KR101551533B1

KR101551533B1 - 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법

Info

Publication number: KR101551533B1
Application number: KR1020130115682A
Authority: KR
Inventors: 양택호; 송효학; 박종명; 라트나싱
Original assignee: 지에스칼텍스 주식회사
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2015-09-21
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: KR20150035657A; US20160244730A1; US10006008B2; CN105593368A; WO2015046978A1; CN105593368B

Abstract

본 발명은 아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 갖는 효소를 코드하며, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 유전자에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 유전자가 코드하는 단백질에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 단백질의 활성이 억제된 재조합 미생물에 대한 것이다.

Description

2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법{RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED BUTANEDIOL PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING BUTANEDIOL USING THE SAME}

본 발명은 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법에 대한 것이다.

네 개의 탄소와 두 개의 하이드록시기(-OH)를 가지는 알코올의 하나(CH3CHOHCHOHCH3)인 2,3-부탄디올은 합성고무 제조 공정의 원료물질인 1,3-부타디엔(1,3-Butadiene)과 연료 첨가제 및 용매로 사용되는 메틸에틸케톤(Methyl ethyl ketone, MEK)으로 화학적 촉매 전환이 가능하다 (Ji et al., Biotechnol. Adv., 29: 351, 2011). 또한, 2,3-부탄디올은 가솔린(Gasoline)과 혼합하여 octane booster로 적용할 수 있어 산업적으로 매우 중요한 중간체이다(Celinska et al., Biotechnol. Adv., 27: 715, 2009).

2,3-부탄디올은 화학적 합성 공정과 미생물 발효 공정을 통하여 생산할 수 있다. 하지만 상기 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산 가격이 매우 높기 때문에 상업적 규모로의 2,3-부탄디올 생산은 이루어지지 않고 있다. 한편, 최근 미생물 발효 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산 기술의 비약적인 발전과 함께, 화석원료 물질의 급격한 가격 상승과 국제적인 환경오염에 대한 규제가 강화됨에 따라 미생물 발효를 통한 바이오 기반 2,3-부탄디올 생산에 대한 관심과 연구 개발의 중요성이 증대되고 있다.

미생물 발효 공정을 통한 바이오 기반 2,3-부탄디올 생산 연구는 발효 공정 최적화 (온도, pH, 용존산소 등)와 미생물 개발 (미생물 발굴, 생리학적 특성 파악, 돌연변이, 유전자 조작 등) 분야로 나누어서 진행되고 있다. 발효 공정 최적화 측면에 있어서는 2,3-부탄디올을 효율적으로 생산할 수 있는 온도, pH, 용존산소 농도 등 다양한 조건들이 규명되었다 (Ji et al., Bioresour. Technol., 100: 3410, 2009; Nakashimada et al., J. Biosci. Bioeng., 90: 661, 2000; Nakashimada et al., Biotechnol. Lett., 20: 1133, 1998). 하지만 상기 조건에서의 미생물 발효 공정을 통한 2,3-부탄디올 생산은 여전히 생산성(Productivity) 및 수율(Yield)이 낮아 상업 공정에 직접 적용하기 어렵운 것이 사실이다. 또한 발효 과정에서 2,3-부탄디올과 함께 젖산을 포함하는 유기산들(Organic acids)과 에탄올을 포함하는 알코올들(Alcohols)등 다양한 부산물들(By-products)이 생성되는 단점이 있다.

부산물 생성은 바이오 원료물질에 대한 2,3-부탄디올의 수율을 낮출 뿐 아니라 배양액으로부터 2,3-부탄디올 회수 과정에서 막대한 분리 및 정제 비용을 요구한다. 따라서 2,3-부탄디올 생산에 관련된 미생물 개발 연구는 주로 부산물을 감소시키는 방향으로 진행되어 왔다. 대표적으로 Ji 등은 야생형 클렙시엘라 옥시토카 균주에 물리/화학적 돌연변이 방법의 일종인 UV를 노출시켜 부산물인 유기산들의 생성을 일부 억제시키는 것에 성공하였다 (Ji et al., Biotechnol. Lett., 30: 731, 2008). 이와 함께, 이온 주사(Ion beam) 방식을 클렙시엘라 뉴모니에 균주에 적용하여 바이오매스 소모속도를 증가시켜 2,3-부탄디올 생산을 향상시킬 수 있었다 (Ma et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 82: 49, 2009). 선택적 유전자 조작을 통한 부산물 감소 관련 연구에서는, 주요한 부산물의 하나인 젖산(Lactic acid) 생성에 관여하는 유전자(ldhA)를 제거하여 만든 변이 미생물이 일반적인 조건에서 가장 좋은 성능을 보였다. 또한, 부산물인 에탄올의 생성을 저하시키기 위하여 에탄올 생성에 관여하는 유전자 (adhE, aldA)를 제거한 예도 있다 (Ji et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 85: 1751, 2010). 또한, 젖산균 (lactic acid bacteria, LAB)에서 포름산 생성에 관여하는 효소 (pyruvate-formate lyase)의 활성을 저하시킨 예도 있다 (WO2010/037114 A1).

본 발명자들은 2,3-부탄디올의 전환능을 갖는 유전자를 확인하였으며, 상기 유전자의 활성을 저해한 재조합 미생물의 2,3-부탄디올 생성능이 증가하고 생성된 2,3-부탄디올의 소모가 저해되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 갖는 효소를 코드하며, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 유전자가 코드하는 단백질을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 단백질의 활성이 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은, 2,3-부탄디올 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 상기 단백질의 활성이 억제되는 것을 특징으로 하는, 2,3-부탄디올의 생성능이 증가한 재조합 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은,

2,3-부탄디올 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,

아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 가지며, 2,3-부탄디올로의 전환 활성보다 아세토인으로의 전환 활성이 높은 효소가 억제된, 2,3-부탄디올의 생성능이 증가된 재조합 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은,

상기 재조합 미생물을 배양하는 단계;및

상기 배양액으로부터 2,3-부탄디올을 회수하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 생성능이 증가되며, 기생산된 2,3-부탄디올의 소모율이 감소한다. 또한 재조합 미생물의 배양에 따른 아세토인 축적율이 낮다.

