(G) boxot (az egyik a -54 - -58 pozícióban, a másik a -320 - -324 pozícióban található), valamint néhány feltételezett TATAA boxot kiemeltünk az ábrán.

A 3. ábrán a DUR1,2 transzkripciójának és transzlációjának a DUR1,2 expressziós kazettával transzformált élesztőgomba sejtben megfigyelhető fokozódását mutatjuk be. (A) A DUR1,2 cDNS-t tartalmazó (2. sáv), valamint azt nem tartalmazó (1. sáv) transzformált GVY400 sejtek DUR1.2 expresszióját a teljes RNS DUR1,2 elleni, a³²P-dATP jelzett próbával végzett Northem-blot elemzesevel hasonlítottuk össze. RNS feltöltő standardkent HHFI • · · ·* ·· ·· · ♦

-3kódoló 4-es hisztont alkalmaztunk. (B) A DUR1,2 cDNS-t tartalmazó (3. sáv), valamint azt nem tartalmazó (2. sáv) transzformált GVY400 sejtek karbamid-amidoliáz expresszióját a transzformánsokból kivont összes proteinben jelen lévő biotinizált proteinek westem-blot elemzésével tettük láthatóvá. A kimutatást tormaperoxidázhoz kötött streptavidinnel végeztük, a kemilumineszcenciát röntgenfilmen tettük láthatóvá. Molekulatömeg-markerként (1. sáv) nagy molekulatömegű biotinizált standardokat (5 pg/sáv) alkalmaztunk.

A 4. ábrán a PJC1 előállítása érdekében a DUR1.2 gén Di/TRISEC eljárással [Dietmaler és Fabry (1995)] pHVX2 plazmidba klónozásának sematikus ábrázolása látható. A Saccharomyces cerevisiae TCY 1-böl standard eljárásokkal genomi DNS-t állítottunk elő [Ausubel és mtsai. (1995)]. A DUR1.2 gén kódoló szekvenciáját ExTaq (Takara) DNS-polimerázt alkalmazó PCR-rel amplifikáltuk. A gén 5’ végéhez a 5TTAAAAAAATGACAGTTAGTTCCGATACA-3, a 3’ végéhez pedig a 5TCGAAAAAGGTATTTCATGCCAATGTTATGAC-3’ láncindítót alkalmaztuk. A tervezett kezdőkodont és a végkodon komplementer szekvenciáját megvastagítva jelöltük. Az amplifíkációs termék T4 DNS-polimerázzal történő kezelésével néhány nukleotidot eltávolítottunk a 3’ szegélyező végről. Az enzim 3’-5’ exonukleáz aktivitását a kívánt időben megfelelő nukleotidok hozzáadásával állítottuk le. A pHVX2 plazmidot [Volschenk és mtsai. (1997)] EcoRI és BglII restrikciós enzimekkel hasítottuk, majdE¹. coli polimeráz I Klenow fragmensével kezeltük. A restrikciós helyeket az inszert klónozásával kompatíbilis szekvenciák nyerése érdekében dATP és dGTP jelenlétében részlegesen betöltöttük.

Az 5. ábra a phleomicin rezisztencia gén kazetta DUR1.2 gént tartalmazó (pHVX2ként vagy pRURl,2-ként jelölt) pJCl-be történő klónozását ábrázolja sematikusan. A (pHVX2phleo-ként vagy pDURl,2phleo-ként jelölt) pJC2 kialakításához standard rekombináns eljárásokat alkalmaztunk [Ausubel és mtsai. (1995)].

A 6. ábra a pJC2/DURl,2phleo jelzésű (az ábrán pDURl,2phleo-ként feltüntetett) plazmid sematikus szerkezetét tartalmazza. A plazmid a pJC2phleo vektorból származó többkópiás, episzomális Saccharomyces cerevisiae-E. coli ingázóplazmid, amelyben a DUR1.2 gén az élesztőgomba foszfoglicerát kináz (PGK1) gén szabályozó (promoter és terminátor szekvenciái) közé inszertáltan található. A LEU2 marker lehetővé teszi a leucin tekintetében auxotróf transzformált elesztogomba sejtek szelekcióját. A plazmid magaban foglalja ezen kívül a konstitutív TEF1 élesztőgomba promoter és a CYC1 élesztőgomba terminátor által szabályozott Tn5Ble gént. Az ezt a kazettát tartalmazó élesztősejtek phleomicin rezisztensek. E pozitív szelekciós marker alkalmazása különösen olyan ipari élesztőgombatörzsek esetében előnyös, amelyek nem hordoznak auxotróf markereket.

-4A 7. ábra a találmány szerinti transzformált élesztőgombának a tápközegbeli karbamid koncentráció csökkentésére vonatkozó képességét szemléltető grafikon. ADUR1.2 kromoszóma lokusznál megszakított haploid laboratóriumi élesztőgombatörzset pJC2/DURl,2phleo plazmiddal vagy DUR1.2 gént nem tartalmazó pJC2phleo plazmiddal transzformáltuk. Az említett mutáns törzs alkalmazásával a törzs tulajdonságai az endogén karbamid amidoliáz aktivitás miatti háttérreakció kiküszöbölésével vizsgálhatók. A transzformált sejteket 0,1% glutamint tartalmazó minimális tápközegben tenyésztettük, kinyertük, majd friss tápközeg beoltására használtuk. Egy óra elteltével a tápközeghez 33 mg/L karbamidot adtunk. Ezután a tenyészetből kétóránként egyenlő mennyiségeket távolítottunk el, a sejteket üveggyöngyökkel roncsoltuk, majd a sejttörmeléket centrifugálással távolítottuk el. A begyűjtött felülúszóban az enzimeket hővel inaktiváltuk, majd megállapítottuk a karbamid mintabeli mennyiségét. Ezzel az eljárással egy időben állapítható meg az intracellulans es extracellulans karbamid mennyisége, amivel elkülöníthető a sejtek által felvett és metabolizált karbamid mennyisége. A tenyészetek növekedési fázisát a 600 nm-en mutatott abszorbancia rendszeres meghatározásával ellenőriztük. Standard eltérés n = 6. A pJC2phleo-val transzformált laboratóriumi törzzsel beoltott tápközeg karbamid koncentrációját teli körökkel jelöltük. A pJC2/DURl,2phleo-val transzformált laboratóriumi törzzsel beoltott tápközeg karbamid koncentrációját teli négyzetekkel jelöltük. Az üres körökkel jelölt görbe a pJC2phleo törzs esetében 600 nm-en mért abszorbanciát mutatja be. Az üres négyszögekkel jelölt görbe a pJC2/DURl,2phleo törzs esetében 600 nm-en mért abszorbanciát mutatja be. A bal oldali Y tengely a karbamid koncentrációt ábrázolja mg/L-ben. A jobb oldali Y tengely a 600 nm-en mért abszorbanciát ábrázolja. Az X tengelyen a beoltás után eltelt órák számát tüntettük fel.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

A találmány különböző szempontokból gének módosításával és rekombináns gének alkalmazásával kapcsolatos. Ebben az összefüggésben a „gén” kifejezést általános definíciójának megfelelően használjuk, ami nukleinsav-szekvenciák működőképesen kapcsolt csoportját jelöli. A találmány szerinti megoldás szempontjából egy gén módosítása a génben működőképesen kapcsolt állapotban lévő szekvenciák bármelyikének módosítását magában foglalhatja. A „működőképesen kapcsolt” kifejezés alatt azt értjük, hogy az adott szekvenciák kívánt funkciójuk ellátása, pl. génexpresszió elősegítése vagy módosítása érdekében közvetlenül vagy közvetve kölcsönhatásba lépnek egymással. A működőképesen kapcsolt szekvenciák kölcsönhatása pl. a szekvenciákkal kölcsönhatásba lépő proteineken keresztül valósulhat meg.

