JPS63226274A

JPS63226274A - 清酒の製造方法

Info

Publication number: JPS63226274A
Application number: JP62061444A
Authority: JP
Inventors: Norihiro Tanaka; 田中　凖浩; Hideo Nagai; 永井　英雄; Eigoro Nakazawa; 中沢　英五郎
Original assignee: Hakutsuru Sake Brewing Co Ltd
Current assignee: Hakutsuru Sake Brewing Co Ltd
Priority date: 1987-03-16
Filing date: 1987-03-16
Publication date: 1988-09-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は清酒酵母の突然変異株を用いて尿素濃度の低い
清酒を製造する清酒製造方法に係わるものである。

（背　　景）清酒中に含まれる尿素は、その含有量が多い場合には官
能的に酒に苦味を与え、また加熱殺菌や長期貯蔵を行う
と、清酒の着色増加ならびに香味劣化を引き起す原因と
なることが野山ら４こより報告されている。そのため尿
素を含有しないか、もしくは含有量の少ない清酒の製造
は重要な課題であり、各方面で研究がなされている。

（従来の技術）清酒中の尿素を減少あるいは除去するには、前述の野山
らによりウレアーゼ酵素剤を使用し、尿素をアンモニア
と炭酸ガスに換える方法が考案されている。

しかし、清酒はアルコール濃度が高＜ｐＨが酸性という
条件のため、ウレアーゼの失活が激しく、上記の方法で
は低温で長期間の反応ならびに多量のウレアーゼ酵素剤
を必要とする。このため酒質、コストの両面で実用化が
困難であった。

また現在までに清酒製造工程における尿素の生成機構に
ついて詳細に調べられた報告はない。原料である米中に
も数〜数十ｐｐｍの尿素が含まれているが、製品である
清酒中の尿素の大部分は酵母がアルコール醗酵の過程で
生産してくるものによると考えられている。

尿素はアミノ酸代謝系においてアルギナーゼという酵素
によりアルギニンがオルニチンに変換される際に生成さ
れてくるが、一方酵母は尿素を分λ）３）解する酵素であるウレアアミドリアーゼも持つととが知
られている。

しかしながら、このような酵母菌体内の代謝機能がアル
コール醗酵をしていく過程で清酒中の尿素濃度にどのよ
うに関与しているかは全く知られていない。またこの代
謝機能を利用した尿素低生産性酵母も得られていない。

（本発明が解決しようとする問題点）本発明は尿素生産能の低い清酒酵母を突然変異株取得法
で育種し、その菌株を用いて尿素濃度の低い清酒を製造
する清酒製造方法の開発を目的としている。

（問題を解決するための手段および作用）本発明者らは
、清酒酵母からメチルアミン耐性突然変異株を分離し、
これを酒母または種菌として清酒を製造することで尿素
濃度の低い清酒を造り得ることを見いだした。

尿素生産性の低い酵母を育種する方策としては、アルギ
ナービ活性を弱めて尿素生成量を抑えるか、あるいはウ
レアアミドリアーゼ活性を高めて尿素分解能を上げるか
の２つが考えられる。本発明者らはアルギナーゼを抑制
すれば尿素サイクル内のオルニチンやシトルリン量も変
化し、生理代謝全般に影響がでる可能性があるため、ウ
レアアミドリアーゼに着目して研究を進めた。

まず本発明者らは、ウレアアミドリアーゼが生産されて
いる状態で醗酵を行わせれば、製成酒の尿素濃度がどの
程度下がるかを調べてみた。酵母のウレアアミドリアー
ゼは通常アンモニアによって抑制されている誘導酵素で
あり、尿素を唯一の窒素源として培養すれば誘導、生産
されることが知られている。そこで前培養の窒素源とし
て尿素を用いた酵母とアンモニアを用いた酵母で仕込み
を行い、製成酒の尿素濃度がどう変わるかを調べた。

協会７０１号酵母を１０ｍＭ尿素、あるいは０゜１％硫
安を含むＹＣＢ培地（Ｄｉｆｃｏ製イーストイ−ストン
・ベース１．１７％）で−晩培養した。

この菌体を遠心分離で回収し、３回無菌水で洗浄した後
、３　Ｘ　１０’個／　ｍ　ＩＩ　；１本の濃度で各々
添加し、一段酵母仕込みによる清酒醸造を行った。使用
した総米はＩｋｇ、麹歩合は２０％、汲水歩合は１３５
％、および品温経過は１５℃一定とした。

もろみ各段階における尿素濃度を分析した結果、図−１
に示したように尿素を唯一の窒素源として前培養すると
、アンモニアを用いた場合に比べて製成酒の尿素濃度を
約５０％抑えられることを見いだした。