도 1은 2,3-부탄디올 생성 균주에서 2,3-부탄디올의 생합성 경로(A) 및 소모 경로(B 및 C)를 나타낸다.
도 2는 클렙시엘라 옥시토카 내에 존재하는 2,3-부탄디올 합성 관련 유전자 오페론을 도식한 것이다.
도 3은 클렙시엘라 옥시토카 내에 존재하는 2,3-부탄디올 합성 관련 유전자의 세포 내 기능을 확인하기 위해 대장균 (E. coli JM109) 발현 재조합 벡터 제작 과정을 도식화한 것이다.
도 4는 재조합 대장균의 회분식 발효 시 2,3-부탄디올 생산능을 나타내며, 도 5는 아세토인 생산능을 나타낸다(●: pBRbudRAB/E. coli JM109, ▲: pBRbudRABC/E. coli JM109, ■: pBRbudRABD/E. coli JM109).
도 6은 M9 최소 배지에서 2,3-부탄디올을 유일 탄소원으로 하여 재조합 클렙시엘라 균주를 성장시킨 결과이며, 도 7는 잔류 2,3-부탄디올의 농도이다(●: KO △ldhA, ▲: KO △dhA △budC, ■: KO △ldhA △dar. ◆: KO △ldhA △budC△dar.)
도 8 내지 11은 재조합 클렙시엘라 균주들을 회분식 발효하여 2,3-부탄디올을 생산한 결과를 나타낸다(도 8: KO △ldhA, 도 9: KO △ldhA △budC, 도 10: KO △ldhA △dar, 도 11: KO △ldhA △budC △dar).

본 발명은 아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 갖는 효소를 코드하며, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 유전자에 대한 것이다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터에 대한 것이다.

또한 본 발명은 상기 유전자가 코드하는 단백질에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 단백질의 활성이 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물에 대한 것이다.

또한 본 발명은, 2,3-부탄디올 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 상기 단백질의 활성이 억제되는 것을 특징으로 하는, 2,3-부탄디올의 생성능이 증가한 재조합 미생물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 가지며, 2,3-부탄디올로의 전환 활성보다 아세토인으로의 전환 활성이 높은 효소가 억제된, 2,3-부탄디올의 생성능이 증가된 재조합 미생물에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

상기 재조합 미생물을 배양하는 단계;및

상기 배양액으로부터 2,3-부탄디올을 회수하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

아세토인과 2,3- 부탄디올의 전환 활성

본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 생성능을 갖는다. 본 발명의 재조합 미생물에서 2,3-부탄디올은 아세토인을 거쳐 생성되며, 또한 2,3-부탄디올은 아세토인으로 전환된다. 이를 아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성, 특히 상호 전환 활성이라 한다.

이와 관련된 2,3-부탄디올의 생합성 경로는 도 1(A)에 기재되어 있다. 한편, 대부분의 2,3-부탄디올 생산 균주들은 2,3-부탄디올을 유일 탄소원으로 이용할 수 있는데, 이 때 2,3-부탄디올는 아세토인을 중간물질로 하여 소모되며, 그 경로는 하기 2 개가 알려져 있다. 이 중 경로 2는 “2,3-부탄디올 cycle”을 통하여 2분자의 2,3-부탄디올이 1분자의 2,3-부탄디올과 2분자의 초산(acetic acid)으로 전환된다.

<경로 1>

2,3-부탄디올 → 아세토인 → 아세트알데히드(acetaldehyde), 아세틸 코엔자임 에이 (Acetyl-CoA) → TCA 경로(도 1(B)).

<경로 2>

2,3-부탄디올 → 아세토인 → 디아세틸 (Diacetyl) → 초산 (acetic acid), AAc (acetylacetoin) → 초산 (acetic acid) 및 ABD (acetylbutanediol)(도 1(C)).

서열번호 12의 염기서열을 갖는 유전자

본 발명은 아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 갖는 효소를 코드하며, 서열번호 12의 염기서열을 갖는 유전자에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터에 대한 것이다. 상기 벡터는 플라스미드 등 당업계에서 일반적으로 사용되는 벡터이면 되고, 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상기 유전자가 코드하는 단백질에 대한 것이다. 상기 단백질은 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 그와 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

재조합 미생물

본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 가지며, 2,3-부탄디올로의 전환 활성보다 아세토인으로의 전환 활성이 높은 효소가 억제된, 2,3-부탄디올의 생성능이 증가된 재조합 미생물이다.

또한 본 발명의 재조합 미생물은 2,3-부탄디올 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서, 서열번호 12의 유전자가 코드하는 단백질의 활성이 억제된 재조합 미생물이다. 상기 서열번호 12의 유전자가 코드하는 단백질은, 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 서열번호 11과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질, AR2 단백질, 또는 AR2와 효소 활성이 90% 이상 동일한 단백질 등이 될 수 있다.

상기 단백질의 활성은 상기 단백질의 발현 억제, 효소 활성 억제 등에 의하여 억제될 수 있다. 예컨대, 상기 단백질의 활성은 단백질을 코드하는 유전자, 예컨대 dar 유전자, 서열번호 12의 유전자, 또는 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있다.

본 발명의 재조합 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 추가로 억제될 수 있다. 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase)는 피루베이트의 락테이트로의 전환을 조절한다. 상기 락테이트 디하이드로게나제를 억제함으로써 피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 억제될 수 있다. 상기 락테이트 디하이드로게나제의 억제는 락테이트 디하이드로게나제의 발현 억제, 락테이트 디하이드로게나제의 효소 활성 억제 등에 의하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldhA를 결실시키거나 상기 유전자에 돌연변이(일부 염기를 변이, 치환 또는 삭제하거나 일부 염기를 도입하여 정상적인 유전자의 발현을 억제시키는 등의 돌연변이)를 일으키거나, 전사 과정 또는 번역 과정에서의 유전자 발현 조절 등, 당업자는 적절한 방법을 선택하여 락테이트 디하이드로게나제를 억제할 수 있다.

2,3-부탄디올 전환 효소는 2,3-부탄디올의 생성과 소모에 관여하는데, 본 발명의 재조합 미생물은 이중 소모 활성이 높은 dar 유전자가 억제되는바, 2,3-부탄디올 생산은 그대로 유지하면서, 생성된 2,3-부탄디올의 소모가 줄어든다. 그러므로2,3-부탄디올의 생산성, 즉 생성능이 증가하게 된다. 또한, 2,3-부탄디올의 생산 시 대표적인 부산물들 중의 하나인 아세토인의 축적 역시 감소하여 분리/정제 공정의 비용을 절감할 수 있다.

상기 재조합 미생물은 2,3-부탄디올의 생성능을 갖는 미생물이다. 상기 재조합 미생물은 클렙시엘라 (Klebsiella) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 엔테로벡터 (Enterobacter) 속으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 클렙시엘라 속이다.

2,3- 부탄디올의 생산 방법

본 발명은 본 발명의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및 상기 배양액으로부터 2,3-부탄디올을 회수하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법에 대한 것이다.

