JPH0771472B2

JPH0771472B2 - 尿素非生産性実用醸造酵母

Info

Publication number: JPH0771472B2
Application number: JP20787489A
Authority: JP
Inventors: 康次郎高橋; 勝ひこ北本; 勝也五味; 佳緒子小田
Original assignee: 国税庁長官
Priority date: 1989-08-14
Filing date: 1989-08-14
Publication date: 1995-08-02
Anticipated expiration: 2010-08-02
Also published as: JPH0372869A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、アルギナーゼ遺伝子破壊による尿素非生産性
実用醸造酵母に関する。

更に詳細には、本発明は、実験室株酵母（１倍体）では
なく、実際の飲食品の醸造に用いられている酵母（実用
醸造酵母と呼ぶ:2倍体、もしくはそれ以上の高次倍数
体）のアルギナーゼ遺伝子（CAR1）の破壊による尿素非
生産性酵母に関する。

本発明の形質転換体である尿素非生産性実用醸造酵母
は、アルギニンをオルニチンと尿素に分解する酵素であ
るアルギナーゼ（EC3.5.3.1）を欠失しているため、尿
素の生成が抑制されている。従って、尿素から誘導され
る発癌物質カルバミン酸エチルの生成を抑えることが可
能である。

つまり、本発明の形質転換体を用いることによって、ア
ルコール発酵速度及び品質は親株と変らず、しかもカル
バミン酸エチルを全く含まない酒類等を製造することが
できる。従って、本発明は酒類、アルコール、その他の
醸造食品の製造に大きく貢献するものである。

（発明の背景及び従来技術とその問題点）一般に、各種醸造飲食品（清酒、焼酎、果実酒、ビー
ル、ウイスキー、ブランデー、醤油、味噌、老酒等）の
製造醪中には、含量にはかなりの差があるが、尿素が存
在し、それがエタノールと反応して発癌物質であるカル
バミン酸エチル（ウレタン）を生成させるため、世界中
で問題になっている。

従来、尿素を減少させる方法としては、アルギニンの酵
母菌体への取込みに関与するアルギニン透過酵素の欠失
した変異株を用いる方法、又は、尿素をアンモニアと炭
酸ガスに分解するウレアアミドリアーゼ作用の脱抑制変
異株を用いる方法がとられてきたが、これらの菌株を用
いても従来の約半量までしか尿素量を減らすことはでき
ない。しかも、これらの変異株は親株に比べ一般に発酵
が鈍いため、他の酵母に汚染され易く確実な効果が得ら
れにくいという問題があった。

本発明者らは、先に、特願昭63−268097で、アルギナー
ゼ遺伝子破壊又は置換により尿素非生産性酵母を育種し
たが、宿主の酵母には、形質転換体を選択するためのマ
ーカーを付与し易い実験室株（１倍体）を用いており、
かつ、１倍体のため、実用的に発酵速度が遅いなどの問
題がある。

通常、清酒、焼酎、果実酒、ビール、ウイスキー、ブラ
ンデー、老酒等の製造に用いられている実用醸造酵母
（サッカロマイセス・セレビシアエ）は倍数性が２倍体
（もしくはそれ以上の高次倍数体）である他、各酒類の
製造で要求される性質、例えば、清酒や焼酎でのアルコ
ール耐性、果実酒での亜硫酸耐性、ビールでの低温発酵
性等を備えており、実験室株とは大きく異なっている。

また、形質転換体の選択のためのマーカーを付与するに
当り、１倍体である実験室株に対しては、人工突然変異
による栄養要求性マーカーを付与することができる。

しかしながら、実用醸造酵母は、倍数性が２倍体（もし
くはそれ以上の高次倍数体）であるので、その醸造特性
を損なうことなく劣性変異であるこのような栄養要求性
を取得することはできなかった。

更にまた、実用醸造酵母においては、その倍数性が２倍
体（もしくはそれ以上の高次倍数体）であるため、目的
とする遺伝子を破壊又は置換するには、２本（又はそれ
以上）の染色体上の同一遺伝子を破壊又は置換する必要
があり、上記選択マーカーの遺伝子を凍結した複数個の
破壊又は置換用プラスミドの構築が必要となる。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、上記したように各種の点において実験室
株とは全く異なる実用醸造酵母において、尿素非生産性
を有するすぐれた実用醸造酵母を創製する目的でなされ
たものである。

上記目的を達成するために各方面から検討した結果、実
用醸造酵母の選択マーカーとして、薬剤（例えば、オリ
ゴマイシン、ジェネティシン、エリスロマイシン、フレ
オマイシン、８−アザグアニン、ナイスタチン、スルフ
ォメチュロンメチル等）耐性や重金属（銅、亜鉛、コバ
ルト、水銀等）耐性、キラー蛋白分泌性等の優性マーカ
ーを用いる必要を認めた。