Egy gén expressziója jellemzően a gén egy szakasza által kódolt polipeptid előállítását foglalja magában. Ez a folyamat jellemzően legalább két lépésből áll: a kódoló szekvencia ·«· ·· ·· ·* ♦·

-5transzkripciója mRNS-sé, amely önálló biológiai szereppel is rendelkezhet, illetve az mRNS egy részének transzlációja polipeptiddé. Bár a transzkripció és transzláció folyamata még nem teljesen ismert, általánosan elfogadott nézet szerint a DNS-szekvencia mRNS-sé történő transzkripcióját a DNS számos régiója szabályozza. Mindegyik régió meghatározott sorrendben lévő bázisok [adenozin (A), timidin (T), citidin (C) és guanidin (G)] sorozatából áll.

Az egy génben rendszerint jelen lévő régiók közé tartozik a promoter szekvencia, amelynek egy régiója hatására az RNS-polimeráz és az egyéb transzkripciós faktorok kapcsolatba lépnek a DNS promoter szegmensével. Az RNS-polimeráz rendszerint a promoter átmeneti szakasza felett haladva éri el a transzkripciós kezdőhelyet, amely az mRNS szintézisének megkezdésére utasítja. Az RNS-polimeráz feltételezhetően megfelelő távolságban, pl. 20-30 bázissal a transzkripciós kezdőhelyen túl kezdi meg az mRNS szintézisét. Az előzőekben említett szekvenciákat összefoglaló néven a gén promoter régióinak nevezzük, amelyek magukban foglalhatnak a génexpressziót módosító egyéb elemeket is. Az ilyen összetett promoterek tartalmazhatnak a gén indukciójában vagy repressziójában szerepet játszó egy vagy több szekvenciát is.

A találmány leírásában „promoter” alatt egy adott nukleotid-szekvencia transzkripcióját a kívánt helyen, időben és mértékben elősegíteni vagy módosítani képes nukleotid-szekvenciát értünk, amely transzkripciót szabályozó régió az adott szekvenciával működőképesen kapcsolt állapotban van. A transzkripciót szabályozó régió és az adott szekvencia „működőképesen kapcsolt állapotban van”, ha a szekvenciák közötti funkcionális kapcsolat lehetővé teszi a transzkripciót szabályozó régió számára az adott szekvencia transzkripciójának elősegítését vagy módosítását. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a működőképesen kapcsolt állapot elérése érdekében a transzkripciót szabályozó régió az adott szekvenciával megegyező szálon helyezkedik el. A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban a transzkripciót szabályozó régió az adott szekvenciától 5’ irányban helyeződik. Ezekben a megvalósítási módokban a transzkripciót szabályozó régió az adott szekvencia mellett közvetlenül 5’ pozícióban helyeződhet, vagy közöttük köztes szekvenciák is előfordulhatnak. A találmány egyes megvalósítási módjaiban az adott szekvenciától 3’ irányban is helyeződhetnek transzkripciót szabályozó szekvenciák. Az adott szekvencia és a transzkripciót szabályozó régió működőképes kapcsolata a transzkripciós szabályozó régióhoz kapcsolódó megfelelő molekulák (pl. transzkripciós aktivátor proteinek) jelenlétét is igényelheti. Ennek megfelelően a találmány tárgyát képezik azon megvalósítási módok is, amelyekben in vitro vagy in vivo jelen vannak ilyen molekulák.

······ · * : ··: .··. . ·. . ’· ·« · ·· ·· *· ·*

-6Az RNS-polimeráz által mRNS-sé transzkriptáit DNS-szekvencia rendszerint proteinné nem transziáit szekvenciával (más néven 5’ nem transziáit véggel) kezdődik, ami riboszómához kötődhet. Ez a nem transziáit szekvencia (CAP) a gén transzkripciója után is kialakítható. Az mRNS keresztülhalad a riboszómán, amíg egy „kezdőkodon” nem következik. A kezdőkodon rendszerint három bázisból álló sorozat, ami leggyakrabban AUG, de esetenként a GUG kodon is elindíthatja a transzlációt.

A génben a következő szekvencia rendszerint a kódoló vagy strukturális szekvencia. A kezdőkodon hatására a riboszóma peptidkötésekkel aminosavakat kezd egymáshoz kapcsolni, amivel metioninnal kezdődő polipeptidet hoz létre. A polipeptid így kialakított, úgynevezett amino terminálisáról a metionin később más enzimekkel eltávolítható. Az AUG kezdőkodont követő bázisokat hármas egységenként csoportosítjuk, ezeket kodonoknak nevezzük. A kezdőkodon által meghatározott ún. „leolvasási fázis” alakítja ki a bázisok hármas csoportosítását. Mindegyik kodon egy meghatározott aminosav polipeptidhez kapcsolásáért felel. A kodonok közül három (UAA, UAG és UGA) jellemzően végkodon. Amikor egy ilyen kodon eléri a riboszóma transzlációs helyét, az elkészült polipeptid leválik a riboszómáról és a megelőző aminosav lesz a polipeptid karboxi terminálisa.

Egy monocisztronos génben a végkodon 3’ oldalán helyeződő mRNS régiót 3’ nem transziáit régiónak nevezzük. Ez a régió az mRNS transzkripciót követő feldolgozásáért, stabilitásáért és/vagy transzportálásáért felel. Ez a régió tartalmazhat az mRNS molekulához jelentős számú adenozint kapcsoló enzim által felismert poliadenilációs jelet is, aminek hatására poli-A farok jön létre.