상기 배양은 호기 조건에서 수행되며, 바람직하게는 미세호기적 조건(microaerobic condition)에서 수행된다. 예컨대, 상기 배양은 배양 시 산소, 즉 공기를 공급하면서 수행되며, 구체적인 예로서, 이는 교반을 통하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<재료 및 방법>

클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12133BP △ldhA (KO △ldhA) 균주

젖산 탈수소화 효소 (락테이트 디하이드로게나제, ldhA)가 결실된 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12133BP △ldhA (KO △ldhA) 균주는 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 클렙시엘라 옥시토카의 락테이트 디하이드로게나제를 클로닝하기 위해 표적 유전자인 ldhA(서열번호 1)의 상동 부위 1(서열번호 2)을 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 또한 상동 부위 2(서열번호 5)를 서열번호 6 및 7의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1과 2를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편(서열번호 8)을 완성하였다. 표적 유전자의 재조합 확률을 높이기 위하여 상기 완성된 DNA 단편은 항생제 내성 유전자 등을 포함할 수 있고, 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위해서 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다.

상기 제작된 DNA 단편은 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 클렙시엘라 옥시토카 야생형에 전달하였으며, 미생물이 자체적으로 가지고 있는 상동 재조합 기작 이용하여 표적 유전자를 제거하게 된다.

<실험예 1> 2,3-부탄디올 전환 효소

클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12133BP의 유전체 정보를 바탕으로 KEGG database(http://www.genome.jp/kegg/)와 NCBI database ((http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)를 이용하여 2,3-부탄디올의 합성 및 소모 경로와 관련된 효소들을 탐색하였다. 그 결과, 유전체 정보가 알려진 모든 클렙시엘라 옥시토카들은 적어도 두 개의 2,3-부탄디올 전환 효소(AR1 및 AR2)를 갖는 것으로 확인되었다. 이를 이용하여 도식화한 유전자군은 도 2와 같다.

상기 AR1의 아미노산 서열은 서열번호 9에 기재되어 있으며, 이를 코드하는 유전자인 budC의 염기서열은 서열번호 10이다. 한편, AR2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 기재되어 있으며, 이를 코드하는 유전자인 dar의 염기서열은 서열번호 12이다(표 2).

클렙시엘라 속 미생물을 포함하여 2,3-부탄디올 생산 미생물들은 지금까지 하나의 2,3-부탄디올 전환 효소를 가지고 있는 것으로 알려져 있었다. 또한 일반적인 클렙시엘라 속 미생물은 AR1에 해당하는 2,3-부탄디올 전환 효소가 관련 효소들 (ALDC 및 ALS)과 함께 오페론 형식으로 존재한다(Oppermann, U. et al., Chem. Biol. Interact. 143: 247-253). 즉, 본 발명에서 확인한 AR2는 기존에 알려져 있지 않던 신규 효소이며, AR2는 하기 (1) 내지 (3)과 같은 2,3-부탄디올 전환 효소의 특징을 갖는 것으로 확인되었다.

(1) 2,3-부탄디올 전환 효소는 효소군 중 short chain dehydrogenase/reductase (SDR) 군에 속하고, SDR의 특징은 250~350 정도의 아미노산 서열을 가진다.

(2) 2,3-부탄디올 전환 효소는 N-말단(terminal) 부분에 코엔자임인 NADH 부위를 갖는다(glycine-rich TGXXXGXG 와 NNAG motifs).

(3) 2,3-부탄디올 전환 효소는 Asn-Ser-Tyr-Lys 아미노산 서열의 촉매 활성 부위 (catalytic tetrad) 및 활성 부위 (YXXXK)를 갖는다.

<실험예 2> 2,3-부탄디올 전환 효소의 확인

도 3과 같은 재조합 플라스미드를 제작하여, AR1 및 AR2의 2,3-부탄디올 전환 활성을 실험적으로 확인하였다. 이 때 기본 벡터로는 클로람페니콜 내성인자를 함유하는 것을 특징으로 하는 pBBR1MCS를 사용하였다(Kovach, M. E., et al., Biotechniques 16: 800-802).

pBRbudRAB는 활성 전사인자(TA), 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세토인 디카르복실레이즈(ALDC)를 함유하고 있어 아세토인 합성만 가능할 것으로 예상되었다. pBRbudRABC는 활성 전사인자(TA), 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세토인 디카르복실레이즈(ALDC), 2,3-부탄디올 전환 효소(AR1)을 모두 가지고 있어 2,3-부탄디올 생산이 가능할 것으로 예상되었다. 한편, 실험의 대상인 pBRbudRAD는 활성 전사인자(TA), 아세토락테이트 합성효소 (ALS), 아세토인 디카르복실레이즈(ALDC), 2,3-부탄디올 전환 효소(AR2)를 가지고 있어 AR2의 기능에 따라 2,3-부탄디올 생산 유무가 결정된다.

상기 제작한 플라스미드를 대장균(E. coli JM109)에 형질 전환 시켜 재조합 대장균을 제작하였다. 그리고 상기 재조합 대장균을 이용하여 발효를 수행하였으며, 모든 배양 과정에서 도입한 재조합 벡터의 유지를 위해 클로람페니콜을 30 μg/ml의 농도로 포함시켰다. 상기 발효는 상기 재조합 대장균을 9 g/L 포도당 (50mM, glucose)을 포함한 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 수행하였으며, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 400 rpm), 90 g/L 초기 포도당 농도, pH 6.8, 배양 온도 37℃로 하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 재조합 대장균에 대하여 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄디올의 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

그 결과, 발효 24시간 후 pBRbudRAB/E. coli JM109는 2,3-부탄디올 2.0 g/L 및 아세토인 30.0 g/L를 생산한 반면, pBRbudRABC/E. coli JM109는 2,3-부탄디올 34.0 g/L 및 아세토인 4.7 g/L 를 생산하였다. 실험의 대상인 pBRbudRABD/E. coli JM109는 2,3-부탄디올 12.6 g/L 및 아세토인 13.0 g/L 를 생산하였다(도 4: 2,3-부탄디올 생산능 및 도 5: 아세토인 생산능. ●: pBRbudRAB/E. coli JM109, ▲: pBRbudRABC/E. coli JM109, ■: pBRbudRABD/E. coli JM109).

즉, 비록 AR1을 코드하는 budC 유전자를 포함하는 재조합 균주보다 2,3-부탄디올 합성능이 떨어지기는 하지만, AR2를 코딩하는 dar 유전자를 포함한 재조합 균주 역시 2,3-부탄디올의 생산이 가능한 것으로 확인되었다. 그러므로 AR1 및 AR2 모두 2,3-부탄디올의 전환 활성을 갖는 효소로 확인되었다.

<실험예 3> AR1 및 AR2가 결실된 재조합 균주의 제조

실험예 2에서 2,3-부탄디올 전환 효소로 확인된AR1(budC 유전자가 코드함) 및 AR2(dar 유전자가 코드함)에 대하여, 각각의 효소를 코딩하는 유전자를 클렙시엘라 옥시토카 유전체에서 결실시키기 위하여 미생물의 상동성 재조합 기작을 이용하였다. 클렙시엘라 옥시토카의 표적 유전자를 불활성화 시키는 재조합 DNA 단편은 제거하고자 하는 유전자의 상동 부위 (homologous region)를 포함하고, 재조합 확률을 높이기 위해 항생제 내성 유전자 등과 염색체 내에 재조합된 항생제 내성 유전자를 제거하기 위한 레반수크라제 효소를 코딩하는 sacB 유전자를 포함할 수 있다. 이에 제작된 DNA 단편을 대상 미생물 (클렙시엘라 옥시토카)에 도입하면, DNA 단편 내 유전자의 상동 부위와 미생물 유전체에 있는 유전자 사이에 재조합 효소 (recombinase)에 의한 재조합 기작으로 표적 유전자를 제거하게 된다.