なおもろみ中の尿素濃度の測定は、もろみを分取した後
、遠心分離し、その上澄み液の尿素濃度をベーリンガー
・マンハイム社製のＦ−キットにより分析した。

上述の実験結果から、本発明者らは次の段階としてウレ
アアミドリアーゼが脱抑制した突然変異株の取得に取り
組むことにし、Ｃｏｏｐｅｒの方Ｉ″′＠清酒酵母に応
用しようと試みた。この方法はウレアアミドリアーゼが
脱抑制されれば、アンモニアのアナログであるメチルア
ミンに耐性となることを利用したポジティブな選択方法
であるため、１倍体のみならず２　（ｇ体の清酒酵母に
も広く応用できると考えられる。

突然変異誘発処理を行わなかった菌体、あるいは紫外線
照射を行って誘発処理した菌体をメチルアミン２００ｍ
Ｍ含む合成培地上にまいたところ、４〜６０間後に１０
〜１０の頻度で耐性株のコロニーが出現してきた。

次にこれらの耐性株を純粋分離し、醸造特性や清酒醸造
過程での尿素生産性を調べてみた。耐性株の中には、親
株と同じように尿素生産性が高い株や、醗酵速度が著し
く遅いためもろみが変敗してしまう株もあった。しかし
ながら数株の突然変異株は尿素生産性が明らかに低く、
しかも醗酵速度や製成酒の風味の面で充分実用化し得る
ものであった。

これらの尿素低生産性突然変異株の尿素取り込み能につ
いて培養実験でさらに詳しく調べた。

上述の方法で選択してきた突然変異株の一つであるＭＲ
−９９株と、親株である協会７０１号酵母を１０ｍＭ尿
素、０．１％硫安、あるいは１０ｍＭ尿素および０．１
％硫安の両方を含む３種類のＹＣＢ培地で対数増殖期ま
で前培養した。これらの酵母を各々遠心分離で回収し、
３回無菌水で洗浄後、カザミノ酸０．１％、尿素４０　
ｐｐｍ　、アンモニア４０　ｐｐｍおよびブドウ糖を５
％含むＹＣＢ培地に３×１０′７個／　ｍ　（ｌ　）濃
度で添加シ、２５°ｃテｆＱ盪培養を行い、培養液中の
尿素およびアンモエフ８度をベーリンガー・マンハイム
社製のＦ−キットにより経時的に測定した。その結果を
図−２に示す。

親株の協会７０１号酵母（Ｋ−７０１）では、前培養の
窒素源としてアンモニアを用いた場合（２−ａ）および
アンモニアと尿素の両方を用いた場合（２−ｂ）は、ア
ンモニアが消失した後尿素が減少し始めるが、尿素を用
いた場合（２−ｃ）にはアンモニアと尿素が並行して減
少した。

一方ＭＲ−９９株では、前培養の窒素源として　□アン
モニアを用いた場合（２−ｄ）のみアンモニアが消失し
た後尿素が減少し始めたが、アンモニアと尿素の両方を
用いた場合（２−ｅ）と尿素のみを用いた場合（２−ｆ
）の双方でアンモニアと尿素が並行して減少した。

通常、酵母においてアンモニアと尿素が共存している状
態では、尿素を代謝する酵素は抑制されている。しかし
図−２の結果から、ＭＲ−９９株は尿素が存在すればア
ンモニアによる抑制からはずれることは明らかであり、
当初の目的の変異株が得られたことになる。

このことは以下の実験でも裏付けられた。

協会７０１号酵母とＭＲ−９９株について、アンモニア
あるいは尿素を窒素源として前培養し、その菌体ヲ用い
てアンモニアレベルを４０　ｐｐｍ一定とする流加培養
を行った。その時の尿素およびアンモニアの分析結果を
図−３に示す。

尿素で前培養した場合はいずれの酵母でも尿素の減少が
認められた。一方アンモニアで前培養した場合、協会７
０１号酵母では尿素は減少しなかったが、アンモニアに
よる制御から脱抑制されたＭＲ−９９株では尿素の減少
が認められた。

最後に、本発明者らは数珠の尿素低生産性突然変異株を
数十回繰り返して植え継ぎ、変異の安定性を調べた結果
、工業化し得るに充分安定であることを確認し、本発明
を完成するにいたった。

なお本発明においては、アンモニアのアナログ剤として
メチルアミンを用いたが、他のアナログ剤でも同様の結
果が期待できる。

以下に実施例を示す。

実施例１　　（メチルアミン耐性突然変異株の分離とそ
の性質）協会７０１号酵母をＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦
芽エキス０．３％、ペプトン０．５％、ブドウ糖１％）
で１０間増殖培養した。この細胞をメチルアミン２００
ｍＭおよび尿素１０ｍＭ含むｙｃＢ寒天培地に１プレー
ト当り１０個まき、３０°Ｃで４〜６０間培養した。

生育してきたコロニーを単離し、再度上記のＹＣＢ寒天
培地でメチルアミン耐性であることを確認し、耐性がは
っきりしている株６０株を選択した。この６０株はすべ
て硫安０．１％を含むＹＣｌ３培地でよく増殖するので
、アンモニアの透過性の変異ではないと考えられる。

