CN101287824A

CN101287824A - 东方伊氏酵母种及密切相关物种的基因修饰的酵母和采用它们的发酵方法

Info

Publication number: CN101287824A
Application number: CNA2006800285014A
Authority: CN
Inventors: P·索米宁; A·阿里斯蒂多; M·潘蒂拉; M·伊尔门; L·罗霍宁; K·科伊武兰塔; K·罗伯特-佩雷斯
Original assignee: Cargill Inc
Current assignee: Cargill Inc
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2008-10-15
Also published as: KR20080028902A; CA2611028A1; AR055964A1; US20120129230A1; EP1885842A2; WO2007032792A3; US8097448B2; AU2006291566A8; ZA200711038B; WO2007032792A2; AU2006291566A1; JP2008545429A; BRPI0610951A2; US20090226989A1; EP1885842A4; MX2007015170A

Abstract

用载体转化物种东方伊氏酵母及密切相关的酵母种的细胞，以导入外源乳酸脱氢酶基因。所述细胞有效产生乳酸，并且在低pH下抗高乳酸滴度条件。

Description

东方伊氏酵母种及密切相关物种的基因修饰的酵母和采用它们的发酵方法

本发明是在与美国能源部的DE-FC07-021D14349号合同下进行的。美国政府对本发明有某些权利。

本申请要求2005年6月2日提交的美国临时专利申请60/686,899的优先权。

本发明涉及某些基因修饰的酵母种。

某些有机酸，如乳酸，是通过工业发酵方法制造的。用各种类型的细菌种进行发酵，所述细菌种消耗糖类(主要是葡萄糖)，并且将这些糖类转化为需要的酸。

由于一些原因，需要开发用于从糖底物生产有机酸的酵母或真菌生物催化剂。很多细菌不能合成它们生长和有效代谢糖类所需的一些氨基酸或蛋白。因此，通常必须给细菌供给某种程度上复杂的营养物包。这增加了操作发酵所需的直接花费。培养液的复杂程度的增加使得更难以合理纯的形式回收发酵产物，因此，导致回收产物的操作和资金花费增加。另一方面，很多酵母种可以从无机氮化合物合成它们需要的氨基酸或蛋白。它们通常在所谓的“确定成分”培养基中良好生长和发酵，所述培养基经过简化，通常价格较低，并且在产物回收操作中带来较少的困难。

有兴趣将酵母用作有机酸生产的生物催化剂的另一个原因与产物自身的性质相关。为了采用经济上可行的方法，必须在发酵培养液中积累高浓度的有机酸产物。除了关于毒性的正常考虑(当以高浓度存在时，发酵产物可能对生物催化剂有毒)，当发酵产物是酸时，存在关于酸度的额外考虑。随着产生更多的有机酸，培养基的酸性越来越高。大多数产生这些有机酸的细菌在强酸性环境中的表现不佳-它们在这些条件下不能存活，或产生产物太慢，以至于在经济上不可行。

由于此原因，通过加入中和形成的酸的试剂，缓冲了商业酸发酵过程。这使培养液保持在中性pH或接近中性pH，并且使得细菌能够生长和有效生产。但是，这将酸转化成盐，随后必须分离这些盐，以获得需要的酸形式的产物。

最常见的缓冲剂是钙化合物，其中和有机酸，形成相应的钙盐。从发酵培养液回收钙盐后，通过加入无机酸(典型是硫酸)分离所述盐，以重新得到有机酸并且形成无机酸的不溶性钙盐。因此，该方法涉及缓冲剂和无机酸的直接消耗，以及操作和处理不需要的钙盐副产物的花费。如果生物催化剂能够在低pH条件下生长和有效生产，则这些花费可以减少或消除。

酵母种被认为是所述低pH发酵的候选物。很多酵母种天然发酵己糖产生乙醇，但很少(如果有)天然产生需要的有机酸，如乳酸。进行了很多努力，对多种酵母种进行基因修饰，以插入一种或多种使得细胞能够产生乳酸的基因。为了将糖代谢从乙醇生产转向乳酸生产，也对这些细胞进行了基因修饰，以破坏或缺失天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因。该工作描述于例如WO 99/14335，WO 00/71738A1，WO 02/42471A2，WO 03/049525A2，WO 03/102152A2和WO 03/102201A2。这些公开内容中描述的大部分努力集中在克鲁维氏酵母种，如马克斯克鲁维氏酵母，和某些分类在假丝酵母属中的种，如C.sonorensis和C.methanosorbosa。

仍然需要提供用于有机酸发酵方法的甚至更好的生物催化剂。这些发酵方法的生物催化剂理想地可以实现高体积生产率和单位生产率；从发酵底物生产需要的有机酸的高产率；在酸性条件下生长和以合理效率生产的能力；以及在微需氧，特别是无氧条件下生长和以合理效率生产的能力。生物催化剂优选可以利用简化的确定成分培养基实现这些结果。

一方面，本发明是东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝中的物种的基因修饰的酵母细胞，其具有整合到其基因组中的至少一种外源性乳酸脱氢酶基因。

本发明也是一种发酵方法，其中在包含可发酵的糖的发酵培养液中在发酵条件下培养第一方面的基因修饰的酵母细胞，以便生产乳酸或其盐。

此外，本发明是一种发酵方法，其中在包含可发酵的糖的发酵培养液中在发酵条件下培养第一方面的基因修饰的酵母细胞，以便生产乳酸或其盐，其中发酵的至少一部分时间中发酵培养液的pH是在约1.5-约4.5的范围内。

已经出乎意料地发现，本发明的修饰的细胞表现出对适度低的pH、高乳酸滴度条件的优越耐受性，并且能够在未缓冲的培养基中，甚至在无氧或准无氧条件下以良好的速度生长和生产乳酸。此外，修饰的细胞在确定成分培养基中生长良好。

图1是描述pMI318质粒的图解。

图2是描述pMI320质粒的图解。

图3是描述pMI321质粒的图解。

图4是描述pMI355质粒的图解。

图5是描述pMI356质粒的图解。

图6是描述pMI357质粒的图解。

图7是描述pMI319质粒的图解。

图8是描述pMI433质粒的图解。

图9是描述pMM25质粒的图解。

图10是描述pMM28质粒的图解。

图11是描述pMI445质粒的图解。

图12是描述pMM35质粒的图解。

图13是描述pMI446质粒的图解。

图14是描述pMI447质粒的图解。

图15是描述pMI448质粒的图解。

图16是描述pMI457质粒的图解。

图17是描述pMI458质粒的图解。

图18是描述pMI449质粒的图解。

图19是描述pMI454质粒的图解。

图20是描述pBH165质粒的图解。

图21是描述pMI464质粒的图解。

通过对宿主酵母细胞进行某些基因修饰，制备本发明的基因修饰的酵母。宿主细胞是包含在东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝范围内的物种的细胞。该进化枝是最终末的进化枝，其至少包括以下物种：东方伊氏酵母、Pichia galeiformis、毕赤氏酵母种YB-4149(NRRL名称)、Candida ethanolica、P.deserticola、膜醭毕赤氏酵母(P.membranifaciens)和发酵性毕赤氏酵母。通过用Kurtzman和Robnett在“Identification andPhylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysis of Nuclear Large Subunit(26S)Ribosomal DNA Partial Sequences”，Antonie van Leeuwenhoek73：331-371，1998中描述的方法分析酵母种的26S核糖体DNA的可变D1/D2结构域，鉴定东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝的成员，该文献在此引入作为参考。特别参见第349页。来自数百种子囊菌的26S核糖体DNA的可变D1/D2结构域的分析揭示了东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝含有非常密切相关的物种。东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝的成员与该进化枝外的酵母种相比，26S核糖体DNA的可变D1/D2结构域与该进化枝的其它成员的所述结构域具有更大相似性。因此，采用Kurtzman和Robnett的方法，可以通过比较它们各自的核糖体DNA的D1/D2结构域，并且与该进化枝的其它成员和该进化枝外的密切相关物种的该结构域，可以鉴定东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝的其它成员。

当首次表征时，物种东方伊氏酵母命名为库德齐维氏毕赤氏酵母。东方伊氏酵母的无性型(无性形式)称作克鲁斯氏假丝酵母。

特别合适的宿主细胞是东方伊氏酵母株ATCC 32196。另一特别合适的宿主细胞是东方伊氏酵母株ATCC PTA-6658。

本发明的细胞含有至少一种整合到其基因组中的功能性外源乳酸脱氢酶(LDH)基因。LDH基因是任何编码乳酸脱氢酶，即具有乳酸脱氢酶活性的酶的基因。“乳酸脱氢酶活性”是指蛋白催化丙酮酸转化为乳酸的反应的能力。乳酸脱氢酶包括(但不限于)由酶委员会编号1.1.1.27和1.1.1.28分类的那些。

在上下文中，“外源性”表示考虑的遗传物质(在此情况下是LDH基因)对于宿主菌株不是天然的。本文中针对宿主细胞的野生型细胞的基因组中存在(除了不影响功能的个体-个体的突变)的遗传物质(如基因、启动子或终止子)使用。

LDH基因可以使修饰的细胞产生L-或D-乳酸立体异构体。本发明的修饰细胞可以含有L-和D-LDH基因，因此，能够生产两种乳酸立体异构体。但是，优选仅仅存在L-或仅仅存在D-乳酸立体异构体，使得细胞生产光学纯度更高的乳酸产物。

合适的LDH基因包括获自细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源的那些。特定L-LDH基因的实例包括获自瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸片球菌、米根霉和牛来源，如原牛的那些。特定的D-LDH基因的实例是获自瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和乳酸片球菌的那些。与所述L-LDH或D-LDH基因相同的基因，或在氨基酸水平相对于所述基因具有至少35％、60％、70％或80％的同一性评分的基因是合适的。如果必须提供从通常的真核起始密码子(ATG)开始的编码序列，或为了其它目的，获自任何上述来源的天然基因可能进行诱变。优选的L-LDH基因是获自瑞士乳杆菌的L-LDH基因或相对于所述基因具有至少35％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的同一性评分的基因。另一种优选的L-LDH基因是获自巨大芽孢杆菌的L-LDH基因，或与所述基因相比具有至少35％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的同一性评分的基因。另一种优选的L-LDH基因是获自原牛的L-LDH基因，或与所述基因相比具有至少35％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的同一性评分的基因。优选的D-LDH基因是获自瑞士乳杆菌的D-LDH基因或与所述基因相比具有至少45％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的同一性评分的基因。