A találmány szerinti különféle gén és nukleinsav-szekvenciák rekombináns szekvenciák is lehetnek. A „rekombináns” kifejezés valami rekombinációjára (újra összeállítására) utal, egy bizonyos nukleinsav-szerkezettel kapcsolatban ez a kifejezés egy adott ponton összekapcsolt, vagy molekuláris biológiai eljárásokkal előállított nukleinsav-szekvenciákból álló molekulát jelöl. Egy proteinnel vagy polipeptiddel kapcsolatban a „rekombináns” kifejezés molekuláris biológiai eljárásokkal előállított rekombináns nukleinsav szerkezet expresszálásával kapott protein vagy polipeptid molekulára utal. A genetikai összetétellel kapcsolatban a „rekombináns” kifejezés a természetes körülmények között előforduló szülői genomokban nem megtalálható új allélkombinációt tartalmazó ivarsejtre, utódra, sejtre vagy genomra utal. A rekombináns nukleinsav szerkezetek magukban foglalhatnak olyan nukleotid-szekvenciát, amely a természetben egyébként hozzá nem kötődő, vagy más helyen kötődő nukleinsavszekvenciához kapcsolódik, vagy e kapcsolódás érdekében módosítva lett. Egy nukleinsavr ··: .··. »4« *« ·· *· *·

-7szerkezettel kapcsolatban tehát a „rekombináns” megnevezés a nukleinsav molekula emberi beavatkozással, génsebészeti úton történt módosítására utal.

A rekombináns nukleinsav-szerkezetek például transzformációval juttathatók be egy gazdasejtbe. Ezek a rekombináns nukleinsav szerkezetek azonos vagy eltérő gazdasejtből izolált szekvenciák lehetnek.

A rekombináns nukleinsav-szekvenciák a gazdasejt eredeti transzformációja vagy későbbi rekombinációs és/vagy javítási események eredményeként a gazdasejt genomjába integrálódhatnak. A rekombináns szekvenciák alternatív módon extrakromoszomális elemként is fennmaradhatnak. Ezek a szekvenciák kezdő törzsként pl. transzformált élesztőgombatörzset alkalmazó, pl. mutációval, tömeges tenyésztéssel vagy protoplaszt fúzióval végzett törzs fejlesztési eljárásokban reprodukálhatók. Az előbbiek eredményeként keletkezett, a találmány szerinti rekombináns szekvenciát megőrzött törzseket is rekombinánsnak nevezzük.

A találmány különböző megvalósítási módjaiban a nukleinsav-molekulák kémiai úton is szintetizálhatok pl. a következő eljárások alkalmazásával: 4598049 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Itakura és mtsai.; 4458066 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Caruthers és mtsai.; 4401796 és 4373071 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat, Itakura. Az ilyen szintetikus nukleinsavak a kifejezés itt használt értelmében eredendően „rekombinánsak” (a molekula alkotórészei egymást követő lépésekben történő összeállításának eredményei).

Transzformációnak nevezzük azt a folyamatot, amelynek során egy adott sejt genetikai anyagát egy vagy több exogén nukleinsav sejtbe juttatásával (inkorporálásával) módosítjuk. Az élesztőgomba sejtek például számos protokoll szerint transzformálhatok [Gietz és mtsai. (1995)]. A transzformáció végbemehet az exogén nukleinsavnak a sejt genetikai anyagába történő inkorporálásával, vagy a sejt endogén genetikai anyagának az exogén nukleinsav hatására bekövetkező megváltozása eredményeként. A transzformánsok vagy transzformált sejtek olyan sejtek, vagy olyan sejtek leszármazottai, amelyek exogén nukleinsav felvétele következtében genetikai módosuláson estek át. Ezek a kifejezések a transzformált sejtek azon utódaira is vonatkoznak, amelyekben a kívánt genetikai módosulás megőrződött az egymást követő generációk során, függetlenül attól, hogy a későbbi generációk sejtjeiben esetleg egyéb mutációk vagy változások is előfordulhatnak.

Alternatív szempontokból a találmány tárgyát különféle termékek, pl. bor, sör, tészta, etanol vagy ecet fermentációs előállítására használt élesztőgombatörzsek képezik. Alternatív megvalósítási módokban a találmány tárgyát Saccharomyces cerevisiae élesztő gombatörzsek, Saccharomyces bayanus élesztőgombatörzsek vagy Schizosaccharomyces élesztőgombatör·««··· ♦ * *4· ·» «· ·* ··

-8zsek képezik. A borkészítés során alkalmazott transzformált gazdasejtek lehetnek például Saccharomyces cerevisiae vagy Schizosaccharomyces törzsek, pl. a Bourgovin (RC 212 Saccharomyces cerevisiae), az ICV D-47 Saccharomyces cerevisiae, a 71B-1122 Saccharomyces cerevisiae, a K1V-1116 Saccharomyces cerevisiae, az EC-1118 Saccharomyces bayanus, a Vinl3, a Vin7, az N96 és a WE352 törzs. Élesztőgombatörzsek számos kereskedelmi forrásból beszerezhetők, ilyen például a Lallemand Inc. (Montreal, Quebec, Kanada).

A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban karbamidbontó aktivitással (ilyen pl. a DUR1,2 karbamid-karboxiláz és allofanát-hidroláz aktivitása) rendelkező endogén vagy heterológ enzimek alkalmazására kerülhet sor. Ezek az enzimek homológok lehetnek a DUR1,2vel, vagy a DUR1,2 releváns aktivitással rendelkező részeivel.

A szekvenciák (pl. a natív DUR1,2 protein vagy natív DUR1,2 nukleinsav-szekvencia és a találmány szerinti megoldásban alkalmazott alternatív protein vagy nukleinsav) közötti homológia mértéke kifejezhető az optimálisan egymás alá rendezett szekvenciák százalékos azonossága, vagyis a szekvenciák tökéletesen egyező pozícióinak előfordulása alapján. A szekvenciák azonosságának összehasonlítása érdekében történő optimális egymás alá rendezés számos algoritmussal elvégezhető, ilyenek pl. Smith és Waterman helyi azonosság (local homology) algoritmusával [Smith és Waterman: Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)], Needleman és Wunsch azonossági (homology) egymás alá rendezési algoritmusával [Needleman és Wunsch: J. Mól. Bioi. 48, 443 (1970)], Pearson és Lipman hasonlóságkeresési (search for similarity) eljárásaival [Pearson és Lipman: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)], valamint az említett algoritmusokon alapuló számítógépes programokkal [a Wisconsin Genetics programcsomag GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA és TFASTA programjaival; Genetics Computer Group, Madison, WI]. A szekvencia-azonosság alapján történő egymás alá rendezés megvalósítható pl. a BLAST algoritmus közzétett alapbeállításaival is [Altschul és mtsai.: J. Mól. Bioi. 215, 403 (1990)]. A BLAST elemzések elvégzéséhez szükséges szoftver beszerezhető pl. a National Center for Biotechnology hiformation-től (interneteim: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)· A BLAST algoritmus során először magas pontszámú szekvencia párok („high scoring sequence pairs”, HSP) azonosítására kerül sor olyan, kérdéses szekvenciabeli W hosszúságú rövid szavak azonosítása alapján, amelyek egy adatbázis-szekvenciabeli azonos hosszúságú szóval egymás alá rendezve azzal megegyeznek, vagy azonosságuk meghalad egy bizonyos pozitív T határértéket. A T a szomszéd szó határértéket jelöli. A kezdeti szomszédos szó találatok alapján indul meg a hosszabb HSP-k keresése. Amíg a kumulatív egymás alá rendezési pontszám növelhető, addig a „szöveg” („word hits”) mindkét szekvencia mindkét irányába meghosszabbodik. A „szöveg” meghosszabbítása bármely