本発明者らは、以上の観点から、実用醸造酵母の選択マ
ーカーに薬剤耐性としてジェネティシン（G418）耐性と
スルフォメチュロンメチル（SM）耐性をとりあげ、各々
の耐性遺伝子を凍結したアルギナーゼ遺伝子（CAR1）破
壊用プラスミドの構築を目的として鋭意研究を行った。

その結果、本発明者らは、サッカロマイセス・セレビシ
アエのアルギナーゼをコードするDNA断片をクローン化
し、コーティングリージョンの中間に選択マーカーとし
てのSM耐性遺伝子（SMR1）を凍結したプラスミドＡを構
築するのに成功した。同様にして、選択マーカーとして
のG418耐性遺伝子（G418^r）を連結したプラスミドＢを
構築するのにも成功した。

そしてこのようにして作成された新規プラスミドを用い
て尿素非生産性実用醸造酵母を創製するために、研究を
更に行った結果、該酵母の創製に成功した。

すなわち、二倍体の実用醸造酵母を形質転換する方法と
して、（１）プラスミドＡ又はプラスミドＢの何れか１
個のプラスミドを用いて形質転換する（２）プラスミド
ＡとプラスミドＢを用い二段階で形質転換する（３）プ
ラスミドＡとプラスミドＢの混合物を用いて一回で形質
転換するの３方法が考えられるが、（１）の方法は極
めて効率が悪く（２）の方法、次に（３）の方法が効率
よく形質転換体を得ることができ、この方法により、実
用醸造酵母の２つの染色体上に在るアルギナーゼ遺伝子
の破壊された形質転換体が得られることを見出したので
ある。このようにして得られた尿素非生産性実用醸造酵
母は、従来知られておらず、新規である。

本発明は、このようにして新規尿素非生産性実用醸造酵
母を創製するのに成功しただけにとどまらず、得られた
形質転換体を用いて酒類の製造を行ったところ、尿素の
生成は全く認めず、従って、カルバミン酸エチルの生成
がなく、かつ、アルコール発酵速度及び酒質も親株と変
らないことも確認し、これらを総合的に検討し、有用性
を確認し、遂に本発明を完成するに至った。

以下、本発明について詳細に説明する。

（詳細な説明）本発明に用いたゲノムDNAの供与体は、サッカロマイセ
ス・セレビシアエであり、具体的には協会７号酵母（市
販品）である。

本菌体からの染色体DNAの抽出法及び染色体ジーンライ
ブラリーの作製法は、例えばAgric．Biol．Chem.,Vol.5
3,431〜436,（1989）に記載された方法に準じて行われ
る。

上記で得られた染色体ジーンライブラリーから当該遺伝
子の単離に当っては、サッカロマイセス・セレビシアエ
のアルギナーゼ遺伝子のDNA配列（Ｊ．Bacteriol Vol.1
60,1078〜1087（1984））に基づいて合成したDNAオリゴ
マーを作成し、それをプローブに用いてプラークハイブ
リダイゼーションを行い、サッカロマイセス・セレビシ
アエのアルギナーゼ遺伝子のDANをクローニングする。

遺伝子破壊のためのプロスミドＡ及びＢの作製は次のよ
うにして行う。

プラスミドＡの作製は、アルギナーゼ遺伝子由来の0.9k
bpのHind III−Pst Iフラグメントを組込んだプラスミ
ドpUC18−HPのBgl II−Kpn I断片を除き、その代りにpW
X509より切り出したSM耐性遺伝子を含む約3.5kbpのBamH
I−Kpn IフラグメントをつないでプラスミドＡ（pCAT
−2D）を作製する（第１図）。

また、プラスミドＢの作製は、アルギナーゼ遺伝子を含
む約6kbpのBamH I−BamH IフラグメントをpUC119に組込
んだプラスミド（pCAR112）にYCpG11より切り出したG41
8耐性遺伝子を含む1.7kbpのPvu II−Pvu IIフラグメン
トをつないでプラスミドＢ（pCAT−1E、pCAT−1F）を作
製する（第２図）。

形質転換においては、実用醸造酵母は２倍体（もしくは
高次倍数体）なので、２本の染色体上の当該遺伝子を破
壊する必要がある。まず、最初に、プラスミドＡをAva
Iサイトで切断し、直鎖状のDNAにして実用醸造酵母を形
質転換し、１本の染色体上の当該遺伝子が破壊されSM耐
性の生じた形質転換体を選択する。次に、プラスミドＢ
をBamH Iサイトで切断して得られた約7kbpの直鎖状DNA
を用いて形質転換体を再度形質転換し、残りの染色体上
の当該遺伝子が破壊され、G418耐性の生じた形質転換体
を選択する。この様な二段階の形質転換を行って目的の
形質転換体を得る。

なお、アルギナーゼ遺伝子が破壊されたかどうかの判定
は、サザンブロッティングにより確認すると共に、次の
方法でアルギナーゼ活性を測定し、活性の有無を調べ
る。

形質転換体及び親株をアルギナーゼ非誘導培地（イース
トナイトロゲンベース（Ｎフリー）0.17％、グルコース
２％、（NH₄）₂SO₄5mM）又はアルギナーゼ誘導培地（非
誘導培地にアルギニン塩酸塩10mM添加）に２×10⁷セル/
mlとなるよう植菌し、30℃、４時間振とう培養後集菌洗
浄する。この菌体を10mMトリス・塩酸バッファー（pH7.
0）にけん濁し、ガラスビーズで破壊する。

このホモジネートの15000rpm、10分間の遠心上清を酵素
液とし、アルギニンを基質として反応させ生成する尿素
を東洋醸造（株）製尿素キットで定量し、アルギナーゼ
活性とする。次に、この形質転換体を用いて常法どお
り、清酒や果実酒、ビール、焼酎、ウイスキー、ブラン
デー、老酒等の酒類を製造することにより、尿素を全く
含まない酒類の製造ができ、ひいてはカルバミン酸エチ
ルの生成しない酒類の製造が可能となる。

次に実施例及び応用例を示す。

実施例１サッカロマイセス・セレビシアエのアルギナ
ーゼ遺伝子のクローニング；清酒酵母協会７号（サッカロマイセス・セレビシアエ）
の染色体DNAのジーンライブラリー（作製法はAgric.Bio
l.Chem.,Vol.53,431〜436（1989）に記載された方法に
よった）を用いてプラークハイブリダイゼーションによ
りアルギナーゼ遺伝子を含むクローンの選択を行った。
この一連の操作は常法（Molecular Cloning,P63〜67,Co
ld Spring Harbor Laboratory（1982））によった。

プラークハイブリダイゼーションに用いた２つのプロー
ブは次の配列をもつ合成オリゴマー（32〜35で）を³²P
で放射能標識したものである。

プローブ NR−１５′TGGACAAATACCCCGATGCTGGTCTTTTATGG ３′ NR−２５′ATGTAACCCTGATCTGGCTATTCATGATATCCATG
３′ 約20,000個のプラークよりNR−１、NR−２プローブのど
ちらにもハイブリダイゼーションする１個のクローンを
選択できた。

これらのクローンの中に挿入されているサッカロマイセ
ス・セレビシアエ協会７号由来のDNA断片をBamH Iで完
全消化したところ、２つのプローブでハイブリダイズす
る5.6kbのDNA断片を得た。このDNA断片をE.coliのプラ
スミドベクターpUC119に連結したプラスミドpCAR112を
得て、これから当該挿入断片の制限酵素切断地図を作製
した（第２図のpCAR112）。

実施例２アルギナーゼ遺伝子破壊のためのプラスミド
の作製；プラスミドＡの作製法：第２図記載のpCAR112から制限
酵母Hind IIIとPst Iで切り出されるアルギナーゼ遺伝
子由来の0.9kbpのDNA断片をpUC18にT4DNAリガーゼを用
いて連結し、pUC18−HPを作製した。これに選択マーカ
ーを付与するために、ベクターpWX509よりSMR1をコード
する約3.5kbpのBamH I−Kpn Iフラグメントを制限酵母
で切り出し、pUC18−HPのBal II−Kpn Iフラグメントを
制限酵素で切り出した後にT4DNAリガーゼを用いて連結
し、アルギナーゼ破壊用プラスミドＡ（pCAT−2D）を作
製した。

プラスミドＢの作製法:pCAR112のBal II−Bal IIフラグ
メントを制限酵素で切り出した後、Klenow処理で平滑化
し、アルカリフォスファターゼで脱燐酸を行う、これに
YCpG11のG418rをコードしている1.7kbpのPvu II−Pvu I
Iフラグメントを制限酵母で切り出し、T4DNAリガーゼを
用いて連結し、プラスミドＢ（pCAT−1E及びPvu II−Pv
u IIフラグメントの挿入方向が反対のpCAT−1F）を作製
した。

実施例３アルギナーゼを生産しないサッカロマイセス
・セレビシアエの作製；アルギナーゼ遺伝子破壊用プラスミドＡおよびＢを用
い、サッカロマイセス・セレビシアエ清酒用酵母協会９
号（２倍体）（市販品）の形質転換をItoらの方法（J.B
acteriol.,Vol.153,163（1983））に準じて行った。