对于本发明的目的，DNA、RNA或蛋白的氨基酸序列的同一性评分是用具有默认参数的BLAST 2.2.1版软件计算的。

特别合适的LDH基因包括编码具有一种氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列与表示为SEQ.ID.NO.93的序列(WO 03/049525中的SEQ.ID.NO.45)相比或与表示为SEQ.ID.NO.94的序列(WO 03/049525中的SEQ.ID.NO.49)相比具有至少60％，特别是至少80％、85％或95％的同一性评分。特别合适的LDH基因也包括编码具有一种蛋白序列的酶，所述蛋白序列与SEQ.ID.NO.95或SEQ.ID.NO.96(分别是WO03/049525中的SEQ ID.NO.46和50)相比，具有至少60％、80％、85％或95％的同一性评分。

转化的细胞可以包含单个LDH基因或多个LDH基因，例如1-10个LDH基因，特别是1-5个LDH基因。当转化的细胞含有多个LDH基因时，各个基因可以是相同基因的拷贝，或包括两个或多个不同LDH基因的拷贝。多个拷贝的外源LDH基因可以整合到宿主细胞基因组内的单个基因座(使得它们彼此相邻)，或一些基因座。

外源LDH基因处于一个或多个启动子和一个或多个终止子的转录控制下，所述启动子和终止子在修饰的酵母细胞中都是功能性的。如本文用到的，术语“启动子”是指位于结构基因的翻译起始密码子上游(即5’)(通常在约1-1000bp内，优选1-500bp，特别是1-100bp)，并且控制结构基因的转录起始的未翻译序列。类似地，术语“终止子”表示位于结构基因的翻译终止密码子下游(即3’)(通常在约1-1000bp内，更典型是1-100碱基对，特别是1-100碱基对)并且控制结构基因的转录终止的未翻译序列。根据实际情况，如果启动子或终止子在基因组中的位置相对于结构基因的位置使得启动子或终止子能够行使其转录控制功能，则它们是与结构基因“操作性连接的”。

启动子和终止子序列可能是东方伊氏酵母天然的，或对于细胞是外源的。有用的启动子和终止子序列包括分别与宿主细胞天然的启动子和终止子序列的功能部分相比在它们的功能部分具有高度同一性(即具有90％或更多的同一性评分，特别是95％或更多，更优选99％或更多)的那些，特别是当外源基因的插入靶定在细胞基因组的特定位点时。

一种合适类型的启动子相对于酵母基因的天然启动子具有至少90％、95％或99％的同一性评分。一种更合适类型的启动子与宿主细胞的天然基因启动子相比具有具有至少90％、95％或99％的同一性评分。特别有用的启动子包括酵母丙酮酸脱氢酶(PDC)、磷酸甘油激酶(PGK)和转录延伸因子-1(TEF-1)基因的启动子，特别是来自各自的东方伊氏酵母基因。一种特别有用的启动子包括东方伊氏酵母PGK基因的启动子的功能部分。

一种合适类型的终止子与酵母的天然基因的终止子相比具有至少90％、95％或99％的同一性评分。终止子可以与宿主细胞的天然基因终止子具有至少90％、95％或99％同源的同一性评分。特别有用的终止子包括酵母丙酮酸脱羧酶(PDC)、木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)或异-2-细胞色素c(CYC)基因的终止子，或酵母中半乳糖基因家族的终止子，特别是所谓的GAL10终止子。特别优选的终止子包括宿主细胞的PDC基因的终止子的功能部分。

(宿主细胞)天然的启动子和终止子和它们各自的上游和下游侧翼区的使用可以防止LDH基因靶向整合到宿主细胞基因组的特定基因座，并且用于同时整合LDH基因和缺失另一种天然基因，例如PDC基因。

将不同的外源LDH基因置于不同类型启动子和/或终止子的控制下是可能的。

外源LDH基因可以随机整合到宿主细胞的基因组中，或插入一个或多个靶定的位点。靶定的位点的实例包括希望缺失或破坏的基因，如PDC基因的基因座。可以在缺失或破坏天然PDC基因，或不缺失或破坏天然PDC基因的条件下实现在PDC基因座的整合，但通常优选破坏或缺失PDC基因，使得修饰的细胞产生较少乙醇。

宿主细胞可以含有多个PDC基因。例如，天然东方伊氏酵母细胞含有两个PDC基因，在本文中称作IoPDC1A和IoPDC1B。在一些菌株，包括ATCC PTA-6658中，它们在野生型生物的DNA分析后分别显现为约8kbp和约10kbp的HindIII条带。其它东方伊氏酵母株，例如ATCC32196，表现出具有产生相似大小的条带的两种等位基因。当宿主细胞含有多个PDC基因时，优选缺失或破坏至少其中之一，优选破坏全部，因为这破坏了细胞生产乙醇的能力。因此，在东方伊氏酵母中，优选破坏IoPDC1A或IoPDC1B基因，更优选破坏IoPDC1A和IoPDC1B基因两者。

“缺失或破坏”表示消除(缺失)基因的整个编码区，或修饰基因或其启动子和/或终止子区(例如通过缺失、插入或突变)，使得基因不再产生活性酶，或产生活性严重降低的酶。可以通过基因工程方法、强制进化或诱变和/或选择或筛选，实现缺失或破坏。实现此目的的优选方式是用含有LDH基因的盒替代PDC基因，如下文更完整的描述。

通过设计和构建合适的载体并且用这些载体转化宿主细胞，在一个或多个步骤中实现了宿主细胞的基因修饰。可以采用电穿孔和/或化学(如基于氯化钙或醋酸锂)转化方法。用于转化酵母株从而插入外源LDH基因的方法描述于WO 99/14335，WO 00/71738，WO 02/42471，WO03/102201，WO 03/102152和WO 03/049525；这些方法通常适用于根据本发明转化东方伊氏酵母细胞。可以用特定限制酶切割载体，或用作环状DNA。

概言之，制备含有LDH基因和相关启动子和终止子序列的载体。载体可以含有多种类型的限制位点，用于线性化或片段化。载体可以进一步含有主链部分(例如用于在大肠杆菌中增殖)，其中的许多方便地获自可商购的酵母或细菌载体。

载体优选含有一个或多个选择标记基因盒。“选择标记基因”编码转化的细胞在选择性培养基中存活和/或生长所需的蛋白。典型的选择标记基因编码的蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素，如zeocin(印度斯坦链异壁菌的sh ble基因)、G418(Tn903的卡那霉素抗性基因)、潮霉素(大肠杆菌的氨基糖苷类抗生素抗性基因)、氨苄青霉素、四环素或卡那霉素，(b)补充细胞的营养缺陷。营养缺陷的两个突出的实例是氨基酸-亮氨酸缺陷(如LEU2基因)或尿嘧啶缺陷(如URA3基因)。乳清苷-5’-磷酸脱羧酶阴性(ura3^-)细胞不能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长。因此，功能性URA3基因可以用作具有尿嘧啶缺陷的细胞上的标记物，并且可以在缺乏尿嘧啶的培养基上选择成功的转化体。仅有功能性URA3基因转化的细胞能够合成尿嘧啶，并且在所述培养基上生长。如果野生型菌株不具有尿嘧啶缺陷(例如东方伊氏酵母的情况)，则必须制备具有缺陷的营养缺陷突变体，以便用URA3作为菌株的选择标记。实现这一目的的方法是本领域公知的。

优选的选择标记包括zeocin抗性基因、G418抗性基因、潮霉素抗性基因和MEL5(蜜二糖酶基因)。选择标记盒将进一步包含启动子和终止子序列，它们与选择标记基因操作性连接，并且在东方伊氏酵母中是可操作的。合适的启动子包括上文针对LDH基因描述的那些，以及例如描述于WO 99/14335，WO 00/71738，WO 02/42471，WO 03/102201，WO 03/102152和WO 03/049525的其它启动子。特别优选的启动子是宿主菌株的PGK或PDC启动子(或其功能部分)，或与所述PGK或PDC启动子相比具有至少80、85、90或95％同一性评分的序列。合适的终止子包括上文针对LDH基因描述的那些。启动子或终止子(或这两者)可以与LDH基因使用的那些相同。

可以通过构建具有与靶基因的上游(5’-)和下游(3’-)侧翼区具有高度同一性(即80％或更高，优选95％或更高，或最优选100％的同一性评分)的区域的载体，实现靶定的整合。这些区域中的一个，或全部这两个区域可以包含靶基因的编码区的一部分以及各自的启动子或终止子区的一部分或全部。LDH盒(包括相关启动子和终止子，前提是它们与靶基因的启动子和终止子不同)和选择标记(在需要的情况下具有相关启动子和终止子)将位于载体中与靶基因的上游和下游侧翼区具有高度同一性的区域之间。如上文提到的，优选的靶基因是IoPDC1或IoPDC1B基因(或这两者)，因为这两种基因之一或全部两种的破坏或缺失是优选的。但是，其它天然基因也可以作为用于插入LDH基因盒的靶。

通过利用标记基因带来的属性，或通过插入的基因带来的其它特征(例如产生乳酸的能力、不能产生乙醇、或在特定底物上生长的能力)，可以通过已知方式选择成功的转化体。可以通过PCR或DNA印迹分析进行筛选，以证实发生了需要的插入和缺失，证实拷贝数，并且鉴定基因整合到宿主细胞基因座中的点。插入的基因编码的酶的活性和/或缺失的基因编码的酶的活性的缺乏可以用已知的测定方法证实。