-9irányba leáll, ha az összesített egymás alá rendezési pontszám maximálisan elért értékétől X mennyiséggel csökkent, ha az összesített pontszám egy vagy több negatív pontszámot eredményező egymás alá rendezésnek köszönhetően nullára, vagy az alá csökken, vagy ha a rendezés elérte a szekvenciák bármelyikének végét. A BLAST algoritmus W, T és X paraméterei az egymás alá rendezés érzékenységét (sensitivity) és sebességét határozzák meg. A BLAST program a következő alapbeállításokkal futtatható: szóhossz (wordlength, W) =11; BLOSUM62 pontozómátrix [Heinkoff és Heinkoff: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)]; egymás alá rendezés (B) = 50; várható érték (expectation, E) = 10 (amely alternatív megvalósítási módokban 1, 0,1, 0,01, 0,001 vagy 0,0001 is lehet, bár a 0,1-nél lényegesen nagyobb E értékek nem azonosítanak funkcionálisan hasonló szekvenciákat, mégis hasznos lehet az alacsonyabb szignifíkanciájú találatok vizsgálata is, így pl. rövid hasonló régiókban 0,1-10 közötti E értékek is használhatók) M = 5, N = -4, mindkét szál összehasonlítása. Proteinek összehasonlítására a BLASTP program vehető igénybe, a következő alapbeállításokkal: G = 11 (hézagnyitás büntetőpontja); E = 1 (hézagnövelés büntetőpontja); E = 10 (várható érték, ebben a beállításban várhatóan 10, a definiált S egymás alá rendezési pontszámmal azonos vagy annál jobb találat adódik véletlenszerűen a keresett adatbázissal egyező méretű adatbázisban; az E érték a keresés sztringensségének módosítása érdekében növelhető vagy csökkenthető); W = 3 (szóhossz, a BLASTN esetében az alapbeállítás 11, más BLAST programoknál 3). A BLOSUM mátrix az egymás alá rendezés mindegyik pozíciójához egy valószínűségi értéket rendel az adott szubsztitúció rokon proteinek konszenzus blokkjaiban történő előfordulásának gyakorisága alapján. A BLAST 2.0 program alapbeállításában a BLOSUM62 helyettesítési mátrixot alkalmazza (hézag jelenlét büntetőpont =11; bázisonként! hézag büntetőpont = 1; lambda arányszám = 0,85). A BLOSUM62 alternatívájaként számos egyéb mátrix is igénybe vehető, ilyenek pl. a PAM30 (9, 1, 0.82); a PAM70 (10, 1, 0,87); a BLOSUM80 (10, 1, 0,87); a BLOSUM62 (11, 1, 0,82) és a BLOSUM 45 (14, 2, 0,87). A BLAST algoritmus alkalmazása esetén két szekvencia statisztikai hasonlóságának egyik mérőszáma a legkisebb összes valószínűség [„smallest sum probability”, P(N)], ami két nukleotid vagy aminosav-szekvencia közötti véletlenszerű egyezés valószínűségét adja meg. A találmány alternatív megvalósítási módjaiban nukleinsav- vagy aminosav-szekvenciákat alapvetően azonosnak tekintünk, ha a vizsgált szekvenciák esetében a p(N) kisebb, mint kb. 1, előnyösen kisebb, mint kb. 0,1, előnyösebben kisebb, mint kb. 0,01 és legelőnyösebben kisebb, mint kb. 0,001.

A találmány egyes megvalósítási módjaiban a találmány szerinti nukleinsav-szekvenciák alapvetően megegyezhetnek pl. a DUR1,2 proteinnel vagy a DUR1,2 nukleinsav-szekvenciával. Az említett szekvenciák alapvető azonossága megnyilvánulhat az optimálisan egy„ * »· -«··*·*· , 4 v . · f ··» _β ·«·· V·

I <4 ·» - - · . ^Λ · * · y - · «>··»

- 10más alá rendezett szekvenciák százalékos azonosságában, ami nagyobb mint 50%, 80-100% közötti, legalább 80%, legalább 90% vagy legalább 95% lehet. A gént célzó szubsztrátok esetében ez az azonosság a szubsztrát és a cél szekvencia egy-egy részére vonatkozik, ahol az azonosság foka elősegítheti a homológ párképzést és rekombinációt és/vagy javítást. Két nukleinsav-szekvencia alapvető azonosságát jelzi továbbá, ha a két nukleinsav-szekvencia mérsékelten sztringens, vagy előnyösebben sztringens körülmények között hibridizál egymással. Filterhez kötött szekvenciával mérsékelten sztringens körülmények között történő hibridizálás végbemehet például 0,5 M NaHPO₄, 7% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 1 mM EDTA jelenlétében 65°C-on, amit 0,2 X SSC/0,1% SDS-ben 42°C-on végzett mosás követ [Current Protocols in Molecular Biology, 1. kötet, p. 2.10.3, szerk.: Ausubel és mtsai., kiad.: Green Publishing Associates Inc. és John Wiley & Sons Inc., New York (1989)]. Filterhez kötött szekvenciával sztringens körülmények között történő hibridizálás végbemehet például 0,5 M NaHPO₄, 7% SDS, 1 mM EDTA jelenlétében 65°C-on, amit 0,1 X SSC/0,1% SDS-ben 68°C-on végzett mosás követ [Id. Ausubel és mtsai., fentebb (1989)]. A hibridizációs körülmények a kérdéses szekvenciától függően ismert eljárások szerint módosíthatók [Tijssen: „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, I. rész, 2. fejezet, kiad.: Elsevier, New York (1993)]. Általánosságban a szteingens körülményeket úgy választják meg, hogy adott ionerősség és pH mellett a hőmérséklet 5°C-kal alacsonyabb legyen, mint a meghatározott szekvencia olvadáspontja. Sztringens hibridizálás során a mosás pl. 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105 vagy 120 percig is tarthat.

Szakember számára jól ismert, hogy egy polipeptid, pl. a DUR1,2 szerkezetében a pepiid biológiai funkciójának lényeges mértékű megváltoztatása nélkül bizonyos módosítások és változtatások végezhetők, így biológiailag egyenértékű polipeptid nyerhető. A találmány egyik megvalósítási módjában a karbamid-karboxiláz és/vagy allofanát-hidroláz aktivitású proteinek a natív DUR1,2 szekvenciától konzervatív aminosav-helyettesítésekben különböző proteinek is lehetnek. A „konzervatív aminosav-helyettesítés” alatt egy protein egy adott helyén a releváns funkció lényeges mértékű csökkenése nélkül elvégezhető aminosav-helyettesítést értünk. Az ilyen jellegű változtatások során a hasonló aminosavak helyettesítése az oldallánc szubsztituensek relatív hasonlósága, pl. méretük, töltésük, hidrofóbitásuk, hidrofilitásuk stb. alapján történhet, a helyettesítések proteinfunkcióra gyakorolt hatása rutineljárásokkal vizsgálható.

