CN103710278A - 一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，该工程菌构建方法如下：构建URA3基因敲除组件，分别转化a型和α型单倍体黄酒酵母，得尿嘧啶缺陷型菌株；构建含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件，并分别转化所述a型和α型尿嘧啶缺陷型菌株，通过同源重组整合入该菌株基因组，在其DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体工程菌株，重新融合为二倍体，即得低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌。本发明工程菌为原养型，生长和发酵能力与亲本菌株相差无几，可明显降低发酵液中尿素和EC的含量，不引入外源基因，生物安全性高，具有良好的工业化应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程和发酵技术领域，具体涉及一种低产尿素和氨基甲酸乙酯（EC）的工业黄酒酵母代谢工程及其构建方法。
背景技术
氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,简称EC），俗称尿烷，是黄酒发酵过程中伴随产生的有害副产物，具有遗传毒性。随着人们对酒精饮品消费量的增加以及黄酒产业的日益壮大，EC的存在不仅是消费者的健康隐患，更阻碍了黄酒国际化的步伐。因此，控制黄酒中EC的含量显得尤为重要。
尿素是发酵酒中EC的主要前体物质，黄酒中大部分EC来自尿素与乙醇的自发反应产物，而发酵醪液中的尿素的主要来源是由酵母在生长和发酵过程中代谢精氨酸产生。在黄酒发酵过程中，酿酒酵母受到氮代谢阻遏效应（NCR）的影响导致降解尿素的脲基酰胺酶编码基因（DUR1,2）表达水平受到抑制，尿素不能被及时分解，从而被分泌到胞外与发酵醪液中的乙醇发生反应生成EC。
2006年，加拿大van Vuuren研究团队利用代谢工程手段，在葡萄酒工业酵母菌株UC davis522基因组的URA3位点整合入一个组成型高表达脲基酰胺酶基因盒（URA3-PGK1p-DUR1,2-PGK1t-URA3），增强了尿素降解途径，大幅减少了酵母分泌到发酵液中的尿素量，使葡萄酒终产品中EC含量下降了89.1%，其工业化应用亦被批准（Coulon J,etc.(2006)Metabolic Engineering ofSaccharomyces cerevisiae to Minimize the Production of Ethyl Carbamatein Wine.American Journal of Enology and Viticulture57(2):113-124）。
2010年，该团队继续以日本清酒常用工业酵母菌株K7和K9为改造对象，利用相同方法构建了低产尿素工程菌株K7EC-和K9EC-，清酒小试发酵显示两株工程菌较出发菌株EC含量分别下降了87%和68%（Dahabieh M.S.,etc.(2010)Functional enhancement of Sake yeast strains to minimize the productionof ethyl carbamate in Sake wine.Journal of Applied Microbiology109(3):963-973）。
Van Vuuren团队改造的葡萄酒和清酒酵母均为二倍体工业酵母菌株，由于缺少可用的缺陷型筛选标记，所以采用了与质粒共转的方式转化酵母，转化效率低，且该高表达组件（URA3-PGK1p-DUR1,2-PGK1t-URA3）用于单倍体菌株改造时，所获得的工程菌为尿嘧啶缺陷型，会影响酿酒酵母的生长和发酵能力。
发明内容
针对现有技术存在的上述缺陷，本申请人经过研究改进，提供一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌及其构建方法。本发明工程菌为原养型，生长和发酵能力与亲本菌株相差无几，可明显降低发酵液中尿素和EC的含量，且具有生物安全性。
本发明的技术方案如下：
一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其构建方法为：构建URA3基因敲除组件，分别转化a型和α型单倍体黄酒酵母，得尿嘧啶缺陷型菌株；构建含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件，并分别转化所述a型和α型尿嘧啶缺陷型菌株，通过同源重组整合入该菌株基因组，在其DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体工程菌株，重新融合为二倍体，即得低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌。
具体地，其构建步骤如下：
（1）尿嘧啶缺陷型工程菌的构建
以二倍体工业黄酒酵母DNA为模板，分别扩增URA3基因上游同源臂URA3L和URA3R，再以上述URA3L和URA3R为模板利用融合PCR获得URA3基因敲除组件URA3L-URA3R；将该基因敲除组件分别转化两种配型的单倍体工业黄酒酵母，通过5-FOA平板培养基筛选出尿嘧啶缺陷型菌株Δura3；
（3）DUR1,2基因高表达二倍体工业黄酒酵母工程菌的构建