클렙시엘라 옥시토카의 AR1(budC)와 AR2 (dar)가 결실 시키기 위한 재조합 플라스미드는 하기의 방법으로 제조하였다.

먼저, AR1 결실을 위해 표적 유전자인 budC (서열번호 10)의 상동 부위 1 (서열번호 13)을 서열번호 14 및 15 프라이머를 이용하며 PCR로 증폭하고, 상동 부위 2 (서열번호 16)를 서열번호 17 및 18 프라이머를 이용하며 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1 (서열번호 13)과 2 (서열번호 16)를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편 (서열번호 19)을 완성하였다(표 3).

또, AR2 결실을 위해 표적 유전자인 dar (서열번호 12)의 상동 부위 1 (서열번호 20)을 서열번호 21 및 22 프라이머를 이용하며 PCR로 증폭하고, 상동 부위 2 (서열번호 23)를 서열번호 24 및 25 프라이머를 이용하며 PCR로 증폭하였다. 그 후, 상동 부위 1 (서열번호 20)과 2 (서열번호 23)를 동시에 주형으로 하여 PCR로 증폭하여 상동 부위 1과 2가 접합된 DNA 단편 (서열번호 26)을 완성하였다(표 4).

젖산 탈수소화 효소 (ldhA)가 결실된 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12133BP △ldhA (KO △ldhA)를 준비하였다. 그리고 상기 서열 번호 19, 26의 DNA 단편을 각각 전기 천공법 (electroporation, 25 uF, 200 Ω, 18 kV/cm)을 이용하여 클렙시엘라 옥시토카 (KO △ldhA)에 도입하였다. 이로써, KO △ldhA 에서 AR1 (budC)이 제거된 재조합 균주 (KO △ldhA △budC) 및 AR2 (dar)가 제거된 재조합 균주 (KO △ldhA △dar)가 각각 제작되었다.

또한 AR1 (budC)이 제거된 재조합 균주 (KO △ldhA △budC)를 대상으로 pKOV deltaAR2 플라스미드를 도입하여 추가로 AR2 (dar) 역시 제거된 재조합 균주 (KO △ldhA △budC △dar)를 완성하였다.

상기 DNA 단편을 도입한 후, 유전자 결실을 위한 일반적인 과정은 항생제 내성 test와 수크로오스 (sucrose) 내성 test를 거치며, 콜로니 PCR을 수행하여 해당 유전자가 제거된 것을 확인하였다

<실험예 4> AR1 및 AR2의 기능 확인

아세토인을 중간물질로 하는 2,3-부탄디올의 소모 경로를 이용하여, AR1 및 AR2 단백질의 기능을 확인하였다. 구체적으로는, M9 최소 배지에 2,3-부탄디올을 유일 탄소원으로 사용하여 재조합 클렙시엘라 옥시토카 균주들의 생장 및 잔류 2,3-부탄디올 농도를 관찰하였다. 상기 균주들을 LB 고체 배지에 스트리킹 (streaking)하여 30℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 단일 콜로니를 3 ml LB 액체 배지에서 8시간 배양하였다. 이 배양액을 M9 최소 배지로 2번 씻어 잔류하는 LB 성분들을 제거한 후, 10 g/L 2,3-부탄디올을 포함한 100 ml의 M9 기본 배지에 접종하여 배양하였다. 상기 재조합 균주들의 배양 중 샘플을 채취하였다. 상기 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄디올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

그 결과, AR2를 코딩하는 dar 유전자가 유전체에 온전히 남아 있는 균주들 (KO △ldhA와 KO △ldhA △budC)은 2,3-부탄디올을 탄소원으로 이용하여 성장을 하고, 잔류 2,3-부탄디올 농도 역시 성장과 더불어 낮아졌다. 반면, dar 유전자가 제거된 균주들(KO △ldhA △dar과 KO △ldhA △budC △dar)은 모두 200 시간의 배양에 걸쳐 전혀 성장을 하지 못했고, 잔류 2,3-부탄디올의 농도 역시 배양 초기 농도를 유지하였다. 즉, AR1을 코딩하는 budC의 유무와는 상관없이 AR2(dar)의 유무에 따라 2,3-부탄디올을 탄소원으로 이용하기도 하고 그렇지 못하기도 하는 것으로 나타났다(도 6: 성장 결과. ●: KO △ldhA, ▲: KO △ldhA △budC, ■: KO △ldhA △dar. ◆: KO △ldhA △budC △dar. 도 7:잔류 2,3-부탄디올의 농도. ●: KO △ldhA, ▲: KO △ldhA △budC, ■: KO △ldhA △dar. ◆: KO △ldhA △budC △dar.).

그러므로 2,3-부탄디올 소모와 관련된 두 가지 경로에서 가장 핵심적인 효소는 AR2로 판단되었으며, AR2가 세포 내에서 2,3-부탄디올을 아세토인으로 전환시키는 2,3-부탄디올 디하이드로게나제(2,3-butanediol dehydrogenase)로서 기능하는 것으로 확인되었다.

이를 실험예 1 및 2의 결과와 종합하여 보면, AR2는 아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 가지며, 아세토인을 2,3-부탄디올로의 전환하는 활성보다 2,3-부탄디올을 아세토인으로 전환하는 활성이 높은 것으로 확인되었다. 반면, AR1은 아세토인과 2,3-부탄디올 간의 전환 활성을 가지며, 2,3-부탄디올을 아세토인으로 전환하는 활성보다 아세토인을 2,3-부탄디올로 전환하는 활성이 높은 것으로 확인되었다.

<실험예 5> 2,3-부탄디올의 생산

상기 실험예 3에서 제작한 재조합 균주들을 배양하여 2,3-부탄디올을 생산하였다. 이 때, 비교예로는 클렙시엘라 옥시토카 KCTC 12133BP △ldhA (KO △ldhA)를 사용하였다.

각 재조합 균주들을 9 g/L 포도당 (50mM, glucose)을 포함하는 250 ml의 복합배지에 접종하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후, 이 배양액을 3 L 복합배지에 접종하여 발효시켰다. 이 때, 발효 조건은 미세호기조건 (micro-aerobic condition; 호기 속도 1 vvm, 교반 속도 400 rpm), 90 g/L 초기 포도당 농도, pH 6.8, 배양 온도 37℃로 하였다. 발효 중 pH의 조정을 위하여 5N NaOH를 사용하였다. 상기 재조합 클렙시엘라에 대해 발효 중 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료의 OD600 (optical density)를 측정하여 생장 속도를 측정하였고, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액의 대사산물 및 2,3-부탄디올 농도를 액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다.