A találmány bizonyos megvalósítási módjaiban konzervatív aminosav-helyettesítések végezhetők az aminosavak hasonló (± 2,0 határon belüli) hidrofilitási értéke alapján, ahol a

- 11 következő aminosav kb. -1,6-os hidropatikus indexű Tyr (-1,3) vagy Pro (-1,6) lehet. Amint az a kitanítás részét képező 4554101 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban részletesen szerepel, az egyes aminosavakhoz a következő hidrofílitási értékek rendelthetők: arginin (+3,0); lizin (+3,0); aszparaminsav (+3,0); glutaminsav (+3,0); szerin (+0,3); aszparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glicin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5); alanin (-0,5); hisztidin (0,5); cisztein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); izoleucin (-1,8); tirozin (-2,3); fenilalanin (-2,5); triptofán (-3,4).

A találmány alternatív megvalósítási módjaiban hasonló (± 2,0 értékű) hidropatikus indexszel rendelkező aminosavak között is konzervatív aminosav-helyettesítés végezhető. Ezekben a megvalósítási módokban hidrofóbitásuk és töltési jellemzőik alapján minden egyes aminosavhoz meghatározott hidropatikus index rendelhető: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cisztein/cisztin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (0,4); treonin (-0,7); szerin (-0,8); triptofán (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); hisztidin (-3,2); glutaminsav (-3,5); glutamin (-3,5); aszparaginsav (-3,5); aszparagin (-3,5); lizin (-3,9); arginin (-4,5).

A találmány alternatív megvalósítási módjaiban konzervatív aminosav-helyettesítések végezhetők azonos osztályba tartozó aminosavak kicserélésével is. Az aminosavakat nem poláris, savas, bázikus és semleges osztályokba sorolhatjuk. Nem poláris aminosavak: Alá, Val, Leu, He, Phe, Trp, Pro, Met; savas aminosavak: Asp, Glu; bázikus aminosavak: Lys, Arg, His; semleges aminosavak: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gin, Tyr.

A találmány alternatív megvalósítási módjaiban konzervatív aminosav-helyettesítések végezhetők az aminosavak hidrofilitásának vagy hidrofóbitásának, méretének, térfogatának vagy töltésének figyelembe vételével. Főként oldalláncaik tulajdonságai alapján általánosságban hidrofób és hidrofil aminosavakat különböztethetünk meg. Az Eisenberg és mtsai. által felállított normalizált konszenzus hidrofóbitási skála alapján egy hidrofób aminosav nullánál nagyobb hidrofóbitási értékkel, míg egy hidrofil aminosav nullánál kisebb hidrofílitási értékkel rendelkezik [Eisenberg és mtsai.: J. Mól. Bio. 179, 125 (184)]. Genetikailag kódolt hidrofób aminosavak a Gly, az Ala, a Phe, a Val, a Leu, az He, a Pro, a Met és a Trp, míg genetikailag kódolt hidrofil aminosavak a Thr, a His, a Glu, a Gin, az Asp, az Arg, a Ser és a Lys. Nem genetikailag kódolt hidrofób aminosav pl. a t-butilalanin, nem genetikailag kódolt hidrofil aminosavak pl. a citrullin és a homocisztein.

A hidrofób és hidrofil aminosavak oldalláncaik jellemzői alapján tovább osztályozhatók. Aromás aminosavnak nevezzük pl. a legalább egy aromás vagy heteroaromás gyűrűt tartalmazó oldallánccal rendelkező hidrofób aminosavakat, amelyekben a gyűrű egy vagy több,

- 12pl. -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO₂, -NO, -NH₂, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR, -C(O)NRR szubsztituenst tartalmaz, ahol R jelentése egymástól függetlenül (Ci-Ce) alkil, szubsztituált (Ci-Có) alkil, (Ci-Ce) alkenil, szubsztituált (CiC₆) alkenil, (Ci-C₆) alkinil, szubsztituált (Ci-C₆) alkinil, (C₅-C₂o) aril, szubsztituált (C5-C20) aril, (C₆-C₂₆) alkaril, szubsztituált (C6-C₂ó) alkaril, 5-20 tagú heteroaril, szubsztituált 5-20 tagú heteroaril, 6-26 tagú alkheteroaril vagy szubsztituált 6-26 tagú alkheteroaril. Genetikailag kódolt aromás aminosavak a Phe, a Tyr és a Trp.

Az apoláris aminosav olyan hidrofób aminosav, amely élettani pH-értéken töltéssel nem rendelkező oldalláncot tartalmaz, az oldalláncbeli kötésekben a két atom egyforma mértékben osztozik egy elektronpáron (vagyis az oldallánc nem poláris). Genetikailag kódolt apoláris aminosavak a Gly, a Leu, a Val, az He, az Alá és a Met. Az apoláris aminosavak között megkülönböztethetünk úgynevezett alifás aminosavakat, amelyek alifás szénhidrogén oldalláncot tartalmazó apoláris aminosavak. Genetikailag kódolt alifás aminosavak például az Alá, a Leu, a Val és az He.

A poláris aminosav olyan hidrofil aminosav, amely élettani pH-értéken töltéssel nem rendelkező oldalláncot tartalmaz, egy oldalláncbeli kötésben azonban két atom nem egyforma mértékben osztozik egy elektronpáron. Genetikailag kódolt poláris aminosavak a Ser, a Thr, az Asn és a Gin.

A savas aminosavak olyan hidrofil aminosavak, amelyekben egy oldallánc pKa értéke 7 alatti. A savas aminosavak élettani pH értéken egy hidrogénion elvesztése miatt jellemzően negatív töltésű oldalláncokkal rendelkeznek. Genetikailag kódolt savas aminosavak az Asp és a Glu. A bázikus aminosavak olyan hidrofil aminosavak, amelyekben egy oldallánc pKa értéke 7 feletti. A bázikus aminosavak élettani pH értéken egy hidrogénion felvétele miatt jellemzően pozitív töltésű oldalláncokkal rendelkeznek. Genetikailag kódolt savas aminosavak az Arg, a Lys és a His.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fenti osztályozás nem abszolút érvényű, továbbá egy aminosav egynél több kategóriába is besorolható. Mindezeken túl az aminosavak ismert viselkedésük, vagy meghatározott vizsgálati eljárásokban mutatott kémiai, fizikai vagy biológiai tulajdonságaik, továbbá korábban azonosított aminosavakkal történő összehasonlításuk alapján is osztályozhatók.