可以通过多种途径实现PDC基因的缺失或破坏，包括，例如与WO 99/14335，WO 02/42471，WO 03/049525，WO 03/102152和WO03/102201中描述的方法类似的方法。在一种特别感兴趣的方法(关于转化东方伊氏酵母)中，(1)克隆了东方伊氏酵母PDC基因之一的5’和3’侧翼区，任选与一部分功能性PDC基因一起克隆，(2)制备了含有5’和3’侧翼区的载体，和(3)用载体转化了东方伊氏酵母细胞。同源重组事件导致功能性PDC基因的缺失。已经发现IOPDC1A的5’和3’侧翼区可以用于载体中，以便缺失或破坏IOPDC1A和IOPDC1B。可以用类似的方法破坏或缺失用于本发明的其它宿主细胞中的一个或多个PDC基因。

PDC缺失或破坏载体可以包含一个或多个功能性结构基因，特别是上文描述的LDH基因，其插入宿主细胞的PDC基因之一的5’和3’侧翼部分之间。功能性基因优选包括操作性连接于结构基因的功能性启动子和终止子序列。该方法使得能够同时缺失PDC基因和插入功能性基因。载体可以包含需选择标记基因来代替结构基因，或除结构基因外还包含选择标记基因。再次，选择标记基因位于载体中被靶定的PDC基因的5’和3’侧翼部分之间，并且插入在功能性PDC基因的基因座中。选择标记基因的使用具有引入选择成功转化体的手段的优点。但是，基于产生乙醇的能力减少或消除来选择成功的转化体是可能的，特别是在多个PDC基因破坏或缺失的转化体中(例如东方伊氏酵母的IOPDC1A和IOPDC1B基因)。

在东方伊氏酵母中，通过用含有任一靶基因的5’侧翼区、包含相关启动子和终止子的功能性基因盒和/或包含相关启动子和终止子的选择标记基因盒以及任一靶基因的3’侧翼区的单个载体转化宿主菌株，可以在单个步骤中消除IOPDC1A和IOPDC1B。所述载体的一个实例是在实施例2B中称作PMI356的载体。用所述载体转化东方伊氏酵母，产生了缺失单个PDC等位基因的转化体，和缺失IOPDC1A和IOPDC1B等位基因两者的转化体。典型地，用功能性LDH基因(或其它结构基因)取代PDC等位基因中的至少一个。再次，类似的方法可以用于具有多个PDC等位基因的宿主细胞。

或者，可以在两步方法中去除东方伊氏酵母中的IOPDC1A和IOPDC1B。例如，可以用上文描述的载体转化东方伊氏酵母，用相象或类似的载体二次转化单个PDC缺失的菌株，以消除第二PDC等位基因。下文的实施例2D和3B举例说明了这样的方法。

本发明的基因修饰的酵母细胞可以包含额外的基因修饰，其给细胞提供一些需要的特性。特别感兴趣的其它修饰给细胞赋予发酵戊糖得到需要的发酵产物的能力。所述修饰中包括(1)插入功能性的外源木糖异构酶基因，(2)缺失或破坏产生催化木糖转化为木糖醇的酶的天然基因，(3)缺失或破坏功能性木糖醇脱氢酶基因和/或(4)导致细胞超量表达功能性木酮糖激酶的修饰。将所述修饰导入酵母细胞的方法描述于例如WO04/099381，在此引入作为参考。

在本发明的发酵方法中，在包含可以被转化的细胞发酵的糖的发酵培养基中培养本发明的细胞。所述糖可以是己糖，如葡萄糖、聚糖或葡萄糖的其它聚合物、葡萄糖寡聚物，如麦芽糖、麦芽三糖和异麦芽三糖、戊糖、果糖和果糖寡聚物。如果修饰细胞以赋予发酵戊糖的能力，发酵培养基可以包含戊糖，如木糖、木聚糖或木糖的其它寡聚物。所述戊糖合适地是含有半纤维素的生物物质的水解产物。在寡糖的情况下，可能必须在发酵培养液中加入酶，以便将其消化为用于由细胞发酵的相应单体糖。

培养基典型地含有特定细胞所需的营养物质，包括氮源(如氨基酸、蛋白、无机氮源，如氨水或铵盐等)和各种维生素、矿物质等。东方伊氏酵母能够从无机源满足其对氮、磷和镁的需要，并且因此能够在含有这些元素的无机源的化学确定成分培养基中生长和发酵。因此，可以在所述化学确定成分培养基中培养本发明的细胞。但是，也可以在不是化学成分确定的复杂培养基中培养本发明的细胞，所述培养基可以含有无机氮来源，如蛋白、部分消化的蛋白或氨基酸。

其它发酵条件，如温度、细胞密度、底物选择、营养物质的选择等，不认为对本发明是关键的，并且通常选择用于提供经济的方法。每个生长阶段和生产阶段的温度可以从高于培养基的冷冻温度到约50℃。优选的温度，特别是生产阶段的优选温度是约30-45℃。

在生产阶段，发酵培养基中的细胞浓度典型地是约0.1-20，优选约0.1-5，甚至更优选约1-3g干细胞/升发酵培养基。

发酵可以在需氧条件、微需氧条件或无氧条件下进行。准无氧条件也可以使用，其中在发酵期间不加入氧气，但在发酵开始时发酵培养基中存在溶解的氧。如果需要，可以将单位氧气摄取速度用作过程控制，如WO 03/102200中的描述。本发明的细胞显示出在甚至无氧条件下以良好的体积生产率和单位生产率将糖发酵为乳酸或乳酸/乙醇混合物的能力。

当发酵产物是酸时，可以在发酵的生产阶段对培养基进行缓冲，使得pH保持在约5.0-9.0的范围，优选约5.5-约7.0。合适的缓冲剂是碱性物质，其中和形成的乳酸，所述碱性物质包括例如氢氧化钙、碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨水、氢氧化铵等。概言之，用于常规发酵方法中的缓冲剂在这里也是合适的。

在缓冲的发酵中，将酸性发酵产物，如乳酸在其形成时中和为相应的盐。因此，酸的回收包括重新产生游离酸。典型地，通过除去细胞并且用诸如硫酸的强酸对发酵培养液进行酸化而实现。形成了盐副产物(当钙盐是中和剂并且硫酸是酸化剂的情况下是石膏)，将其从酸中分离。然后通过诸如描述于T.B.Vickroy，Vol.3，Chapter 38 ofComprehensive Biotechnology，(ed.M.Moo-Young)，Pergamon，Oxford，1985；R.Datta，et al.，FEMS Microbiol.Rev.，1995；16：221-231；美国专利Nos.4,275,234，4,771,001，5,132,456，5,420,304，5,510,526，5,641,406和5,831,122，以及WO 93/00440中的液体-液体萃取、蒸馏、吸附等技术回收酸。

但是，优选进行发酵，使得发酵终末时培养基的pH是酸性发酵产物的pKa或低于该pKa。合适的最终pH合适地是约1.5-约3.5，约1.5-约30，或约1.5-约2.5。起始pH可能在某种程度上较高，例如约3.5-约6.0，特别是约3.5-约5.5，或可以调节到1.5-约3.5的更酸性的pH。已经证明了本发明的细胞具有出乎意料的在pH低于3.5，低于3.0，低于2.5，甚至低于2.0的酸性发酵培养基中良好生长和生产的能力。已经发现仅仅具有基本基因修饰，如插入LDH基因和缺失IoPDC1A和IoPDC1B基因的东方伊氏酵母细胞在最初含有10重量％葡萄糖的未缓冲培养基中在无氧条件下生产15-20g/L乳酸。

可以用诸如描述于美国专利Nos.6,229,046中的方法进行乳酸从低pH发酵培养基中的回收。

本发明的方法可以连续、分批或其组合的方式进行。

提供了以下实施例来说明本发明，但不意欲限制其范围。除非另外指出，所有份和百分比都是重量份和重量百分比。

实施例1A：克隆东方伊氏酵母PGK(IoPGK1)启动子；构建具有IoPGK1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子控制下的大肠杆菌潮霉素基因的质粒(pMI318，图1)

以与WO 02/042471的实施例22的描述相同的方式，用表示为SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的引物从C.sonorensis的基因组DNA获得C.sonorensis PGK1基因的920bp探针片段。从生长中的东方伊氏酵母株分离基因组DNA，重悬于10mM Tris-HCl+1mM EDTA(pH 8)(TE)中。用HindIII切割东方伊氏酵母基因组DNA，制备DNA印迹，并且采用C.sonorensis PGK1基因作为探针，用常规方法杂交。从琼脂糖凝胶分离约2kb大小的片段，克隆到HindIII切割的质粒。具有PGK1探针的大肠杆菌转化体的菌落杂交导致分离了含有大多数东方伊氏酵母PGK1(IoPGK1)蛋白编码序列，但不含启动子的HingIII片段，这是通过测序证实的。

用连接介导的PCR扩增(Mueller，P.R.and Wold，B.1989，“In vivofootprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR.”Science 246：780-786)获得含有IoPGK1启动子区的基因组片段。用T4DNA连接酶(New England BioLabs)将表示为SEQ.ID.NO.3的接头和表示为SEQ.ID.NO.4的接头的混合物连接到HaeIII消化的东方伊氏酵母基因组DNA中。连接混合物的样品用作50μl PCR反应的模板，该反应含有0.1μM表示为SEQ.ID.NO.5的引物和1μM表示为SEQ.ID.NO.6的引物。加入2U Dynazyme EXT后，将反应混合物在94℃加热3分钟。如下使反应循环30次：94℃下1分钟，68℃下2分钟，和72℃下2分钟，最后在72℃下延伸10分钟。将该第一次PCR扩增的稀释样品用作嵌套PCR反应(50μl)的模板，所述嵌套PCR反应含有0.05μM表示为SEQ.ID.NO，7的引物和0.5μM表示为SEQ.ID.NO.8的引物。加入2U Dynazyme EXT后，将反应混合物在94℃加热3分钟。然后如下使反应循环30次：94℃下1分钟，67℃下2分钟，和72℃下2分钟，最后在72℃下延伸10分钟。

