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ES2451573T3 - Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina - Google Patents

Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina Download PDF

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ES2451573T3
ES2451573T3 ES11168826.3T ES11168826T ES2451573T3 ES 2451573 T3 ES2451573 T3 ES 2451573T3 ES 11168826 T ES11168826 T ES 11168826T ES 2451573 T3 ES2451573 T3 ES 2451573T3
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ES
Spain
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adjuvant
mpl
vaccine
immunization
antigen
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ES11168826.3T
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English (en)
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Pierre Vandepapeliere
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GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Publication date
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Abstract

Una composición inmunógena que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvanteque comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja SaponariaMolina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicholipopolisacárido están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 1 μg y 30 μg por dosis, para su usocomo un medicamento humano.

Description

Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina
Campo técnico
La presente invención se refiere a composiciones de vacunas mejoradas, a procedimientos para fabricarlas y a suuso en medicina. En particular, la invención se refiere a composiciones de vacunas potenciadas potenciadas con adyuvante en las que el adyuvante es una formulación liposomal, que comprende una saponina y un lipopolisacárido.
Antecedentes técnicos
Se necesitan siempre composiciones o vacunas nuevas con una inmunogenicidad mejorada. Como estrategia, se han usado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada por cualquier antígeno dado.
Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas superficiales principales y se encuentran exclusivamente en la lámina externa de la membrana exterior de bacterias gram-negativas. Los LPS impiden la destrucción de la bacteria por complementos del suero y células fagocíticas y están implicados en la adherencia para la colonización. Los LPS son un grupo de moléculas complejas estructuralmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Dalton de tamaño yconsisten en tres regiones unidas de forma covalente:
(i)
una cadena de polisacárido O-específica (antígeno O) en la región externa
(ii)
una región central de oligosacárido del núcleo
(iii) lípido A-la región más interna que sirve como unión hidrófoba, comprende unidades de disacárido de glucosamina que llevan ácidos grasos de cadena larga.
Se ha mostrado que las actividades biológicas de LPS, tales como toxicidad letal, pirogenicidad y capacidad de actuar como adyuvantes, están relacionadas con el resto de lípido A. Por el contrario, la inmunogenicidad está asociada con el componente de polisacárido O-específico (antígeno O). Tanto los LPS como el lípido A se conocen desde hace tiempo por sus efectos adyuvantes fuertes, pero la alta toxicidad de estas moléculas ha impedido su uso en formulaciones de vacunas. Se ha hecho por lo tanto un esfuerzo significativo para reducir la toxicidad de los LPS
o lípido A manteniendo al mismo tiempo su capacidad de actuar como adyuvantes.
El mutante R595 de Salmonella minnesota se aisló en 1996 a partir de un cultivo de la cepa parental (lisa) (Luderitzy col. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374). En las colonias seleccionadas se exploró su susceptibilidad a lisis con un grupo de fagos y solo las colonias que presentaron un intervalo de sensibilidad estrecho (susceptibles a uno
o dos fagos solamente) se seleccionaron para estudio adicional. Este esfuerzo condujo al aislamiento de una cepa mutante rugosa profunda que es defectuosa en la biosíntesis de LPS y se denomina S. minnesota R595.
En comparación con otros LPS, los producidos por el mutante S. minnesota R595 tienen una estructura relativamente sencilla.
(i)
no contienen región O-específica-una característica que es responsable de la deriva del fenotipo liso de tipo salvaje al fenotipo rugoso mutante y produce una pérdida de virulencia
(ii)
la región del núcleo es muy corta-esta característica aumenta la susceptibilidad de la cepa a una diversidad de productos químicos
(iii) el resto de lípido A está altamente acilado con hasta 7 ácidos grasos.
El 4’-monofosforil lípido A (MPL), que puede obtenerse por la hidrólisis ácida de LPS extraído de una cepa mutante rugosa profunda de bacterias gram-negativas, mantiene las propiedades adyuvantes de los LPS demostrando una toxicidad que está reducida en un factor de más de 1000 (como se mide por dosis letal en huevos embrionarios de pollo) (Johnson y col. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl.: S512-S516). Los LPS se calientan a reflujo típicamente en soluciones de ácido mineral para moderar su fuerza (por ejemplo, HCl 0,1 M) durante un periodo deaproximadamente 30 minutos. Este procedimiento produce desfosforilación en la posición 1 y descarbohidrataciónen la posición 6’, produciendo MPL.
El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), que puede obtenerse por hidrólisis alcalina leve de MPL, tiene una toxicidad reducida adicionalmente manteniendo de nuevo la capacidad de actuar como adyuvantes, véase eldocumento US 4.912.094 (Ribi Immunochemicals). La hidrólisis alcalina se realiza típicamente en disolvente orgánico, tal como una mezcla de cloroformo/metanol, por saturación con una solución acuosa de una base débil, talcomo carbonato sódico 0,5 M a pH 10,5.
Se dispone de información adicional sobre la preparación de 3D-MPL en, por ejemplo, los documentos US 4.912.094 y WO02/078637 (Corixa Corporation).
Las saponinas de Quillaja son una mezcla de glucósidos de triterpeno extraídos de la corteza del árbol Quillajasaponaria. Se han empleado de forma extensa saponinas brutas como adyuvantes veterinarios. Quil-A es un extracto acuoso parcialmente purificado del material de saponina de Quillaja. QS21 es una fracción no tóxica purificada por HPLC de Quil A y su procedimiento de producción se describe (como QA21) en la Patente de Estados Unidos N.º: 5.057.540.
A modo de ejemplo, se han desarrollado vacunas contra la gripe y vacunas contra el virus de papiloma humano (VPH) con adyuvantes.
El documento WO96/33739 divulga una composición de vacuna que comprende una saponina inmunológicamente activa y un esterol.
Todavía hay una necesidad de vacunas mejoradas.
Los adyuvantes que contienen lipopolisacáridos y saponinas de Quillaja se han descrito anteriormente, por ejemplo en el documento EP0671948. Esta patente demostró una fuerte sinergia cuando se combinaba un lipopolisacárido (3D-MPL) con una saponina de Quillaja (QS21). Ahora se ha descubierto que pueden conseguirse buenas propiedades adyuvantes con combinaciones de lipopolisacárido y saponina de quillaja como inmunoestimulantes en una composición adyuvante incluso cuando los inmunoestimulantes están presentes en bajas cantidades en una dosis humana.
Estado de la invención
La presente invención proporciona una composición inmunógena que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de lacorteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en dicha dosis humana a un nivel de entre 1 μgy 30 μg, para su uso como un medicamento humano.
Adecuadamente, el adyuvante de saponina en forma de un liposoma de acuerdo con la invención comprende una fracción activa de la saponina obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21 y un esterol, tal como colesterol, en una proporción saponina:esterol de 1:1 a 1:100 p/p.
En particular, dicha composición inmunógena comprende un antígeno con un epítopo de célula T CD4. Como alternativa, dicha composición inmunógena comprende un antígeno con un epítopo de célula B.
Se revela en el presente documento el uso de (a) un antígeno o preparación antigénica del mismo y (b) unadyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento en la preparación de una composición inmunógena para inducir, en un ser humano, al menos una, o al menos dos, o todas de las siguientes: (i) una respuesta inmunitaria de células T CD4 mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (ii) una respuesta inmunitaria humoral mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (iii) una respuesta de células B de memoria mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo.
También se revela en el presente documento el uso de un antígeno o preparación antigénica del mismo y unadyuvante según se define en el presente documento en la preparación de una composición inmunógena para lavacunación de un ser humano, en particular un ser humano adulto anciano, contra el patógeno del que se obtiene elantígeno en la composición inmunógena.
Como se revela en la presente memoria, la composición inmunógena puede inducir una respuesta inmune decélulas T CD4 mejorada frente a dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, y en particular es capaz, adicionalmente, de inducir, bien una respuesta inmune humoral, o bien una respuesta de células B de memoria mejorada, o ambas, en comparación con la que se obtiene con el antígeno o composición antigénica sin adyuvante. Especificamente dicha respuesta inmune de c´lulas T CD4 implica la inducción de una respuesta auxiliar de T CD4de reactividad cruzada. Especificamente dicha respuesta inmune humoral implica la inducción de una respuesta inmune humoral de reactividad cruzada.
También se revela en el presente documento un procedimiento o uso como se ha definido anteriormente en el presente documento para protección contra infecciones o enfermedades causadas por un patógeno que es una variante del patógeno del que se deriva el antígeno en la composición inmunógena. Se revela adicionalmente o usocomo se ha definido anteriormente en el presente documento para protección contra infecciones o enfermedades causadas por un patógeno que comprende un antígeno que es una variante del antígeno de la composición inmunogénica. También se revela en el presente documento el uso de un antígeno o preparación antigénica del mismo en la preparación de una composición inmunógena para revacunación de seres humanos vacunados previamente con una composición inmunógena que comprende un antígeno, o preparación antigénica del mismo, en combinación con un adyuvante como se describe en el presente documento.
También se revela una composición usada para la revacunación puede contener adicionalmente un adyuvante. Ladivulgación se refiere adicionalmente a la composición inmunógena para revacunación que contiene un antígeno que comparte epítopos de células T CD4 comunes con un antígeno o preparación antigénica usada para una vacunación anterior.
Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la siguiente descripcióndetallada de las realizaciones preferidas de la misma.
Descripción de las figuras
Figura 1-representación esquemática de preparación de MPL.
Figura 2-Respuesta humoral contra diversas cepas de gripe después de la inmunización de hurones con formulaciones experimentales: Ensayo de Inhibición de la Hemaglutinación (GMT +/-CI95) antes y después de la sensibilización heteróloga (H1N1 A/Estocolmo/24/90), después de la inmunización (H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 y B/Shangdong/7/97) y después de estimulación heteróloga (H3N2 A/Wyoming/3/2003).
Figura 3-Estudio con hurones: titulación viral en lavados nasales después de la estimulación (Día 42).
Figura 4-Estudio con ratones: Respuesta humoral contra las tres cepas de vacuna de gripe después de lainmunización de ratones con formulaciones experimentales: Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (GMT +/-CI95) 21 días después de la inmunización (H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Wyoming/3/2003 yB/Jiangsu/10/2003).
Figura 5-Estudio con ratones: Respuesta inmunitaria mediada por células: Respuestas de células T CD4+ específicas de gripe el Día 7 Después de la inmunización.
Figura 6-Estudio con ratones: CMI para CD4-Cepa combinada (todo doble)-Día 0 y Día 21.
Figura 7-GMT en los días 0 y 21 para anticuerpos HI.
Figura 8: frecuencia de síntomas locales y generales en seres humanos (total y relacionada con el grado 3) durante el periodo de seguimiento de 7 días después de la inmunización con formulaciones de virus de la gripe potenciadascon adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 9: respuestas humorales a VPH 16 y 18 L1 en ratones después de la inmunización con formulaciones de VPHpotenciadas con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 10: respuesta inmunitaria mediada por células en ratones: tinción de citocina intracelular-PSV16 y células TCD4+ 18 después de la inmunización con formulaciones de VPH potenciadas con adyuvante, comparandoadyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 11: producción de células B de memoria específicas después de la inmunización con formulaciones de VPHpotenciadas con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 12: comparación preclínica de vacunas de S. pneumoniae potenciadas con adyuvante en ratones,comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 13: titulaciones de ELISA Anti-gB en cobaya después de la inmunización con vacuna Gb potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 14: titulaciones neutralizantes Anti CMV en cobaya después de la inmunización con vacuna Gb potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes que tienen dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes.
Figura 15: titulaciones de ELISA Anti-gB en Ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada con adyuvante.
Figura 16: titulaciones neutralizantes Anti CMV en ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada con adyuvante.
Figura 17: estudio con ratones: inmunidad mediada por células-Células CD4+ y CD8+ específicas para CMV después de la re-estimulación con una reserva de péptidos gB (7 días después de la segunda inmunización).
Figura 18: estudio con ratones. Inmunidad mediada por células-Células CD4+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segunda inmunización).
Figura 19: estudio con ratones. Inmunidad mediada por células-Células CD8+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segunda inmunización).
Figura 20: titulaciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra proteína de Circumsporozoito CSP después de la inmunización con vacuna RTS,S potenciada con adyuvante en ratones; comparando adyuvantes que tienen inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 21: titulaciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra antígeno de superficie de Hepatitis B (HB) después de la inmunización con vacuna RTS,S potenciada con adyuvante en ratones; comparando adyuvantes con inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 22: expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para CSP después de la inmunización con una composición inmunógena RTS, S potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes con inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 23: expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para HB después de la inmunización con una composición inmunógena RTS, S potenciada con adyuvante, comparando adyuvantes con inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 24: respuestas humorales en ratones después de la inmunización con vacuna contra la gripe dividida trivalente potenciada con adyuvante (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu), inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 25: respuesta inmunitaria mediada por células en ratones después de inmunización con vacuna contra lagripe potenciada con adyuvante (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu), inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 26: resultados preclínicos en ratones de comparación del adyuvante para vacunas VZV gE con AS01 B o AS01 E.
Figura 27: titulaciones virales de lavados nasales tras sensibilización y exposición a antígenos del virus de la gripeinmunización con A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante o con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes, en hurones.
Figura 28: monitorización de la temperatura corporal en hurones tras sensibilización y exposición a antígenos de la gripe. Inmunización con A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu sin adyuvante o con composiciones adyuvantesque comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 29: titulaciones anti HI para las cepas A en la formulación de vacuna trivalente tras inmunización y exposición a preparaciones del antígeno de la gripe. Inmunización con A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu bien simple obien con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Figura 30: titulaciones anti HI para las cepas B/Jiangsu y de deriva usadas para la exposición tras inmunización y exposición a preparaciones del antígeno de la gripe. Inmunización con A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu bien simple o bien con composiciones adyuvantes que comprenden inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes.
Descripción detallada
Los autores de la presente invención han descubierto que una composición adyuvante que comprende una saponina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, donde cada inmunoestimulante está presente a un nivel en o por debajo de 30 !g por dosis humana puede mejorar las respuestas inmunitarias contra una preparación antigénica, teniendo al mismo tiempo una reactogenicidad inferior que algunas de las formulaciones de la técnica anterior donde los inmunoestimulantes estaban presentes a niveles superiores por dosis humana.
Los autores de la presente invención han descubierto adicionalmente que una formulación contra la gripe que comprende un virus de la gripe o preparación antigénica del mismo junto con un adyuvante que comprende una saponina presentada en forma de un liposoma y opcionalmente también con un derivado de lípido A tal como 3D-MPL, fue capaz de mejorar la respuesta inmunitaria de células T CD4 contra dicho antígeno o composición antigénica en comparación con la obtenida con el virus o preparación antigénica del mismo sin adyuvante. Las formulaciones potenciadas con el adyuvante saponina presentada en forma de un liposoma se usan de manera ventajosa para inducir respuestas de células T CD4 anti-gripe capaces de detectar epítopos de la gripe presentados por moléculas MHC de clase II. El presente solicitante ha descubierto que es eficaz dirigir el sistema inmune mediado por células para aumentar la sensibilidad frente a cepas de la gripe homólogas y de deriva (después de la vacunación e infección).
Los autores de la presente invención han descubierto que la composición adyuvante definida en el presente documento demuestra resultados de inmunogenicidad para la producción de anticuerpos y la frecuencia de CD4 con especificidad para la gripe después de la vacunación que son equivalentes a, o a veces superiores a, los generadoscon vacuna sin adyuvante. Este efecto es en particular de valor para la población anciana y puede conseguirse con un adyuvante definido en el presente documento que contiene una dosis inferior de inmunoestimulantes. Además, los síntomas de reactogenicidad mostraron una tendencia a ser superiores en el grupo que recibió la vacuna con adyuvante con la concentración más alta de inmunoestimulantes en comparación con el grupo que recibió la vacuna con adyuvante en la que los inmunoestimulantes están a una concentración inferior.
Estos descubrimientos pueden aplicarse a otras formas de los mismos antígenos y a otros antígenos.
Adyuvante saponina
Una saponina particularmente adecuada para su uso en la presente invención es Quil A y sus derivados. Quil A esuna preparación de saponina aislada del árbol de América del Sur Quillaja Saponaria Molina y se describió por primera vez por Dalsgaard y col. en 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlín, páginas 243-254) que tiene actividad adyuvante. Los fragmentos purificados de Quil A se han aislado por HPLC que mantiene su actividad adyuvante sin la toxicidad asociada con Quil A (documento EP 0 362 278), por ejemplo, QS7 y QS21 (también conocidos como QA7 y QA21). QS-21 es una saponina natural obtenida de la corteza de Quillaja saponaria Molina, que induce células T citotóxicas CD8+ (CTL), células Th1 y unarespuesta de anticuerpos predominante de IgG2a y es una saponina preferida en el contexto de la presente invención.
En una forma adecuada de la presente invención, el adyuvante saponina en la composición inmunógena es underivado de saponaria molina quil A, preferiblemente una fracción inmunológicamente activa de Quil A, tal como QS17 o QS-21, adecuadamente QS-21. En una realización las composiciones de la invención contienen la fracción desaponina inmunológicamente activa en forma sustancialmente pura. Preferiblemente, las composiciones de la invención contienen QS21 en forma sustancialmente pura, es decir, la QS21 es al menos el 90% pura, por ejemplo al menos el 95% pura, o al menos el 98% pura.
En una realización específica, QS21 se proporciona en su composición menos reactogénica donde se inactiva con un esterol exógeno, tal como colesterol por ejemplo. Existen varias formas particulares de composiciones menos reactogénicas donde QS21 se inactiva con un colesterol exógeno. En una realización específica, la saponina/esterol está en forma de una estructura de liposoma (documento WO 96/33739, Ejemplo 1). En esta realización los liposomas contienen adecuadamente un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, que es adecuadamente no cristalina a temperatura ambiente, por ejemplo fosfatidilcolina de la yema del huevo, dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) o dilauril fosfatidilcolina. Los liposomas también pueden contener un lípido cargado que aumenta la estabilidad de la estructura liposoma-QS21 para liposomas compuestos de lípidos saturados. En estos casos la cantidad de lípido cargado es adecuadamente del 1-20% p/p, preferiblemente del 5-10%. La proporción de esterol a fosfolípidos es del 1-50% (mol/mol), adecuadamente del 20-25%.
Los esteroles adecuados incluyen ∀-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. En una realización particular, la composición adyuvante comprende colesterol como esterol. Estos esteroles son bien conocidos en la técnica, por ejemplo se describe el colesterol en el Merck Index, 11ª Edn., página 341, como unesterol de origen natural encontrado en la grasa animal.
Las composiciones adyuvantes de la invención que comprenden QS21 y un esterol, colesterol en particular,muestran una reactogenicidad disminuida cuando se comparan con composiciones en las que el esterol está ausente, aunque se mantiene el efecto adyuvante. Los estudios de reactogenicidad pueden evaluarse de acuerdo con los procedimientos revelados en el documento WO 96/33739. El esterol de acuerdo con la invención se escoge para que indique un esterol exógeno, es decir un esterol que no es endógeno para el organismo del que se toma la preparación antigénica pero se añade a la preparación antigénica o posteriormente en el momento de la formulación. Típicamente, el esterol puede añadirse durante la formulación posterior de la preparación de antígeno con el adyuvante saponina, usando, por ejemplo, la saponina en su forma inactivada con el esterol. Adecuadamente el esterol exógeno se asocia con el adyuvante saponina como se describe en el documento WO 96/33739.
Cuando la fracción de saponina activa es QS21, la proporción de QS21:esterol será típicamente del orden de 1:100a 1:1 (p/p), adecuadamente entre 1:10 y 1:1 (p/p) y preferiblemente 1:5 a 1:1 (p/p). Adecuadamente está presente exceso de esterol, siendo la proporción de QS21:esterol de al menos 1:2 (p/p). En una realización, la proporción de QS21:esterol es 1:5 (p/p). El esterol es adecuadamente colesterol.
Otras saponinas útiles se obtienen de las plantas Aesculus hippocastanum o Gyophilla struthium. Otras saponinasque se han descrito en la bibliografía incluyen Escina, que se ha descrito en el Merck index (12a ed: entrada 3737)como una mezcla de saponinas que se encuentra en la semilla del castaño de indias, Lat: Aesculus hippocastanum. Su aislamiento se describe por cromatografía y purificación (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) y por resinas de intercambio iónico (Erbring y col., documento US 3.238.190). Las fracciones de escina se han purificado y han demostrado ser biológicamente activas (Yoshikawa M y col. (Chem Pharm Bull (Tokio) 1996 agosto; 44(8):14541464)). La Sapoalbina de Gypsophilla struthium (R. Vochten y col., 1968, J. Pharm. Belg., 42, 213-226) también seha descrito con relación a la producción de ISCOM por ejemplo.
Un aspecto clave de la presente invención es el hecho de que la saponina inmunológicamente activa, que espreferiblemente QS21, puede usarse a cantidades inferiores que las que se habían creído previamente útiles, especificamente entre 1 y 30 μg, por dosis humana de la composición inmunógena.
Por lo tanto, la invención proporciona una dosis humana de una composición inmunógena que comprende saponina inmunológicamente activa, preferiblemente QS21, a un nivel de entre 1 y 30 μg.
En una realización, una composición inmunógena en un volumen que es adecuado para una dosis humana, en laque la dosis humana de la composición inmunógena comprende QS21 a un nivel de aproximadamente 25 μg, por ejemplo entre 20-30 μg, adecuadamente entre 21-29 μg o entre 22 y 28 μg o entre 23 y 27 μg o entre 24 y 26 μg, o 25 μg.
En otra realización, la dosis humana de la composición inmunógena comprende QS21 a un nivel de aproximadamente 10 μg por, por ejemplo, entre 5 y 15 μg, adecuadamente entre 6 y 14 μg, por ejemplo entre 7 y 13 μg, o entre 8 y 12 μg, o entre 9 y 11 μg, o 10 μg.
En una realización adicional, la dosis humana de la composición inmunógena comprende QS21 que está presente aun nivel de aproximadamente 5 μg, por ejemplo entre 1 y 9 μg, o entre 2 y 8 μg o adecuadamente entre 3 y 7 μg o 4y 6 μg, o 5 μg.
Una cantidad adecuada de QS21 es por ejemplo cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, μg (p/v) por dosis humana de la composición inmunógena.
Con la expresión “dosis humana” se quiere decir una dosis que está en un volumen adecuado para uso humano. En general está entre 0,3 y 1,5 ml. En una realización, una dosis humana es 0,5 ml. En una realización adicional, una dosis humana es mayor de 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, una dosis humana es entre 1 ml y 1,5 ml. La invención se caracteriza porque cada dosis humana contiene 30 μg o menos, por ejemplo entre 1 y 30 μg, de QS21.
Donde el adyuvante está en una forma líquida para combinarse con una forma líquida de una composición antigénica, la composición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana que es aproximadamente la mitad del volumen final pretendido de la dosis humana, por ejemplo un volumen de 360 μl para una dosis humana pretendida de 0,7 ml o un volumen de 250 μl para una dosis humana pretendida de 0,5 ml. La composiciónadyuvante se diluye cuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis humana final de vacuna. El volumen final de dicha dosis por supuesto variará dependiendo del volumen inicial de la composición adyuvante y del volumen de la composición de antígeno añadido a la composición adyuvante. Alternativamente, eladyuvante líquido se usa para reconstituir una composición antigénica liofilizada. En tales casos, el volumen adecuado de la dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composición adyuvante líquida se añade al vial que contiene la composición antigénica liofilizada. Ladosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml. En una realización particular, la dosis humana es 0,5 ml, en esta realización la composición de vacuna de la invención comprenderá un nivel de QS21 entre 1 y 30 μg, por 0,5 ml de dosis humana.
