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CN101260149B - 链球菌抗原 - Google Patents

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CN101260149B
CN101260149B CN200710181645.XA CN200710181645A CN101260149B CN 101260149 B CN101260149 B CN 101260149B CN 200710181645 A CN200710181645 A CN 200710181645A CN 101260149 B CN101260149 B CN 101260149B
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Abstract

揭示了链球菌多肽和编码它们的多核苷酸。上述多肽可能是用于动物链球菌感染的预防或治疗的疫苗有效成份。还阐释了制造蛋白质抗原的重组方法和检测链球菌感染的诊断测定方法。

Description

链球菌抗原
本发明是申请号为01814388.1，申请日为2001年6月19日，发明名称为“链球菌抗原”专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及可能用于链球菌感染的预防、诊断或治疗的肺炎链球 菌(Streptococcuspneumoniae)病原体抗原、表位和直接针对这些表位特别是多肽抗原的抗体。
发明背景
肺炎链球菌(S.Pneumoniae)是一种在人类特别是婴儿、老年人和无免疫应答的人群中引起疾病的重要媒介。它是一种可经常从患有例如菌血症/败血症、肺炎、脑膜炎等这些在全世界有高发病率及高死亡率的侵染性疾病的患者中分离出来的细菌。即使使用适当的抗生素治疗，肺炎球菌的感染还是会造成许多人死亡。尽管抗菌药物的出现从整体上降低了肺炎球菌疾病的死亡率，但是肺炎球菌的抗药性已经成为当今世界上的主要问题。有效的肺炎球菌疫苗可以对与肺炎链球 菌相关疾病的发病率及死亡率有显著的影响。这些疫苗还有可能用于对婴儿及少儿中耳炎的预防。
开发肺炎球菌疫苗的努力一般都集中在产生针对肺炎球菌荚膜多糖的免疫应答。基于抗原的不同已经鉴定了超过80种肺炎球菌荚膜的血清型。目前可用的肺炎球菌疫苗含有23种引发疾病频率最高的荚膜多糖，但存在显著的缺陷，最主要的是有些荚膜多糖的免疫原性太低、血清型的多样性以及随着时间、地域及年龄的不同而造成血清型分布的差异。特别要指出，由于现有疫苗以及荚膜偶联疫苗在保护少儿抵御所有血清型的肺炎球菌感染方面的失败，引发了人们对肺炎链球菌其它组份的重新评价。尽管荚膜多糖的免疫原性可以改进，但是其血清型特异性仍然是基于多糖的疫苗的主要限制。利用抗原性保守的有免疫原性的肺炎球菌蛋白抗原，单独使用或与其它成份联合使用，使研发一种基于蛋白质的肺炎球菌疫苗成为可能。
1998年5月7日公开的名为“肺炎链球菌抗原和疫苗”的专利PCTWO98/18930描述了某些据称有抗原性的多肽。但是，没有关于这些多肽生物活性的报道。类似的，也没有作为一般疫苗候选株所需要的序列保守性的报道。
PCTWO00/39299描述了这些多肽和编码这些多肽的多核苷酸。PCTWO00/39299证明了命名为BVH-3和BVH-11的多肽对肺炎球菌致死性实验感染提供了保护。
因此，对可以用于预防诊断和/或治疗链球菌感染的链球菌抗原的需要还没有被满足。
发明概述
一种分离出来的多核苷酸，其包括选自下列的多核苷酸：
(a)一种多核苷酸，其编码的多肽与选自表A、B、D、E或H中的某一个多肽有至少70％的同一性；
(b)一种多核苷酸，其编码的多肽与选自表A、B、D、E或H中的某一个多肽有至少95％的同一性；
(c)一种多核苷酸，其编码的多肽含有选自表A、B、D、E或H中的氨基酸序列或片段、类似物成衍生物；
(d)一种多核苷酸，其编码选自表A、B、D、E或H中的一种多肽；
(e)一种多核苷酸，其编码的多肽能够产生抗体，该抗体与选自表A、B、D、E或H中某一序列的多肽有结合特异性；
(f)一种多核苷酸，其编码选自表A、B、D、E或H中某一多肽中的含有表位的一部分；和
(g)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多核苷酸互补的一种多核苷酸。
在其它方面还提供了本发明中的多核苷酸所编码的新的多肽、药物或疫苗组合物，含有可在表达控制区域连接本发明的多核苷酸的载体，以及上述载体转染的宿主细胞和生产多肽的方法，包含在适合于表达的条件下培养所述的宿主细胞来。
附图的简要说明
图1为SP64BVH-3基因的DNA序列；SEQIDNO：1
图2为包含完整的SP64BVH-3基因(从第1777到第4896位的核苷酸)的DNA序列；SEQIDNO：2
图3为SP64BVH-11基因的DNA序列；SEQIDNO：3
图4为包含完整的SP64BVH-11基因(从第45到第2567位的核苷酸)的DNA序列；SEQIDNO：4
图5为包含完整的SP64BVH-11-2基因(从第114到第2630位的核苷酸)的DNA序列；SEQIDNO：5
图6为多肽SP64BVH-3的氨基酸序列；SEQIDNO：6
图7为多肽SP64BVH-11的氨基酸序列；SEQIDNO：7
图8为多肽SP64BVH-11-2的氨基酸序列；SEQIDNO：8
图9为SP63BVH-3基因的DNA序列；SEQIDNO：9
图10为多肽SP63BVH-3的氨基酸序列；SEQIDNO：10
图11为多肽4D4.9的氨基酸序列；SEQIDNO：11
图12为多肽7G11.7的氨基酸序列；SEQIDNO：12
图13为多肽7G11.9的氨基酸序列；SEQIDNO：13
图14为多肽4D3.4的氨基酸序列；SEQIDNO：14
图15为多肽8E3.1的氨基酸序列；SEQIDNO：15
图16为多肽1G2.2的氨基酸序列；SEQIDNO：16
图17为多肽10C12.7的氨基酸序列；SEQIDNO：17
图18为多肽14F6.3的氨基酸序列；SEQIDNO：18
图19为多肽B12D8.2的氨基酸序列；SEQIDNO：19
图20为多肽7F4.1的氨基酸序列；SEQIDNO：20
图21为多肽10D7.5的氨基酸序列；SEQIDNO：21
图22为多肽10G9.3、10A2.2、B11B8.1的氨基酸序列；SEQIDNO：22
图23为多肽11B8.4的氨基酸序列；SEQIDNO：23
图24为单抗H11B-11B8目标表位的氨基酸序列；SEQID163
图25为BVH-3基因和编码全长及截断的多肽的基因的位置的图示。DNA片段之间的彼此相互关系已经分别标出。
图26为BVH-11基因和编码全长及截断的多肽的基因的位置的图示。DNA片段之间的彼此相互关系已经分别标出。
图27为BVH-11-2基因和编码全长及截断的多肽的基因的位置的图示。DNA片段之间的彼此相互关系已经分别标出。
图28为蛋白BVH-3和可被特定单克隆抗体识别的内部及表面表位位置的图示。
图29为蛋白BVH-11-2和可被特定单克隆抗体识别的保护性表面表位位置的图示。
图30为质粒pURV22.HIS的图谱。KanR，卡那霉素抗性编码区；cI857，λ噬菌体cI857温度敏感阻遏基因；lambdapL，λ噬菌体转录启动子；His-tag，连续6个组氨酸的编码区；终止子，T1转录中止子；ori，colE1复制起始点。
图31为使用程序ClustalW(MacVectorsequenceanalysissoftware，version6.5.3)对蛋白BVH-3M(sp64)和BVH-3(Sp63)的氨基酸序列比较的结果。在序列比较排列的下面画有一条共同的直线，用符号*和.分别表示相同的和相似的氨基酸残基。
图32为使用程序ClustalW(MacVectorsequenceanalysissoftware，version6.5.3)对蛋白BVH-3、BVH-11和BVH-11-2的氨基酸序列比较的结果。在序列比较排列的下面画有一条共同的直线，用符号*和.分别表示相同的和相似的氨基酸残基。
图33为NEW43基因的DNA序列(SEQIDNo257)。
图34为推导出的多肽NEW43的氨基酸序列(SEQIDNo258)。
本发明的详细描述
已经明确的是多肽BVH-3和BVH-11的一部分是在内部的。其它部分不存在于像能致病的有荚膜的肺炎链球菌这样重要的菌株上。如果多肽含有不在内部的部分那么将是很有利的。当多肽的大部分位于内部，这些部分是不会暴露在细菌表面的。可是，在一个重组多肽中这些部分的免疫原性会很强而同时又不会对感染提供保护。如果该多肽的一部分是存在于大多数菌中的则也将是有利的。
为了获得特异性的免疫应答，本发明关注那些不需要保留的部分已经被缺失掉并/或进行了修饰的多肽。
依照本发明，还提供了含有保护性功能域的多肽或编码这些多肽的多核苷酸。
令人惊讶的是，当多肽的不需要被保留的部分被缺失掉或修饰后，这些多肽还拥有需要的生物学功能。这令人感到惊讶是因为在专利申请书PCTWO98/18930中一些这样的部分被描述为含有表位的部分。在其它的已公开的如PCTWO00/37105中，鉴定为三组氨酸和卷曲螺旋区域的部分被称作是重要的。本发明者已经发现某些特定部分被缺失和/或修饰的多肽BVH-3和BVH-11的变体以及这些多肽的嵌合体具有生物学活性并产生了特异性免疫应答。
本发明依照一个方面，提供了一种分离出来的多核苷酸，其编码与本申请的图表中揭示出的某一序列的多肽相比有至少70％同一性的多肽。
依照本发明的某一方面，这里提供的分离出来的多核苷酸包含的多核苷酸选自：
(a)一种多核苷酸，其编码的多肽与表B、E或H中的一个多肽有至少70％的同一性；
(b)一种多核苷酸，其编码的多肽与表B、E或H中的一个多肽有至少95％的同一性；
(c)一种多核苷酸，其编码的多肽含有选自表A、B、D、E或H中的氨基酸序列或片段、类似物或衍生物；
(d)一种多核苷酸，其编码选自表A、B、D、E或H中的一种多肽；
(e)一种多核苷酸，其编码的多肽能够产生抗体，该抗体与选自表B、E或H中某一序列的多肽有结合特异性；
(f)一种多核苷酸，其编码选自表B、E或H中某一多肽中的含有表位的一部分；和
(g)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的某一多核苷酸互补的一种多核苷酸；
本发明的一个方面是提供了一种分离出来的编码与选自表A、B、D、E、G或H中的某一序列的多肽或其片段、类似物或衍生物相比有至少70％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面是提供了一种分离出来的编码与选自表A、B、D、E、G或H中的某一序列的多肽或其片段、类似物或衍生物相比有至少95％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面是涉及以表A、B、D、E、G或H中的氨基酸序列或其片段、类似物或衍生物为特征的多肽。
本发明的一个方面是提供了一种分离出来的编码与选自表A、B、D、E、G或H中的某一序列的多肽相比有至少70％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面是提供了一种分离出来的编码与选自表A、B、D、E、G或H中的某一序列的多肽相比有至少95％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面是涉及以表A、B、D、E、G或H中的氨基酸序列为特征的多肽。
本发明的一个方面是提供了一种分离出来的编码与选自表B、E或H中的某一序列的多肽或其片段、类似物或衍生物相比有至少70％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面是提供了一种分离出来的编码与选自表B、E或H中的某一序列的多肽或其片段、类似物或衍生物相比有至少95％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面是涉及以表B、E或H中的氨基酸序列或其片段、类似物或衍生物为特征的多肽。
本发明的一个方面是提供了一种分离出来的编码与选自表B、E或H中的某一序列的多肽相比有至少70％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面是提供了一种分离出来的编码与选自表B、E或H中的某一序列的多肽相比有至少95％同一性的多肽的多核苷酸。
本发明的一个方面是涉及以表B、E或H中的氨基酸序列为特征的多肽。
依照本发明，编码多肽和嵌合的多肽的所有核苷酸都在本发明的范围之内。
在进一步的实施例中，与本发明一致的多肽或嵌合的多肽是有抗原性的。
在进一步的实施例中，与本发明一致的多肽或嵌合的多肽是有免疫原性的。
在进一步的实施例中，与本发明一致的多肽或嵌合的多肽可以在个体内诱生免疫应答。
在进一步的实施例中，本发明还涉及能够刺激产生与前面提到的本发明中的多肽或嵌合的多肽有结合特异性的抗体的多肽。
在一个实施例中，表A的多肽(BVH-3)或表D的多肽(BVH-11)包含至少有一个含有表位的部分。
在进一步的实施例中，本发明中的多肽的片段将包含一个或多个在表C及F中确认的含有表位的部分。该片段将包括表C及F中的多肽中至少15个连续的氨基酸。该片段将包括表C及F中的多肽中至少20个连续的氨基酸。
在进一步的实施例中，表A中的多肽(BVH-3)的含有表位的部分至少包括表C所列出的一个多肽。
在进一步的实施例中，表B中的多肽(BVH-11)的含有表位的部分至少包括表F所列出的一个多肽。
“有结合特异性”的抗体是一种可以识别并结合选定多肽的抗体，但它不会是实质性的识别并结合同一样品(例如生物样品)中的其它分子。特异性结合可以以选定的多肽作为抗原而用ELISA方法来测定。
除非有其它不同的定义，这里使用的全部技术术语和科学术语同本发明所属领域的普通技术人员的一般理解是一样的。这里提到的所有出版物、专利申请、专利、以及其它参考文献全部列出在参考文献中。如遇有抵触的情况，以本说明及定义为准。另外，材料，方法和样品只是描述性的而不是试图进行限制。
根据本发明，生物学实验中的“保护”被定义为在存活曲线、存活率或存活周期中的显著增长。统计学分析分别使用对数秩检验来比较存活曲线，用Fisher精确概率检验来比较存活率以及到死亡所用天数，可能有助于计算P值并确定两组的差异是否是统计学显著的。P值为0.05被认为不显著。
像这里用到的，发明中多肽的“片段”、“衍生物”或“类似物”包括那些一个或多个氨基酸残基被保守的或不保守的、天然的或非天然的氨基酸残基(更适宜用保守的)所替换的多肽。在一个实施例中，发明中多肽的衍生物和类似物将同图示中的序列或其片段有70％的同一性。也就是说，70％的残基是相同的。在进一步的实施例中，多肽将有大于75％的同源性。在进一步的实施例中，多肽将有大于80％的同源性。在进一步的实施例中，多肽将有大于85％的同源性。在进一步的实施例中，多肽将有大于90％的同源性。在进一步的实施例中，多肽将有大于95％的同源性。在进一步的实施例中，多肽将有大于99％的同源性。在进一步的实施例中，发明中多肽的衍生物和类似物将有少于约20个氨基酸残基被替换、修饰或缺失并且最好是少于10个。倾向于被替换的是那些在实验中被认为是保守的也就是说被替换的残基在诸如疏水性、大小、电荷或功能团的物理或化学性质等方面作用是等同的。
技术人员将会注意到本发明中的蛋白质或多肽的类似物或衍生物在本发明的文章中也会用到，即用作抗原性/免疫原性的材料。这样，本发明包括了举例中的包含一个或多个插入、缺失、替换或类似的蛋白质或多肽。此外，还可能用另外一个相似的“类型”的氨基酸来替换某一氨基酸。例如用另外一个亲水性氨基酸来替换某一疏水性氨基酸。
研究人员可以用如CLUSTAL这样的程序来比较氨基酸序列。该程序比较氨基酸序列并通过在序列中适当的位置插入空当来找出最佳的排列。它可以计算一个最佳排列的氨基酸的同一性或相似性(同一性外加氨基酸类型的保守性)。像BLASTx这样的程序可以排列极长的相似序列并计算其匹配值。这样就能够比较许多区域的相似性，对每一个差异计算出不同的数值。在本发明中认真进行了这两种同一性分析。
在另外一种方法中，类似物或衍生物可以是融合蛋白，附加上便于进行纯化的部分，例如在尾部有效地添加一段设计好的蛋白质或多肽标签，最终可能需要去除这个“标签”或者融合蛋白本身在这种情况下保留足够的抗原性也将有用。
本发明的另外一个方面是提供了本发明中的蛋白质或多肽的具有抗原性/免疫原性的片段、或其类似物或衍生物。
本发明的片段应包括一个或多个这样的表位区域或者与其足够相似的区域以保持它们的抗原性/免疫原性。因而，依据本发明的这些片段的同一性程度可能是不相关的，因为它们可能同这里所描述的蛋白质或多肽、类似物或衍生物的某一特定部分是100％相同的。关键是，这些片段应保留抗原性/免疫原性。
因此，对于类似物、衍生物和片段来说最重要的是它们在一定程度上保留了其亲本蛋白质或多肽的抗原性/免疫原性。
依照本发明，本发明的多肽包括那些多肽及嵌合的多肽。
还包括与其它能够改变多肽的生物学或药理学活性的化合物融合的多肽，如聚乙二醇(PEG)用以延长其半衰期；引导的或分泌的氨基酸序列以便于进行纯化；以及前前导序列和前导序列和(多)糖。
此外，在那些被发现是多形态的氨基酸区域，可以寄希望于改变一个或多个特定的氨基酸以更有效地模仿不同链球菌株的不同表位。
而且，本发明的多肽可以在N末端被酰基化修饰(举例来说，如被乙酰化，或被巯基乙酸酰胺化，羧末端酰胺化，例如用氨水或甲胺)以保持稳定性，增加疏水性以用来连接或结合到支持物或其它分子上。
还仔细考虑了多肽片段、类似物和衍生物的异源和同源多肽多聚体。这些聚合物形式包括例如一个或多个通过交联剂如生物素/亲和素、戊二醛或二甲基过亚氨酸酯(dimethylsuperimidate)交联的多肽。这些聚合物形式还包括含有两个或多个串联或相邻位置颠倒的序列的多肽，它们是通过DNA重组技术从多顺反子mRNAs产生的。
优选的是，本发明的一个多肽的片段、类似物或衍生物将含有至少一个抗原性区域即至少一个表位。
为了形成抗原的聚体(即合成的多聚体)，使用的多肽要含有双卤代乙酰基团、硝基芳基卤，或类似的对巯基有特异性的反应物。因此，不同多肽间两个巯基基团的连接可能是通过单键或者连接基团来形成，该连接基团的碳原子数最少是两个，典型的是至少四个，且不会多于16个，但是通常不超过14个。
在一个特别的实施例中，本发明的多肽片段、类似物和衍生物不含有起始的甲硫氨酸(Met)残基。优选的，多肽不带有引导或分泌序列(信号肽)。本发明中多肽的信号部分取决于构建过程中使用的分子生物学技术。一般而言，感兴趣的多肽可以从链球菌培养物中分离出来后测序以确定成熟蛋白质的起始残基以及成熟多肽的序列。
本发明的另一个方面是提供了疫苗组分，它是由本发明中的一个或多个链球菌多肽与可药用的载体稀释液或佐剂混合而成。适当的佐剂包括油即弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂；盐即AlK(SO4)2，AlNa(SO4)2，AlNH4(SO4)2，硅土，高岭土，多核苷酸碳即多聚IC和多聚AU。优选的佐剂包括QuilA和Alhydrogel。本发明的疫苗的给药方式包括注射、快速灌注、经鼻吸入、经皮吸收或口腔或口服等胃肠外给药。可药用的载体还包括破伤风类毒素。
疫苗这个术语的含义还包括抗体。根据本发明，这里还提供了使用一种或多种与本发明中的多肽有结合特异性的抗体来治疗或预防链球菌感染和/或由链球菌感染介导的疾病及症状。
本发明中的疫苗组分被用于链球菌感染和/或由链球菌感染介导的疾病及症状的治疗或预防在P.R.Murray(主编)、E.J.Baron、M.A.Pfaller、F.C.Tenover及R.H.Yolken编写的ManualofClinicalMicrobiology(ASMPress，Washington，D.C.sixthedition，1995，第1482页，已列入参考文献)中有所描述。在本发明的一个实施例中，该疫苗组分被用于脑膜炎、中耳炎、菌血症或肺炎的治疗或预防。在本发明的一个实施例中，该疫苗组分被用于链球菌感染和/或由链球菌感染介导的疾病及症状的治疗或预防，特别是肺炎链球菌，A群链球菌(模式种)，B群链球菌(GBS-B组链球菌或无乳链球菌)，停乳链球菌，乳房链球菌，诺卡氏菌及金黄色葡萄球菌。更具体地说，链球菌感染是指肺炎链球菌感染。
在一个特别的实施例中，疫苗是给那些会因链球菌感染而造成危险的个体如婴儿、老人及无免疫应答的个体使用的。
本申请中使用的术语“个体”包括哺乳动物。更具体地说，哺乳动物是指人类。
疫苗组分的单位剂量优选的为0.001-100微克/千克(抗原/体重)，更优选的为0.01-10微克/千克，最优选的是以0.1-1微克/千克为单位剂量免疫1-3次，每次免疫间隔1-6周。
疫苗组分优选的单位剂量为约0.1μg-10mg，更优选的为1μg-1mg，最优选的为10-100μg免疫1-3次，每次免疫间隔1-6周。
本发明的另一方面是提供了编码以选自表A、B、D、E、G或H中的氨基酸序列为特征的多肽或其片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
本发明的另一方面是提供了编码以选自表B、E或H中的氨基酸序列为特征的多肽或其片段、类似物或衍生物的多核苷酸。
在一个实施例中，多核苷酸是指那些在表A、B、D、E、G或H中给出的编码本发明中的多肽的多核苷酸。
在一个实施例中，多核苷酸是指那些在表B、E或H中给出的编码本发明中的多肽的多核苷酸。
可以发现图中列举出的多核苷酸序列可能会因简并密码子而发生改变，但是仍然能够编码本发明的多肽。因此本发明进一步提供了与上述多核苷酸序列(或其互补序列)杂交的多核苷酸，它们的序列之间有50％的同一性。在一个实施例中，序列之间至少有70％的同一性。在一个实施例中，序列之间至少有75％的同一性。在一个实施例中，序列之间至少有80％的同一性。在一个实施例中，序列之间至少有85％的同一性。在一个实施例中，序列之间至少有90％的同一性。在进一步的实施例中，多核苷酸可以在严格条件下杂交也就是说至少有95％的同一性。在进一步的实施例中，有大于97％的同一性。
适当的严格的杂交条件对于一个熟练的技术人员来说是很容易掌握的(可以参照如Sambrool等编写的(1989)Molecularcloning：ALaboratoryManual，2nded，ColdSpringHarbor，N.Y.；CurrentProtocolsinMolecularBiology，(1999)EditedbyAusubelF.M.等，JohnWiley&Sons，Inc.，N.Y.)。
在进一步的实施例中，本发明提供了可在严格条件下与下列任一多核苷酸杂交的多核苷酸
(a)编码一个多肽的一段DNA序列或
(b)编码一个多肽的一段DNA序列的互补序列；
其中提到的多肽包含选自表A、B、D、E、G或H中的一段序列或其片段或类似物。
在进一步的实施例中，本发明提供了可在严格条件下与下列任一多核苷酸杂交的多核苷酸
(c)编码一个多肽的一段DNA序列或
(d)编码一个多肽的一段DNA序列的互补序列；
其中提到的多肽包含选自表B、E或H中的一段序列或其片段或类似物。
在进一步的实施例中，本发明提供了可在严格条件下与下列任一多核苷酸杂交的多核苷酸
(a)编码一个多肽的一段DNA序列或
(b)编码一个多肽的一段DNA序列的互补序列；
其中提到的多肽包含选自表A、B、D、E、G或H中的一段序列或其片段或类似物的至少10个连续的氨基酸残基。
在进一步的实施例中，本发明提供了可在严格条件下与下列任一多核苷酸杂交的多核苷酸
(a)编码一个多肽的一段DNA序列或
(b)编码一个多肽的一段DNA序列的互补序列；
其中提到的多肽包含选自表B、E或H中的一段序列或其片段或类似物的至少10个连续的氨基酸残基。
在进一步的实施例中，多核苷酸编码的是在本发明的表A、B、D、E、G或H中举例说明的多肽。
本领域一个熟练的技术人员很容易发现，多核苷酸包括DNA和RNA。
本发明还包括与本申请中描述的多核苷酸互补的多核苷酸。
进一步来看，编码本发明中的多肽，或其片段、类似物或衍生物的多核苷酸还可能用于DNA免疫的方法中。也就是说，它们可以被连接到一个可复制和表达的载体上直接进行注射，并在体内产生有抗原性的多肽。例如多核苷酸可以被连接到一个在CMV启动子控制下的可在真核细胞中产生功能的质粒载体上。载体优选地被进行肌肉注射。
依照另一个方面，这里提供了通过重组技术使编码上述多肽的多核苷酸在宿主细胞中表达并回收表达的多肽产物的方法。另外一个可以选择的方法是通过化学合成技术即通过液相或固相合成的方式将寡肽连接成为全长的多肽(分段连接)。
获得和评价多核苷酸和多肽的常规方法见下列参考文献：Sambrooketal，MolecularCloning：AlaboratoryManual，2nded，ColdSpringHarbor，N.Y.；1989；CurrentProtocolsinMolecularBiology，EditedbyAusubelF.M.etal，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork；PCRCloningProtocols，fromMolecularCloningtoGeneticEngineering，EditedbyWhiteB.A.，HumanaPress，Totowa，NewJersey，1997，490pages；ProteinPurification，PrinciplesandPracticesScopesR.K.，Springer-Verlag，NewYork，3rdEdition，1993，380pages；CurrentProtocolsinImmunology，EditedbyColiganJ.E.etal.，JohnWiley&SonsInc.，NewYorkwhicharehereinincorporatedbyreference.
为了用重组技术生产，先用编码多肽的载体转染宿主细胞，在调配好的适合于激活启动子的培养基中培养，挑选转化子或扩增基因。合适的载体是指那些能够在选择性宿主中存活并复制的载体，包括染色体的、非染色体的以及合成的DNA序列，例如细菌的质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、质粒和噬菌体DNA结合衍生出的载体等。利用限制性内切酶将多肽序列插入到载体上的适当的位点，连接到一个表达控制区域，它含有启动子、核糖体结合位点(共有保守区域或Shine-Dalgamo序列)及一个可随意选择的操纵子(控制元件)。操作人员可以根据确定的分子生物学规则(Sambrooketal，MolecularCloning：AlaboratoryManual，2nded，ColdSpringHarbor，N.Y.；1989；CurrentProtocolsinMolecularBiology，EditedbyAusubelF.M.etal，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYorkincorporatedhereinbyreference)挑选适合于给定的宿主及载体的表达控制区域的单个组件。适当的启动子包括但并不局限于LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac、tac或trp启动子以及λ噬菌体PL启动子。载体最好带有复制起始点及选择性标记如氨苄青霉素抗性基因。适当的细菌载体包括pET、pQE70、pQE60、pQE9、pbs、pD10phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5以及真核载体pBlueBacIII，pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG，pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL。宿主细胞可以是细菌如大肠杆菌 (E.coli)、枯草杆菌(BacillusSubtilis)、链霉菌(Streptomyces)、真菌如黑曲霉(Aspergillusniger)、构巢曲霉(Aspergillusniduline)；酵母 (Saccharomyces)或真核细胞如CHO、COS。
在培养物中多肽表达之前，常用的方法是通过离心收集细胞，然后用物理或化学手段(如果表达的多肽没有分泌到培养基中)进行破碎，获得的粗提物留待分离目的多肽。根据多肽的性质选用成熟的技术手段来纯化培养基或裂解物中的多肽，如硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。最终的纯化可以使用高效液相色谱。
表达多肽时带或不带引导或分泌序列均可。在前体的形式下引导序列可以在翻译后修饰的过程中去除(参见US4,431,739；US4,425,437以及US4,338,397收编于参考文献中)，或者在后边纯化多肽时通过化学方法来切除。
依照进一步的一个方面，本发明中的链球菌多肽还可以用于链球菌感染的诊断检测中，特别是肺炎链球菌感染。许多诊断方法都是可行的，例如检测一个生物样本中的链球菌生物体，可以按照如下步骤操作：
(a)从患者处获取一份生物样本；
(b)将可以和发明中的链球菌多肽反应的抗体或其片段与生物样本一起孵育以形成混合物；并
(c)检测混合物中特异性结合的抗体或结合的片段用以指示其中是否有链球菌存在。
另外一种方法是检测一个生物样本中是否含有能与链球菌抗原特异性结合的抗体，可以按照如下步骤操作：
(a)从患者处获取一份生物样本；
(b)将本发明中的一种或多种链球菌多肽或其片段与生物样本一起孵育以形成混合物；并
(c)检测混合物中特异性结合的抗原或结合的片段用以指示其中是否有对链球菌特异的抗体存在。
一个本领域熟练的技术人员会认识到这一诊断测试包括多种形式，包括免疫学检测例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定或乳胶凝聚实验测定，从而最终判定生物体中是否存在对多肽特异性的抗体。
编码本发明中多肽的DNA序列也可以用来设计DNA探针以用于检测被怀疑的生物样本中是否存在链球菌。该发明的检测方法包括：
(a)从患者处获取一份生物样本；
(b)将一种或多种含有编码本发明中的多肽或其片段的DNA序列的DNA探针与生物样本一起孵育以形成混合物；并
(c)检测混合物中特异性结合的DNA探针用以指示其中是否有链球菌的存在。
该发明中的DNA探针也可以用于检测循环的链球菌即样品中肺 炎链球菌的核酸，例如使用聚合酶链式反应作为诊断链球菌感染的一种方法。
探针可以通过常规的方法合成并可以固定在固定相上，或用可检测的标签进行标记。对于本申请而言一个优选的DNA探针是一个寡聚体，它含有与发明中的肺炎链球菌多肽编码序列上至少6个连续的核苷酸互补的序列。
检测病人体内链球菌的另外一个诊断方法包括：
(a)用可检测的标签标记能与本发明中的多肽或其片段相作用的抗体；
(b)将标记过的抗体或片段对患者给药；并
(c)检测患者体内特异性结合的经标记的抗体或片段以确定是否有链球菌存在。
本发明的另一个方面是用本发明中的链球菌多肽作为免疫原以产生特异性抗体，从而用于诊断特别是用来治疗链球菌感染。使用适当的筛选方法可以确定适合的抗体，例如测定实验模型中特定抗体对链球菌感染的被动保护能力。这里举例描述的动物模型是小鼠模型。抗体可能是整个抗体或其一个抗原结合片段，该抗体可能属于任意一个免疫球蛋白家族。抗体或片段可能是动物来源的，特定的哺乳动物来源以及更为特定的是鼠科动物、大鼠或是人来源的。它可以是天然抗体或其片段，或如果需要，是一个重组抗体或抗体片段。术语重组抗体或抗体片段的意思是通过分子生物学技术产生的抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可能是多克隆的，或者优选的是单克隆。它可能对多种与肺炎链球菌相关的表位是特异的，但是最好是对单一表位特异。
本发明的另一方面是使抗体直接与发明中的链球菌多肽作用以进行被动免疫(接种)。技术人员可以使用本申请中描述的抗体。使用适当的筛选方法可以确定适合的抗体，例如测定实验模型中特定抗体对链球菌感染的被动保护能力。这里举例描述的动物模型是小鼠模型。抗体可能是整个抗体或其一个抗原结合片段，该抗体可能属于任意一个免疫球蛋白家族。抗体或片段可能是动物来源的，特定的哺乳动物来源以及更加特定的鼠科动物、大鼠或是人来源的。它可以是天然抗体或其片段，或者如果需要，是一个重组抗体或抗体片段。术语重组抗体或抗体片段的意思是通过分子生物学技术产生的抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可能是多克隆的，或者最好是单克隆。它可能对许多与肺炎链球菌相关的表位是特异的，但是最好是对单一表位特异。
下面的参考表格概述了本申请中所揭示的序列：
表A、B和CBVH-3的变体及表位
表A
表B
**沉默突变，即该多肽同New1或New56是一样的。
表CBVH-3的表位
表D、E和FBVH-11的变体及表位
表D
表E
表FBVH-11的表位
表G和H嵌合体
表G
*可变的氨基酸
表H
实施例1
本实施例描述了所用的细菌菌株、质粒、PCR引物、重组蛋白质以及杂交瘤抗体。
肺炎链球菌SP64(血清群6)和SP63(血清群9)临床分离株是由Laboratoirede1aSantéPubliqueduQubec，Sainte-Anne-de-Bellevvue提供的；Rx1株，2型菌株D39和3型菌株WU2衍生的无荚膜株，由伯明翰的阿拉巴马大学的DavidE.Briles提供，3型临床分离株P4241由theCentredeRechercheenInfectiologieduCentreHospitalierdel′UniversiteLaval，Sainte-Foy提供。大肠杆菌菌株DH5α(GibcoBRL，Gaithesburg，MD)；AD494(λDE3)(Novagen，Madison，WI)和BL21(λDE3)(Novagen)还有质粒载体superlinkerpSL301(Invitrogen，SanDiego，CA)；pCMV-GH载体(德克萨斯州达拉斯市德克萨斯大学生物化学系StephenA.Johnston博士惠赠)；本研究中使用了表达载体pET32和pET21(Novagen)和pURV22.HIS(图30)。载体pURV22.HIS含有一个已经删除了PR启动子的λ噬菌体cI857温度敏感阻遏蛋白基因。当温度从30-37℃升高至37-42℃时cI857阻遏蛋白失活导致启动子λPL控制的下游基因开始诱导。用于产生重组质粒的PCR引物在5′末端有一个限制性内切酶位点，因而可以将扩增产物直接克隆到经酶切的质粒载体。使用的PCR寡核苷酸引物列在下面的表1中。图25、图26、及图27中分别概述了编码BVH-3、BVH-11和BVH-11-2基因产物的基因序列的位置。
表1.PCR寡核苷酸引物列表
按照标准方法进行分子生物学技术操作。参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，″MolecularCloning：AlaboratoryManual″Vol.1-2-3(secondedition)ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，NewYork；已列入参考文献。PCR扩增产物用限制性内切酶酶切并连接到用同样的酶酶切或用其它能产生同样粘末端的酶酶切后的线性化的质粒pSL301，pCMV-GH，pET或pURV22.HIS表达载体。重组的pSL301和pCMV-GH质粒用限制性内切酶酶切以便按正确的阅读框架克隆到pET表达载体中。使用pET载体时，克隆需要先在大肠杆菌DH5α中稳定，然后再导入到大肠杆菌BL21(λDE3)或AD494(λDE3)表达全长或截断的BVH-3、BVH-11或BVH-11-2分子。每一个构建好的质粒都经过核酸测序以确保无误。重组蛋白表达时在N末端融合了硫氧还蛋白和组氨酸标签(pET32表达系统)；C末端融合组氨酸标签(pET21表达系统)；或者在N末端融合了组氨酸标签(pURV22.HIS表达系统)。表达的重组蛋白用组氨酸结合金属螯合树脂(QIAgen，Chatsworth，CA)从经IPTG诱导(pET系统)或温度诱导(pURV22.HIS)的大肠杆菌超声破碎产物离心后的上清部分中纯化获得。肺炎链球菌SP64中的基因产物列于下面的表2中。编码BVH-3-Sp63蛋白的基因片段(SEQIDNO10的第21到840氨基酸残基)是从用一对PCR引物OCRR479-OCRR480从肺炎链球菌SP63扩增产生的片段及克隆载体pSL301产生的。重组子pSL301-BVH-3Sp63酶切后按正确阅读框架克隆到pET32载体中以表达BVH-3-Sp63分子。
表2.从肺炎链球菌SP64获取的截断的BVH-3、BVH-11、BVH-11-2和嵌合的基因产物列表
C’end：表示C未端
N’end：表示N未端
internal：表示内部
w/oss：无信号序列。根据对BVH-3、BVH-11和BVH-11-2蛋白质序列的分析推断可能存在疏水的引导序列。
Chimera*：嵌合体的编码氨基酸被表达为基因产物，额外添加了非必需的氨基酸残基，M为甲硫氨酸，K为赖氨酸，L为亮氨酸，G为甘氨酸，P为脯氨酸。
分泌单克隆抗体(Mab)的杂交瘤用免疫的小鼠脾细胞和非分泌型、HGPRT缺陷的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按照经修改的(J.Hameletal.JMedMicrobiol23：163-170，1987)的FazekasDeSt-Groth和Scheidegger(JImmunolMethods35：1-21，1980)方法融合来获得。雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver，St-Constant，Quebec，Canada)分别用从肺 炎链球菌SP64株得到的的基因产物BVH-3M(硫氧还蛋白-组氨酸标签-BVH-3M融合蛋白/pET32系统)，BVH-11M(硫氧还蛋白-组氨酸标签-BVH-11M融合蛋白/pET32系统)，BVH-11-2M(硫氧还蛋白-组氨酸标签-BVH-11-2M融合蛋白/pET32系统)，BVH-11B(硫氧还蛋白-组氨酸标签-BVH-11B融合蛋白/pET32系统)，BVH-3M(组氨酸标签-BVH-3融合蛋白/pURV22.HIS系统)或NEW1(NEW1-组氨酸标签融合蛋白/pET21系统)进行免疫产生的单克隆抗体系列H3-，H11-，H112-，H11B-，H3V-及HN1-。杂交瘤的培养液上清首先按照Hamel等(Supra)描述的程序用纯化的BVH-3，BVH-11和/或BVH-11-1重组蛋白或加热杀死的肺炎链球菌细胞悬液包被的平板作酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选。挑选出的用于下一步鉴定的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞列于下面实施例2中的表3及表4中。单克隆抗体免疫球蛋白的类及亚类通过购买商用试剂(SouthernBiotechnologyAssociates，Birmingham，AL)作ELISA来鉴定。
此外，描述了编码嵌合的多肽的嵌合基因的克隆和表达以及用这些嵌合多肽免疫后的保护效果观察。
用为了扩增嵌合基因所包含的基因片段而合成的成对的寡核苷酸引物进行PCR以扩增对应于基因3′末端的BVH-3和BVH-11基因片段。使用的引物在5′末端有一个限制性内切酶位点，因而可以直接将扩增产物按正确的阅读框架克隆到经酶切的质粒载体(表1和表2)。PCR扩增产物用限制性内切酶酶切并连接到线性化的质粒载体pET21或pSL301。构建好的质粒用核酸测序加以确认。为了按正确的阅读框架克隆第二个DNA片段并产生一个编码嵌合肺炎球菌蛋白质分子的嵌合基因，包含PCR产物的重组pSL301质粒经限制性内切酶线性化处理。为了获得DNA插入片段，将包含PCR产物的重组pSL301质粒用限制性内切酶酶切。纯化得到DNA插入片段并将这些对应于给定的嵌合基因的片段连接到pET21载体中用以产生嵌合基因。列于表2的重组嵌合多肽在C末端融合了一个组氨酸标签。表达的重组蛋白用组氨酸结合金属螯合树脂(QIAgen，Chatsworth，CA)从经IPTG诱导的大肠杆菌超声破碎产物离心后的上清部分中纯化获得。
每组8只雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver)用25微克任一个经亲和纯化的组氨酸标签融合蛋白与15-20微克QuilA佐剂混合皮下免疫两次，中间间隔3周。末次免疫后10-14天，用10E5-10E6CFU的3型肺炎链球菌菌株WU2通过静脉注射来攻击小鼠。多肽及片段可以诱生保护性的免疫应答。
表2A
实施例2
该实施例描述了使用实施例1中描述的单克隆抗体和重组的截断蛋白来鉴定含有目标表位的多肽结构域。
用截断的BVH-3，BVH-11或BVH-11-2基因产物对杂交瘤细胞作ELISA进行了检测以明确可以被单克隆抗体识别的表位特征。除了BVH-3-Sp63产自肺炎链球菌SP63株，其余的截断的基因产物均源于肺炎链球菌SP64株。作为阳性对照，每个抗体的反应活性都用全长的BVH-3，BVH-11或BVH-11-2重组蛋白来检测。在某些情况下，基因产物经SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离后转移到硝酸纤维素膜上通过Western免疫印记方法来检测单克隆抗体的反应活性。观察到的结果列在下面的表3和表4中。
图28和图29概述了推测出的表位的位置。从表3的数据中可以看出，与BVH-3作用的单克隆抗体可以分为两组：与BVH-3A-和BVH-3B作用的单克隆抗体，这其中不包括能与BVH-3A-和BVH-3B-分子都作用的单克隆抗体H11-7G11和H3V-15A10。根据有无与BVH-3C重组蛋白反应的活性可以将与BVH-3A作用的单克隆抗体分为两个亚组。BVH-3和BVH-11均享有可以被与BVH-3C蛋白作用的单抗所识别的表位。从表4中可以看出，这些BVH-3-和BVH-11-交叉反应的单抗也可以同BVH-11A和BVH-11-2M重组蛋白反应。根据它们与NEW1、NEW2和NEW3重组蛋白的反应活性可以将与BVH-3B作用的单抗分成3个亚组。一些单抗只与NEW1蛋白作用而其它的单抗则可以和NEW1和NEW2或NEW1和NEW3重组蛋白中的任一个相作用。
单抗H11-7G11和H3V-15A10可以和BVH-3中一个以上的位置的表位作用。H11-7G11和BVH-3AD，BVH-3B，BVH-3C，BVH-11A和BVH-11-2M分子的反应活性说明H11-7G11表位可能包含HXXHXH序列。该序列在BVH-3和BVH-11/BVH-11-2蛋白序列中分别重复了6次和5次。单抗H11-7G11与NEW10分子反应活性的缺乏说明表位含有HGDHXH序列。单抗与两个不重叠的BVH-3片段的反应活性说明H3V-15A10表位在BVH-3上有多个位置。
有趣的是，单抗H3-7G2，H3V-9C6和H3V-16A7不与BVH-3Sp63相作用，这样就空出了它们对应的在一个177个氨基酸的片段上的表位，该片段即肺炎链球菌BVH-3分子第244到420个氨基酸。(图31)
从表4的数据可以看出，与BVH-11-和/或BVH-11-2作用而不识别BVH-3分子的单抗可以依据它们与BVH-11A和NEW10重组蛋白的反应活性被分为3组。一些单抗只专一地与BVH-11A或NEW10中的一个作用而其它的单抗可以与BVH-11A和NEW10重组蛋白都反应。
实施例3
该实施例描述了为了绘制表位图谱而进行的BVH-3和BVH-11-2基因文库的构建。
BVH-3和BVH-11-2基因文库是用分别含有BVH-3基因序列从第1837到4909位核苷酸(SEQIDNO：2)的重组质粒pCMV-GH和含有BVH-11-2基因序列从第172到2630位核苷酸(SEQIDNO：5)的重组pSL301质粒DNA以及Novatope文库构建及筛选系统(Novagen)所构建的。含有BVH-3或BVH-11-2基因片段的重组质粒是用QIAgen试剂盒(Chatsworth，CA)纯化的并且分别用限制性内切酶BglII和XbaI进行酶切。所得到的BglII-XbaIDNA片段用QIAgen公司的QIAquickgelextraction试剂盒纯化，并且用DnaseI酶切以产生随机切断的DNA。纯化50到200bp的DNA片段，用T4DNA聚合酶来使靶DNA末端平端化，并且在3’末端添加一个dA，按照厂商建议的操作步骤(NovatopeSystem，Novagen)连接到pSCREENT载体(Novagen)。基因文库的每一个大肠杆菌克隆表达一小段从BVH-3或BVH-11-2基因衍生出来的肽，以单抗作免疫探针用标准的菌落转移方法来筛选。在菌落转移时会产生高背景的单抗是无法用于筛选菌落的。此外，在某些情况下，单抗无法检测表达表位的菌落。缺乏反应活性的原因可能是由于重组蛋白产量低或者是对包括不同的蛋白结构域的依赖于构象的表位的识别。对阳性克隆中DNA插入片段测序可以定位编码目标表位的片段。数据列于表5。由插入到重组pSCREEN-T载体的DNA所编码的肽可以纯化并用作下面实施例6中所描述的免疫原。
用单抗从BVH-3和BVH-11-2基因文库筛选出的肽的序列同对被截断的基因产物的单抗ELISA试验反应活性是一致的。像预期的那样，从H11-7G11所获得氨基酸序列包含HGDHXH序列。这些发现为定位单抗识别的表位提供了额外的证据。有趣的是，尽管单抗H112-10G9，H112-10A2和H11B-11B8能够作用于同一个多肽序列(BVH-11-2蛋白序列上从第594到679位氨基酸残基)，对应于第658到698位氨基酸残基序列的克隆用单抗H11B-11B8给单独挑选了出来。这揭示了H11B-11B8的表位在第658到679位氨基酸残基(SEQIDNO：163)之间。单抗H112-10G9，H112-10A2和H11B-11B8直接作用于在第594到679位氨基酸残基(SEQIDNO：22)上的3个很接近但不重叠的不同表位。
实施例4
该实施例描述了用重组蛋白免疫动物从而产生能够与BVH-3，BVH-11和/或BVH-11-2相作用的抗体。
用50微克或100微克纯化的BVH-3M，L-BVH-3AD，NEW1，NEW13或L-BVH-11重组蛋白同80微克QuilA佐剂(CedarlaneLaboratoratoriesLtd，Hornby，Canada)混合并在多个位置对NZW家兔(CharlesRiverLaboratories，St-Constant，QuébecCanada)进行皮下免疫。末次免疫后6到28天时用相同的抗原对家兔进行加强免疫2次，间隔3星期，每次免疫前收集血液样本。血清样品被标记为免疫前，第1次免疫后，第2次免疫后，第3次免疫后。家兔的免疫应答用重组BVH-3M(BVH-3M组氨酸标签融合蛋白/pET21系统)或BVH-11M(BVH-11M组氨酸标签融合蛋白/pET21系统)蛋白或加热灭活的肺炎 链球菌Rx-1细胞悬液进行包被作ELISA来评价。ELISA滴度被定义为在A410光吸收值比本底高0.1时血清最高稀释倍数的倒数。像在表6中列出的那样，在免疫后的所有动物身上均诱生与BVH-3和/或BVH-11表位作用的抗体。在免疫前血清中没有能与重组抗原或肺炎链球菌抗原反应的抗体存在。用重组抗原单次注射免疫后在所有家兔血清中均可检测到针对免疫的免疫应答。任意抗原二次注射免疫后的免疫应答经检测均表现为抗体滴度显著升高。有趣的是，第3次免疫后观察到与肺炎链球菌细胞反应的抗体滴度平均值高达52,000，这说明在重组大肠杆菌基因产物上确实表达了天然肺炎链球菌的表位。这些数据对将BVH-3，BVH-11和/或BVH-11-2基因产物以及由BVH-3，BVH-11和/或BVH-11-2基因产物诱生的抗体作为疫苗分别用于预防和治疗肺炎链球菌疾病的潜在可能性提供了支持。
表6家兔对BVH-3和BVH-11基因产物免疫的抗体反应
NT：未测试
Preimmune：免疫前
Post1st或Post-1st：第1次免疫后
Post2nd或Post-2nd：第2次免疫后
Post3nd或Post-3nd：第3次免疫后
实施例5
该实施例描述了BVH-3，BVH-11或BVH-11-2基因产物诱生的抗体用于对肺炎链球菌致死性实验中动物的保护。
高滴度单抗制备物是按照Brodeur等(JImmuMethods71：265-272，1984)描述的方法用分泌单抗的杂交瘤细胞对小鼠进行腹膜内接种后由腹水中获得的。血清样本采自实施例4中描述的BVH-3M免疫的家兔。家兔血清是第三次免疫后收集的，用45-50％饱和硫酸铵使腹水中的抗体沉淀。抗体制备物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解并透析。
在用约200CFU(菌落形成单位)的3型肺炎链球菌菌株WU2进行静脉注射攻击前，先用0.1ml纯化的家兔抗体或0.2ml腹水对CBA/N(xid)小鼠(NationalCancerInstitute，Frederick，MA)进行腹膜内注射。对照组使用无菌的PBS或其它无关抗体，包括从免疫前家兔血清或用无关的脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)重组蛋白抗原免疫的家兔血清中纯化的抗体。一组小鼠在使用抗BVH-3抗体前用肺炎链球菌攻击。肺炎链球菌攻击用的菌培养物样本涂布于巧克力琼脂平板以确定CFU数目及攻击剂量。之所以选用CBA/N小鼠是由于它们对肺炎链球菌感染有高度的易感性。CBA/N小鼠静脉注射WU2的LD50值估计小于10CFU。每隔24小时记录一次死亡数，共延续至少7天。
通过注射家兔抗BVH-3抗体而获得保护的小鼠的实验数据列于下面的表7中。曾注射抗BVH-3抗体的10只小鼠中有9只均在攻击实验中存活下来，而使用对照的抗体或PBS缓冲液的对照组10只均死亡。通过观察发现针对BVH-3-M分子的抗体能被动地保护即使已经被攻击的小鼠，这证明了抗BVH-3抗体的预防能力，乃至于防止由已经形成的感染导致死亡的能力。
表7对应于BVH-3-M基因的家兔抗体对肺炎球菌WU2静脉注射攻击CBA/N小鼠的保护效果
CBA/N小鼠在腹膜内注射0.1ml家兔抗体之前或之后被1000CFU肺炎链球菌WU2感染。
在另外一个实验中，先分别对CBA/N小鼠通过腹膜内注射0.1ml从免疫前及免疫后的家兔血清中制备的抗体，在4小时后用280CFU3型肺炎链球菌菌株P4241经鼻给药攻击。像表8中看到的那样，所有免疫过的小鼠均存活下来，而用免疫前血清抗体或单独用缓冲液注射的9只小鼠在感染后第6天已全部死亡。所有存活的小鼠在攻击后11天时肺炎链球菌血(细菌)培养物均为阴性。此外，用直接针对BVH-11/BVH-11-2的单抗H112-10G9或H112-10G9与H11B-7E11的混合物免疫的小鼠存活率为100％。
表8对应于BVH-3-M基因产物的家兔抗体或抗-BVH-11/BVH-11-2特异性单抗对用肺炎球菌P4241经鼻攻击CBA/N小鼠的被动免疫保护效果。
总之，表7和表8的结果清晰地表明用BVH-3基因产物对动物进行免疫如BVH-3M诱生的保护性抗体能够预防实验性的菌血症及肺炎感染。
通过对小鼠注射腹水获得的保护性数据列于下面的表9中。总体积0.2ml，成对地使用腹水可以预防实验的感染所造成的死亡。例如，H112-3A4搭配H112-10G9和H112-10G2搭配H112-10D7，这两组单抗均可对实验的感染提供完全的保护。这些数据说明针对BVH-11和/或BVH-11-2表位的抗体提供了有效的保护。单抗H112-3A4，H112-10G9，H112-10D7，H112-10A2，H112-3E8，H112-10C5，H11B-11B8，H11B-15G2，H11B-1C9，H11B-7E11，H11B-13D5和H11-10B8存在于至少一对保护性抗体中，它们被认为是有保护性的并且可以与保护性表位作用。在BVH-11-2分子上提供保护性作用的表位的定位列于表10和图29中。保护性单抗H112-3A4，H112-10G9，H112-10D7，H112-10A2，H112-3E8，H112-10C5，H11B-11B8，H11B-15G2，H11B-1C9，H11B-7E11，H11B-13D5和H11-10B8均可以与对应于BVH-11-2分子上第271到838位氨基酸残基的蛋白NEW10相作用。这12个单抗中有6个直接针对于NEW19蛋白上的表位，3个保护性单抗识别NEW14。有趣的是，单抗H112-3A4和H112-10C5作用于BVH-11-2上专有的独立表位，这些表位位于BVH-11-2羧末端第769至837氨基酸残基之间。还有，能够与肺炎球菌BVH-3，BVH-11和BVH-11-2分子共享的表位相作用的单抗H11-7G11，H11-6E7和H3-4F9无法成功地提供保护，即使将它们与保护性单抗H112-10G9或H112-11B8混合使用也不行。这些单抗识别的表位位于BVH-3，BVH-11和BVH-11-2分子的N末端，分别含有最前端的225，228和226个氨基酸残基。BVH-3，BVH-11和BVH-11-2蛋白序列的比较揭示在含有这225-228个残基的N末端部分，有大量的氨基酸是保守的，总体上看有72.8％的同一性(图32)。
纵观所有表9和表10中的数据说明，可以诱生保护性的BVH-11及BVH-11-2表位分别位于BVH-11和BVH-11-2蛋白包含第229到840和227到838位氨基酸的C末端产物中。
表9BVH-11-和/或BVH-11-2特异性单抗的被动免疫可以对实验用肺炎球菌致死性感染的小鼠提供保护
None：无单抗
在用肺炎链球菌WU2静脉注射攻击前4小时给CBA/N小鼠腹膜内注射总计0.2ml的腹水。
表10推测的BVH-11-2分子上提供保护的表位的定位
and：表示“和”。
该实施例中的所有数据表明由BVH-3，BVH-11或BVH-11-2分子诱发的抗体有可能用于肺炎链球菌疾病的预防，诊断或治疗。
实施例6
该实施例描述了使用实施例1中的单抗来对暴露在表面的肽的结构域的定位。
3型肺炎链球菌菌株WU2用含0.5％酵母抽提物(DifcoLaboratories)的ToddHewitt氏链球菌肉汤培养基(DifcoLaboratories，DetroitMI)在37℃，8％CO2条件下培养，使其OD600达到0.260(约108CFU/ml)。将肺炎链球菌菌悬液等分为1ml/份，离心收集沉淀，重悬于杂交瘤细胞培养上清中。将菌悬液于4℃孵育2小时。样品用封闭缓冲液[含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS]洗两次，加入1ml用封闭缓冲液稀释的荧光素标记的羊抗鼠IgG和IgM。室温放置60分钟，用封闭缓冲液洗两次，用含0.25％甲醛的PBS缓冲液在4℃固定18-24小时。细胞用PBS缓冲液洗一次并重悬于500微升PBS缓冲液洗中。细胞在4℃避光存放，用流式细胞仪分析(EpicsXL；BeckmanCoulter，Inc.)。每个样品分析一万个(10,000)细胞，结果以荧光百分比及荧光指数(FI)值表示。荧光百分比是荧光素标记的肺炎链球菌数除以100，FI值为用单抗上清处理过的肺炎链球菌的荧光中间值除以单纯用荧光素标记抗体或一个无关单抗对照处理的肺炎链球菌荧光值。FI值为1表示在细菌表面未检测到单抗，当至少10％的肺炎链球菌被标记时FI值会大于2，认为是阳性，说明单抗与细胞表面暴露的表位发生了作用。
下面的表11列出了用流式细胞仪检测单抗所获得的数据。
流式细胞仪分析揭示与BVH-3C和/或BVH-11A分子相作用的单抗并未结合在细胞表面。相比之下，除了单抗H3V-9C6和H3V-16A7，与NEW1，NEW2，NEW3，NEW22或NEW23这些BVH-3基因产物作用的单抗在肺炎链球菌表面均被检测到。这些数据说明BVH-3N末端的最前面的225个氨基酸残基是在内部的。单抗H3V-9C6与H3V-16A7没有结合，这说明序列中对应于肺炎链球菌SP63的BVH-3分子上所缺少的177个氨基酸的部分可能无法接触到抗体。
与BVH-11和/或BVH-11-2作用的单抗的结果揭示暴露于表面和保护性是十分相关的。通过流式细胞仪检测的与内部表位作用的所有单抗都是无保护性的，而实施例5中所描述的所有有保护性的单抗均在流式细胞仪检测时有阳性信号。尽管单抗H11-7G11的FI值为9.0，荧光百分比为81.2％，但它并没有显示出有保护性。可以用其他检测手段进一步验证该单抗及其对应的表位是否参与了抗感染的免疫。
表11流式细胞仪检测单抗在肺炎链球菌表面结合的结果
and：表示“和”。
“and”、“AND”：表示“和”。
实施例7
该实施例描述了用BVH-3和BVH-11-2的肽表位对动物的免疫。
含有编码单抗3A4-表位(SEQIDNO：24)DNA片段(SEQIDNO：5上的第2421到2626位核苷酸)的重组pSCREEN-T载体质粒(Novagen，Madison，WI)经电击转化(GenePulserIIapparatus，Bio-RadLabs，Mississauga，Canada)到大肠杆菌Tuner(λDE3)pLysS[BL21(F’ompThsdSB(rB-mB-)galdcmlacYIplysS(Cmr))](Novagen)。在该菌株中，融合蛋白的表达是由被T7RNA聚合酶(存在于λDE3噬菌体上，受控于由异丙基-β-D-硫半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子)识别的T7启动子控制的。pLysS质粒通过编码T7RNA聚合酶的天然抑制因子-T7溶菌酶来降低融合蛋白的基础表达水平。
转化子在含50mM葡萄糖、100μg/ml羧苄青霉素及34μg/ml氯霉素的LB肉汤培养基(蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠5g/l)中于37℃，250rpm振荡培养直到600nm的光吸收值为0.7。加入IPTG至终浓度1mM，25℃，250rpm继续振荡培养3小时以诱导T7基因10蛋白-组氨酸标签-3A4.1融合蛋白的过表达。取800ml诱导后的培养物离心收集沉淀并在-70℃冻存。使用基于6个组氨酸残基序列(组氨酸标签)与固定在金属螯合Ni-NTA树脂(Qiagen，Mississauga，Canada)上的二价阳离子(Ni2+)的结合的亲和色谱技术从细胞可溶性部分中纯化融合蛋白。简要地说，收集的沉淀的细胞融解后在Tris缓冲的蔗糖溶液(50mMTris，25％(w/v)蔗糖)中重悬，-70℃冻存15分钟。将细胞在2mg/ml溶菌酶条件下冰浴15分钟，之后用超声波进行破碎。裂解物在12000RPM离心30分钟，在上清中加入含有Ni电荷的Ni-NTA树脂(Qiagen)，4℃，100RPM振荡过夜。用含20mMTris，500mMNaCl，20mM咪唑pH7.9的缓冲液清洗树脂，再用含250mM咪唑的上述缓冲液将融合的3A4.1蛋白洗脱下来。在4℃对PBS透析来除去盐分及咪唑。使用BCA蛋白测定试剂盒(Perce，Rockford，IL)来测定蛋白质浓度并将浓度调整到760μg/ml。
为了验证用表位肽序列免疫是否能对疾病提供保护，每组6只雌性CBA/N(xid)小鼠(NationalCancerInstitute)每隔3周用亲和纯化的T7基因10蛋白-组氨酸标签-3A4.1融合蛋白或用QuilA佐剂加入PBS中作对照进行皮下免疫一次，共免疫3次。第3次免疫后的12到14天小鼠用肺炎链球菌WU2株静脉注射攻击或用P4241株经鼻给药攻击。肺炎链球菌攻击用的菌培养物样本涂布于巧克力琼脂平板以确定CFU数目及攻击剂量。攻击剂量约为300CFU。每天记录死亡数，共记录14天且在攻击后第14天时，处死存活的小鼠并检测其血液样本中的肺炎链球菌。由于3A4.1免疫组的小鼠感染后存活数或至死亡的天数的中值均明显大于对照的模拟-免疫组，所以认为3A4.1及其它测试的蛋白是有保护性的。
实施例8
该实施例阐明了使用BVH-3片段及其变体时对肺炎球菌的抗体应答的改善。
综合实施例2，3，6中截断的基因产物、表达表位的克隆以及活的完整的肺炎球菌与单抗反应活性的研究结果，可以描绘出暴露于表面的及内部的表位。用单抗检测到的可以与肺炎球菌有效结合的表位位于在SEQIDNO6中描述的BVH-3上第223-1039位氨基酸残基的区域。位于BVH-3的C端的半部分的保护性表位已经通过NEW1分子免疫能对受P4241菌株致死性感染的小鼠提供保护而加以验证。
基因序列的比较揭示出在一些菌株中，像SEQIDNO6中描述的BVH-3上编码第244到420位氨基酸的区域的缺失说明缺失该序列的疫苗无法对这些菌株引起的疾病提供保护(SEQIDNO：9对SEQIDNO：1)。更多的BVH-3片段或其变体的设计是为了开发一种新的通用高效的疫苗，它瞄准的是普遍存在的暴露在表面的保护性表位的免疫应答。命名为NEW1(编码SEQIDNO：6上472-1039氨基酸残基)和NEW40(编码SEQIDNO：6上408-1039氨基酸残基)的BVH-3基因片段是用设计好的一对引物从肺炎链球菌SP64株通过PCR扩增得来的。每个引物的5’末端有一个限制性内切酶位点，以便于将扩增产物按照正确的阅读框架克隆到经酶切的质粒载体。PCR扩增产物经限制性内切酶酶切并连接到经同样的酶切后线性化的表达载体质粒pET21(Novagen)。寡核苷酸引物HAMJ489(ccgaattccatatgcaaattgggcaaccgactc；NdeI)和HAMJ279(cgccaagcttcgctatgaaatcagataaattc；HindIII)用于扩增NEW40。为了表达截断的基因产物，克隆在导入大肠杆菌BL21(λDE3)之前先稳定在大肠杆菌DH5α中。NEW1和NEW40的变体是通过Stratagene公司的QuickchangeSite-DirectedMutagenesis试剂盒以及为产生适当的突变设计的寡核苷酸引物来产生突变的。重组分子C末端的6个组氨酸标签可以配合镍离子亲和色谱技术来简化蛋白的纯化。下面的表12及13分别描述了用于产生基因突变的引物序列及基因突变体产物。为了提高目标基因或基因片段的表达，使用成对的引物39，40，46，47或48进行基因突变实验可获得沉默突变，因为在表达的过程中，BVH-3基因及短一些的二级翻译起始物片段是共表达的。
*有下划线的氨基酸残基代表蛋白序列中的修饰。在NEW105，NEW106和NEW107产物中核苷酸/氨基酸残基被缺失掉了。
**沉默突变，也就是多肽与NEW1是相同的。
以7或8只像前面实施例1中描述的那样被免疫过的雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver)为一组，用于肺炎链球菌P4241毒株经鼻攻击的保护性实验。观察感染后10-14天的小鼠。表15的数据清晰地表明了NEW35分子与亲本的NEW1的保护性是等同的。有趣的是，NEW40-和NEW56免疫过的组在总数8只小鼠中分别有7和8只活下来的高存活率。类似地，在致死性感染中含有第233到1039位氨基酸的NEW25也能对8只中的7只提供保护。
表14.由BVH-3片段或其变体介导的对实验中肺炎的保护性
此外，用流式细胞仪分析免疫动物的血清抗体的结合能力结果揭示，NEW40和NEW56抗体比BVH-3M诱生的抗体对活的完整的肺炎球菌的结合更有效(表15)。
表15.流式细胞仪测量鼠血清抗体对3型肺炎链球菌菌株WU2表面的结合能力。
*nd：未进行实验
流式细胞仪检测结果以荧光指数值来表示，荧光指数是用检测血清处理过的肺炎链球菌的荧光平均值除以单纯用荧光素标记抗体处理的肺炎链球菌的背景荧光值。在这些流式细胞仪的检测中，所有的血清的稀释度均为1∶50，用BVH-3C片段或单独用QuilA佐剂免疫的小鼠血清可得到与背景相似的值。
所有的保护性实验及肺炎链球菌抗体结合数据表明用NEW1或NEW40分子及其变体的免疫应答是直接针对暴露在表面的保守的保护性表位。
实施例9
该实施例描述了一个BVH-11-2嵌合缺失体基因的克隆和表达，它编码一个在多数肺炎链球菌中均存在的对应BVH-11-2暴露在表面的保守的保护性表位的嵌合多肽。
用成对的寡核苷酸引物PCR扩增对应于4个基因区域的BVH-11-2基因片段，这4个区域是肺炎链球菌菌株Sp64的BVH-11-2基因上SEQIDNO：5中1662-1742，1806-2153，2193-2414及2484-2627的片段。
使用的引物HAMJ490-491，HAMJ492-493，HAMJ494-495，HAMJ496-HAMJ354在5’末端有一个限制性内切酶位点，以便于将扩增产物按照正确的阅读框架克隆到线性化的pET21b(+)表达载体(表16)。除用HAMJ490-491引物对之外的所有PCR扩增产物经限制性内切酶酶切后连接到线性化的质粒载体pSL301中。HAMJ490-491引物的PCR扩增产物用QIAgen(Chatsworth，CA)公司的QIAquickgelextraction试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化并连接到没有经任何限制性内切酶酶切的pGEM-T质粒载体。得到的构建产物通过核酸测序加以确认。分别含有这4个片段的重组质粒被对应于PCR引物5’末端的限制性内切酶酶切。为了按照正确的阅读框架将BVH-11-2基因中的4个不同的区域进行克隆，像上面所说的那样从琼脂糖凝胶中纯化酶切后的片段，连接到经限制性内切酶NdeI和HindIII酶切的线性化的质粒pET21b(+)。为了表达嵌合的肺炎球菌蛋白分子，克隆在导入大肠杆菌BL21(λDE3)之前先稳定在大肠杆菌DH5α中。
图33中描述了获得的NEW43基因序列(SEQIDNO257)。
图34中描述了NEW43蛋白推导出来(SEQIDNO258)的氨基酸序列。
表16.用于构建NEW43，VP43S和NEW86的PCR引物列表
表17.为构建NEW43而从肺炎链球菌SP64中获取的截断的BVH-11-2基因片段列表
表18.由NEW43基因产生的NEW86和VP43S基因的性质
命名为VP43S和NEW86，由NEW43衍生出来的分子是通过表16和18中描述的PCR引物和pET21表达质粒载体等进行PCR扩增及克隆而得来的。NEW43的变体是通过Stratagene公司的QuickchangeSite-DirectedMutagenesis试剂盒以及为适当的突变设计的寡核苷酸引物来产生的。重组分子C末端的6个组氨酸标签可以配合镍离子亲和色谱技术来简化蛋白的纯化。下面的表19及20分别描述了用于产生基因突变的引物序列及产生的NEW43基因突变体产物。
表19.用于使NEW43基因产生定点突变的PCR寡核苷酸引物对列表
表20.从肺炎链球菌SP64产生的NEW变基因产物列表
*有下划线的氨基酸残基代表蛋白序列中的修饰。在NEW88D1，NEW88D2和NEW88构建产物中核苷酸/氨基酸残基被缺失掉了。
以7或8只像前面实施例1中描述的那样被免疫过的雌性BALB/c小鼠(CharlesRiver)为一组，用于肺炎链球菌P4241毒株经鼻攻击的保护性实验。表21的数据清晰地表明了NEW19，NEW43及其变体对实验性肺炎提供了保护。
表21.由NEW19和NEW43片段或其变体介导的对实验性肺炎的保护
实施例10
该实施例描述了编码一个嵌合蛋白的基因的克隆和表达，该嵌合蛋白对应于BVH-3或其变体的C末端区域，同NEW43或其变体在C末端或N末端相融合。
嵌合基因含有按照实施例1中描述的步骤设计的一个BVH-3截断的变体基因和一个NEW43或NEW43变体的基因。这些嵌合基因编码的多肽列于表22中。简要地说，嵌合基因所包含的基因片段通过PCR扩增产生，为了按照正确的阅读框架将扩增产物克隆到酶切的载体上，PCR引物的5’末端设计了一个限制性内切酶位点(表23和表24)。PCR扩增产物经限制性内切酶酶切后与线性化的质粒载体pSL301相连接。重组质粒的结构通过核酸测序来确证。含有PCR产物的pSL301重组质粒用限制性内切酶再进行酶切以获得DNA插入片段。纯化所得的插入片段，对应于给定的嵌合基因的片段被连接到经NdeI酶切的pURV22-MdeI载体以产生嵌合基因。经热诱导大肠杆菌培养物用超声波破碎后收集上清，使用多重色谱纯化步骤从上清中纯化表达的重组蛋白。
表22.由嵌合基因编码的多肽列表，该基因含有一个BVH-3截断的变体基因和一个NEW43或NEW43变体的基因。
*嵌合体的编码氨基酸是以基因产物形式表达的，增加了额外的氨基酸残基。M是甲硫氨酸，G是甘氨酸，P是脯氨酸。
表23为产生编码表22中的多肽的嵌合基因而设计的PCR引物对列表
表24为产生编码表22中的多肽的嵌合基因而设计的PCR引物列表

Claims (33)

1.一种分离的多肽，由SEQIDNO:258的氨基酸序列组成，其中该多肽能够诱导针对肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的免疫应答。
2.一种分离的多肽，其由多肽片段组成，所述多肽片段由SEQIDNO:8的497-838位的氨基酸序列组成，其中该分离的多肽能够诱导针对肺炎链球菌的免疫应答。
3.一种分离的多肽，其由多肽片段组成，所述多肽片段由SEQIDNO:8的227-838位的氨基酸序列组成，其中该分离的多肽能够诱导针对肺炎链球菌的免疫应答。
4.一种分离的多肽，由SEQIDNO:21，SEQIDNO:22或SEQIDNO:23的氨基酸序列组成，其中该多肽能够诱导针对肺炎链球菌的免疫应答。
5.融合到糖类的权利要求1-4之一的分离的多肽。
6.融合到纯化标签部分的权利要求1-4之一的分离的多肽。
7.编码权利要求1-4之一的多肽的分离的多核苷酸。
8.权利要求7的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA或RNA。
9.与权利要求7的多核苷酸互补的分离的多核苷酸。
10.包括权利要求7的多核苷酸的表达载体，其中多核苷酸与表达控制区可操作连接。
11.用权利要求10的表达载体转染的宿主细胞。
12.权利要求11的宿主细胞，其中细胞是细菌细胞或真菌细胞。
13.权利要求11的宿主细胞，其中细胞是真核细胞。
14.一种制备权利要求1-4之一的多肽的方法，包括(a)在适合表达该多肽的条件下培养权利要求11-13之一的宿主细胞；和(b)分离该多肽。
15.权利要求14的方法，其中所述多肽是重组多肽。
16.一种疫苗组合物，包括根据权利要求1至4任一项的多肽和可药用的载体或稀释液。
17.权利要求16的疫苗组合物，还包括药物可接受的佐剂。
18.一种疫苗组合物，包括权利要求5的多肽，用于生产治疗或预防链球菌感染的药物。
19.权利要求18的疫苗组合物，还包括药物可接受的佐剂。
20.权利要求1-4之一的多肽在制备用于治疗或预防链球菌感染的药物中的应用。
21.权利要求20的应用，其中链球菌感染由肺炎链球菌导致。
22.根据权利要求20的应用，其中链球菌感染由化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)或停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)导致。
23.根据权利要求20的应用，其中链球菌感染由乳房链球菌(Streptococcusuberis)导致。
24.权利要求5的多肽在制备用于治疗或预防链球菌感染的药物中的应用。
25.根据权利要求24的应用，其中链球菌感染由肺炎链球菌导致。
26.根据权利要求24的应用，其中链球菌感染由化脓链球菌，无乳链球菌或停乳链球菌导致。
27.根据权利要求24的应用，其中链球菌感染由乳房链球菌导致。
28.由SEQIDNO:8的227-838位的氨基酸序列组成的多肽在制备用于治疗或预防人类婴儿链球菌感染的药物中的应用，其中所述多肽的单位剂量是10μg到100μg。
29.由SEQIDNO:8的497-838位的氨基酸序列组成的多肽在制备用于治疗或预防人类婴儿链球菌感染的药物中的应用，其中所述多肽的单位剂量是10μg到100μg。
30.由SEQIDNO:8的氨基酸序列组成的多肽在制备用于治疗或预防人类婴儿链球菌感染的药物中的应用，其中所述多肽的单位剂量是10μg到100μg。
31.权利要求28-30任一项的应用，其中链球菌感染是脑膜炎，中耳炎，细菌血症或肺炎。
32.权利要求31的应用，其中链球菌感染由肺炎链球菌导致。
33.根据权利要求31的应用，其中链球菌感染由化脓链球菌，无乳链球菌或停乳链球菌导致。
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