그 결과, AR1이 결실된 재조합 균주(KO △ldhA △budC)는 비교예인 KO △ldhA (도 8)에 비하여 2,3-부탄디올 생산성이 낮은 반면, 아세토인 축적은 더 많았다(도 9). 반면, AR2가 결실된 균주(KO △ldhA △dar)의 경우 당 소모 시점까지 비교예인 KO △ldhA와 유사한 2,3-부탄디올 생산성을 보였고, 당 소모 완료 후에는 2,3-부탄디올 소모율 및 아세토인 축적율이 비교예보다 낮았다(도 10). 한편, AR1과 AR2가 모두 결실 된 균주는 2,3-부탄디올을 거의 생산하지 못하고 대신 높은 아세토인 생산성을 보였다(도 11). 그러므로, AR2가 제거되고 AR1은 온전히 남아 있는 균주(KO △ldhA △dar)가 2,3-부탄디올 생산과 및 발효 완료 후 보관에 매우 유리한 것으로 확인되었다(표 5).

<110> GS CALTEX <120> RECOMBINANT MICROORGANISM HAVING ENHANCED BUTANEDIOL PRODUCING ABILITY AND METHOD FOR PRODUCING BUTANEDIOL USING THE SAME <130> GSP120801 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 1 atgaaaatcg ctgtgtatag tacaaaacag tacgacaaga agtatctgca gcatgttaat 60 gatgcatatg gctttgaact ggagtttttt gacttcctgc taaccgaaaa aaccgccaaa 120 accgccaacg gctgtgaagc ggtgtgtatc ttcgtaaacg atgacggtag ccgcccggta 180 cttgaagaac tgaaagccca cggcgtgcag tacatcgcgc tgcgctgcgc ggggttcaac 240 aacgttgacc tcgatgccgc caaagagctg ggcctgcggg tggtgcgcgt cccggcctac 300 tcgccggaag cggtcgctga gcacgcgatc ggcatgatga tgtcgctgaa ccgccgcatt 360 caccgtgcct atcagcgcac ccgcgacgcg aacttctctc tggaagggct gaccggtttc 420 accatgcacg gtaaaaccgc cggcgttatt ggcaccggta aaatcggcgt cgccgcgctg 480 cgcattctta aaggcttcgg tatgcgtctg ctggcgtttg atccctaccc aagcgccgcc 540 gcgctggata tgggcgtgga gtatgtcgat cttgaaaccc tgtaccggga gtccgatgtt 600 atctcactgc actgcccact gaccgatgaa aactaccatt tgctgaacca tgccgcgttc 660 gatcgcatga aagacggggt gatgatcatc aacaccagcc gcggcgcgct catcgattcg 720 caggcagcga tcgacgccct gaagcatcag aaaattggcg cgctggggat ggacgtgtat 780 gagaacgaac gcgatctgtt ctttgaagat aagtctaatg acgtgattca ggatgatgtg 840 ttccgccgtc tctccgcctg ccataacgtc ctgtttaccg gtcaccaggc gtttctgacc 900 gcggaagcgt tgatcagcat ttcgcaaacc accctcgaca acctgcgtca agtggatgca 960 ggcgaaacct gtcctaacgc actggtctga 990 <210> 2 <211> 595 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 2 atgacgttcg ctaaatcctg cgccgtcatc tcgctgctga tcccgggcac ctccgggcta 60 ctgctgttcg gcaccctggc atcggccagc ccgggacatt tcctgttaat gtggatgagc 120 gccagcctcg gcgctatcgg cggattctgg ctctcgtggc tgacgggcta ccgctaccgg 180 taccatctgc atcgtatccg ctggcttaat gccgaacgcc tcgctcgcgg ccagttgttc 240 ctgcgccgcc acggcgcgtg ggcagtcttt tttagccgct ttctctctcc gcttcgcgcc 300 accgtgccgc tggtaaccgg cgccagcggc acctctctct ggcagtttca gctcgccaac 360 gtcagctccg ggctgctctg gccgctgatc ctgctggcgc caggcgcgtt aagcctcagc 420 ttttgatgaa aggtattgtc ttttaaagag atttcttaac accgcgatat gctctagaat 480 tattactata acctgctgat taaactagtt tttaacattt gtaagattat tttaattatg 540 ctaccgtgac ggtattatca ctggagaaaa gtcttttttc cttgcccttt tgtgc 595 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 3 cacggatcca tgacgttcgc taaatcctgc 30 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 4 gcacaaaagg gcaaggaaaa aagacttttc tccagtgata 40 <210> 5 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence <400> 5 tatcactgga gaaaagtctt ttttccttgc ccttttgtgc tcccccttcg cggggggcac 60 attcagataa tccccacaga aattgcctgc gataaagtta caatcccttc atttattaat 120 acgataaata tttatggaga ttaaatgaac aagtatgctg cgctgctggc ggtgggaatg 180 ttgctatcgg gctgcgttta taacagcaag gtgtcgacca gagcggaaca gcttcagcac 240 caccgttttg tgctgaccag cgttaacggg cagccgctga atgccgcgga taagccgcag 300 gagctgagct tcggcgaaaa gatgcccatt acgggcaaga tgtctgtttc aggtaatatg 360 tgcaaccgct tcagcggcac gggcaaagtc tctgacggcg agctgaaggt tgaagagctg 420 gcaatgaccc gcatgctctg cacggactcg cagcttaacg ccctggacgc cacgctgagc 480 aaaatgctgc gcgaaggcgc gcaggtcgac ctgacggaaa cgcagctaac gctggcgacc 540 gccgaccaga cgctggtgta taagctcgcc gacctgatga attaataatt a 591 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 6 tatcactgga gaaaagtctt ttttccttgc ccttttgtgc 40 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 7 cctgcggccg ctaattatta attcatcagg tc 32 <210> 8 <211> 1146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence <400> 8 atgacgttcg ctaaatcctg cgccgtcatc tcgctgctga tcccgggcac ctccgggcta 60 ctgctgttcg gcaccctggc atcggccagc ccgggacatt tcctgttaat gtggatgagc 120 gccagcctcg gcgctatcgg cggattctgg ctctcgtggc tgacgggcta ccgctaccgg 180 taccatctgc atcgtatccg ctggcttaat gccgaacgcc tcgctcgcgg ccagttgttc 240 ctgcgccgcc acggcgcgtg ggcagtcttt tttagccgct ttctctctcc gcttcgcgcc 300 accgtgccgc tggtaaccgg cgccagcggc acctctctct ggcagtttca gctcgccaac 360 gtcagctccg ggctgctctg gccgctgatc ctgctggcgc caggcgcgtt aagcctcagc 420 ttttgatgaa aggtattgtc ttttaaagag atttcttaac accgcgatat gctctagaat 480 tattactata acctgctgat taaactagtt tttaacattt gtaagattat tttaattatg 540 ctaccgtgac ggtattatca