La dosis de QS21 es adecuadamente capaz de potenciar una respuesta inmunitaria contra un antígeno en un ser humano. En particular una cantidad adecuada de QS21 es la que mejora el potencial inmunológico de la composición en comparación con la composición sin adyuvante, o en comparación con la composición potenciada con otra cantidad de QS21, siendo aceptable de un perfil de reactogenicidad.
Adyuvante 3D-MPL
La composición comprende adicionalmente un adyuvante adicional que es un lipopolisacárido, adecuadamente un derivado no tóxico de lípido A, particularmente monofosforil lípido A o más particularmente monofosforil lípido A 3desacilado (3D-MPL).
3D-MPL se vende con el nombre MPL por GlaxoSmithKline Biologicals N.A. y se menciona en todo el documento como MPL o 3D-MPL. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.ºs: 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y
4.912.094. 3D-MPL promueve principalmente las respuestas de células T CD4+ con un fenotipo IFN-g (Th1). 3D-MPL puede producirse de acuerdo con los procedimientos revelados en el documento GB 2 220 211 A. Químicamente es una mezcla de monofosforil lípido A 3-desacilado con 3, 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Preferiblemente en las composiciones de la presente invención se usa 3D-MPL de partícula pequeña. 3D-MPL departícula pequeña tiene un tamaño de partícula tal que puede filtrarse a esterilidad a través de un filtro de 0,22 !m. Dichas preparaciones se describen en el documento WO 94/21292.
Un aspecto clave de la presente invención es el hecho de que el lipopolisacárido, que es preferiblemente 3D-MPL, puede usarse a cantidades inferiores que las que se habían creído anteriormente útiles, adecuadamente a un nivel de 30 μg o menos, por ejemplo entre 1 y 30 μg, por dosis humana de la composición inmunógena.
Por lo tanto la invención proporciona una dosis humana de una composición inmunógena que comprende lipopolisacárido, preferiblemente 3D-MPL, a un nivel de 3 entre 1 y 30 μg.
En una realización, la dosis humana de la composición inmunógena comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 25 μg, por ejemplo entre 20-30 μg, adecuadamente entre 21-29 μg o entre 22 y 28 μg o entre 23 y 27 μg o entre 24 y 26 μg, o 25 μg.
En otra realización, la dosis humana de la composición inmunógena comprende 3D-MPL a un nivel de aproximadamente 10 μg, por ejemplo entre 5 y 15 μg, adecuadamente entre 6 y 14 μg, por ejemplo entre 7 y 13 μg oentre 8 y 12 μg o entre 9 y 11 μg, o 10μg.
En una realización adicional, la dosis humana de la composición inmunógena comprende 3D-MPL a un nivel deaproximadamente 5 μg, por ejemplo entre 1 y 9 μg, o entre 2 y 8 μg o adecuadamente entre 3 y 7 μg o 4 y 6 μg, o 5 μg.
Una cantidad adecuada de 3D-MPL es por ejemplo cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, μg (p/v) por dosis humana de la composición inmunógena.
En una realización, el volumen de la dosis humana es 0,5 ml. En una realización adicional, la composicióninmunógena está en un volumen adecuado para una dosis humana cuyo volumen es mayor de 0,5 ml, por ejemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 ml. En una realización adicional, la dosis humana es entre 1 ml y 1,5 ml. La invención secaracteriza porque cada dosis humana contiene 30 μg o menos, por ejemplo entre 1 y 30 μg de 3D-MPL.
Donde el adyuvante está en una forma líquida para combinarse con una forma líquida de una composición antigénica, la composición adyuvante estará en un volumen adecuado de dosis humana que es aproximadamente la mitad del volumen final pretendido de la dosis humana, por ejemplo un volumen de 360 μl para una dosis humana pretendida de 0,7 ml o un volumen de 250 μl para una dosis humana pretendida de 0,5 ml. La composiciónadyuvante se diluye cuando se combina con la composición de antígeno para proporcionar la dosis human final de la composición inmunógena. El volumen final de tal dosis por supuesto variará dependiendo del volumen inicial de la composición adyuvante y del volumen de la composición de antígeno añadido a la composición adyuvante.Alternativamente, la composición adyuvante líquida se usa para reconstituir una composición antigénica liofilizada. En esta realización, el volumen adecuado de dosis humana de la composición adyuvante es aproximadamente igual al volumen final de la dosis humana. La composición adyuvante líquida se añade al vial que contiene la composición antigénica liofilizada. La dosis humana final puede variar entre 0,5 y 1,5 ml. En una realización particular la dosis humana es 0,5 ml, en esta realización la composición de vacuna de la invención comprenderá un nivel de 3D-MPL entre 1 y 30 μg, por 0,5 ml de dosis humana.
La dosis de 3D-MPL es adecuadamente capaz de permitir que se potencie una respuesta inmune a un antígeno en un ser humano. En particular una cantidad adecuada de 3D-MPL es la que mejora el potencial inmunológico de la composición comparado con la composición no potenciada con adyuvante, o comparada con la composiciónpotenciada con adyuvante con otra cantidad de MPL, mientras que es aceptable a partir de un perfil de reactogenicidad.
Las composiciones adecuadas de la invención son aquellas en las que los liposomas se preparan inicialmente sin MLP (como se describe en el documento .WO 96/33739) y después se añade MPL, de manera adecuada comopartículas por debajo de partículas de 100 nm o partículas que son susceptibles de filtración estéril a través de membrana de 0,22 μm. Por lo tanto, MPL no está contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL fuera). Las composiciones en las que MLP está contenido dentro de la membrana de vesícula (conocido como MPL dentro) también forman un aspecto de la invención. El antígeno puede estar contenido dentro de la membrana de la vesícula o contenido fuera de la membrana de la vesícula. Los antígenos solubles adecuados están fuera y los antígenos hidrófobos o lipídicos están bien contenidos dentro o bien fuera de la membrana.
La composición inmunogénica de la invención comprende tanto lipopolisacárido como saponina inmunológicamente activa. En una realización específica de la invención, el lipopolisacárido es 3D-MPL y la saponinainmunológicamente activa es QS21.
En una realización adicional de la invención, la composición adyuvante comprende una formulación liposomal delipopolisacárido y saponina inmunológicamente activa en combinación con uno o más inmunoestimulantes o adyuvantes adicionales. De manera adecuada en una forma de esta realización el lipopolisacárido es 3D-MPL y lasaponina inmunológicamente activa es QS21.
En una realización específica, QS21 y 3D-MPL están presentes en la misma concentración final por dosis humana de la composición inmunógena. En un aspecto de esta realización, una dosis humana de composición inmunógena comprende un nivel final de 25 μg de 3D-MPL y 25 μg de QS21. En una realización final, una dosis humana decomposición inmunógena comprende un nivel final de 10 μg de cada uno de MPL y QS21. En una realización específica adicional se proporciona una composición adyuvante que tiene un volumen de 250 μl y comprende un nivel de 25 μg de 3D-MPL y 25 μg de QS21, o 10 μg de cada uno de MPL y QS21.
Los antígenos ejemplares de C trachomatis se seleccionan de CT858, CT 089, CT875, MOMP, CT622, PmpD, PmpG y fragmentos de los mismos, SWIB y fragmentos inmunogénicos de cualquiera de los mismos (tales como PmpDpd y PmpGpd) y combinaciones de los mismos. Las combinaciones preferidas de antígenos incluyen CT858, CT089 y CT875. Se describen en el documento WO2006/104890 secuencias y combinaciones específicas que pueden emplearse.
Propiedades inmunógenas de la composición inmunógena usada para la vacunación de la presenteinvención
En la presente invención la composición inmunógena es preferentemente capaz de inducir una respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada frente a al menos uno de los antígeno(s) componente(s) o composición antigénica en comparación con la mejorada respuesta inmunitaria de las células T CD4 obtenida con la correspondientecomposición que no está potenciada por adyuvante, es decir que no contiene ningún adyuvante exógeno (en elpresente documento también denominada “composición simple”).
Por “respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada“ se pretende decir que se obtiene una mayor respuesta de las células CD4 en un mamífero tras la administración de la composición inmunógena potenciada por adyuvante que la obtenida tras la administración de la misma composición sin adyuvante.
La respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada puede evaluarse midiendo el número de células que producen cualquiera de las siguientes citocinas:
#
células que producen al menos dos diferentes citocinas (CD40L, IL-2, IFN∃, TNF%)
#
células que producen al menos CD40L y otra citocina (IL-2, TNF%, IFN∃)
#
células que producen al menos IL-2 y otra citocina (CD40L, TNF% IFN∃)
#
células que producen al menos IFNγ y otra citocina (IL-2, TNF%,CD40L)
#
células que producen al menos TNFα y otra citocina (IL-2, CD40L, IFN∃)
Habrá una respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada cuando las células que producen alguna de las citocinas anteriores se encuentren en mayor cantidad después de la administración de la composición potenciada con adyuvante en comparación con la administración de la composición sin potenciar con adyuvante. Normalmente se cumplirán al menos una, preferentemente dos de las cinco condiciones mencionadas anteriormente en elpresente documento. En una forma de realización determinada, las células productoras de las cuatro citocinas estarán presentes en una cantidad superior en el grupo adyuvado en comparación con el grupo sin potenciar con adyuvante.
En otra forma de realización, la administración de dicha composición inmunógena induce una respuesta de células Bde memoria B mejorada en pacientes a los que se ha administrado la composición inmunógena potenciada con adyuvante en comparación con la respuesta de células B de memoria inducida en individuos inmunizados con lacomposición sin potenciar con adyuvante. Una respuesta de células B de memoria mejorada se pretende que quieradecir un incremento de la frecuencia de los linfocitos B de sangre periférica capaces de diferenciarse en células plasmáticas secretoras de anticuerpos tras el encuentro con el antígeno, medido mediante la estimulación de la diferenciación in vitro.
En otra forma de realización, la administración de dicha composición inmunógena induce una respuesta humoral mejorada en pacientes a los que se ha administrado la composición inmunógena potenciada con adyuvante en comparación con la respuesta humoral inducida en individuos inmunizados con la composición sin potenciar por adyuvante. Dicha respuesta inmunitaria humoral se puede medir de acuerdo con cualquiera de los procedimientos detallados en el Ejemplo 1 y especialmente en las secciones I.1 (I.1.1), I.2 (I.2.1) e I.3 (I.3.5.2).
En una forma de realización específica, la administración de dicha composición inmunógena potenciada con adyuvante induce al menos dos de las siguientes respuestas: (i) una respuesta inmunitaria de las células T CD4 mejorada, (ii) una respuesta de células memoria B mejorada, (iii) una respuesta humoral mejorada, contra al menos uno de los antígeno(s) componente(s) o composición antigénica en comparación con cualquiera de las respuestas inmunitarias obtenidas con la correspondiente composición que está sin potenciar con adyuvante, es decir que nocontiene ningún adyuvante exógeno (en el presente documento también denominada “composición simple”).
En otra forma más de realización específica, la vacunación con la composición de la primera vacunación potenciada con adyuvante, no posee ningún impacto mensurable sobre la respuesta de las células CD8.
Medio de vacunación
Las composiciones inmunógenas de la invención se pueden administrar por cualquier vía de la administración adecuada, tal como intradérmica, mucosa, por ejemplo intranasal, oral, intramuscular o subcutánea. En la técnica se conocen bien otras vías de administración.
Para la composición inmunógena potenciada con adyuvante se prefiere la vía de administración intramuscular.
La administración intradérmica es otra vía adecuada. Para la administración intradérmica se puede usar cualquier dispositivo adecuado, por ejemplo dispositivos con agujas cortas tales como los descritos en los documentos US4,886,499, US5,190,521, US 5,328,483, US 5,527,288, US 4,270,537, US 5,015,235, US 5,141,496, US 5,417,662.Las vacunas intradérmicas también pueden administrarse a través de dispositivos que limitan la longitud de lapenetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los descritos en los documentos WO99/34850 y EP1092444 ylos equivalentes funcionales de los mismos. También son adecuados los dispositivos de chorro que administran vacunas líquidas en la dermis a través de un inyector de chorro líquido o de una aguja que perfora el estrato córneoy produce un chorro que alcanza la dermis. Los dispositivos de inyección de chorro se describen, por ejemplo, en los documentos US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520, 639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 y WO 97/13537. También son adecuados los dispositivos de administración balística de polvo/partículas que usan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a través de las capas externas de la piel y hacia la dermis. Además, se puedenusar jeringas convencionales en el procedimiento manthoux clásico de administración intradérmica.
Otra vía de administración adecuada es la vía subcutánea. Para la administración subcutánea se puede usar cualquier dispositivo adecuado, por ejemplo una aguja clásica. Preferentemente se usa un servicio de inyector achorro sin aguja, tal como el publicado en los documentos WO 01/05453, WO 01/05452, WO 01/05451, WO01/32243, WO 01/41840, WO 01/41839, WO 01/47585, WO 01/56637, WO 01/58512, WO 01/64269, WO 01/78810, WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, WO 02/34317. Más preferentemente, dicho dispositivo está precargadocon la formulación de vacuna líquida.
Alternativamente la vacuna se administra por vía intranasal. Normalmente, la vacuna se administra localmente en el área nasofaríngea, preferentemente sin que sea inhalada a los pulmones. Es deseable usar un dispositivo deadministración intranasal que administra la formulación de la vacuna en el área nasofaríngea, sin entrar o sustancialmente sin entrar en los pulmones.
Los dispositivos preferidos para la administración intranasal de las vacunas de acuerdo con la invención son dispositivos de aerosol. Los dispositivos de aerosol nasal adecuados disponibles comercialmente incluyen AccusprayTM (Becton Dickinson). Los nebulizadores producen un aerosol muy fino que puede ser inhalado con facilidad hacia los pulmones y por tanto, no alcanzan de forma eficaz la mucosa nasal. Por tanto no se prefieren los nebulizadores.
Los dispositivos de aerosol preferidos para uso intranasal son los dispositivos para los que el funcionamiento del dispositivo no depende de la presión aplicada por el usuario. Estos dispositivos se conocen como dispositivos de presión umbral. El líquido sale por la boquilla únicamente cuando se aplica una presión umbral. Estos dispositivos facilitan alcanzar un aerosol con un tamaño de gota regular. En la técnica se conocen los dispositivos de presión umbral para su uso con la presente invención y se describen por ejemplo en los documentos WO 91/13281 y EP 311 863 B y EP 516 636. Tales dispositivos están disponibles comercialmente en Pfeiffer GmbH y también se han descrito en Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, septiembre de 1999.
Los dispositivos intranasales preferidos producen gotas (medidas usando agua como el líquido) en el intervalo de 1 a 200 !m, preferentemente de 10 a 120 !m. Por debajo de 10 !m existe un riesgo de inhalación, por lo que esdeseable no tener más de aproximadamente el 5% de las gotas por debajo de 10 !m. Las gotas por encima de 120!m no se extienden tan bien como las gotas más pequeñas, por lo que es deseable que no más de aproximadamente el 5% de las gotas supere los 120 !m.
La administración de dos dosis es otra característica de un sistema de administración intranasal para su uso con las vacunas de acuerdo con la invención. Los dispositivos bidosis contienen dos subdosis de una única dosis de lavacuna, una subdosis para administrar en cada fosa nasal. En general, las dos subdosis están presentes en una única cámara y la construcción del dispositivo permite la administración eficaz de una única subdosis cada vez.Como alternativa, se puede usar un dispositivo monodosis para administrar las vacunas de acuerdo con la invención.
Como alternativa, la vía de vacunación epidérmica o transdérmica también se contempla en la presente invención.
Poblaciones a vacunar
La población objetivo para vacunar pueden ser seres humanos inmunocomprometidos. En general, los seres humanos inmunocomprometidos son bastante menos capaces de responder a un antígeno, en comparación con adultos sanos.
Regímenes de vacunación, dosificación y criterios adicionales de eficacia
Adecuadamente las composiciones inmunógenas de acuerdo con la presente invención son una dosis inyectable estándar de 0,5 ml en la mayoría de los casos. Adecuadamente, el volumen de la dosis de la vacuna será de entre 0,5 ml y 1 ml, en particular un volumen de dosis de vacuna estándar de 0,5 ml o 0,7 ml.
Se revela un procedimiento para diseñar una vacuna para las enfermedades que se sabe que se curan o tratan mediante activación de células T CD4+, que comprende
1) seleccionar un antígeno que contenga epítopos de CD4+ y
2) combinar dicho antígeno con adyuvante saponina en forma de liposoma como se ha definido anteriormente en elpresente documento, donde dicha vacuna tras la administración en dicho mamífero es capaz de inducir una mejor respuesta de células T CD4 en dicho mamífero.
Para evitar las dudas en los términos “que comprende”, “comprende”, los autores de la invención pretenden en elpresente documento que sean opcionalmente sustituibles con los términos “que consiste en”, “consiste en”, respectivamente en cada caso.
La invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos de referencia, no limitantes:
El Ejemplo de referencia I describe procedimientos inmunológicos usados en estudios con ratones, hurones y seres humanos.
El Ejemplo de referencia II describe una preparación del adyuvante liposómico MPL/QS21.
El Ejemplo de referencia III describe una evaluación preclínica de vacunas potenciadas con adyuvante y sin potenciar con adyuvante en hurones.
El Ejemplo de referencia IV muestra una evaluación preclínica de vacunas frente a la gripe potenciadas con adyuvante y sin potenciar con adyuvante en ratones C57Bl/6 no expuestos y sensibilizados.
El Ejemplo de referencia V describe una comparación de vacunas frente a la gripe potenciadas con adyuvante con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes en ratones.
El Ejemplo de referencia VI describe una comparación de vacunas frente a la gripe potenciadas con adyuvante con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes en seres humanos ancianos.
El Ejemplo de referencia VII describe una evaluación preclínica de vacunas frente a VPH potenciadas con adyuvante en ratones.
El Ejemplo de referencia VIII describe una evaluación preclínica de composiciones inmunógenas frente a citomegalovirus potenciadas con adyuvante y sin potenciar con adyuvante.
El Ejemplo de referencia IX describe la evaluación preclínica de una composición vacunal frente a RTS,Spotenciada con adyuvante con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes.
El Ejemplo de referencia X describe la evaluación clínica de una vacuna RTS,S potenciada con adyuvante con 3D-MPL a dos concentraciones diferentes.
Ejemplo de referencia I–Procedimientos de lectura inmunológica
I.1. Procedimientos en ratones I.1.1. Prueba de inhibición de la hemaglutinación
Procedimiento de ensayo
Las titulaciones de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (HI). El principio de la prueba de la HI se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros inactivados con calor se trataron previamente con caolín y RBCde pollo eliminando los inhibidores no específicos. Tras el pretratamiento, diluciones a la mitad de suero se incubaron con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos depollo y se clasificó la inhibición de la aglutinación. Las titulaciones se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:20,un nivel indetectable se clasificó como una titulación igual a 10.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron en las titulaciones de HI posteriores a la vacunación usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
●
Transformación log de los datos
●
Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos
●
Prueba de Cochran para verificar la homogeneidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)
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Análisis bilateral de la varianza realizado en los grupos
●
Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples
I.1.2. Tinción intracelular de citocinas Esta técnica permite una cuantificación de linfocitos T específicos de antígeno sobre la base de la producción de
citocinas: las células T efectoras y/o las células T de memoria-efectoras producen IFN-γ y las células T de memoria centrales producen IL-2. Las PBMC se recogen el día 7 después de la inmunización.
Las células linfoides se reestimulan in vitro en presencia de un inhibidor de la secreción (Brefeldina): Estas células se procesan a continuación mediante procedimiento de inmunofluorescencia convencional usando anticuerpos fluorescentes (CD4, CD8, IFN-γ y IL-2). Los resultados se expresan en forma de frecuencia de células positivas para citocinas en las células T CD4/CD8. La tinción intracelular de las citocinas de las células T se realizó en las PBMC 7días después de la segunda inmunización. Se recogió sangre de ratones y se agrupó en medio heparinizado RPMI + Ad. Para la sangre se estratificaron las suspensiones de RPMI + Ad diluidas en PBL en un gradiente de linfocitomamífero de acuerdo con el protocolo recomendado (centrífuga 20 min a 2500 rpm a TA). Las células mononucleares en la interfase se extrajeron, se lavaron 2 veces en RPMI + Ad y las suspensiones de PBMC seajustaron a 2 x 106 células/ml en RPMI con 5% de suero bovino fetal.
La estimulación antigénica in vitro de las PBMC se llevó a cabo a una concentración final de 1 x 106 células/ml (en tubo para FACS) con gripe trivalente dividida en μesferas (5 μg de HA/cepa) o Fl entera (1 μg de HA/cepa) ydespués se incubó 2 horas a 37 ºC con la adición de anti-CD28 y anti-CD49d (1 μg/ml para ambos).
La adición de ambos anticuerpos aumentó la proliferación y la producción de citocinas por parte de las células T yNK activadas y puede proporcionar una señal coestimuladora para la inducción de LTC.
Además, las PBMC también se estimularon durante la noche con gripe trivalente dividida (30 μg de HA/cepa) o Fl entera (5 μg de HA/cepa) en pulsos de BMDC (1 x 105 células/ml), que se prepararon mediante pulsos de BMDC con gripe dividida (60 μg de HA/cepa) o gripe trivalente entera Fl (10 μg de HA/cepa) durante 6 horas a 37 ºC. Tras la reestimulación antigénica, las PBMC se incuban O.N. a 37ºC en presencia de Brefeldina (1μg/ml) a 37ºC inhibiendo la secreción de citocina.
La tinción de IFN-γ /IL-2/CD4/CD8 se realizó del siguiente modo: las suspensiones celulares se lavaron, se resuspendieron en 50 μl de PBS con 1% de FCS que contenga 2% de reactivo bloqueante de Fc (1/50; 2.4G2). Tras 10 min de incubación a 4ºC, se añadieron 50 μl de una mezcla de anti-CD4-PE (2/50) y anti-CD8-perCp (3/50) y se incubaron durante 30 min a 4ºC. Tras un lavado en PBS y 1% de FCS, las células se permeabilizaron mediante resuspensión en 200 μl de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) y se incubaron 20 min a 4ºC. A continuación, las células selavaron con Perm Wash (Kit BD) y se resuspendieron con 50 μl de una mezcla de anti-IFN-γ APC (1/50) + anti-IL-2FITC (1/50) diluida en Perm Wash. Tras una incubación de como mínimo 2 horas y como máximo durante toda la noche a 4ºC, las células se lavaron con Perm Wash y se resuspendieron en PBS con 1% de FCS + 1% deparaformaldehído. El análisis de la muestra se realizó con FACS. Las células vivas se agruparon (FSC/SSC) y la adquisición se realizó en ~ 50.000 sucesos (linfocitos) o 35.000 sucesos en células T CD4+. Los porcentajes de IFNγ + o IL2+ se calcularon en poblaciones agrupadas de CD4+ and CD8+.
I.2. Procedimientos en hurones I.2.1. Prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Procedimiento de ensayo
Las titulaciones de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (HI). El principio de la prueba de la HI se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros se trataron primero con una solución al 25% de neuraminidasa(RDE) y se inactivaron con calor eliminando los inhibidores inespecíficos. Tras el pretratamiento, diluciones a la mitad de sueros se incubaron con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación seañadieron los eritrocitos de pollo y se clasificó la inhibición de la aglutinación usando gotas para la lectura. Las titulaciones se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo lahemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se clasificó como unatitulación igual a 5.
Análisis estadístico.
Los análisis estadísticos se realizaron con titulaciones de HI (día 41 antes de la provocación) usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
●
Transformación log de los datos.