これらの変異株と親株の協会７０１号酵母の菌学的性質
を表−１に示す。

次にこの６０株について前述の一段酵母仕込みの方法に
より清酒醸造過程での尿素生産性や醗酵速度等の醸造特
性を調べた。背後１３０目に−・斉に上槽し、製成酒の
一般成分を国税庁所定分析法により分析した。また尿素
およびアンモニア濃度をベーリンガー・マンハイム社製
のＦ−キットにより分析した。

そのうち１０株の変異株と親株の協会７０１号酵母につ
いての分析結果を表−２に示す。

表−１突然変異株の菌学的性質表−２製成酒の一般成分分析値表−２に示したように、親株の協会７０１号酵母に比べ
て尿素生産性の低い突然変異株が多く得られたが、株に
よっては尿素生産性、醗酵速度あるいは製成酒の酸度に
若干の差があった。これらの株の中から尿素生産性や製
成酒の風味の点で最も優れた株としてＭＲ−９９株を選
択した。

なおこのＭＲ−９９株は工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研菌寄第９２０５号として寄託されている。

実施例２　　（ＭＲ−９９株による清酒醸造）突然変異
株ＭＲ−９９株と親株の協会７０１号について、総米７
ｔの仕込みを行い工業的規模での清酒醸造特性を調査し
た。

仕込み配合を表−３に示した。

ＭＲ−９９株は親株に比べ醗酵がやや遅くもろみ口数も
２０程長くなったが、後半ボーメの切れが弱まるような
ことはなかった。

製成酒の一般成分分析値を表−４に示した。

ＭＲ−９９株による製成酒の尿素濃度は親株の約３０％
と低い値であったが、他の値は酸度を除いてほとんど同
じであった。

表−３仕込み配合表表−４製成酒の一般成分分析値表−４に示したように酸度に若干の差がでたので、有機
酸組成をベーリンガー・マンノλイム社裂のＦ−キット
により分析した。

その結果を表−５に示す。

表−５製成酒の有機酸組成ＭＲ−９９株による製成酒はリンゴ酸の含量が多くスッ
キリした酸味であった。

また１７名のパネルによりペアーテストを３回繰り返し
て官能審査を行った。その結果を表−６に示す。

表−６官能審査結果表−６の結果によると、親株の協会７０１号酵母の酒に
くらべてＭＲ−９９株の酒は優れた成績であった。

（効　果）アンモニアのアナログ耐性突然変異株を用いて清酒醸造
を行うことにより、製成酒の尿素濃度を減らすことがで
き、尿素に起因する酒質劣化の少ない清酒を製造するこ
とができた。

また清酒の火入れ工程や貯蔵中に増加し、食品衛生上好
ましくない成分とされているカルバミン酸エチルエステ
ルは尿素濃度に比例して生成される。従って、本発明に
より当該成分の生成をも抑制し得ることは明らかである
。

さらに製成酒のリンゴ酸含量が増えることは酸味がスッ
キリとしたものになり、現代の嗜好にマツチしたものに
なる。

またこの方法は新たな設備投資も必要でなく、工程が増
えるわけでもないのでコスト面では従来と何ら変わるこ
とがない方法である。

文献１）野山、原、秋山：特許公報　昭５６−２０８３０２
）　Ｒ，Ｊ、Ｒｏｏｎ、Ｂ、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ：　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２４５゜３）　Ｐ、八、Ｗ
ｈｉｔｎｅｙ、Ｔ、Ｇ、Ｃｏｏｐｅｒ：　　ｎｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、　　４０，８１４−８１９　
　（１９７０）４）　Ｐ、八Ｊｈｉｔｎｅｙ、Ｔ、Ｇ、
Ｃｏｏｐｅｒ、Ｂ、Ｍａｇａｓａｎｉｋ：　　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４８．６２０３−　６２０９
　（１９７３）５　）　　Ｔ、Ｇ、Ｃｏｏｐｅｒ：　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ
、。

８２．１２５８−１２６３　　　（１９７８）

【図面の簡単な説明】

図−１は前培養の窒素源としてアンモニアを用いた酵母
、および尿素を用いた酵母で仕込んだ各もろみ中の尿素
濃度の経時変化を示す図である。図−２は親株である協会７０１号酵母と尿素低生産性突
然変異株ＭＲ−９９株について、前培養の窒素源として
アンモニア、尿素、あるいはアンモニアおよび尿素を用
いた場合の、本培養液中のアンモニア濃度および尿素濃
度の経時変化を示す図である。図−３は親株である協会７０１号酵母と尿素低生産性突
然変異株ＭＲ−９９株について、前培養の窒素源として
アンモニアあるいは尿素を用い、アンモニア濃度を一定
にして流加培養を行った時のアンモニア濃度および尿素
濃度の経時変化を示す図である。図−２垢脣時間（ｈｒ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）清酒酵母からメチルアミン耐性突然変異株を分離
し、これを酒母または種菌として尿素濃度の低い清酒を
製造する清酒の製造方法
（２）メチルアミン耐性突然変異株がＭＲ−９９株であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の製造
方法