TWI820099B - 新穎皂素佐劑及其評估方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露係有關於經分離之OBI-821佐劑的六種異構物結構(OBI-821-1990-V1A、OBI-821-1990-V1B、OBI-821-1990-V2A、OBI-821-1990-V2B、OBI-821-1858-A、以及OBI-821-1858-B)及用於評估其性質的方法。本揭露的方法單獨或串聯採用親水性液相層析(HILIC)及逆相高效液相層析(RP-HPLC)，並且能夠在隨後的層析中分離OBI-821佐劑的異構物。因此，可進一步評估OBI-821佐劑的性質。
Description
本揭露揭露一種源自皂樹(Quillaja saponaria Molina)樹皮的皂素類佐劑。純化的皂素佐劑其結構類似於另一種佐劑QS-21。此外，本揭露揭露一種藉由高效液相層析評估皂素品質的方法。
皂素是一種從皂樹(Quillaja Saponaria Molina)樹皮中萃取的化合物。先前的研究表明，若干種皂素(稱為QS-7、QS-17、QS-18及QS-21)能夠顯著提高抗體濃度，這意味著其作為佐劑的醫藥應用潛力(Charlotte R.Kensil等，The Journal of Immunology，Vol.146，No.02，第431-437頁，1991)。其中，QS-21實際上已廣泛使用作為疫苗的佐劑。
鑑於上述情況，本揭露的目的是揭露皂素類佐劑的六種異構物及分離這些異構物的方法，從而可進一步評估其純度及/或品質。
本揭露的另一目的是提供來自皂素類佐劑的經分離之皂素化合物，從而可評估並實現醫藥用途。
為了達到上述目的，本揭露提供一種經分離之式(I)化合物或其醫藥上可接受的鹽，
其中，R1選自β-D-芹菜糖、β-D-木糖或氫；以及R2及R3選自氫或
。
較佳地，該經分離之化合物具有如下表所示的結構：
其中R1為芹菜糖、木糖或H；其中R2及R3獨立地為氫或該脂肪醯基。
本揭露還提供皂素組合物，其包含一種或多種前述經分離之化合物及醫藥上可接受的載體。
本揭露更提供一種用於評估皂素組合物的異構物組合物之方法，其包含：(a)將皂素組合物導入親水性液相層析(HILIC)管柱；(b)用流動相流析該親水性液相層析(HILIC)管柱，以獲得析出液；以及(c)獲得該析出液的層析圖譜；其中該流動相包含三氟乙酸水溶液及乙腈；其中在30分鐘內，該流動相中的三氟乙酸水溶液的量於18至19%(v/v)之間變化，而流動相中的乙腈的量於81至82%(v/v)之間變化；其中該%(v/v)係基於該流動相的總體積。
較佳地，該流析以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
較佳地，該流析在2至11的pH範圍內進行。
較佳地，該親水性液相層析(HILIC)管柱為醯胺管柱。
較佳地，該層析圖譜藉由紫外光檢測獲得。
本揭露還提供一種用於評估皂素組合物純度之方法，其包含：(a)將皂素組合物導入逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱；(b)用流動相流析逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱，以獲得析出液；(c)獲得該析出液的層析圖譜；其中該流動相包含三氟乙酸水溶液及三氟乙酸乙腈溶液；其中在35分鐘內，該流動相中的三氟乙酸水溶液的量於20至75%(v/v)之間變化；而該流動相中的三氟乙酸乙腈溶液的量於25至80%(v/v)之間變化；其中該%(v/v)係基於該流動相的總體積。
較佳地，該流析以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
較佳地，該流析在2至7.5的pH範圍內進行。
較佳地，該逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱是疏水性管柱。
較佳地，該疏水性管柱為C4管柱、C8管柱或C18管柱。
較佳地，該層析圖譜係藉由紫外光檢測獲得。
本揭露更提供一種用於評估皂素組合物品質之方法，其包含：(a)將皂素組合物導入親水性液相層析(HILIC)管柱；(b)用第一流動相流析該親水性液相層析管柱以收集第一析出液；(c)將一部分該第一析出液導入逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱；(d)用第二流動相流析該逆相高效液相層析管柱以收集第二析出液；及(e)獲得該第二析出液的層析圖譜；其中該第一流動相包含三氟乙酸水溶液及乙腈；其中該第二流動相包含三氟乙酸水溶液及三氟乙酸乙腈溶液。
較佳地，在30分鐘內，該第一流動相中的三氟乙酸水溶液的量從0%(v/v)變化至20%(v/v)，而該第一流動相中的乙腈的量從80%(v/v)變化至100%(v/v)；其中該%(v/v)係基於該第一流動相的總體積。
較佳地，在35分鐘內，該第二流動相中的三氟乙酸水溶液的量從20%(v/v)變化至80%(v/v)，而該第二流動相中的乙腈的量從20%(v/v)變化至80%(v/v)；其中該%(v/v)係基於該第二流動相的總體積。
較佳地，該步驟(b)中的流析係以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
較佳地，該步驟(b)中的流析係在2至11的pH範圍內進行。
較佳地，該步驟(d)中的流析係以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
較佳地，該步驟(d)中的流析係在2至7.5的pH範圍內進行。
較佳地，該親水性液相層析(HILIC)管柱為醯胺管柱。
較佳地，該逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱為疏水性管柱。
更佳地，該疏水性管柱為C4管柱、C8管柱或C18管柱。
第一圖為OBI-821親水性液相層析(HILIC)紫外光(UV)層析圖譜。
第二圖為收集自親水性液相層析(HILIC)紫外光(UV)層析圖譜的OBI-821的峰1部分(1858化合物，上圖)、峰2部分(1990-V1化合物，中圖)及峰3部分(1990-V2化合物，下圖)的負ESI MS光譜圖。
第三圖為(A)1858化合物(左圖)及1990化合物(右圖)的結構及其來自OBI-821的串聯MS碎片離子和(B)1990化合物(上圖)及1858化合物(下圖)的MS/MS光譜圖。
第四圖為收集自親水性液相層析(HILIC)紫外光(UV)層析圖譜的峰2部分(1990-V1化合物，上圖)、峰3部分(1990-V2化合物，中圖)及峰1部分(1858化合物，下圖)之高效陰離子交換層析法配合脈衝安培偵測器(HPAEC-PAD)單醣分析圖。
第五圖為OBI-821的逆相高效液相層析(RP-HPLC)層析圖譜。
OBI-821佐劑物質(AS)，一種皂素組合物，是來自皂樹(Quillaja saponaria)之源自植物的皂素複合物，且包含六種具下式(I)的異構物：
其中R1為芹菜糖、木糖或H；其中R2及R3獨立地為氫或脂肪醯基。
六種異構物列於下表1中，在本文中具有參考名稱。在六種異構物中，連接在海藻糖殘基上的代替OBI-821-1990異構物中的三醣部分之具有末端芹菜糖的OBI-821-1990-V1、具有末端木糖的OBI-821-1990-V2及具有雙醣部分的OBI-821-1858(D-木糖基-(1→4)-O)-β-D-L-鼠李糖基-(1→4))是其主要的三個組分。三種主要組分分別具有「A形式」及「B形式」位置異構物。
數字「1990」是OBI-821-1990-V1A、OBI-821-1990-V1B、OBI-821-1990-V2A及OBI-821-1990-V2B經理論上估算的分子量。同樣的，數字「1858」是OBI-821-1858-A及OBI-821-1858-B經理論上估算的分子量。
在OBI-821佐劑物質(AS)中發現總共六種異構物。這六種異構物可分為三組，OBI-821-1990-V1、OBI-821-1990-V2及OBI-821-1858。每組包含兩種可鑑定為A組及B組的位置異構物。OBI-821佐劑的命名及物理化學性質總結在表2中。
OBI-821 AS的製造過程涉及三個純化階段(階段I、階段II及階段III)。在主要原料Quil-A中發現的OBI-821的初始含量通常不超過3%。階段I純化過程可將OBI-821含量增加至約15%，其中此中間體被鑑定為純化的Quil-A(PQA)。在階段II過程中，OBI-821含量增加至約0.2g/g乾燥形式的鹽(約50%主峰M.W.1990，此為經HPLC法得到的層析純度)，其中此中間體被鑑定為粗OBI-821(Crd-821)。在階段III純化過程後，OBI-821的含量可濃縮至不低於98%，並被鑑定為OBI-821 AS。
Quil-A可從Brenntag Biosector A/S(Brenntag；Frederikssund，丹麥)商業獲得，其已被丹麥監管機構認證使用作為食品添加劑(證書號32119)。
本揭露的第一態樣涉及來自皂素類佐劑的經分離之皂素化合物。術語「經分離」是指描述皂素化合物基本上是純的。更具體地，在一具體實施例中，該經分離之皂素化合物不含雜質及其他種異構物。例如，在一具體實施例中，該經分離之皂素化合物是化合物1990-V1A，其不含化合物1990-V2A、化合物1990-V1B、化合物1990-V2B、化合物1858-A及化合物1858-B。
本揭露的第二態樣係有關一種皂素組合物，其包含一種或多種前述經分離之化合物及醫藥上可接受的載體。該皂素組合物可包含兩種或更多種前述經分離之化合物於適於展現佐劑效果的比例。醫藥上可接受的載體可以是本領域常用的任何載體。
在一較佳的具體實施例中，該皂素組合物包含佔皂素組合物總重量的75至90重量%的化合物1990混合物及10至25重量%的化合物1858混合物；其中化合物1990混合物包含化合物1990-V1A、化合物1990-V1B、化合物1990-V2A、化合物1990-V2B，或其混合物；且化合物1858混合物包含化合物1858-A、化合物1858-B或其混合物。在更佳的具體實施例中，該皂素組合物包含佔皂素組合物總重量的80-88重量%的化合物1990混合物及12-23重量%的化合物1858的混合物。
在另一較佳的具體實施例中，該皂素組合物包含佔皂素組合物總重量的約45至65重量%的化合物1990-V1A。在一具體實施例中，該皂素組合物包含佔皂素組合物總重量的約45至65重量%的化合物1990-V1A；約19.31至27.99重量%的化合物1990-V2A；約0.29至7.71重量%的化合物1990-V1B；以及約0.11
至3.11重量%的化合物1990-V2B。在另一具體實施例中，該皂素組合物包含佔皂素組合物總重量的約49.26至63.42重量%的化合物1990-V1A；約19.31至27.99重量%的化合物1990-V2A；約0.29至7.71重量%的化合物1990-V1B；以及約0.11至3.11重量%的化合物1990-V2B。
下文中提到的「評估OBI-821的異構物組成」的術語是藉由一種方法分離OBI-821，從而可分離並觀察OBI-821的三種主要組分。這對於驗證所討論的OBI-821是否包含所有三種主要成分至關重要，因為其可能是OBI-821在增強抗體或細胞中介免疫反應中的功能的一個因素。下文中提到的「評估OBI-821純度」的術語是評估所討論的OBI-821中存在的雜質含量。較佳地，在所討論的OBI-821中雜質含量小於10重量%；也就是說，OBI-821的純度超過90%。下文中提到的「評估OBI-821的品質」的術語是評估三個主要組分的存在與否及所討論的OBI-821的純度。
本揭露的第三態樣，提供一種用於藉由親水性液相層析評估皂素組合物的異構物組成之方法。該方法包含：(a)將皂素組合物導入親水性液相層析管柱；(b)用流動相流析該親水性液相層析管柱，以獲得析出液；以及(c)獲得該析出液的層析圖譜。
在一較佳的具體實施例中，該流動相係以梯度施加，該流動相中的三氟乙酸水溶液的量在30分鐘內從0%(v/v)變化至20%(v/v)，而該流動相中的乙腈的量從80%(v/v)變化至100%(v/v)；其中該%(v/v)係基於該流動相的總體積。
該流析可根據操作條件以合適的流速進行。然而，在較佳的具體實施例中，該流析以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
在一較佳具體實施例中，在進行分析之前，該管柱應由緩衝液潤濕(conditioned)。另外，在一較佳具體實施例中，在分析完成後，應以洗滌緩衝液洗滌該管柱。用於該條件的緩衝液可以是三氟乙酸水溶液、乙腈或其混合物。該洗滌緩衝液可以是乙腈、水或其混合物。較佳地，該洗滌緩衝液是具合適梯度之乙腈和水的混合物。
在一較佳具體實施例中，該層析圖譜包含三個峰，分別代表上述六種異構物的三種主要組分。實務上可透過計算三個峰的峰面積來初步確定所討論的OBI-821的純度。
本揭露的第四態樣，提供一種用於藉由逆相高效液相層析(RP-HPLC)評估皂素組合物純度之方法。該方法包含：(a)將皂素組合物導入逆相高效液相層析管柱；(b)用流動相流析該逆相高效液相層析管柱，以得到析出液；(c)獲得該析出液的層析圖譜。
在一較佳具體實施例中，該流動相以梯度施加，該流動相中的三氟乙酸水溶液的量在35分鐘內從20%(v/v)變化至80%(v/v)，而該流動相中的乙腈的量從20%(v/v)變化至80%(v/v)；其中該%(v/v)係基於該流動相的總體積。
該流析可根據操作條件以合適的流速進行。然而，在較佳具體實施例中，該流析以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
在較佳具體實施例中，該層析圖譜包含分別代表「A形式」位置異構物及「B形式」位置異構物的兩個峰。具體地，代表「A形式」位置異構物的峰將是OBI-821-1990-V1A、OBI-821-1990-V2A及OBI-821-1858-A的組合；代表「B形式」位置異構物的峰將是OBI-821-1990-V1B、OBI-821-1990-V2B及
OBI-821-1858-B的組合。在一較佳具體實施例中，可透過計算該兩個峰的峰面積來確定所討論的OBI-821的純度。
本揭露的第五態樣，提供一種用於評估皂素組合物品質之方法。該方法藉由HILIC及RP-HPLC串聯進行。以本揭露第三態樣的評估皂素組合物之異構物組成的方法處理該皂素組合物，然後將所得的組分應用於本揭露第四態樣之評估OBI-821的純度的方法。
具體地，方法包含(a)將皂素組合物導入親水性液相層析管柱；(b)用第一流動相流析該親水性液相層析管柱，以收集第一析出液；(c)將一部分該第一析出液導入逆相高效液相層析管柱；(d)用第二流動相流析該逆相高效液相層析管柱，以收集第二析出液；(e)獲得該第二析出液的層析圖譜。
較佳地，該親水性液相層析管柱、逆相高效液相層析管柱、流動相、流速等條件與前面段落中所述的相同。
在一較佳具體實施例中，在所述步驟(c)中，將代表六種異構物的三種主要組分中的任何一種的該第一析出液的餾分(fraction)導入該逆相高效液相層析管柱，因此可分離該餾分的「A形式」位置異構物及「B形式」位置異構物。
在較佳具體實施例中，在所述步驟(c)中，將分別代表六種異構物的三種主要組分的三種餾分分別導入該逆相高效液相層析管柱，因此，可分離每種三種主要組分的「A形式」位置異構物及「B形式」位置異構物。因此，可獲得三個層析圖譜，其中每個層析圖譜具有代表「A形式」位置異構物的一個峰及代表「B形式」位置異構物的一個峰。計算獲得的三個層析圖譜的兩個峰的峰面積便能夠提供所討論的OBI-821的每六種異構物的含量。
實施例
實施例1：透過HILIC分離OBI-821佐劑。
以本實驗分離OBI-821佐劑，藉此觀察六種異構物的三種主要組分。分析方法及條件總結在下表3及表4中。將1.0至2.0mg測試樣品溶於空白緩衝液(含80%(v/v)乙腈的去離子水)中以製備OBI-821溶液(500微克/毫升)。然後，將OBI-821溶液導入WATERS XBridge醯胺管柱(Waters Corporation，Part No.186004896)中。HILIC的流動相是沖滌液A及沖滌液B的混合物。沖滌液A是0.1%(v/v)之溶解在去離子水(DI水)中的三氟乙酸，而沖滌液B是乙腈。將流動相的梯度設定為表4中所示的流析程序如下。
資料處理：
1. 在214nm處處理層析圖譜。積分所有峰並記錄所有峰的滯留時間、峰面積(曲線下面積)及面積%。(注意：請避免從空白樣品積分溶劑峰)。面積%可理解為重量%(wt/wt)。
2. 相對滯留時間(RRT)的計算
RRT是峰的滯留時間與峰值1990-V1的滯留時間的比率。1990-V1的滯留時間係藉由OBI-821溶液中主峰的平均滯留時間所定義。
RRT=RT峰/RT1990-Api
3. 峰值識別
三個OBI-821組分(1858、1990-V1及1990-V2)係藉由表5中所示的相對滯留時間(RRT)來識別，如下所示：
資料分析：
1. 系統適用性測試(SST)
SST的結果係由注入OBI-821溶液獲得。計算RT的相對標準偏差(RSD%)及1990-Api的峰面積。RT和峰面積的可接受標準應小於2%。
2. 糖異構物分佈
糖異構物分佈係由峰的峰面積決定。
1858(%)=1858的峰面積/3峰的峰面積之和(1858、1990-V1及1990-V2)x100%
1990-V1(%)=1990-V1的峰面積/3峰的峰面積之和(1858、1990-V1及1990-V2)x 100%
1990-V2(%)=1990-V2的峰面積/3峰的峰面積之和(1858、1990-V1及1990-V2)x 100%
將結果平均並計算相對標準偏差(%RSD)。將最終結果表示為平均含水量±標準偏差。
如第一圖所示，OBI-821的層析圖譜分別在滯留時間的9.661分鐘(以下為峰1；OBI-821-1858)、10.113分鐘(以下為峰2；OBI-821-1990-V1)以及10.560分鐘(以下為峰3；OBI-821-1990-V2)顯示三個主峰。滯留時間為6.300分鐘時還有另一個峰，這將是HILIC的溶劑峰。
為了進一步鑑定上述三個主峰的析出液，收集上述三個OBI-821峰的餾分，並藉由負ESI MS檢測。如第二圖所示，對於OBI-821-1990-V1(峰2)及-V2(峰3)觀察到m/z 1989；對於-1858(峰1)觀察到m/z 1857。這些m/z結果分別與理論分子量1990.13192(C92H148O46)及1858.0173(C87H140O42)一致。
為了確定OBI-821異構物的結構，經由定向輸注MS/MS及MS/MS/MS分析，進一步應用ESI MS中三個峰的析出液進行結構分析。串聯MS結構資訊總結在第三(A)圖中。MS/MS光譜圖顯示於第三(B)圖，選擇圖中指定的質量峰用於MS/MS/MS分析。從串聯質譜中，顯示碎片離子與母離子之間存在相應的結構關係。
然後，進行高效陰離子交換層析法配合脈衝安培偵測器(HPAEC-PAD)單醣分析(Thermo Fisher Scientific，Dionex ICS-5000和CarboPac PA1管柱(部件號035391，4x250mm))，進一步區分這三個餾分的特質。從HILIC收集OBI-1990-V1、-V2及-1858並藉由旋轉蒸汽濃縮。濃縮的OBI-1990-V1、-V2及-1858在100℃下用4M TFA水解4小時並凍乾。冷凍乾燥後，藉由去離子水重新溶解(reconstitute)OBI-1990-V1、-V2及-1858，並藉由高效陰離子交換層析法配合脈衝安培偵測器(HPAEC-PAD)進行分析。使用200mM氫氧化鈉作為流動相A，使用DI水作為流動相B。使用100mM氫氧化鈉及500mM乙酸鈉作為流動相C。
流動相的初始組合物在流動相A為91%，流動相B為9%，持續10分鐘。然後切換至90%流動相A和10%流動相C，然後在10分鐘內線性梯度至60%流動相A和40%流動相C。然後藉由100%流動相A進行洗滌步驟20分鐘。
根據第四圖和表6所示的結果，三種析出液均含有一種海藻糖(fucose)、一種鼠李糖、一種半乳糖、一種葡萄醣醛酸及一種阿拉伯糖，但木糖和芹菜糖的數量不同。峰1部分具有2個木糖但沒有芹菜糖。峰2部分具有2個木糖和1個芹菜糖。峰3部分具有3個木糖和0個芹菜糖。因此，三種餾分分別被鑑定為OBI-821-1858異構物、OBI-821-1990-V1異構物及OBI-821-1990-V2異構物。也就是說，在該實驗中進行的HILIC分析能夠分離OBI-821的六種異構物的三種主要組分。換句話說，藉由上述HILIC分析可以清楚地觀察到OBI-821的三個主要組分。
實施例2：藉由RP-HPLC鑑定OBI-821佐劑的位置異構體
在該實驗中，藉由逆相高效液相層析(RP-HPLC)分離OBI-821以鑑定其位置異構物。如本領域所知，OBI-821具有A型位置異構物，其中醯基在海藻糖的4-羥基位置鍵結；B型位置異構物，在3-羥基位置具有醯基。RP-HPLC的條件列於下表7和表8中。簡言之，將測試樣品溶解在配方緩衝液(1.25mg/mL)中並注射到YMC-Pack C4管柱(部件號BU30S05-2546WT，5μm，4.6×250mm)中，並藉由包含在15分鐘內在水/乙腈梯度中的0.1%TFA的流動相而流析管柱。然後藉由214nm的紫外線檢測析出液。
表8 RP-HPLC的流析程序
資料處理：
1. 在214nm處處理層析圖譜。積分參數如下所示：
(a)峰寬：30
(b)門檻：50.0
(c)最低峰高：2000
(d)整合時間：6-17分鐘
2. 峰值定義
在YMC-Pack C4層析中，OBI-821由主峰和次峰組成。記錄主峰和次峰的滯留時間。次峰對上主峰的相對滯留時間(RRT)應在0.95-0.97之間。
資料分析：
1. 系統適用性
計算平均滯留時間和峰面積以及相對標準偏差(RSD)。RT和峰面積的RSD應小於2%。SST的峰值也應符合標準：美國藥典理論拖尾因子(USP tailing)：0.5-2.0
美國藥典理論塔板數(USP plate count)：≧8000
解析度：≧1.8
2. OBI-821的識別：
記錄測試樣品的峰滯留時間。試樣的滯留時間應與OBI-821參考標準的滯留時間相對應。與標準品的滯留時間差異應在2%以內。
3. 測定OBI-821的純度和雜質
純度和雜質由記錄峰面積%的峰面積分析確定如下：純度(%)=(AOBI-821/A總峰值)
單一雜質(%)=(A單一雜質峰/A總峰)
總雜質(%)=(A總雜質峰/A總峰)
AOBI-821=測試樣品的主峰和次峰的峰面積之和
A單一雜質峰=除溶劑峰外的單一雜質峰的峰面積
A總雜質峰=除溶劑峰外的每個單一雜質峰的峰面積之和
A總峰值=除溶劑峰外的所有峰的峰面積
平均每個測試樣品的純度(%)和雜質(%)的值。
結果如第五圖所示。主峰的滯留時間為9.912分鐘，次峰為9.526分鐘。主峰代表A型位置異構物，包含OBI-821-1858-A、OBI-821-1990-V1A和OBI-821-1990-V2A。次峰代表B型位置異構物，包含OBI-821-1858-B、OBI-821-1990-V1B和OBI-821-1990-V2B。在7.104分鐘處的另一個峰被確定為雜質。因此，結果證明該實驗的RP-HPLC能夠分離OBI-821的兩種形式的位置異構物，從而可以清楚地觀察其存在和含量。
另外，以主峰的滯留時間為標準，計算上述雜質峰、主峰和次峰的相對滯留時間(表9)。此外，純度約為96.72%。與獲得的結果一起，本揭露的RP-HPLC可用於確定所討論的OBI-821的純度。
表9 OBI-821層析圖譜的定量數據
實施例3：藉由HILIC和RP-HPLC的串聯組合鑑定OBI-821的六種異構物。
實施例1中描述的研究提供證據表明本揭露的HILIC分析能夠分離OBI-821異構物的三種主要組分。實施例2中的研究證實，本RP-HPLC分析可用於觀察OBI-821的位置異構物。因此，將本揭露的HILIC分析和RP-HPLC分析串聯組合是合理的，以便在HILIC分析中收集的餾分可以進一步分為每個餾分的A形式位置異構物和B形式位置異構物。隨後，可分離OBI-821的六種異構物，並可計算其含量。
在該實驗中，如上述實施例1所述，將六種佐劑物質樣品用於HILIC分析，以收集代表三種主要組分的三種餾分。然後，如前述實施例2中所公開的，將各餾分分別進行RP-HPLC分析，以分離其位置異構物。因此，在分析結束時，預計從每個OBI-821樣品中獲得六種異構物。確定每個樣品的六個峰的峰面積以計算每種異構物的含量。OBI-821 AS(佐劑物質)和OBI-821 AP(佐劑產物)的結果顯示在表10和表11中。
表11 OBI-821 AP批次的每種異構體的含量。
報告的百分比被歸一化並由HILIC和RP-HPLC的層析資料計算。藉由層析組合物，三種主要異構物OBI-821-1990-V1A、-V2A和1858-A佔OBI-821佐劑的90%以上。發現這三種主要異構物由與海藻糖殘基的4-羥基連接的脂肪醯基取代基形成。在六種異構物中，OBI-821-1990-V1A佔49%至63%，且為OBI-821佐劑的主要異構物。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語以及任何首字母縮略詞具有與本揭露領域的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。儘管用於傳遞與本文描述的那些類似或等同的資訊的任何組合物、方法、套組和手段可用於實施本揭露，但本文描述了用於傳遞資訊的較佳組合物、方法、套組和手段。
本文引用的所有參考文獻在法律允許的最大範圍內藉由引用併入本文。對這些參考文獻的討論僅僅是為了總結其作者所作的斷言。不承認任何參考(或任何參考文獻的一部分)是相關的現有技術。申請人保留質疑任何引用參考文獻的準確性和針對性的權利。
Claims (14)
- 一種皂素組合物，其包含基於該皂素組合物的總重量的：45至65重量%的該化合物1990-V1A；19.31至27.99重量%的該化合物1990-V2A；0.29至7.71重量%的該化合物1990-V1B；0.11至3.11重量%的該化合物1990-V2B；11.94至21.25重量%的該化合物1858-A；以及0.06至2.44重量%的該化合物1858-B，其中該化合物1990-V1A、化合物1990-V1B、化合物1990-V2A、化合物1990-V2B、化合物1858-A、化合物1858-B分別具有下式：
，且R3為H；化合物1990-V1B：R1為β-D-芹菜糖，R2為H，且R3為
，且R3為H；化合物1990-V2B：R1為β-D-木糖，R2為H，且R3為
，且R3為H；以及化合物1858-B：R1為H，R2為H且R3為
- 如請求項1之皂素組合物，其進一步包含醫藥上可接受的載體。
- 一種用於評估皂素組合物的異構物組成之方法，其包含： (a)將該皂素組合物導入一親水性液相層析(HILIC)管柱；(b)用一流動相流析該親水性液相層析(HILIC)管柱，以獲得一析出液；以及(c)獲得該析出液的層析圖譜；其中該流動相包含三氟乙酸水溶液及乙腈；其中該親水性液相層析(HILIC)管柱為醯胺管柱。
- 如請求項3之方法，其中該流析以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
- 如請求項3之方法，其中該層析圖譜係藉由紫外光檢測獲得。
- 如請求項3之方法，其中該皂素組合物為請求項1或2之皂素組合物。
- 一種用於評估皂素組合物純度之方法，其包含：(a)將如請求項1之皂素組合物導入一逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱；(b)用一流動相流析該逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱，以獲得一析出液；以及(c)獲得該析出液的層析圖譜；其中該流動相包含三氟乙酸水溶液及三氟乙酸乙腈溶液；其中該逆相高效液相層析(RP-HPLC)管柱為一疏水性管柱。
- 如請求項7之方法，其中該流析以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
- 如請求項7之方法，其中該疏水性管柱為C4管柱、C8管柱或C18管柱。
- 如請求項7之方法，其中該層析圖譜係藉由紫外光檢測獲得。
- 一種用於評估皂素組合物品質之方法，其包含：(a)將該皂素組合物溶液導入一親水性液相層析管柱；(b)用一第一流動相流析該親水性液相層析管柱以收集一第一析出液；(c)將該第一析出液的一餾分(fraction)導入一逆相高效液相層析管柱；(d)用一第二流動相流析該逆相高效液相層析管柱以收集一第二析出液；以及(e)獲得該第二析出液的層析圖譜；其中該第一流動相包含三氟乙酸水溶液及乙腈；其中該第二流動相包含三氟乙酸水溶液及三氟乙酸乙腈溶液；其中該親水性液相層析管柱為醯胺管柱；其中該逆相高效液相層析管柱為一疏水性管柱。
- 如請求項11之方法，其中該步驟(b)中的該流析以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
- 如請求項11之方法，其中該步驟(d)中的該流析以0.1至10mL/分鐘的流速進行。
- 如請求項11之方法，其中該疏水性管柱為C4管柱、C8管柱或C18管柱。
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