以二倍体工业黄酒酵母DNA为模板，分别扩增DUR1,2基因起始密码子前300～600bp同源臂片段DUR1,2L、起始密码子后300～600bp同源臂片段DUR1,2R、完整URA3基因以及PGK1p强启动子；利用降落PCR将上述四个基因片段融合，以融合片段为模板，经特异性扩展获得含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R；将该高表达组件转化步骤（1）所得尿嘧啶缺陷型菌株Δura3，通过同源重组整合入宿主基因组并在其DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体工程菌株；将所得a型和α型原养型单倍体工程菌株融合，即得低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌。
其进一步的技术方案为：
步骤（1）所述URA3L片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述URA3R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
步骤（1）所述URA3L-URA3R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:4所示。
步骤（2）所述URA3基因片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示。
步骤（2）所述PGK1p片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
步骤（2）所述DUR1,2L片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10所示，所述DUR1,2R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示。
步骤（2）所述降落PCR扩增无引物，其扩增条件如下：95℃预变性4min，98℃变性10s，63℃退火15s，每个循环退火温度降低1℃，共15个循环，72℃延伸3min，然后55℃退火再循环一次，最后72℃再延伸10min。
步骤（2）所述高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R的特异性扩增引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12所示。
步骤（2）中，利用菌落PCR进行黄酒酵母倍性鉴定的扩增引物序列如SEQID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示。
本发明的有益技术效果在于：
本发明以从二倍体工业黄酒酵母分离得到的单倍体菌株为改造对象，首先构建尿嘧啶缺陷型菌株（a型和α型），然后利用降落PCR高效构建含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件，将该组件转化尿嘧啶缺陷型菌株，通过同源重组整合入宿主基因组并在DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，以尿嘧啶缺陷型的恢复为筛选标记获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体酵母工程菌，将改造后的单倍体菌株融合为二倍体后进行黄酒发酵实验，结果表明工程菌的生长和发酵能力与亲本菌株相差无几，而且可明显降低发酵液中尿素和EC的含量；此外，本发明构建的高表达组件中所有基因片段均以黄酒酵母自身基因组为模板扩增得到，因此所获工程菌不含外源基因，生物安全性高，具有良好的工业化应用前景。同时，本发明思路也适用于其他基因的高表达。
附图说明
图1为实施例1中融合PCR构建URA3基因敲除组件的琼脂糖凝胶电泳结果，M：DNA分子量Marker；1：URA3L扩增片段（510bp）；2：URA3R扩增片段（416bp）；3：URA3L-URA3R扩增片段（926bp）。
图2为实施例1中尿嘧啶缺陷型转化子的PCR鉴定结果，M：DNA分子量Marker；1、2：两个Δura3阳性转化子（926bp）；3、4：两个Δura3阴性对照（1151bp）。
图3为实施例2含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件构建及宿主整合示意图，将构建的高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R转化Δura3菌株，通过同源重组的原理整合入宿主基因组并在DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，从而达到高表达DUR1,2基因的目的。
图4为实施例2中降落PCR构建高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R的基因片段琼脂糖凝胶电泳结果，M：DNA分子量Marker；1：DUR1,2L扩增片段（490bp）；2：URA3扩增片段（1235bp）；3：PGK1p扩增片段（781bp）；4：DUR1,2R扩增片段（482bp）；5：DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R扩增片段（2989bp）。
图5为实施例2中DUR1,2基因高表达工程菌转化子的PCR鉴定结果，M：DNA分子量Marker；1、2：两个阳性转化子（2989bp）；3：阴性对照（1182bp）。