A találmány különböző megvalósítási módjaiban egy gazdasejt karbamidbontó aktivitása úgy módosítható, hogy az fermentációs körülmények között, pl. bor fermentációs körülmények között egy kívánt mértéket érjen el. A „fermentációs körülmények” vagy „fermentáló körülmények” kifejezések olyan körülményekre vonatkoznak, amelyek között egy szervezet,

- 13 pl. a Saccharomyces cerevisiae fermentációs úton termel energiát, vagyis olyan tenyésztési feltételeket jelölnek, amelyek mellett fermentáció megy végbe. Általánosságban definiálva a fermentáció azon anaerob reakciók összessége, amelyek oxigén hiányában energiát szolgáltatnak a mikroorganizmusok növekedéséhez. A fermentáció során az energiát a szubsztrát-szintü foszforiláció fedezi. A fermentáció során egy szerves vegyület (az energiaforrás) elektrondonorként szerepel, míg egy másik szerves vegyület az elektronakceptor szerepét tölti be. A fermentációra számos szerves szubsztrát felhasználható, ilyenek pl. a szénhidrátok, az aminosavak, a purinok és a pirimidinek. Egy bizonyos szempontból a találmány tárgyát etilalkoholt eredményező szénhidrát-fermentációra képes szervezetek, pl. élesztőgombák képezik.

A bor fermentációja során a mustbeli tenyésztési feltételek a kezdőanyagként használt gyümölcslén alapulnak. Például a szőlőlé fő összetevői a (jellemzően kb. 75-150 g/L) glükóz, a (jellemzően 75-150 g/L) fruktóz, a (jellemzően 2-10 g/L) borostyánkősav, a (jellemzően kb. 1-8 g/L) almasav és a (jellemzően kb. 0,2-2,5 g/L) szabad aminosavak. Ugyanakkor gyakorlatilag bármely gyümölcsből vagy cukortartalmú növényi nedvből alkoholos ital állítható elő olyan eljárással, amelynek fő reakcióját szénhidrát etil-alkohollá történő alakítása képezi.

A borélesztő jellemzően kb. 4-4,5 közötti pH-tartományban nő és fermentál, minimálisan 0,85-ös vízaktivitást (vagy kb. 88% körüli relatív páratartalmat) igényel. A fermentáció kezdődhet spontán, vagy megindítható korábban fermentál musttal történő beoltással, utóbbi esetben a szőlőlé kb. 10⁶-10⁷ cfú/mL mennyiségű élesztőgombával oltható be. Az élesztőpopuláció elszaporítása céljából a must levegőztethető is. A fermentáció megkezdődése után a gyors széndioxid termelés általában fenntartja az anaerob viszonyokat. A fermentáció hőmérséklete általában 10°C és 30°C közötti, időtartama néhány naptól néhány hétig terjedhet.

Egy szempontból a találmány tárgyát fermentált alkoholos italok etil-karbamát koncentrációját csökkenteni képes élesztőgombatörzsek képezik. A találmány szerinti megoldás alkalmazásával például kevesebb mint 40 pg/L (ppb), 35 pg/L, 30 pg/L, 25 pg/L, 20 pg/L, 15 pg/L, 10 pg/L vagy 5 pg/L (vagy 50 pg/L és 1 pg/L közötti bármely egész érték) etil-karbamátot tartalmazó borok állíthatók elő. A találmány szerinti alternatív megoldásokban a találmány dúsított borok vagy desztillált szeszek állíthatók elő, amelyek etil-karbamát koncentrációja kevesebb, mint kb. 500 pg/L, 400 pg/L, 300 pg/L, 200 pg/L, 150 pg/L, 100 pg/L, 90 pg/L, 80 pg/L, 70 pg/L, 60 pg/L, 50 pg/L, 40 pg/L, 30 pg/L, 20 pg/L vagy 10 pg/L (vagy 500 pg/L és 10 pg/L közötti tetszőleges egész érték).

A találmány szerinti alternatív megoldási módokban a találmány tárgyát szőlőmustbeli csökkentett karbamid-koncentráció fenntartására képes élesztőgombatörzsek képezik. A must

- 14karbamid-koncentrációja ebben az esetben 15 mg/L, 10 mg/L, 5 mg/L, 4 mg/L, 3 mg/L, 2 mg/L vagy 1 mg/L lehet.

Egy szempontból a találmány tárgyát egy fermentáló szervezet fermentációs körülmények között kívánt mértékű karbamidbontó aktivitással rendelkező természetes mutánsainak kiválasztására alkalmas eljárások képezik. így például olyan élesztőgombatörzsek szelektálhatok, amelyekből hiányzik a DUR1,2 NCR. Élesztőgombák mutációs és szelekciós protokolljaival kapcsolatban lásd Mortimer és mtsai. 6140108 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratát. Ezekben az eljárásokban élesztőtörzset mutagén anyaggal, például etil-metánszulfonáttal, salétromossawal vagy hidroxilaminnal kezelnek, amelyek bázispár-helyettesítésen alapuló mutációkat hoznak létre. A megváltozott karbamidbontó aktivitással rendelkező mutánsok pl. megfelelő tápközegre oltást követően szkrínelhetők.

A találmány egy alternatív megvalósítási módjában egy gazdasejt karbamidbontó aktivitása mértékének megváltoztatására hely irányított mutagenezissel kerül sor. így például hely irányított mutagenezis vehető igénybe az NCR közvetítő elemek DUR1.2 promoterből történő eltávolítására. A natív DUR.1,2 promoterben meglévő GATAA(G) boxok (2. ábra) például kitörölhetők, vagy szubsztitúcióval módosíthatók. A találmány egy megvalósítási módjában például egyik vagy mindkét GATAA boksz módosítható a G T-re cserélésével, aminek következtében a szekvencia TATAA-ra változik. A hely irányított mutagenezis eljárásai megtalálhatók többek között a következő szakirodalmi közleményekben: Rothstein (1991); Simon és More (1987); Winzeler és mtsai. (1999); Negritto és mtsai. (1997). Alternatív megvalósítási módokban az NCR módosítása érdekében a Saccharomyces cerevisiae-b&a. az NCR közvetítésében szerepet játszó Gln3p-t és Gatlp-t kódoló gének is mutációnak vethetők alá.

Egy találmány szerinti élesztőgombatörzs karbamidbontó relatív enzimatikus aktivitása a nem transzformált szülőtörzsével összehasonlítva állapítható meg. így például olyan találmány szerinti transzformált élesztőgombatörzsek szelektálhatok, amelyek a szülőtörzsnél fermentációs körülmények között nagyobb mértékű karbamidbontó aktivitással rendelkeznek, illetve amelyek megegyező fermentációs körülmények között lényegesen nagyobb aktivitással rendelkeznek, mint a szülőtörzs, pl. a szülőtörzs aktivitásának legalább 150%-ával, 200%-ával, 250%-ával, 300%-ával, 400%-ával vagy 500%-ával bírnak. Hasonlóképpen, a találmány szerinti rekombináns nukleinsavak által kódolt vagy expresszált enzimek aktivitása is a forrásukul szolgáló nem rekombináns szekvenciákkal történő összehasonlítással adható meg.