即ち、清酒酵母（協会９号）を100mlのYPD培地（１％酵
母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、pH5.
3）中30℃で振とう培養し、対数増殖期に遠心によって
集菌した。TE緩衝液で洗浄後、同じ緩衝液に２×10⁸セ
ル/mlの濃度でけん濁した。この0.5mlを小試験管に移
し、等容量の0.2M酢酸リチウム溶液を添加し、１時間30
℃で振とうした。この中から0.1mlを1.5mlのエッペンド
ルフチューブに移し、プラスミドＡ（pCAT−2D）を制限
酵素Ava Iで処理し直鎖状にしたDNA溶液（１μg/μｌ）
10μｌを加え、30℃、30分間静置培養した。

次に、殺菌した70％ PEG−4000 150μｌを加えよく混
合した。30℃で１時間静置した後、エッペンドルフチュ
ーブを42℃の恒温水中で５分間静置後、菌体を直ちに室
温まで冷却し、室温で殺菌水で洗浄し、SM含有培地（イ
ーストナイトロゲンベース（W/Oアミノ酸）0.67％、グ
ルコース２％、寒天２％、スルフォメチュロンメチル10
0ppm（オートクレーブ後添加）で生育する90菌株（９個
／μgDNA）の形質転換体を得た。

次に、この中の３株に対し、プラスミドＢ（pCAT−1F）
を制限酵素BamH Iで処理し、直鎖状にしたDNA溶液（0.8
μg/μｌ）10μｌを加え、上述のプラスミドＡの場合と
同様の方法で形質転換を行った。

得られた210株の形質転換株の中から、80株について、
アルギニン含有培地（イーストナイトロゲンベース（Ｎ
フリー）0.17％、グルコース２％、アルギニン塩酸塩20
mM、寒天２％）で生育できず、SM含有培地及びG418含有
培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース
２％、寒天２％、ジェネテシン600ppm（オートクレーブ
後添加））で生育できる56株（７個／μgDNA）を目的株
として単離した。

また、このとき、プラスミドＡ及びＢの混合物（但し、
DNA濃度を各1000μｇ使用）を用いて１回で形質転換株
を取得することも可能であった。この場合選択培地とし
てはSM含有培地で約1000の形質転換体を得、次にこれら
のうちでG418含有培地でも生育できる株（２株）を単離
した。

このようにして得られたアルギナーゼ欠損株（AL−１〜
AL−３）と親株のアルギナーゼ活性及び細胞内尿素等を
第１表に示したが、アルギニンによる誘導培養及び非誘
導培養においても形質転換株はアルギナーゼ活性が認め
られないことから、２本の染色体上のアルギナーゼ遺伝
子が共に破壊された株であることが確認された。

また、細胞内尿素量も親株に比較し、極微量であった。

更に、サザンブロッティングでもアルギナーゼ遺伝子が
破壊されていることを確認した。なお、AL−１株はFERM
Ｐ−10903として微工研に寄託されている。

応用例１形質転換体による酒類の醸造；形質転換体AL−１ FERM Ｐ−10903及び親株（協会９
号）をYPD培地10mlで、30℃、１夜振とう培養後、集菌
洗浄し、第２表に示す仕込配合及び製造条件で総米200g
の清酒仕込を行った。

アルコール発酵経過をCO₂の発生による重量の減少で測
定し、第３図に示した。また、製成酒の尿素含量及び各
種成分を第３表に示した。

この結果、形質転換体AL−１では、アルコール発酵速
度、一般的成分及び官能評価は、親株である協会９号と
ほとんど変らず、しかも尿素を全く含まない清酒の製造
が可能であった。また、火入れ貯蔵後のカルバミン酸エ
チルの生成も全く認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図はアルギナーゼ遺伝子の遺伝子破壊のためのプラ
スミドＡの作製説明図、第２図は同様のプラスミドＢの
作製説明図、第３図は親株と形質転換体のアルコール発
酵の経過図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者小田佳緒子東京都千代田区大手町１丁目３番２号東京国税局鑑定官室内 (56)参考文献欧州特許出願公開286303（ＥＰ，Ａ) Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，1984〔160〕Ｐ．1078−1087

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記に示す、アルギナーゼ遺伝子を破壊す
るための、サッカロマイセス属酵母由来のプラスミドpC
AT−2Dを用い、アルギナーゼ遺伝子を破壊することによ
って得られる尿素非生産性実用醸造酵母。
【請求項２】下記に示す、アルギナーゼ遺伝子を破壊す
るための、サッカロミセス属由来のプラスミドpCAT−1E
及び／又はpCAT−1Fを用い、アルギナーゼ遺伝子を破壊
することによって得られる尿素非生産性実用醸造酵母。
【請求項３】プラスミドpCAT−2D、pCAT−1E及びpCAT−
1Fから選択される１種又は２種以上のプラスミドを用
い、アルギナーゼ遺伝子を破壊することによって得られ
る尿素非生産性実用醸造酵母。