分离约600bp的PCR片段并测序。设计了表示为SEQ.ID.NO.9和SEQ.ID.NO.10的嵌套引物，并且类似上文的描述与表示为SEQ.ID.NO.11和SEQ.ID.NO.12的寡核苷酸一起用于连接介导的PCR扩增中，不同之处是采用了消化的东方伊氏酵母DNA，并且PCR是采用65℃的退火温度进行的。

用表示为SEQ.ID.NO.13和SEQ.ID.NO.14的引物和作为模板的东方伊氏酵母基因组DNA对东方伊氏酵母PGK1启动子进行PCR扩增。用Klenow酶填充片段，然后用XbaI切割。凝胶分离633bp的片段，连接到4428bp片段，所述片段是通过以下步骤获得的：用XhoI消化命名为pMI270的质粒(描述于WO 03/049525的图4)，用Klenow酶和0.1mM dNTP填充该片段，然后用XbaI消化。质粒pMI270含有与C.sonorensis PGK1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子连接的大肠杆菌潮霉素基因。得到的质粒命名为pMI318(图1)。质粒pMI318含有东方伊氏酵母PGK1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子控制下的大肠杆菌潮霉素基因。

实施例1B：构建含有IoPGK1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子控制下的潮霉素基因以及IoPGK1启动子和啤酒糖酵母CYC1终止子控制下的瑞士乳杆菌LDH基因的质粒(pMI321，图3)。

用表示为SEQ.ID.NO.15和SEQ.ID.NO.16的引物，并且用东方伊氏酵母基基因组DNA作为模板，对来自实施例1A的东方伊氏酵母PGK1启动子进行PCR扩增。用Klenow酶和0.1mM dNTP填充该片段，然后用NcoI切割。凝胶分离633bp的片段。

质粒pVR1(描述于WO 03/102152图7)含有啤酒糖酵母TEF1启动子和啤酒糖酵母CYC1终止子控制下的瑞士乳杆菌LDH基因。用XhoI消化质粒pVR1，用Klenow酶填充，用NcoI切割。将来自质粒pVR1的7386bp片段连接于633 bp IoPGK1启动子片段。得到的质粒命名为pMI320(图2)。质粒pMI320含有IoPGK1启动子和啤酒糖酵母CYC1终止子控制下的瑞士乳杆菌LDH基因。

用ApaI和NotI消化质粒pMI318(实施例1A，图1)和pMI320。将来自质粒pMI318的5008bp片段连接于来自质粒pMI320的1995bp片段，形成质粒pMI321(图3)。

潮霉素基因(及其终止子)位于质粒pMI321上的两个拷贝的IoPGK1启动子之间。该构建体可以允许质粒pMI321转化的细胞参与同源重组，以便“排出”潮霉素基因和终止子，以及一个拷贝的IoPGK1启动子。

实施例1C：通过用部分消化的质粒pMI321(图3，实施例1B)转化野生型东方伊氏酵母，制备具有整合的LDH基因和潮霉素抗性基因的东方伊氏酵母突变体(CD 990)。

用XhoI对质粒pMI321进行部分限制性消化，将得到的线性和环状DNA的混合物用于采用Gietz et al.(1992，Nucleic Acids Rs.20：1425)中描述的标准醋酸锂方法转化命名为ATCC PTA-6658的野生型东方伊氏酵母株。筛选转化细胞的潮霉素抗性。培养一些潮霉素抗性菌落，分析培养基中的乳酸产生。产生乳酸的潮霉素抗性菌落命名为菌株CD990。

实施例1D：通过用部分消化的质粒pMI321(图3，实施例1B)转化野生型东方伊氏酵母，制备具有整合的LDH基因和潮霉素抗性基因的东方伊氏酵母突变体。

用XhoI对质粒pMI321进行部分限制性消化，将得到的线性和环状DNA的混合物用于采用上文描述的标准醋酸锂方法转化野生型东方伊氏酵母株ATCC 32196。筛选转化细胞的潮霉素抗性。培养一些潮霉素抗性菌落，分析培养基中的乳酸产生。发现一些菌落产生乳酸。

实施例1E：通过用部分消化的质粒pMI320和消化的质粒pMI321(图2、3，实施例1B)转化野生型东方伊氏酵母，制备具有整合的LDH基因和潮霉素抗性基因的东方伊氏酵母突变体。

用XhoI对质粒pMI320进行部分消化。用SmaI和SalI消化质粒pMI321。合并消化的材料，用于采用上文描述的标准醋酸锂方法转化野生型东方伊氏酵母株ATCC PTA-6658。筛选转化细胞的潮霉素抗性。培养一些潮霉素抗性菌落，分析培养基中的乳酸产生。发现一些菌落产生乳酸。

实施例1F：通过用部分消化的质粒pMI320和消化的质粒pMI321(图2、3，实施例1B)转化野生型东方伊氏酵母，制备具有整合的LDH基因和潮霉素抗性基因的东方伊氏酵母突变体。

用XhoI对质粒pMI320进行部分消化。用SmaI和SalI消化质粒pMI321。合并消化的材料，用于采用上文描述的标准醋酸锂方法转化命名为ATCC 32196的野生型东方伊氏酵母株。筛选转化细胞的潮霉素抗性。培养一些潮霉素抗性菌落，分析培养基中的乳酸产生。发现一个菌落产生乳酸。

实施例2A：克隆东方伊氏酵母PDC(IoPDC1A)启动子区；构建具有IoPGK1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子控制下的大肠杆菌潮霉素基因、IoPGK1启动子和啤酒糖酵母CYC1终止子控制下的瑞士乳杆菌LDH基因以及IoPDC1A5’侧翼区的质粒(pMI355，图4)。

根据制造商提供了说明书，将天然东方伊氏酵母株ATCC PTA-6658的基因组文库构建到SuperCosl(Stratagene)粘粒载体中。用命名为SEQ.ID.NO.17和SEQ.ID.NO.18的引物，通过PCR从菌株的基因组DNA扩增PDC样序列。扩增PDC基因的700bp片段。按照WO 03/049525中的描述，采用杂交技术，用标记的PCR片段作为探针筛选基因组文库，分离含有PDC基因的粘粒克隆，并且测序。用表示为SEQ.ID.NO.19和SEQ.ID.NO.20的引物，以及作为模板的东方伊氏酵母PDC粘粒DNA，对读码框起始处上游1000bp-167bp的东方伊氏酵母PDC1A 5’区进行PCR扩增。扩增的基因(从起始到终止密码子)具有表示为SEQ.ID.NO.97的序列。用SalI和SacI切割该片段。凝胶分离836bp片段，并且连接于通过用SalI和SacI消化质粒pMI321(实施例1B，图3)获得的6992bp片段。得到的质粒命名为pMI355(图4)。

实施例2B：克隆东方伊氏酵母PDC(IoPDC1A)终止子区；构建具有IoPDC1A 5’侧翼区、IoPGK1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子控制下的大肠杆菌潮霉素基因、IoPGK1启动子和啤酒糖酵母CYC1终止子控制下的瑞士乳杆菌LDH基因以及IoPDC1A 3’侧翼区的质粒。

用表示为SEQ.ID.NO.21和SEQ.ID.NO.22的引物，以及作为模板的东方伊氏酵母PDC1A粘粒DNA(实施例2A)，对相应于PDC翻译终止密码子下游233bp-872bp的序列的东方伊氏酵母PDC 3’区进行PCR扩增。用ApaI和SmaI切割该片段。凝胶分离630bp片段，并且连接于通过用ApaI和SmaI消化质粒pMI355(实施例2A，图4)获得的7809bp片段。得到的质粒命名为pMI356(图5)。其含有位于IoPDC1A基因的5’侧翼区和3’侧翼区的一部分之间的来自质粒pMI355的潮霉素和LDH盒。

用表示为SEQ.ID.NO.23和SEQ.ID.NO.24的引物，以及作为模板的东方伊氏酵母PDC粘粒DNA(实施例2A)，对相应于PDC翻译终止密码子上游524bp-下游217bp的序列的东方伊氏酵母PDC1A 3’区进行PCR扩增。用ApaI和SmaI切割该片段。凝胶分离764bp片段，并且连接于通过用ApaI和SmaI消化质粒pMI355获得的7809bp片段。得到的质粒命名为pMI357(图6)。其含有位于IoPDC1A基因的5’侧翼区和3’侧翼区的一部分之间的来自质粒pMI355的潮霉素和LDH盒。质粒pMI357与质粒pMI356的不同此处在于存在的3’IoPDC1A侧翼区部分。

实施例2C：通过用质粒pMI357(图6，实施例2B)转化野生型东方伊氏酵母，制备具有缺失的PDC基因和整合的瑞士乳杆菌LDH基因以及潮霉素抗性基因的东方伊氏酵母突变体(ATCC/357-5)。

用SacI和ApaI限制性消化质粒pMI357，用于采用前面描述的标准化学方法转化东方伊氏酵母株ATCC 32196。

对在潮霉素培养基上生长的菌落进行DNA分析，证实来自质粒pMI357的LDH基因的整合，并且证实IoPDC1A和/或IoPDC1B等位基因的缺失。含有LDH基因和IoPDC1A或IoPDC1B等位基因之一缺失的转化体命名为ATCC/357-5。

实施例2D：通过用质粒pMI356(图5，实施例2A)转化野生型东方伊氏酵母，制备具有缺失的PDC基因和整合的瑞士乳杆菌LDH基因以及潮霉素抗性基因的东方伊氏酵母突变体(CD1027和CD1030)。

用SacI和ApaI限制性消化质粒pMI356，用于采用前面描述的标准化学方法转化东方伊氏酵母株ATCC PTA-6658。

选择在潮霉素培养基上生长的菌落。与LhLDH和PDC 5’探针杂交的HindII-XbaI切割的基因组DNA的DNA分析证实转化体中来自质粒pMI356的LDH基因的整合和IoPDC1B基因的缺失，该转化体命名为CD1030。具有整合的LDH和IoPDC1A基因缺失的转化体命名为CD1027。