Egy szempontból a találmány tárgyát a DUR1,2 polipeptid szabályozott expresszióját elősegítő heterológ promoter szekvencia ellenőrzése alatt álló DUR1,2 kódoló szekvenciát vagy annak homológját tartalmazó rekombináns nukleinsav-molekulát magában foglaló vekf ····· · · • · · · * · a ·« ··

- 15tor képezi. E vektor a Saccharomyces cerevisiae DUR1,2 nyitott leolvasási fázisát a rekombináns DUR1,2 gén expresszióját szabályozó expressziós kazettát tartalmazó plazmidba történő inszertálásával állítható elő. A rekombináns molekula egy kiválasztott élesztőgombatörzsbe juttatásával megváltozott karbamidbontási aktivitással rendelkező transzformált törzs hozható létre. A találmány alternatív megvalósítási módjaiban egy gazdaszervezetben, pl. Saccharomyces cerevisiae-ben a natív DUR1,2 kódoló szekvencia homológ expressziója a natív promoter egy másik promoterre cserélésével is megoldható. Az endogén kódoló szekvenciát alkalmazó rekombináns expressziós kazetták előállításához egyéb szabályozó elemek is felhasználhatók. A rekombináns gének vagy expressziós kazetták egy gazdaszervezet, pl. Saccharomyces cerevisiae kromoszomális DNS-ébe is integrálhatók.

A találmány szerinti különböző megoldásokban alkalmazott promoterek lehetnek megfelelő natív Saccharomyces cerevisiae promoterek is, amilyen pl. a PGK1 vagy a CARI promoter. Az említett promoterek további szabályozó elemekkel, pl. PGK1 és CÁRI terminátorokkal együtt is alkalmazhatók. A találmány szerinti megoldásban meghatározott körülmények, pl. bor előállítására alkalmas körülmények között karbamidbontó aktivitás, pl. DUR1,2 aktivitás expressziójának elősegítése érdekében kiválasztott vagy megszerkesztett számos natív vagy rekombináns promoter alkalmazható.

Egy szempontból a találmány tárgyát a karbamidbontó aktivitását módosító rekombináns nukleinsavval transzformált gazdaszervezetet, pl. élesztőgombatörzset alkalmazó, szénhidrát fermentálására, pl. bor fermentálására szolgáló eljárás képezi. így pl. bor előállítására alkalmas élesztőgombatörzsben a DUR1,2 gén NCR-jének módosításával fokozható a karbamid ammóniát és széndioxidot eredményező bomlása. Ebből a szempontból a találmány szerinti megoldásban a szőlőmust említett élesztőgomba törzzsel történő fermentációja korlátozott mennyiségű etil-karbamát képződését eredményezheti.

A találmány egy megvalósítási módjában standard rekombináns eljárásokat [Ausubel és mtsai. (1995)] alkalmazva phleomicin rezisztencia gén kazetta élesztőgomba ingázóvektorba klónozásával a pJC2phleo jelű plazmidot alakítottuk ki. A DUR1,2 gén nyitott leolvasási fázisát PCR-rel amplifikáltuk, majd a pJC2phleo plazmidba klónoztuk, ezáltal a pJC2/DURl,2phleo vektort hoztuk létre. A pJC2/DURl,2phleo vektor többkópiás episzomális Saccharomyces cerevisiae-E. coli ingázóplazmid, amelyben a DUR1.2 kódoló szekvencia az élesztőgomba foszfoglicerát kináz (PGK1) gén szabályozó szekvenciái közé inszertálva, a promoter és a terminátor szekvenciákkal működőképes állapotban kapcsoltan van jelen. A LEU2 marker lehetővé teszi a leucin tekintetében auxotróf transzformált élesztőgomba sejtek szelekcióját. A plazmid magában foglalja ezen kívül a konstitutív TEF1 élesztőgomba promoI ····· · · • · · ·· ·· ·· ··

- lő- tér és a CYC1 élesztőgomba terminátor által szabályozott Tn5Ble gént is. A transzformánsok in vivo vizsgálatával a tápközeg karbamid-koncentrációja alapján kimutattuk, hogy a pJC2phleo-val transzformált sejtekéhez képest a pJC/DURl,2phleo plazmiddal transzformált Saccharomyces cerevisiae sejtek karbamidbontó kapacitása lényeges mértékben fokozódott.

Bár az előzőekben a találmány számos megvalósítási módját bemutattuk, a találmány szerinti megoldáson átlagos képzettségű szakember a találmány hatókörének elhagyása nélkül sokféle módosítást és adaptációt végezhet. Ilyen módosítás például a lényegében ugyanazon eredmény elérése érdekében ismert egyenértékű összetevők helyettesítése a találmány szerinti megoldás bármely szempontjában. A leírásban a számtartományok magukban foglalják a tartomány feltüntetett szélső értékeit. A találmány szerinti megoldás részletes leírásában a „tartalmaz” kifejezést tágabb értelmű meghatározásként, a „többek között, de nem kizárólag tartalmaz” kifejezéssel gyakorlatilag megegyező értelemben alkalmaztuk; a „tartalmazza” szó jelentése is ennek megfelelő. A szakirodalmi hivatkozások idézése nem jelenti annak elismerését, hogy a hivatkozások a találmányt előzményét jelentenék. Minden idézett közlemény, ideértve többek között a szabadalmakat és szabadalmi beadványokat teljes egészében, külön-külön a kitanítás részét képezi. A találmány hatóköre kiteljed a találmány összes megvalósítási módjára, valamint azoknak az előzőekben példák és ábrák segítségével illusztrált változataira.

A szekvencialista kötetlen szövegeinek fordításai

1. és 2. azonosítószámú szekvencia:

Mesterséges szekvencia = láncindító

- 17Referencialista

Az alább felsorolt dokumentumok teljes terjedelmükben a kitanítás részét képezik:

Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, JA, and Struhl, K„ editors. 1999. Short Protocols in Molecular Biology, 4^m Ed. John Wiley and Sons, N.Y.

Ausubel,FM, Brent,R, Kingston,RE, Moore,DD, Seidman,JG, Smith,JA, Struhl, K eds. Current Protocols in Molecular Biology. 1987-2000. John Wiley and Sons, Inc.

Dietmaier, W. and Pabry S. (1995). Protocol: Dl/tri nucleotide Sticky End Cloning. Boerhinger Mannheim PCR Application Manual.

Genbauffe, F.S., and Cooper, T.G. 1991. The urea amidolyase (DUR1,2) gene ot Saccharomyces cerevisiae. DNASeq. 2(1): 19-32.