ctggagaaaa gtcttttttc cttgcccttt tgtgctcccc 600 cttcgcgggg ggcacattca gataatcccc acagaaattg cctgcgataa agttacaatc 660 ccttcattta ttaatacgat aaatatttat ggagattaaa tgaacaagta tgctgcgctg 720 ctggcggtgg gaatgttgct atcgggctgc gtttataaca gcaaggtgtc gaccagagcg 780 gaacagcttc agcaccaccg ttttgtgctg accagcgtta acgggcagcc gctgaatgcc 840 gcggataagc cgcaggagct gagcttcggc gaaaagatgc ccattacggg caagatgtct 900 gtttcaggta atatgtgcaa ccgcttcagc ggcacgggca aagtctctga cggcgagctg 960 aaggttgaag agctggcaat gacccgcatg ctctgcacgg actcgcagct taacgccctg 1020 gacgccacgc tgagcaaaat gctgcgcgaa ggcgcgcagg tcgacctgac ggaaacgcag 1080 ctaacgctgg cgaccgccga ccagacgctg gtgtataagc tcgccgacct gatgaattaa 1140 taatta 1146 <210> 9 <211> 256 <212> PRT <213> Klebsiella oxytoca <400> 9 Met Lys Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly Gln Gly Ile Gly Lys 1 5 10 15 Ala Ile Ala Leu Arg Leu Val Lys Asp Gly Phe Ala Val Ala Ile Ala 20 25 30 Asp Tyr Asn Asp Ala Thr Ala Gln Ala Val Ala Asp Glu Ile Asn Arg 35 40 45 Ser Gly Gly Arg Ala Leu Ala Val Lys Val Asp Val Ser Gln Arg Asp 50 55 60 Gln Val Phe Ala Ala Val Glu Gln Ala Arg Lys Gly Leu Gly Gly Phe 65 70 75 80 Asp Val Ile Val Asn Asn Ala Gly Val Ala Pro Ser Thr Pro Ile Glu 85 90 95 Glu Ile Arg Glu Glu Val Ile Asp Lys Val Tyr Asn Ile Asn Val Lys 100 105 110 Gly Val Ile Trp Gly Ile Gln Ala Ala Val Glu Ala Phe Lys Lys Glu 115 120 125 Gly His Gly Gly Lys Ile Ile Asn Ala Cys Ser Gln Ala Gly His Val 130 135 140 Gly Asn Pro Glu Leu Ala Val Tyr Ser Ser Ser Lys Phe Ala Val Arg 145 150 155 160 Gly Leu Thr Gln Thr Ala Ala Arg Asp Leu Ala His Leu Gly Ile Thr 165 170 175 Val Asn Gly Tyr Cys Pro Gly Ile Val Lys Thr Pro Met Trp Ala Glu 180 185 190 Ile Asp Arg Gln Val Ser Glu Ala Ala Gly Lys Pro Leu Gly Tyr Gly 195 200 205 Thr Gln Glu Phe Ala Lys Arg Ile Thr Leu Gly Arg Leu Ser Glu Pro 210 215 220 Glu Asp Val Ala Ala Cys Val Ser Tyr Leu Ala Gly Pro Asp Ser Asn 225 230 235 240 Tyr Met Thr Gly Gln Ser Leu Leu Ile Asp Gly Gly Met Val Phe Asn 245 250 255 <210> 10 <211> 768 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 10 atgaaaaaag tcgcactcgt caccggcgcg ggccagggta tcggtaaagc tatcgccctt 60 cgtctggtga aagatggttt tgccgtggct atcgccgatt ataacgacgc caccgcgcag 120 gcggtcgctg atgaaattaa ccgcagcggc ggccgggcgc tagcggtgaa ggtggatgtg 180 tctcaacgcg atcaggtttt tgccgccgtc gaacaggcgc gcaagggtct cggcggtttt 240 gacgtgatcg tcaacaacgc cggggttgcg ccctccacac caatcgaaga gattcgcgag 300 gaggtgatcg ataaagtcta caatatcaac gttaaaggcg ttatctgggg catccaggcc 360 gcggtagagg cgtttaaaaa agagggccac ggcggcaaaa ttatcaacgc ctgctcccag 420 gcgggccatg taggtaaccc ggagctggcg gtctatagct ccagtaaatt tgccgtgcgc 480 ggcctgacgc aaaccgccgc ccgcgatctg gcgcatctgg ggattaccgt aaacggctac 540 tgcccgggga tcgtcaaaac cccaatgtgg gcggaaattg accgccaggt ttccgaagcg 600 gcgggtaaac cgctgggcta cggaacccag gagttcgcca aacgcattac ccttgggcgg 660 ctatccgagc cggaagacgt cgcagcctgc gtctcttatc tcgccggtcc ggactccaat 720 tatatgaccg gccaatcgct gctgatcgat ggcggcatgg tatttaac 768 <210> 11 <211> 259 <212> PRT <213> Klebsiella oxytoca <400> 11 Met Ala Ile Glu Asn Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly Gln Gly 1 5 10 15 Ile Gly Arg Gly Ile Ala Leu Arg Leu Ala Lys Asp Gly Ala Ser Val 20 25 30 Met Leu Val Asp Val Asn Pro Glu Gly Ile Ala Ala Val Ala Ala Glu 35 40 45 Val Glu Ala Leu Gly Arg Lys Ala Ala Thr Phe Val Ala Asn Ile Ala 50 55 60 Asp Arg Ala Gln Val Tyr Ala Ala Ile Asp Glu Ala Glu Lys Gln Leu 65 70 75 80 Gly Gly Phe Asp Ile Ile Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Gln Val Gln 85 90 95 Ala Leu Ala Asp Val Thr Pro Glu Glu Val Asp Arg Ile Met Arg Ile 100 105 110 Asn Val Gln Gly Thr Leu Trp Gly Ile Gln Ala Ala Ala Lys Lys Phe 115 120 125 Ile Asp Arg Gln Gln Lys Gly Lys Ile Ile Asn Ala Cys Ser Ile Ala 130 135 140 Gly His Asp Gly Phe Ala Leu Leu Gly Val Tyr Ser Ala Thr Lys Phe 145 150 155 160 Ala Val Arg Ala Leu Thr Gln Ala Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Ser Arg 165 170 175 Gly Ile Thr Val Asn Ala Tyr Cys Pro Gly Ile Val Gly Thr Gly Met 180 185 190 Trp Thr Glu Ile Asp Lys Arg Phe Ala Glu Ile Thr Gly Ala Pro Val 195 200 205 Gly Glu Thr Tyr Lys Lys Tyr Val Glu Gly Ile Ala Leu Gly Arg Ala 210 215 220 Glu Thr Pro Asp Asp Val Ala Ser Leu Val Ser Tyr Leu Ala Gly Pro 225 230 235 240 Asp Ser Asp Tyr Val Thr Gly Gln Ser Ile Leu Ile Asp Gly Gly Ile 245 250 255 Val Tyr Arg <210> 12 <211> 777 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 12 atggctatcg aaaataaagt tgcgctggta accggcgccg gtcagggcat tggccgcggt 60 