实施例2E：通过用质粒pMI356(图5，实施例2A)转化野生型东方伊氏酵母，制备具有缺失的IoPDC1A基因和整合的瑞士乳杆菌LDH基因以及潮霉素抗性基因的东方伊氏酵母突变体(ATCC/356-23)。

用SacI和ApaI限制性消化质粒pMI356，用于采用前面描述的标准化学方法转化野生型东方伊氏酵母株ATCC 32196。

选择在潮霉素培养基上生长的菌落。与LhLDH和PDC 5’探针杂交的HindII-XbaI切割的基因组DNA的DNA分析证实转化体中来自质粒pMI356的LDH基因的整合和IoPDC1A或IoPDC1B等位基因之一的缺失，该转化体命名为ATCC/356-23。

实施例3A：构建含有IoPDC1A 5’侧翼区、IoPGK1启动子控制下的ScMEL5基因、IoPGK1启动子和ScCYC1终止子控制下的瑞士乳杆菌LDH基因以及IoPDC1A 3’侧翼区的质粒pMI433(图8)。

用表示为SEQ.ID.NO.25和SEQ.ID.NO.26的引物和作为模板的东方伊氏酵母基因组DNA对东方伊氏酵母PGK1启动子进行PCR扩增。用Klenow酶和0.1mm dNTP填充片段，然后用SphI切割。凝胶分离669bp的片段。用XhoI切割命名为pMI233的质粒(描述于WO 03/049525的图23C)。用Klenow酶填充该片段，然后用SphI切割。连接4534bp和669bp片段，得到的质粒命名为pMI319(图7)。质粒pMI319含有啤酒糖酵母MEL5(ScMEL5)基因和IoPGK1启动子区。

用ApaI切割质粒pMI319，用T4聚合酶平端化，用NotI切割。凝胶分离2317bp片段。连接到6498bp片段，所述片段是通过以下步骤获得的：用SalI消化质粒pMI357(实施例2B，图6)，用Klenow酶平端化，然后用NotI切割。得到的质粒含有ScMEL5基因(具有其天然终止子)，代替了质粒pMI357的潮霉素基因。得到的质粒命名为pMI433(图8)。

实施例3B：通过用质粒pMI433(图8，实施例3A)转化突变株CD1027(实施例2B)，制备具有缺失的IoPDC1A和IoPDC1B基因和整合的瑞士乳杆菌LDH基因以及ScMEL5基因的东方伊氏酵母突变体(C258/433-3和C258/433-4)。

采用标准化学方法，用来自质粒pMI433的5.9kb SacI/ApaI片段转化突变株CD1027。用各种酶组合消化的基因组DNA，并且采用LhLDH和PDC 5’探针，在表现出蜜二糖酶活性的转化体上进行DNA分析。将失去IoPDC1B等位基因和获得第二个拷贝的LhLDH基因的转化体分别命名为C258/433-3和C258/433-4。但是，整合在两个转化体中的发生是不同的，因为相应于质粒pMI433的LhLDH盒的LhLDH 3’条带在两个菌株中表现不同。不清楚插入的LhLDH表达盒在这些转化体中是否是完整的。

实施例4：通过用质粒pMI356(图5，实施例2B)转化野生型东方伊氏酵母，一步制备具有缺失的IoPDC1A和IoPDC1B等位基因以及整合的LhLDH基因的东方伊氏酵母突变体(CD1184)。

采用实施例3B描述的通用方法，用质粒pMI356转化东方伊氏酵母株ATCC PTA-6658。培养在潮霉素板上生长的转化株。选择不产生乙醇的转化体进行DNA分析，证实IoPDC1A和IoPDC1B等位基因的缺失以及至少一个拷贝的LhLDH基因插入。该菌株命名为CD1184。

实施例5：通过用质粒pMI356(图5，实施例2B)转化野生型东方伊氏酵母株ATCC32196，一步制备具有缺失的IoPDC1A和IoPDC1B等位基因以及整合的LhLDH基因的东方伊氏酵母突变体(CD1270)。

采用实施例3B描述的通用方法，用质粒pMI356转化东方伊氏酵母株ATCC 32196。培养在潮霉素板上生长的转化株。选择不产生乙醇的转化体进行DNA分析，证实IoPDC1A和IoPDC1B等位基因的缺失以及至少一个拷贝的LhLDH基因插入。该菌株命名为CD1270。

实施例6：菌株CD 990(实施例1C)，ATCC/357-5(实施例2C)，ATCC 356-23(实施例2E)，CD1030(实施例2D)，CD1184(实施例4)和CD1270(实施例5)在未缓冲的确定成分培养基中的微需氧摇瓶表征。

在250mL带挡板的烧瓶中，在不含氨基酸、补加100g/L葡萄糖的50mL酵母氮基(YNB)中分开培养转化体CD990、ATCC/357-5、ATCC356-23、CD1030、CD1184和CD1270。培养没有进行缓冲，因此培养基的pH随着乳酸的产生而降低，在每种情况下达到2.0±0.1的最终pH。用酵母蛋白胨+葡萄糖板上生长的细胞将每个烧瓶接种至OD₆₀₀为0.2。100rpm振荡下将培养维持在30℃的温度。在培养过程中定期取出样品，测量OD₆₀₀。通过离心从每个样品回收细胞，通过HPLC分析上清液中的乳酸、葡萄糖和乙醇。

用连接了Waters 2414示差折射计和Waters 2487双λ吸光度检测仪的Waters 2690 Separation组件和Water System Interfase组件的液相色谱进行HPLC分析。液相色谱柱是来自Phenomenex的50X7.8mm FastJuice柱和来自Bio-Rad的100X7.8mm Fast酸分析柱。60℃下用2.5mMH₂SO₄水溶液平衡柱子，以0.5ml/min的流速用2.5mM H₂SO₄水溶液洗脱样品。用Waters Millennium软件进行数据采集。

单PDC缺失株(ATCC/357-5，ATCC/356-23和CD1030)均生产乙醇和乳酸。在168小时的培养中，这三种菌株的葡萄糖消耗几乎是线性的，每种菌株在约72小时后消耗约50％葡萄糖，在约168小时后基本消耗了所有的葡萄糖。这些菌株中的每一种都在168小时后生产约20-24g/L乙醇。约96小时后，每种菌株的乳酸生产在15-20g/L的水平达到峰值。因此，这些菌株消耗小量乳酸。这些菌株的乳酸产率在48小时后达到约35％的峰值，此后由于乳酸消耗和持续产生乙醇而减少。

无PDC缺失的菌株CD990与单PDC缺失菌株的表现相似。

双PDC缺失株(CD1184和CD1270)产生乳酸但不产生乙醇。这些菌株比其它菌株消耗葡萄糖更慢，168小时后大约48-55％的葡萄糖未消耗。菌株CD1270在培养的前96小时产生乳酸，此后乳酸滴度仅仅略微增加。菌株CD1270产生约56％的峰值乳酸产率。菌株CD1184继续在整个培养阶段产生乳酸，培养结束时乳酸滴度是大约31g/L。该菌株的乳酸产率是大约55％。

实施例7：菌株CD 990(实施例1C)，CD1030(实施例2D)，CD1184(实施例4)和CD1270(实施例5)在缓冲的确定成分培养基中的微需氧两阶段摇瓶表征。

转化体CD990、CD1030、CD1184和CD1270分别在酵母蛋白胨+5％葡萄糖上生长。用细胞接种分开的含有YNB+5％葡萄糖+0.5MMES，pH 5.5培养基的烧瓶，达到OD₆₀₀＝0.1。30℃和250rpm振荡下将烧瓶温育过夜。然后将细胞转移到含有50ml YNB+10％葡萄糖+4gCaCO₃的分开的烧瓶，达到OD₆₀₀＝12，30℃和100rpm振荡下温育5天。在培养过程中定期取出样品，测量OD₆₀₀。按照实施例6的描述，通过离心从每个样品回收细胞，通过HPLC分析上清液中的乳酸、葡萄糖和乙醇。

单PDC缺失株CD1030产生乙醇和乳酸。其在48小时内消耗所有萄萄糖，并且产生约56g/L乳酸。该菌株的乳酸产率刚好低于60％。该菌株也产生约13g/L乙醇。该性能非常类似于CD990，CD990具有无PDC缺失的LhLDH基因。

双PDC缺失株(CD1184和CD1270)也产生乳酸，但不产生乙醇。菌株CD1270消耗葡萄糖比菌株CD1184略快，但与菌株CD1030的速度基本相同。50小时后，菌株CD1270的乳酸滴度达到大约85g/L的峰值，此后由于当葡萄糖消除后菌株开始消耗乳酸，乳酸滴度略微下降。50小时后该菌株的乳酸产率是大约85％。菌株CD1184在50小时后消耗大约90％的葡萄糖，并且在随后72小时中消耗其余的葡萄糖。其产生约73g/L的最大乳酸滴度和约80％的最大乳酸产率。

实施例8：菌株CD990(实施例1C)，CD1030(实施例2D)，CD1184(实施例4)和CD1270(实施例5)在缓冲的确定成分培养基中的准无氧两阶段摇瓶表征。

转化体CD990、CD1030、CD1184和CD1270分别在酵母蛋白胨+2％葡萄糖上生长。用细胞接种分开的含有酵母蛋白胨+10％葡萄糖的烧瓶，30℃和250rpm振荡下温育过夜。然后将细胞转移到含有50ml酵母蛋白胨+10％葡萄糖的分开的烧瓶，达到OD₆₀₀＝13。用水密封烧瓶，在酵母蛋白胨+10％葡萄糖中30℃和100rpm振荡下温育大约6天。但是，没有从烧瓶顶部空腔除去残留空气，并且没有采取任何手段除去溶解的氧。因此这些培养不是严格无氧的，因为至少在培养开始时存在一些氧。