●
Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos.
●
Prueba de Cochran para verificar la homogeneidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)
●
Prueba para la interacción de ANOVA unilateral.
●
Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples.
I.2.2. Lavados nasales
Los lavados nasales se realizaron mediante la administración de 5 ml de PBS en ambas fosas nasales en animales despiertos. El inóculo se recogió en una placa petri y se situó en contenedores de muestras en hielo seco.
Titulación viral en lavados nasales
Todas las muestras nasales primero se filtraron en esterilidad a través de filtros Spin X (Costar) eliminando toda contaminación bacteriana. 50 μl de diluciones seriadas de diez en diez de lavados nasales se transfirieron a placas de microtitulación conteniendo 50 μl de medio (10 pocillos/dilución). A continuación se añadieron 100 μl de células MDCK (2,4 x 105 células/ml) a cada pocillo y se incubaron a 35ºC durante 5-7 días. Tras 6-7 días de incubación, el medio de cultivo se elimina suavemente y se añaden 100 μl de un medio que contiene 1/20 WST-1 y se incuban durante otras 18 horas.
La intensidad del pigmento amarillo formazán producido tras la reducción de WST-1 mediante células viables esproporcional al número de células viables presente en el pocillo al final del ensayo de titulación vírica y se cuantifica midiendo la absorbancia de cada pocillo a la longitud de onda adecuada (450 nanómetros). El valor de corte se define como la DO media de las células control no infectadas, 0,3 DO (0,3 DO corresponde a una desviación estándar de +/-3 de la DO de las células control no infectadas). Una puntuación positiva se define cuando la DO es lt; del valor de corte y en contraste una puntuación negativa se define cuando la DO es gt; del valor de corte. Las titulaciones de eliminación del virus se determinaron mediante “Reed y Muench” y se expresaron en forma deDICT50/ml.
I.3. Análisis para evaluar la respuesta inmunitaria en seres humanos I.3.1. Análisis de inhibición de la hemaglutinación
La respuesta inmunitaria se determinó midiendo los anticuerpos de HI usando el procedimiento descrito por el Centro colaborador de la OMS para la gripe, Centros de Control de Enfermedades, Atlanta, EE.UU. (1991).
Las mediciones de la titulación de anticuerpos se realizaron en muestras de suero congeladas descongeladas con un microprocedimiento normalizado y validado exhaustivamente usando 4 unidades inhibidoras de la hemaglutinación (4 UIH) de los antígenos adecuados y una suspensión al 0,5% de eritrocitos de ave de corral. Los inhibidores séricos no específicos se eliminaron mediante tratamiento con calor y enzima destructora del receptor.
Los sueros obtenidos se evaluaron para determinar los niveles de anticuerpos de HI. Comenzando con una dilución inicial de 1:10, se preparó una serie de diluciones (por un factor de 2) hasta una dilución final de 1:20480. El criterio de valoración de la titulación se tomó como la etapa de dilución más elevada que mostró inhibición completa (100%) de la hemaglutinación. Todos los análisis se realizaron por duplicado.
I.3.2. Análisis de inhibición de la neuraminidasa
El análisis se realizó en placas de microtitulación recubiertas con fetuina. Se preparó una serie de diluciones a la mitad del antisuero y se mezcló con una cantidad normalizada de virus de la gripe A H3N2, H1N1 o de virus de lagripe B. La prueba se basó en la actividad biológica de la neuraminidasa que enzimáticamente libera ácido neuramínico a partir de la fetuina. Tras la escisión del ácido neuramínico terminal se descubrió ß-D-galactosa-Nacetil-galactosamina. A los pocillos se añadió aglutinina de cacahuete de Arachis hypogaea marcado con peroxidasa de rábano pocante (HRP), que se une de forma específica a las estructuras de galactosa. La cantidad de aglutinina unida se puede detectar y cuantificar en una reacción de sustrato con tetra-metilbenzidina (TMB). La dilución deanticuerpos más elevada que todavía inhibe la actividad de neuraminidasa viral en al menos un 50% es la titulación de IN.
I.3.3. Análisis de anticuerpos neutralizantes
Las mediciones de los anticuerpos neutralizantes se llevaron a cabo en muestras de suero congeladasdescongeladas. La neutralización de virus por los anticuerpos contenidos en el suero se determinó en un análisis de microneutralización. Los sueros se usaron sin posterior tratamiento en el análisis.
Cada suero se analizó por triplicado. Una cantidad normalizada de virus se mezcló con diluciones seriadas de sueroy se incubó permitiendo la unión de los anticuerpos al virus. A continuación a la mezcla de virus y antisuero seañadió una suspensión celular que contenía una cantidad definida de células MDCK y se incubó a 33 ºC. Tras elperiodo de incubación, la replicación se visualizó mediante hemaglutinación de eritrocitos de pollo. La titulación de neutralización del 50% de un suero se calculó mediante el procedimiento de Reed and Muench.
I.3.4. La inmunidad mediada por células se evaluó mediante citometría de flujo de citocinas (CFC)
Las células T DC4 y CD8 específicas de antígeno de sangre periférica se pueden reestimular in vitro produciendo IL2, CD40L, TNF-alfa e IFN si se incuban con su correspondiente antígeno. En consecuencia, las células T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar por citometría de flujo tras marcaje con inmunofluorescencia convencional del fenotipo celular así como por producción de citocinas intracelulares. En el presente estudio, comoantígeno para reestimular las células T específicas de la gripe se usaron el antígeno de la vacuna de la gripe así como péptidos derivados de proteína de la gripe específica. Los resultados se expresaron en forma de una frecuencia de células T CD4 o CD8 positivas para citocina(s) dentro de la subpoblación de células T CD4 o CD8.
I.3.5. Procedimientos estadísticos
I.3.5.1. Criterios de valoración principales
# Porcentaje, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales solicitados durante un periodo de seguimiento de 7 días (es decir, día de la vacunación y 6 días posteriores) después de la vacunación y globales.
# Porcentaje, intensidad y relación con la vacunación de los signos y síntomas locales y generales no solicitados durante un periodo de seguimiento de 21 días (es decir, día de la vacunación y 20 días posteriores)
después de la vacunación y globales. # Aparición de acontecimientos adversos serios durante el estudio completo.
I.3.5.2. Criterios de valoración secundarios
Para la respuesta inmunitaria humoral:
Variables observadas:
# En los días 0 y 21: titulaciones de anticuerpos de inhibición de la hemoaglutinación (HI) y NI en suero, ensayados por separado frente a cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).
# En los días 0 y 21: titulaciones de anticuerpos neutralizantes, ensayados por separado frente a cada una delas tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna.
Variables derivadas (con intervalos de confianza del 95%):
# Titulaciones en media geométrica (GMT) de anticuerpos HI en suero con intervalos de confianza del 95% (95% CI) antes y después de la vacunación.
#
Proporciones de seroconversión* con 95% CI el día 21.
#
Factores de conversión** con 95% CI en el día 21.
#
Proporciones de seroprotección*** con 95% CI en el día 21.
#
GMT de anticuerpo NI en suero (con intervalos de confianza del 95%) en todos los momentos puntuales
* La proporción de seroconversión se define como el porcentaje de vacunados que tienen al menos un aumento de 4veces en las titulaciones HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0, para cada cepa de vacuna.
** El factor de conversión se define como el aumento en veces en GMT HI en suero en el día 21 en comparación conel día 0, para cada cepa de vacuna.
*** La proporción de protección se define como el porcentaje de vacunados con una titulación HI en suero = 40después de la vacunación (para cada cepa de vacuna) que se acepta habitualmente como indicador de protección.
Para la respuesta inmunitaria mediada por células (CMI)
Variable observada
En los días 0 y 21: frecuencia de células T CD4/CD8 positivas a citocinas por 106 en diferentes ensayos. Cada ensayo cuantifica la respuesta de células T CD4/CD8 a:
•
Antígeno peptídico (pf) de la gripe (la naturaleza y origen precisos de estos antígenos tiene queproporcionarse/explicarse).
•
Antígeno de la gripe dividido (sf).
•
Antígeno de la gripe completo (wf).
Variables derivadas:
•
células que producen al menos dos citocinas diferentes (CD40L, IL-2, IFN∃, TNF%)
•
células que producen al menos CD40L y otra citocina (IL-2, TNF%, IFN∃)
•
células que producen al menos IL-2 y otra citocina (CD40L, TNF%, IFN∃)
•
células que producen al menos IFN∃ y otra citocina (IL-2, TNF%, CD40L)
•
células que producen al menos TNF% y otra citocina (IL-2, CD40L, IFN∃)
I.3.5.3. Análisis de inmunogenicidad
El análisis de inmunogenicidad se basó en la cohorte vacunada total. Para cada grupo de tratamiento, se calcularonlos siguientes parámetros (con intervalos de confianza del 95%):
•
Titulaciones en media geométrica (GMT) de titulaciones de anticuerpo HI y NI en los días 0 y 21.
•
Titulaciones en media geométrica (GMT) de titulaciones de anticuerpo neutralizante en los días 0 y 21.
•
Factores de conversión en el día 21.
•
Proporciones de seroconversión (SC) en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados que tienen al menosun aumento de 4 veces en las titulaciones HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0.
•
Proporciones de protección en el día 21 definido como el porcentaje de vacunados con una titulación HI en suero =
1:40.
•
La frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 que secretan en respuesta se resumió (estadística descriptiva) para cada grupo de vacunación, en cada momento puntual (Día 0, Día 21) y para cada antígeno (de la gripe peptídico (pf), dela gripe dividido (sf) y de la gripe completo (wf)).
•
Estadística descriptiva en la diferencia individual entre respuestas en momentos puntuales (posterior-anterior) para cada grupo de vacunación y cada antígeno (pf, sf y wf) en cada uno de los 5 diferentes ensayos.
•
Se usó un ensayo no paramétrico (ensayo de Kruskall-Wallis) comparando las diferencias de localización entre los 3 grupos y se calculó el valor p estadístico para cada antígeno en cada uno de los 5 ensayos diferentes. Todos los ensayos de significancia tuvieron dos extremos. Los valores p menores o iguales a 0,05 se consideraron comoestadísticamente significativos.
Ejemplo de referencia II-Preparación del adyuvante liposomal MPL/QS21
II.3 Preparación de suspensión líquida de MPL
Se prepara la carga líquida de MPL (como se usa en todo el documento es una abreviatura de 3D-MPL, es decir, monofosforil lípido 3-O-desacilado) a partir de 3D-MPL en polvo liofilizado. La carga líquida de MPL es una dispersión acuosa concentrada estable (alrededor de 1 mg/ml) del material sin procesar, que está listo para su uso para una formulación de vacuna o adyuvante. Se proporciona una representación esquemática del procedimiento de preparación en la Figura 1.
Para un tamaño de lote máximo de 12 g, se lleva la preparación de carga líquida de MPL a recipientes de vidrio estériles. La dispersión de MPL consta de las siguientes etapas:
-
se suspende el polvo de MPL en agua para inyección.
-
se disgregan cualesquiera agregados grandes calentando (tratamiento térmico).
-
se reduce el tamaño de partícula entre 100 nm y 200 nm por microfluidización.
-
se precarga la preparación en una unidad de prefiltro Sartoclean, 0,8/0,65 μm.
-
se filtra en esterilidad la preparación a temperatura ambiente (unidad P Sartobran, 0,22 μm).
Se liofiliza el polvo de MPL por microfluidización dando como resultado una dispersión acuosa coloidal estable (tamaño de partículas de MPL susceptible para filtración estéril). El polvo liofilizado de MPL se dispersa en agua para inyección para obtener una suspensión gruesa de 10 mg/ml. La suspensión después experimenta untratamiento térmico con agitación. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se inicia el procedimiento demicrofluidización disminuyendo el tamaño de partícula. La microfluidización se realiza usando un aparatoMicrofluidics M110EH, por circulación continua de la dispersión a través de una cámara de interacción de microfluidización, a una presión definida durante una cantidad mínima de pases (cantidad de ciclos: nmin). La duración de la microfluidización, que representa la cantidad de ciclos, se calcula en base al caudal medido y el volumen de dispersión. En un equipo dado a una presión dada, el caudal resultante puede variar de una cámara deinteracción a otra y durante todo el ciclo vital de una cámara de interacción particular. En el presente ejemplo la cámara de interacción usada es del tipo F20Y Microfluidics. Como la eficacia de la microfluidización está unida a la presión acoplada-caudal, el tiempo de procesado puede variar de un lote a otro. El tiempo necesario para 1 ciclo se calcula en base al caudal. El caudal a considerar es el caudal medido con agua para inyección justo antes de laintroducción de MPL en el aparato. Un ciclo se define como el tiempo (en minutos) necesario para que el volumen total de MPL pase una vez a través del aparato. El tiempo necesario para obtener n ciclos se calcula del siguiente modo:
n x cantidad de MPL a tratar (ml)/caudal (ml/min)
La cantidad de ciclos por tanto se adapta en consecuencia. La cantidad mínima de ciclos a realizar (nmin) se describepara el equipo preferido y cámaras de interacción usadas. La cantidad total de ciclos a procesar se determina por el resultado de una medida del tamaño de partícula realizada después de nmin ciclos. Se define un límite del tamaño de partícula (dlim) en base a los datos históricos. La medida se realiza por la técnica de espectroscopía de correlación de fotones (PCS) y dlim se expresa como un resultado unimodal (Zmedio). En este límite, la microfluidización puede detenerse después de nmin ciclos. Por encima de este límite, la microfluidización se continúa hasta que se obtiene una reducción del tamaño satisfactorio, para un máximo de otros 50 ciclos.
Si la filtración no tiene lugar inmediatamente después de la microfluidización, el MPL dispersado se almacena de +2 a +8ºC en espera de la transferencia al área de filtración.
Después de la microfluidización, la dispersión se diluye con agua para inyección y se filtra en esterilidad a través de un filtro de 0,22 μm con flujo laminal. La concentración final de MPL es 1 mg/ml ((0,80-1,20 mg/ml).
II.2 Preparación de MPL/QS21 adyuvante liposomal
Este adyuvante, llamado AS01, comprende 3D-MPL y QS21 en una forma inactivada con colesterol y se preparó como se describe en el documento WO 96/33739. En particular el adyuvante AS01 se preparó esencialmente como en el Ejemplo 1.1 del documento WO 96/33739. El adyuvante AS01B comprende: liposomas, que a su vez comprenden dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), colesterol y 3D MPL [en una cantidad de 1000 !g DOPC, 250 !g
colesterol y 50 !g 3D-MPL, cada valor dado aproximadamente por dosis de vacuna], QS21 [50 !g/dosis], tampón fosfato NaCl y agua hasta un volumen de 0,5 ml.
El adyuvante AS01E comprende los mismos ingredientes que AS01B pero a una concentración menor en una cantidad de 500 μg DOPC, 125 μg colesterol, 25 μg 3D-MPL y 25 μg QS21, tampón fosfato NaCl y agua hasta un 5 volumen de 0,5ml.
En el procedimiento de producción de liposomas que contienen MPL los DOPC (dioleil fosfatidilcolina), colesterol y MPL se disuelven en etanol. Se forma una película lipídica mediante evaporación de disolvente al vacío. Se añade solución salina tamponada con fosfato (Na2HPO4 9 mM, KH2PO4 41 mM, NaCl 100 mM) a pH 6,1 y la mezcla sesomete a prehomogeneización seguida de homogeneización a alta presión a 103421386,3 pascales (15.000 psi)
10 (aproximadamente 15 a 20 ciclos). Esto conduce a la producción de liposomas que se filtran en esterilidad a través de una membrana de 0,22 !m en un área aséptica (clase 100). El producto estéril se distribuye después enrecipientes de vidrio estériles y se almacena en una habitación fría (+2 a +8°C).
De esta manera los liposomas producidos contienen MPL en la membrana (el “MPL in” realización del documento WO 96/33739).
15 QS21 se añade en solución acuosa a la concentración deseada.
Ejemplo de referencia III-Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe con adyuvante y sin adyuvante enhurones
III.1. Fundamento y objetivos
La infección de la gripe en un modelo de hurón mimetiza estrechamente la gripe de humanos, con respecto a la 20 sensibilidad a infección y la respuesta clínica.
El hurón es extremadamente sensible a infección con virus tanto de la gripe A como B sin adaptación anterior a cepas virales. Por lo tanto, proporciona un sistema de modelo excelente para estudios de protección conferida por vacunas contra la gripe administradas.
Este estudio investigó la eficacia de diversas vacunas divididas trivalentes, con o sin adyuvante, para reducir los
25 síntomas de enfermedad (temperatura corporal) y supresión viral en secreciones nasales de hurones expuestos a cepas homólogas.
El objetivo de este experimento fue demostrar la eficacia de una vacuna contra la gripe potenciada con adyuvante encomparación con la vacuna simple (no potenciada con adyuvante).
Los criterios de valoración fueron:
30 1) criterio de valoración principal: reducción de la supresión viral en lavados nasales después de la estimulación homóloga
2) criterios de valoración secundarios: análisis de la respuesta humoral por titulaciones de HI.
III.2. Diseño experimental
III.2.1. Tratamiento/grupo (Tabla 1)
35 Se obtuvieron hurones hembra (Mustela putorius furo) con edad de 14-20 semanas de MISAY Consultancy(Hampshire, Reino Unido). Los hurones se sensibilizaron en el día 0 con la cepa heterosubtípica H1N1 A/Estocolmo/24/90 (4 Log TCID50/ml). En el día 21, a los hurones se les inyectó por vía intramuscular una dosis humana completa (dosis de vacuna de 500 !g, 15 !g de HA/cepa) de una combinación de H1N1 A/NewCaledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 y B/Shangdong/7/97. Los hurones después se expusieron en el día 41
40 por vía intranasal con una cepa heterosubtípica H3N2 A/Wyoming/3/2003 (4,51 Log TCID50/ml).
Tabla 1
Grupo
Antígeno(s) +dosificación Formulación + dosificación Comentarios (programa/vía/exposición) In/Re Otros tratamientos
1
Simpletrivalente HD completo:15 !g deHA/cepa IM; Día 21 In Sensibilización con H1N1 (A/Estocolmo/24/90) Día 0
2
Trivalente/MPL-QS21 en liposomas HD completo:15 !g deHA/cepa IM; Día 21 In Sensibilización con H1N1 (A/Estocolmo/24/90) Día 0
6 hurones/grupo. In/Re = Individuo/Reserva
III.2.2. Preparación de las formulaciones de vacuna (Tabla 2)
Formulación 1: formulación simple trivalente (sin adyuvante):
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Tritón-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua
5 para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 17,5 !g de la cepa B con agitación durante 10 minutos entre cada adición. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación 2: trivalente contra la gripe dividida con adyuvante MPL/QS21 en liposomas:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene
10 Tween 80, Tritón-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 17,5 !g de lacepa B con agitación durante 10 minutos entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Se añadeuna mezcla anterior del llamado “DQS21-MPLin a la formulación que se agita después durante un mínimo de 15 minutos. La mezcla anterior de DQS21-MPLin es una mezcla de liposomas (preparada de DOPC 40mg/ml, colesterol
15 10 mg/ml, MPL 2 mg/ml) y el inmunoestimulante QS21. Esta mezcla anterior se incuba durante un mínimo de 15 minutos antes de la adición a la mezcla dividida trivalente. La concentración de MPL y QS21 en la formulación final es 50 μg por 500 μl. La formulación se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Observación: en cada formulación, se añade PBS concentrado 10 veces hasta alcanzar isotonicidad y se concentra 1 vez en el volumen final. El volumen de H2O se calcula para alcanzar el volumen objetivo.
20 Tabla 2: Composición final de las formulaciones 1 y 2 (Formulaciones preparadas con cepas divididas (para 500 μl))
Formulación
Antígeno Tween 80 Tritón X100 VES DOPC Colesterol MPL QS21
1
H1N1: 15 μg H3N2: 15 μg B: 17,5 μg 375 μg 55 μg 50 μg - - - -
2
H1N1: 15 μg H3N2: 15 μg B: 17,5 μg 375 μg 55 μg 50 μg 1 mg 250 μg 50 μg 50 μg
III.2.3. Lecturas (Tabla 3)
Tabla 3
Lectura
Punto temporal Tipo de muestra Procedimiento de análisis
Supresión viral
D+1 a D+7 Después de laexposición Lavados nasales Titulación
Anticuerpos anti-HI (Titulacionesde HI)
Antes, después de lasensibilización, Después de la inmunización, Después de laexposición Sueros Ensayo de inhibición de lahemoaglutinación
III.3. Resultados
En las Figuras 1 y 2 se proporciona una representación esquemática de los resultados.
25 III.3.1. Inmunidad humoral (Figura 1).
Se detectó la actividad de inhibición de hemoaglutinación frente a las cepas de vacuna de H3N2 (cepa de vacuna A/Panamá/2007/99 y cepa de estimulación A/Wyoming/3/2003) en sueros de 6 animales por grupo en el Día 17 después de la sensibilización heteróloga intranasal y en el Día 21 después de la inmunización y Día 13 después de la exposición.
30 Se determinaron titulaciones de anticuerpos anti-hemaglutinina para las tres cepas de virus de la gripe usando el ensayo de inhibición de la hemoaglutinación (HI) como se detalla en el Ejemplo I.2.1. Las conclusiones son las siguientes:
• Para las dos cepas de A/H3N2 y para todos los grupos, se observó un refuerzo de titulaciones de HI en todos los grupos vacunados después de la inmunización.
35 • Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, se observaron titulaciones de HI anti
A/Panamá/2007/99 mayores estadísticamente significativos cuando la vacuna trivalente dividida se potenciaba con MPL/QS21 en liposomas en comparación con la vacuna simple trivalente dividida.
•
Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, solamente la trivalente divida potenciada con MPL/QS21 en liposomas fue capaz de aumentar de forma significativa las titulaciones de HI a la cepa heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reactividad cruzada antes de la estimulación con esta cepa de deriva).
•
Después de la estimulación con A/Wyoming3/2003, se observó un aumento significativo de titulacionesde HI anti-A/Wyoming/3/2003 para simple trivalente dividida y trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas.
•
Para cepas A/New Caledonia/20/99 y B/Shangdong/7/97, se observaron titulaciones de HI mayores estadísticamente significativas cuando la trivalente dividida se potenciaba con MPL/QS21 en liposomas en comparación con la vacuna simple trivalente dividida.
III.3.2. Diseminación viral (Figura 3).
Se realizó titulación viral de lavados nasales en 6 animales por grupo como se detalla en el Ejemplo I.2.3. Los lavados nasales se realizaron mediante administración de 5 ml de PBS en ambas fosas nasales en animales despiertos. La inoculación se recogió en una placa de Petri y se colocó en recipientes para muestra a -80°C.
•
Dos días después de la estimulación, se observó diseminación viral menor estadísticamente significativa con trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas en comparación con simple trivalente dividida.
•
El día 49 (7 días después de la estimulación), no se detectaron virus en los lavados nasales.
III.3.3. Conclusión del experimento
Se observaron respuestas humorales mayores (titulaciones de HI) con trivalente dividida potenciada con MPL/QS21 en liposomas en comparación con la simple trivalente dividida para las 4 cepas.
Después de la inmunización con A/Panamá/2007/99, solamente la trivalente divida potenciada con MPL/QS21 enliposomas fue capaz de aumentar de forma significativa titulaciones de HI a la cepa heteróloga A/Wyoming/3/2003 (reactividad cruzada antes de la estimulación con esta cepa).
MPL/QS21 en formulaciones de liposomas mostró beneficio adicional en términos de eficacia protectora en hurones (supresión viral menor después de estimulación heteróloga). La reacción cruzada observada después de la inmunización con trivalente dividida MPL/QS21 en liposomas contra la cepa de deriva usada para la estimulación parecía estar en correlación con el efecto de protección observado en estos hurones.
Ejemplo de referencia IV-Evaluación preclínica de vacunas contra la gripe con adyuvante y sin adyuvante enratones C57Bl/6 inmunizados
IV.1. Diseño experimental y objetivo
Ratones C57BI/6 inmunizados con cepas heterólogas se usaron para este experimento.
El propósito era comparar las respuestas inmunes humoral (titulaciones de HI) y CMI (ICS, tinción de citocinaintracelular) inducidas por una vacuna trivalente dividida de GlaxoSmithKline disponible en el mercado (FluarixTM)frente a una vacuna de subunidad trivalente (vacuna AgrippalTM de Chiron) así como la respuesta CMI obtenida con estas vacunas potenciadas con liposomas que contienen 3D-MPL en solitario, DQS21 (QS21 en liposomas, es decir, QS21 destoxificado) en solitario o MPL/QS21 en liposomas. En el ejemplo más adelante en el presente documento,se prepararon formulaciones a partir de las monocargas divididas hasta alcanzar la misma composición que en lavacuna Fluarix y no de dosis de Fluarix disponible en el mercado. Las formulaciones obtenidas se denominaron “similares a Fluarix”.
IV.1.1. Tratamiento/grupo
Se obtuvieron ratones C57Bl/6 de 6-8 semanas de edad de Harlan Horst, Países Bajos. Los ratones sesensibilizaron en el día 0 con cepas heterosubtípicas (5 μg HA completa inactivada H1N1 A/Pekín/262/95, H3N2 A/Panamá/2007/99, B/Shangdong/7/97). En el día 28, a los ratones se les inyecto por vía intramuscular 1,5 μg de HA trivalente dividida (A/New Caledonia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) simple o potenciada con adyuvante (véase grupos en Tablas 4 a 6 a continuación).
Tabla 4
Gr
Antígeno / Formulación Otro tratamiento
1
Trivalente dividida* / Simple (no potenciada con adyuvante)= Similar a Fluarix Inmunización heteróloga D0
2
Trivalente dividida* / liposomas que contienen 3D-MPL Inmunización heteróloga D0
3
Trivalente dividida* / DQS21 Inmunización heteróloga D0
4
Trivalente dividida* / MPL/QS21 en liposomas Inmunización heteróloga D0
5
Aggripal TM (subunidad) Inmunización heteróloga D0
6
Aggripal TM (subunidad) / liposomas que contienen 3D-MPL Inmunización heteróloga D0
7
Aggripal TM (subunidad) / DQS21 Inmunización heteróloga D0
Gr
Antígeno / Formulación Otro tratamiento
8
Aggripal TM (subunidad) / MPL/QS21 en liposomas Inmunización heteróloga D0
9
PBS Inmunización heteróloga D0
* Similar a Fluarix. 16 ratones/grupo
IV.1.2. Preparación de las formulaciones de vacuna
Formulación para el grupo 1:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Tritón-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua
5 para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa Bcon 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y sealmacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 2:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene
10 Tween 80, Tritón-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa Bcon 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Se añaden liposomas que contienen 3D-MPL concentrado (preparado a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml) alcanzando una concentración final de MPL de 50 μg por dosis. La formulación se agita después un mínimo de 15
15 minutos y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
Formulación para el grupo 3:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contiene Tween 80, Tritón-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa B
20 con 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Después se añade una mezcla anterior preparada a partir de liposomas (preparada a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml) y QS21 denominada “DQS21” hasta alcanzar una concentración de QS21 de 50 μg por dosis. Esta mezcla anterior seincuba al menos durante 15 minutos antes de la adición a la mezcla trivalente dividida. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4°C si no se administra directamente.
25 Formulación para el grupo 4:
Se añade PBS concentrado 10 veces (pH 7,4 cuando está concentrado una vez) así como una mezcla que contieneTween 80, Tritón-X-100 y VES (cantidades que toman en cuenta los detergentes presenten en las cepas) a agua para inyección. Después de 5 minutos de agitación, se añaden 15 !g de cada cepa H1N1, H3N2 y 15 !g de cepa Bcon 10 minutos de agitación entre cada adición. La formulación se agita durante 15 minutos. Después se añade una
30 mezcla preparada a partir de liposomas que contienen 3D-MPL (preparada a partir de DOPC 40 mg/ml, Colesterol 10 mg/ml, 3D-MPL 2 mg/ml) y QS21 hasta alcanzar concentraciones de QS21 y MPL 50 μg por dosis. Esta mezcla se incuba al menos durante 15 minutos antes de la adición a la mezcla trivalente dividida. La denominada formulación “trivalente dividida MPL/QS21 en liposomas” se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a4°C si no se administra directamente.
35 Observación: en los grupos 1 a 4, se añade PBS concentrado 10 veces hasta alcanzar isotonicidad y está concentrado 1 vez en el volumen final. El volumen de H2O se calcula para alcanzar el volumen objetivo.
Formulación para el grupo 5:
Se mezcla una dosis de AggripalTM con un volumen igual de PBS mod pH 7,4. La formulación se agita durante unmínimo de 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
40 Formulación para el grupo 6:
Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añaden después en agitación liposomas que contienen 3D-MPL (preparados de 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de colesterol, 2 mg/ml 3D-MPL) hasta alcanzar el equivalente de 50 !g de MPL por dosis. La formulación se agita durante un mínimo de 15 minutos y se almacena a 4ºC si no seadministra directamente.
45 Observación: se añade PBS alcanzando la isotonicidad en el volumen final. Aggripal es la mitad del volumen de la formulación.
Formulación para el grupo 7: Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añade después en agitación una premezcla de liposomas (hechos de 40 mg/ml de DOPC, 10 mg/ml de colesterol) y QS21, “DQS21” así llamado hasta alcanzar el equivalente de 50 !g de QS21. Esta premezcla se incuba durante al menos 15 minutos previamente a la adición. La formulación se agita mínimo 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administra directamente.
5 Observación: se añade PBS alcanzando la isotonicidad en el volumen final. Aggripal™ es la mitad del volumen de la formulación.
Formulación para el grupo 8:
Se mezclan PBS pH 7,4 y una dosis de AggripalTM. Se añade después en agitación a la formulación una premezcla llamada de “DQS21-MPLin”. La premezcla de DQS21-MPLin es una mezcla de liposomas (hechos de 40 mg/ml de
10 DOPC, 10 mg/ml de colesterol, 2 mg/ml de MPL) y el inmunoestimulante QS21. Esta premezcla se incuba durante almenos 15 minutos previamente a la adición de la mezcla de Aggripal/PBS. La cantidad de MPL y QS21 en la formulación es 50 !g cada uno. La formulación se agita mínimo 15 minutos y se almacena a 4ºC si no se administradirectamente.
Observación: se añade PBS alcanzando la isotonicidad en el volumen final. Aggripal es la mitad del volumen de la15 formulación.
Tabla 5: Composición final de las formulaciones 1 a 4 preparadas con cepas divididas (para 1 ml)
Grupo
Antígeno Tween 80 Tritón X-100 VES DOPC Colesterol MPL QS21
1
H1N1: 15 !g 750 !g 110 !g 100 !g _ _ _ _
H3N2: 15 !g B: 17,5 !g
2
Idéntico a 1 Idéntico a 1 110 !g 100 !g 1 mg 250 !g 50 !g -
3
Idéntico a 1 Idéntico a 1 110 !g 100 !g 1 mg 250 !g - 50 !g
4
Idéntico a 1 Idéntico a 1 110 !g 100 !g 1 mg 250 !g 50 !g 50 !g
Tabla 6: Composición final de las formulaciones 5 a 8 preparadas con vacuna Aggripal (1 ml)
Grupo
Antígeno DOPC Colesterol MPL QS21
5
1 dosis de vacuna Aggripal _ _ _ _
6
Idéntico a 5 1 mg 250 !g 50 !g -
7
Idéntico a 5 1 mg 250 !g - 50 !g
8
Idéntico a 5 1 mg 250 !g 50 !g 50 !g
IV.1.3. Lecturas (Tabla 7) 20 Tabla 7
Lectura
Punto del tiempo Tipo de muestra In/Po Procedimiento de análisis
Anticuerpos anti-HI (titulaciones HI)
Día 21 Postinmunización (Día 49) Suero In Ensayo de inhibición de la hemaglutinación
CD4, CD8, IL-2, IFN-∃ (FACS)
Día 7 Postinmunización (Día 35) PBL Po Tinción de citocinas intracelulares (ICS)
In= Individual / Po= combinación
IV. 2. Resultados
IV.2.1.Respuesta humoral (titulaciones HI 21 días post-inmunización)
Respuestas humorales por titulaciones HI-Figura 4.
Se detectó la actividad de inhibición de la hemaglutinación contra las tres cepas de la vacuna (A/New25 Caledonia/20/99, A/Wyoming/3/2003, B/Jiangsu/10/2003) en el suero de 8 animales por grupo en el día 21 postinmunización.
•
Comparado con ratones inmunizados con PBS, se observó un aumento en las titulaciones HI después de inmunización con todos los candidatos de vacuna de la gripe analizados para todas las tres cepas (vacuna dividida trivalente o de subunidades trivalente).
•
Para todas las tres cepas, se observaron titulaciones HI más altas estadísticamente significativas enratones inmunizados con la dividida trivalente potenciada con DQS21 sola MPL/QS21 en liposomas comparados conratones inmunizados con la simple de la gripe dividida trivalente o potenciada con liposomas que contenían 3D-MPL solo. La clasificación de la respuesta humoral fue como sigue: (MPL/QS21 en liposomas = DQS21 solo) gt; (liposomas que contenían 3D-MPL solo = simple) gt; PBS
•
Para todas las tres cepas, se observaron titulaciones HI más altas estadísticamente significativas enratones inmunizados con la de subunidades trivalente potenciada con DQS21 solo, liposomas que contenían·3D-MPL solo o MPL/QS21 en liposomas comparados con ratones inmunizados con la simple dividida trivalente. Laclasificación de la respuesta humoral fue como sigue: (MPL/QS21 en liposomas = DQS21 solo = Liposomas que contenían 3D-MPL solo) gt; Simple gt; PBS.
•
La dividida trivalente y la de subunidades trivalente inducían titulaciones HI similares cuando las formulaciones no estaban potenciadas o se potenciaron con DQS21 solo o MPL/QS21 en liposomas.
IV.2.2.Respuesta inmunitaria mediada por células (ICS al 7º día de la inmunización).
Respuestas de células T CD4-Figura 5
Se recogieron las PBMC de 8 ratones por grupo en el 7º día de la inmunización y se analizaron en 4 conjuntos de 2 ratones/grupo. En términos de células T CD4+ específicas del virus completo de la gripe (que expresan IL-2, IFN-∃ yambas citocinas):
•
Cualquiera que sea la formulación, se observaron respuestas de células T CD4+ idénticas entre las vacunas dividida trivalente y de subunidades trivalente.
•
Se observaron respuestas de células T CD4+ más altas para las formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) potenciadas con MPL/QS21 en liposomas cuando se compararon con formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) simples o potenciadas con liposomas que contenían 3D-MPL solo o DQS21 solo.
•
Para la respuesta celular inducida por una formulación trivalente (dividida o de subunidades), existe unefecto sinérgico de liposomas que contienen 3D-MPL + DQS21 comparado con DQS21 solo o liposomas que contienen 3D-MPL solo.
•
La clasificación para la respuesta celular fue como sigue: MPL/QS21 en liposomas gt; (liposomas que contienen 3D-MPL solo = DQS21 solo = simple = PBS).
IV.3. Resumen de resultados y conclusiones
•
Para todas las tres cepas, se observaron titulaciones HI más altas estadísticamente significativas enratones inmunizados con formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) potenciadas con DQS21 solo o con MPL/QS21 en liposomas comparados con ratones inmunizados con formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) simples. Los liposomas que contenían 3D-MPL solo parecían inducir respuesta humoral más alta cuando se formuló con la de subunidades trivalente que con la dividida trivalente.
•
Cualquiera que sea la formulación, se obtuvieron respuestas de células T CD4+ similares para la dividida trivalente (Fluarix) y la de subunidades trivalente (Aggripal).
•
Las formulaciones trivalentes (divididas o de subunidades) potenciadas con MPL/QS21 en liposomas inducían respuestas de células T CD4+ más altas comparadas con formulaciones trivalentes (divididas o desubunidades) simples o potenciadas con liposomas que contenían 3D-MPL solo o QS21 en liposomas (DQS21) solo.
Ejemplo de referencia V-Comparación preclínica de una vacuna que contiene una preparación de antígeno de la gripe dividido potenciada con 3D-MPL/QS21 en una formulación liposomal (3D-MPL a dos concentraciones diferentes).
V.1-Ratones.
V.1.1-Diseño experimental y objetivo.
Se usaron para este experimento ratones C57B1/6 inmunizados con cepas heterólogas. El propósito era analizar las respuestas inmunes humorales (titulaciones HI) y CMI (ICS, tinción de citocinas intracelulares) inducidas por una vacuna dividida trivalente disponible en el mercado en GlaxoSmithKline (FluarixTM) en una forma no potenciada ycuando se potenció con liposomas que contenían dos concentraciones diferentes de 3D-MPL y QS21.
V.1.2 Tratamiento/grupo
Se obtuvieron ratones hembra C57B1/6 de 8 semanas de edad de Harlan Horst, Países Bajos. Los ratones seinmunizaron de forma intranasal en el día 0 con cepas heterosubtípicas (A/Beijing/262/95 inactivada completa, H3N2A/Panamá/2007/99, B/Shandong/7/97). En el día 28, se les inyectó a los ratones de forma intramuscular la simple
dividida trivalente o la potenciada dividida trivalente (A/New Caledonia, A/Wyoming, B/Jiangsu) con dos concentraciones diferentes de inmunoestimulantes en formulaciones liposomales (véanse los grupos en la tabla 8 a continuación).
Tabla 8
Grupo
Antígeno(s) + dosificación Formulación + dosificación Otros tratamientos
1
Gripe dividida trivalente1,5 !g/cepa/50 !l Simple Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos D0 de forma intranasal
2
Gripe dividida trivalente1,5 !g/cepa/50 !l Liposomas que contienen 50 !gde 3D-MPL por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos D0 de forma intranasal
3
Gripe dividida trivalente1,5 !g/cepa/50 !l 50 !g de DQS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos D0 de forma intranasal
4
Gripe dividida trivalente1,5 !g/cepa/50 !l 25 !g de MPL y QS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos D0 de forma intranasal
5
Gripe dividida trivalente1,5 !g/cepa/50 !l 50 !g de MPL y QS21 por 0,5 ml de dosis Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos D0 de forma intranasal
6
PBS Ninguno Sensibilización heteróloga con 5 !g/20 !l inactivados completos D0 de forma intranasal
Las formulaciones se prepararon como en el ejemplo IV.
V.1.3-Resultados
Respuestas humorales por titulaciones HI-Figura 24.
Se detectó la actividad de inhibición de la hemaglutinación contra las tres cepas de la vacuna en el suero de 9animales/grupo en el día 21 post inmunización.
•
Comparado con ratones inmunizados con PBS, se observó un aumento en las titulaciones HI después de inmunización con todos los candidatos de vacuna de la gripe analizados para todas las tres cepas
•
Para todas las tres cepas, se observaron titulaciones HI más altas estadísticamente significativas enratones inmunizados con la dividida trivalente potenciada con MPL y QS21 a cualquier concentración comparadascon ratones inmunizados con la simple dividida de la gripe trivalente (valor p máx. = 0,03).
•
No se observó diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos de adyuvantes liposomales.
Respuesta inmunitaria mediada por células (ICS en el día 7 post-inmunización)-Figure 25.
Se recogieron las PBMC de 9 ratones/grupo 7 días post-inmunización y se analizaron en tres conjuntos de 3 ratones/grupo. En términos de células T CD4+ específicas del virus de la gripe completo que expresan IL-2, IFN-∃ o ambas citocinas:
Como se puede ver en la figura 25 las respuestas específicas de células T CD4+ IFN-∃ más altas se obtuvieron después de la inmunización con la dividida trivalente potenciada con la concentración más alta de inmunoestimulantes. Sin embargo, las respuestas de células T IL2 e IL2+ IFN-∃ fueron similares entre las dos concentraciones de inmunoestimulantes.
Ejemplo de referencia VI-Ensayo clínico en una población anciana por encima de 65 años con una vacuna que contiene una preparación de antígeno de la gripe dividido potenciada con MPL/QS21 en una formulaciónliposomal (3D-MPL a dos concentraciones diferentes).
VI.1. Diseño del estudio y objetivos
Un estudio de fase I/II abierto, aleatorizado, para demostrar la no inferioridad en términos de respuesta inmunitariamediada por células de las vacunas candidatas de la gripe de GlaxoSmithKline Biologicals que contienen diversos adyuvantes administradas a una población anciana (65 años de edad y mayor) comparadas con Fluarix™ (conocida como %-Rix™ en Bélgica) administrada en adultos (18-40 años).
Se asignaron cuatro grupos paralelos:
# 75 adultos (18-40 años de edad) en un grupo de control que recibieron una dosis de Fluarix™ (grupo de
Fluarix) # 200 sujetos ancianos (65 años de edad y mayores) aleatorizados 3:3:2 en tres grupos: -Un grupo con 75 sujetos que recibieron la vacuna de la gripe potenciada con AS01B -Un grupo con 75 sujetos que recibió la vacuna de la gripe potenciada con AS01E -Grupo de gripe de referencia con 50 sujetos que recibieron una dosis de Fluarix™ Objetivo principal El objetivo principal es demostrar la no inferioridad 21 días post-vacunación de las vacunas potenciadas de la gripe
administradas a sujetos ancianos (65 años de edad y mayores) comparadas con Fluarix™ administrado en adultos (18-40 años de edad) en términos de frecuencia de linfocitos T CDR específicos de la gripe que producen al menos dos citocinas diferentes (CD40L, IL-2, TNF-%, IFN-∃).
Objetivos secundarios Los objetivos secundarios son: 1) Evaluar la seguridad y reactogenicidad de la vacunación con las vacunas de la gripe candidatas potenciadas
durante 21 días posteriores a la administración intramuscular de la vacuna en sujetos ancianos (65 años de edad y
mayores). Se usa Fluarix como referencia. 2) Evaluar la respuesta inmunitaria humoral (titulación anti-hemaglutinina) 21, 90 y 180 días después de la vacunación con las vacunas candidatas de la gripe potenciadas. Se usa Fluarix como referencia.
Objetivo terciario El objetivo terciario es evaluar la respuesta inmunitaria mediada por células (producción de IFN-∃, IL-2, CD40L y TNF-% y respuesta de células B de memoria) 21, 90 y 180 días después de la vacunación con las vacunas de la gripe potenciadas. Se usa Fluarix como referencia.
VI.2. Composición de vacuna y administración
Se han usado dos adyuvantes diferentes:
1.
AS01 B un adyuvante basado en liposomas que contiene 50 !g MPL y QS21
2.
AS01 E una formulación de AS01B diluida dos veces.
Control: dosis completa de Fluarix™ por administración IM.
Todas las vacunas están destinadas a administración intramuscular. Las cepas usadas en las cinco vacunas eran las que había recomendado la OMS para la temporada 2005-2006 en el hemisferio norte, es decir, A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Nueva California/7/2004 (H3N2) y B/Jiangsu/10/2003.
Los tres antígenos de viriones divididos inactivados (volúmenes monovalentes) usados en la formulación de la vacuna candidata de la gripe potenciada, son exactamente los mismos que los ingredientes activos usados en laformulación de la vacuna de la gripe inactivada de viriones divididos Fluarix∋/%-Rix™-GSK Bio’s comercial. Se derivan de virus crecidos en huevos. Las cepas de la gripe son las recomendadas para la temporada 2005/2006, como se usan en la formulación de la Fluarix∋/%-Rix™ 2005/2006 comercial.
Las cepas usadas en las tres vacunas son las que han sido recomendadas por la OMS para la temporada 2005/2006 en el hemisferio norte, es decir
# A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116
# A/New York/55/2004 (H3N2) NYMC X-157
# B/Jiangsu/10/2003
Como Fluarix™/%-Rix™, la vacuna potenciada contiene 15 !g de hemaglutinina (HA) de cada cepa del virus de la gripe por dosis.
VI.2.1.Descripción de los lotes de vacunas potenciadas con AS01B
La vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01 B es una vacuna de 2 componentes que consiste enantígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados presentados en un vial de vidrio tipo I y por unvial de vidrio tipo I que contiene el adyuvante AS01B. En el momento de la inyección, se retira el contenido del vial del adyuvante y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar el contenido se retira con la jeringa y la aguja se reemplaza por una aguja intramuscular. La aguja usada se reemplaza por una aguja intramuscular y el volumen se corrige a 1 ml. Una dosis de la vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01 B reconstituida corresponde a 1 ml.
La vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01 B es una vacuna sin conservantes.
VI.2.2.Composición del lote clínico potenciado con AS01B
Una dosis de la vacuna de la gripe potenciada con AS01 B corresponde a 1 ml. Su composición se da en la Tabla 8. Contiene 15 !g de HA de cada cepa del virus de la gripe como en la vacuna FluarixTM/%-Rix® registrada.
Tabla 8-Composición (componentes de gripe y adyuvantes) de la vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01 B reconstituida
Componente
Cantidad por dosis Referencia analítica
INGREDIENTES ACTIVOS
Viriones divididos inactivados -A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 -A/New York/55/2004 (H3N2) NYMC X-157 -B/Jiangsu/10/2003
15 !g HA 15 !g HA 15 !g HA Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158
ADYUVANTE AS01B
-Liposomas # dioleil fosfatidilcolina (DOPC) # Colesterol # MPL
1000 !g 250 !g 50 !g GSK Bio 3217 Ph. Eur. 0993 GSK Bio 2972
-QS21
50 μg GSK Bio 3034
VI.2.3.Procedimiento de producción del lote de vacuna potenciada con AS01B
La fabricación de la vacuna de la gripe potenciada con AS01B consiste en tres etapas principales:
# Formulación del volumen final trivalente (concentrada 2x) sin adyuvante y carga en el recipiente del antígeno
# Preparación del adyuvante AS01B
# Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01B.
Formulación del volumen final trivalente sin adyuvante y carga en el recipiente del antígeno
Los volúmenes de los tres volúmenes monovalentes se basan en la medida del contenido en HA de cada volumen monovalente previamente a la formulación y en un volumen objetivo de 1320 ml. Se diluyen en agua para inyecciónsolución salina tamponada con fosfato concentrado PO4 Na/K2 (80 !l/dosis) y una premezcla de Tween 80, Tritón X100 e hidrogenosuccinato de %-tocoferilo. Los tres monovolúmenes concentrados (A/New Caledonia/20/99 IVR-116, A/New York/55/2004 NYMC X-157, B/Jiangsu/10/2003) se diluyen después sucesivamente en la solución resultante de solución salina tamponada con fosfato/Tween 80-Tritón X-100-hidrogenosuccinato de %-tocoferilo (pH 7,8, NaCl 81 mM, KCl 1,56 mM, Na2HPO4 4,79 mM, KH2PO4 0,87 mM, NaH2PO4 7,2 mM, K2HPO4 72,8 mM, 750 μg/ml de Tween 80, 110 μg/ml de Tritón X-100 y 100 μg/ml de hidrogenosuccinato de %-tocoferilo) teniendo una concentración final de 30 !g de HA de cepas A (H1N1 y H3N2) por ml de volumen final trivalente (15 !g de HA/cepa A/500 !l de volumen final trivalente) y 35 !g de HA de cepa B (17,5 !g de HA/cepa B/500 !l de volumen final trivalente). Entre laadición de cada volumen monovalente, la mezcla se agita durante 10-30 minutos a temperatura ambiente. Después de la adición de la último volumen monovalente y 15-30 minutos de agitación, se controla el pH y se ajusta a 7,65 ( 0,25 con HCl o NaOH.
El volumen final trivalente de antígenos se carga de forma aséptica en viales de vidrio tipo I (Ph. Eur.) estériles de 3ml. Cada vial contiene un volumen de 600 !l (500 !l + 100 !l de sobrecarga).
Preparación del volumen de adyuvante AS01B y carga en el recipiente del adyuvante
El adyuvante AS01B se prepara mezclando los dos componentes: QS21 y liposomas que contienen MPL. Lapreparación de cada uno de estos componentes se resume a continuación. QS21 es un glucósido de triterpeno, obtenido de la corteza del árbol Quillaja saponaria y lo produce Aquila Worchester, MA, EE.UU. (ahora Antigenics).
QS21 se proporciona a GSK Bio como un polvo liofilizado. La preparación de QS21 en GSK Bio consiste en lasuspensión del polvo de QS21 en agua para inyección a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml, ajuste delpH a pH 6,0 ( 0,2 y filtración estéril. El volumen líquido de QS21 se almacena a -20ºC en recipientes de polietileno.
MPL es el 4’-monofosforil lípido A 3-O-desacilado obtenido por hidrólisis ácida y básica secuencial del lipopolisacárido de la cepa Re595 de Salmonella minnesota. Lo produce GSK Biologicals, Hamilton, Montana. Elvolumen de MPL se suministra a GSK Bio como la sal de trietilamina liofilizada (TEA).
En el procedimiento de producción de liposomas que contienen MPL, se disuelven en etanol DOPC (dioleil
fosfatidilcolina), colesterol y MPL. Se forma una película lipídica por evaporación del disolvente al vacío. Se añade solución salina tamponada con fosfato compuesta de Na2HPO4 9 mM, KH2PO4 41 mM, NaCl 100 mM a pH 6,1 y lamezcla se somete a prehomogeneización seguida por homogeneización a presión alta a 103421386,3 pascales MPa
(15.000 psi) (+/-20 ciclos). Esto conduce a la producción de liposomas, que se filtran de forma estéril a través de unamembrana de 0,22 !m en un área aséptica (clase 100). El producto estéril se distribuye después en recipientes de vidrio estériles y se almacenan en la habitación refrigerada (de +2 a +8ºC).
La preparación de volumen estéril de liposomas se mezcla con la solución de volumen de QS21 estéril. Después de30 minutos de agitación, la mezcla se añade a una mezcla de agua para inyección y fosfato 500 mM, NaCl 1 M pH6,1 cuando se diluye 10 veces. La cantidad de fosfato 500 mM, NaCl 1 M pH 6,1 cuando se diluye 10 se calcula para alcanzar la isotonicidad en el volumen final. Se controla el pH. El adyuvante se filtra después de forma estéril (0,22 !m) y se distribuye de forma aséptica en viales. Los viales se almacenan de +2 a +8ºC.
El diluyente AS01B es un líquido incoloro opalescente, libre de partículas extrañas, contenido en un vial de vidrio tipoI, estéril. El objetivo de llenado para cada vial es 0,7 ml para cumplir la especificación () 0,5ml).
Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01B
En el momento de la inyección, el contenido del vial que contiene el adyuvante se retira y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar, el contenidose retira con una jeringa y se reemplaza la aguja por una aguja intramuscular y el volumen se corrige a 1 ml. Una dosis de vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B reconstituida corresponde a 1 ml.
VI.2.4.Descripción de los lotes de vacunas potenciadas con AS01E
La vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01 E es una vacuna de tres componentes que consiste en unos antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados presentada en un vial de vidrio, un vial de vidrio que contiene el adyuvante AS01 B y un vial de vidrio que contiene el diluyente (solución de cloruro sódico para inyección) para la dilución dos veces de AS01 B.
Preparando el adyuvante AS01 E el contenido del vial del diluyente se retira con una jeringa y se inyecta en el vial que contiene el adyuvante AS01 B, seguido por mezcla. En el momento de la inyección, se retiran 600 !l de adyuvante AS01 E con una jeringa del vial de AS01 E y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar se retira el contenido con la jeringa y la aguja sereemplaza por una aguja intramuscular. Una dosis de vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01B corresponde a 1 ml.
La vacuna candidata contra la gripe potenciada con AS01 E es una vacuna sin conservantes.
VI.2.5.Composición del lote clínico potenciado con AS01E
Una dosis de la vacuna de la gripe potenciada con AS01 E reconstituida corresponde a 1 ml. Su composición se da en la Tabla 9. Contiene 15 !g de cada cepa del virus de la gripe como en la vacuna FluarixTM/%-Rix® registrada.
Tabla 9 Composición (componentes de gripe y adyuvantes) de la vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01E
Componente
Cantidad por dosis Referencia analítica
INGREDIENTES ACTIVOS
Viriones divididos inactivados -A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116 -A/New York/55/2004 (H3N2) NYMC X-157 -B/Jiangsu/10/2003
15 !g HA 15 !g HA 15 !g HA Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158 Ph. Eur. 158
ADYUVANTE AS01B
-Liposomas # dioleil fosfatidilcolina (DOPC) # Colesterol # MPL
500 !g 125 !g 25 !g GSK Bio 3217 Ph. Eur. 0993 GSK Bio 2972
-QS21
25 μg GSK Bio 3034
VI.2.6.Procedimiento de producción del lote de vacuna potenciada con AS01E La fabricación de la vacuna de la gripe potenciada con AS01 B consiste en tres etapas principales: # Formulación del volumen final trivalente (concentrada 2x) sin adyuvante y carga en el recipiente del
antígeno # Preparación del adyuvante AS01 B
# Preparación del adyuvante AS01 E seguida por reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividida potenciada con AS01 E.
Formulación del volumen final trivalente sin adyuvante y carga en el recipiente del antígeno.
Se hace referencia a la sección V.2.3 para la vacuna de la gripe potenciada con AS01B.
Preparación del volumen de adyuvante AS01B y carga en el recipiente del adyuvante
Se hace referencia a la sección V.2.3 para la vacuna de la gripe potenciada con AS01B.
Reconstitución extemporánea de la vacuna del virus dividido potenciada con AS01E.
Preparando el adyuvante AS01E el contenido del vial del diluyente se retira con una jeringa y se inyecta en el vial que contiene el adyuvante AS01B, seguido por mezcla. En el momento de la inyección, se retiran 600 !l de adyuvante AS01E con una jeringa del vial de AS01E y se inyecta en el vial que contiene los antígenos de viriones divididos inactivados trivalentes concentrados. Después de mezclar se retira el contenido con la jeringa y la aguja sereemplaza por una aguja intramuscular. Una dosis de vacuna candidata de la gripe potenciada con AS01 E corresponde a 1 ml.
Cuatro visitas programadas por sujeto: en los días 0, 21, 90 y 180, recogiéndose muestras de sangre en cada visitapara evaluar la inmunogenicidad.
Programa de vacunación: una inyección de vacuna de la gripe en el día 0.
VI.2.7 Ensayos inmunológicos
Hemaglutinación-Ensayo de inhibición
La respuesta inmunitaria se determina midiendo los anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HI) usando elprocedimiento descrito por el Centro colaborador de la OMS para la gripe, Centros de Control de Enfermedades, Atlanta, EE.UU. (1991). Las mediciones de la titulación de anticuerpos se realizaron en muestras de suero congeladas descongeladas con un microprocedimiento normalizado y validado exhaustivamente usando 4 unidadesinhibidoras de la hemaglutinación (4 UIH) de los antígenos adecuados y una suspensión al 0,5% de eritrocitos deave de corral. Los inhibidores séricos no específicos se eliminaron mediante tratamiento con calor y enzimadestructora del receptor. Los sueros obtenidos se evaluaron determinando los niveles de anticuerpos de HI. Comenzando con una dilución inicial de 1:10, se preparó una serie de diluciones (por un factor de 2) hasta una dilución final de 1:20480. Como punto final de la titulación se tomó la dilución más elevada que mostró una inhibición completa (100%) de la hemaglutinación. Todos los análisis se realizaron por duplicado.
Citometría de flujo de citocinas (CFC) usada para evaluar las frecuencia de citocinas-linfocitos CD4 o CD8 positivos.
Las células T DC4 y CD8 de sangre periférica específicas del antígeno se pueden reestimular in vitro produciendoIL-2, CD40L, TNF-alfa e IFN si se incuban con su antígeno correspondiente. En consecuencia, las células T CD4 y CD8 específicas del antígeno se pueden enumerar por citometría de flujo tras marcaje con inmunofluorescencia convencional del fenotipo celular así como por producción de citocinas intracelulares. En el presente estudio, comoantígenos para reestimular las células T específicas de la gripe se usarán antígenos de la vacuna de la gripe. Los resultados se expresarán en forma de una frecuencia de células T CD4 o CD8 positivas para citocina(s) dentro de la subpoblación de células T CD4 o CD8.
ELISPOT usado para evaluar la frecuencia de las células B de memoria
La tecnología Elispot de células B permite la cuantificación de las células B de memoria específicas para unantígeno dado. Las células B de memoria se pueden inducir para diferenciarse en células plasmáticas, in vitro tras el cultivo con CpG durante 5 días. Las células plasmáticas generadas específicas de antígeno generadas in vitro sepueden enumerar usando el ensayo elispot de células B. Las células plasmáticas generadas in vitro se incuban en placas de cultivo revestidas con antígeno. Las células plasmáticas específicas del antígeno formarán manchas anticuerpo/antígeno, que se pueden detectar mediante un procedimiento inmunoenzimático convencional. En elpresente estudio se usan las cepas de la vacuna de la gripe, o inmunoglobulina anti-humana revistiendo las placas de cultivo con el fin de enumerar las células plasmáticas secretoras de IgG o anti-gripe, respectivamente. Los resultados se expresan con frecuencia de plasma específica de antígeno en un millón de células plasmáticas productoras de IgG.
Caracterización exploratoria de PBMC
La expresión de marcadores seleccionados de superficie/activación (es decir, CD4, CD8, CD45RO, CD45RA, CD28,CD27 o algún KIR) se puede realizar. La función de los linfocitos T inducidos por la vacuna se puede abordar mediante el análisis de marcadores domésticos (es decir, CCR7, CXCR5) de citocinas (citocinas de T colaborador 1
o de T colaborador 2) o mediante análisis de la expresión de factores asociados con funciones reguladoras comoFoxp3, CTLA-2 o TGF-∀. En particular, la población CD8+CD28-u otras poblaciones de células T reguladoras sepuede analizar en relación con las respuestas humoral, de células B y T, al antígeno de la vacuna.
VI.3. Resultados de inmunogenicidad
VI.3.1. Criterios de valoración y resultados de CMI
Con el fin de caracterizar la respuesta de CMI después de la vacunación con las vacunas antigripales acompañadasde adyuvante, los linfocitos T CD4 y CD8 se reestimularon in vitro usando antígenos de las tres cepas de vacuna (usadas individualmente o combinadas). Los linfocitos T CD4/CD8 específicos de la gripe se enumeraron por citometría de flujo de acuerdo con el marcaje por inmunofluorescencia convencional de producción de citocinasintracelulares (IL-2, IFN-∃, TNF-% y CD40L).
Evaluación del criterio de valoración principal.
En el día 21: respuesta de CMI en todos los sujetos con respecto a la frecuencia del linfocito T CD4 específico de lagripe por 106 en pruebas que producen al menos dos citocinas diferentes (IL-2, IFN-∃, TNF-% y CD40L).
Para la evaluación de respuesta de CMI, se analiza la frecuencia del CD4 específico de la gripe como sigue:
Usando el abordaje de no inferioridad, la no inferioridad de al menos una vacuna potenciada con adyuvante contra la gripe (administrada a ancianos ) 65 años de edad-el grupo denominado ancianos Flu o ELD Flu) en comparación con los que recibieron FluarixTM (administrada a adultos de 18-40 años de edad-el grupo denominado Jóvenes Flu o Flu YNG) se alcanzó cuando el límite superior del intervalo de confianza bilateral 98,75% en el índice de la media geométrica (GM) (entre el grupo de FluarixTM (18-40 años) y el grupo con la vacuna candidata potenciada con adyuvante contra la gripe (grupo ) 65 años) en términos de frecuencia de células T CD4 específicas de la gripe productoras de al menos dos citocinas el día 21) fue inferior a 2,0.
ULCI al 98,75 % = (GMFluarix adultos)/GMgripe potenciada por coadyuvante)lt; 2
Las proporciones de CI al 98,75 %, 21 días después de vacunación, se introdujo en el ordenador usando un modelo de análisis de covarianza (ANCOVA) en la transformación en logaritmos decimales de las frecuencias. El modelo ANCOVA incluye el grupo de vacuna en forma de efecto fijo (FluarixTM (18-40 años) frente a la vacuna candidata potenciada con coadyuvante de la gripe (≥ 65 años)) y la frecuencia de pre-vacunación en forma de regresor. Larelación de la GM y su CI al 98,75% se derivan como transformación exponencial de contraste del grupocorrespondiente en el modelo. El CI al 98,75% para la GM ajustada se obtiene por transformación exponencial de CIal 98,75% para la media del ajuste por mínimos cuadrados del grupo del modelo ANCOVA anterior.
Resultados–Análisis Inferencial (Tabla 10)
En la Tabla 10 se presentan las relaciones de GM y GM ajustada (con su CI al 98,75%) de linfocito T CD4 específico de la gripe que produce al menos dos citocinas (IL-2, IFN-∃, TNF-% y CD40L) en el día 21, después de reestimulación in vitro con “antígenos combinados II”. Para cada vacuna antigripal acompañada de adyuvante, ellímite superior de CI al 98,75% de dos lados de la relación de la GM es bastante inferior al límite clínico de 2,0. Estomuestra la no inferioridad de ambas vacunas antigripales potenciadas por adyuvante administradas a sujetos mayores en comparación con la vacuna Fluarix™ administrada en adultos de edades entre 18 y 40 años con respecto a frecuencia post-vacunación de CD4 específico de la gripe.
Tabla 10 Relación de GM ajustada de las células T CD4 específicas de la gripe que producen al menos dos citocinas, después de reestimulación con antígenos de vacunas combinados, Día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad)
Relación GM (Flu YNG / AS01B )
Flu YNG
AS01B 98,8% CI
N
GM N GM Valor LL UL
74
2844,8 71 2725,6 1,04 0,79 1,38
Relación GM (Flu YNG/AS01E)
Flu YNG
AS01E 98.8% CI
N
GM N GM Valor LL UL
74
2879,6 74 2697,0 1,07 0,79 1,44
GM ajustada = media geométrica de anticuerpos ajustada para titulación de línea basal; N = Número de sujetos con resultados disponibles de pre-y post-vacunación; CI al 98,8% =Intervalo de confidencia al 98,8% para la relación de GM ajustada (Modelo Ancova: ajustepara línea basal); LL = Límite inferior, UL = Límite superior; Fuente de Información = Apéndicetabla IIIA
Resultados–Análisis descriptivo (Figura 6)
Los principales resultados fueron: 1) Antes de la vacunación la respuesta de CMI es superior en adultos jóvenes que en mayores 2) Después de la vacunación:
26 -hubo un efecto de refuerzo de la vacuna antigripal sobre la respuesta de CMI en adultos jóvenes (18-40 años)
-
la respuesta de CMI en los mayores que han recibido la vacuna antigripal acompañada de adyuvante se compara con la respuesta de CMI de adultos jóvenes.
La diferencia entre pre-y post-vacunación en respuestas de linfocitos T CD4 para todas las citocinas investigadas 5 (IL-2, CD40L, TNF-% y IFN-∃) fue significativamente superior con las vacunas acompañadas de adyuvante en comparación con Fluarix™ para todas las pruebas.
Análisis del objetivo terciario:
Con el fin de evaluar el criterio de valoración terciario, se midieron la frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 específicosde la gripe y células B de la memoria en los días 0, 21, 90 y 180.
10 # La frecuencia de linfocitos T CD4/CD8 específicos de la gripe con citocinas positivas se resumió (estadísticas descriptivas) para cada grupo de vacunación en los días 0 y 21, para cada antígeno.
# Se usó una prueba no paramétrica (prueba de Wilcoxon) comparando la situación de diferencia entre los dos grupos (vacuna antigripal acompañada de adyuvante frente a Fluarix™) y se calcula el valor p estadístico para cadaantígeno en cada prueba diferente.
15 # La estadística descriptiva en diferencia individual entre las respuestas del día 21/día 0 (Post-/Pre-vacunación) se calcula para cada grupo de vacunación y cada antígeno en cada prueba diferente.
# Se usa una prueba no paramétrica (prueba de Wilcoxon) comparando la diferencia individual (Post-/Prevacunación) y se calculará el valor p estadístico para cada antígeno en cada prueba diferente.
En la Tabla 11 se presentan los valores p de la prueba de Wilcoxon usados para comparar la diferencia en la20 frecuencia de linfocitos T CD4 específicos de la gripe.
Resultados-Evaluación del criterio de valoración terciario (Tabla 11)
Las conclusiones principales son:
# Las frecuencias de GM pre-vacunación de CD4 específicos de la gripe fueron similares en todos los grupos de sujetos mayores, pero superiores en los adultos de edades entre 18 y 40 años.
25 # La frecuencia post-vacunación (día 21) de linfocitos T CD4 específicos de la gripe fue significativamente más alta después de vacunación con vacunas potenciadas con coadyuvantes que con Fluarix™.
# En sujetos mayores, la frecuencia pos-vacunación de linfocitos T CD4 específicos de la gripe permaneció más baja en sujetos mayores vacunados con vacunas potenciadas con AS01 B o AS01E que en adultos de edad entre 18 y 40 años vacunados con Fluarix™.
30 # La frecuencia de GM pre-vacunación y post-vacunación en células T CD8 específicas de la gripe fue esencialmente similar en todos los grupos.
Tabla11 Estadística inferencial: valores p de las pruebas de Kruskal-Wallis para células T CD4 en cada momento (Cohorte ATP para Inmunogenicidad)
Descripción prueba
Valor p
AS01B frente a Flu YNG
AS01E frente a Flu YNG
día 0
día 21 día 0 día 21
TODOS DOBLES
lt;0,0001 0,0070 lt;0,0001 0,0025
CD4OL
lt;0,0001 0,0056 lt;0,0001 0,0015
IFN∃
lt;0,0001 0,0009 lt;0,0001 0,0006
IL2
lt;0,0001 0,0029 lt;0,0001 0,0021
TFN%
lt;0,0001 0,0295 lt;0,0001 0,0378
AS01B frente a Flu ELD
AS01E frente a Flu ELD
día 0
día 21 día 0 día 21
TODOS DOBLES
0,6165 0,0004 0,6165 0,0004
CD4OL
0,7560 0,0005 0,7560 0,0005
IFN∃
0,9936 0,0008 0,9936 0,0008
Descripción prueba
Valor p
AS01B frente a Flu YNG
AS01E frente a Flu YNG
día 0
día 21 día 0 día 21
IL2
0,6702 0,0011 0,6702 0,0011
TFN%
0,5450 0,0022 0,5450 0,0022
Resultados-Evaluación de los puntos finales de valoración de respuesta inmunitaria humoral
Variables observadas:
En los días 0, 21, 90 y 180: titulaciones de anticuerpos por inhibición de la hemoaglutinación (HI) en suero, analizadas por separado frente a cada una de las tres cepas del virus de la gripe representadas en la vacuna 5 (anticuerpos anti-H1N1, anti-H3N2 y anti-B).
El valor de corte para el anticuerpo por HI frente a todos los antígenos de vacuna se definió por parte del laboratorio antes del análisis (y equivale a 1:10). Un sujeto seronegativo es un sujeto cuya titulación de anticuerpo es inferior alvalor de corte. Un sujeto seropositivo es un sujeto cuya titulación de anticuerpo es superior o igual al valor de corte. A la titulación de anticuerpo inferior al corte del ensayo se le proporciona un valor arbitrario de la mitad del corte.
10 Los siguientes parámetros se calculan en base a las titulaciones de anticuerpos por HI:
# Media geométrica de las titulaciones (GMT) del anticuerpo por HI en los días 0 y 21, calculada tomando el antilogaritmo de la media de las transformaciones del logaritmo de titulación.
# Factores de seroconversión (SF) en el día 21 definidos a medida que aumenta la parte en GMT por HI en suero en el día 21 en comparación con el día 0.
15 # Velocidades de seroconversión (SC) en el día 21 definidas como el porcentaje de vacunas con o bien una titulación por HI pre-vacunación lt;1:10 y una titulación pos-vacunación ) 1:40, o bien una titulación pre-vacunación a ) 1:10 y un aumento mínimo de cuatro veces en la titulación pos-vacunación.
# Velocidades de seroprotección (SPR) en el día 21 definidas como el porcentaje de vacunas con una titulación por HI en suero )1:40.
20 El CI al 95% para GM se obtiene dentro de cada grupo por separado. El CI al 95% para la media del logaritmo de titulación transformado se obtiene en primer lugar suponiendo que los logaritmos de titulación transformados sedistribuyen normalmente con variante desconocida. Después el CI al 95% para GM se obtiene por transformación exponencial del CI al 95% para la media del logaritmo de titulación transformado.
El resultado serológico ausente para la medida de un anticuerpo particular no está sustituido. Por tanto, un sujeto sin 25 resultado serológico en un momento dado no contribuye al análisis del ensayo para ese momento.
Resultados de respuesta inmunitaria humoral (Figura 7 y Tabla 12)
Las GMT pre-vacunación de anticuerpos por HI para las 3 cepas de vacuna estaban dentro del mismo intervalo enlos 4 grupos de tratamiento. Después de la vacunación, existe un claro impacto de los 2 adyuvantes que aumentan la respuesta humoral en los mayores, en comparación con Fluarix convencional en la misma población (Figura 7).
30 Las GMT son
# significativamente superiores para H1N1 para AS01 E
# significativamente superiores para H3N2 para ambos adyuvantes.
# No se observo ninguna diferencia significativa en términos de GMT post-vacunación entre los dos grupos de sujetos que ha recibido las vacunas adyuvantes.
35 Veinte días después de la vacunación, los sujetos de Fluarix (18-40 años) tuvieron una respuesta HI superior para las cepas New Caledonia y B/Jangsu.
Como se muestra en la Tabla 12 las vacunas antigripales acompañadas de adyuvantes sobrepasaron los requisitos de las autoridades europeas para el registro anual de vacunas antigripales de virión dividido [“Nota para la Directriz sobre los requisitos para vacunas antigripales para evaluación inmunológica de los cambios anuales de las cepas”
40 (CPMP/BWP/214/96)] en sujetos de edades superiores a 60 años.
Después de la vacunación, se produjo una diferencia estadística con respecto a velocidades de seroprotección deanticuerpos por HI entre el grupo de Fluarix () 65 años) y
# Flu/AS01B y Flu/AS01E para cepa A/H1N1/ New Caledonia
Para cada cepa de vacuna, las velocidades de seroprotección para los 2 grupos de vacuna antigripal acompañada 45 de adyuvante están en el mismo intervalo en comparación con el grupo Fluarix (18-40 años).
Para cada cepa de vacuna, las velocidades de seroconversión para los 2 grupos de vacuna antigripal acompañada de adyuvante están en el mismo intervalo en comparación con el grupo Fluarix (18-40 años), salvo para la cepa New Caledonia.
Tabla 12 Velocidades de seroprotección, velocidades de seroconversión y factores de conversión en el día 21 (cohorte ATP para inmunogenicidad)
Cepas
Grupo N Velocidad de seroprotección(titulación HI ) 40)% Velocidad seroconversión () aumento cuatro veces) [CI al 95%] % Factor de conversión [CI al 95%]%
Norma UE (gt; 60 años)
gt; 60% gt; 30% gt; 2,0
Norma UE (lt; 60 años)
gt; 70% gt; 40% gt; 2,5
A/New Caledonia (H1N1)
Flu Yng 75 100 [95,20-100] 77,3 [66,2-86,2] 35,1 [21,9-56,4]
Flu Elderly
49 71,4 [56,74-83,42] 30,6 [18,3-45,4] 3,7 [2,4-5,7]
FluAS01B
75 97,3 [90,70-99,68] 48,0[36,5-59,8] 4,5 [3,3-6,1]
FluAS01E
75 93,3 [85,12-97,80] 52,0 [40,2-63,7] 5,0 [3,6-6,9]
A/New York(H3N2)
Flu Yng 75 93,3 [85,12-97,80] 76,0 [64,7-85,1] 9,2 [7,1-11,8]
Flu Elderly
49 81,6 [67,98-91,24] 69,4 [54,6-81,7] 8,2 [5,7-11,8]
FluAS01B
75 96,0 [88,75-99,17] 85,3 [75,3-92,4] 13,1 [10,0-17,1]
FluAS01E
75 93,3 [85,12-97,80] 80,0 [69,2-88,4] 14,5 [10,4-20,2]
B/Jiangsu (B)
Flu Yng 75 100 [95,20-100] 80,0 [69,2-88,4] 13,9 [10,1-19,1]
Flu Elderly
49 93,9 [83,13-98,72] 81,3 [70,7-89,4] 4,3 [3,0-6,1]
FluAS01B
75 100 [95,20-100] 65,3 [53,5-76,0] 5,2 [4,2-6,5]
FluAS01E
75 97,3 [90,70-99,68] 70,7 [59,0-80,6] 6,7 [5,1-8,9]
N = número total de sujeto; % = porcentaje de sujetos con titulación en el día 21 dentro del intervalo específico; CI =
intervalo de confianza
VI.3.2. Conclusiones de inmunogenicidad
# La frecuencia pre-vacunación de CD4 específico de la gripe fue significativamente inferior en adultos mayores
10 en comparación con adultos de edades entre 18 y 40 años. Después de la vacunación con Fluarix™, la frecuencia pos-vacunación (día 21) permaneció inferior en adultos mayores en comparación con los jóvenes. Por el contrario, la no inferioridad con respecto a la frecuencia de frecuencia pos-vacunación de CD4 específico de la gripe después de la vacunación con vacunas potenciadas por adyuvante en sujetos mayores se demostró comparada con vacunación con Fluarix™ en adultos con edades entre 18 y 40 años.
15 # En lo que se refiere a la respuesta inmunitaria humoral con respecto a la respuesta de anticuerpo por HI, todas las vacunas antigripales cumplieron los requisitos de las autoridades europeas para el registro anual de vacunas antigripales inactivadas [“Nota para la Directriz sobre los requisitos para vacunas antigripales para evaluación inmunológica de los cambios anuales de las cepas” (CPMP/BWP/214/96)]. En adultos mayores, las vacunas acompañadas de adyuvante mediaron al menos una tendencia de respuesta inmunitaria humoral superior a la
20 hemaglutinina de la gripe que Fluarix™. En la Tabla 13 se resume la diferencia significativa entre la respuesta inmunitaria humoral frente a cada cepa de vacuna mediada en sujetos mayores por vacunas acompañadas deadyuvante en comparación con Fluarix™. En comparación con adultos de edades entre 18 y 40 años vacunados con Fluarix™, los sujetos mayores vacunados con las vacunas acompañadas de adyuvante mostraron una tendencia de GTM pos-vacunación y factor de seroconversión superiores en el día 21 frente a la cepa A/New York.
25 Tabla 13 Diferencia significativa en la respuesta inmunitaria humoral entre vacunas con adyuvantes y Fluarix en sujetos ancianos
Post-vac GMT
Factor de Seroconversión Tasa de Seroproteccción Tasa de Seroconversión
FluAS01B
A/ New York A/New Caledonia
FluAS01E
A/ New Caledonia A/ New York A/ New Caledonia
Post-vac GMT= Media geométrica de la Titulación en la post-vacunación.
Conclusiones de reactogenicidad
VI.4.1. Registro de episodios adversos (AE)
Se registraron los síntomas solicitados (véase la tabla 14) que se producen durante un período de seguimiento de 7 30 días (día de vacunación y 6 días posteriores). También se registraron los síntomas no solicitados que se producen durante el período de seguimiento de 21 días (día de vacunación y 20 + 3 días posteriores). La intensidad de los AE
siguientes se determinó como se describe en la Tabla 15.
Tabla 14 Episodios adversos locales/generales solicitados
AE locales solicitados
AE generales solicitados
Dolor en el sitio de la inyección Enrojecimiento en el sitio de la inyección Hinchazón en el sitio de la inyección Hematoma
Fatiga Fiebre Migraña Dolor muscular Temblor Dolor en la articulación en el brazo de la inyección Dolor en la articulación en otras localizaciones
N.B. Se registró la temperatura por la tarde. Las mediciones de temperatura adicional se deben realizar en otros momentos del día, se registró la temperatura más alta.
Tabla 15 Escalas de intensidad para los síntomas solicitados en adultos
Episodio adverso
Grado de intensidad Parámetro
Dolor en el sitio de la inyección
0 Ausente
1
cuando se toca
2
cuando se mueve el miembro
3
evita la actividad normal
Enrojecimiento en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Hinchazón en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Hematoma en el sitio de la inyección
Diámetro de la superficie de mayor registro en mm
Fiebre*
Temperatura de registro en °C / °F
Migraña
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Fatiga
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Dolor de articulación en el sitio de inyección y otraslocalizaciones
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
Dolor muscular
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
continuación
Episodio adverso
Grado de intensidad Parámetro
Temblor
0 Ausente
1
se tolera fácilmente
2
interfiere con la actividad normal
3
evita la actividad normal
*Fiebre se define como la temperatura de la axila ) 37,5°C (99,5°F)
La intensidad máxima del enrojecimiento/hinchazón del sitio de inyección local se puntúa como sigue: 0 es 0 mm; 1 es gt; 0-≤ 20 mm; 2 es gt; 20-≤ 50 mm; 3 es gt; 50 mm.
5 La intensidad máxima de fiebre se puntúa como sigue:
1 es gt;37,5-∗ 38.0°C; 2 es gt; 38,0-∗ 39,0°C; 3 es gt; 39,0
El investigador hace una evaluación de la intensidad de los otros AE, es decir, síntomas no solicitados, que incluyen SAE reseñados durante el estudio. La evaluación se basa en el juicio clínico del investigador. La intensidad de cadauno de los registros de AE se asigna a una de las siguientes categorías:
10 1 (suave) = Un valor de AE que se tolera fácilmente por el sujeto, provocando malestar y que no interfiere con las actividades de cada día;;
2 (moderado) = Un valor de AE que es suficientemente molesto para interferir con las actividades de cada día normales;
3 (grave) = Un valor de AE que evita las actividades normales de cada día (en adultos/adolescentes, tal valor de AE15 evitaría, por ejemplo, la atención en el trabajo/escuela y necesitaría la administración de terapia correctora).
VI.4.2. Registro de episodios adversos (AE)
En los sujetos ancianos, la reactogenicidad observada con vacunas de adyuvantes, en términos de síntomas tanto locales como generales era más alta que con Fluarix™. No solamente la incidencia sino también la intensidad de síntomas se incrementaron después de la vacunación con vacunas de adyuvantes (Figura 8). Los síntomas de grado
20 3 muestran una tendencia a ser más altos en el grupo que recibía la vacuna potenciada con adyuvantes con la concentración de los inmunoestimulantes más alta (MPL, QS21) al grupo que recibía la vacuna potenciada conadyuvantes en el que los inmunoestimulantes están a una concentración menor. Sin embargo, en todos los casos, los síntomas se resuelven rápidamente.
Ejemplo de referencia VII: evaluación pre-clínica de las vacunas VPH con adyuvantes en ratones.
25 Este estudio usó una composición antigénica bivalente de papilomavirus humano (VPH), combinando partículas de tipo virus (VLP) formadas a partir de L1 de VPH 16 y L1 de VPH 18 como el antígeno. El objetivo del estudio era comparar la eficiencia de esta preparación antigénica cuando se formula con AS01B y una dilución 1/5 de AS01B, evaluada de manera comparativa con el adyuvante actual encontrado en la vacuna de cáncer cervical de GSK, AS04 (MPL sobre alumbre).
30 VII.1-Vacunación
Se inyectaron ratones (n = 12 por grupo) en los días 0 y 28 con formulaciones de vacuna compuestas por VPH16/18 L1 (2 !g o 0,5μg cada una) derivadas de procedimiento Hi-5 80/80L y formuladas con AS04 (50 μg MPL formuladas con alumbre o AS01B (50 μg QS21-50 μg MPL en 0,5 ml) 1/10 y 1/50 de dosis humana. Ya que los estudios sellevaron a cabo en ratones, la dosis humana de 1/10 se puede tomar equivalente a la formulación de AS01 B, es35 decir. 50 μg de QS21 y 50 μg de MPL en 0,5ml y 1/50 se puede tomar para que sea una dilución 1/5 de la formulación humana AS01 B es decir: 10 μg de QS21 y 10 μg de MPL en 0,5 ml. Se tomaron muestras de sangre los días 14 y 45 después de la dosis II para ensayar los anticuerpos específicos de tipo anti-L1 en suero individual. Latinción de citocinas intracelulares se midió los días 7 y 14 después de II en PBMC y el día 45 después de II usando células de bazo. La frecuencia de las células B de memoria específica de VLP se midieron el día 45 después de II
40 usando células de bazo.
VII.2-Anti-VPH 16/18 L1 ELISA
La cuantificación de anticuerpos anti-VPH-16 y VPH-18 L1 se realizó mediante ELISA usando VPH-16 y VPH-18 L1 como revestimiento. Se diluyeron los antígenos a una concentración final de 0,5 μg/ml in PBS y se adsorbieron durante toda una noche a 4°C a los pocillos de placas de microvaloración de 96 pocillos (Maxisorp Immuno-plate, 45 Nunc, Dinamarca). Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía albúmina sérica bovina al 1% (tampón de saturación). Sueros diluidos en tampón que contiene PBS + 0,1% de Tween 20 + 1% deBSA se añadieron a las placas revestidas con VPH L1 y se incubaron durante 1 hora 30 min a 37°C. Las placas se lavaron con cuatro veces con PBS 0,1% de Tween 20 e Ig anti-ratón conjugada a biotina (Dako, Reino Unido) diluidaa 1/1000 en tampón de saturación se añadió a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37°C. Después de la etapa 50 de lavado, estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (Dako, Reino Unido), diluida 1/3000 en tampón desaturación se añadió durante un tiempo adicional de 30 min a 37°C. Las placas se lavaron como se ha indicado anteriormente y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con una solución de 0,04% de o
fenilendiamina (Sigma) 0,03% de H2O2 en 0,1% de Tween 0, tampón citrato 0,05 M pH 4,5. La reacción se detuvo con H2SO4 2N y se leyó a 492/620 nm. Las titulaciones de ELISA se calcularon a partir de una referencia de SoftMaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresaron en EU/ml.
VII.3-Tinción de citocinas intracelulares (ICS)
La tinción de citocinas intracelulares de las células T se realizó sobre PBL los días 7 y 14 después de II y sobre las células de bazo el día 45 después de la segunda inmunización. PBMC (1 conjunto/grupo) o células de bazo (4conjuntos de 3 órganos por grupo) se recogieron de los ratones. La estimulación de antígenos in vitro de células de bazo se llevó a cabo a una concentración final de 5 106 células /ml (microplaca de 96 pocillos) con VLP 16, 18, 31 o45 (5 μg/ml) + anticuerpos CD49d CD28 (1 μg/ml) y después se incubaron 3H a 37°C. Después de la etapa dereestimulación de antígenos, se incubaron las células durante toda una noche en presencia de Brefeldin (1 μg/ml) a37°C inhibiendo la secreción de citocinas. La tinción de citocinas se realizó como sigue: se lavaron suspensiones celulares, se resuspendieron en 50 μl de PBS 1% FCS que contiene 2% Fc de reactivo bloqueador (1/50; 2.4G2). Después de 10 minutos de incubación a 4°C, se añadieron 50 μl de una mezcla de anti-CD4-APC (1/50) y anti-CD8perCp (1/50) y se incubaron 30 min a 4°C. Después de lavar en PBS 1% FCS, las células se permeabilizaron resuspendiendo en 200 μl de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) y se incubaron durante 20 min a 4°C. Después las células se lavaron con Perm Wash (Kit BD) y se resuspendieron con 50 μl de anti-IF∃ APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluidos en PermWash. Después de 2H de incubación a 4°C, las células se lavaron con Perm Wash y se resuspendieron en PBS 1% FCS + 1% paraformaldehído. El análisis de muestras se realizó mediante FACS. Se activaron las células vivas (FSC/SSC) y se realizó una adquisición en ~ 20.000 casos (linfocitos). Los porcentajes de IFγ + o IL2+ se calcularon en las poblaciones activadas por CD4+ y CD8+.
VII.4-Memoria de células B
Cuarenta y cinco días después de la segunda inmunización, se sacrificaron los ratones, se separaron las células del bazo mediante un gradiente de linfoprep (Cedarlane). Después se resuspendieron las células B en medio RPMI1640 (Gibco) que contienen aditivos (piruvato de sodio 1 mM, MEM aminoácidos no esenciales, Pen/Strep, Glutamina y ∀-2 mercaptoetanol), 5% de suero de ternera fetal, 50 U/ml rhIL-2 (eBioscience) y 3 μg/ml de CpG. Se cultivaron las células durante cinco días a una concentración final de 106 células/ml, en 5 ml de placas de fondo redondo de 6 pocillos. Después de una etapa de activación con etanol, se recubrieron las placas de nitrocelulosa (Multiscreen-IP; Millipore) con 10 μg/ml de VLP o con Ig de cabra anti-ratón (GAM; Sigma) diluido 1/200 in PBS. Después de una etapa de saturación con medio completo, se añadieron 100 μl de 2,106 células/ml a las placas recubiertas con VLP y se añadieron 100 μl de 106 y 5.105 células/ml a las placas de GAM. Después de un tiempo de incubación de 2 hrs a 37°C, se almacenaron las placas durante toda una noche a 4°C. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS 0,1% Tween 20 y anti-ratón Ig Biot diluido 1/200 en PBS 1% BSA 5% FCS (tampón de dilución) sedistribuyó a las placas y se incubó durante 2 horas a 37°C. Después de la etapa de lavado, se añadió Extravidina HRP (Sigma) diluida 1/550 en tampón de dilución durante 1 hora adicional a 37°C. Se lavaron las placas como se ha indicado anteriormente y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con una solución de AEC (Sigma). La reacción se detiene enjuagando las placas suavemente cubietas con agua del grifo. Cuando las placas están secas, se leen con KS-400.
VII.5-Análisis estadístico
Los medios de formulación se compararon usando un análisis de una cola de varianza (ANOVA 1). El análisis se llevó a cabo en los datos transformados de log10 para propósitos de normalización. Cuando se detectó una diferencia significativa entre los medios de procedimiento (valor de p ≤ 0,05), se llevaron a cabo comparaciones por pares entre los medios a un nivel significativo de 0,05 (ensayo de comparación múltiple de Student-Newman-Keuls).
VII.6–Resultados
Se inmunizaron los ratones como se ha indicado anteriormente VII.1. Se usaron los siguientes grupos
Grupos
Antígeno Adyuvante Dilución de adyuvante
1
VPH 16-18 L1 2 μg AS04 1/10 dosis humana (equivalente a 50 μg de MPL por 0,5 ml HD)
2
VPH 16-18 L1 0,5μg AS04 1/50 dosis humana (equivalente a 10μg MPL por 0,5 ml de HD)
3
VPH 16-18 L1 2 μg AS04 1/10 dosis humana (equivalente a 50μg de MPL por 0,5 ml de HD)
4
VPH 16-18 L1 0.5μg AS04 1/50 dosis humana (equivalente a 10μg de MPL por 0,5 ml de HD)
5
VPH 16-18 L1 2μg AS01B 1/10 dosis humana (equivalente a 50 μg de MPL por 0,5 ml de HD)
6
VPH 16-18 L1 0,5 μg AS01B 1/50 dosis humana (equivalente a 10 μg de MPL por 0.5ml HD)
7
VPH 16-18 L1 2μg AS01B 1/10 dosis humana (equivalente a 50 μg de MPL por 0,5ml de HD)
(continuación)
Grupos
Antígeno Adyuvante Dilución de adyuvante
8
VPH 16-18 L1 0.5μg AS01B 1/50 dosis humana (equivalente a 10 μg de MPL por 0,5ml HD)
VII.6.1-Respuestas humorales
No se observó intervalo de dosis significativo para las dos dosis ensayadas de antígenos con ambas diluciones de adyuvantes bien para valoraciones de anticuerpos de VPH 16-L1 o bien para valoraciones de anticuerpos de VPH18-L1 (figura 9)
5 No se observó intervalo de dosis significativo para las dos dosis ensayadas de cada adyuvante en cuanto a la dosis de antígeno para las valoraciones de anticuerpo anti VPH 16-L1.
Cuando se miran las titulaciones de anticuerpo anti VPH 18-L1, se observa un ligero incremento en la valoración según AS01B (1/10 HD) comparado con AS01B (1/50 HD) como se mide el día 14 después de II (intervalo de dosis 2,5 veces, valor de p = 0,0035), sin embargo este intervalo se observó solamente para 2 μg de antígeno y no para
10 0,5 μg de antígeno (valor de p = 0,0867), el día 45 después de II, no se observó ningún intervalo de dosis significativo para las dos dosis ensayadas de cada adyuvante con relación a la dosis de antígeno.
VII.6.2-Respuestas celulares
Tinción de citocinas intracelulares
No se detectó ningún efecto de intervalo de dosis para las dos dosis ensayadas de antígenos con relación a la dosis
15 de adyuvante para VPH 18-L1. Se obtuvieron frecuencias similares de CD4+ T células específicas de VLP16 con las dos dosis ensayadas de antígeno con dosis diferentes de adyuvantes. (Figura10).
Se observó un ligero efecto de dosificación (2,6 veces, valor de p = 0,0009 para VPH 18-L1, 2 veces, valor de p = 0,0187 para VPH 16-L1) para AS01 B (1/10 HD) comparado con AS01 B (1/50 HD), sin embargo se observó este intervalo solamente para 2 μg de antígeno y no para 0,5 μg de antígeno.
20 Células de memoria B específicas
No se observó ningún efecto de intervalo de dosis para las dos dosis ensayadas de antígenos con relación a la dosisde adyuvante para VPH 16 o 18 L1 (figura 11)
No se observó ningún efecto de intervalo de dosis de adyuvante para las dos dosis ensayadas de adyuvantes con relación a la dosis de antígeno para VPH 17 o 18 L1.
25 Como se puede observar a partir de los resultados anteriores, una dilución 1/5 dilución de AS01B produce una formulación que tiene eficacia equivalente en las composiciones inmunógenas a la propia AS01B.
Ejemplo de referencia VIII: Evaluación preclínica de vacunas de S. pneumoniae en ratones.
La vacuna de neumococos usada en este estudio eran unas vacunas conjugadas de neumococos con (11PCV/AS) que constan de una mezcla de 11 conjugados 11 de polisacáridos con adyuvantes o bien con AS01B o AS01E. Los
30 conjugados constan de los serotipos de polisacáridos purificados de S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F y 23F, cada uno de ellos conjugados individualmente a una proteína vehículo, o bien toxoide de difteria (DT), toxoide de tétanos (TT) o proteína D de H. influenzae (PD). Las vacunas se presentan como un polvo secado por congelación a reconstituir con uno de los líquidos adyuvantes.
11PCV/AS se produce como sigue:
35 Las condiciones de activación y acoplamiento son específicas para cada polisacárido. Estas se proporcionan en la tabla más adelante. El polisacárido calibrado (salvo para PS5, 6B and 23F) se disolvió en NaCl 2M o en agua para inyección (WFI). La concentración óptima de polisacárido se evaluó para todos los serotipos. Todos los serotipos salvo el serotipo 18C se conjugaron directamente a la proteína vehículo como se detalla más adelante.
A partir de una solución madre de 100 mg/ml en acetonitrilo o solución de acetonitrilo/agua 50%/50%, se añadió
40 CDAP (relación CDAP/PS 0,75 mg/mg PS) a la solución de polisacárido. 1,5 minutos después, se añadió 1,5 0,2M-0,3M de NaOH obteniendo el pH de activación específica. La activación del polisacárido se realizó a este pH durante 3 minutos a 25ºC. La proteína purificada (proteína D o DT) (la cantidad depende de la relación inicial de PS/proteínavehículo) se añadió al polisacárido activado y la reacción de acoplamiento se realizó al pH específico durante hasta dos horas (dependiendo del serotipo) sometida a un pH de regulación. Con el fin de inactivar los grupos éster de
45 cianato sin reaccionar, se añadió después una solución 2M de glicina a la mezcla. Se ajustó el pH al pH de inactivación (pH 9,0). La solución se agitó durante 30 minutos a 25ºC y después durante toda una noche a 2-8 °C con agitación lenta continua.
Preparación de 18C:
18C se ligó a la proteína vehículo mediante un enlace-dihidrazida de ácido adípico (ADH). Se microfluidificó el 50 serotipo 18C polisacárido antes de la conjugación.
Derivatización del toxoide de tétanos con EDAC
Para la derivatización del toxoide de tétanos, se diluyó TT a 25 mg/ml en NaCl 0,2M y se añadió el espaciador ADH con el fin de alcanzar una concentración final de 0.2 M. Cuando la disolución del espaciador se completó, se ajustó el pH hasta 6,2. EDAC (1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil) carbodiimida) se añadió después hasta alcanzar una
5 concentración final de 0,02M y la mezcla se agitó durante 1 hora sometida a regulación de pH. La reacción de condensación se detuvo incrementando el pH hasta 9,0 durante al menos 30 minutos a 25ºC. TT derivatizada sediafiltró después (membrana10 kDa CO) in con el fin de retirar reactivos ADH y EDAC residual.
La cantidad a granel de TTAH se filtró finalmente de manera estéril hasta la etapa de acoplamiento y se almacenó a 70°C.
10 Acoplamiento químico de TTAH a PS 18C
Los detalles de los parámetros de conjugación se pueden encontrar en la Tabla 1. Se diluyeron 2 gramos de PS micofluidificado en la concentración definida de agua y se ajustaron hasta NaCl 2 M mediante la adición de NaCl en polvo.
Se añadió solución de CDAP (100 mg/ml preparado recientemente 50/50 v/v acetonitrilo/WFI) alcanzando la 15 proporción apropiada de CDAP/PS.
El pH se incrementó hasta el pH de activación 9,0 mediante la adición de NaOH 0,3 M y se estabilizó a este pH hasta la adición de TTAH.
Después de 3 minutos, se añadió TTAH derivatizado (20 mg/ml en ClNa 0,2 M) hasta alcanzar una relación TTAH /PSde 2; se reguló el pH hasta el pH de acoplamiento de 9,0. Se dejó la solución una hora sometida a pH de regulación.
20 Para inactivar, se añadió una solución de glicina 2M a la mezcla PS/TTAH/CDAP.
Se ajustó el pH hasta el pH de inactivación (pH 9,0).
La solución se agitó durante 30 minutos a 25ºC y después se dejó durante toda una noche a 2-8ºC con agitación lenta continua.
Purificación de los conjugados:
25 Los conjugados se purificaron mediante filtración de gel usando una columna de filtración de gel Sephacryl 500HR equilibrada con NaCl 0,15M (S500HR para 18C) retirando las moléculas pequeñas (incluyendo DMAP) y PS yproteína no conjugadas. Basándose en los diferentes tamaños moleculares de los componente de reacción, los conjugados PS-PD, PS-TT o PS-DT se eluyen primero, seguido de PS libre, después mediante PD libre o DT libre y finalmente DMAP y otras sales (NaCl, glicina).
30 Las fracciones que contienen los conjugados se detectan mediante UV280 nm. Se reúnen las fracciones de acuerdo con su Kd, se filtran de manera estéril (0,22 !m) y se almacenan a +2-8°C. Se determinaron las relaciones PS/Proteína en las preparaciones de conjugados.
Condiciones específicas de activación/acoplamiento/inactivación de conjugados de PS S. pneumoniae-Proteína D/TT/DT
Serotipo
1 μfluido 3 (μfluid.) 4 μfluido 5 6B 7F μfluido
conc. (mg/ml) dePS
2,5 3,0 2,5 7,1 5,0 5,0
disolución de PS
WFI NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M
conc. (mg/ml) dePD
10,0 5,0 10,0 5,0 5,0 10,0
Relación inicial de PS/PD (p/p)
1,5/1 1/1 1,5/1 1/1 1,1/1 1,2/1
conc. de CDAP (mg/mg PS)
0,50 0,75 0,50 0,79 0,83 0,75
pHa =pHc =pHq
9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,5
Serotipo
9V μfluido 14 μfluido 18C μfluido 19F μfluido 23F
conc, (mg/ml) dePS
5,0 5,0 4,5 9,0 2,38
disolución de PS
NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M
conc, (mg/ml) devehículo proteína
10,0 10,0 20,0 (TT) 20,0 (DT) 5,0
Relación inicial de proteínavehículo/PS (p/p)
1,2/1 1,2/1 2/1 1,5/1 1/1
conc, (mg/mg PS) deCDAP
0,50 0,75 0,75 1,5 0,79
pHa=pHc=pHq
9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0

Los 11 conjugados se mezclan después y la preparación antigénica final mezclada con el adyuvante antes de lainmunización.
5 Se inmunizaron IM 40 ratones hembras Balb/c de cuatro semanas de edad los días 0, 14 y 28 con 0,1μg de conjugados 11-valentes PS formulados con o bien AS01 B o AS01 E. Se dosificaron anticuerpos Anti-PS IgG mediante ELISA en los sueros recogidos el día 42.
Como se puede observar en la figura 12, se observaron respuestas comparables entre la formulación AS01E diluida comparada con la formulación AS01 B salvo para PS 14 donde se observó una mayor respuesta con AS01B y PS
10 19F donde se observó una mayor respuesta con AS01 E.
Ejemplo de referencia IX: evaluación preclínica de las composiciones inmunógenas de citomegalovirus con adyuvantes y sin adyuvantes.
IX.1: Cobayas.
IX.1.1 Elisa anti-gB
15 La cuantificación de anticuerpos anti-anticuerpos gB se realizó mediante ELISA usando gB como un antígeno de cobertura. Se diluyó el antígeno a una concentración final de 4 μg/ml en PBS y se incubaron 100 μl durante toda una noche a 4 0C en placas de microvaloración de 96 pocillos. Después las placas se saturaron durante 1 hora a 37 0C con 200 μl de PBS que contiene albúmina sérica bovina al 1%. Se añadieron disoluciones en serie dos veces (100 μl/pocillo) y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37 0C. Las placas se lavaron 4 veces con PBS 0,1% de Tween
20 20 y se añadieron a cada pocillo 100 μl de IgG de peroxidasa de rábano picante anti-cobaya (Dako, Reino Unido) y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37 0C. Se lavaron las placas 4 veces con PBS 0,.1% de Tween 20 y 1 vez con agua. Después se incubaron durante 20 minutos a 22 0C con 100 μl de una solución de o-fenilendiamina (Sigma) en tampón citrato 0,1 M pH 4,2. Esta reacción se detuvo con 100 μl de H2SO4 2N y se leyó a 490/620 nm.Las valoraciones de Elisa se determinaron mediante interpolación de los valores de la DO a partir de una referencia
25 de muestra de SoftMaxPr. Las valoraciones se expresan en EU/ml.
Se realizaron analiza estadísticos 14 días después de los datos de 2 Elisa usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de varianza se puede describir brevemente como sigue:
1)
Transformación Log de los datos
2)
Ensayo Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad
3)
Ensayo de Cochran con el fin de verificar la homogeneidad de varianza entre poblaciones diferentes
(grupos)
4) Análisis de varianza de los datos seleccionados (una cola)
5) Ensayo de Tuckey-HSD para comparación múltiple.
IX.1.2–Ensayo de neutralización
Antes del ensayo, se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 3 días a 37ºC con CO2 células MRC5 (10000 células/200 μl de medio MEM). Se realizaron e incubaron diluciones de dos veces de suero inactivado (30 minutos a 56ºC) con 100 μl de disolución viral (800/ml) durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, se inocularon 100 μl de mezcla de suero/virus en microplacas de 96 pocillos que contienen monocapa de MRC5. Las placas se centrifugaron a 2000 RPM durante 1 hora a 35ºC. Después de una incubación a 37ºC, las placas se fijaron con una disolución de acetona al 80% (20 minutos a -20ºC). La disolución de acetona se descartó y las células positivas para CMV se detectaron usando un monoclonal específico anti-antígeno temprano inmediato durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron 3 veces con PBS y se añadió Ig antirratón conjugada con biotina y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante una adición de 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces y se incubaron durante 10 minutos con una disolución de True-blue. Las señales de color específico se registraron mediante examen con el microscopio. Las valoraciones de neutralización se expresaron como la inversa de la dilución más alta de suero dando un 50% de reducción de células CMV positivas comparadas con un control de virus (CMV más células sin suero).
IX.1.3–Protocolos de inmunización
Se inmunizaron 4 grupos. Cada grupo contenía 8 conejillos de Indias Hartley Clr:(ha) hembras de 5-8 semanas deedad, salvo por un grupo de control (grupo 4) que contenía solo 4 sujetos. Los sujetos se inmunizaron IM a 0 y 28días. Las muestras de suero se recogieron 28 días después de la primera inmunización y 14 días después de la segunda inmunización. Se llevaron a cabo ensayos de ELISA como se describe anteriormente en suero tomado a 28 tras I y 14 tras II. Los ensayos de neutralización se llevaron a cabo como se describe anteriormente a 14 tras II. Losgrupos son como a continuación:
Grupo
Antígeno Adyuvante
1
gB NaCl
2
gB AS01B
3
gB AS01E
4
NaCl NaCl
El antígeno se preparó como sigue. El antígeno de vacuna se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) como gB**, una quimera truncada conteniendo secuencias peptídicas de glicoproteína gD del virus Herpes Simplex 2 (HSV2) en su extremo N t C-terminal. La gB** está truncada en us dominio C-terminal que contiene la secuencia de unión a membrana y se segrega por lo tanto en el sobrenadante de cultivo.
Para los primeros tres grupos, 15 μg de gB** preparados en 500 μl de bien PBS, AS01B o bien AS01E (preparados como en el ejemplo II.2 anterior) se inyectaron intramuscularmente. En el grupo 4, PBS solo se administró intramuscularmente.
IX.1.4–Resultados
Como se puede ver en la figura 13, se observaron valoraciones de anti-gB ELISA significativamente mayores para los dos grupos adyuvantes comparadas con la llanura gB (valoración de 8 y 5,5 veces más alta para gB y AS01B y gb/AS01E respectivamente). Valoraciones de anticuerpo tras la dosis II fueron muy ligeramente mayores (1,5 veces) en el grupo gB/AS01B comparadas con el grupo gB/AS01E.
Comparación múltiple: Tuckey–HSD
Grupo
Casos Media Llanura AS01E AS01B
Llanura
8 4,7917 ** **
AS01E
8 5,5293 **
AS01B
8 5,6942 **
Llanuralt;AS01E = AS01B
Con respecto a titulaciones de neutralización (figura 14):
# No se observaron anticuerpos neutralizantes específicos en el grupo de la llanura gB
# Se detectaron anticuerpos neutralizantes específicos en ambos grupos adyuvantes
# Se observaron niveles similares de anticuerpos neutralizantes en ambos grupos adyuvantes.
IX.2–Ratones
IX.2.–ELISA anti gB
Se llevó a cabo mediante ELISA la cuantificación de anticuerpos anti-gB usando gB como un antígeno de recubrimiento. El antígeno se diluyó a una concentración final de 1 μg/ml en PBS y se incubaron 100 μl durante toda una noche a 4ºC en placas de microvaloración de 96 pocillos. Las placas se saturaron durante 1 hora a 37ºC con 200 μl de PBS que contienen 1% de seroalbúmina bovina. Se añadieron diluciones en serie dos veces de sueros (100 μl/pocillo) y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con Tween 20 al0,1% en PBS y se añadieron 100 μl de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante a cada pocillo durante unos 30 minutos adicionales a 37 0C. Las placas se lavaron 4 veces con Tween 20 al 0,1% en PBS y 1 vez con agua. Después de incubaron durante 10 minutos a 22 0C con 100 μl de tetra-metil-benzidina al 75% en tampón citrato 0,1M a pH 5,8. Esta reacción se detuvo con 100 μl de H2SO4 0,4 N y se leyó a 450/620 nm. Se determinaron valoraciones de ELISA mediante interpolación de valores de DO a partir de una referencia de muestra mediante SoftMaxPro. Las valoraciones se expresaron en UE/ml.
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo en los días 14 tras 2 datos de ELISA usando UNISTAT. El protocolo se aplicó para análisis de varianza se puede describir brevemente como sigue:
1) Transformación logarítmica de los datos
2) Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad
3) Prueba de Cochran con el fin de verificar la homogeneidad de varianza entre diferentes poblaciones (grupos)
4) Análisis de varianza en datos seleccionados (una ruta)
5) Prueba Tuckey-HSD para comparación múltiple.
IX.2.2–Ensayo de neutralización
Antes del ensayo, se distribuyeron en microplacas de 96 pocillos y se incubaron durante 3 días a 37ºC con CO2 al 5% células MRC5 (10000 células/200 μl de medio MEM). Se incubaron diluciones de dos veces (60 μl) de sueros inactivados (30 minutos a 56ºC) con 60 μl de disolución viral (800IPU/ml) durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, se inocularon 100 μl de mezcla de sueros/virus en microplacas de 96 pocillos que contienen células MRC5. Las placas se centrifugaron a 2000 RPM durante 1 hora a 35ºC. Después de una incubación a 37ºC, las placas se fijaron con una disolución de acetona al 80% (20 minutos a -20ºC). La disolución de acetona se descartó y las células positivas para CMV se detectaron usando un antígeno I (IE-I) temprano antiinmediato monoclonal específico durante 1 hora a 37ºC. Las placas de lavaron 3 veces con PBS y se añadió Ig antirratón conjugada con biotina y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante una adición de 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces y se incubaron durante 10 minutos con una disolución de True-blue. Las señales de color específico se registraron mediante examen con el microscopio. Las valoraciones de neutralización se expresaron como la inversa de la dilución más alta de suero dando un 50% de reducción de células CMV positivas comparadas con un control de virus (CMV más células sin suero).
IX.2.3–Tinción de citocina intracelular
Detección intracelular de citocinas de células T se llevó a cabo en PBL en días 7 y 21 después de la segunda inmunización. Se recogieron PBL de ratones y se almacenaron (1 reserva por grupo). Se hizo estimulación con antígeno in vitro de linfocitos (concentración final de 10*7 células/ml) bien con una reserva de péptidos que cubre la secuencia de CMV o bien con la proteína gB. Se incubó mezcla de PBL/antígeno 2 horas a 37ºC. Se incubaron después células durante toda una noche en presencia de Brefelding (1 μg/ml) a 37ºC inhibiendo secreción de citocinas.
La tinción celular se llevó a cabo como sigue: las suspensiones celulares se lavaron, se resuspendieron en 50 μl de PBS 1& FCS que contenía reactivo bloqueante de Fc al 2%. Después de 10 minutos de incubación a 4ºC, seañadieron 50 μl de una mezcla de anti-CD4 PE y anti-CD8 perCp y se incubaron 30 minutos a 4ºC. Después de una etapa de lavado en FCS al 1% en PBS, las membranas celulares se permeabilizaron mediante resuspensión en 200 μl de Cytofix = Cytoperm (kit de Beckton Dickinson) y se incubaron 20 minutos a 4ºC. Las células se lavaron después con PermWash (kit de BD) y se resuspendieron con 50 μl de un APC anti-IFN-gamma + FITC anti-IL-2diluidas en PermWash. Después de 2 horas de incubación a 4ºC, las células se resuspendieron en FCS al 1% enPBS + paraformaldehído al 1%.
El análisis de muestras se llevó a cabo mediante FACS. Las células vivas se controlaron y la adquisición se llevó a cabo en +/-20000 eventos. Los porcentajes de IFNg+ o IL2+ se calcularon en poblaciones CD4+ y CD8+controladas.
IX.2.4–Protocolos de Inmunización
Se inmunizaron 4 grupos. Cada grupo contenía 12 ratones C57Bl/6 hembra de 4–10 semanas de edad.
Grupo
Antígeno Adyuvante
1
gB NaCl
2
gB AS01B
3
gB AS01E
4
NaCl NaCl
El antígeno se preparó como sigue. El antígeno de vacuna se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO)como gB**, una quimera truncada conteniendo secuencias peptídicas de glicoproteína gD del virus Herpes Simplex 2 (HSV2) en su extremo N t C-terminal. La gB** está truncada en us dominio C-terminal que contiene la secuencia de unión a membrana y se segrega por lo tanto en el sobrenadante de cultivo.
Para cada grupo gB** a una concentración de 1,5 μg/dosis el antígeno se prepara en 625 μl de PBS o adyuvanteAS01B o AS01E (preparados como en el ejemplo II.2 anterior que tenía una concentración de 100 μl de inmunoestimulantes por ml o 50 μl de inmunoestimulantes por ml respectivamente). 50 μl (es decir 1/10 de una dosis humana de 0,5 ml) se inyectaron intramuscularmente. Las inyecciones se llevaron a cabo en los días 0 y 28. Las muestras de suero se recogieron 14 días después de las segundas inyecciones para ensayos ELISA y de Neutralización. Se recogieron PBL 7 días y 21 días tras las segundas inyecciones por ICS.
IX.2.5–Resultados
Valoraciones ELISA Anti–gB (figura 15).
Se observó un nivel de muy débil a indetectable de anticuerpos anti-gB en el grupo gB sin adyuvantes. Sin embargo, se observó una respuesta de anticuerpos elevada en ambos grupos adyuvantes. No hubo significancia estadística entre el grupo AS01B y el AS01E.
Comparación múltiple: Tuckey – HSD
Grupo
Casos Media Llanura AS01E AS01B
Llanura
12 2,1132 ** **
AS01E
12 3,9317 **
AS01B
12 3,9375 **
Llanuralt;AS01E = AS01B
Valoraciones neutralizantes anti-CMV (figura 16)
Se observaron valoraciones neutralizantes anti-gB significativamente más altas para los dos grupos adyuvantescomparados con el grupo llanura gB. No se observó diferencia significativa en valoraciones de anticuerposneutralizantes entre las formulaciones AS01B y AS01E.
Inmunidad mediada por células.
Debido al nivel muy bajo de respuesta observado después de reestimulación de muestras 7 tras II, no se pudo hacerdiscriminación entre grupos y no se pudo ver respuesta concluyente para estimulación de CD4 y CD8 (figura 17).Estas respuestas de bajas a indetectables se debieron probablemente a una cuestión técnica durante la preparación de muestras. Sin embargo, se pudieron ver respuestas 21 días tras la segunda inyección. Los datos de CD4 (figura 18) no muestran diferencia después de reestimulación mediante gB (5 μg/ml) o péptidos (2 μg/ml o 4 μg/ml). Unperfil de citocinas similar se ve para AS01E y AS01B. No se puede ver respuesta concluyente para estimulación de CD8 (figura 19)
Estos experimentos muestran que para otra composición antigénica y en dos organismos diferentes, un adyuvanteque tiene niveles más bajos de inmunoestimulantes es tan inmunológicamente efectivo como aquel que tiene niveles mayores.
Ejemplo de referencia X: Evaluación preclínica de vacuna RTS,S con adyuvantes
X.1-Formulación
La composición antigénica, RTS, S se produce en Saccharomyces cerevisiae y consta de dos proteínas, RTS y S,que intracelularmente y espontáneamente se ensamblan dentro de estructuras particuladas poliméricas mezcladas que se estima cada una que contiene, en promedio, 100 polipéptidos. RTS es una cadena polipeptídica híbrida de51 kDa de 424 aminoácidos que consiste en 189 aminoácidos derivada de un antígeno de superficie de esporozoitos de la cepa NF53 del parásito de la malaria P. falciparum (el antígeno CSP, aminoácidos 207 a 395), condensada al extremo aminoterminal de la proteína S del virus de la hepatitis B. S es un polipéptido de 24 kDa (de 226 aminoácidos de largo) correspondiente al antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. El sedimento de antígeno liofilizado contiene aproximadamente 50 μg (cuando se diseña para formularse en 0,5 ml con AS01B) o 25 μg(cuando se diseña para formularse en 0,5 ml con AS01E) de antígeno.
AS01B y AS01E se prepararon mezclando los diversos componentes (PBS, liposomas, MPL y QS21) en un tanque yagitando en condiciones asépticas. El producto se filtró después de forma estéril antes de cargarse en viales o jeringuillas. El adyuvante líquido se almacenó desde a +2ºC hasta a +8ºC antes de usarse para reconstituir elsedimento de antígeno liofilizado.
X.2–Experimentos con ratones
Se llevaron a cabo dos experimentos en ratones que se dirigen a comparar las respuestas inmunes específicas aRTS,S inducidas por RTS,S/AS01 B comparadas con RTS,S formulada con AS01 E. En cada experimento, seinmunizaron ratones C57Bl/6 (10 ratones/grupo) intramuscularmente tres veces dos semanas aparte con 10, 5 o 2,5μg de RTS,S formulada con adyuvantes AS01 B o AS01 E. Controles AS, dos grupos se inmunizaron bien con AS01B o bien con AS01 E solo. Las respuestas de anticuerpos específicas para HB y CS se evaluaron para cada ratón mediante ELISA 15 días después de la tercera inmunización. La media geométrica de valoraciones deanticuerpo y sus intervalos de 95% de confianza se calcularon para todos los ratones que reciben el mismo tratamiento en ambos experimentos. Los análisis estadísticos para evaluar efecto adyuvante y efectos de dosis deantígeno se llevaron a cabo en datos almacenados de ambos experimentos. Las respuestas de células T específicas CD4 y células T específicas CD8 se midieron mediante citometría de flujo 7 días después de las inmunizaciones segunda y tercera en reservas de células sanguíneas de 5 ratones por grupo. Así se generaron dos valores para cada grupo en cada experimento.
Respuesta inmunitaria humoral
Como se muestra en las figuras 20 y 21, ambos adyuvantes AS01B y AS01E inducen respuestas de anticuerpo comparables fuertes contra CSP y HB.
Una ANOVA de tres rutas en anti-CSP GMT mostró que no hubo ninguna diferencia significativa entre AS01B yAS01E para las dosis de 5 o 2,5 μg de RTS,S.
Para la dosis de 10 μg, se encontró adyuvante de AS01B para inducir valoraciones anti-CS mayores que AS01E y la proporción de GMT “grupo AS01B/grupo AS01E” fue 1,93 (Cl al 95%: 1,33–2,79; p = 0,001)
Respuesta inmunitaria específica mediada por células
Las figuras 22 y 23 muestran los niveles de células T CD4 y CD8 específicas para CSP y HB que expresan IL-2 y/o IFN gamma.
La respuesta CD4 específica para CSP tiende a ser mayor con AS01B comparada con AS01E después de tres inmunizaciones mientras que la respuesta celular de las células T CD8 con AS01E son equivalentes a o mejores quecon AS01 B.
La respuesta CD4 específica para HB tiende a ser mayor con AS01 B comparada con AS01 E después de tres inmunizaciones salvo para las dosis menores de RTS,S donde los niveles de células T CD4 son comparables entre los dos adyuvantes. Las respuestas de células T CD8 específicas de HB inducidas por RTS,S formuladas con AS01E son equivalentes a o mejores que las respuestas inducidas mediante RTS,S formuladas con AS01 B.
Estas diferencias se piensa que están dentro de la variabilidad esperada de ensayos de inmunología celular.
La evaluación preclínica de la vacuna RTS,S/AS01 E en ratones reveló un perfil de seguridad aceptable, similar aaquel de RTS,S/AS01 B.
Ejemplo de referencia XI: Evaluación clínica de RTS,S/AS01B y RTS,S/AS01E.
Las formulaciones se prepararon como en el ejemplo X anterior. Se usa sacarosa como un conservante en elsedimento de antígeno liofilizado. Como en el ejemplo X, el adyuvante líquido se usó reconstituyendo el antígeno liofilizado. Se preparó AS01 E como se describe en el ejemplo II.2 y se almacenaron desde a +2 hasta a +8ºC hasta que se necesita para reconstitución.
Un estudio puente de doble ciego aleatorio de fase II de la seguridad e inmunogenicidad de la RTS,S potenciada con adyuvante con AS01E está actualmente en proceso en niños de 18 meses de edad en Gabón. El calendario devacunación es un calendario de vacunación de 0, 1, 2 – meses. Los objetivos son como sigue para RTS,S/AS01E cuando se administró a 3 dosis intramuscularmente en un calendario de vacunación de 0, 1, 2 – meses a niños de 18 meses a 4 años de edad que viven en un área endémica de malaria:
Coprincipal
-
para evaluar seguridad hasta un mes tras la dosis 3.
-
para demostrar la no inferioridad a RTS,S/AS02D en términos de respuesta de anticuerpos anti-CS un mes tras la dosis 3.
Secundario
-
para evaluar reactogenicidad hasta un mes tras la dosis 3. -para demostrar la no inferioridad a RTS,S/AS02D en términos de respuesta de anticuerpos anti-HB un mes tras la dosis 3. -para describir seroprotección contra hepatitis B hasta un mes tras la dosis 3 5 -para describir la respuesta anti-CS hasta un mes tras la dosis 3 Terciario -seguridad entre de 1 mes tras la dosis 3 hasta 12 meses tras la dosis 3 -respuesta inmunitaria humoral a antígeno CS a 12 meses tras la dosis 3 -respuesta inmunitaria humoral a antígeno HB a 12 meses tras la dosis 3 10 Exploratorio -para evaluar respuesta inmunitaria mediada por células T a antígeno CS hasta 12 meses tras la dosis 3 -para evaluar respuesta inmunitaria de memoria de células B a antígeno CS hasta 12 meses tras la dosis 3 -para describir la respuesta anti-CS hasta un mes tras la dosis 3 de acuerdo con el estado de inmunización de HBV documentado en el rastreo. 15 Se apuntaron 180 sujetos. A 90 se les dio una vacuna potenciada con adyuvante con un aceite patentado en adyuvante de emulsión de agua (llamado “control” en las tablas más adelante) y a 90 se les dio una vacuna potenciada con adyuvante con AS01 E. Se rastrearon los niños masculinos y femeninos de 18 meses de edad acuatro años de edad. Las vacunas se administran mediante la vía intramuscular al deltoides izquierdo.
Incidencia y naturaleza de los síntomas (solicitados y no solicitados) notificados durante el periodo de 7 días 20 después de la vacunación (días 0-6) tras cada dosis y global (cohorte de vacunados totales)
Estos datos demuestran que una vacuna RTSS potenciada con adyuvante con AS01E daba resultados dereactogeneicidad aceptables en una población pediátrica cuando se comparó con una formulación control.
Las respuestas serológicas se midieron evaluando las respuestas de los anticuerpos a HB y a repeticiones de CSP(anti R32LR). El suero para la determinación de anticuerpos se recogió en la selección, los días 60 y 90 (a la
5 segunda vacunación y a la tercera vacunación). Los niveles de anticuerpos contra CS se midieron mediante ELISA estándar usando antígeno R32LS absorbido en placa con un anticuerpo de referencia estándar como control deacuerdo con los PNT del laboratorio. Los resultados se indican en UE/ml.
Los anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B se midieron usando un inmunoensayo ELISA disponible (kit de ensayo AUSAB EIA de Abbott) o equivalente de acuerdo con las instrucciones del ensayo. Los
10 resultados se indican en mUI/ml.
Índices de seropositividad y GMC para anticuerpos anti-CS (cohorte de vacunados totales)
gt;= 0,5 ELU/ml
GMC
IC del 95 %
IC del 95 %
Anticuerpo
Grupo Momento N n % LL UL valor LL UL Mín. Máx.
Anti-CS
Gr 1 SELECCIÓN 89 0 0,0 0,0 4,1 0,3 0,3 0,3 lt;0,5 lt;0,5
PII (D60)
78 78 100 95,4 100 81,9 64,9 103,2 4,6 568,6
PII (D90)
75 75 100 95,2 100 215,6 178,8 2599,9 14,3 1922,3
GR. 2
SELECCIÓN 90 1 1,1 0,0 6,0 0,3 0,2 0,3 lt;0,5 0,5
PII (D60)
78 78 100 95,4 100 56,9 45,7 70,9 3,6 2380,9
PII (D90)
80 80 100 95,5 100 164,8 134,1 202,6 6,3 2093,6
Gr, 1= RTS, S, AS01E Gr. 2= control GMC= media geométrica de la concentración de anticuerpo calculada en todos los sujetos N= número de sujetos resultados disponibles n/%= número/porcentaje de sujetos que con concentración dentro del IC del 95% especificado= intervalo deconfianza del 95 %; LL= límite inferior UL=límite superior MÍN/MÁX= Mínimo/Máximo
Índices de seropositividad y GMC para anticuerpos anti-HB (cohorte de vacunados totales)
Estos datos demuestran que una formulación de vacuna RTSS potenciada con adyuvante con AS01E daba respuestas humorales aceptables en una población pediátrica cuando se comparó con un control validado.
Ejemplo de referencia XII: Evaluación preclínica del virus de la varicela zóster con AS01B en comparación con AS01E
La vacuna candidata está compuesta por una proteína truncada de la cubierta del VZV, gE, producida en células CHO.
Para este estudio se primoinmunizaron ratones C57bu6 (n= 48) con una dosis humana (DH) de Varilrix (-4log ufp/dosis) administrada por vía subcutánea. Cinco semanas después de la primoinmunización con Varilrix, los ratones se dividieron en 5 grupos de 12 ratones a los que s inyectó por vía intramuscular (tibias) los días 0 y 28, 5 !gde gE sola, , 5 !g de gE + AS01E* (1/10 DH) o , 5 !g de gE + AS01B (1/10 DH). En el grupo control de ratones (soloprimoinmunizados) se inyectó solución salina (NaCl 0,9 %). Las respuestas inmunitarias se evaluaron a los días 14y/o 30 tras la segunda vacunación. Se evaluaron los niveles de anticuerpos totales específicos de gE y la frecuenciade las células T CD4 y CD8 productoras de citocinas (IL2/IFN).
Respuestas de anticuerpos específicos de gE:
Se realizó un ELISA detectando y cuantificando los anticuerpos específicos de gE en los sueros de los ratones usando la proteína gE como el antígeno de revestimiento. Las titulaciones de ELISA se definieron con el recíproco de la dilución del suero que produjo una medida de absorbancia (densidad óptica) igual al 50 % del valor de absorbancia máximo. Las titulaciones de ELISA se calcularon mediante análisis de regresión.
Los datos demuestran que gE AS01 E y gE AS01 B inducían niveles similares de anticuerpos específicos de gE(valores p gt; 0,05). Ambas formulaciones indujeron respuestas significativamente mayores en comparación con el antígeno gE solo (10-13 veces, valores p lt; 0,05) los días 14 y 30 después (Figura 26).
14 días después II
IC 95 % 30 días después II IC 95 %
Grupo
GMT (UE/ml) LL UL GMT (UE/ml) LL UL
gE
12067 5960 24433 3832 911 16115
gE /AS01 E
125934 95504 166059 50439 38071 66825
gE /AS01 B
131728 88112 196934 47589 36158 62635
Varilrix
34 11 105 33 10 102
Respuestas CD4 y CD8 específicas de gE
La producción de citocinas se evaluó en las células CD4 y CD8 usando una técnica de señalización de citocinas intracelulares. Las células del bazo se aislaron de cada grupo de 12 ratones a los 30 días de II y se combinaron en 4grupos de 3 bazos. Las células del bazo (1 x 106) se incubaron durante 2 horas en presencia de péptidos gE (63 péptidos) con la proteína gE completa (péptidos de 20 aa/solapamiento de 10 aa) y después se incubaron durante lanoche en presencia de brefeldina. Después, las células se tiñeron con AcMo fluorescente específico de la superficie celular de CD4/CD8 y tras la permeabilización de citocinas intracelulares IL-2 e IFN∃.
Como se muestra en las figuras 26, aunque las dos formulaciones gE AS01B como gE AS01E inducían perfilessimilares de citocinas (IL2/IFN∃), la formulación gE AS01B inducía una magnitud mayor de células productoras de citocinas CD4 y CD8 (2 veces, pgt; 0,05 para CD4, 3,6 veces, p gt; 0,05 para CD8). Debido a la inesperadamente altavariabilidad de las respuestas de células T, la potencia para detectar una diferencia significativa entre las dosis deadyuvante era muy limitada (lt; 50 5). Es importante el hecho de que la gE formulada con AS01B o AS01E inducía células T CD4 productoras de citocinas de una magnitud significativamente mayor (13,3 veces, plt; 0,05) encomparación con la gE sola. Niveles mayores de células CD8 también fueron inducidas por la gE formulada con AS01 B o AS01 E (3,8 veces, pgt; 0,05) en comparación con el antígeno gE solo.
Ejemplo XIII: Evaluación preclínica de S01B frente a AS01E en un modelo de gripe en hurones
Materiales y procedimientos
Se obtuvieron hurones hembra (Mustela putorius furo) con edad de 4-6 meses de MISAY Consultancy (Hampshire, UK). Los hurones se sensibilizaron en el día 0 con la cepa heterosubtípica H1N1 A/Estocolmo/24/90 (4 Log TCID50/ml). En el día 21, a los hurones se les inyectó por vía intramuscular una dosis humana completa (dosis devacuna de 1000 !g, 15 !g de HA/cepa, 17,5 g de HA/cepa B) de una combinación de H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panamá/2007/99 y B/Shangdong/7/97. Los hurones después se estimularon en el día 41 por vía intranasal con una cepa heterosubtípica H3N2 A/Wyoming/3/2003 (4,51 Log TCID50/ml).
Las vacunaciones el día 21 fueron con la formulación trivalente simple (“plain” en las tablas siguientes) o con la formulación potenciada con adyuvante trivalente con AS01B (“AS01B” en las tablas siguientes) o AS01E (“AS01E” en las tablas siguientes). Las formulaciones se prepararon como se indica en el ejemplo 3 anterior.
Monitorización de la temperatura corporal:
Las temperaturas individuales se monitorizaron durante el periodo de exposición y se evaluaron usando implantes de telemetría que registraron cada temperatura individual de cada animal cada 15 minutos antes y después de la exposición. Todos los implantes se comprobaron y se realizó una nueva calibración mediante DSI antes de lacolocación en la cavidad intraperitoneal. Todos los animales fueron estabulados individualmente en una sola jaula durante estas mediciones.
Las temperaturas se registraron cada15 minutos, 6 días antes de la inmunización hasta 4 días después de la inmunización, así como 3 días antes de la exposición hasta 7 días después de la exposición.
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Procedimiento de ensayo
Las titulaciones de anticuerpo antihemaglutinina frente a las tres cepas del virus de la gripe se determinaron usando la prueba de la inhibición de la hemaglutinación (HI). El principio de la prueba de la HI se basa en la capacidad de los anticuerpos antigripe específicos para inhibir la hemaglutinación de eritrocitos (RBC) de pollo por la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe. Los sueros inactivados con calor se trataron previamente con caolín y RBCde pollo eliminando los inhibidores no específicos. Tras el pretratamiento, diluciones de dos en dos de suero se incubaron con 4 unidades de hemaglutinación de cada cepa de gripe. A continuación se añadieron los eritrocitos depollo y se clasificó la inhibición de la aglutinación usando gotas para la lectura. Las titulaciones se expresaron como el recíproco de la dilución más alta de suero que inhibió por completo la hemaglutinación. Dado que la primera dilución de suero fue de 1:10, un nivel indetectable se clasificó como una titulación igual a 5.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron en las titulaciones de HI posteriores a la vacunación usando UNISTAT. El protocolo aplicado para el análisis de la varianza se puede describir brevemente del siguiente modo:
●
Transformación log de los datos
●
Prueba de Shapiro-Wilk en cada población (grupo) con el fin de verificar la normalidad de la distribución de los grupos
●
Prueba de Cochran para verificar la homogeneidad de la varianza entre las diferentes poblaciones (grupos)
●
Análisis bilateral de la varianza realizado en los grupos
●
Prueba de Tukey HSD para comparaciones múltiples
Titulación viral en lavados nasales
Todas las muestras nasales primero se filtraron en esterilidad a través de filtros Spin X (Costar) eliminando toda contaminación bacteriana. 50 μl de diluciones seriadas de diez en diez de lavados nasales se transfirieron a placas de microtitulación que contengan 50 μl de medio (10 pocillos/dilución). A continuación se añadieron 100 μl de células MDCK (2,4 x 105 células/ml) a cada pocillo y se incubaron a 35ºC durante 6-7 días. Tras 6-7 días de incubación, el medio de cultivo se elimina suavemente y se añaden 100 μl de un medio con 1/20 WST-1 y se incuban durante otras 18 horas. La intensidad del pigmento amarillo formazán producido tras la reducción de WST-1 mediante células viables es proporcional al número de células viables presente en el pocillo al final del ensayo de titulación vírica y se cuantifica midiendo la absorbancia de cada pocillo a la longitud de onda adecuada (450 nanómetros). El valor decorte se define como la DO media de las células control no infectadas, 0,3 DO (0,3 DO corresponde a una desviación estándar de +/-3 de la DO de las células control no infectadas). Una puntuación positiva se define cuando la DO es lt; del valor de corte y en contraste, una puntuación negativa se define cuando la DO es gt; del valor de corte. Las titulaciones de eliminación del virus se determinaron mediante “Reed y Muench” y se expresaron en forma deDICT50/ml.
Ensayo de linfoproliferación
Las PBMC se recolectaron mediante centrifugación en gradiente de densidad (20 min a 2500 rpm y 4 ºC) en FicollCedarlane, solución para mamíferos. Las PB,C se resuspendieron en 5 ml de medio de cultivo (RPMI/añadir a 4 ºC)y 10 % de suero normal para hurones. Los aditivos estaban compuestos por piruvato sódico 100 mM, aminoácidos no esenciales MEM, penicilina/estreptomicina, glutamina y 1000 x concentrado de ∀2-mercaptoetanol. Los PMBC recién aislados se usaron inmediatamente para los ensayos de proliferación in vitro. Las células se introdujeron en placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos a 2 a 105 células/pocillo y se cultivaron con diferentes concentraciones de antígeno (0,1 a 1 !g HA de virus entero inactivad) durante de 44 a 96 horas y después se marcaron con pulsos con 0,5 !Cl de timidina tritiada. La incorporación del radiomarcaje se estimó de 4 a 16 h después mediante espectroscopia de emisión ∀.
Resultados
Carga viral en los lavados nasales tras la exposición.
Los lavados nasales se recogieron 2 días antes de la inmunización (inmunización= día 0), 1, 2 y 7 días después dela inmunización, además de 4 días antes de la exposición (Exposición = día 42) y durante un periodo de 7 días tras la exposición.
Grupo
-2 0 +1 +2 +7 39 42 43 44 45 47 49
Simple
0,82 1,84 5,35 1,85 0,8 1,82 5,77 4,44 1,97 0,9
AS01E
0,82 2,11 5,83 1,65 0,8 1,62 4,93 4,15 2,4 0,85
AS01B
0,82 2,26 5,83 1,91 0,82 1,74 2,25 1,89 1,,350 0,9
Véanse los resultados en la figura 27. Diseminación viral tras la sensibilización. Se observó un pico de diseminación viral en todos los hurones 2 días después de la sensibilización, 7 días después
de la sensibilización solo se observó una carga viral residual en todos los grupos.
Diseminación viral tras la exposición
El pico de diseminación viral se observó 24 horas después de la exposición.
La titulación viral 3 días después de la exposición mostró titulaciones virales altas (sin protección) en los huronesinmunizados con la simple trivalente dividida.
Se observó una reducción menor de la diseminación viral en hurones inmunizados con S01E trivalente simple dividida que lo observado con la potenciada con adyuvante trivalente dividida con AS01B.
Monitorización de la temperatura:
La temperatura corporal se monitorizó desde 6 días antes de la inmunización (inmunización día = 0) hasta 4 días después, además de 3 días antes de la exposición hasta 7 días después de la exposición (exposición= día 42). Las mediciones se tomaron cada 15 minutos y se realizó la media al medio día para cada grupo, Los resultados se pueden ver en la figura 28.
Postsensibilización
La temperatura corporal monitorizada antes, durante y después de la sensibilización mostró un incremento de latemperatura en todos los grupos.
Postexposición
La interpretación de la monitorización de la temperatura corporal es difícil. Se observó un ligero incremento de latemperatura corporal tras la exposición en hurones inmunizados con la S01 E trivalente simple dividida y trivalente dividida, pero no con AS01B trivalente dividida. La puntuación siguiente se obtuvo por el número de hurones con un incremento de la temperatura corporal gt; 0,4 ºC.
Incremento en la temperatura postexposición
Trivalente simple: 5/8 (+0,4, +0,4, +0,5, +0,7, +0,8)
Trivalente AS01B 0/8
Trivalente AS01E 6/8 ((+0,4, +0,4, +0,5, +0,5, +0,9, +1,6)
Esta lectura es menos sólida que otras lecturas usadas en hurones.
Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Las muestras de suero se recogieron 4 días antes de la sensibilización, 17 días después de la sensibilización, 21 días de la inmunización y 13 días después de la exposición. Los resultados se pueden ver en las figuras 29 y 30. Para las tres cepas de vacuna se observaron titulaciones de HI significativamente estadísticamente mayores en hurones inmunizados con la trivalente dividida potenciada con adyuvante con AS01B o AS01 E en comparación con la simple trivalente dividida. No se observaron diferencias entre los dos grupos adyuvados. En comparación con otros grupos, se observaron titulaciones de HI de reacción cruzada estadísticamente significativas frente a A/New York H3N2 (cepa de exposición) tras la inmunización de los hurones con vacunas divididas trivalentes potenciadas con adyuvante con AS01 B.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición inmunógena que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvanteque comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 1 μg y 30 μg por dosis, para su uso como un medicamento humano.
  2. 2.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha composición adyuvante comprende adicionalmente un esterol, en la que la relación de saponina:esterol es de 1:1 a 1:100 p/p.
  3. 3.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicho esterol es colesterol.
  4. 4.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21.
  5. 5.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho lipopolisacárido es un derivado de lípido A.
  6. 6.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicho derivado de lípido A es 3D-MPL.
  7. 7.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la relación QS21:3D-MPLes 1:1.
  8. 8.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende QS21 presentada enforma de un liposoma y 3D-MPL en la que dicha QS21 y dicho 3D-MPL están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 5 μg y 15 μg por dosis.
  9. 9.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende QS21 presentada en forma de un liposoma y 3D-MPL en la que dicha QS21 y dicho 3D-MPL están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 7 μg y 13μg por dosis.
  10. 10.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende QS21 presentada enforma de un liposoma y 3D-MPL en la que dicha QS21 y dicho 3D-MPL están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 20 μg y 30 μg por dosis.
  11. 11.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende un antígeno de C. trachomatis en combinación con un adyuvante que comprende QS21 presentada en forma de un liposoma y 3D-MPL en la que dicha QS21 y dicho 3D-MPL están ambos presentes en la composición a un nivel de 25 μg por dosis.
  12. 12.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que elantígeno de C. trachomatis es Ct858 o un fragmento inmunógeno del mismo.
  13. 13.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que elantígeno de C. trachomatis es Ct089 o un fragmento inmunógeno del mismo.
  14. 14.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que elantígeno de C. trachomatis es Ct875 o un fragmento inmunógeno del mismo.
  15. 15.
    La composición inmunógena para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que elantígeno de C. trachomatis es PmpDpd.
    Figura 1–Preparación de MPL
    MPL® en polvo ↓ Suspensión (10 mg/ml) ↓ Tratamiento térmico ↓ Enfriamiento ↓ Microfluidización ↓ Dilución a 2 mg/ml ↓ Prefiltración en 0,65 μm ↓ Filtración en 0,2 μm ↓ Dilución a 1 mg/ml ↓ Almacenamiento a +2/+8ºC
    Figura 2–Inmunidad humoral contra diversas cepas de gripe tras inmunización de hurones con formulaciones experimentales (prueba de inhibición de hemaglutinación (GMT +/-IC95)
    Figura 3–Estudio con hurones-Valoración vírica en lavados nasales después de exposición (día 42)
    Simple trivalente MPL/QS21 trivalente
    Figura 4–Estudio con ratones-Respuesta humoral contra las tres cepas de vacuna de gripe tras inmunización de ratones con formulaciones experimentales: prueba de inhibición de hemaglutinación (GMT +/-IC95) 21 días después de la inmunización
    Figura 5–Estudio con ratones-Respuesta inmunitaria mediada por células: respuestas de células T CD4+ específicas de gripe en el día 7 tras la inmunización.
    % gripe entera en células T CD4+ específicas
    % gripe entera en células T CD4+ específicas
    triv
    triv triv
    triv
    triv
    triv
    triv
    triv
    Figura 6-CMI para CD4-Cepa combinada (todo doble)-Día 0 y Día 21
    Figura 7-GMT en días 0 y 21 para anticuerpos HI
    GMT en el día 21 GMT en el día 0
    Figura 8 Incidencia de síntomas locales y generales en seres humanos (total y relacionada con el grado 3) durante el periodo de seguimiento de 7 días
    % de síntomas reseñados (con IC 95%)
    100 90 80 70 60 50 40 30 20 10
    Síntomas generales Síntomas locales
    Flu YNG Rel. de grado 3Flu ELD
    Rel. de grado 3 AS01B
    Rel. de grado 3 AS01E
    Rel. de grado 3
    Flu YNGRel. de grado 3 Flu ELDRel. de grado 3 AS01BRel. de grado 3 AS01E Rel. de grado 3
    Grupo de vacuna
    Figura 9: respuestas humorales a VPH 16 y 18 L1.
    Figura 10: tinción de citocina intracelular-VLP16 y células T CD4+ 18
    Figura 11: producción de células B de memoria específicas después de la inmunización con formulaciones de VPH potenciadas con adyuvante.
    Figura 12: comparación preclínica de vacunas de S. pneumoniae potenciadas con adyuvante en ratones.
    Figura 13: titulaciones de ELISA Anti-gB en cobaya después de la inmunización con vacuna Gb adyuvante
    Figura 14: titulaciones neutralizantes Anti CMV en cobaya después de la inmunización con vacuna Gb adyuvante.
    Figura 15: titulaciones de ELISA Anti-gB en ratones después de la inmunización con vacuna gB adyuvante.
    Figura 16: titulaciones neutralizantes Anti CMV en ratones después de la inmunización con vacuna gB potenciada.
    Figura 17: inmunidad mediada por células-Células CD4+ y CD8+ específicas para CMV después de la reestimulación con una reserva de péptidos gB (7 días después de la segunda inmunización).
    Restimulación con péptidos de gB 2 μg/ml
    Reestimulación
    % específico de CMV en la población de CD4+
    2,0
    1,5
    1,0
    0,5
    0,0
    1,5μg gB simple
    0,00CD4+IL2+INFg+ CD4+IL2+
    CD4+INFg+
    1,5μg gB
    1,5μg gB
    Nacl
    AS01b
    AS01e
    0,02
    0,00
    0,00
    0,00
    0,02
    0,02
    0,00
    0,00
    0,07
    0,02
    0,02
    Figura 18: inmunidad mediada por células-Células CD4+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segundainmunización).
    Figura 19: inmunidad mediada por células-Células CD8+ específicas para CMV después de la re-estimulación con dos dosificaciones diferentes de una reserva de péptidos gB (21 días después de la segundainmunización).
    Figura 20: titulaciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra proteína de Circumsporozoito CSP después de la inmunización con vacuna RTS,S potenciada con adyuvante en ratones.
    Nota: los resultados se presentan como la media geométrica de titulaciones de Ab anti-CSP de grupos de ratones de dos experimentos y sus límites de confianza del 95 %.
    Figura 21: titulaciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) contra antígeno de superficie de Hepatitis B (HB) después de la inmunización con vacuna RTS,S potenciada con adyuvante en ratones.
    AS01B AS01E
    RTS,S 10μg -AS01B RTS,S 5μg -AS01BRTS,S 2,5μg -AS01B RTS,S 10μg -AS01E RTS,S 5μg -AS01ERTS,S 2,5μg -AS01E
    Figura 22: expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para CSP
    Figura 23: expresión ex vivo de IL-2 y/o IFN gamma por células T CD4 y CD8 específicas para HB.
    Figura 24: respuestas humorales en ratones después de la inmunización con vacuna contra la gripe dividida trivalente potenciada con adyuvante (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes).
    Figura 25: respuesta inmunitaria mediada por células en ratones después de inmunización con vacuna contra la gripe potenciada con adyuvante (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes).
    Figura 26: resultados preclínicos en ratones de comparación del adyuvante para vacunas VZV gE con AS01 B o AS01 E.
    Figura 27: titulaciones virales de lavados nasales tras sensibilización y exposición a antígenos del virus dela gripe (simple o potenciado con adyuvantes) en hurones.
    Figura 28: monitorización de la temperatura corporal en hurones tras sensibilización y exposición aantígenos de la gripe.
    Titulaciones H1 (GMT +/-IC95)
    Titulaciones HI (GMT +/-IC95)
    Sensibilización
    simple triv. div. AS01B triv. div. AS01E triv. div.
    exposición
    simple triv. div. AS01B triv. div. AS01E triv. div.
    Figura 29: titulaciones anti HI para las cepas A en la formulación de vacuna trivalente tras inmunización y exposición a preparaciones del antígeno de la gripe.
    Figura 30: titulaciones anti HI para las cepas B/Jiangsu y de deriva usadas para la exposición tras inmunización y exposición a preparaciones del antígeno de la gripe.
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