attgcgttgc gtctggccaa agacggcgcg tcggtgatgc tggtcgacgt gaaccctgaa 120 gggattgccg ccgtcgccgc cgaagtggaa gcgctgggac gcaaagcagc caccttcgtc 180 gctaacatcg ccgatcgcgc gcaggtgtac gccgccattg atgaagcgga aaaacagctg 240 ggcggctttg atattatcgt gaacaacgcc gggatcgccc aggttcaggc gctggccgat 300 gtgacgcctg aagaagtgga ccgcatcatg cgcatcaacg ttcagggtac cctgtggggt 360 attcaggcgg cggcgaaaaa attcatcgat cgtcagcaga aagggaaaat catcaacgcc 420 tgctctatcg ccggtcatga tggtttcgcg ctgctgggcg tttattccgc caccaaattt 480 gccgtacgcg ccctgacgca ggcggcggcg aaggagtatg ccagccgcgg cattacggtt 540 aatgcctact gtccggggat tgtgggaacc gggatgtgga ccgaaatcga taagcgcttt 600 gcggaaatta ccggtgcgcc ggtgggcgaa acttataaaa aatacgttga aggcatcgcc 660 cttggccgcg ccgaaacgcc ggacgatgtg gcaagcctgg tctcttatct ggcaggcccg 720 gattccgatt atgttaccgg tcagtcgatt ctgatcgatg gcggtattgt ttaccgt 777 <210> 13 <211> 640 <212> DNA <213> Klebsiella oxytoca <400> 13 gctgcgcatc gttcgcgcca tgcaggacat cgtcaatagc gatgtcaccc tgaccgtcga 60 tatggggagc tttcatatct ggatcgcccg ctatctctac agctttcgcg cccgtcaggt 120 catgatttcc aacggtcaac agaccatggg cgtggcgctg ccgtgggcga ttggcgcctg 180 gctggtcaat ccgcagcgca aagtggtttc cgtttccggc gacggcggtt tcctgcagtc 240 cagcatggag ctggagaccg ctgtacggct gaaagcgaac gtcctgcata tcatctgggt 300 cgataacggc tacaacatgg tggcgattca ggaggagaaa aaataccagc ggctctccgg 360 cgttgagttc ggcccggtgg attttaaagt ctacgccgaa gccttcggcg ccaaagggtt 420 tgcggtagag agcgccgaag cccttgagcc gacgctgcgg gcggcgatgg acgtcgacgg 480 ccccgccgtc gtagccatcc ccgtggatta ccgcgataac ccgctgctga tgggccagct 540 ccatctcagt caactacttt gagtcactac agaaggaatc tatcaatgaa aaaagtcgca 600 ctcgtgaccg gcgcgatgac cggccaatcg ctgctgatcg 640 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 14 ggatccgctg cgcatcgttc gcgccatgc 29 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 15 cgatcagcag cgattggccg gtcatcgcgc cggtcacgag tgcgactt 48 <210> 16 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence <400> 16 aagtcgcact cgtgaccggc gcgatgaccg gccaatcgct gctgatcgat ggcggcatgg 60 tatttaacta ataataaata agctctgaca tggtttgccc cggcgtcacc gccggggctt 120 ttttatttca acctttaggg aagatccaca ggtcgctgac gggcaatgtc agatggcaac 180 gctcggcatc gcgcagcgcg ctgccgtagg cgcgtatggc gaaatcatcg ccttcagtgc 240 gaaacagata ctcccagcgg tcgccgaggt acatgctggt caacagcggc agcgccagca 300 tgttctcttc aggcgcggaa gcgatgcgca aacgctcaac gcggatcacc gccgtcgcct 360 cttcccccac gctaacccct tcccccgcca ttccccatag cgcccagctg gccccctcaa 420 tgcgcgcccg accgttctcc agcgcgctaa cggtgccatg caggcgatta ttactgccca 480 taaactcggc ggcaaacagc gttttcgggc tgccgtacat ctcctgcggg gttccctgct 540 gctcgatcac gccgttgtta agcagcagaa tgcgatcgga aatcgccatc gcctcgttct 600 gatcgt 606 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 17 aagtcgcact cgtgaccggc gcgatgaccg gccaatcgct gctgatcg 48 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 18 gcggccgcac gatcagaacg aggcgatggc gat 33 <210> 19 <211> 1198 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence <400> 19 gctgcgcatc gttcgcgcca tgcaggacat cgtcaatagc gatgtcaccc tgaccgtcga 60 tatggggagc tttcatatct ggatcgcccg ctatctctac agctttcgcg cccgtcaggt 120 catgatttcc aacggtcaac agaccatggg cgtggcgctg ccgtgggcga ttggcgcctg 180 gctggtcaat ccgcagcgca aagtggtttc cgtttccggc gacggcggtt tcctgcagtc 240 cagcatggag ctggagaccg ctgtacggct gaaagcgaac gtcctgcata tcatctgggt 300 cgataacggc tacaacatgg tggcgattca ggaggagaaa aaataccagc ggctctccgg 360 cgttgagttc ggcccggtgg attttaaagt ctacgccgaa gccttcggcg ccaaagggtt 420 tgcggtagag agcgccgaag cccttgagcc gacgctgcgg gcggcgatgg acgtcgacgg 480 ccccgccgtc gtagccatcc ccgtggatta ccgcgataac ccgctgctga tgggccagct 540 ccatctcagt caactacttt gagtcactac agaaggaatc tatcaatgaa aaaagtcgca 600 ctcgtgaccg gcgcgatgac cggccaatcg ctgctgatcg atggcggcat ggtatttaac 660 taataataaa taagctctga catggtttgc cccggcgtca ccgccggggc ttttttattt 720 caacctttag ggaagatcca caggtcgctg acgggcaatg tcagatggca acgctcggca 780 tcgcgcagcg cgctgccgta ggcgcgtatg gcgaaatcat cgccttcagt gcgaaacaga 840 tactcccagc ggtcgccgag gtacatgctg gtcaacagcg gcagcgccag catgttctct 900 tcaggcgcgg aagcgatgcg caaacgctca acgcggatca ccgccgtcgc ctcttccccc 960 acgctaaccc cttcccccgc cattccccat agcgcccagc tggccccctc aatgcgcgcc 1020 cgaccgttct ccagcgcgct aacggtgcca tgcaggcgat tattactgcc cataaactcg 1080 gcggcaaaca gcgttttcgg gctgccgtac atctcctgcg gggttccctg ctgctcgatc 1140 acgccgttgt taagcagcag aatgcgatcg gaaatcgcca tcgcctcgtt ctgatcgt 1198 <210> 20 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence <400> 20 ggaggtcggc cggaagctcg ccttgcagca gctgcagaaa cgacgggctc cacccctgcc 60 acaagggccg cagcgcctcc tgcagatagc gtataaacag tagcggcgcg ttgtcatcct 120 cttcaaggct cagccaggcc agcgcatccc cttgtcgaag gcggtgtcga taccactgcg 180 ccagcagggt ggttttgcca aatccggcgg gcgcgcgcac cagggttaaa cggcgggaga 240 cggcggcgtc gaggcgctgt agcaggcgct cccgcgatag cagactttcc ggcgtacggg 300 gcggcgtaaa gcgcgtggag ataagcggca gcgtccccgt gaagcgtaaa ggttcctgat 360 gaacaagcgc tgccagcgca tcatccgccg aggataaaaa ggccatacca cgattactcc 420 ttaatccagt ccgtacgctc attatccccc ccatcagggg ggtaggccac gcttatcgcg 480 cccgatagag tagtgccatt cgccgcagcg gctacgacga catcggccgc gggcctccct 540 agtttattaa tcagtacaag gtgagtacag acatggctat cgaaaataaa gttgcgaccg 600 gtcagtcgat tctgatcgat g 621 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 21 tctagaggat ccggaggtcg gccggaagct cgcc 34 <210> 22 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 22 catcgatcag aatcgactga ccggtcgcaa ctttattttc gatagccatg tc 52 <210> 23 <211> 608 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence <400> 23 gacatggcta tcgaaaataa agttgcgacc ggtcagtcga ttctgatcga tggcggtatt 60 gtttaccgtt aagggataaa cccggcgcag aacgcgccgg gtttttgcgg ggttacgcgt 120 tagccgcggg ctcctgcggc ttgtcgctac gggtgttttc cagcatccgg cgaaccggaa 180 caatcagcag gcacagcacc gcggcgcaga tcagcagcgc aatagagcag cgtgcgaaca 240 ggtcgggcag catatccagc tgatcggcct tcacgtgacc gccaatcaga cccgccgcca 300 ggttccccag ggcgctggcg cagaaccaca gccccatcat ctggccgcgc attctttccg 360 gcgccagcag cgtcatggtc gcgaggccaa tcgggctgag gcacagctcg cccagcgtca 420 gcatcagaat actgcccacc agccacatcg gcgagacgcc cgcgccgttg ttgctcagga 480 cgttttgcgc cgccagcatc atcaggccaa agcccgccgc cgcgcataaa ataccgataa 540 caaacttggt gatgctgctc ggacgcacgt ttttacgcgc cagcgcaggc cacgcccagc 600 taaatacc 608 <210> 24 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 24 gacatggcta tcgaaaataa agttgcgacc ggtcagtcga ttctgatcga tg 52 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence-primer <400> 25 atcgcggccg cggtatttag ctgggcgtgg cctgc 35 <210> 26 <211> 1177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aritificial sequence <400> 26 ggaggtcggc cggaagctcg ccttgcagca gctgcagaaa cgacgggctc cacccctgcc 60 acaagggccg cagcgcctcc tgcagatagc gtataaacag tagcggcgcg ttgtcatcct 120 cttcaaggct cagccaggcc agcgcatccc cttgtcgaag gcggtgtcga taccactgcg 180 ccagcagggt ggttttgcca aatccggcgg gcgcgcgcac cagggttaaa cggcgggaga 240 cggcggcgtc gaggcgctgt agcaggcgct cccgcgatag cagactttcc ggcgtacggg 300 gcggcgtaaa gcgcgtggag ataagcggca gcgtccccgt gaagcgtaaa ggttcctgat 360 gaacaagcgc tgccagcgca tcatccgccg aggataaaaa ggccatacca cgattactcc 420 ttaatccagt ccgtacgctc attatccccc ccatcagggg ggtaggccac gcttatcgcg 480 cccgatagag tagtgccatt cgccgcagcg gctacgacga catcggccgc gggcctccct 540 agtttattaa tcagtacaag gtgagtacag acatggctat cgaaaataaa gttgcgaccg 600 gtcagtcgat tctgatcgat ggcggtattg tttaccgtta agggataaac ccggcgcaga 660 acgcgccggg tttttgcggg gttacgcgtt agccgcgggc tcctgcggct tgtcgctacg 720 ggtgttttcc agcatccggc gaaccggaac aatcagcagg cacagcaccg cggcgcagat 780 cagcagcgca atagagcagc gtgcgaacag gtcgggcagc atatccagct gatcggcctt 840 cacgtgaccg ccaatcagac ccgccgccag gttccccagg gcgctggcgc agaaccacag 900 ccccatcatc tggccgcgca ttctttccgg cgccagcagc gtcatggtcg cgaggccaat 960 cgggctgagg cacagctcgc ccagcgtcag catcagaata ctgcccacca gccacatcgg 1020 cgagacgccc gcgccgttgt tgctcaggac gttttgcgcc gccagcatca tcaggccaaa 1080 gcccgccgcc gcgcataaaa taccgataac aaacttggtg atgctgctcg gacgcacgtt 1140 tttacgcgcc agcgcaggcc acgcccagct aaatacc 1177

Claims

2,3-부탄디올 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성이 억제되는 것을 특징으로 하는, 2,3-부탄디올의 생성능이 증가한 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 추가로 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
락테이트 디하이드로게나제의 활성이 추가로 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldhA가 결실 또는 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 1항에 있어서,
상기 미생물은 클렙시엘라인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
2,3-부탄디올 및 락테이트 생합성 경로를 갖는 미생물에 있어서,
서열번호 12의 염기서열을 갖는 유전자가 코드하는 단백질의 활성이 억제되는 것을 특징으로 하는, 2,3-부탄디올의 생성능이 증가한 재조합 미생물.
제 6항에 있어서,
피루베이트를 락테이트로 전환하는 경로가 추가로 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 6항에 있어서,
락테이트 디하이드로게나제의 활성이 추가로 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 6항에 있어서,
락테이트 디하이드로게나제를 코드하는 유전자인 ldhA가 결실 또는 억제되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제 6항에 있어서,
상기 미생물은 클렙시엘라인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
삭제
삭제
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하는 단계;및
배양액으로부터 2,3-부탄디올을 회수하는 단계를 포함하는 2,3-부탄디올의 생산 방법.