在培养期间，由于乳酸的产生，培养液的pH降低到3.2±0.1。

在培养过程中定期取出样品，测量OD₆₀₀。按照实施例6的描述，通过离心从每个样品回收细胞，通过HPLC分析上清液中的乳酸、葡萄糖和乙醇。

单PDC缺失株CD1030在24小时后产生约19g/L乳酸，在72小时后产生约24g/L乳酸，并且在141小时后，产生略高于25g/L的乳酸。没有PDC缺失的菌株CD990在24小时后产生约20g/L乳酸，并且在141小时后产生约22g/L乳酸。菌株CD990和CD1030都产生乙醇和乳酸。

双PDC缺失株CD1184在24小时后产生约15g/L乳酸，在72小时后产生约18g/L乳酸。双PDC缺失株CD1270在24小时后产生约15.5g/L乳酸，在72小时后产生约14.5g/L乳酸，并且在141小时后产生约19.5g/L乳酸。

实施例9A：pH3时菌株CD1184(实施例4)的微需氧分批培养

用1mL菌株CD1184接种含有确定成分培养基的双份单阶段分批培养反应器，所述培养基含有硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁、微量元素、维生素和83g/L葡萄糖。加入细胞前，将培养基的pH调节为3.3。30℃下380rpm搅拌和0.1vvm通气条件下培养细胞。这些条件导致氧摄取速度(参见WO 03/102200)为2.9-3.1mmol/L/h。随着细胞生长并且开始产生乳酸，培养物的pH降低到3.0。此后，通过加入氢氧化钾，使pH维持在3.0。

按照上文的描述进行HPLC分析。在这些条件下，生物在约120小时发酵后产生67g/L乳酸。乳酸产生速度是0.62g/L/hr，用葡萄糖产生乳酸产率是0.76g/g。

实施例9B：pH3时菌株CD1184(实施例4)的需氧分批培养

用1mL菌株CD1184接种含有确定成分培养基的单阶段分批培养反应器，所述培养基含有硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁、微量元素、维生素、消泡剂和90g/L葡萄糖。加入细胞前，将培养基的pH调节为约3.3。随着细胞生长并且开始产生乳酸，培养物的pH降低到3.0。此后，通过加入氢氧化钾，使pH维持在约3.0。30℃下490rpm搅拌和0.1vvm通气条件下培养细胞。这些条件导致氧摄取速度(参见WO 03/102200)为约8mmol/L/h。在约50小时发酵后，将额外的40g/L葡萄糖加入发酵中。

按照上文的描述进行HPLC分析。在这些条件下，生物在约90小时发酵后产生80g/L乳酸(包括约18小时的延迟期，其中很少发生发酵)。在整个分批发酵中，乳酸产生速度是1.0g/L/hr，用葡萄糖产生乳酸的产率是0.71g/g。在延迟期(18小时)末和达到70g/L的乳酸滴度(69小时)之间的时间段，在考虑来自加入葡萄糖和氢氧化钾的稀释作用后，乳酸产生速度是1.5g/L/hr，用葡萄糖产生乳酸产率是0.75g/g。

实施例10A：构建含有位于相同耐热克鲁维氏酵母(K.thermotolerans)重复序列之间的啤酒糖酵母MEL5基因盒的质粒(pMI445，图11)

采用表示为SEQ.ID NO.27和SEQ.ID.NO.28的引物，通过PCR从天然马克斯克鲁维氏酵母株的基因组DNA PCR扩增包含启动子和终止子区的整个马克斯克鲁维氏酵母CYB2(KmCYB2)基因盒，并且导入BamHI和SalI限制位点。将PCR产物连接于用BamHI和SalI消化的命名为pUC18(来自Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)的商用载体。得到的质粒命名为pMM25(图9)。

采用表示为SEQ.ID.NO.30和SEQ.ID.NO.31的引物，从马克斯克鲁维氏酵母基因组DNA PCR扩增表示为SEQ.ID.NO.29的705bp序列，并且导入SphI和SalI限制位点。马克斯克鲁维氏酵母序列不编码任何活性蛋白。用SphI和SalI消化质粒pMM25，将马克斯克鲁维氏酵母序列连接于其中的KmCYB2盒上游(5’)，以形成命名为pMM27的质粒。

采用表示为SEQ.ID.NO.32和SEQ.ID.NO.33的引物，PCR扩增相同的马克斯克鲁维氏酵母序列，并且加入BamHI和XmaI限制位点。用BamHI和XmaI消化质粒pMM27，将马克斯克鲁维氏酵母序列连接于其中的KmCYB2盒下游(3’)，形成命名为pMM28的质粒(图10)。质粒pMM28含有侧翼于相同马克斯克鲁维氏酵母序列的KmCYB2盒，两者是相同方向。

用BamHI消化质粒pMM28，用Klenow酶填充，并且用SalI消化。将如此获得的4077bp片段连接于通过用NotI消化pMI433(图8，实施例3A)获得的2317bp片段，用Klenow酶填充突出端，用SalI消化。得到的质粒命名为pMI445(图11)。

实施例10B：从东方伊氏酵母分离CYB2同源物

将KmCYB2基因用作探针，从获自生长中的东方伊氏酵母株的基因组DNA文库分离同源基因。采用寡核苷酸SEQ.ID.NO.34和SEQ.ID.NO.35作为引物，马克斯克鲁维氏酵母基因组DNA作为模板，通过PCR合成探针，并且用³²P标记。用如此获得的KmCYB2基因从东方伊氏酵母基因组文库分离东方伊氏酵母CYB2基因。制备含有来自6个东方伊氏酵母粘粒克隆的EcoRI消化的DNA和来自野生型东方伊氏酵母株的基因组DNA的DNA印迹，并且与KmCYB2基因杂交。检测约1.5kbp的条带，从凝胶分离，并且克隆到EcoRI消化的pBluescript SK(-)质粒中。采用M13反向和正向引物对条带进行测序。基于如此获得的序列设计序列特异性引物。鉴定了两种CYB2基因，命名为IoCYB2A和IoCYB2B。对每个克隆的编码区和大约1kbp的5’和3’侧翼区进行测序。序列分别表示为SEQ.ID.NO.36和SEQ.ID.NO.37。

实施例10C：构建含有东方伊氏酵母PDC1A启动子、耐热克鲁维氏酵母序列、ScMEL1盒、第二相同耐热克鲁维氏酵母序列、LhLDH基因盒和东方伊氏酵母PDCIA终止子的质粒(pMI447，图14)。

从位于Golden，Colorado的国家研究能量实验室获得命名为pNC16的载体。该质粒含有啤酒糖酵母PDC1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子控制下的啤酒糖酵母MEL1基因。采用命名为SEQ.ID.NO.38和SEQ.ID.NO.39的引物PCR扩增MEL1基因盒，并且加入BglII和SacI限制位点。用BglII和SacI消化质粒pMM28(实施例10A.图10)，并且连接于MEL1盒。这同时使质粒pMM28的KmCYB2盒缺失，并且用MEL1盒代替。得到的质粒命名为pMM31。它含有侧翼于重复的耐热克鲁维氏酵母序列的MEL1盒。

采用表示为SEQ.ID.NO.40和SEQ.ID.NO.41的引物以及作为模板的基因组DNA，通过PCR扩增紧接KmCYB2编码区3’的约2kbp侧翼区，并且导入XmaI和SacI限制位点。将得到的片段连接于XmaI/SacI消化的质粒pMM31，从而插入自身位于MEL1盒下游的耐热克鲁维氏酵母序列下游(3’)的3’CYB2侧翼区。得到的质粒命名为pMM32。

采用表示为SEQ.ID.NO.42和SEQ.ID.NO.43的引物以及作为模板的基因组DNA，通过PCR扩增紧接KmCYB2编码区5’的约2kbp侧翼区，并且导入AatII和NarI限制位点。将得到的片段连接于AatII/NarI消化的质粒pMM32。得到的质粒(命名为pMM35，图12)按顺序含有5’KmCYB2侧翼区、第一相同耐热克鲁维氏酵母序列、MEL1盒、第二相同耐热克鲁维氏酵母序列和3’KmCYB2侧翼区。

采用表示为SEQ.ID.NO.44和SEQ.ID.NO.45的引物，用质粒pMM35作为模板，通过PCR扩增耐热克鲁维氏酵母序列。用NotI和SpeI消化PCR产物。将得到的712bp片段连接于通过用NotI和SpeI消化pMI433(实施例3A，图8)获得的8798bp片段。得到的质粒命名为pMI446(图13)。其按顺序含有东方伊氏酵母PDC启动子、cMEL5基因盒、耐热克鲁维氏酵母序列、LhLDH盒和东方伊氏酵母PDC1A终止子。

采用表示为SEQ.ID.NO.46和SEQ.ID.NO.47的引物，用质粒pMM35作为模板，通过PCR扩增耐热克鲁维氏酵母序列。用SalI消化PCR产物。将得到的711bp片段连接于质粒pMI446的9510bp SalI片段。得到的质粒命名为pMI447(图14)。其按顺序含有东方伊氏酵母PDC启动子、第一耐热克鲁维氏酵母重复序列、cMEL5盒、第二耐热克鲁维氏酵母重复序列、LhLDH基因盒和东方伊氏酵母PDC终止子。

实施例10D：构建含有耐热克鲁维氏酵母序列、ScMEL5基因盒、第二相同耐热克鲁维氏酵母序列和IoCYB2A终止子的质粒(pMI448，图15)。

采用表示为SEQ.ID.NO.48和SEQ.ID.NO.49的引物，和作为模板的含有东方伊氏酵母CYB2A基因的粘粒克隆，通过PCR扩增读码框下游约90-676bp的IoCYB2A基因的3’侧翼区。用SacI和SmaI消化PCR产物。获得607bp片段，连接于通过用SacI和SmaI消化质粒pMI445(实施例10A，图11)获得的6386片段。得到的质粒命名为pMI448(图15)。

实施例10E：从东方伊氏酵母分离URA3基因

采用表示为SEQ.ID.NO.50和SEQ.ID.NO.51的引物，通过PCR从东方伊氏酵母天然株的基因组DNA扩增URA3基因(IoURA3)的片段。获得约650bp片段，对其进行测序，证实与其它酵母的URA3基因的密切同源性。然后将这种约650bp片段用作探针，用于从东方伊氏酵母天然株的基因组粘粒文库分离全长基因。获得了一个克隆，对其进行纯化和测序。该克隆包含IoURA3功能性基因和侧翼区，并且包含表示为SEQ.ID.NO.52的序列。该基因的读码框编码具有262个氨基酸的蛋白。该氨基酸序列表示为SEQ.ID.NO.53。

实施例10F：构建含有IoURA3启动子、相同耐热克鲁维氏酵母序列之间的ScMEL5基因盒、LhLDH基因盒和IoURA3终止子的转化质粒pMI457(图16)以及含有IoURA3启动子、相同耐热克鲁维氏酵母序列之间的ScMEL5基因盒和IoURA3终止子的转化质粒pMI458(图17)。

采用表示为SEQ.ID.NO.54和SEQ.ID.NO.55的引物，并且采用含有URA3基因的东方伊氏酵母粘粒克隆作为模板，扩增东方伊氏酵母的IoURA3 3’侧翼序列。获得630bp片段，用SmaI和ApaI切割，连接于质粒pMI447(实施例10C，图14)的SmaI/ApaI片段，产生命名为pMI455的质粒。质粒pMI455含有东方伊氏酵母PDC启动子、重复的耐热克鲁维氏酵母序列之间的ScMEL5基因盒、LhLDH基因盒和IoURA3’侧翼区。

采用表示为SEQ ID.NO.56和SEQ.ID.NO.57的引物，并且采用含有URA3基因的东方伊氏酵母粘粒克隆作为模板，扩增东方伊氏酵母的IoURA3 5’侧翼序列。获得554bp片段，用SphI切割，连接于质粒pMI448(实施例10C，图15)的6994bp SphI切割片段，产生质粒pMI456。质粒pMI456含有IoURA3启动子、重复的耐热克鲁维氏酵母序列之间的ScMEL5基因盒和东方伊氏酵母CYB2A终止子。

用SacI和SalI切割质粒pMI455。将得到的8542bp片段连接于质粒pMI456的1264bp SacI-XhoI片段，产生质粒pMI457(图16)。

用NotI和Sma切割质粒pMI457，用Klenow酶填充，连接得到的7834bp片段，形成质粒pMI458(图17)。

实施例10G：通过用质粒pMI457(实施例10F，图16)和pMI458(实施例10F，图17)转化突变株CD1184(实施例4)制备具有插入天然URA3基因的基因座中的2个(CD1439)和1个(CD1440)拷贝的LhLDH基因和ScMEL5盒(和URA3缺失)的东方伊氏酵母突变体(CD1439和CD1440)。

采用实施例3B描述的通用方法，用质粒pMI457转化突变株CD1184，并且铺板到YPD+X-α-gal板上。基于蓝色鉴定含有ScMEL5基因的转化体。采用表示为SEQ.ID.NO.58和SEQ.ID.NO.59的引物，通过PCR筛选这些转化体。通过EcoRV-HindIII和NcoI-BsmI消化的DNA的DNA分析，进一步鉴定阳性转化体。采用表示为SEQ.ID.NO.56和SEQ.ID.NO.55的引物，以及作为模板的含有东方伊氏酵母URA3基因的粘粒克隆，合成洋地黄毒苷标记的UPA3探针。产生预期条带的转化体鉴定为菌株CD1439。菌株CD1439具有与菌株CD1184相同的遗传背景，只是它具有位于天然UPA3基因的基因座的额外拷贝的LhLDH盒和ScMEL5盒。

以相同方式制备菌株CD1440，不同之处是用质粒pMI458转化。质粒pMI458缺乏LhLDH盒，但以与质粒pMI457实现相同的转化。因此，菌株CD1439和CD1440具有相同的遗传背景，只是LhLDH盒数目不同。

实施例11：菌株CD1184(实施例4)，CD1439(实施例10F)和CD1440(实施例10F)的微需氧摇瓶表征。

分别将菌株CD1439和CD1440接种到无挡板的烧瓶中的50mlYP+100g/L葡萄糖中，达到初始OD600为0.15。在30℃ 100rpm振荡下温育烧瓶，22、47、62、91、119和143小时后测定。

通过离心定期收集酶活性测量的样品(5mL)。用1mL补加2mMEDTA的冷10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄(pH7.5)洗涤细胞沉淀。将洗涤的沉淀重悬于1mL相同缓冲液中，在-70℃下储存。室温下使样品解冻，在补加2mM MgCl₂、1mM DTT和蛋白酶抑制剂(无EDTA，Roche)的匀浆缓冲液(100mM K₂HPO₄/KH₂PO₄(pH 7.5)中洗涤。将洗涤的样品重悬于0.5mL匀浆缓冲液中，并且采用Bead Beater匀浆器，用0.5mL玻璃珠二次匀浆30秒。然后4℃下以14,000rpm将样品离心30分钟。通过分光光度计分析上清液(A340)，确定LDH活性，其中采用Cobas MIRA自动化分析仪30℃下在含有0.4mM NADH、5mM果糖-1，6-二磷酸和2mM丙酮酸的醋酸钠缓冲液中进行。1U的活性确定为每分钟将1μmolNADH转化为NAD⁺的活性量。用Bio-Rad法确定蛋白浓度，其中将牛γ-球蛋白用作蛋白标准物。

菌株CD1184、CD1439和CD1440都以大约相同的速度消耗葡萄糖，并且都产生大约55-60g/L乳酸。它们都产生约0.6g/L丙酮酸和6g/L甘油。在培养过程中，由于第二个拷贝的LhLDH盒的存在，菌株CD1439的LDH活性比CD1440的活性高大约40％。

实施例12A：克隆东方伊氏酵母天然GPD1基因以及上游和下游侧翼区

对已知的来自一些酵母种(啤酒糖酵母、马克斯克鲁维氏酵母、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、P.jadinii、汉逊氏德巴利氏酵母、C.glabrata)的甘油-3-磷酸脱氢酶基因进行了比对，并且鉴定了多种基因中高度保守的区域。在这些高度同源的区域中设计了两组简并引物。这两组分别表示为SEQ.ID.NO.60和SEQ.ID.NO.61，以及SEQ.ID.NO.62和SEQ.ID.NO.63。用第一组引物和作为模板的东方伊氏酵母基因组DNA进行PCR，获得了预期的约200bp的产物。用第二组引物和作为模板的东方伊氏酵母基因组DNA再次进行PCR，获得了预期的约400bp产物。对两个PCR产物进行凝胶纯化，用相同引物测序。采用如此获得的部分序列，设计引物用于基因组步移。根据制造商的说明书，采用表示为SEQ.ID.NO.64和SEQ.ID.NO.65的PCR引物以及表示为SEQ.ID.NO.66和SEQ.ID.NO.67的嵌套PCR引物，用BD Clontech基因组步移试剂盒进行基因组步移。对从上游和下游基因组步移获得的序列进行比对，与以前获得的部分序列合并，从而构建东方伊氏酵母甘油-3-磷酸脱氢酶基因。

实施例12B：构建含有东方伊氏酵母CYB25’侧翼区、耐热克鲁维氏酵母直接重复序列之间的ScMEL5基因盒和东方伊氏酵母CYB2 3’侧翼区的质粒pMI449(图18)和pMI454(图19)。

用BamHI消化质粒pMM28(图10，实施例10A)，用Klenow酶填充，用SalI消化。将如此获得的4077bp片段连接于pMI433(图8，实施例3A)的2317bp NotI(用Klenow酶填充)-SalI片段。得到的质粒命名为pMI445。

采用表示为SEQ.ID.NO.68和SEQ.ID.NO.69的引物，采用CYB2-2粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增东方伊氏酵母L-乳酸；亚铁细胞色素c氧化还原酶(IoCYB2A)基因的3’侧翼区(相应于预测的读码框下游90-676bp的序列)。用SacI和SmaI消化PCR产物，将607bp片段连接于质粒pMI445的6386bp SacI-SmaI片段。得到的质粒命名为pMI448。

采用表示为SEQ.ID.NO.70和SEQ.ID.NO.71的引物，再次采用CYB2-2粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增IoCYB2A 5’侧翼区(相应于预测的读码框上游913-487bp的序列)。用SphI消化PCR产物，将454bp片段连接于通过部分消化pMI448获得的6993bp SphI片段。得到的质粒命名为pMI449(图18)。

采用表示为SEQ.ID.NO.72和SEQ.ID.NO.73的引物，再次采用CYB2-2粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增IoCYB2A 5’侧翼区(相应于预测的读码框上游466-7bp的序列)。用SphI消化PCR产物，将493bp片段连接于通过部分消化质粒pMI448获得的6993bp SphI片段。得到的质粒命名为pMI453。

采用表示为SEQ.ID.NO.74和SEQ.ID.NO.75的引物，采用CYB2-2粘粒克隆作为模板，通过PCR扩增IoCYB2A 3’侧翼区(相应于预测的终止密码子下游402bp-下游77bp的序列)。用ApaI和SmaI消化PCR产物，将506bp片段连接于质粒pMI453的6886bp ApaI-SmaI片段。得到的质粒命名为pMI454(图19)。

实施例12C：构建含有IoGPD1基因的上游片段、第一耐热克鲁维氏酵母直接重复区、MEL5基因盒、第二耐热克鲁维氏酵母直接重复区和IoGPD1基因的下游片段的质粒(pBH165，图20)。