Giete,RD, Schiestl.RH, WillemsAR, Woods,RA: Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast 11: 355-360 (1995)

Henschke, P.A., and Jiranek, V. 1993. Yeasts: metabolism of nitrogen compounds. In G.H. Fleet, editor. Wine Microbiology and Biotechnology. 77-164, Switzerland: Harwood Academic Publishers.

Hoffmann, W. 1985 Molecular characterization of toe CAN1 locus in Saccharomyces cerevisiae: a transmembrane protein without N-terminal hydrophobic signal sequence. J. Biol. Chern. 260(21): 11831-11837.

Jauniaux, J.C., and Grenson, M. 1990. GAP1, the general amino add permease gene of Saccharomyces cerevisiae: nucleotide sequence, protein similarity with the other bakers yeast amino acid permeases, and nitrogen catabolite repression. Eur. J. Biochem. 190(1): 39-44.

Mate, G.S., Haas, EM and Gastric, PA Purification and properties of the allophanate hydrolase from Chlamydomonas reinhardii. Biochim. Biophys. Acta 714 (1982)486-491.

- 18Middelhoven, W.J. 1964. The pathway of arginine breakdown in Saccharomyces cerevisiae. Biochem. Biophys. Acta. 156: 650-652.

Mirvish, S.S. 1968. The carcinogenic action and metabolism of urethan and n-hydroxyurethan Adv. Cancer Res. 11: M2.

Negritto.MT, Wu,X, Kuo,T, Chu,S, Bailis,AM: Influence of DNA sequence identity on efficiency of targeted gene replacement. Mol Cell Biol 17:278-286 (1997).

Roon, R.J. and Levenberg, B. ATP-Urea amidolyase (ADP) (Candida utilis). Methods Enzymol. 17A (1970) 317-324.

Roon, R.J. and Levenberg, B. Urea amidolyase. I. Properties erf the enzyme from Candida utilis. J. Biol. Chern. 247 (1972)4107-4113.

Rothstein.R: Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast Methods Enzymol. 194:281-301 (1991).

Simon, JR, Moore,PD. Homologous recombination between single-stranded DNA and chromosomal genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biochem 7, pp. 2329-2334.1987.

Sumrada, R.A., and Cooper, T.G. 1982. Urea carboxylase and allophanate hydrolase are components erf a multifunctional protein in yeast. J. Biol. Chern. 257(15): 9119-9127.

Vofechenk, H„ M. Viljoen, M. Grobler, J. Bauer, F.F., Subden, R.E., Denayrolles, M., Lonvaud, A, Young, R.A. & H.J.J. van Vuuren. 1997. Engineering a pathway for malate degradation in Saccharomyces cerevisiae. Nature Biotechnol. 15:253-257.

Winzeler.EA, Shoemaker,DD, AstromoffA Liang,H, Anderson,K, Andre,B, Bangham,R, Benito,R, Boeke.JD, Bussey,H, Chti,AM, Connelly,C, Davis,K, Dietrich,F, Dow.SW, El Bakkoury,M, Foury.F, Friend.SH, Gentalen,E, Giaever.G, Hegemann.JH, Jones,T, Laub,M, Liao,H, Davis,RW: Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science 285: 901 906 (1999).

Claims (20)

1. ·· ·· ·«

   SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Élesztőgombatörzs, amely az élesztőgombatörzs által fermentációs körülmények között expresszált karbamidbontó enzimatikus aktivitás nitrogén katabolit repressziójának csökkentése céljából transzformálva lett.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti élesztőgombatörzs, amely karbamidbontó enzimatikus aktivitásként karbamid-karboxiláz vagy allofanát-hidroláz aktivitás csökkentése céljából lett transzformálva.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti élesztőgombatörzs, amely karbamidbontó enzimatikus aktivitást kódoló szekvenciát magában foglaló rekombináns nukleinsawal lett transzformálva.
4. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti élesztőgombatörzs, amely karbamidbontó enzimatikus aktivitás fermentációs körülmények közötti expressziójának elősegítésére adaptált promotert tartalmazó rekombináns nukleinsawal lett transzformálva.
5. 5. A 3. igénypont szerinti élesztőgombatörzs, amely egy DUR1,2 nyitott leolvasási fázissal homológ nyitott leolvasási fázist tartalmazó kódoló szekvencia felhasználásával lett transzformálva.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti élesztőgombatörzs, amely fermentációs körülmények között fermentáció eredményeként szénhidrátból etilalkoholt állít elő.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti élesztőgombatörzs, amely Saccharomyces cerevisiae törzs.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti élesztőgombatörzs, amely fermentációs körülmények között 30 pg/L-nél alacsonyabb etilkarbamát koncentrációjú bor előállítását eredményezi.
9. 9. A leírásban, a példákban és az ábrák segítségével bemutatottakkal lényegében megegyező élesztőgombatörzs.
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti élesztőgombatörzs alkalmazása fermentált alkoholos ital előállítására.
11. 11. Eljárás fermentált alkoholos ital előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti élesztőgombatörzset fermentációs körülmények között tartjuk.
12. 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eljárással fermentált alkoholos ital.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárással fermentált alkoholos ital, amely bor vagy desztillált alkoholos ital.
14. 14. A 13. igénypont szerinti fermentált alkoholos ital, amely bor, és amelynek etilkarbamát koncentrációja kevesebb, mint 30 pg/L.
15. 15. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti élesztőgombatörzs alkalmazása fermentált termék előállítására.
16. 16. Eljárás fermentált termék előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti élesztőgombatörzset fermentációs körülmények között tartjuk.
17. 17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti eljárással fermentált termék.
18. 18. Eljárás élesztő gombatörzs módosítására, azzal jellemezve, hogy az élesztőgombatörzs által fermentációs körülmények között expresszált karbamidbontó enzimatikus aktivitás nitrogén katabolit repressziójának csökkentése céljából transzformáljuk az élesztőgombatörzset.
19. 19. Izolált nukleinsav, amely optimális egymás alá rendezés esetén egy natív DUR1.2 promoter szekvenciával legalább 95%-ban megegyező promoter szekvenciát tartalmaz, amely gazdasejtben fermentációs körülmények között nem segíti elő egy vele működőképesen kapcsolt kódoló szekvencia nitrogén katabolit represszióját.
20. 20. Izolált nukleinsav szekvencia, amely optimális egymás alá rendezés esetén egy natív DUR1,2 kódoló szekvenciával legalább 80%-ban megegyező kódoló szekvenciát tartalmaz, amely kódoló szekvencia olyan promoter szekvenciával van működőképesen kapcsolt állapotban, amely gazdasejtben fermentációs körülmények között nem mediálja a kódoló szekvencia nitrogén katabolit represszióját.

    A meghatalmazott:

    DANUBIA

    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

    dr. Pethő Árpád szabadalmi ügyvivő ♦ PCT/CA02/01719

    1. ábra

    KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY A