ES2318016T3 - Metodo y materiales para la produccion de productos organicos en celulas de especies de candida. - Google Patents

Abstract

Una construcción de ácido nucleico recombinante que contiene un ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína lactato deshidrogenasa, en la que la proteína lactato deshidrogenasa está unida operativamente a un promotor funcional en una célula de levadura de una especie del género Candida, y en la que el plásmido no es un plásmido seleccionado de entre pMI205, pMI227, pMI246 o pMI247 según se muestra en las Figs. 24 y 25, y en la que la proteína lactato deshidrogenasa no es endógena para la célula de Candida.

Description

Métodos y materiales para la producción de productos orgánicos en células de especies de Candida.

Antecedentes de la invención

La utilización de microorganismos para sintetizar productos orgánicos con importancia industrial es bien conocida. Los procedimientos biosintéticos para producir productos orgánicos pueden ser extremadamente eficaces cuando se comparan con la síntesis química a gran escala. Las ventajas que un procedimientos biosintético puede tener sobre un procedimiento de síntesis química para producir un producto orgánico incluyen un rendimiento de producto más rápido y más eficaz, pureza isomérica y coste reducido (ver Thomas y col., 2002, Trends Biotechnol. 20: 238-42).

El ácido láctico tiene una amplia aplicabilidad industrial, incluyendo utilizaciones en procesamiento químico y síntesis química, en cosméticos, en productos farmacéuticos, en plásticos y en la producción de alimentos. El ácido láctico es una molécula orgánica relativamente sencilla y puede ser producido mediante síntesis química o mediante fermentación en microorganismos (biosíntesis). Como la manipulación genética de los microorganismos está cada vez más avanzada, los procesos de fermentación para la producción de ácido láctico se han convertido en preferidos, desde el punto de vista comercial, con respecto a la síntesis química. Una razón de esta preferencia es que la utilización de microorganismos modificados genéticamente permite la producción de un producto ópticamente puro (esto es, el isómero L(+) o D(-)). Tales métodos obvian la necesidad de separar las mezclas de productos racémicos, reduciendo de este modo el coste.

No obstante, la utilización de microorganismos para producir productos orgánicos tiene ciertas limitaciones. Por ejemplo, las bacterias pueden producir grandes cantidades de productos orgánicos bajo condiciones de fermentación, pero la acumulación de productos orgánicos en la propia bacteria y en el medio de crecimiento puede inhibir la proliferación de la bacterias o producir la muerte celular. Incluso cuando se han generado organismos más robustos y se han utilizado para la producción, tales como la levadura acidófila Saccharomyces cerevisiae, los productos orgánicos pueden dar lugar a la supresión del crecimiento celular, reduciendo el rendimiento total de producto orgánico. Por tanto, permanece la necesidad en la técnica de microorganismos robustos que sean susceptibles de manipulación genética, para su utilización en biorreactores y con otros métodos biosintéticos con el fin de producir productos orgánicos industrialmente importantes.

WO 0242471 describe células de levadura recombinantes que contienen vectores de expresión recombinantes que codifican genes heterólogos de la lactato deshidrogenasa, para producir lactato y constituye la técnica anterior bajo el Artículo 54(3) del EPC.

Waldvogel, S. y col., Biol. Chem. Hoppe Seyler, Vol. 368, nº 10, Octubre de 1987, páginas 1391-1399, describen la estructura y la función de L-lactato deshidrogenasas procedentes de bacterias termófilas y mesófilas.

Resumen de la invención

Esta invención proporciona métodos y reactivos, particularmente células y células recombinantes, para la producción de ácido láctico mediante biosíntesis. La invención proporciona específicamente construcciones de ácido nucleico recombinante que codifican lactato deshidrogenasa útiles para la síntesis de este producto orgánico, células que contienen dichas construcciones, particularmente células negativas para Crabtree que son células de Candida, métodos para la producción de tales células, métodos para el cultivo de tales células y métodos y reactivos para la síntesis in vivo de numerosos productos orgánicos.

La invención está reflejada en las realizaciones siguientes:

1. Una construcción de ácido nucleico recombinante que contiene un ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína lactato deshidrogenasa, en la que la proteína lactato deshidrogenasa está unida operativamente a un promotor funcional en una célula de levadura procedente de una especie del género Candida, y en la que el plásmido no es un plásmido seleccionado de pMI205, pMI227, pMI246 o pMI247, según se muestra en las Figs. 24 y 25, y en la que la proteína lactato deshidrogenasa no es endógena para la célula de Candida.

2. Una célula modificada genéticamente del género Candida, que contiene al menos un gen no endógeno que codifica una proteína lactato deshidrogenasa, con la condición de que la célula no sea una C. sonorensis transformada con

a)

el plásmido pMI246 cortado con BstBI;

b)

el plásmido pMI246 cortado con ApaI-BamHI;

c)

el plásmido pMI247 cortado con BstBI;

d)

el plásmido pMI247 cortado con ApaI-BamHI;

en la que los plásmidos pMI246 y pMI247 están descritos en la Figura 25, y donde la célula expresa el gen no endógeno de la proteína lactato deshidrogenasa.

Preferiblemente, la célula expresa actividad piruvato descarboxilasa (PDC) reducida.

3. Un método para la producción de ácido láctico que comprende las etapas de

a)

el cultivo de una célula según el punto 2 bajo condiciones que permitan a la célula proliferar; y

b)

la fermentación del cultivo celular en un medio nutricio que contiene un azúcar, bajo condiciones en las cuales se incrementa la cantidad de azúcar convertido por la célula en ácido láctico, con relación a la cantidad de azúcar convertido en ácido láctico por una célula de Candida no transformada,

donde el método no es el método de cualquiera de las Figuras 26 (A) a (G).

4. Un método para reducir la actividad piruvato descarboxilasa en una célula según el apartado 2 mediante la eliminación o la alteración del gen que codifica la piruvato descarboxilasa 1 (pdc1), del gen que codifica la piruvato descarboxilasa 2 (pdc2) o de ambos, pdc1 y pdc2, comprendiendo dicho método la transformación de la célula con una construcción de ácido nucleico recombinante que contiene un gen seleccionable flanqueado por secuencias flanqueantes 3' y 5' procedentes de pdc1, de pdc2 o de ambos, pdc1 y pdc2.

5. Utilización del método del apartado 4 para producir plásticos a partir de ácido láctico.

En un aspecto, la descripción proporciona construcciones de ácido nucleico recombinante que contienen una secuencia que codifica al menos una proteína útil para la síntesis de ácido láctico, donde la construcción de ácido nucleico recombinante codifica lactato deshidrogenasa. En una realización de este aspecto, la construcción de ácido nucleico recombinante contiene un promotor unido operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína útil para la síntesis de un producto orgánico, donde el promotor es un promotor de una especie de Candida, preferiblemente de la especie de Candida que contiene la construcción de ácido nucleico recombinante.

En otro aspecto, la descripción proporciona una célula del género Candida transformada negativa para Crabtree, que contiene la construcción de ácido nucleico recombinante que codifica al menos una proteína útil para síntesis de ácido láctico, donde la construcción de ácido nucleico recombinante codifica lactato deshidrogenasa. En una realización de este aspecto, la construcción de ácido nucleico recombinante contiene un promotor unido operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína útil para la síntesis de un producto orgánico, donde el promotor es un promotor de una especie de Candida, preferiblemente de la especie de Candida que contiene la construcción de ácido nucleico recombinante. En otro aspecto, la descripción proporciona una célula de una especie de Candida manipulada genéticamente con el fin de que tenga una eficacia reducida para metabolizar piruvato a etanol. En las realizaciones preferidas, la célula contiene además una construcción de ácido nucleico recombinante de la invención que codifica al menos una proteína útil para la síntesis de un producto orgánico, donde la construcción de ácido nucleico recombinante codifica lactato deshidrogenasa. En una realización de este aspecto, la construcción de ácido nucleico recombinante contiene un promotor unido operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína útil para la síntesis de un producto orgánico, donde el promotor es un promotor de una especie de Candida, preferiblemente de la especie de Candida que contiene la construcción de ácido nucleico recombinante.

En otro aspecto, la descripción proporciona métodos para la producción de ácido láctico que comprenden la fermentación de una célula del género Candida negativa para Crabtree que contiene una construcción de ácido nucleico recombinante de la invención bajo condiciones que permitan la biosíntesis de dichos productos orgánicos. En este aspecto, el producto orgánico es ácido láctico. La construcción de ácido nucleico recombinante codifica lactato deshidrogenasa. En este aspecto, la construcción de ácido nucleico recombinante contiene un promotor unido operativamente al ácido nucleico que codifica una proteína útil para la síntesis de un producto orgánico, donde el promotor es un promotor de una especie de Candida, preferiblemente de la especie de Candida que contiene la construcción de ácido nucleico recombinante.

Es una ventaja el que las células transformadas proporcionadas en la presente tengan el fenotipo "Crabtree negativo". Los organismos negativos para Crabtree se caracterizan por la capacidad para ser inducidos a un estado fermentativo incrementado. Organismos existentes en la naturaleza y organismos modificados genéticamente pueden ser caracterizados como negativos para Crabtree. Se define el efecto Crabtree como la inhibición del consumo de oxígeno en un microorganismo cuando el microorganismo es cultivado bajo condiciones aeróbicas en presencia de una elevada concentración de glucosa (por ejemplo, glucosa >5 mM). Los organismos positivos para Crabtree continúan fermentando (en lugar de respirar) independientemente de la disponibilidad de oxígeno en presencia de glucosa, mientras que los organismo negativos para Crabtree no presentan la inhibición del consumo de oxígeno mediada por glucosa. Esta característica es útil para la síntesis de productos orgánicos, ya que permite que las células sean cultivadas a concentraciones elevadas de sustrato pero que conserven los efectos energéticos beneficiosos de la fosforilación oxidativa. Muchas levaduras y hongos tienen el fenotipo negativo para Crabtree, incluyendo los ejemplos no limitantes de los géneros Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Torulopsis, Yamadazyma y
Candida.

Las especies de Candida, que son caracterizadas en la técnica, según los casos, como levaduras y hongos dimórficos, pueden presentar el fenotipo negativo para Crabtree (Franzblau y Sinclair, 1983, Mycopathologia 82: 185-190). Ciertas especies pueden fermentar la glucosa, así como fuentes de carbono alternativas, pueden crecer a temperaturas elevadas (esto es, superiores a 37ºC) y pueden tolerar el estrés de un pH bajo. Las especies de Candida tienen varias de las características deseables para que un organismo sea utilizado en métodos biosintéticos para la producción de productos orgánicos: susceptibilidad a la manipulación genética, capacidad para procesar una variedad de fuentes de carbono, el fenotipo negativo para Crabtree y la capacidad para proliferar bajo diferentes estreses medio-
ambientales.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI260, que contiene el gen que codifica resistencia a G418 dirigido por el promotor de PGK (S. cerevisiae) y unido al terminador de GAL10 (S. cerevisiae).

La Fig. 2 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI268, que contiene el gen que codifica resistencia a G418 dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis) y unido al terminador de GAL10 (S. cerevisiae).

La Fig. 3 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI269, que contiene el gen que codifica resistencia a G418 dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis) y unido al terminador de GAL10 (S. cerevisiae).

La Fig. 4 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI270, que contiene el gen que codifica resistencia a higromicina dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis) y unido al terminador de GAL10 (S. cerevisiae).

La Fig. 5 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI234, que contiene el gen de MEL5 (S. cerevisiae) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis).

La Fig. 6 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI238, que contiene el gen de MEL5 (S. cerevisiae) dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis).

La Fig. 7 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI271, que contiene el gen que codifica resistencia a higromicina dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis) y unido al terminador de GAL10 (S. cerevisiae).

La Fig. 8 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI246, que contiene los genes de MEL5 (S. cerevisiae) y LDH (L. helveticus) dirigidos cada uno de ellos por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está ligado al terminador de CYC1, el cual está corriente arriba de una región de ARNr S26 (C. sonorensis).

La Fig. 9 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI247, que contiene el gen de MEL5 (S. cerevisiae) dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis) y el gen de LDH (L. helveticus) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está ligado al terminador de CYC1, que está corriente arriba de una región de ARNr S26 (C. sonorensis).

La Fig. 10 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI257, que contiene el gen de MEL5 (S. cerevisiae) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis) y el gen de LDH (L. helveticus) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está ligado al terminador de CYC1. Este casete de expresión completo está insertado entre el promotor y el terminador de PDC1 (C. sonorensis).

La Fig. 11 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI265, que contiene el gen de MEL5 (S. cerevisiae) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis) y el gen de LDH (B. megaterium; procedente del vector pVR24) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está ligado al terminador de PDC1 (C. sonorensis). Este casete de expresión completo está insertado entre el promotor y el terminador de PDC1 (C. sonorensis).

La Fig. 12 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI266, que contiene el gen de MEL5 (S. cerevisiae) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis) y el gen de LDH (R. oryzae; procedente del vector pVR27) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está ligado al terminador de PDC1 (C. sonorensis). Este casete de expresión completo está insertado entre el promotor y el terminador de PDC1 (C. sonorensis).

La Fig. 13 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI267, que contiene el gen de MEL5 (S. cerevisiae) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). Este casete de expresión está insertado entre el promotor y el terminador de PDC1 (C. sonorensis).

La Fig. 14 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI278, que contiene el gen que codifica resistencia a G418 dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis), unido operativamente al terminador de MEL5, y el gen de LDH (B. megaterium) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está ligado al terminador de GAL10 (S. cerevisiae).

La Fig. 15 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI286, que contiene el gen que codifica resistencia a G418 dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis), unido operativamente al terminador de MEL5 (S. cerevisiae), y el gen de LDH (B. megaterium) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está ligado al terminador de GAL10 (S. cerevisiae). Este casete de expresión completo está insertado entre el promotor y el terminador de PDC2 (C. sonorensis).

La Fig. 16 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI287, que contiene el gen que codifica resistencia a G418 dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis), unido operativamente al terminador de MEL5 (S. cerevisiae). Este casete de expresión está insertado entre el promotor y el terminador de PDC2 (C. sonorensis).

La Fig. 17 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI288, que contiene el gen que codifica resistencia a G418 dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis), unido operativamente al terminador de MEL5 (S. cerevisiae), y el gen de LDH (L. helveticus) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está unido al terminador de CYC1. Este casete de expresión completo está insertado entre el promotor y el terminador de PDC2 (C. sonorensis).

La Fig. 18 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI256, que contiene el gen de MEL5 (S. cerevisiae) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis) y el gen de LDH (L. helveticus) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está unido al terminador de CYC1. Este casete de expresión completo está insertado corriente arriba del terminador de PDC1 (C. sonorensis).

La Fig. 19 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI277, que contiene el promotor de PDC2 (C. sonorensis).

La Fig. 20 es un diagrama esquemático del vector descrito como pMI279, que contiene el gen que codifica resistencia a G418 dirigido por el promotor de TDH (C. sonorensis), unido operativamente al terminador de MEL5 (S. cerevisiae), y el gen de LDH (B. megaterium) dirigido por el promotor de PGK (C. sonorensis). El gen de LDH está ligado al terminador de GAL10 (S. cerevisiae). Este casete de expresión completo está insertado corriente abajo del promotor de PDC2 (C. sonorensis).

La Fig. 21 es un diagrama esquemático del vector descrito como pVR24.

La Fig. 22 es un diagrama esquemático del vector descrito como pVR27.

Las Figs. 23 A-C son diagramas esquemáticos de vectores, incluyendo pMI214, pMI203, pMI205, pMI227, pMI233 y pMI234.

Las Figs. 24 y 25 son diagramas esquemáticos de los vectores pMI205, pMI227, pMI246 y pMI247 descritos en WO 0242471, vectores que son excluidos de la presente invención mediante renuncia.

Las Figs. 24 y 25 son diagramas esquemáticos de procesos de producción de ácido láctico descritos en WO 0242471, procesos que son excluidos de la presente invención mediante renuncia.

Descripción detallada de la invención

Según se utiliza en la presente, un "producto orgánico" es cualquier compuesto que contenga un átomo de carbono. Ejemplos no limitantes de productos orgánicos incluyen carboxilatos (por ejemplo, lactato, acrilato, citrato, isocitrato, alfa-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, oxaloacetato), carbohidratos (por ejemplo, D-xilosa), alditoles (por ejemplo, xilitol, arabitol, ribitol), aminoácidos (por ejemplo, glicina, triptófano, glutamato), lípidos, ésteres, vitaminas (por ejemplo, L-ascorbato), polioles (por ejemplo, glicerol, 1,3-propanodiol, eritritol), aldehídos, alquenos, alquinos y lactonas. Por tanto, un producto orgánico pueden contener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más átomos de carbono. Además, los productos orgánicos pueden tener un peso molecular que es menor de 1.000 daltons aproximadamente (por ejemplo menor de 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ó 100 daltons aproximadamente). Por ejemplo, la D-xilosa (C_{5}H_{10}O_{5}) es un producto orgánico que tiene un peso molecular de 150 daltons. Además, los productos orgánicos pueden ser productos de fermentación.

El término "producto de fermentación", según es utilizado en la presente, se refiere a cualquier compuesto orgánico que es producido mediante un proceso de fermentación. En general, un proceso de fermentación puede implicar la conversión enzimática anaerobia de compuestos orgánicos (por ejemplo, carbohidratos) en compuestos tales como alcohol etílico, produciendo energía en forma de ATP. La fermentación celular difiere de la respiración celular en que se utilizan como aceptores de electrones productos orgánicos en lugar del oxígeno molecular. Ejemplos no limitantes de productos de fermentación son acetato, etanol, butirato y lactato.

Los productos orgánicos pueden derivar también del piruvato. Un "producto derivado de piruvato", según se utiliza en la presente, se refiere a cualquier compuesto que sea sintetizado a partir de piruvato en no más de quince etapas enzimáticas. Se considera que una etapa enzimática es cualquier reacción química o cualquier serie de reacciones catalizadas por un polipéptido con actividad enzimática. Tales polipéptidos son cualquier polipéptido que catalice una reacción química de otras sustancias sin ser él mismo destruido o alterado después de la finalización de la reacción o de las reacciones. Estos polipéptidos pueden tener cualquier tipo de actividad enzimática, incluyendo los ejemplos no limitantes de actividades asociadas con aconitasa, isocitrato deshidrogenasa, cetoglutarato deshidrogenasa, succinato tioquinasa, succinato deshidrogenasa, fumarasa, malato deshidrogenasa, citrato sintasa, 2,5-dioxovalerato deshidrogenasa, 5-deshidro-4-desoxi-D-glucarato deshidrogenasa, glucarato deshidratasa, aldehído deshidrogenasa, glucuronolactona reductasa, L-gulonolactona oxidasa, 2-deshidro-3-desoxi-D-pentanoato aldolasa, xilonato deshidratasa, xilonolactonasa, D-xilosa deshidrogenasa, lactato deshidrogenasa, CoA-transferasa, lacil-CoA deshidratasa o acrilil-CoA hidratasa.

Los productos carboxilato pueden estar en forma de ácido libre o de sal y pueden ser referidos indistintamente (por ejemplo, "ácido láctico" o "lactato"). Se considera que la utilización de cualquiera de los términos incluye el otro, a no ser que se indique específicamente de otro modo. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona los carboxilatos en forma de ácido libre.

El término "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ADN o ARN. El término incluye moléculas formadas a partir de cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-iso-penteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

El término "vector" es utilizado para referirse a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) utilizada para transferir a una célula huésped la información codificadora de una proteína.

El término "vector de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula huésped y que contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan la expresión de secuencias de ácido nucleico heterólogas insertadas. La expresión incluye, pero no se limita a, procesos tales como la transcripción, la traducción y el ayuste de ARN, si hay intrones presentes.

El término "unido operativamente" se utiliza en la presente para referirse a una disposición de secuencias, en la cual las secuencias están unidas entre sí y configuradas o ensambladas con el fin de llevar a cabo su función habitual. De este modo, una secuencia unida operativamente a una secuencia que codifica una proteína puede flanquear a la secuencia codificadora y ser capaz de llevar a cabo la replicación y/o la transcripción de la secuencia codificadora. Por ejemplo, una secuencia codificadora está unida operativamente a un promotor cuando el promotor es capaz de dirigir la transcripción de esa secuencia codificadora. Una secuencia flanqueante no necesita ser contigua a la secuencia codificadora, siempre que funcione correctamente. Así, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias intermedias no traducidas ya transcritas entre una secuencia promotora y la secuencia codificadora, y la secuencia promotora puede seguir siendo considerada como "unida operativamente" a la secuencia codificadora.

El término "célula huésped" se utiliza para hacer referencia a una célula en la cual se ha introducido, o ha sido transformada con, o es capaz de ser transformada con, una secuencia de ácido nucleico y posteriormente expresa un gen seleccionado de interés. El término incluye la progenie de la célula parental, sea o no la progenie idéntica en morfología o en composición genética al parental original.

El término "endógeno", según se utiliza en la presente, se refiere a un material genómico que no es exógeno, esto es, que no ha sido introducido en la célula. Tal material genómico endógeno se desarrolla normalmente en un organismo, tejido o célula y no ha sido insertado ni modificado mediante la tecnología recombinante. El material genómico endógeno incluye las variaciones que tienen lugar de forma natural.

El término "exógeno" o "heterólogo", según se utiliza en la presente, se refiere a un material genómico que no es endógeno, esto es a un material que ha sido introducido en la célula. Típicamente, tal material ha sido insertado o modificado mediante la tecnología recombinante.

Según se utiliza en la presente, el término "modificado genéticamente" se refiere a un organismo cuyo genoma ha sido modificado mediante métodos que incluyen los ejemplos no limitantes de adición, sustitución o eliminación de material genético. Tales métodos de manipulación genética son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis aleatoria, mutaciones puntuales, incluyendo inserciones, deleciones y sustituciones de un residuo o de una pluralidad de residuos de nucleótidos individuales, la tecnología de "knock-out" y la transformación de un organismo con una secuencia de ácido nucleico utilizando la tecnología recombinante, incluyendo transformantes estables y transitorios.

Los términos "anaerobio" y "condiciones anaerobias" tienen la intención de significar que la cantidad de oxígeno disuelto en una solución, típicamente en un medio de cultivo, no es detectable (esto es, alrededor del 0%) o que, alternativamente, la cantidad de oxígeno en la atmósfera es del 0% al 2% aproximadamente.

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Vectores y Células Huésped

Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido útil para la síntesis de productos orgánicos de interés, es insertada en un vector de clonaje o expresión apropiado utilizando técnicas estándar de ligadura (ver, por ejemplo, Sambrook y col., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). El vector es seleccionado típicamente para que sea funcional en la célula huésped particular empleada (esto es, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de tal manera que puede tener lugar la replicación, la amplificación y/o la expresión del gen). Una molécula de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido útil para la síntesis de productos orgánicos de interés puede ser amplificada en cualquier célula apropiada y expresada en cualquier célula huésped, muy preferiblemente en una célula huésped negativa para Crabtree. Las realizaciones de la presente invención se presentan en las reivindicaciones acompañantes.

Las células huésped negativas para Crabtree son aquellas del género Candida, incluyendo los ejemplos no limitantes de C. sonorensis, C methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naeodendra, C. krusei, C. blankii y C. entomophila.

Las secuencias flanqueantes (incluyendo promotores y terminadores) pueden ser homólogas (esto es, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (esto es, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula huésped), híbridas (esto es, una combinación de secuencias flanqueantes de más de un origen) o sintéticas, o bien las secuencias flanqueantes pueden ser secuencias nativas que funcionan normalmente regulando la expresión del gen de interés. Así, el origen de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda ser activada por, la maquinaria de la célula huésped.

Secuencias flanqueantes útiles en los vectores de esta invención, y definidas en las reivindicaciones acompañantes, pueden ser obtenidas mediante cualquiera de diferentes métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes útiles en la presente habrán sido previamente identificadas mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción, y pueden ser por tanto aisladas de una fuente biológica utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante puede ser conocida. En tales casos, la secuencia flanqueante puede ser sintetiza utilizando métodos bien conocidos por las personas con experiencia en la técnica, así como los descritos en la presente, para la síntesis o el clonaje de ácidos nucleicos.

Cuando se conoce toda o únicamente una porción de la secuencia flanqueante, puede obtenerse la extensión completa de la secuencia flanqueante funcional utilizando una técnica de amplificación in vitro, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y/o mediante la selección de una biblioteca genómica con un oligonucleótido adecuado y/o con un fragmento de la secuencia flanqueante procedente de la misma especie o de otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, un fragmento de ADN conteniendo la secuencia flanqueante puede ser aislado de un fragmento más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificadora o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede ser llevado a cabo mediante digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado, seguido por aislamiento utilizando purificación en un gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Chatsworth, CA) u otros métodos conocidos por el técnico experto. La selección de los enzimas adecuados para conseguir este fin será fácilmente obvia para las personas con experiencia habitual en la técnica.

Un gen o elemento marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores útiles para la selección codifican proteínas que (a) confieren resistencia a las células huésped a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina; (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula huésped, tal como la deficiencia en Leu2; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los ejemplos no limitantes del gen de resistencia a zeocina, el gen de resistencia a G418 y el gen de resistencia a higromicina.

Pueden utilizarse otros genes para la selección con el fin de amplificar el gen que será expresado. La amplificación es el proceso mediante el cual genes que tienen mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento son repetidos en tándem en los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina quinasa sin promotor. Los transformantes de células de mamífero son colocados bajo una presión de selección en la cual solamente los transformantes están exclusivamente adaptados para sobrevivir en virtud del gen de selección presente en el vector. La presión de selección es impuesta mediante el cultivo de las células transformadas bajo condiciones en las cuales se incrementa progresivamente la concentración del agente de selección en el medio, dando lugar de este modo a la amplificación del gen de selección y del ADN que codifica un polipéptido útil para sintetizar un producto orgánico.

Los vectores de expresión y clonaje de la presente invención contendrán típicamente un promotor, según se define en las reivindicaciones acompañantes, que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente a la molécula que codifica el polipéptido útil para sintetizar un producto orgánico. Los promotores son secuencias no transcritas localizadas corriente arriba (esto es, 5') respecto al codón de inicio de la traducción de un gen estructural (generalmente en 100 a 1000 pb) y controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles incrementados de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de la temperatura. Por otra parte, los promotores constitutivos inician la producción continua de un producto génico; esto es, hay poca o ninguna regulación de la expresión del gen. Se conoce bien en la técnica un gran número de promotores de ambos tipos de promotores, reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Un promotor adecuado es unido operativamente al ADN que codifica un polipéptido útil para la síntesis de un producto orgánico, extrayendo el promotor del ADN de origen mediante digestión con enzimas de restricción o produciendo un fragmento de promotor mediante amplificación in vitro e insertando la secuencia promotora deseada en el vector. Pueden utilizarse secuencias promotoras nativas para dirigir la amplificación y/o la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido útil para la síntesis de un producto orgánico. Se prefiere, sin embargo, un promotor heterólogo si el mismo permite un mayor nivel de transcripción y mayores rendimientos de la proteína expresada en comparación con el promotor nativo, y si el mismo es compatible con el sistema de la célula huésped que ha sido seleccionado para su utilización.

Promotores adecuados para ser utilizados con células huésped de levadura son también bien conocidos en la técnica e incluyen los ejemplos no limitantes de promotores de genes de levadura, incluyendo fosfoglicerato quinasa (PGK), triosa deshidrogenasa (TDH), piruvato descarboxilasa (PDC), triosa fosfato isomerasa (TPI) y alcohol deshidrogenasa (ADH). Los promotores preferidos de la invención incluyen los promotores de PGK y TDH. Las secuencias intensificadoras de levadura, secuencias que incrementan la expresión cuando están situadas en relativa proximidad a un promotor, son utilizadas de manera ventajosa con los promotores de levaduras.

Los métodos de transformación de células son bien conocidos en la técnica, y pueden incluir ejemplos no limitantes tales como electroporación y métodos de transformación basados en cloruro de calcio o acetato de litio.

Varios de los vectores descritos en los Ejemplos de esta invención han sido construidos previamente y están descritos en la solicitud PCT/US01/44041 (WO 02/42471). Brevemente, los vectores pMI234, pMI238, pMI246, pMI247 y el PDC2 en lambda fueron construidos según sigue.

Aislamiento de genes de C. sonorensis (PDC2 en lambda): Se aisló el ADN genómico de C. sonorensis (Nº de Acceso de la ATCC 32109) de células cultivadas durante una noche en YPD utilizando el kit Easy DNA (Invitrogen). El ADN fue digerido parcialmente con Sau3A y fraccionado por tamaños mediante centrifugación en un gradiente de sacarosa (Sambrook y col., Id.). Fragmentos de ADN de 22 kb aproximadamente fueron ligados en los brazos del vector lambda DASH^{TM} (Stratagene) digerido con BamHI, tratado con fosfatasa, y la mezcla de ligadura fue empaquetada en partículas de lambda utilizando Gigapack II Gold Packaging Extract (Stratagene). Las partículas de lambda fueron utilizadas para infectar E. coli MRA P2.

Las sondas utilizadas para el aislamiento de los genes de C. sonorensis de la biblioteca fueron preparadas mediante amplificación por PCR utilizando la polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Espoo, Finlandia), cebadores específicos de la secuencia y ADN genómico de S. cerevisiae, C. albicans o C. sonorensis como molde, según sigue.

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Los oligonucleótidos TGT CAT CAC TGC TCC ATC TT (SEC ID Nº 17) y TTA AGC CTT GCC AAC ATA TT (SEC ID Nº 18), correspondientes al gen de TDH1 de S. cerevisiae, fueron utilizados para amplificar un fragmento del gen de TDH procedente del ADN genómico de S. cerevisiae.

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Los oligonucleótidos GCG ATC TCG AGG TCC TAG ATT ATG TAT ACT AAT TTG C (SEC ID Nº 19) y CGC GAA TTC CCA TGG TTA GTT TTT GTT GGA AAG AGC AAC (SEC ID Nº 20), correspondientes al gen de PGK1 de C. albicans, fueron utilizados para amplificar un fragmento del gen de PGK1 procedente del ADN genómico de C. albicans.

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Los oligonucleótidos TGG ACT AGT AAA CCA ACA GGG ATT GCC TTA GT (SEC ID Nº 21) y CTA GTC TAG AGA TCA TTA CGC CAG CAT CCT AGG (SEC ID Nº 22), correspondientes al ARNr 26S de C. sonorensis, fueron utilizados para amplificar un fragmento del gen de ADNr 26S procedente del ADN genómico de C. sonorensis.

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Los oligonucleótidos CCG GAA TTC GAT ATC TGG GCW GGK AAT GCC AAY GAR TTR AAT GC (SEC ID Nº 23) y CGC GGA TTC AGG CCT CAG TAN GAR AAW GAA CCN GTR TTR AAR TC (SEC ID Nº 24), fueron diseñados sobre la base de porciones de la secuencia de aminoácidos de la piruvato descarboxilasa WAGNANELNA (SEC ID Nº 25) y DFNTGSFSYS (SEC ID Nº 26), que se conservan entre PDC1 de S. cerevisiae, PDC1 y PDC2 de Pichia stipitis y secuencias incompletas de PDC1 y PDC3 de Candida albicans. Estos cebadores fueron utilizados para amplificar un fragmento del(los) gen(es) de PDC procedente(s) del ADN genómico de C. sonorensis. La reacción de PCR con estos cebadores produjo dos fragmentos con secuencias de nucleótidos diferentes denominados PDC1 y PDC2.

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Los oligonucleótidos TCTGTTMCCTACRTAAGA (SEC ID Nº 27) y GTYGGTGGTCACGAAGGTGC (SEC ID Nº 28) fueron diseñados sobre la base de regiones conservadas encontradas en secuencias de la alcohol deshidrogenasa fúngica. Estos cebadores fueron utilizados para amplificar un fragmento del(los) gen(es) de ADH procedente(s) del ADN genómico de C. sonorensis. La reacción de PCR con estos cebado- res produjo tres fragmentos con secuencias de nucleótidos diferentes denominados ADH1, ADH2 y ADH3.

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La biblioteca fue sometida a selección con los fragmentos de PCR producidos según se describió anteriormente, y los productos fueron marcados con ^{32}P \alpha-dCTP utilizando el kit de marcaje Random Primed Labeling Kit (Boehringer Mannheim). La hibridación con las sondas radioactivas se llevó a cabo mediante incubación durante una noche a 42ºC en una solución que contenía formamida 50%, Denhardt 5x, SSPE 5x, SDS 0,1%, 100 \mug/ml de ADN de esperma de arenque, 1 \mug/ml de ADN poliA. Para las sondas de TDH1, PGK1 y PDC1, los filtros fueron lavados después de la hibridación a temperatura ambiente en una solución de SSC 2x durante 5 minutos y se repitió, seguido por dos lavados de 30 minutos en una solución de SSC 1x-SDS 0,1% a 68ºC. Los lavados después de la hibridación para las sondas de ADNr y PDC2 se llevaron a cabo dos veces durante 5 minutos a temperatura ambiente en SSC 2x, seguido por dos lavados de 30 minutos en SSC 0,1x-SDS 0,1% a 68ºC.

Las placas positivas fueron aisladas y purificadas según las instrucciones del fabricante (Stratagene). Los bacteriófagos fueron purificados utilizando métodos convencionales (Sambrook y col., Id.), modificados mediante eliminación por tratamiento con ADNasa I y la precipitación de las partículas de fago liberadas de las células huésped lisadas utilizando PEG6000. Dichas partículas de fago fueron posteriormente disueltas en tampón SM y extraídas con cloroformo, aglutinadas por centrifugación a 25.000 rpm en un rotor Kontron TST41.14 durante 2 horas y disueltas de nuevo en tampón SM. El ADN de lambda fue aislado mediante digestión de las partículas de fago con proteinasa K, seguido por extracción con fenol y precipitación con etanol.

Los insertos de ADN genómico de C. sonorensis fueron secuenciados parcialmente utilizando cebadores específicos de la secuencia. Las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos deducidas de las mismas fueron comparadas frente a bases de datos de secuencias con el fin de identificar genes codificados totalmente o en parte por el inserto del fago, utilizando la homología con genes o proteínas conocidos. Las secuencias obtenidas tenían una similitud significativa con ADNr, fosfoglicerato quinasas, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas o piruvato descarboxilasas fúngicas, dependiendo de la sonda utilizada para el aislamiento de cada clon. Los puntos iniciales y finales de los marcos de lectura abiertos que codificaban secuencias de PGK1, PDC1 y TDH1 de C. sonorensis fueron así identificados.

Vectores "componentes básicos", pMI203, pMI205 (vectores de resistencia a Zeocina para C. sonorensis), pVR24 y pVR27

Estos plásmidos son utilizados en la construcción de los vectores descritos en los Ejemplos y están descritos en la solicitud de PCT PCT/US01/44041. Brevemente, se describe la construcción de estos vectores.

El plásmido pTEF1/Zeo (Invitrogen) que contenía el marcador de resistencia a Zeocina bajo el control del promotor de TEF1 de S. cerevisiae, fue modificado mediante la adición de un fragmento de ADNr de C. sonorensis con el fin de proporcionar una diana para recombinación homóloga. Los cebadores oligonucleotídicos siguientes:

TGG \underline{ACT \ AGT} AAA CCA ACA GGG ATT GCC TTA GT

(SEC ID Nº 29)

y

CTA \underline{GTC \ TAG \ A}GA TCA TTA CGC CAG CAT CCT AGG

(SEC ID Nº 30),

que corresponden a ARNr 26S de C. sonorensis (Nº de Acceso del Genbank U70185), fueron utilizados para amplificar ADN genómico de C. sonorensis con el fin de proporcionar un fragmento del gen de ADNr 26S amplificado por PCR. El fragmento producto de la PCR resultante fue digerido con los enzimas de restricción SpeI y XbaI y ligado con el plásmido pTEF/Zeo digerido con XbaI. El plásmido resultante fue denominado pMI203 (Fig. 23B).

El promotor de TEF1 contenido en pMI203 fue sustituido por un promotor de un gen de otra especie de Candida, el promotor de PGK1 de C. albicans. Los siguientes cebadores oligonucleotídicos:

GCG AT\underline{C \ TCG \ AG}G TCC TAG AAT ATG TAT ACT AATTTGC

(SEC ID Nº 31)

y

ACT TGG \underline{CCA \ TGG} TGA TAG TTA TTC TTC TGC AATTGA

(SEC ID Nº 32)

fueron diseñados sobre la base de la secuencia disponible de PGK1 de C. albicans (Nº de Acceso del Genbank U25180). Estos cebadores fueron utilizados para amplificar un fragmento de 700 pb de la región corriente arriba del marco de lectura abierto de PGK1 de C. albicans, utilizando como molde ADN genómico de C. albicans. Se añadieron a los cebadores los sitios de restricción de XbaI y SpeI (subrayados arriba) con el fin de facilitar el clonaje del fragmento. Después de la amplificación, el fragmento fue aislado y digerido con los enzimas de restricción XhoI y NcoI y ligado posteriormente al plásmido pMI203 digerido con XhoI y NcoI. El plásmido resultante fue denominado pMI205 (Fig. 23B).

pVR24 y pVR27: El plásmido pBFY004 (patentado, NREL) fue digerido con el enzima de restricción NotI (Invitrogen), teniendo como resultado un fragmento de 1235 pb (SEC ID Nº: 33). El fragmento fue aislado y ligado a pGEM5zF(+) (Promega North, Madison, WI) digerido con NotI. E. coli (top 10) (Invitrogen) fue transformada con la mezcla de ligadura utilizando protocolos estándar de electroporación (Sambrook, Id.). El plásmido resultante fue denominada pNC002.

El ADN de B. megaterium que codificaba el gen de LDH fue aislado según sigue. B. megaterium fue obtenido de la American Type Culture Collection (# de Acceso de la ATCC 6458) y cultivado bajo condiciones estándar. El ADN genómico fue purificado a partir de estas células utilizando el kit de Invitrogen "Easy-DNA" según el protocolo del fabricante. Se diseñaron cebadores sobre la base de la secuencia disponible en el Genbank para el L-LDH de B. megaterium (# de Acceso del Genbank M22305). Las reacciones de amplificación por PCR se llevaron a cabo utilizando técnicas estándar, conteniendo cada reacción ADN genómico de B. megaterium (6 ng/\mul), los 4 dNTPs (0,2 mM) y los cebadores de la amplificación BM1270 y BM179 (1 \muM de cada uno). Los cebadores tienen las
secuencias:

BM 1270 \hskip0.3cm CCTGAGTCCACGTCATTATTC

(SEC ID Nº 34)

y

BM179 \hskip0.5cm TGAAGCTATTTATTCTTGTTAC

(SEC ID Nº 35)

Las reacciones se llevaron a cabo según las siguientes condiciones de termociclación: una incubación inicial durante 10 minutos a 95ºC, seguido por 35 ciclos que constaban de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 50ºC, 60 segundos a 72ºC. Un potente fragmento del producto de 1100 pares de bases (pb) fue purificado en gel utilizando procedimientos convencionales, clonado y secuenciado. La secuencia resultante pudo ser traducida a un polipéptido que presentaba una excelente homología con genes conocidos que codificaban L-LDH.

La secuencia codificadora de LDH de B. megaterium descrita en la presente fue unida operativamente a un promotor del gen de PGK1 y a un terminador de la transcripción del gen de GAL10, ambos de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se diseñaron dos cebadores oligonucleotídicos, Bmeg5' y Bmeg3', sobre la base de esta secuencia con el fin de introducir sitios de restricción en los extremos de la secuencia codificadora del gen:

Bmeg5' \hskip0.3cm GCTCTAGATGAAAACACAATTTACACC

(SEC ID Nº 36)

y

Bmeg3' \hskip0.3cm ATGGATCCTTACACAAAAGCTCTGTCGC

(SEC ID Nº 37)

Esta reacción de amplificación fue llevada a cabo utilizando las concentraciones de dNTP y de cebadores descritas anteriormente y utilizando polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) en un tampón suministrado por el fabricante. Los ciclos térmicos se realizaron mediante una incubación inicial de la mezcla de reacción durante 3 minutos a 95ºC, seguido posteriormente por 20 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 50ºC, 60 segundos a 72ºC, seguido por una incubación final de 9 minutos a 72ºC. El producto fue digerido con los enzimas de restricción XbaI y BamHI y ligado posteriormente en los sitios de XbaI y BamHI del plásmido pNC002. Esta ligadura tuvo como resultado el que el promotor de PGK y el terminador de GAL10 fueran unidos operativamente a la secuencia codificadora de LDH de B. megaterium (pVR24; Fig. 21).

La construcción de pVR27 (Fig. 22) se llevó a cabo para crear un vector que contuviera LDH de R. oryzae para su expresión bajo el control del promotor de PGK1 de S. cerevisiae. Se aisló LDH de Rhizopus oryzae a partir de ADN genómico purificado (kit "Easy-DNA", Invitrogen) de células (# de Acceso de la ATCC 9363) cultivadas bajo condiciones estándar. Se diseñaron cebadores sobre la base de la secuencia disponible en el GenBank para LDH de R. oryzae (# de Acceso del GenBank AF226154). Las reacciones de amplificación por PCR se llevaron a cabo utilizando técnicas estándar, conteniendo cada reacción ADN genómico de R. oryzae (6 ng/\mul), cada uno de los 4 dNTPs (0,2 mM) y cada uno de los cebadores de la amplificación Ral-5' y Ral-3' (1 \muM). Los cebadores de la amplificación tenían la secuencia:

Ral-5' \hskip0.3cm CTTTATTTTTCTTTACAATATAATTC

(SEC ID Nº 38)

y

Ral-3' \hskip0.3cm ACTAGCAGTGCAAAACATG

(SEC ID Nº: 39)

Las reacciones se llevaron a cabo según las siguientes condiciones de ciclación: una incubación inicial durante 10 minutos a 95º, seguido por 35 ciclos que constaban de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 41ºC, 60 segundos a 72ºC. Un potente fragmento del producto de 1100 pb fue purificado en gel, clonado en el vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) y secuenciado. La secuencia resultante pudo ser traducida a un polipéptido que presentaba una excelente homología con la secuencia conocida del gen que codifica LDH de Rhizopus oryzae del GenBank (# de Acceso AF226154).

La secuencia codificadora del gen que codifica LDH de R. oryzae descrita en la presente fue unida operativamente a un promotor de PDK1 y a un terminador de la transcripción del gen de GAL10, ambos de la levadura S. cerevisiae. Para producir esta construcción, se prepararon y utilizaron los siguientes oligonucleótidos para amplificar la secuencia codificadora del plásmido que contenía el inserto de LDH de Rhizopus. Se diseñaron dos cebadores oligonucleotídicos, Rapgk5 y Papgk3, sobre la base de esta secuencia con el fin de introducir sitios de restricción en los extremos de la secuencia codificadora del gen.

Rapgk5 \hskip0.3cm GCTCTAGATGGTATTACACTCAAAGGTCG

(SEC ID Nº 40)

y

Papgk3 \hskip0.3cm GCTCTAGATCAACAGCTACTTTTAGAAAAG

(SEC ID Nº 41)

Esta reacción de amplificación fue llevada a cabo utilizando las concentraciones de dNTP y de los cebadores descritas anteriormente y utilizando polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) en un tampón suministrado por el fabricante. La termociclación fue realizada incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 3 minutos a 95ºC, posteriormente mediante 20 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a 53ºC, 60 segundos a 72ºC, seguido por una incubación final de 9 minutos a 72ºC. El producto fue digerido con el enzima de restricción XbaI y ligado posteriormente en el sitio de XbaI del plásmido pNC002.

Esta ligadura tuvo como resultado el que el promotor de PGK y el terminador de GAL10 fueran unidos operativamente a la secuencia codificadora de LDH de R. oryzae (pVR27; Fig. 22).

pMI234 y pMI238: Con el fin de desarrollar una selección positiva para los transformantes de C. sonorensis, se obtuvo el gen de MEL5 de S. cerevisiae (Naumov y col., 1990, MGG 224: 119-128; Turakainen y col., 1994, Yeast 10, 1559-1568; Nº de Acceso del Genbank Z37511) como el fragmento EcoRI-SpeI de 2160 pb del plásmido pMEL5-39 y se ligó a pBluescript II KS(-) (Stratagene) digerido con EcoRI y SpeI. El sitio de EcoRI en el gen de MEL5 está situado 510 pb corriente arriba de la secuencia iniciadora ATG, y el sitio de SpeI está situado 250 pb corriente abajo del codón de parada de MEL5. El plásmido resultante fue denominado pMI233 (Fig. 23C)

El promotor de PGK1 de 1500 pb de C. sonorensis fue amplificado con cebadores que tenían la secuencia: GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG (SEC ID Nº 5) y TGG ACT AGT ACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACA TTG TAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG (SEC ID Nº 42) utilizando ADN del clon de lambda con PGK1 aislado anteriormente como molde. El cebador 3' puede crear una fusión entre el promotor de PGK1 de C. sonorensis y MEL5 de S. cerevisiae, ya que corresponde a nucleótidos presentes en el promotor de PGK1 inmediatamente corriente arriba del marco de lectura abierto y a nucleótidos que corresponden al extremo 5' del marco de lectura abierto de MEL5. El fragmento amplificado resultante fue digerido con los enzimas de restricción SphI y XhoI y ligado al plásmido pMI233 (Fig. 23C) digerido con SphI y XhoI. La construcción resultante en el plásmido contiene el promotor de PGK1 de C. sonorensis corriente arriba de, y unido operativamente a, el marco de lectura abierto de MEL5, y está identificado como pMI234 en la Fig. 5.

De manera similar, un fragmento de 650 pb del promotor de TDH1 de C. sonorensis fue amplificado con cebadores que tenían la secuencia: GCG ATC TCG AGA AAA TGT TAT TAT AAC ACT ACA C (SEC ID Nº 3) y TGG ACT AGT ACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACA TTT TGT TTG ATT TGT TTG TTT TGT TTT TGT TTG (SEC ID Nº 43) utilizando como molde ADN del clon de lambda con TDH1 aislado anteriormente. El cebador 3' puede crear una fusión entre el promotor de TDH1 de C. sonorensis y MEL5 de S. cerevisiae, ya que corresponde a nucleótidos presentes en el promotor de TDH1 inmediatamente corriente arriba del marco de lectura abierto y a nucleótidos correspondientes al extremo 5' del marco de lectura abierto de MEL5. El fragmento amplificado fue digerido con SphI y XhoI y ligado en el plásmido pMI233 (Fig. 23C) digerido con SphI y XhoI. El plásmido resultante, identificado como pMI238 en la Fig. 6, contiene el promotor de TDH1 de C. sonorensis corriente arriba de, y unido operativamente a, el marco de lectura abierto de MEL5.

pMI246 y pMI247: El plásmido pMI205 fue utilizado para producir un plásmido que contenía el gen de MEL5 como marcador seleccionable y el gen de LDH para permitir la producción de ácido láctico en C. sonorensis. En el plásmido resultante, el gen de resistencia a zeocina de pMI205 fue sustituido por el gen de LDH de L. helveticus.

Un fragmento NcoI-BamHI de 1329 pb de pVR1 que contenía el gen de LDH y el terminador de CYC1, fue ligado al fragmento NcoI-BamHI de 3413 pb de pMI205 (Fig. 23B), poniendo al gen de LDH de L. helveticus bajo el control del promotor de PGK1 de C. albicans; el plásmido resultante fue denominado pMI214. En una segunda etapa, el promotor de PGK1 de C. albicans fue sustituido por el promotor de PGK1 de C. sonorensis. El promotor de PGK1 de C. sonorensis fue aislado mediante amplificación de un clon de lambda aislado según se describió anteriormente utilizando cebadores que tenían la secuencia: GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG (SEC ID Nº 5) y ACT TGG CCA TGG TAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG (SEC ID Nº 44) y el producto de la PCR fue digerido con XhoI y NcoI y ligado en pMI214 digerido con XhoI y NcoI. Este plásmido fue denominado pMI277 y está mostrado en la Fig. 19.

El casete de expresión de LDH procedente de pMI227 y el casete del marcador MEL5 procedente de pMI234 fueron combinados en el mismo vector ligando un fragmento AvrII-NheI de 3377 pb de pMI227 (Fig. 23A) con pMI234 digerido con SpeI (Fig. 23C). El plásmido resultante fue denominado pMI246 y está mostrado en la Fig. 8.

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El casete de expresión de LDH procedente de pMI227 y el casete del marcador MEL5 procedente de pMI238 fueron combinados en el mismo vector ligando un fragmento AvrII-NheI de 3377 pb de pMI227 con pMI238 digerido con SpeI. El plásmido resultante fue denominado pMI247 y está mostrado en la Fig. 9.

En una realización, la invención proporciona construcciones de ácido nucleico recombinante, según se definen en las reivindicaciones acompañantes, que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica el gen de la lactato deshidrogenasa, útil para la biosíntesis de ácido láctico, que está unida operativamente a un promotor que es funcional en el género Candida, donde la secuencia de nucleótidos codifica un gen de la lactato deshidrogenasa heterólogo para la célula de la levadura Candida en la cual se ha introducido. En las realizaciones más preferidas el gen de la lactato deshidrogenasa procede de un microorganismo tal como, por ejemplo, una bacteria o un hongo, y el producto orgánico producido de acuerdo con los métodos descritos en la presente es ácido láctico (o lactato).

Típicamente, los métodos descritos en la presente para producir ácido láctico pueden dar lugar a (sobre la base de los gramos de ácido láctico producido/gramos de sustrato carbohidratado consumido) un 60% aproximadamente o más, preferiblemente un 70% aproximadamente o más, más preferiblemente un 80% aproximadamente o más y, muy preferiblemente, un 90% aproximadamente o más, cuando el sustrato carbohidratado es una hexosa, por ejemplo, glucosa.

Los métodos para producir ácido láctico pueden tener como resultado títulos de ácido láctico de 75 gramos/l aproximadamente o más, preferiblemente 90 gramos/l aproximadamente o más y, muy preferiblemente, 100 gramos/l aproximadamente o más. Las células de la invención tienen una productividad específica de producción de ácido láctico (en términos de gramos de ácido láctico producido/gramos de peso celular seco por hora) de 0,20 aproximadamente o más, preferiblemente de 0,30 aproximadamente o más y, muy preferiblemente, de 0,50 aproximadamente o más, cuando se utiliza para la producción un sustrato carbohidratado que es una hexosa, tal como glucosa.

Las células negativas para Crabtree pueden también catabolizar almidón, ya sea de forma natural o debido a una modificación genética. Además, las células pueden ser modificadas genéticamente para que catabolicen productos de celulosa mediante la adición de moléculas tales como celulasas fúngicas.

En realizaciones relacionadas, las células pueden metabolizar azúcares distintos de glucosa o de otras hexosas monosacarídicas, en particular pentosas, incluyendo los ejemplos no limitantes de xilosa y L-arabinosa.

Las células negativas para Crabtree de la invención son seleccionadas preferiblemente de las cepas de Candida C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naeodendra, C. krusei, C. blankii y C. entomophila. En las realizaciones preferidas, las células son células de C. sonorensis y C. methanosorbosa.

Los métodos para aislar los productos orgánicos producidos por las células son bien conocidos en la técnica. En particular, los métodos para separar ácido láctico de una mezcla de fermentación, incluyendo mezclas de fermentación a pH bajo, están descritos por Eyal y col. (Solicitud de Patente Internacional, Publicación Nº WO 99/19290, publicada el 22 de Abril de 1999). Tales métodos para aislar ácido láctico incluyen extracción, adsorción, destilación/vaporización, separación a través de una membrana, cristalización y separación de fases (Ver también: Vickroy, 1985, Comprehensive Biotechnology, (Moo-Young, ed.), Volumen 3, Capítulo 38, Pergamon Press, Oxford; Datta y col., 1995, FEMS Microbiol. Rev. 16: 221-231; Patente de EE.UU. 4.771.001; Patente de EE.UU. 5.132.456; Patente de EE.UU. 5,510.526 y Patente de EE.UU. 5.420.304).

Condiciones de la Fermentación

Pueden utilizarse varios procesos de fermentación con los diferentes aspectos de la presente invención. (Ver, por ejemplo, Wolf, 1996, Nonconventional Yeasts in Biotechnology, Springer-Verlag, Berlin, y Walker, 2000, Yeast Physiology and Biotechnology, John Wiley & Sons, Inglaterra). Aquellas personas con experiencia en la técnica reconocerán que las condiciones de la fermentación pueden ser variadas con el fin de mejorar diferentes aspectos de la fermentación, incluyendo el rendimiento de producto, la productividad del cultivo y la salud del cultivo (entre otros), dependiendo del organismo huésped específico y del producto deseado. Es particularmente ventajoso utilizar las características favorables de Candida para ajustar las condiciones de la fermentación. De este modo, el pH puede tener un rango durante las diferentes etapas del procesamiento de 2,5 aproximadamente hasta 9,0 aproximadamente. Los niveles de oxígeno pueden variar desde el 0% aproximadamente hasta el 100% aproximadamente (con relación al contenido de oxígeno encontrado en el aire), medidos en la atmósfera por encima del medio o disueltos en el medio. Los niveles de oxígeno pueden ser medidos o calculados mediante cualquiera de los métodos habituales, incluyendo presión parcial, electrodo de O_{2}, volumen/volumen o velocidad de flujo del gas (VVM). Los rangos de temperatura pueden extenderse desde la temperatura ambiente aproximadamente (23ºC) hasta 40ºC aproximadamente y por encima (por ejemplo, hasta 45ºC aproximadamente).

Las condiciones de fermentación preferidas incluyen el mantenimiento de un rango de pH desde 4 aproximadamente hasta 5 aproximadamente. Se prefiere especialmente mantener un pH de alrededor de 5 durante la producción de biomasa y durante la producción de ácido láctico. Preferiblemente, el pH es mantenido a lo largo de todo el proceso de fermentación mediante la adición automatizada de una base, por ejemplo Ca(OH)_{2}. La temperatura durante la producción de biomasa es mantenida preferiblemente a 35ºC aproximadamente. Preferiblemente, la biomasa es producida bajo condiciones aerobias en las que el medio de cultivo es preferiblemente agitado y al que se suministra un flujo de aire, hasta que se alcance una masa celular adecuada para la producción de ácido láctico. Durante la producción de ácido láctico, la velocidad de agitación y el flujo de aire son preferiblemente más lentos, con relación a su velocidad durante la producción de biomasa.

Los datos siguientes fueron generados a partir de tres cultivos en fermentadores diferentes en medio con glucosa bajo las condiciones preferidas anteriormente detalladas.

Rendimiento total y productividad

1

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Rendimiento y productividad en la fase de producción de lactato

2

Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar la presente invención así como ciertas realizaciones de la misma, y no la limitan en su alcance. El alcance está definido por las reivindicaciones acompañantes.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Vectores de resistencia a G418 y utilización de G418 para la selección de transformantes de C. sonorensis

Se prepararon vectores que conferían resistencia a G418 a las células de levadura transformadas, los cuales permitieron la selección de los transformantes de células de levadura que contienen una construcción de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína útil para la síntesis de un producto orgánico, según sigue. El marcador de resistencia a G418 fue clonado con el fin de que estuviera bajo el control transcripcional del promotor de PGK1 o del promotor de TDH1 de C. sonorensis y las construcciones fueron denominadas pMI268 (Fig. 2) y pMI269 (Fig. 3), respectivamente. El terminador de GAL10 de S. cerevisiae fue utilizado en ambos casos.

El gen de resistencia a G418 fue amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando la Polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Espoo, Finlandia) y empleando un par de cebadores oligonucleotídicos que tenían las secuencias: CTAGTCTAGA ACA ATG AGC CAT ATT CAA CGG GAA ACG (G418 5'; SEC ID Nº 1) y CGC GGATCC GAA TTC TTA GAA AAA CTC ATC GAG CAT CAA ATG (G418 3'; SEC ID Nº 2). El plásmido pPIC9K (obtenido de Invitrogen) fue utilizado como molde. La PCR se llevó a cabo incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95ºC, seguido por 29 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 55ºC y 2 minutos a 72ºC, con una incubación final a 72ºC durante 5 minutos. El producto de la PCR fue digerido con los enzimas de restricción BamHI y XbaI y se aisló un fragmento de 800 pb. Este fragmento fue ligado al fragmento BamHI-XbaI de 4226 pb de pNC101 (obtenido de Eric Jarvis de NREL). El plásmido pNC101 fue construido a partir del promotor de la fosfoglicerato quinasa (pPGK) y de las secuencias terminadoras de GAL10 de S. cerevisiae utilizando técnicas estándar de clonaje (ver, por ejemplo, Sambrook y col., Id.). Este plásmido alberga también un gen de LDH de K. thermotolerans insertado entre los sitios de XbaI y EcoRI que, junto con un sitio de BamHI, están contenidos en una región poliadaptadora encontrada entre las secuencias del promotor y el terminador de la levadura. Este plásmido permite la expresión de varios genes o marcadores seleccionables bajo el control del promotor y del terminador de la levadura.

El plásmido resultante de estas manipulaciones contiene el gen de resistencia a G418 entre el promotor de PGK1 de S. cerevisiae y el terminador de GAL10 de S. cerevisiae y fue denominado pMI260. La estructura de este plásmido está mostrada esquemáticamente en la Fig. 1.

El promotor de TDH1 de 600 pb de C. sonorensis fue amplificado mediante PCR utilizando la Polimerasa Dynazyme EXT con un par de cebadores oligonucleotídicos que tenían la secuencia: GCG ATC TCG AGA AAA TGT TAT TAT AAC ACT ACA C (5441; SEC ID Nº 3) y CTAGTCTAGATT TGT TTG ATT TGT TTG TTT TGT TTT TGT TTG (Cs1; SEC ID Nº 4) utilizando como molde pMI238 (ver el apartado anterior "Vectores y Células Huésped"; mostrado en la Fig. 6). La PCR se llevó a cabo incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95ºC, seguido por 29 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, con una incubación final a 72ºC durante 5 minutos. El producto de la PCR se hizo de extremos romos con polimerasa Klenow y cada uno de los 4 dNTPs y posteriormente fue digerido con el enzima de restricción XbaI. El fragmento de 600 pb resultante fue ligado con el fragmento de PstI (que se hizo de extremos romos con polimerasa T4)-XbaI de 4216 pb de pMI260. El plásmido resultante contiene el gen de resistencia a G418 unido operativamente al promotor de TDH1 de C. sonorensis y al terminador de GAL10 de S. cerevisiae y fue denominado pMI269. La estructura de este plásmido está mostrada esquemáticamente en la Fig. 3.

El promotor de PGK1 de C. sonorensis de 1500 pb fue amplificado mediante PCR utilizando la Polimerasa Dynazyme EXT con un par de cebadores oligonucleotídicos que tenían la secuencia: GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG (5423; SEC ID Nº 5) y CTA GTC TAG ATG TAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG (Cs2; SEC ID Nº 6) utilizando como molde pMI234 (ver el apartado anterior "Vectores y Células Huésped"; Fig. 5). La PCR se llevó a cabo incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95ºC, seguido por 29 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, con una incubación final a 72ºC durante 10 minutos. El fragmento de 1500 pb producto de la PCR se hizo de extremos romos con polimerasa Klenow y cada uno de los 4 dNTPs y posteriormente fue digerido con el enzima de restricción XbaI. El fragmento de 1500 pb del promotor de PGK1 fue ligado con el fragmento PstI (que se hizo de extremos romos con polimerasa T4)-XbaI de 4216 pb de pMI260. El plásmido resultante contiene el gen de resistencia a G418 unido operativamente al promotor de PGK1 de C. sonorensis y al terminador de GAL10 de S. cerevisiae, y fue denominado pMI268. La estructura de este plásmido está mostrada esquemáticamente en la Fig. 2.

Las dos construcciones pMI268 y pMI269 fueron digeridas con los enzimas de restricción SalI y NotI y transformadas en C. sonorensis utilizando el método químico según Gietz y col. (1992, Nucleic Acids Res. 20: 1425). Esta técnica de transformación fue utilizada en todos estos Ejemplos y se describe brevemente según sigue.

Se recogieron mediante centrifugación células de un cultivo de una noche de C. sonorensis cultivada hasta una DO_{600} de 0,8-1,5 y se lavaron primeramente con un exceso de una solución de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5), seguido por un lavado con un exceso de una solución de acetato de litio (LiAc) 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5), y se resuspendieron posteriormente en 2 ml de una solución de LiAc 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5). Las células fueron mezcladas (50 \mul aproximadamente de la suspensión de 2 ml) con 10 \mug aproximadamente de ADN transformante y 300 \mul de una solución de PEG4000 40%, LiAc 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5). Las células fueron incubadas a 30ºC durante 30 minutos con agitación lenta. Se añadió dimetil sulfóxido (DMSO; 40 \mul) y las células fueron incubadas en un baño de agua a 42ºC durante 15 minutos. Las células fueron recogidas por centrifugación, lavadas con un exceso de una solución de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5), resuspendidas e incubadas a 30ºC en medio YPD (conteniendo 10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona y 20 g/l de glucosa) durante 3-7 horas. Opcionalmente, la incubación en YPD puede ser continuada durante una noche.

Antes de aplicar la selección, las células fueron incubadas en YPD líquido durante al menos 3 horas o durante una noche. Los transformantes fueron cultivados en placas de agar YPD (conteniendo 10 g/l de extracto de levadura, 20 g/l de peptona y 20 g/l de glucosa y un 2% de agar) suplementado con el antibiótico G418 a una concentración de 100 \mug/ml o de 200 \mug/ml. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante 2-5 días y los transformantes fueron posteriormente resembrados en estrías en placas de selección nuevas. El análisis Southern del ADN total aislado de las colonias resistentes a G418 mostró que el gen de resistencia a G418 estaba integrado en el genoma de los
transformantes.

Estos resultados mostraban que el gen de resistencia a G418 puede ser expresado por las construcciones preparadas según se describe en la presente y que es adecuado para la selección de los transformantes de C. sonorensis.

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Ejemplo 2

Vectores de resistencia a higromicina (hgh) y utilización de higromicina B para la selección de los transformantes de C. sonorensis

Se prepararon vectores que conferían resistencia a higromicina a las células de levadura transformadas, que permitían la selección de transformantes de células de levadura conteniendo una construcción de ácido nucleico recombinante que codificaba una proteína útil para la síntesis de un producto orgánico, según sigue. El marcador de resistencia a higromicina (hph de E. coli) fue clonado bajo el control transcripcional del promotor de PGK1 o del promotor de TDH1 de C. sonorensis y las construcciones fueron denominadas pMI270 (Fig. 4) y pMI271, respectivamente. El terminador de GAL10 de S. cerevisiae fue utilizado en ambos casos.

El gen de hph de E. coli que confiere resistencia a higromicina B fue obtenido del plásmido pRLMex30 (Mach y col., 1994, Curr. Genet. 25: 567-570). El pRLMex30 fue linealizado con el enzima de restricción NsiI, se hizo de extremos romos con ADN polimerasa de T4 y posteriormente fue digerido con XbaI.

El plásmido pMI268 preparado en el Ejemplo 1 fue digerido con EcoRI y se hizo de extremos romos con polimerasa Klenow y cada uno de los 4 dNTPs y posteriormente fue digerido con XbaI. El fragmento de 4900 pb resultante fue ligado con el fragmento de hph de 1035 pb procedente de pRLMex30. Esta ligadura produjo un plásmido que contenía el gen de resistencia a higromicina unido operativamente al promotor de PGK1 de C. sonorensis y al terminador de GAL10 de S. cerevisiae, y fue denominado pMI270. La estructura de este plásmido está mostrada esquemáticamente en la Fig. 4.

El plásmido pMI269 preparado en el Ejemplo 1 fue digerido con EcoRI y se hizo de extremos romos con polimerasa Klenow y cada uno de los 4 dNTPs, y posteriormente fue digerido con XbaI. El fragmento de 4000 pb resultante fue ligado con el fragmento de hph de 1035 pb de pRLMex30. Esto produjo un plásmido que contenía el gen de resistencia a higromicina unido operativamente al promotor de TDH1 de C. sonorensis y al terminador de GAL10 de S. cerevisiae y fue denominado pMI271. La estructura de este plásmido está mostrada esquemáticamente en la Fig. 7.

Se transformaron células de levadura utilizando el método químico según Gietz y col. (1992, Nucleic Acids Res. 20: 1425) según se describió en el Ejemplo 1 anterior. Las dos construcciones pMI270 y pMI271 fueron digeridas con los enzimas de restricción XhoI y NotI. La mezcla de transformación fue incubada en YPD a 30ºC durante 3 horas, antes de ser sembrada en placas selectivas. Los transformantes fueron cultivados a 30ºC durante 2-5 días en placas de agar YPD suplementado con higromicina B (Calbiochem) a concentraciones de 150-300 \mug/ml. Los transformantes fueron resembrados en estrías en placas de selección nuevas. La presencia del ADN transformado en el genoma de los transformantes resistentes a higromicina fue verificada mediante PCR utilizando un par de cebadores oligonucleotídicos que tenían la secuencia: CCGGACTA GTT GGT ACA GAG AAC TTG TAA ACA ATT CGG (ScerGal10t; SEC ID Nº 7) y TAT AAA TAC TTA TCA TTT CCTCC (5436; SEC ID Nº 8). La PCR se llevó a cabo mediante la incubación inicial de la mezcla de reacción durante 3 minutos a 94ºC, seguido por 29 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, con una incubación final a 72ºC durante 10 minutos.

Estos resultados muestran que el gen de hph de E. coli puede ser expresado utilizando las construcciones descritas en la presente, que funciona en C. sonorensis y que la higromicina B puede ser utilizada para seleccionar los transformantes de C. sonorensis.

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Ejemplo 3

Vectores para la expresión de LDH de L. helveticus y para la integración dirigida del ADN transformado en el locus de PDC1

Se prepararon vectores que contenían un gen de LDH de L. helveticus para la integración dirigida en el locus del gen de PDC1 de C. sonorensis, según sigue. El vector pMI246 contiene el casete de expresión de MEL5 y el casete de expresión de LDH de L. helveticus y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 8 (ver el apartado "Vectores y Células Huésped" anterior). Con el fin de construir un vector que permitiera la integración dirigida en el locus de PDC1 de C. sonorensis y la sustitución de la región codificadora de la proteína PDC1, fragmentos de ADN correspondientes a las secuencias inmediatamente corriente arriba y corriente abajo de la región codificadora de la proteína PDC1 fueron añadidos a pMI246.

El terminador de PDC1 fue amplificado mediante PCR utilizando la Polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Espoo, Finlandia) con cebadores oligonucleotídicos que tenían la secuencia: GGG ACT AGT GGA TCC TTG AAG TGA GTC AGC CAT AAG GAC TTA AATTCACC (Cs7; SEC ID Nº 9) y AAGGCCT TGT CGA CGC GGC CGC TTG GTT AGA AAA GGT TGT GCC AAT TTA GCC (Cs8; SEC ID Nº 10), utilizando como molde ADN genómico de C. sonorensis. La PCR se llevó a cabo incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95ºC, seguido por 29 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, con una incubación final a 72ºC durante 10 minutos. El fragmento de 920 pb producto de la PCR fue digerido con los enzimas de restricción BamHI y NotI y el fragmento de 920 pb fue purificado y ligado con el fragmento BamHI-NotI de 8900 pb procedente de pMI246. El plásmido resultante fue denominado pMI256 y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 18.

El promotor de PDC1 fue amplificado a partir de C. sonorensis con un par de cebadores oligonucleotídicos que tenían la secuencia: GGG ACG GGC CCG CGG CCG CTA CAA GTG ATT CAT TCA TTC ACT (Cs5; SEC ID Nº 11) y CCC TGG GCC CCT CGA GGA TGA TTT AGC AAG AAT AAA TTA AAA TGG (Cs6; SEC ID Nº 12) utilizando como molde ADN genómico de C. sonorensis. La PCR se llevó a cabo incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 5 minutos a 95ºC, seguido por 29 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, con una incubación final a 72ºC durante 10 minutos. El fragmento producto de la PCR fue digerido con ApaI y el fragmento de 800 pb fue purificado y ligado con el pMI256 de 9760 pb linealizado con ApaI (ver el apartado "Vectores y Células Huésped" anterior; Fig. 18). El plásmido resultante fue denominado pMI257 y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 10. El pMI257 contiene, en orden, el promotor de PDC1 de C. sonorensis, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de MEL5 de S. cerevisiae, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al LDH de L. helveticus y al terminador de CYC1 de S. cerevisiae, seguido por el terminador de PDC1 de C. sonorensis.

El pMI257 fue digerido con NotI para cortar el fragmento de 7300 pb que contenía los casetes de expresión de MEL5 y LDH flanqueados por las regiones 5' y 3' de PDC1. Este fragmento de 7300 pb fue utilizado para transformar C. sonorensis mediante el método descrito en el Ejemplo 1 anterior, y los transformantes fueron sometidos a selección sobre la base de la expresión del marcador MEL5. Los transformantes fueron cultivados en placas de agar YPD suplementado con el sustrato cromogénico de la \alpha-galactosidasa, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\alpha-D-galactopiranósido (X-\alpha-gal; ICN Biochemicals) a una concentración de 40 \mug/ml. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante 1-3 días y transferidas posteriormente a 4ºC. En presencia de X-\alpha-gal, las colonias de levadura transformadas con un casete de expresión funcional de MEL5 se volvían azules, mientras que las colonias no transformadas eran blancas. Las colonias azules fueron purificadas mediante la resiembra en estrías de las mismas en placas indicadoras nuevas. Los transformantes que se originaron de la transformación de C. sonorensis con pMI257 digerido con NotI fueron denominados como 257-1 a 257-15, 257-41, 257-42 y 257-45.

El análisis de transferencia Southern del ADN genómico aislado de los transformantes con pMI257 se llevó a cabo con la sonda de PDC1 de C. sonorensis con el fin de identificar los transformantes en los cuales había tenido lugar la sustitución anticipada del marco de lectura abierto de PDC1 por el ADN de pMI257 transformado. La ausencia de una banda de hibridación de PDC1 en los transformantes 257-3, 257-9, 257-12, 257-15 y 257-41 indicaba que el gen de PDC1 había sido eliminado. Otros transformantes con pMI257 y C. sonorensis dieron una señal positiva en la hibridación con PDC1. La hibridación con la sonda de LDH de L. helveticus mostró que el gen de LDH estaba presente en una copia en los transformantes en los que se había eliminado pdc1. Los transformantes 257-6, 257-7 y 258-8 contenían dos copias del LDH de L. helveticus integradas aleatoriamente en el genoma. Otros transformantes con pMI257 tenían una copia de LDH integrada aleatoriamente en el genoma.

Estos resultados muestran que la integración dirigida del ADN de pMI257 transformado en el locus de PDC1 tenía lugar mediante recombinación homóloga entre las secuencias promotoras y terminadoras de PDC1. Estos resultados muestran también que PDC1 es un gen de una sola copia en C. sonorensis. Además, tuvieron lugar acontecimientos de integración fuera del locus de PDC1. En algunos transformantes, el gen de LDH se había integrado en el genoma con más de una copia.

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Ejemplo 4

Vectores para la expresión de LDH de B. megaterium y para la integración dirigida del ADN transformado en el locus de PDC1

Se prepararon vectores que contenían el gen de LDH de B. megaterium para la integración dirigida en el locus del gen de PDC1 de C. sonorensis, según sigue. En estos vectores, el LDH de L. helveticus de pMI257 fue sustituido por el LDH de B. megaterium.

El pMI257 fue linealizado con NcoI y los salientes 5' fueron rellenados parcialmente con ADN polimerasa I, fragmento Klenow, y una mezcla de dATP, dCTP y dTTP, omitiendo dGTP de la reacción. Esto fue seguido por la eliminación de las extensiones monocatenarias mediante tratamiento con nucleasa de frijol chino. El ADN fue digerido posteriormente con BamHI y el fragmento de 9200 pb fue aislado de un gel de agarosa al 0,8% después de la separación electroforética. El vector pVR24, que contenía LDH de B. megaterium, fue generado a partir de ADN genómico de B. megaterium y está mostrado en la Fig. 21. El gen de la LDH fue clonado a partir del ADN genómico mediante PCR utilizando cebadores diseñados a partir del Nº de Acceso M22305 y ligado en un vector disponible comercialmente (ver el apartado "Vectores y Células Huésped" anterior). El fragmento de 976 pb que contenía el LDH de B. megaterium fue cortado de pVR24 mediante digestión con XbaI, seguido por el rellenado de los salientes 5' con ADN polimerasa I, fragmento Klenow, y cada uno de los 4 dNTPs, y digestión con BamHI. El fragmento NcoI(romo)-BamHI de 9200 pb procedente de pMI257 y el fragmento XbaI(romo)-BamHI de 976 pb procedente de pVR24 fueron ligados y el plásmido resultante fue denominado pMI265 y está mostrado en la Fig. 11. El pMI265 contiene, en orden, el promotor de PDC1 de C. sonorensis, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de MEL5 de S. cerevisiae, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de LDH de B. megaterium y el terminador de PDC1 de C. sonorensis. El pMI265 fue digerido con NotI para cortar el fragmento de 7300 pb que constaba de los casetes de expresión de MEL5 y LDH flanqueados por las regiones 5' y 3' de PDC1. Este fragmento de 7300 pb fue utilizado para transformar C. sonorensis según se describió en el Ejemplo 1, y los transformantes fueron sometidos a selección en placas de YPD suplementado con X-\alpha-gal a una concentración de 40 \mug/ml. Los transformantes fueron cultivados en placas de agar YPD suplementado con X-\alpha-gal (40 \mug/ml). Los transformantes que se originaron de la transformación de C. sonorensis con pMI265 digerido con NotI fueron denominados 265-1 a 265-60.

Se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern del ADN genómico aislado de los transformantes con pMI265 con la sonda de PDC1 de C. sonorensis para identificar los transformantes en los cuales había tenido lugar la sustitución anticipada del marco de lectura abierto de PDC1 por el ADN de pMI265 transformado. La ausencia de una banda de hibridación de PDC1 en los transformantes 265-5, 265-7, 265-15, 265-17, 265-33, 265-34, 265-35, 265-38, 265-39, 265-42, 265-43, 265-47, 265-48, 265-49, 265-51 y 257-60 indicaba que el gen de PDC1 había sido eliminado. Otros transformantes de C. sonorensis con pMI265 y C. sonorensis sin transformar daban una señal positiva para la hibridación con PDC1. La hibridación con la sonda de LDH de B. megaterium mostraba que el gen de LDH estaba presente en una copia en los transformantes en los que se había eliminado pdc1. Los transformantes 265-14, 265-22 y 265-23, que hibridaban positivamente con PDC1, contenían dos copias y 265-56 contenía tres copias del gen de LDH integradas aleatoriamente en el genoma. Otros transformantes con pMI265 tenían una copia de LDH integrada aleatoriamente en el genoma.

Estos resultados mostraban que la integración dirigida del ADN de pMI265 transformado en el locus de PDC1 tenía lugar mediante recombinación homóloga entre secuencias promotoras y terminadoras de PDC1. Estos resultados confirmaban también que PDC1 es un gen con una sola copia en C. sonorensis. Los transformantes en los que se había eliminado pdc1 eran viables, indicando que PDC1 no es un gen esencial en C. sonorensis. Además de las integraciones que eliminaban PDC1, tenían lugar acontecimientos de integración fuera del locus de PDC1 en ciertos transformantes. En algunos transformantes, el gen de LDH se había integrado en el genoma con más de una copia.

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Ejemplo 5

Vectores para la expresión de LDH de R. oryzae y para la integración dirigida del ADN transformado en el locus de PDC1

Se prepararon vectores que contenían el gen de LDH de R. oryzae para la integración dirigida en el locus del gen de PDC1 de C. sonorensis, según sigue. En estos vectores, las secuencias que codificaban LDH de L. helveticus en pMI257 fueron sustituidas por LDH de R. oryzae.

El plásmido pMI257 descrito en el Ejemplo 3 anterior fue linealizado con NcoI y los salientes 5' fueron rellenados parcialmente con ADN polimerasa I, fragmento Klenow, y con una mezcla de dATP, dCTP y dTTP, omitiendo de la reacción dGTP. Esto fue seguido por la eliminación de las extensiones monocatenarias mediante tratamiento con nucleasa de frijol chino. El ADN fue digerido posteriormente con BamHI y el fragmento de 9200 pb fue aislado de un gel de agarosa al 0,8% después de la separación electroforética. La secuencia codificadora de ADN que codificaba LDH de R. oryzae estaba unida operativamente al promotor de PGK1 de C. sonorensis y al terminador transcripcional del gen de PDC1 de C. sonorensis. Se generó el vector pVR27 que contenía LDH de R. oryzae a partir del ADN genómico de R. oryzae, y está mostrado en la Fig. 22. El gen de la LDH fue clonado a partir del ADN genómico mediante PCR utilizando cebadores diseñados a partir del Nº de Acceso AF226154 y ligado en un vector disponible comercialmente (ver el apartado "Vectores y Células Huésped" anterior). El fragmento de 978 pb que contenía el gen de LDH de R. oryzae fue cortado de pVR27 mediante digestión con XbaI, seguido por el rellenado de los salientes 5' con ADN polimerasa I, fragmento Klenow, y cada uno de los 4 dNTPs, y digestión con BamHI. El fragmento NcoI(romo)-BamHI de 9200 pb de pMI257 y el fragmento XbaI(romo)-BamHI de 978 pb de pVR27 fueron ligados y el plásmido resultante fue denominado pMI266 y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 12. El pMI266 contiene, en orden, el promotor de PDC1 de C. sonorensis, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de MEL5 de S. cerevisiae, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de LDH A de R. oryzae y el terminador de PDC1 de C. sonorensis. El pMI266 fue digerido con NotI para cortar un fragmento de 7300 pb que constaba de los casetes de expresión de MEL5 y LDH flanqueados por las regiones 5' y 3' de PDC1. Este fragmento de 7300 pb fue utilizado para transformar C. sonorensis mediante el método descrito en el Ejemplo 1 anterior, y los transformantes fueron sometidos a selección en placas de YPD suplementadas con X-\alpha-gal a una concentración de 40 \mug/ml. Los transformantes que se originaron de la transformación de C. sonorensis con pMI266 digerido con NotI fueron denominados 266-1 a 266-13.

Se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern del ADN genómico aislado de los transformantes con pMI266 mediante la sonda de PDC1 de C. sonorensis, para identificar los transformantes en los cuales había tenido lugar la sustitución anticipada del marco de lectura abierto de PDC1 por el ADN de pMI266 transformado. La ausencia de una banda de hibridación de PDC1 en los transformantes 266-1, 266-3, 266-4 y 266-11 indicaba que el gen de PDC1 había sido eliminado. En contraste, los transformantes con pMI266 266-2, 266-7 y 266-8 y C. sonorensis sin transformar daban una señal positiva en la hibridación de PDC1. La hibridación con la sonda de LDH mostró que el gen de LDH de R. oryzae estaba presente en todos los transformantes con una sola copia.

Estos resultados mostraban que la integración dirigida del ADN de pMI266 transformado en el locus de PDC1 tenía lugar mediante recombinación homóloga entre secuencias promotoras y terminadoras de PDC1. Además, tenían lugar acontecimientos de integración fuera del locus de PDC1.

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Ejemplo 6

Vector para la sustitución de PDC1 sin LDH

Se prepararon vectores para sustituir PDC1 sin la introducción de secuencias exógenas codificadoras de LDH. El plásmido pMI257 descrito en el Ejemplo 3 anterior fue digerido con NcoI y BamHI con el fin de eliminar el gen de LDH y el terminador de CYC1 de S. cerevisiae. Los salientes 5' fueron rellenados con ADN polimerasa I, fragmento Klenow, y cada uno de los 4 dNTPs. El fragmento de 9200 pb fue purificado después de electroforesis en gel de agarosa y recircularizado mediante incubación a una concentración de 40 \mug/ml en presencia de 400 U de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs) y el tampón apropiado recomendado por el fabricante. El plásmido resultante fue denominado pMI267 y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 13. El pMI267 contiene, en orden, el promotor de PDC1 de C. sonorensis, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de MEL5 de S. cerevisiae y el terminador de PDC1 de C. sonorensis.

El pMI267 fue digerido con NotI para cortar el fragmento de 6300 pb que constaba del casete de MEL5 flanqueado por las regiones 5' y 3' de PDC1. Este fragmento de 6300 pb fue utilizado para transformar C. sonorensis mediante el método descrito en el Ejemplo 1 anterior, y los transformantes fueron seleccionados en placas de YPD suplementado con X-\alpha-gal a una concentración de 40 \mug/ml. Los transformantes que se originaron de la transformación de C. sonorensis con pMI267 digerido con NotI fueron denominados 267-1 a 267-10.

Se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern del ADN genómico aislado de los transformantes con pMI267 con la sonda de PDC1 de C. sonorensis para identificar los transformantes en los que se había eliminado el marco de lectura abierto de PDC1. La ausencia de una banda de hibridación de PDC1 en los transformantes 267-1 y 267-10 indicaba que se había eliminado el gen de PDC1.

Estos resultados mostraban que la integración dirigida del ADN de pMI267 transformado en el locus de PDC1 tenía lugar mediante recombinación homóloga entre secuencias promotoras y terminadoras de PDC1. No se requería la expresión de LDH para mantener la viabilidad de la cepa en la que se había eliminado pdc1. Además, tuvieron lugar acontecimientos de integración fuera del locus de PDC1.

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Ejemplo 7

Construcción de un vector de C. sonorensis que contenía el gen de LDH de B. megaterium y el marcador G418

Se preparó un vector que contenía el gen de resistencia a G418 y el gen de LDH de B. megaterium, según sigue. En estos vectores, el casete de expresión de LDH de B. megaterium del plásmido pMI265 y el casete del marcador de resistencia a G418 del plásmido pMI269 estaban combinados en el mismo vector. El plásmido pMI269 descrito en el Ejemplo 1 fue digerido con EcoRI y los salientes 5' fueron rellenados con ADN polimerasa I, fragmento Klenow, y cada uno de los 4 dNTPs, seguido por digestión del ADN con BamHI. El fragmento EcoRI(romo)-BamHI de 4800 pb de pMI269 fue ligado con el fragmento MscI-BamHI de 2800 pb del plásmido pMI265 descrito en el Ejemplo 4. El plásmido resultante fue denominado pMI278 y contiene, en orden, el promotor de TDH1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de resistencia a G418 y al terminador de MEL5, seguido por el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de LDH de B. megaterium y al terminador de GAL10 de S. cerevisiae, y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 14.

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Ejemplo 8

Construcción de cepas de C. sonorensis que expresaban simultáneamente LDH de R. oryzae y LDH de B. megaterium

Se eligió el transformantes de C. sonorensis denominado 266-3, en el cual el gen de LDH de R. oryzae está integrado en el locus de pdc1, como huésped para una segunda transformación con la construcción de LDH de B. megaterium descrita en el Ejemplo 4 anterior. El transformante 266-3 fue además transformado con pMI278 digerido con SalI-NotI y los transformantes fueron seleccionados en placas de agar YPD suplementado con el antibiótico G418 a una concentración de 200 \mug/ml. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante 2-5 días para la selección; los transformantes fueron purificados mediante resiembra en estría en placas de selección nuevas. Los transformantes resultantes fueron denominados 278-1 a 278-20. La presencia de LDH de B. megaterium en el genoma de 19 de estos transformantes fue verificada mediante análisis de transferencia Southern de ADN de levadura digerido con HindIII, utilizando como sonda el gen de LDH de B. megaterium. Algunos de los transformantes tenían más de una copia del gen de LDH de B. megaterium integrada en el genoma. El análisis de transferencia Southern fue repetido con el gen de LDH de R. oryzae como sonda con el fin de verificar que el gen de LDH de R. oryzae estaba todavía presente.

Este experimento mostró que C. sonorensis podía ser transformada de manera múltiple e independiente con diferentes marcadores. De esta forma se demostró que era posible incrementar el número de copias del gen de interés (LDH) en el genoma del huésped.

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Ejemplo 9

Vectores para la expresión de LDH de B. megaterium y para la integración dirigida del ADN transformado en el locus de PDC2

Se prepararon vectores que contenían el gen de LDH de B. megaterium para la integración dirigida en el locus del gen de PDC2 de C. sonorensis, según sigue. El promotor de PDC2 de C. sonorensis fue amplificado mediante PCR utilizando la polimerasa Dynazyme EXT y un par de cebadores oligonucleotídicos que tenían la secuencia: GGG ACG GGC CCG CGG CCG CTT ACA GCA GCA AAC AAG TGATGCC (Cs26; SEC ID Nº 13) y CCC TGG GCC CCT CGA GTT TGA TTT ATT TGC TTT GTA AAGAGAA (Cs27; SEC ID Nº 14). La copia genómica del PDC2 de C. sonorensis clonada en un vector lambda fue utilizada como molde (ver anteriormente). La PCR se llevó a cabo incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 3 minutos a 94ºC, seguido por 29 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, con una incubación final a 72ºC durante 10 minutos. El producto de la PCR de 1000 pb fue clonado en el vector TOPO TA (Invitrogen) y el plásmido resultante fue denominado pMI277, y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 19. El promotor de PDC2 fue liberado mediante digestión con EcoRI y se hizo de extremos romos con la polimerasa Klenow y cada uno de los 4 dNTPs.

El plásmido pMI278 preparado según se describió en el Ejemplo 7, fue linealizado con SalI y los salientes 5' fueron rellenados con la polimerasa Klenow y cada uno de los 4 dNTPs, y posteriormente fue ligado al fragmento de EcoRI (romo) de 1000 pb del plásmido pMI277. El plásmido que contenía el inserto en la orientación deseada fue denominado pMI279 y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 20.

El terminador de PDC2 fue amplificado por PCR utilizando la polimerasa Dynazyme EXT con un par de cebadores oligonucleotídicos que tenían la secuencia: TGGACTAGTTAGATAG CAA TTC TTA CTT GAA AAA TTA ATT GAA GCA TTACC (Cs29; SEC ID Nº 15) y GGC CCG CGG CCG CTA AAT ATA ATT ATC GCT TAG TTA TTA AAA TGG (Cs30; SEC ID Nº 16), utilizando como molde la copia genómica del gen de PDC2 de C. sonorensis clonado en un vector lambda. El fragmento terminador de pdc2 incluye parte del marco de lectura abierto correspondiente a los 239 aminoácidos C-terminales. Se introdujeron codones de parada de la traducción en el oligonucleótido Cs29 de la PCR en los tres marcos corriente arriba de los nucleótidos correspondientes a los últimos 239 aminoácidos C-terminales de la proteína en el fragmento terminador. La PCR se llevó a cabo incubando inicialmente la mezcla de reacción durante 3 minutos a 94ºC, seguido por 29 ciclos de 45 segundos a 94ºC, 45 segundos a 55ºC, 2 minutos a 72ºC, con una incubación final a 72ºC durante 10 minutos. El producto de la PCR se hizo de extremos romos con la polimerasa Klenow y cada uno de los 4 dNTPs, y se purificó con una columna Qiaquick (Qiagen). El producto de la PCR fue fosforilado con polinucleótido quinasa de T4 y ATPr a una concentración de 1 mM bajo condiciones estándar (ver Sambrook y col., Id.). El fragmento terminador de PDC2 de 800 pb fue purificado después de electroforesis en gel de agarosa y ligado con pMI279 digerido con NcoI (romo), el cual fue desfosforilado con fosfatasa intestinal de ternera. El plásmido resultante fue denominado pMI286 y contiene, en orden, el promotor de PDC2 de C. sonorensis, el promotor de TDH1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de resistencia a G418 y el terminador de MEL5 de S. cerevisiae, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de LDH de B. megaterium, el terminador de GAL10 de S. cerevisiae seguido por el terminador de PDC2 de C. sonorensis. Esta construcción está mostrada esquemáticamente en la Fig. 15.

El plásmido pMI286 fue digerido con NotI para cortar el fragmento de 6400 pb que constaba de los casetes de expresión del gen de resistencia a G418 y del gen de LDH flanqueados por las regiones 5'y 3' de PDC2. Este fragmento de 6400 pb fue utilizado para transformar C. sonorensis mediante el método descrito en el Ejemplo 1 anterior. Los transformantes fueron cultivados en placas de agar YPD suplementado con el antibiótico G418 a una concentración de 200 \mug/ml. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante 2-5 días y los transformantes fueron posteriormente resembrados en estría en placas de selección nuevas. Los transformantes fueron denominados 281-1 a 286-40.

Se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern del ADN genómico aislado de los transformantes con pMI286 con la sonda de PDC2 de C. sonorensis (correspondiente a los nucleótidos del área eliminada) con el fin de identificar los transformantes en los cuales el LDH de B. megaterium se había integrado en el locus de PDC2. La ausencia de una banda de hibridación de PDC2 en los transformantes 286-1, 286-2, 286-4, 286-19 y 286-30 indicaba que el gen de PDC2 había sido eliminado. Otros transformantes con pMI286 y C. sonorensis no transformadas daban una señal positiva en la hibridación de PDC2. La hibridación con la sonda de LDH de B. megaterium mostró que el gen de LDH estaba presente en una copia en los transformantes en los que se había eliminado pdc2. La frecuencia de la integración dirigida en el locus de PDC2 fue del 15%.

Estos resultados mostraban que la integración dirigida del ADN de pMI286 transformado en el locus de PDC2 tenía lugar mediante recombinación homóloga entre secuencias promotoras de PDC2 y secuencias terminadoras de PDC2. Estos resultados muestran también que el PDC2 es un gen de una sola copia en C. sonorensis. Además, tuvieron lugar acontecimientos de integración fuera de PDC2. En algunos transformantes el gen de LDH se había integrado en el genoma con más de una copia.

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Ejemplo 10

Construcción de cepas de C. sonorensis en las que se había eliminado pdc1 y se había alterado pdc2 y que albergaban dos copias de LDH de B. megaterium integradas en el genoma en los loci de pdc1 y pdc2

Se eligió el transformante 265-15 de C. sonorensis que tenía LDH de B. megaterium integrado en el locus de PDC1 como huésped para una segunda transformación con LDH de B. megaterium. El transformante 265-15 fue transformado además con pMI286 digerido con NotI utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1 anterior, y los transformantes fueron seleccionados en placas de agar YPD suplementado con el antibiótico G418 a una concentración de 200 \mug/ml. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante 2-5 días para la selección, y los transformantes obtenidos de este modo fueron purificados mediante resiembra en estría de los mismos en placas de selección nuevas. Los transformantes fueron denominados C44/286-1 a C44/286-40.

La alteración del gen pdc2 fue verificada utilizando la sonda de PDC2 (correspondiente a los nucleótidos del área eliminada). La ausencia de una banda de hibridación de PDC2 en los transformantes C44/286-10, C44/286-26, C44/286-27, C44/286-28, C44/286-29, C44/286-30, C44/286-31, C44/286-32 y C44/286-33, indicaba que se había eliminado el gen de PDC2. La presencia del gen de LDH de B. megaterium con dos copias en el genoma de los transformantes que tenían la doble deleción de pdc1 y pdc2 fue verificada mediante análisis Southern de ADN de levadura digerido con HindIII, utilizando como sonda el gen de LDH de B. megaterium.

Estos resultados mostraban que la integración dirigida del ADN de pMI286 transformado en el locus de PDC2 tenía lugar mediante recombinación homóloga entre secuencias del promotor de PDC2 y del terminador de PDC2. Estos resultados confirman también que el gen de PDC2 es un gen de una sola copia en C. sonorensis, y que pueden tener lugar acontecimientos de integración fuera del locus de PDC2. En algunos transformantes, el gen de LDH se había integrado en el genoma con más de una copia. Los transformantes en los que simultáneamente se había eliminado pdc1 y se había alterado pdc2 eran viables.

Este Ejemplo confirmaba también que C. sonorensis puede ser transformada de manera múltiple e independiente cuando se utilizan diferentes marcadores. De esta forma es también posible incrementar el número de copias del gen de interés (LDH) en el genoma del huésped.

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Ejemplo 11

Producción de etanol por las cepas pdc1-pdc2-

Se analizó la producción de etanol en cepas de Candida portadoras de deleciones o alteraciones en los genes de PDC1 y/o PDC2, según sigue. Los transformantes denominados C44/286-10, C44/286-26 y C44/286-33 y cuatro cepas más incluidas como controles fueron cultivados en 50 ml de YP + 5% de glucosa en matraces de 250 ml de un agitador, agitados a 250 rpm y a una temperatura de 30ºC. Se retiraron muestras diariamente y las células fueron extraídas por centrifugación. Muestras del sobrenadante del cultivo tomadas 56 horas después de la inoculación fueron analizadas para determinar etanol mediante el método UV para etanol de Boehringer Mannheim (Tabla 1). Estos resultados mostraban que la producción de etanol por los transformantes en los que se había eliminado pdc1 y pdc2 se había reducido más de diez veces en comparación con las cepas que contenían el gen de PDC1 o el gen de PDC2 intactos.

Estos resultados demostraban que PDC1 y PDC2 codificaban ambos piruvato descarboxilasas funcionales, ya que la drástica reducción de la producción de etanol se observaba únicamente cuando ambos genes habían sido eliminados simultáneamente. Los resultados indicaban también que la alteración de PDC2 que eliminaba el 60% aproximadamente del marco de lectura abierto de PDC2 suprimía la función PDC2.

TABLA 1 Producción de etanol por transformantes de C. sonorensis en YP + 5% de glucosa a las 56 horas de cultivo

3

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Ejemplo 12

Vector para la alteración de PDC2 sin LDH

Se prepararon vectores para sustituir PDC2 sin introducir secuencias exógenas codificadoras de LDH. El gen de LDH de B. megaterium fue eliminado del plásmido pMI286 descrito en el Ejemplo 9 como un fragmento SpeI-XbaI de 1276 pb. El pMI286 fue digerido con SpeI y la molécula linealizada digerida parcialmente con XbaI. El fragmento SpeI-XbaI de 8100 pb fue aislado después de la electroforesis en gel y recircularizado. El plásmido resultante, denominado pMI287, consta de, en orden, el promotor de PDC2 de C. sonorensis, el promotor de TDH1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de resistencia a G418 y al terminador de MEL5 de S. cerevisiae, el promotor de PGK1 de C. sonorensis seguido por el terminador de PDC2 de C. sonorensis, y está mostrado esquemáticamente en la
Fig. 16.

El pMI287 fue digerido con NotI para cortar el fragmento de 5100 pb que constaba del casete de expresión de G418 flanqueado por las regiones 5' y 3' de PDC2. Este fragmento de 5100 pb fue utilizado para transformar C. sonorensis mediante los métodos descritos en el Ejemplo 1 anterior. Los transformantes fueron cultivados en placas de agar YPD suplementado con el antibiótico G418 a una concentración de 200 \mug/ml. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante 2-5 días y los transformantes fueron posteriormente resembrados en estría en placas de selección nuevas.

Los transformantes fueron denominados 287-1 a 287-57. Se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern de ADN genómico aislado de los transformantes con pMI287 utilizando una sonda de PDC2 que correspondía a los nucleótidos de la región eliminada, con el fin de identificar los transformantes con éxito. No se observó ninguna banda de hibridación de PDC2 en los transformantes 287-6 y 287-16, indicando que el gen de PDC2 había sido eliminado.

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Ejemplo 13

Vectores para la expresión de LDH de L. helveticus y para la integración dirigida del ADN transformado en el locus de PDC2

Con el fin de sustituir las secuencias que codificaban LDH de B. megaterium en pMI286 por el ADN que codificaba LDH de L. helveticus, el pMI286 descrito en el Ejemplo 9 fue digerido con el enzima de restricción SpeI y se hizo de extremos romos con ADN polimerasa I, fragmento Klenow, y cada uno de los cuatro dNTPs y posteriormente fue digerido con BspMI. El plásmido pMI247 mostrado en la Fig. 9 fue digerido con BamHI y se hizo de extremos romos con ADN polimerasa I, fragmento Klenow, y cada uno de los cuatro dNTPs y posteriormente fue digerido con BspMI. El fragmento SpeI(romo)-BspMI de 6800 pb de pMI286 y el fragmento BamHI(romo)-BspMI de 2700 pb de pMI247 fueron ligados. El plásmido resultante, denominado pMI288, consta de, en orden, el promotor de PDC2 de C. sonorensis, el promotor de TDH1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de resistencia a G418 y al terminador de MEL5 de S. cerevisiae, el promotor de PGK1 de C. sonorensis unido operativamente al gen de LDH de L. helveticus y al terminador de CYC1 de S. cerevisiae, seguido por el terminador de PDC2 de C. sonorensis, y está mostrado esquemáticamente en la Fig. 17.

El pMI288 fue digerido con NotI para cortar el fragmento de 6400 pb que constaba de los casetes de expresión del gen de resistencia a G418 y del gen de LDH flanqueados por las regiones 5' y 3' de PDC2. El transformante de C. sonorensis denominado 257-3, que tenía el gen de LDH de L. helveticus integrado en el locus de pdc1, fue seleccionado como huésped para una segunda transformación con el gen de LDH de L. helveticus. El transformante 257-3 fue transformado además con el fragmento de NotI de 6400 pb de pMI288 mediante los métodos descritos en el Ejemplo 1 anterior. Los transformantes fueron seleccionados en placas de agar YPD suplementado con el antibiótico G418 a una concentración de 200 \mug/ml. Las placas fueron incubadas a 30ºC durante 2-5 días, y los transformantes obtenidos de este modo fueron purificados mediante resiembra en estría de los mismos en placas de selección nuevas. Estos transformantes fueron denominados C40/288-1 a C40/288-40.

La alteración del gen pdc2 fue verificada utilizando una sonda de PDC2 correspondiente a los nucleótidos del área eliminada del locus. La ausencia de una banda de hibridación de PDC2 en los transformantes C40/288-2, C40/288-11, C40/288-29, C40/288-34 y C40/288-38, indicaba que el gen de PDC2 había sido eliminado. La presencia del gen de LDH de L. helveticus con dos copias en el genoma de los transformantes con la doble deleción de pdc1 y pdc2 fue verificada mediante análisis de transferencia Southern de ADN de levadura digerido con HindIII utilizando como sonda el gen de LDH de L. helveticus.

Estos resultados demostraban que se había conseguido la integración dirigida de secuencias del gen de LDH exógenas en el locus de PDC2 de C. sonorensis, y proporcionaron células con loci de PDC2 alterados.

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Ejemplo 14

Producción de ácido L-láctico en medio definido o rico en glucosa en cultivos aeróbicos en tubo de ensayo por C. sonorensis que albergaba el gen de LDH de L. helveticus o de B. megaterium integrado en el genoma

Células de C. sonorensis y los transformantes descritos en los Ejemplos anteriores (concretamente, 246-27, 247-11, 265-03, 265-05, 265-06, 265-07, 265-11, 265-12, 265-14, 265-15, 265-17, 265-18, 265-22, 265-23, 265-29, 265-33, 265-34, 265-35, 265-38, 265-39, 265-42, 265-43, 265-44, 265-45, 265-46, 265-47, 265-48, 265-49, 265-51, 265-52, 265-55, 265-56, 265-57 y 265-60) fueron cultivados en medio YPD (YP suplementado con un 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5) o en medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 2% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5). Dos colonias independientes de cada transformante fueron inoculadas en un tubo de plástico desechable de 14 ml que contenía 5 ml de medio YPD o de medio YD y cultivadas a 30ºC con una agitación de 250 rpm. Se recogieron muestras durante el cultivo, se midió la DO_{600}, se extrajeron las células por centrifugación y se analizó el sobrenadante del cultivo mediante HPLC para determinar ácido láctico, glucosa y etanol. Los análisis de HPLC se llevaron a cabo con una bomba de HPLC Waters 510, un automuestrador Waters 717+ y un complejo de cromatografía líquida Waters System Interfase Module con detector del índice de refracción (Refractómetro Diferencial Waters 410) y un detector UV (detector de \lambda UV dual Waters 2487). Se utilizó una Columna de Exclusión de Iones Aminex HPX-87H (300 mm x 7,8 mm, Bio-Rad) y se equilibró con H_{2}SO_{4} 5 mM en agua a 35ºC, y las muestras se eluyeron con H_{2}SO_{4} 5 mM en agua a una velocidad de flujo de 0,6 ml/minuto. La adquisición y el control de datos se llevaron a cabo utilizando el programa de ordenador Millennium de Waters. Los valores son la media de dos muestras independientes. Estos resultados están mostrados en las Tablas 2 y 3.

Después de 13 horas de cultivo en medio definido, los transformantes 246-27 y 247-11 que albergaban el gen de LDH de L. helveticus produjeron 0,1-0,4 g/l de ácido láctico; después de 19 horas se produjeron 1,8-3,9 g/l de ácido láctico.

Después de 13 horas de cultivo en medio definido, los transformantes 265-03, 265-06, 265-11, 265-12, 265-18, 265-29, 265-44, 265-45, 265-46, 265-52, 265-55 y 265-57, que albergaban el gen de LDH de B. megaterium integrado en un sitio desconocido del genoma con una sola copia, produjeron 0,5-1,9 g/l de ácido láctico; después de 19 horas se produjeron 4,0-6,3 g/l de ácido láctico.

Después de 13 horas de cultivo en medio definido, los transformantes 265-14, 265-22 y 265-23, que albergaban dos copias del gen de LDH de B. megaterium integradas en un lugar desconocido del genoma, produjeron 0,5-1,2 g/l de ácido láctico; después de 19 horas se produjeron 3,8-6,1 g/l de ácido láctico.

Después de 13 horas de cultivo en medio definido, el transformante 265-56, que albergaba tres copias del gen de LDH de B. megaterium produjo 0,7 g/l de ácido láctico; después de 19 horas se produjeron 5,2 g/l de ácido láctico.

Después de 13 horas de cultivo en medio definido, los transformantes 265-05, 265-07, 265-15, 265-17, 265-33, 265-34, 265-35, 265-38, 265-39, 265-42, 265-43, 265-47, 265-48, 265-49, 265-51 y 265-60, que albergaban el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus del gen pdc1 (genotipo pdc1-), produjeron 0,4-2,7 g/l de ácido láctico; después de 19 horas se produjeron 3,4-7,5 g/l de ácido láctico.

Después de 12 horas de cultivo en medio rico, los transformantes 246-27 y 247-11, que albergaban el gen de LDH de L. helveticus, produjeron 0,5-1,7 g/l de ácido láctico, y después de 17 horas produjeron 3,7-6,1 g/l de ácido láctico. En comparación, la cepa huésped produjo 0,1 g/l de ácido láctico después de 17 horas de cultivo.

Después de 12 horas de cultivo en medio rico, los transformantes 265-03, 265-06, 265-11, 265-12, 265-18, 265-29, 265-44, 265-45, 265-46, 265-52, 265-55 y 265-57, que albergaban el gen de LDH de B. megaterium, produjeron 1,4-4,3 g/l de ácido láctico, y después de 17 horas produjeron 7,2-9,8 g/l de ácido láctico.

Después de 12 horas de cultivo en medio rico, los transformantes 265-14, 265-22 y 265-23, que albergaban dos copias del gen de LDH de B. megaterium, produjeron 2,1-1,9 g/l de ácido láctico, y produjeron 6,3-6,8 g/l de ácido láctico después de 17 horas.

Después de 12 horas de cultivo en medio rico, el transformante 265-56, que albergaba tres copias del gen de LDH de B. megaterium, produjo 2,6 g/l de ácido láctico, y después de 17 horas produjo 7,5 g/l de ácido láctico.

Después de 12 horas de cultivo en medio rico, los transformantes 265-05, 265-07, 265-15, 265-17, 265-33, 265-34, 265-35, 265-38, 265-39, 265-42, 265-43, 265-47, 265-48, 265-49, 265-51 y 265-60, que albergaban el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus del gen pdc1 (genotipo pdc1-), produjeron 2,0-4,7 g/l de ácido láctico y, después de 17 horas, produjeron 7,1-10,7 g/l de ácido láctico.

Estos resultados muestran que los transformantes con LDH producían ácido láctico cuando la cepa huésped no lo hacía. Los genes de LDH de B. megaterium y L. helveticus demostraron ser activos en C. sonorensis. Estos genes de LDH heterólogos pueden por tanto competir eficazmente por piruvato en presencia de PDC. La deleción de pdc1 no parecía tener efecto sobre el rendimiento y la producción total de lactato. La glucosa residual era más elevada, y la concentración de etanol era más baja, en los transformantes que contenían dos (265-14, 265-22, 265-23) o tres (265-56) copias. Un número de copias de LDH más elevado tenía también como resultado una mayor producción de ácido láctico a partir de glucosa, menos producción de etanol y una mayor proporción de ácido láctico respecto a etanol. La biomasa (DO_{600}) aumentaba menos en las cepas que contenían más de una copia del gen de LDH de B. megaterium.

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TABLA 2 DO_{600}, glucosa residual, producción de ácido láctico y etanol por C. sonorensis y los transformantes con LDH en medio definido

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TABLA 3 DO_{600}, glucosa residual, producción de ácido láctico y etanol por C. sonorensis y los transformantes con LDH en medio rico

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Ejemplo 15

Producción de ácido L-láctico en medio definido o rico en glucosa en cultivos aeróbicos en tubo de ensayo por C. sonorensis que albergaba el gen de LDH de L. helveticus, B. megaterium o R. oryzae integrado en el genoma

Células de C. sonorensis y los transformantes anteriormente descritos (concretamente, 246-27, 247-11, 265-39, 265-5, 265-15, 265-44, 266-1, 266-2, 266-4, 266-6, 266-7, 266-8, 266-11, 278-2, 278-3, 278-4, 278-6, 278-7, 278-8, 278-9, 278-11, 278-12, 278-13, 278-14, 278-15, 278-17, 278-18, 278-19, 278-20, 257-3, 257-5, 257-6, 257-8, 257-9, 257-10, 257-11 y 257-12) fueron cultivados en medio YPD (YP suplementado con un 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5) o en medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 2% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5). Una colonia de cada transformante fue inoculada en un tubo de plástico desechable de 14 ml que contenía 5 ml de medio YPD o YD y cultivada con agitación a 250 rpm a 30ºC. Se recogieron muestran durante el cultivo a los puntos de tiempo de 12 y 17 horas, se midió la DO_{600}, se recogieron las células mediante centrifugación y el sobrenadante del cultivo se analizó mediante HPLC según se describió anteriormente para determinar ácido láctico, glucosa y etanol. Los análisis de HPLC se llevaron a cabo según se detalló anteriormente en el Ejemplo 14. Estos resultados están mostrados en las Tablas 4 y 5.

Después de 12 horas de cultivo en medio definido, los transformantes que albergaban el gen de LDH de L. helveticus produjeron 0,1-0,7 g/l de ácido láctico. En medio rico, 0,9-2,7 g/l de ácido láctico fueron producidos por estas células.

Después de 12 horas de cultivo en medio definido, los transformantes que albergaban el gen de LDH de B. megaterium produjeron 0,1-0,5 g/l de ácido láctico. En medio rico, 1,9-3,2 g/l de ácido láctico fueron producidos por estas células.

Después de 12 horas de cultivo en medio definido, los transformantes que albergaban el gen de LDH de R. oryzae produjeron 0,2-0,6 g/l de ácido láctico. En medio rico, 0,9-2,7 g/l de ácido láctico fueron producidos por estas células.

Después de 12 horas de cultivo en medio definido, los transformantes que albergaban el gen de LDH de R. oryzae integrado en el locus del gen pdc1 y el gen de LDH de B. megaterium, produjeron 0,1-0,9 g/l de ácido láctico. En medio rico, 1,0-3,3 g/l de ácido láctico fueron producidos por estas células.

Después de 17 horas de cultivo en medio definido, los transformantes que albergaban el gen de LDH de L. helveticus produjeron 0,9-2,1 g/l de ácido láctico. En medio rico, 6,6-9,9 g/l de ácido láctico fueron producidos por estas células.

Después de 17 horas de cultivo en medio definido, los transformantes que albergaban el gen de LDH de B. megaterium produjeron 0,8-1,7 g/l de ácido láctico. En medio rico, 8,7-11,0 g/l de ácido láctico fueron producidos por estas células.

Después de 17 horas de cultivo en medio definido, los transformantes que albergaban el gen de LDH de R. oryzae produjeron 0,7-1,3 g/l de ácido láctico. En medio rico, 7,3-9,5 g/l de ácido láctico fueron producidos por estas células.

Después de 17 horas de cultivo en medio definido, los transformantes que albergaban el gen de LDH de R. oryzae integrado en el locus del gen pdc1 y el gen de LDH de B. megaterium, produjeron 0,7-3,0 g/l de ácido láctico. En medio rico, 5,0-10,7 g/l de ácido láctico fueron producidos por estas células.

Estos resultados mostraban que los tres genes de LDH heterólogos eran todos activos en C. sonorensis y podían ser utilizados para producir ácido láctico. Estos genes de LDH pueden competir eficazmente por piruvato en presencia de PDC. La expresión de cualquiera de estos genes de LDH reducía la utilización de glucosa, el crecimiento y la producción de etanol, especialmente en medio rico. La reducción de la tasa de utilización de glucosa y del crecimiento era más potente en las cepas que contenían LDH de L. helveticus y más leve en las cepas que contenían LDH de R. oryzae, mientras que los transformantes que tenían LDH de B. megaterium mostraban un comportamiento intermedio. Los efectos estaban enmascarados por la presencia del gen de LDH de B. megaterium en los transformantes que contenían genes de LDH de dos orígenes.

TABLA 4 DO_{600}, glucosa residual, producción de ácido láctico y etanol por C. sonorensis y los transformantes con LDH en medio definido

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TABLA 5 DO_{600}, glucosa residual, producción de ácido láctico y etanol por C. sonorensis y los transformantes con LDH en medio rico

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Ejemplo 16

Producción de ácido L-láctico en medio con glucosa definido con o sin amortiguación en cultivos microaeróbicos en matraces con agitación por C. sonorensis que alberga el gen de LDH de B. megaterium o R. oryzae integrado en el genoma

Los transformantes de C. sonorensis que albergaban el gen de LDH de B. megaterium (concretamente, 265-23 y 265-55) o el gen de LDH de R. oryzae (266-8) fueron cultivados en medio con glucosa definido. Los precultivos fueron cultivados en medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5), las células fueron recogidas por centrifugación y resuspendidas en 50 ml de medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 10% de glucosa) hasta una DO_{600} de 15 para los experimentos de cultivo. Las levaduras fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer de 250 ml con o sin 4 g de CaCO_{3} con agitación a 100 rpm a 30ºC. Se recogieron muestras durante el cultivo, se midió la DO_{600} de los cultivos sin CaCO_{3} y las células se recogieron por centrifugación y el sobrenadante del cultivo se analizó para determinar ácido L-láctico (mediante el método UV para ácido L-láctico de Boehringer Mannheim, Roche) y glucosa (mediante el método de glucosa/GOD-Perid de Boehringer Mannheim, Roche). Estos resultados están mostrados en la Tabla 6.

Después de 24 horas de cultivo, el transformante 265-55 que albergaba el gen de LDH de B. megaterium produjo 35,7 g/l de ácido láctico con amortiguación mediante CaCO_{3} y 6,16 g/l de ácido láctico sin amortiguación cuando el pH disminuyó hasta 2,75. El transformante 265-23 que albergaba dos copias del gen de LDH de B. megaterium produjo 38,2 g/l de ácido láctico con amortiguación mediante CaCO_{3} y 6,81 g/l de ácido láctico sin amortiguación cuando el pH disminuyó hasta 2,68 (24 horas de cultivo). El transformante 266-8 que albergaba el gen de LDH de R. oryzae produjo 35,4 g/l de ácido láctico con amortiguación mediante CaCO_{3} y 3,05 g/l de ácido láctico sin amortiguación cuando el pH disminuyó hasta 2,83 (24 horas de cultivo).

Estos resultados demostraban que en presencia de CaCO_{3} a pH 6,5, la producción de ácido láctico y la utilización de glucosa eran mayores que en las condiciones sin amortiguación por debajo de pH 3. Se consiguieron títulos mayores de ácido láctico en presencia de CaCO_{3}.

TABLA 6 DO_{600}, glucosa residual (g/l) y producción de ácido láctico (g/l) por los transformantes con LDH en medio definido

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Ejemplo 17

Ácido láctico intracelular en cultivo amortiguado con CaCO_{3} y sin amortiguar

Aglutinados celulares de transformantes de C. sonorensis que albergaban el gen de LDH de B. megaterium (concretamente 265-23 y 265-55) o el gen de LDH de R. oryzae (266-8) cultivados en medio con glucosa definido, según se describió anteriormente en el Ejemplo 16, fueron analizados para determinar la concentración de ácido láctico intracelular. Se recogieron muestras (2 ml) durante el cultivo a las 8 horas y a las 24 horas, se midió la DO_{600} y se recogieron las células por centrifugación. El sobrenadante fue desechado y cada uno de los aglutinados fue lavado con 1 ml de K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,5, suplementado con EDTA 2 mM, enfriado en hielo. Los aglutinados celulares lavados fueron resuspendidos en 0,5 ml del mismo tampón y almacenados a -70ºC. La muestras fueron descongeladas y lavadas (1 ml) una vez en Tris-HCl 1 M, pH 9,0, y centrifugadas a 13.000 rpm durante 1 minuto. El aglutinado fue suspendido en 1 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 5% enfriado en hielo y agitado en vórtex durante 1 minuto. Después de la agitación en vórtex, la muestra fue mantenida sobre hielo durante 30 minutos aproximadamente. Después de la incubación en hielo, la mezcla fue agitada en vórtex durante 1 minuto y centrifugada a 13.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. Se midieron los niveles de ácido láctico en el sobrenadante recogido. Se analizó la concentración de ácido láctico de la muestra utilizando un método enzimático (método UV para ácido L-láctico, Boehringer Mannheim, Roche) o mediante HPLC (como en el Ejemplo 14). La concentración intracelular de ácido láctico fue calculada según sigue:

1. Volumen intracelular de las células (de la muestra):

Peso seco del cultivo (g/l) * volumen de la muestra (l) * 2 ml/g de células = volumen celular (ml).

El volumen celular es convertido en litros multiplicando por 0,001. Un gramo de células (peso seco) corresponde a 2 ml de volumen celular (Gancedo & Serrano, 1989, "Energy Yielding Metabolism", en The yeasts (Rose & Harrison, eds.), Vol. 3, Academic Press: London).

2. Cantidad de ácido láctico en las células:

Concentración de ácido láctico medida (g/l) * volumen de TCA al 5% utilizado (l) = cantidad de ácido láctico (g) en la muestra. Para calcular la cantidad de ácido láctico en la célula: dividir la cantidad de ácido láctico en la muestra (g) entre el volumen celular (l).

Después de 24 horas de cultivo, el transformante 266-5 que albergaba el gen de LDH de B. megaterium tenía una concentración de ácido láctico intracelular de 28,2 g/l con amortiguación mediante CaCO_{3} y de 7,2 g/l de ácido láctico sin amortiguación. El transformante 265-23 que albergaba dos copias del gen de LDH de B. megaterium tenía una concentración intracelular de ácido láctico de 46,1 g/l con amortiguación mediante CaCO_{3} y de 8,2 g/l de ácido láctico sin amortiguación, después de 24 horas de cultivo. El transformante 266-8 que albergaba el gen de LDH de R. oryzae tenía una concentración intracelular de ácido láctico de 45,4 g/l con amortiguación mediante CaCO_{3} y de 4,9 g/l de ácido láctico sin amortiguación (24 horas de cultivo). Estos resultados están mostrados en la Tabla 7.

Estos resultados mostraban que después de 8 horas de cultivo, los niveles de ácido láctico intracelular eran el doble de los niveles extracelulares en los transformantes 265-55 y 265-23 cuando eran cultivados en un cultivo sin amortiguar. Para los otros transformantes, a las 8 horas de cultivo la diferencia entre los niveles intracelulares y extracelulares era pequeña, de alrededor del 10%. Cuando se incluyó CaCO_{3} en los cultivos, los niveles de ácido láctico intracelular y extracelular en todas las cepas eran más elevados que en los cultivos sin CaCO_{3}. Las concentraciones de ácido láctico intracelular y extracelular aumentaban en todas las cepas desde las 8 a las 24 horas en el cultivo amortiguado con CaCO_{3}. Las concentraciones de ácido láctico intracelular en los cultivos sin amortiguar son similares a las 8 horas y a las 24 horas. Los niveles de ácido láctico intracelular de la cepa 266-8 son menores que los niveles de las demás cepas.

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TABLA 7 Concentración de ácido láctico intracelular (g/l)

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Ejemplo 18

Actividades enzimáticas de la lactato deshidrogenasa y de la piruvato descarboxilasa en C. sonorensis que albergaba el gen de LDH de L. helveticus o B. megaterium integrado en el genoma

Los transformantes de C. sonorensis (concretamente, 246-27, 247-11, 257-3, 257-12, 257-6, 247-9, 246-27, 247-11, 265-39, 265-15, 265-44, 265-55, 265-23, 265-22, 265-56, 278-14, 278-17, 286-4, 286-30 y 286-1) fueron cultivados en 50 ml de medio YD (base de nitrógeno para levaduras suplementada con un 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5), en matraces Erlenmeyer de 250 ml con agitación a 250 rpm hasta una DO_{600} de 10 a 30ºC. Las células fueron recogidas por centrifugación y el sobrenadante del cultivo fue analizado mediante HPLC. Se recogieron muestras de células por centrifugación con el fin de ser utilizadas para las medidas de la actividad enzimática (2 ml) y se lavaron con 1 ml de K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,5, suplementado con EDTA 2 mM, enfriado en hielo. Los aglutinados celulares lavados fueron resuspendidos en 0,5 ml del mismo tampón y almacenados a -70ºC. Se descongelaron muestras a temperatura ambiente y se lavaron (1 ml) una vez en tampón de sonicación (KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 100 mM, pH 7,5, suplementado con MgCl_{2} 2 mM y DTT 10 mM). Las muestras lavadas fueron resuspendidas en 0,5 ml de tampón de sonicación y homogeneizadas con 0,5 ml de esferas de vidrio con un homogeneizador Bead Beater durante 1 minuto. Después de la homogeneización, las muestras fueron centrifugadas a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. Se recogieron muestras del sobrenadante y se determinó la actividad lactato deshidrogenasa espectrofotométricamente (A_{340}) con un analizador automático Cobas MIRA a 30ºC en tampón acetato de sodio (acetato Na 50 mM, pH 5,2) (LDH de Lactobacillus helveticus) o en tampón imidazol (imidazol-HCl 40 mM, pH 6,5) (LDH de Bacillus megaterium) conteniendo NADH 0,4 mM, fructosa-1,6-difosfato 5 mM, ácido glioxílico 1 mM y piruvato 2 mM. Las concentraciones de proteína fueron determinadas mediante el método de Lowry (Lowry y col., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275). Se utilizó seroalbúmina bovina (Sigma) como estándar de proteína. La actividad piruvato descarboxilasa fue determinada espectrofotométricamente (A_{340}) con un analizar automático Cobas MIRA a 30ºC en tampón imidazol (imidazol-HCl 40 mM, pH 6,5) conteniendo NADH 0,2 mM, MgCl_{2} 50 mM, pirofosfato de tiamina (cocarboxilasa) 0,2 mM, 90 unidades de ADH y piruvato 50 mM. Se definió 1 U de actividad enzimática como la cantidad de actividad que convertía 1 \mumol de NADH en NAD^{+} por minuto. Estos resultados están mostrados en la
Tabla 8.

Este Ejemplo demostró que la actividad LDH intracelular se correlacionaba con el número de copias de los genes de LDH en el genoma. La actividad LDH calculada en las cepas que albergaban una copia del gen de LDH de L. helveticus fue de 8 U/mg de proteína celular total, y la actividad en las cepas que albergaban dos copias fue de 15 ó 35 U/mg de proteína celular total. Los títulos y los rendimientos de ácido láctico a partir de glucosa fueron mayores en las cepas que contenían múltiples copias del gen de LDH, sin embargo los títulos de etanol eran menores que en las cepas que contenían solamente una copia del gen de LDH. La actividad LDH calculada en las cepas que albergaban una copia del LDH de B. megaterium fue de 2-3 U/mg de proteína celular total, la actividad en las cepas que albergaban 2 copias fue de 10 U/mg y la actividad en las cepas que albergaban 3 copias fue de 40 U/mg.

La actividad piruvato descarboxilasa fue típicamente de 2-4 U/mg de proteína celular total en las cepas que contenían un gen de PDC2 intacto. Cuando se alteró pdc2, la actividad PDC disminuyó por debajo de 0,4 U/mg de proteína celular total. Si pdc1 y pdc2 habían sido ambos eliminados o alterados (cepa C44/286-10), la actividad PDC disminuía hasta 0,07 U/mg de proteína celular total.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8 Actividad de los enzimas LDH y PDC; concentraciones de glucosa, ácido láctico y etanol; rendimiento de ácido láctico en el sobrenadante del cultivo medido en cultivos cultivados en medio YD. nd.: no determinado. 1x, 2x y 3x indican el número de copias del gen de LDH

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Ejemplo 19

Producción de ácido L-láctico en medio definido con glucosa por C. sonorensis que alberga el gen que codifica LDH de L. helveticus, B. megaterium o R. oryzae o bien que albergaba los genes de LDH de B. megaterium y R. oryzae integrados en el genoma

Células de C. sonorensis y de los transformantes (concretamente, 266-7, 266-8, 246-27, 247-11, 257-3, 257-12, 257-6, 247-9, 265-39, 265-15, 265-44, 265-55, 265-23, 265-22, 265-56, 266-3, 278-14, 278-17, 286-4, 286-30, 286-1) fueron cultivados en medio YD (base nitrógeno para levaduras sin aminoácido, pH 5,5, suplementado con un 5% de glucosa y MES 0,5 M) y recogidas por centrifugación. Las células fueron resuspendidas en 50 ml de YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 10% de glucosa) hasta una DO_{600} de 15 para los experimentos de cultivo. Las células fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 4 g de CaCO_{3} con agitación a 100 rpm a 30ºC. Se recogieron muestras durante el cultivo, las células fueron recogidas por centrifugación y se analizó el medio de cultivo para determinar ácido láctico, glucosa y etanol mediante HPLC según se describió anteriormente (Ejemplo 14). Estos resultados están mostrados en las Tablas 9-13.

Los títulos máximos de ácido láctico en los sobrenadantes de los cultivos se alcanzaron típicamente a las 72 horas o más tarde en el cultivo después de que se hubiera consumido toda la glucosa. Los títulos y rendimientos máximos de ácido láctico alcanzados, clasificados sobre la base de los diferentes fondos genéticos, fueron según sigue:

-

1 copia de LDH de R. oryzae (cepa 266-7): 81 g/l y un 79% de rendimiento a las 96 horas

-

1 copia de LDH de B. megaterium (cepa 265-55): 85 g/l y un 82% de rendimiento a las 96 horas

-

1 copia de LDH de L. helveticus (cepa 257-3): 85 g/l y un 84% de rendimiento a las 96 horas

-

2 copias de LDH de B. megaterium (cepa 265-22): 87 g/l y un 84% de rendimiento a las 72 horas

-

3 copias de LDH de B. megaterium (cepa 265-56): 83 g/l y un 80% de rendimiento a las 72 horas

-

2 copias de LDH de L. helveticus (cepa 247-9): 90 g/l y un 89% de rendimiento a las 72 horas

-

1 copia de LDH de R. oryzae y 1 copia de LDH de B. megaterium (cepa 278-17): 79 g/l y un 76% de rendimiento a las 72 horas

-

1 copia de LDH de R. oryzae y 2 copias de LDH de B. megaterium (cepa 278-14): 89 g/l y un 86% de rendimiento a las 96 horas.

Una vez que se consumió toda la glucosa se formó un precipitado de lactato de calcio en los cultivos siguientes: cepas 246-27, 247-11, 265-39, 265-15, 265-44, 265-23, 265-22, 278-14, 278-17, 286-4, 286-30 y 286-1. La formación del precipitado indicaba también que se habían obtenido títulos muy elevados de ácido láctico.

Estos resultados demostraban que C. sonorensis que sobreexpresaba el gen de LDH de L. helveticus, R. oryzae o B. megaterium conseguía títulos finales (>80 g/l) y rendimientos finales (>80%) de ácido láctico muy elevados a partir de glucosa en medio definido amortiguado con CaCO_{3} a pH 6,5. Los transformantes que albergaban LDH de L. helveticus y B. megaterium funcionaban esencialmente igual de bien, y mejor que los transformantes que albergaban LDH de R. oryzae que presentaban títulos y rendimientos de ácido láctico ligeramente menores. El número de copias de LDH afectaba especialmente a la formación de subproductos. Un número de copias de LDH más elevado y una actividad LDH más elevada tenían como resultado una menor producción de etanol y acetato. Los transformantes con LDH de L. helveticus y B. megaterium producían ambos menos etanol y menos acetato que los transformantes con LDH de R. oryzae. Otros subproductos medidos, incluyendo glicerol y piruvato, estaban presentes en cantidades despreciables y no diferían significativamente entre los genotipos PDC+, pdc1- o pdc2-.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9 Títulos y rendimientos máximos de ácido láctico y producción de etanol y acetato por los transformantes de C. sonorensis con LDH en un cultivo en medio definido amortiguado con CaCO_{3}. 1x, 2x y 3x indican el número de copias del gen de LDH

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TABLA 10 Glucosa, g/l, a diferentes puntos de tiempo. n.d.= no determinado; *= precipitado de lactato de calcio

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TABLA 11 Ácido láctico, g/l; n.d.= no determinado; *= precipitado de lactato de calcio

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TABLA 12 Etanol, g/l. No se muestran los valores por debajo del límite de detección (0,02 g/l). n.d.= no determinado

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TABLA 13 Ácido láctico (g/g de glucosa consumida). n.d.= no determinado; *= precipitado de lactato de calcio

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Ejemplo 20

Producción de ácido L-láctico en medio definido con glucosa en tubos con burbujeo de nitrógeno por C. sonorensis que albergaba el gen que codifica LDH de L. helveticus o R. oryzae integrado en el genoma

La producción de ácido L-láctico en células de C. sonorensis transformadas fue demostrada según sigue. Células de C. sonorensis y los transformantes que albergaban el gen de LDH de L. helveticus (concretamente, 246-14, 246-18, 246-23, 246-27, 247-7, 247-8, 247-11 y 257-3) o el gen de LDH de R. oryzae (266-3 y 266-4) fueron cultivados en medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 12% de glucosa y MES 0,4 M, pH 5,5). Se cultivaron precultivos en 50 ml medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 6,5% de glucosa y MES 0,4 M, pH 5,5) en matraces Erlenmeyer de 250 ml con agitación a 250 rpm a 30ºC. Las células fueron recogidas por centrifugación y lavadas una vez con NaCl 0,9%, y posteriormente resuspendidas en 50 ml de medio YD hasta una DO_{600} de 11 para los experimentos de cultivo. Las levaduras fueron cultivadas en tubos de plástico desechables de 50 ml burbujeados con nitrógeno, con una agitación de 250 rpm a 30ºC (condiciones (casi) anaeróbicas). Se recogieron muestras durante el cultivo y después de ello los tubos fueron burbujeados con nitrógeno. Se midió la DO_{600}, se recogieron las células por centrifugación y el sobrenadante del cultivo se analizó mediante HPLC según se describió anteriormente para determinar ácido láctico, glucosa y etanol. Estos resultados están mostrados en las Tablas 14-20.

Después de 94 horas de cultivo, los transformantes que albergaban el gen de LDH de L. helveticus produjeron 6,9-7,2 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 66-84%) y 1-1,4 g/l de etanol, mientras que la cepa huésped produjo 0,1 g/l de ácido láctico y 40 g/l de etanol. Los transformantes que albergaban el gen de LDH de R. oryzae produjeron 7,2-8,8 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 13-18%) y 17-28 g/l de etanol después de 94 horas de cultivo. El consumo de glucosa y la producción de etanol por los transformantes que albergaban el gen de LDH de R. oryzae eran más rápidos que los de los transformantes con el gen de LDH de L. helveticus.

Estos resultados mostraban que C. sonorensis transformada con el gen de LDH de L. helveticus o con el gen de LDH de R. oryzae producía ácido láctico a partir de glucosa en cultivos en tubos burbujeados con nitrógeno.

TABLA 14 g de ácido láctico/g de glucosa consumida

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Ejemplo 21

Producción de ácido L-láctico en medio rico en glucosa sin amortiguación, en cultivos microaeróbicos en matraces con agitación por C. sonorensis que albergaba el gen de LDH de L. helveticus o B. megaterium integrado en el genoma

La producción de ácido L-láctico en células de C. sonorensis transformadas fue demostrada según sigue. Los transformantes de C. sonorensis que albergaban el gen de LDH de B. megaterium (concretamente, 265-23 y 286-1) y el gen de LDH de L. helveticus (246-27 y 247-11) descritos anteriormente fueron cultivados en 50 ml de medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5) en matraces Erlenmeyer de 250 ml con agitación a 250 rpm a 30ºC. Las células fueron recogidas por centrifugación y resuspendidas posteriormente en 50 ml de YP suplementado con un 5% de glucosa hasta una DO_{600} de 15 para los experimentos de cultivo. Se cultivaron las células en matraces Erlenmeyer de 250 ml con agitación a 100 rpm a 30ºC. Se retiraron muestras durante el cultivo, se midió la DO_{600} y se recogieron las células por centrifugación. El sobrenadante del cultivo fue analizado para determinar ácido L-láctico (mediante el método UV para ácido L-láctico de Boehringer Mannheim, Roche), glucosa (mediante el método de glucosa/GOD-Perid de Boehringer Mannheim, Roche), acetato (mediante el método UV para ácido acético de Boehringer Mannheim, Roche) y etanol (mediante el método UV para etanol de Boehringer Mannheim, Roche). Estos resultados están mostrados en las Tablas 15-20.

Los transformantes 246-27 y 247-11 que albergaban el gen de LDH de L. helveticus integrado aleatoriamente en el genoma de la levadura (genotipo PDC+), produjeron 7,8-9,0 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 24-29%) después de 24 horas de cultivo. El transformante 286-1 que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus del gen pdc2 (genotipo pdc2-) produjo 8,9 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 31%) después de 24 horas de cultivo. El transformante 265-23 que albergada dos copias del gen de LDH de B. megaterium integradas aleatoriamente en el genoma (genotipo PDC+) produjo 9,1 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 30%) después de 24 horas de cultivo. Después de 24 horas de cultivo, los transformantes que albergaban el gen de LDH de B. megaterium produjeron 8,9-9,1 g/l de ácido láctico, equivalente a un rendimiento del 30-31%, a partir de glucosa. Los transformantes que albergaban el gen de LDH de L. helveticus produjeron 7,8-9,0 g/l de ácido láctico, que es equivalente a un rendimiento del 24-29%, a partir de glucosa. Aunque a las 24 horas había algo de glucosa sin consumir, toda la glucosa fue finalmente consumida (a las 120 horas). Sin embargo, no tuvo lugar ningún incremento adicional de la concentración de ácido láctico después de 24 horas. El consumo de glucosa por todas las cepas fue muy similar. El pH del medio de cultivo estuvo entre 3,4 y 3,8 durante este experimento. El transformante 265-23 que contenía dos copias del gen de LDH de B. megaterium produjo menos etanol y acetato al principio del cultivo, mientras que el transformante 286-1, pdc-2, produjo menos etanol y acetato que las otras cepas hacia el final del cultivo.

Estos resultados demostraban que C. sonorensis transformada con el gen de LDH de L. helveticus o con el gen de LDH de B. megaterium era capaz de producir hasta 9 g/l de ácido láctico a partir de glucosa bajo condiciones microaeróbicas a pH bajo.

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TABLA 15 Absorbancia. DO_{600}

27

TABLA 16 Glucosa, g/l, en diferentes puntos de tiempo

28

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TABLA 17 Ácido láctico, g/l

29

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TABLA 18 Etanol, g/l

30

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TABLA 19 pH

31

TABLA 20 Acetato, g/l

32

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Ejemplo 22

Producción de ácido L-láctico en un biorreactor, en medio rico en glucosa, por C. sonorensis que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el genoma

Los transformantes de C. sonorensis denominados 265-55, 286-30 y 265-15, anteriormente descritos, fueron cultivados en biorreactores aeróbicos. Se llevó a cabo un cultivo intermitente a 35ºC en un biorreactor de laboratorio (Biostat CT-DCU3, Braun, Alemania) con un volumen de trabajo de 2 l. Durante la fase de producción, el pH fue mantenido a 5,0 \pm 0,1 o incrementado hasta 6,0 \pm 0,1 después de 48 horas de cultivo mediante la adición automática de hidróxido de potasio (KOH) 5 M. La biomasa fue producida con medio YP suplementado con 150 g/l de glucosa. La fase de producción de biomasa fue inoculada con 20 ml de cultivo almacenado en glicerol al 23% (p/v) a -80ºC hasta una DO_{600} inicial de 0,7-1. El biorreactor fue inundado con un 100% de aire a una velocidad de flujo de 1,0 l/minuto y agitado a 800 rpm durante esta fase. Después de 23,5 horas de cultivo, se produjeron 10-21 g/l de masa celular (peso seco) (equivalente a 0,2-0,3 g de peso seco por gramo de glucosa utilizado). Después de 24 horas de producción de biomasa, el biorreactor fue vaciado y las células fueron recogidas por centrifugación (4000 rpm, 20ºC, 10 minutos). El medio para la producción de lactato (YP suplementado con 100 g/l de glucosa) fue bombeado al biorreactor y fue inoculado con las células recogidas de la fase de producción de biomasa, hasta una densidad correspondiente a 5 g/l de peso seco. El biorreactor fue inundado con un 10% de aire-90% de gas nitrógeno a una velocidad de flujo de 1,0 l minuto^{-1} y agitado a 500 rpm.

Se recogieron muestras durante el cultivo. Para cada muestra, se determinó el peso celular seco, se midió la DO_{600} y se recogieron las células por centrifugación. Los sobrenadantes del cultivo fueron analizados por HPLC según se describió anteriormente para determinar ácido láctico, glucosa, etanol y acetato. Estos resultados están mostrados en las Tablas 21 y 22.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado aleatoriamente en el genoma (265-55, genotipo PDC+) produjo 28 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 67%) a pH 5,0, después de 52 horas de cultivo en la fase de producción de lactato. El mismo transformante produjo 28 g/l de ácido láctico (equivalente a un 60% de rendimiento) a pH 6,0 después de 72 horas de cultivo en la fase de producción.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus del gen pdc1 (265-15, genotipo pdc1-) produjo 23 g/l de ácido láctico (equivalente a un 66% de rendimiento) a pH 5,0 después de 51 horas de cultivo en la fase de producción de lactato.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus del gen pdc2 (286-30, genotipo pdc2-) produjo 27 g/l de ácido láctico (equivalente a un 54% de rendimiento) a pH 5,0 después de 46 horas de cultivo en la fase de producción de lactato.

Después de 46 a 52 horas de la fase de producción de ácido láctico, los transformantes produjeron 23-28 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 54-67%).

Estos resultados demostraban que C. sonorensis que sobreexpresaba un gen heterólogo que codificaba lactato deshidrogenasa producía ácido láctico a partir de glucosa en una fermentación intermitente bajo condiciones microaeróbicas (por ejemplo, un 0%-2% de O_{2} en la atmósfera).

TABLA 21 Producción de biomasa en cultivos en un biorreactor en medio YPD con 150 g/l de glucosa

33

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TABLA 22 Producción de lactato por C. sonorensis en cultivos en un biorreactor en medio YPD con 100 g/l de glucosa. Consumo de glucosa, concentración de lactato y rendimiento de lactato en el tiempo en el cual se alcanzó la concentración máxima de lactato. *= el pH fue incrementado hasta 6,0 a las 48 horas

34

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TABLA 23 Producción de subproductos por C. sonorensis en cultivos en un biorreactor en medio YPD con 100 g/l de glucosa. Concentraciones de subproductos en el tiempo en el que se alcanzó la concentración máxima de lactato. *= El pH fue incrementado hasta 6,0 a las 48 horas

35

Ácido láctico y piruvato intracelulares

Las concentraciones de ácido láctico y piruvato intracelulares fueron determinadas según se describió anteriormente en el Ejemplo 17, excepto en que el volumen de muestra fue de 1 ml y el aglutinado celular fue lavado (1 ml) en Tris-HCl 1 M, pH 9,0, centrifugado a 13.000 rpm durante 1 minuto y almacenado a -70ºC. Después de descongelar, el aglutinado celular fue suspendido directamente en 1 ml de TCA al 5% enfriado en hielo. La concentración de piruvato intracelular fue analizada en la muestra enzimáticamente (kit de piruvato, Sigma Diagnostics). Estos resultados están mostrados en las Tablas 24-27.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado aleatoriamente en el genoma (265-55, genotipo PDC+) produjo en las células 60,9 g/l de ácido láctico a las 52 horas de cultivo en la fase de producción de lactato a pH 5,0. El mismo transformante produjo 38,7 g/l de ácido láctico, a pH 6,0, a las 72 horas de cultivo en la fase de producción de lactato.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus de pdc1 (265-15, genotipo pdc1-) produjo 13,4 g/l de ácido láctico en las células a las 51 horas de cultivo en la fase de producción de lactato.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus de pdc2 (286-30, genotipo pdc2-) produjo 14,3 g/l de ácido láctico a las 49 horas de cultivo en la fase de producción de lactato.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado aleatoriamente en el genoma (265-55, genotipo PDC+) produjo 0,1 g/l de piruvato en las células durante el cultivo a pH 5,0 y a pH 6,0.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus de pdc1 (265-15, genotipo pdc1-) o en el locus de pdc2 (286-30, genotipo pdc2-) produjo 0,3 g/l de piruvato en las células durante los cultivos.

Estos resultados mostraban que la eliminación de pdc1 y la alteración de pdc2 producían un incremento de los niveles de piruvato intracelular. En la cepa PDC+, los niveles de ácido láctico intracelular aumentaron hacia el final de los cultivos, aunque esta tendencia no era tan clara en las cepas pdc1- y pdc2-.

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TABLA 24 Concentración de lactato y piruvato intracelular (g/l) en la cepa 265-55 (PDC+, pH 5,0)

36

TABLA 25 Concentración de lactato y piruvato intracelular (g/l) en la cepa 265-55 (PDC+, pH 6,0)

38

TABLA 26 Concentración de lactato y piruvato intracelular (g/l) en la cepa 286-30 (pdc2-, pH 5,0)

39

TABLA 27 Concentración de lactato y piruvato intracelular (g/l) en la cepa 265-15 (pdc1-, pH 5,0)

40

Actividades lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa

Las actividades lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa fueron determinadas según sigue. Se recogieron muestras para las medidas de la actividad enzimática (2 ml) mediante centrifugación y los aglutinados celulares fueron lavados con 1 ml de K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,5, enfriado en hielo, suplementado con EDTA 2 mM. Los aglutinados celulares lavados fueron resuspendidos en 0,5 ml del mismo tampón y almacenados a -70ºC. Las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente y lavadas (1 ml) una vez en tampón de homogeneización (KH_{2}PO_{4}/K_{2}HPO_{4} 100 mM, pH 7,5, suplementado con MgCl_{2} 2 mM y DTT 10 mM). Las muestras lavadas fueron resuspendidas en 0,5 ml de tampón de homogeneización y homogeneizadas con 0,5 ml de esferas de vidrio con un homogeneizador Bead Beater durante 1 minuto. Posteriormente las muestras de homogeneización fueron centrifugadas a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. Se recogieron muestras del sobrenadante y se determinaron las actividades lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa espectrofotométricamente (A_{340}) según se describió anteriormente en el Ejemplo 18, excepto en que no se utilizó ácido glioxílico. Estos resultados están mostrados en las Tablas 28-31.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado aleatoriamente en el genoma (265-55, genotipo PDC+) produjo una actividad lactato deshidrogenasa de 1,4 U/mg de proteína celular total y una actividad piruvato descarboxilasa de 0,8 U/mg de proteína celular total a las 52 horas de cultivo en la fase de producción de lactato, a pH 5,0. El mismo transformante produjo una actividad lactato deshidrogenasa de 1,2 U/mg de proteína celular total y una actividad piruvato descarboxilasa de 0,4 U/mg de proteína celular total, a pH 6,0, a las 72 horas de cultivo en la fase de producción de lactato.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus de pdc1 (265-15, genotipo pdc1-) produjo una actividad lactato deshidrogenasa de 1,5 U/mg de proteína celular total y una actividad piruvato descarboxilasa de 0,5 U/mg de proteína celular total a las 51 horas de cultivo en la fase de producción de lactato.

El transformante que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el locus de pdc2 (286-30, genotipo pdc2-) produjo una actividad lactato deshidrogenasa de 0,7 U/mg de proteína celular total y una actividad piruvato descarboxilasa de 0,1 U/mg de proteína celular total a las 49 horas de cultivo en la fase de producción de lactato.

Estos resultados demostraban que la actividad LDH era similar en todas las cepas que contenían una copia del gen de LDH de B. megaterium integrada en el genoma. La actividad LDH era más elevada que la actividad PDC (U/mg de proteína celular total) y por tanto la LDH podía competir eficazmente con la PDC por el piruvato. La cepa 286-30, pdc2-, tiene una actividad PDC claramente reducida en comparación con la cepa de tipo salvaje. El efecto observado de la eliminación de pdc1 sobre la actividad PDC en la cepa 265-15, pdc1-, era una disminución más gradual de la actividad a lo largo del tiempo.

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TABLA 28 Actividades lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa (265-55 (PDC+, pH 5,0))

41

TABLA 29 Actividades lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa (265-55 (PDC+, pH 6,0))

42

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TABLA 30 Actividades lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa (265-15 (pdc1-, pH 5,0))

43

TABLA 31 Actividades lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa (286-30 (pdc2-, pH 5,0))

44

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Ejemplo 23

Producción anaeróbica de ácido L-láctico en un biorreactor, en medio rico en glucosa, por C. sonorensis que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el genoma

El transformante de C. sonorensis denominado 265-55 descrito anteriormente fue cultivado en un biorreactor. Se llevó a cabo un cultivo intermitente a 35ºC en un biorreactor de laboratorio (Biostat CT-DCU3, Braun, Alemania) con un volumen de trabajo de 2 l. La biomasa fue producida aeróbicamente en medio YP suplementado con 150 g/l de glucosa. La fase de producción de biomasa fue inoculada con 20 ml de cultivo almacenado en glicerol al 23% (p/v) a -80ºC. El biorreactor fue inundado con un 100% de aire a una velocidad de flujo de 1,0 l/minuto y agitado a 800 rpm. La concentración de oxígeno disuelto fue monitorizada continuamente con un electrodo de oxígeno (Mettler Toledo). Después de 22,5 horas de producción de biomasa, el biorreactor fue vaciado y las células fueron recogidas por centrifugación (4000 rpm, 20ºC, 10 minutos). Se bombeó al biorreactor medio para la producción de ácido láctico (YP suplementado con 100 g/l de glucosa) y se inoculó con la biomasa centrifugada a una densidad equivalente a 4,5 g/l de peso celular seco. El biorreactor fue inundado con nitrógeno al 100% a una velocidad de flujo de 1,0 l/minuto y agitado a 500 rpm. El pH fue mantenido a 5,0 \pm 0,1 mediante la adición automatizada de hidróxido de potasio (KOH) 5 M.

Se recogieron muestras durante el cultivo. Se determinó el peso celular seco, se midió la DO_{600} y se recogieron las células por centrifugación. Los sobrenadantes del cultivo fueron analizados para determinar el contenido de ácido L-láctico (mediante el método UV para ácido L-láctico de Boehringer Mannheim) y el contenido de glucosa (mediante el método de glucosa/GOD-Perid de Boehringer Mannheim). Estos resultados están mostrados en las Tablas 32 y 33.

Después de 120 horas de cultivo, se produjeron 4,7 g/l de ácido láctico a partir de glucosa (equivalente a un rendimiento del 52%).

Este Ejemplo demostraba que C. sonorensis que sobreexpresaba un gen de lactato deshidrogenasa heterólogo era capaz de producir ácido láctico a partir de glucosa bajo una fermentación intermitente anaeróbica.

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TABLA 32 Producción aeróbica de biomasa en un cultivo en un biorreactor en medio YPD con 150 g/l de glucosa

45

TABLA 33 Producción de ácido láctico por C. sonorensis que sobreexpresaba el gen de LDH de B. megaterium en un cultivo anaeróbico en un biorreactor en medio YPD con 100 g/l de glucosa: consumo de glucosa, concentración de ácido láctico y rendimiento de ácido láctico

46

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Ejemplo 24

Producción de ácido L-láctico en un biorreactor en medio rico en glucosa, amortiguado con Ca(OH)_{2}, por C. sonorensis que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el genoma

El transformante de C. sonorensis denominado 265-55 descrito anteriormente fue cultivado mediante cultivo intermitente en un biorreactor (Biostat CT-DCU3, Braun, Alemania) a 35ºC según se describió en el Ejemplo 23. Después de 18,5 horas de producción de biomasa, el biorreactor fue vaciado y las células fueron recogidas por centrifugación (4000 rpm, 20ºC, 10 minutos). El medio para la producción de ácido láctico (YP suplementado con 100 g/l de glucosa) fue bombeado al biorreactor e inoculado con la biomasa centrifugada a una densidad equivalente a 6,7 g/l de peso celular seco. El biorreactor fue inundado con un 90% de nitrógeno y un 10% de aire a una velocidad de flujo de 1,0 l/minuto y agitado a 500 rpm. El pH fue mantenido a 5,0 \pm 0,1 mediante la adición automatizada de hidróxido de calcio (Ca(OH)_{2}) 2,5 M.

Se retiraron muestras durante el cultivo. Se determinó el peso celular seco, se midió la DO_{600} y se recogieron las células por centrifugación. Los sobrenadantes de los cultivos fueron analizados para determinar el contenido de ácido L-láctico (mediante el método UV para ácido L-láctico, Boehringer Mannheim) y de glucosa (mediante el método de glucosa/GOD-Perid, Boehringer Mannheim). Estos resultados están mostrados en las Tablas 34 y 35.

Después de 53 horas de cultivo, se produjeron 26 g/l de ácido láctico a partir de la glucosa (equivalente a un rendimiento del 67%).

Estos resultados demostraban que C. sonorensis que sobreexpresaba lactato deshidrogenasa de B. megaterium era capaz de producir ácido láctico a partir de glucosa en una fermentación intermitente microaeróbica (2% de O_{2}) con amortiguación mediante hidróxido de calcio.

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TABLA 34 Producción aeróbica de biomasa en un cultivo en medio YPD con 150 g/l de glucosa en un biorreacto

47

TABLA 35 Producción de ácido láctico por C. sonorensis que sobreexpresaba el gen de LDH de B. megaterium en un cultivo en un biorreactor en medio YPD con 100 g/l de glucosa: consumo de glucosa, concentración de ácido láctico y rendimiento de ácido láctico

48

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Ejemplo 25

Producción de ácido L-láctico en un biorreactor en medio rico en glucosa por C. sonorensis que albergaba el gen de LDH de L. helveticus integrado en el genoma

Los transformantes de C. sonorensis denominados 247-5 y 247-11 descritos anteriormente fueron cultivados mediante cultivo intermitente en un biorreactor de laboratorio (Biostat CT-DCU3, Braun, Alemania) a 30ºC (cepa 247-11) o a 35ºC (cepa 247-5) con un volumen de trabajo de 2 l. El medio de cultivo era YP suplementado con 40 g/l de glucosa. Los precultivos fueron cultivados en medio YPD hasta una DO_{600} de 11-16, las células se recogieron por centrifugación y el biorreactor fue inoculado hasta una DO_{600} de 1. El cultivo continuó hasta que se hubo consumido toda la glucosa. El pH fue mantenido a 5,0 \pm 0,1 mediante la adición automatizada de hidróxido de potasio (KOH) 5 M. El biorreactor fue inundado con un 5% de aire y un 95% de gas nitrógeno a una velocidad de flujo de 0,5 l/minuto y agitado a 500 rpm. La concentración de oxígeno disuelto fue monitorizada continuamente con un electrodo de oxígeno (Mettler Toledo).

Se recogieron muestras durante el cultivo. Se determinó el peso celular seco, se midió la DO_{600} y se recogieron las células por centrifugación. Los sobrenadantes de los cultivos fueron analizados mediante HPLC según se describió anteriormente para determinar ácido láctico, glucosa, etanol y acetato. Estos resultados están mostrados en las Tabla 36 y 37.

Después de 52 a 69 horas de cultivo, los transformantes produjeron 26-29 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 67-72%) a partir de la glucosa.

Estos resultados demostraban que C. sonorensis que sobreexpresaba el gen de la lactato deshidrogenasa de L. helveticus era capaz de producir ácido láctico a partir de glucosa en una fermentación intermitente microaeróbica.

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TABLA 36 Producción de lactato por C. sonorensis que sobreexpresaba el gen de LDH de L. helveticus en dos cultivos en un biorreactor en medio YPD con 40 g/l de glucosa: consumo de glucosa, concentración de lactato y rendimiento de lactato al final de la fermentación (toda la glucosa utilizada)

49

TABLA 37 Producción de lactato por C. sonorensis que sobreexpresaba el gen de LDH de L. helveticus en dos cultivos en un biorreactor en medio YPD con 40 g/l de glucosa: concentraciones de los subproductos

50

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Ejemplo 26

Producción de ácido L-láctico en medio definido con xilosa por células de C. sonorensis que albergaban el gen de LDH de L. helveticus integrado en el genoma

Células de C. sonorensis y los transformantes anteriormente descritos (específicamente, 246-1, 246-10, 247-2 y 247-5) fueron cultivados en medio YX (base de nitrógeno para levaduras sin sulfato de amonio ni aminoácidos, suplementado con un 0,3% de urea y un 5% de xilosa). Los precultivos fueron cultivados en medio YPD, las células fueron recogidas por centrifugación, lavadas una vez con medio YX y posteriormente resuspendidas en 50 ml de medio YX hasta una DO_{600} de 14-22 para los experimentos de cultivo. Las células de levadura se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 100 ml con agitación a 100 rpm a 30ºC. Cuando el pH alcanzó 3,5 aproximadamente, se añadió un 0,2% de carbonato de calcio sólido. Se recogieron muestras durante el cultivo, se midió la DO_{600}, se recogieron las células por centrifugación y se analizó el sobrenadante del cultivo por HPLC según se describió anteriormente. Estos resultados están mostrados en la Tabla 38.

Después de 71 horas de cultivo, los transformantes que albergaban el gen de LDH de L. helveticus produjeron 3,6-5,0 g/l de ácido láctico, equivalente a un rendimiento del 18-34%, a partir de xilosa, mientras que el huésped C. sonorensis no produjo ácido láctico detectable. La biomasa aumentó menos del 10% durante el experimento de 167 horas. Los transformantes utilizaron 10-30 g/l de xilosa y produjeron 4-9 g/l de ácido láctico. Un tercio de la xilosa utilizada fue convertido en ácido láctico por los transformantes 246-10 y 247-5.

Estos resultados demostraban que C. sonorensis que sobreexpresaba un gen heterólogo de lactato deshidrogenasa era capaz de producir ácido láctico a partir de xilosa.

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TABLA 38 DO_{600}, xilosa residual y producción de ácido láctico por C. sonorensis y los transformantes con LDH de L. helveticus en medio definido con xilosa

51

52

Ejemplo 27

Producción de ácido L-láctico en medio definido con L-arabinosa por C. sonorensis que albergada el gen de LDH de L. helveticus integrado en el genoma

Células de C. sonorensis y los transformantes descritos anteriormente (específicamente, 246-1, 246-10, 247-10 y 247-5) fueron cultivados en medio YA (base de nitrógeno para levaduras sin sulfato de amonio ni aminoácidos suplementado con un 0,3% de urea y un 2% de L-arabinosa). Los precultivos fueron cultivados en medio YPD, las células fueron recogidas por centrifugación, lavadas una vez con medio YA y resuspendidas en 50 ml de medio YA hasta una DO_{600} de 14-20 para los experimentos de cultivo. Las células de levadura fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer de 100 ml con agitación de 100 rpm (condiciones microaeróbicas) a 30ºC. Cuando el pH alcanzó un valor de 3,5 aproximadamente, se añadió un 0,2% de carbonato de calcio sólido. Se retiraron muestras durante el cultivo, se midió la DO_{600}, se recogieron las células por centrifugación y se analizó el sobrenadante del cultivo para determinar ácido láctico y xilosa mediante HPLC según se describió anteriormente. Estos resultados están mostrados en la Tabla 39.

Después de 71 horas de cultivo, los transformantes que albergaban el gen de LDH de L. helveticus produjeron 2,3-3,2 g/l de ácido láctico a partir de arabinosa, equivalente a un rendimiento del 14-34%, mientras que la cepa control no produjo ácido láctico detectable. La biomasa aumentó un 20-60% durante el experimento de 167 horas. Los transformantes utilizaron casi todos los 20 g/l de arabinosa suministrados inicialmente y produjeron 3,3-4,5 g/l de ácido láctico. Alrededor del 20% de la arabinosa utilizada fue convertido en ácido láctico por los transformantes 246-10 y 247-5.

Este ejemplo mostraba que C. sonorensis que expresaba un gen heterólogo de LDH producía ácido láctico a partir de arabinosa.

TABLA 39 DO_{600}, arabinosa residual y producción de ácido láctico por C. sonorensis y los transformantes con LDH de L. helveticus en medio definido con arabinosa (DO_{600})

53

Ejemplo 28

Transformación de C. methanosorbosa y producción de ácido láctico por cepas que albergaban el gen de LDH de B. megaterium integrado en el genoma

C. methanosorbosa fue transformada con el vector pMI278 de C. sonorensis descrito anteriormente para la producción de ácido láctico. El pMI278 fue digerido con SalI y NotI. Se llevó a cabo una transformación con acetato de litio de acuerdo con una modificación del método de Gietz y col. (1992, Nucleic Acids Res. 20: 1425) descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Células procedentes del cultivo durante una noche de C. methanosorbosa cultivadas hasta una DO_{600} = 0,9-1,1 fueron recogidas por centrifugación, lavadas primeramente con un exceso de una solución de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5), y posteriormente con un exceso de una solución de LiAc 100 mM/Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5), y resuspendidas en 2 ml de LiAc 100 mM/Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5). Se mezclaron 50 \mul de células con 10 \mug de ADN transformante y 50 \mug de ADN de esperma de arenque desnaturalizado por calor. Se añadieron a las células 300 \mul de una solución de PEG-4000 al 40% en LiAc 100 mM/Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5) y las células fueron incubadas posteriormente a 30ºC durante 30 minutos con agitación lenta. A continuación se añadió DMSO (40 \mul) y las células fueron incubadas en un baño de agua a 42ºC durante 15 minutos. Las células fueron recogidas por centrifugación, lavadas con un exceso de una solución de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5), resuspendidas en YPD e incubadas a 30ºC durante una noche. Las células fueron extendidas sobre medio YPD sólido que contenía 200 \mug/ml de G418 e incubadas a 30ºC durante tres a cinco días. Los transformantes fueron sembrados en estría sobre placas de selección nuevas dos veces. Los transformantes fueron denominados Cm/278-1 a Cm/278-74.

Los transformantes fueron analizados para determinar su capacidad para producir ácido L-láctico según sigue. Se inocularon 5 ml de YPD en un tubo de plástico de 10 ml con una colonia crecida en placas de G418 y se incubaron con agitación a 250 rpm durante una noche a 30ºC. Las células fueron extraídas por centrifugación y el sobrenadante fue analizado para determinar ácido L-láctico utilizando el método UV para ácido L-láctico de Boehringer Mannheim. Se produjo ácido L-láctico a una concentración de 2,3-4,3 g/l. La presencia de una única copia del gen de LDH de B. megaterium en el genoma fue verificada mediante análisis de transferencia Southern de ADN de levadura digerido con HindIII utilizando como sonda el gen de LDH de B. megaterium.

Estos resultados mostraban que el gen de LDH de B. megaterium era capaz de funcionar en C. methanosorbosa y producía ácido láctico a partir de glucosa. El gen de LDH de B. megaterium está unido operativamente al promotor de PGK1 de C. sonorensis que es capaz de dirigir la expresión de un gen heterólogo en C. methanosorbosa. Además, el promotor de TDH1 de C. sonorensis que está unido operativamente al gen de resistencia a G418 es también capaz de funcionar en C. methanosorbosa.

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Ejemplo 29

Producción de ácido L-láctico en medio rico en glucosa sin amortiguar por C. methanosorbosa que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el genoma

Uno de los transformantes de C. methanosorbosa descrito anteriormente (Cm/278-1) fue cultivado en medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5). Las células fueron posteriormente recogidas por centrifugación y resuspendidas en 50 ml de YP suplementado con un 5% de glucosa hasta una DO_{600} de 16. Las células de levadura fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer de 250 ml a 30ºC con una agitación de 100 rpm. Se recogieron muestras durante el cultivo, se midió la DO_{600}, se recogieron las células por centrifugación y se analizó el sobrenadante del cultivo para determinar ácido L-láctico (mediante el método UV para ácido L-láctico de Boehringer Mannheim, Roche), glucosa (mediante el método de glucosa/GOD-Perid de Boehringer Mannheim, Roche), acetato (mediante el método UV para ácido acético de Boehringer Mannheim, Roche) y etanol (mediante el método UV para etanol de Boehringer Mannheim, Roche). Estos resultados están mostrados en la Tabla 40.

Después de 24 horas de cultivo, el transformante produjo 8,1 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 19%) a partir de glucosa, y el pH disminuyó hasta 3,5.

Estos resultados demostraban que C. methanosorbosa que sobreexpresaba un gen de LDH heterólogo producía ácido láctico a partir de glucosa en medio rico a pH bajo.

TABLA 40 DO_{600}, glucosa residual, producción de ácido láctico, etanol y acetato y pH del sobrenadante del cultivo de la cepa Cm/278-1

54

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Ejemplo 30

Producción de ácido L-láctico en medio definido con glucosa amortiguado con CaCO_{3} por C. methanosorbosa que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el genoma

Las células de C. methanosorbosa transformadas descritas anteriormente (específicamente, los transformantes denominados Cm/278-1 y Cm/278-14) y la cepa huésped no transformada (Cm) fueron cultivados en medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5). Las células fueron posteriormente recogidas por centrifugación y resuspendidas en 50 ml de medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 10% de glucosa) hasta una DO_{600} de 15 para los experimentos de cultivo. Las células de levadura fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 4 g de CaCO_{3} con una agitación de 100 rpm a 30ºC. El pH del medio de cultivo a lo largo de todo el cultivo fue de 6,5. Se retiraron muestras durante el cultivo, se recogieron las células por centrifugación y se analizó el sobrenadante del cultivo mediante HPLC para determinar ácido láctico, glucosa y etanol, según se describió anteriormente. Estos resultados están mostrados en las Tablas 41-44.

Los transformantes habían consumido la glucosa a las 96 horas de cultivo y habían producido 63-65 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 63-64%) y 6,5-6,9 g/l de etanol. La cepa huésped (Cm) había utilizado toda la glucosa hacia las 120 horas de cultivo y había producido 23 g/l de etanol y nada de ácido láctico.

Estos resultados demostraban que células de C. methanosorbosa que sobreexpresaban un gen de LDH heterólogo producían ácido láctico a partir de glucosa en medio definido a pH neutro. Se consiguieron títulos elevados, 63-65 g/l, y rendimientos elevados, 63-64%, de ácido láctico.

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TABLA 41 Glucosa, g/l

55

TABLA 42 Ácido láctico, g/l

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TABLA 43 Etanol, g/l

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TABLA 44 g de ácido láctico/g de glucosa utilizada

58

Ejemplo 31

Actividades enzimáticas de lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa y producción de ácido L-láctico en medio definido con glucosa por C. methanosorbosa que albergaba el gen de LDH de B. megaterium integrado en el genoma

Los transformantes de C. methanosorbosa descritos anteriormente (Cm/278-1 y Cm/278-14) fueron cultivados en 50 ml de medio YD (base de nitrógeno para levaduras sin aminoácidos suplementada con un 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5). Las células de levadura fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer de 250 ml con agitación a 250 rpm, a 30ºC, hasta una DO_{600} de 10. Se recogieron muestras (2 ml) y se recogieron las células por centrifugación. El sobrenadante del cultivo fue analizado mediante HPLC.

Para las medidas de las actividades enzimáticas, el aglutinado celular fue lavado con 1 ml de K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 10 mM, EDTA 2 mM (pH 7,5) enfriado en hielo. Los aglutinados celulares lavados fueron resuspendidos con 0,5 ml del mismo tampón y almacenados a -70ºC. Las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente y lavadas una vez con 1 ml de tampón de sonicación (K_{2}HPO_{4}/KH_{2}PO_{4} 100 mM, MgCl_{2} 2 mM, DTT 10 mM, pH 7,5). Las muestras lavadas fueron resuspendidas en 0,5 ml de tampón de sonicación y homogeneizadas con 0,5 ml de esferas de vidrio en un homogeneizador Bead Beater durante 1 minuto. Después de la homogeneización, las muestras fueron centrifugadas a 14.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC. Se recogieron muestras del sobrenadante y se determinaron las actividades lactato deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa espectrofotométricamente (A_{340}) según se describió anteriormente en el Ejemplo 18. Estos resultados están mostrados en la Tabla 45.

A las 20 horas de cultivo, los transformantes 278-1 y 278-14 produjeron 0,69 y 0,33 g/l de ácido láctico (equivalente a un rendimiento del 7% y del 4% a partir de glucosa), respectivamente. En ese punto de tiempo, la actividad lactato deshidrogenasa era de 0,05 y 0,16 U/mg de proteína celular total, y la actividad piruvato descarboxilasa era de 0,71 y 0,53 U/mg de proteína celular total en los transformantes 278-1 y 278-14, respectivamente.

Estos resultados demostraban que se había detectado actividad lactato deshidrogenasa en células de C. methanosorbosa que sobreexpresaban un gen de LDH heterólogo y confirmaban que las células eran capaces de producir ácido láctico a partir de glucosa. La actividad más baja podía ser atribuida a una menor DO_{600} de partida y a una mayor aireación (250 rpm), teniendo como resultado predominantemente un crecimiento celular y una pequeña cantidad de producción de lactato.

TABLA 45 Actividades enzimáticas LDH y PDC intracelulares (U/mg de proteína celular total) y glucosa residual, ácido láctico y etanol (g/l) en el sobrenadante del cultivo de C. methanosorbosa que expresaba el gen de LDH de B. megaterium

59

Ejemplo 32

Producción de ácido láctico en medio definido con xilosa por C. sonorensis que albergaba el gen que codifica LDH de L. helveticus o B. megaterium y por C. methanosorbosa que albergaba el gen que codifica LDH de B. megaterium integrado en el genoma

Se produjo ácido láctico a partir de xilosa en cultivos amortiguados con CaCO_{3} de C. sonorensis y C. methanosorbosa cultivadas en medio definido. La biomasa celular fue generada a expensas de glucosa o a expensas de xilosa en dos etapas antes de ser transferida al medio de producción que contenía xilosa.

A) Generación de biomasa a expensas de glucosa y producción de lactato a expensas de xilosa

Se inocularon 5 ml de medio YP + 5% de glucosa con una colonia de levadura (cepa C40/288-34) cultivada en placas de YPD. El cultivo fue incubado durante una noche a 30ºC con agitación a 250 rpm. Se inocularon 50 ml de medio YD (base de nitrógeno para levaduras, sin suplemento de aminoácidos, 5% de glucosa y MES 0,5 M, pH 5,5) en matraces Erlenmeyer de 250 ml a una DO_{600} inicial de 0,1 y se incubaron durante una noche con agitación a 250 rpm, a 30ºC, hasta que se alcanzó una DO_{600} de 10. Las células fueron resuspendidas en 50 ml de medio YX (base de nitrógeno para levaduras sin suplemento de aminoácidos con un 5% de xilosa) hasta una DO_{600} de 11-13. Las células fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 2 g de CaCO_{3} con agitación a 100 rpm, a 30ºC. Se recogieron muestras durante el cultivo. Las células fueron extraídas por centrifugación y el sobrenadante del cultivo fue analizado para determinar ácido láctico y xilosa mediante HPLC según se describió anteriormente (Ejemplo 14). Se llevaron a cabo dos experimentos independientes y los resultados están mostrados en la Tabla 46.

El transformante C40/288-34 de C. sonorensis consumió 50 g/l de xilosa en 7-8 días y produjo 13-16 g/l de ácido láctico, correspondiente a un rendimiento de ácido láctico a partir de xilosa del 28-32%.

TABLA 46 Producción de ácido láctico a partir de xilosa en un cultivo amortiguado con CaCO_{3} en medio definido por células cultivadas con glucosa. Los rendimientos fueron calculados a la concentración máxima de lactato (168 ó 198 horas). Los datos proceden de dos experimentos independientes

60

B) Generación de biomasa a expensas de xilosa y producción de lactato a expensas de xilosa

Se utilizaron los transformantes 265-55 y 265-44 (C. sonorensis) que albergaban el gen de LDH de B. megaterium, los transformantes C40/288-34, C40/288-36, 257-3 y 246-27 (C. sonorensis) que albergaban el gen de LDH de L. helveticus y los transformantes Cm/278-1 y Cm/278-42 (C. methanosorbosa) que albergaban el gen de LDH de B. megaterium.

Se inocularon 50 ml de medio YP + 5% de xilosa en un matraz con agitación de 250 ml con una colonia de levadura cultivada en placas de YP + 2% de xilosa. El cultivo fue incubado durante una noche a 30ºC con agitación a 250 rpm hasta que se alcanzó una DO_{600} de 10, posteriormente 50 ml de medio YX (base de nitrógeno para levaduras sin suplemento de aminoácidos, 5% de xilosa y MES 0,5 M, pH 5,5) en matraces Erlenmeyer de 250 ml fueron inoculados a una DO_{600} inicial de 0,2. Las células fueron incubadas durante una noche a 30ºC con agitación a 250 rpm hasta que se alcanzó una DO_{600} de 7-10. Las células fueron resuspendidas en 50 ml de medio YX (base de nitrógeno para levaduras sin suplemento de aminoácidos y un 5% de xilosa) hasta una DO_{600} de 11-12. Las células fueron cultivadas en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 2 g de CaCO_{3} a 30ºC con agitación a 100 rpm. Se recogieron muestras durante el cultivo. Se extrajeron las células por centrifugación y se analizó el sobrenadante del cultivo para determinar ácido láctico y xilosa mediante HPLC según se describió anteriormente (Ejemplo 14). Los resultados están mostrados en la Tabla 47.

Los transformantes de C. sonorensis con LDH consumieron 50 g/l de xilosa en, típicamente, 5-6 días. Los títulos máximos de ácido láctico se midieron 4-5 días después de la transferencia al medio con xilosa amortiguado con CaCO_{3}, cuando se había consumido al menos un 95% de la xilosa. La cantidad de ácido láctico producida fue de 30-37 g/l, correspondiente a un rendimiento de 63-76% de ácido láctico a partir de xilosa.

Los transformantes de C. methanosorbosa con LDH consumieron 50 g/l de xilosa, típicamente, en 5-6 días. Los títulos máximos de ácido láctico se midieron 4-5 días después de la transferencia al medio con xilosa amortiguado con CaCO_{3}, cuando se había consumido al menos un 95% de la xilosa. Los transformantes produjeron 8-14 g/l de ácido láctico, correspondiente a un rendimiento de ácido láctico a partir de xilosa del 16-28%.

TABLA 47 Producción de ácido láctico a partir de xilosa en medio definido amortiguado con CaCO_{3} por células cultivadas a expensas de xilosa. Los rendimientos fueron calculados a la concentración máxima de ácido láctico

61

62

Este Ejemplo demostraba que las condiciones del cultivo y la historia del inóculo tienen un efecto muy importante sobre la producción de ácido láctico a partir de xilosa. Cuando la biomasa había sido generada a expensas de glucosa, el transformante de C. sonorensis con LDH C40/288-34 convirtió la xilosa en ácido láctico, después de su transferencia al medio que contenía xilosa, con un rendimiento del 30% aproximadamente. En comparación, cuando la biomasa había sido generada a expensas de xilosa, el mismo transformante convertía la xilosa en ácido láctico con un rendimiento mucho más elevado (63-76%) después de su transferencia al medio que contenía xilosa. La biomasa crecida a expensas de xilosa consumía también la xilosa más rápidamente que la biomasa crecida a expensas de glucosa bajo las condiciones de producción de ácido láctico. Los datos sugieren que pueden obtenerse rendimientos incrementados de ácido láctico cuando las células son "adaptadas" a azúcares distintos de glucosa, por ejemplo xilosa, mediante crecimiento en un medio conteniendo xilosa antes de su transferencia al medio de producción de ácido láctico que contenía xilosa.

Ejemplo 33

Producción de ácido L-láctico en medio definido con glucosa por C. sonorensis que contenía un gen pdc1 eliminado y un gen pdc2 alterado y que albergaba el gen que codifica LDH de L. helveticus integrado en el genoma

Los transformantes de C. sonorensis denominados 257-3, C40/288-2, C40/288-34 y C40/288-11 (descritos anteriormente en el Ejemplo 13) fueron cultivados y analizados según se describió en el Ejemplo 19, con la excepción de que las células fueron suspendidas a una DO_{600} = 18 para la fase de producción de lactato. El sobrenadante del cultivo fue analizado para determinar ácido láctico, glucosa y etanol según se describió anteriormente. Estos resultados están mostrados en la Tabla 48.

La cepa 257-3 pdc1- (en la que se había eliminado pdc1) produjo 89 g/l de ácido láctico en 48 horas, correspondiente a un rendimiento del 93% a partir de glucosa (g/g). Las cepas C40/288-2, C40/288-34 y C40/288-11, pdc1- (eliminado), pdc2- (pdc2 alterado), produjeron 86-87 g/l de ácido láctico en 72 horas, correspondiente a un rendimiento del 89-90% a partir de glucosa (g/g). No se detectó etanol en estos puntos de tiempo.

TABLA 48 Títulos y rendimientos de ácido láctico obtenidos en medio definido que contenía glucosa amortiguado con CaCO_{3}, después del consumo de toda la glucosa (inicialmente 96 g/l)

63

La descripción detallada y los ejemplos anteriores están destinados a ilustrar y no a limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

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<110> Rajgarhia, Vineet

\hskip1cm

Ilmen, Marja

\hskip1cm

Koivuranta, Kari

\hskip1cm

Penttila, Merja

\hskip1cm

Ruohonen, Laura

\hskip1cm

Suominen, Pirkko

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<120> MÉTODOS Y MATERIALES PARA LA PRODUCCIÓN DE PRODUCTOS ORGÁNICOS EN CANDIDA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> MBHB00-1237-D

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 50

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el gen de resistencia a G418

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<400> 1

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64

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<210> 2

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el gen de resistencia a G418 (3')

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<400> 2

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65

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<210> 3

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el promotor de TDH1 (C. sonorensis)

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<400> 3

\hskip1cm

66

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<210> 4

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el promotor de TDH1 (C. sonorensis)

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<400> 4

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67

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<210> 5

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el promotor de PGK1 (C. sonorensis)

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<400> 5

\hskip1cm

68

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<210> 6

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el promotor de PGK1 (C. sonorensis)

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<400> 6

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69

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<210> 7

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el gen de resistencia a higromicina (E. coli)

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<400> 7

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70

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<210> 8

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el gen de resistencia a higromicina (E. coli)

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<400> 8

\hskip1cm

71

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<210> 9

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el terminador de PDC1 (C. sonorensis)

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<400> 9

\hskip1cm

72

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<210> 10

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el terminador de PDC1 (C. sonorensis)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

73

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<210> 11

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<211> 42

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el promotor de PDC1 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

74

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<210> 12

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el promotor de PDC1 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

75

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<210> 13

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<211> 43

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador para el promotor de PDC2 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el promotor de PDC2 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el terminador de PDC2 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el terminador de PDC2 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para TDH (S. cerevisiae)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para TDH (S. cerevisiae)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para PGK1 (C. albicans)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para PGK1 (C. albicans)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para ARNr 26S (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para ARNr 26S (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebadores para aislar PDC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para aislar PDC

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características_varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)..(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n significa cualquier nucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características_varias

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)..(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n significa cualquier nucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región conservada de PDC en levaduras

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Región conservada de PDC en levaduras

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para los genes de ADH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para los genes de ADH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para ARNr 26S (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para ARNr 26S (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la secuencia de PGK1 (C. albicans)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la secuencia de PGK1 (C. albicans)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1235

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Fragmento digerido con NotI de 1.235 kpb que comprende el promotor de PGK de S. cerevisiae, un sitio de clonaje múltiple y el terminador de Gal10

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el aislamiento de LDH (B. megaterium)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el aislamiento de LDH (B. megaterium)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para introducir sitios de restricción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para introducir sitios de restricción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el aislamiento de LDH (R. oryzae)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el aislamiento de LDH (R. oryzae)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la introducción de sitios de restricción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para la introducción de sitios de restricción

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el promotor de PGK1 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el promotor de TDH1 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador para el promotor de PGK1 (C. sonorensis)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 957

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(957)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína LDH de B. megaterium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

108

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\hskip1cm

111

\hskip1cm

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 963

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rhizopus oryzae

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(963)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína LDH de R. oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\hskip1cm

114

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rhizopus oryzae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 972

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lactobacillus helveticus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(972)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína LDH de L. helveticus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

\hskip1cm

119

\hskip1cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lactobacillus helveticus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

121

\hskip1cm

122

Claims (39)

1. Una construcción de ácido nucleico recombinante que contiene un ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína lactato deshidrogenasa, en la que la proteína lactato deshidrogenasa está unida operativamente a un promotor funcional en una célula de levadura de una especie del género Candida, y en la que el plásmido no es un plásmido seleccionado de entre pMI205, pMI227, pMI246 o pMI247 según se muestra en las Figs. 24 y 25, y en la que la proteína lactato deshidrogenasa no es endógena para la célula de Candida.

2. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una proteína lactato deshidrogenasa de Bacillus megaterium.

3. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una proteína lactato deshidrogenasa de Lactobacillus helveticus.

4. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos codifica una proteína lactato deshidrogenasa de Rhizopus oryzae.

5. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, en la que el promotor procede de una especie de Candida que es Candida sonorensis, Candida parapsilosis, Candida naeodendra, Candida methanosorbosa, Candida entomophila, Candida krusei, Candida blankii o Candida diddensiae.

6. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, que contiene además un gen que codifica resistencia a un agente selectivo.

7. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 6, en la que el gen que codifica resistencia a un agente selectivo es un gen bacteriano de resistencia a neomicina, un gen de resistencia a kanamicina, un gen de resistencia a higromicina o un gen de resistencia a zeocina.

8. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, que contiene además un gen que codifica una proteína que procesa fuentes de carbono distintas de hexosas monosacarídicas.

9. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 8, en la que el gen codifica una alfa-galactosidasa.

10. La construcción de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 9, en la que el gen es MEL5 de levadura.

11. Una célula genéticamente modificada del género Candida, que contiene al menos un gen no endógeno que codifica una proteína lactato deshidrogenasa, con la condición de que la célula no sea una C. sonorensis transformada con

a)

el plásmido pMI246 cortado con BstBI;

b)

el plásmido pMI246 cortado con ApaI-BamHI;

c)

el plásmido pMI247 cortado con BstBI;

d)

el plásmido pMI247 cortado con ApaI-BamHI;

donde los plásmidos pMI246 y pMI247 están descritos en la Figura 25, y donde la célula expresa el gen no endógeno de la proteína lactato deshidrogenasa.

12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la lactato deshidrogenasa no endógena está codificada

a)

por una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o

b)

por un plásmido seleccionado de entre pMI205 y pMI227 mostrados en la Figura 24, o

c)

por un plásmido seleccionado de entre pMI246 y pMI247 mostrados en la Figura 25, con la condición de que estos plásmidos no estén cortados con BstBI ni con ApaI-BamHI.

13. La célula de la reivindicación 11, en la cual la actividad piruvato descarboxilasa (PDC) ha sido reducida.

14. La célula de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el gen no endógeno de la lactato deshidrogenasa está bajo el control de un promotor, donde el promotor procede de la especie de Candida que contiene la construcción de ácido nucleico recombinante.

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15. La célula de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el gen no endógeno de la lactato deshidrogenasa está bajo el control de un promotor, donde el promotor procede de una especie distinta de la especie de Candida que contiene la construcción de ácido nucleico recombinante.

16. La célula de la reivindicación 11, que es una célula de Candida sonorensis, Candida parapsilosis, Candida naeodendra, Candida methanosorbosa, Candida entomophila, Candida krusei, Candida blankii o Candida diddensiae.

17. La célula de la reivindicación 13, en la que la actividad piruvato descarboxilasa (PDC) ha sido reducida mediante deleción o mediante alteración genética del gen de la piruvato descarboxilasa 1 (pdc1) o del gen de la piruvato descarboxilasa 2 (pdc2) o de ambos (pdc1 y pdc2).

18. La célula de Candida de acuerdo con la reivindicación 17, modificada genéticamente con el fin de que contenga un gen pdc1 o pdc2 no funcional o eliminado, que se caracteriza por una reducción de al menos 10 veces de la producción de etanol cuando es cultivada en presencia de un medio definido con glucosa o de un medio rico en glucosa.

19. La célula de Candida de acuerdo con la reivindicación 17, que contiene una deleción en el locus de gen pdc1, una alteración en el locus del gen pdc2 y dos o más copias de genes no endógenos de lactato deshidrogenasa en el genoma celular en cada uno de los loci de pdc1 y pdc2.

20. La célula de la reivindicación 19, en la que las dos o más copias de los genes no endógenos de lactato deshidrogenasa están cada una de ellas unidas operativamente a un promotor que es transcripcionalmente activo en la célula de Candida.

21. La célula de la reivindicación 20, en la que el gen no endógeno de la lactato deshidrogenasa está unido operativamente a un promotor de pdc1 o pdc2.

22. La célula de Candida de la reivindicación 11, donde la célula tiene una actividad deshidrogenasa de ácido láctico incrementada con relación a la célula de Candida que no ha sido transformada.

23. Un método para producir ácido láctico que comprende las etapas de

a)

el cultivo de una célula de acuerdo con la reivindicación 11 bajo condiciones que permitan la proliferación de la célula; y

b)

la fermentación del cultivo celular de (a) en un medio nutricio que contiene un azúcar, bajo condiciones mediante las cuales la cantidad de azúcar convertido por la célula en ácido láctico está incrementada con relación a la cantidad de azúcar convertido en ácido láctico por una célula de Candida no transforma- da,

donde el método no es el método de ninguna de las Figuras 26 (A) a (G).

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el ácido láctico es ácido L-láctico.

25. El método de la reivindicación 23, en el que la célula es una célula de Candida sonorensis o una célula de Candida methanosorbosa.

26. El método de la reivindicación 25, en el cual el al menos un gen no endógeno de lactato deshidrogenasa es seleccionado de entre un gen de lactato deshidrogenasa de L. helveticus, B. megaterium o R. oryzae, o una combinación de los mismos.

27. El método de la reivindicación 23, en el que las células son cultivadas en un medio que es un medio amortiguado, en el que el medio es amortiguado con el fin de mantener un pH en el medio nutricio de pH 5 aproximadamente a pH 9 aproximadamente.

28. El método de la reivindicación 23, en el que el pH final del medio de cultivo después de la producción de ácido láctico es de pH 2,6 aproximadamente a pH 5 aproximadamente.

29. El método de la reivindicación 23, en el que la etapa de fermentación se lleva a cabo bajo una atmósfera que contiene no más del 2% de oxígeno.

30. El método de la reivindicación 23, en el que la etapa de fermentación se lleva a cabo bajo condiciones anaeróbicas.

31. El método de la reivindicación 23, en el que el azúcar del medio nutricio es una o una pluralidad de hexosas, una o una pluralidad de pentosas, o combinaciones de las mismas.

32. El método de la reivindicación 23, en el que el azúcar del medio nutricio es glucosa, xilosa o L-arabinosa, o combinaciones de las mismas.

33. El método de la reivindicación 32, en el que cuando el azúcar del medio nutricio es glucosa, el rendimiento de ácido láctico relativo a la cantidad de glucosa consumida por la célula es de al menos un 60% en peso.

34. El método de la reivindicación 32, en el que cuando el azúcar del medio nutricio es xilosa, el rendimiento de ácido láctico relativo a la cantidad de xilosa consumida por la célula es de al menos un 15% en peso.

35. El método de la reivindicación 32, en el que cuando el azúcar del medio nutricio es L-arabinosa, el rendimiento de ácido láctico relativo a la cantidad de L-arabinosa consumida por la célula es de al menos un 20% en peso.

36. El método de la reivindicación 23, en el que la célula de Candida es una célula de Candida diddensiae, Candida parapsilosis, Candida naeodendra, Candida krusei, Candida blakii, Candida methanosorbosa o Candida entomophila.

37. Un método para reducir la actividad piruvato descarboxilasa en una célula de acuerdo con la reivindicación 11 mediante la eliminación o la alteración del gen que codifica piruvato descarboxilasa 1 (pdc1), del gen que codifica piruvato descarboxilasa 2 (pdc2) o de ambos pdc1 y pdc2, comprendiendo dicho método la transformación de la célula con una construcción de ácido nucleico recombinante que contiene un gen seleccionable flanqueado por secuencias flanqueantes 5' y 3' procedentes de pdc1, pdc2 o de ambos pdc1 y pdc2.

38. Una célula de Candida modificada genéticamente producida mediante el método de la reivindicación 37.

39. Utilización del método de la reivindicación 23 para producir plásticos a partir de ácido láctico.