图6为实施例2中PCR鉴定黄酒酵母工程菌倍性的琼脂糖凝胶电泳结果，M：DNA分子量Marker；1、4：二倍体菌株（扩增出544bp和404bp两条带）；2、3：a型单倍体（544bp）。
图7为实施例3中二倍体工业黄酒酵母工程菌与亲本菌株发酵过程中的CO2失重曲线。
具体实施方式
以下结合附图，并通过实施例对本发明进行具体说明。
以下实施例所涉及实验材料如下：
菌株：二倍体工业黄酒酵母（亲本菌株）购自国家黄酒工程技术研究中心；单倍体工业黄酒酵母菌株（a型和α型）的分离方法参见以下文献：Wu DH,etc.(2013)Isolation of haploid from an industrial Chinese rice wine yeast formetabolic engineering manipulation.J I Brewing119：288-293）。
试剂与试剂盒：Prime STAR DNA Polymerase（2.5U/μL）、Ex Taq（5U/μL）、MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit、MiniBEST Agrose GelDNA Extraction kit均购自宝生物工程（大连）有限公司。
黄酒发酵实验所使用糯米、生麦曲、熟麦曲均购自国家黄酒工程技术研究中心。
其他试剂和原料均为国产或进口分析纯产品。
实施例1～实施例3实验中所使用引物序列如表1所示。
表1引物序列表
注：上表中下划线代表用于融合的序列。
实施例1尿嘧啶缺陷型酵母工程菌Δura3的构建
1.URA3基因敲除组件的构建
提取亲本菌株基因组DNA（具体操作方法参见MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit试剂盒使用说明书）；以该基因组DNA为模板，利用Prime STAR DNA Polymerase分别使用引物对P1/P2和P3/P4扩增URA3基因上游同源臂（URA3L）和下游同源臂（URA3R），然后使用P1/P4引物，通过融合PCR将URA3L和URA3R融合获得URA3基因敲除组件（URA3L-URA3R）（融合PCR具体操作方法及反应体系配制参见Prime STARDNA Polymerase说明书）。
各引物对的扩增程序如下：
（1）P1/P2和P3/P4：95℃预变性4min，（98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸30s）进行30个循环，72℃再延伸5min；
（2）P1/P4：95℃预变性4min，（98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸60s）进行30个循环，72℃再延伸5min；
PCR扩增结果如图1所示。
由图1可知，扩增得到的URA3L-URA3R片段大小约为920bp，与预期结果一致，送样上海生工测序结果正确，说明URA3基因敲除组件构建成功。
2.单倍体黄酒酵母URA3基因的敲除
利用电转化的方法将上述获得的URA3L-URA3R片段分别转化a型和α型单倍体工业黄酒酵母，具体步骤如下：
（1）挑取酵母单菌落接种于1mL YPD液体培养基，于30℃200r/min过夜培养，得活化种子液；
（2）按照体积比10%的接种比例，将种子液转接至50mL新鲜的YPD液体培养基，于30℃200r/min继续培养至菌液OD600在1.2～1.5之间；
（3）5000r/min离心5min收集菌体，用25mL无菌水离心洗涤菌体两次；
（4）用8mL10mM DTT溶液重悬菌体，于30℃水浴振荡30min，5000r/min离心5min收集菌体；
（5）用15mL4℃预冷的1M山梨醇溶液重悬菌体，于5000r/min4℃离心5min收集菌体；
（6）重复步骤（5）三次；
（7）用0.5mL1M山梨醇重悬菌体，取80μL菌液，加入10μL转化片段以及20μL1mg/mL鲑鱼精DNA，混合后转入电击杯，冰上放置5min后，1.5kv电击；
（8）加入890μL YPD培养基将电转液洗出转移到1.5mL离心管内，于30℃150r/min复苏2h，涂布于5-FOA（5-氟乳清酸）培养基[0.17%(w/v)YNB(Yeast Nitrogen Base without Amino Acids),2%(w/v)glucose,0.5%(w/v)ammonium sulfate,2%(w/v)agar,0.005%(w/v)uracil,0.125%(w/v)5-FOA]平板，于30℃培养至菌落长出；
（9）挑取转化子并提取基因组作为模板，使用引物对P1/P4进行PCR扩增以鉴定URA3基因被敲除的阳性转化子。
PCR鉴定结果如图2所示。图2中，1、2泳道扩增片段大小为920bp左右，为阳性转化子，3、4泳道扩增片段大小为1100bp左右，为阴性对照。分别回收条带后，送样上海生工测序结果正确，说明尿嘧啶缺陷型工程菌Δura3构建成功。
实施例2脲基酰胺酶基因（DUR1,2）高表达的二倍体工业黄酒酵母工程菌的构建
1.含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R的构建
构建的示意图见图3。首先，以工业黄酒酵母基因组DNA为模板，利用Prime STAR DNA Polymerase使用引物对P5/P6、P7/P8、P9/P10、P11/P12分别扩增URA3基因、PGK1p强启动子、DUR1,2起始密码子前同源臂（DUR1,2L）、DUR1,2起始密码子后同源臂（DUR1,2R）。然后以等摩尔的四个片段为模板，不加引物进行降落PCR将上述四个片段进行融合。PCR反应体系见表2：
表225μL PCR反应体系
PCR扩增程序如下：95℃预变性4min，然后进入PCR扩增程序，98℃变性10s，63℃退火15s，每个循环退火温度降低1℃，共15个循环，72℃延伸3min，然后55℃退火再循环一次，最后72℃再延伸10min，反应完毕，得到URA3、PGK1p、DUR1,2L、DUR1,2R四个扩增片段的融合片段。以得到的融合片段为模板，使用引物对P9/P12对该融合片段进行特异性扩增，PCR反应体系的配制如表3所示：
表325μL PCR反应体系
PCR扩增程序如下：95℃预变性4min，（94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸180s）进行15个循环，72℃再延伸10min，扩增完毕，得到酿酒酵母含有PGK1p强启动子的基因片段（DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R）。
PCR扩增结果如图4所示。由图4可知，由降落PCR融合四个片段所得到的片段大小为3000bp左右，与预期片段大小一致，送样上海生工测序结果正确，说明含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R构建成功。
2.DUR1,2基因高表达单倍体酵母工程菌的构建
利用电转化的方法将上述获得的DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R片段分别转化实施例1所得a型和α型的尿嘧啶缺陷型菌株，酵母感受态的制备同实施例1，转化后的菌液涂布于基本培养基[0.17%(w/v)YNB,2%(w/v)glucose,0.5%(w/v)ammonium sulfate,2%(w/v)agar]平板，待菌落长出后提取基因组使用引物P9/P12进行PCR鉴定。
PCR鉴定结果如图5所示。图5中，1、2泳道扩增片段大小为3000bp左右，为阳性转化子，3泳道扩增片段大小为1200bp左右，为阴性对照。分别回收条带后，送样上海生工测序结果正确，说明高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R转化成功，脲基酰胺酶基因高表达的单倍体酵母工程菌构建成功。
3.DUR1,2基因高表达二倍体酵母工程菌的构建
将上述获得的两种配型的DUR1,2基因高表达单倍体酵母工程菌进行融合，获得DUR1,2基因高表达二倍体酵母工程菌，具体步骤如下：
（1）将两种配型的单倍体菌株分别接种于5mL YPD液体培养基，30℃培养24h；
（2）各取1mL上述菌液混合接种于装有20mL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，100rpm摇床培养24h；
（3）将菌液离心（3500rpm，10min）收集菌体，用生理盐水离心洗涤两次，最后悬浮在10mL生理盐水中，将悬浮液适当稀释，取0.1mL涂布YPD平板，30℃培养至菌落长出。
（4）使用引物P13/P14/p15进行菌落PCR，鉴定二倍体菌株。
PCR扩增结果如图6所示。使用引物P13/P14/p15进行酵母倍性鉴定时，扩增出544bp条带的菌株为a型单倍体，扩增出404bp条带的菌株为α型单倍体，两条带都有的为二倍体，由图6可知，1和4泳道为二倍体菌株、2、3泳道为a型单倍体菌株。
实施例3黄酒发酵实验
将实施例2中获得的二倍体酵母工程菌与亲本菌株一起进行黄酒发酵实验以考察工程菌降低尿素和EC含量的能力，具体操作步骤如下：
（1）浸米
取50g糯米，加水浸过米层10cm左右，室温浸渍48h；
（2）蒸煮
将浸好的米进行常压蒸煮，有大量蒸汽冒出后维持25min，至颗粒均匀，内无白心，熟而不粘，软而不烂；
（3）拌饭
将米饭置于通风处冷却，摊凉至27℃左右后，添加熟麦曲1.5g，生麦曲7g，水85g；
（4）前酵
发酵醪液按10%的接种量接入经过活化的酵母种子液，摇匀，加发酵栓于30℃进行发酵至24h失重量少于2g；
（5）后酵
将发酵醪置于15℃放置25d进行后酵；
（6）过滤
使用滤纸进行过滤，参照GB/T13662-2008中的方法进行常规理化指标测定，发酵液中尿素和EC的测定分别参考文献1（邢江涛,等.高效液相色谱-荧光检测器法测定黄酒中尿素含量[J].酿酒科技,2011(3):104-106.）和参考文献2（Wu PG,etc.(2012)A survey of ethyl carbamate in fermented foods andbeverages from Zhejiang,China.Food Control23(1):286-288）；
菌株的CO2失重曲线见图7，发酵液理化指标的测定结果见表4，尿素和EC的含量见表5。
表4发酵液中理化指标的测定
| 菌株 | 酒精度(%) | 总糖（g/L） | 总酸（g/L） | 氨基酸态氮（g/L） | pH值 |
| 亲本菌株 | 15.0 | 4.36 | 3.83 | 0.95 | 4.61 |
| 工程菌 | 15.0 | 4.79 | 3.68 | 0.98 | 4.63 |
由图7和表4可知，工程菌生长和发酵能力与亲本菌株相似；发酵液常规理化指标无明显差异；
表5发酵液中尿素和EC含量的测定
| 菌株 | 尿素（mg/L） | 尿素降低率（%） | EC*（μg/L） | EC降低率（%） |
| N85 | 22.5 | - | 24.8 | - |
| N85-17 | 10.2 | 54.7 | 15.4 | 37.9 |
由表5可知，与亲本菌株相比，工程菌能够降低发酵液中50%的尿素含量，并在一定程度上降低了发酵液中EC的含量；同时，由于尿素含量的降低，在储酒过程中工程菌的发酵液生成EC的含量将要比亲本菌株少。
综上所述，本发明通过降落PCR高效构建了含PGK1p强启动子及URA3基因的高表达组件，转化尿嘧啶缺陷型单倍体菌株后，通过同源重组获得原养型恢复的工程菌，重新融合为二倍体的工程菌可明显降低发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯的含量，且工程菌与亲本菌株的生长发酵能力相似，发酵液中理化指标含量也无明显差异。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于构建方法为：构建URA3基因敲除组件，分别转化a型和α型单倍体黄酒酵母，得尿嘧啶缺陷型菌株；构建含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件，并分别转化所述a型和α型尿嘧啶缺陷型菌株，通过同源重组整合入该菌株基因组，在其DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体工程菌株，重新融合为二倍体，即得低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌。
2.根据权利要求1所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其具体构建步骤如下：
（1）尿嘧啶缺陷型工程菌的构建
以二倍体工业黄酒酵母DNA为模板，分别扩增URA3基因上游同源臂URA3L和URA3R，再以上述URA3L和URA3R为模板利用融合PCR获得URA3基因敲除组件URA3L-URA3R；将该基因敲除组件分别转化两种配型的单倍体工业黄酒酵母，通过5-FOA平板培养基筛选出尿嘧啶缺陷型菌株Δura3；
（2）DUR1,2基因高表达二倍体工业黄酒酵母工程菌的构建
以二倍体工业黄酒酵母DNA为模板，分别扩增DUR1,2基因起始密码子前300～600bp同源臂片段DUR1,2L、起始密码子后300～600bpp同源臂片段DUR1,2R、完整URA3基因以及PGK1p强启动子；利用降落PCR将上述四个基因片段融合，以融合片段为模板，经特异性扩展获得含有PGK1p强启动子和URA3基因的高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R；将该高表达组件转化步骤（1）所得尿嘧啶缺陷型菌株Δura3，通过同源重组整合入宿主基因组并在其DUR1,2基因起始密码前插入PGK1p强启动子，获得DUR1,2基因高表达的原养型单倍体工程菌株；将所得a型和α型原养型单倍体工程菌株融合，即得低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌。
3.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（1）所述URA3L片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述URA3R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（1）所述URA3L-URA3R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:4所示。
5.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述URA3基因片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
6.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述PGK1p片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
7.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述DUR1,2L片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述DUR1,2R片段的扩增引物序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
8.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述降落PCR扩增无引物，其扩增条件如下：95℃预变性4min，98℃变性10s，63℃退火15s，每个循环退火温度降低1℃，共15个循环，72℃延伸3min，然后55℃退火再循环一次，最后72℃再延伸10min。
9.根据权利要求2所述低产尿素的工业黄酒酵母代谢工程菌，其特征在于：步骤（2）所述高表达组件DUR1,2L-URA3-PGK1p-DUR1,2R的特异性扩增引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12所示。
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