用NdeI和SbfI消化质粒pMI449(图18，实施例12B)，以切除5’CYB2A侧翼同源性。对68kbp片段进行凝胶纯化并且去磷酸化。采用表示为SEQ.ID.NO.76和SEQ.ID.NO.77的引物，通过PCR扩增来自实施例12A的IoGPD1基因的302bp片段(相应于基因起始密码子开始的碱基对1-302)。对PCR产物进行凝胶纯化，用NdeI和SbfI消化，连接于来自质粒pMI449的6.8kbp片段，得到质粒pBH164。然后用XmaI和EcoRI消化质粒pBH164，以切除3’CYB2A侧翼同源性。对6.5kbp片段进行凝胶纯化并且去磷酸化。采用表示为SEQ.ID.NO.78和SEQ.ID.NO.79的引物，通过PCR扩增来自实施例12A的IoGPD1基因的346bp片段(相应于起始密码子开始的碱基对322-668)。对PCR产物进行凝胶纯化，用XmaI和EcoRI消化，连接于获自pBH164的6.5kbp片段，得到质粒pBH165(图20)。

按照转录顺序，质粒pBH165含有IoGPD1基因的302bp片段、第一耐热克鲁维氏酵母直接重复区、MEL5基因盒、第二耐热克鲁维氏酵母直接重复区和IoGPD1基因的346bp片段。其设计用于在天然IoGPD1基因(具有基因的破坏)的基因座进行插入，随后排出MEL5基因盒。

实施例12D：通过用质粒pMI449(实施例12B，图18)和pMI454(实施例12B，图19)成功转化菌株CD1184(实施例4)，然后通过诱变，制备东方伊氏酵母突变株(CD1496)。

采用醋酸锂方法，用质粒pMI449转化菌株CD1184，基于YPD X-α-gal板上的蜜二糖酶活性选择转化体(蓝色菌落)。通过菌落PCR和某些转化体中的DNA分析，证实菌株CD1184的IoCYB2A基因的替代。通过耐热克鲁维氏酵母重复序列进行同源重组事件，从而从这些转化体之一排出MEL5标记，这是通过DNA分析证实的。然后用质粒pMI454从该转化体去除第二CYB2A等位基因。通过菌落PCR分析这些转化体中1000bp CYB2A特异性PCR产物的缺乏。通过前面所述的重组，从第二CYB2A等位基因缺失的转化体排出来自质粒pMI454的MEL5标记。转化体命名为菌株CD1436。菌株CD1436的两个PDCI等位基因都缺失(由功能性L-LDH基因盒替代)，并且缺失其两个天然IoCYB2基因。

将来自新的YPD板的菌株CD1436的细胞重悬于2mL磷酸缓冲液中，使OD₆₀₀为大约6。将该细胞悬浮液的12份200μl等分样品移液到12个14mL有螺帽的试管中，将8μL甲磺酸乙酯(EMS，Sigma ChemicalCo.，St Louis，MO，目录号M0880，1.17g/mL溶液)加入12个试管中的10个。其余两个试管作为假处理对照。然后30℃搅拌下(225rpm)温育试管60分钟，以杀伤90-99％的细胞。暴露于EMS后，沉淀12个试管中的细胞，用5.0％Na₂S₂O₃洗涤两次，以中和EMS，用水洗涤一次。使诱变的细胞在200μL YP+20g/L葡萄糖培养基中恢复6小时，然后铺板到PDA+35g/L乳酸板上，30℃下温育1周。比菌株CD1436产生更多乳酸和更少甘油的菌株命名为菌株CD1496。

实施例12E：用质粒pBH165(实施例12C，图20)转化菌株CD1496(实施例12D)，然后排出选择标记，以制备缺失单个GPD1等位基因的转化株CD1671。

使菌株CD1496生长，并且用5μg通过用NdeI和EcoRI消化质粒pBH165获得的4.4kbp片段。在覆盖x-α-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-aD-半乳糖苷)的酵母氮基(YNB)+2％蜜二糖板上选择转化体。30℃下生长大约4天后可以看见蓝色转化体。挑选8种转化体，在含有x-α-gal的YP+20g/L葡萄糖板上进行单菌落铺板。每种转化体挑选单个蓝色菌落，重新划线到YP+20g/L葡萄糖板上。从转化体分离基因组DNA。采用表示为SEQ.ID.NO.80和SEQ.ID.NO.81的引物，通过PCR证实IoGPD1基因的一个等位基因的破坏。一个具有预期约2kb的产物的转化体命名为菌株CD1657。采用命名为SEQ.ID.NO.82和SEQ.ID.NO.83的引物，通过PCR进一步证实一个拷贝的天然IoGPD1基因的一个等位基因的破坏。

30℃下在YP+100g/L葡萄糖中使菌株CD1657生长几轮。将系列稀释液铺板到x-α-gal覆盖的YP+20g/L板上，30℃下生长过夜。选择白色菌落(表明MEL 5标记盒的排出)，并且重新划线到YP+20g/L葡萄糖+x-α-gal板上。选择白色菌落。采用表示为SEQ.ID.NO.84和SEQ.ID.NO.85的引物，通过PCR证实天然IoGPD1基因的一个等位基因的破坏。转化体命名为菌株CD1671。

实施例12F：用质粒pBH165(实施例12C，图20)转化菌株CD1671(实施例12E)，以制备两个GPD1等位基因都缺失的转化株CD1690。

用5μg通过用NdeI和EcoRI消化质粒pBH165获得的4.4kbp片段转化菌株CD1671生长。在覆盖x-α-gal的YNB+2％蜜二糖板上选择转化体。30℃下生长大约4天后可以看见蓝色转化体。挑选10种转化体，在含有x-α-gal的YP+20g/L葡萄糖板上进行单菌落铺板。每种转化体挑选单个蓝色菌落，重新划线到YP+20g/L葡萄糖板上。从转化体分离基因组DNA。采用表示为SEQ.ID.NO.86和SEQ.ID.NO.86的引物，通过PCR证实转化体中IoGPD1基因的第二等位基因的破坏。该转化体命名为菌株CD1690。

实施例12G：菌株CD1690(实施例12F)的微需氧摇瓶表征

将菌株CD1690接种到3升分批发酵罐中的YP+100g/L葡萄糖中，达到初始OD600为0.2。100rpm振荡下在38-40℃将烧瓶温育40小时。培养过程中将培养缓冲为pH 5.5。在这些条件下，菌株CD1690产生88克L-乳酸/100克消耗的葡萄糖的产率。L-乳酸的生产速度是2.6g/L/hr。副产物的产率是CO₂：8％；生物物质：2.4％，和丙酮酸：1％。最终OD600是6.3。

实施例13A：克隆膜醭毕赤氏酵母天然PDC1基因片段。

设计一对简并引物，用于克隆膜醭毕赤氏酵母中的一部分PDC1基因。这些引物表示为SEQ.ID.NO.88和SEQ.ID.NO.89。用引物和作为模板的膜醭毕赤氏酵母基因组进行PCR，获得约700bp产物。将该片段克隆到商购TOPO载体上，产生命名为质粒PDC-7克隆的质粒。用表示为SEQ.ID.NO.90和SEQ.ID.NO.91的引物对该片段进行测序。该片段的核苷酸序列表示为SEQ.ID.NO.92。该片段与其它已知的酵母PDC基因序列具有高度同一性。

实施例13B：构建含有膜醭毕赤氏酵母PDC1基因片段、潮霉素表达盒和LhLDH表达盒的质粒pMI464(图21)。

用SacI和SalI消化质粒pMI357(图6，实施例2B)，形成约7735bp片段。用SacI和XhoI消化质粒PDC-y克隆，产生约700bp片段。将两个片段连接在一起，形成命名为质粒pMI464的质粒。

实施例13C：通过用质粒pMI464转化野生型膜醭毕赤氏酵母株制备菌株CD1598，从而整合LhLDH基因盒。

用通过AgeI消化质粒pMI464获得的片段转化命名为NCYC2696的野生型膜醭毕赤氏酵母株。在YDP+潮霉素板上选择转化体，并且划线到YDP+200μg/mL潮霉素上。一个菌落命名为菌株CD1598。通过PCR证实菌株中LhLDH基因盒的存在。

实施例13D：菌株CD1598(实施例13C)的微需氧摇瓶表征

将菌株CD1598接种到摇瓶中的50ml未缓冲的YP+10％葡萄糖培养基中，达到初始OD600为0.2。100rpm振荡下在30℃将烧瓶温育7天。菌株CD1598产生的乳酸达到47g/L的滴度。基于消耗的葡萄糖，乳酸产率是70％。乳酸生产速度是0.41g/L/hr。该菌株不产生乙醇。

序列表

<110>NatureWorks LLC

Suominen，Pirkko

Aristidou，Aristos

Penttila，Merja

Ilmen，Marja

Ruohonen，Laura

Koivuranta，Kari

Roberg-Perez，Kevin

<120>基因修饰的酵母或东方伊氏酵母及密切相关的物种和采用它们的发酵方法

<130>1204A WO

<150>US 60/686,899

<151>2005-06-02

<160>97

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK引物

<400>1

aaccaaagaa ttgttgctgc ttt 23

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK引物.

<400>2

ttcgaaaaca cctggtggac cgttc 25

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>连接引物

<400>3

gcggtgaccc gggagatctg aattc 25

<210>4

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>连接引物

<400>4

gaattcagat ct 12

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

gcggtgaccc gggagatctg aattc 25

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

ccaattctgc agcaactggc tttaacg 27

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套PCR引物

<400>7

gcggtgaccc gggagatctg aattc 25

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套PCR引物

<400>8

gcctcaccat ttggtctgcc c 21

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套PCR引物

<400>9

gactccccgg agtgtcgaaa tatga 25

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套PCR引物

<400>10

gtgatagcgg gtcctttcgc tacc 24

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>连接介导的PCR引物

<400>11

gcggtgaccc gggagatctg aattc 25

<210>12

<211>12

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>连接介导的PCR引物

<400>12

gaattcagat ct 12

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK 1启动子扩增引物

<400>13

gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg 36

<210>14

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK 1启动子扩增引物

<400>14

ctagcatctg attgttgttg tcgttgtttt tgtttt 36

<210>15

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1扩增引物

<400>15

gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg 36

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1扩增引物

<400>16

acttggccat ggttgttgtt gttgtcgttg tttttg 36

<210>17

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC扩增引物

<400>17

ccggaattcg atatctgggc wggkaatgcc aaygarttra atgc 44

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC扩增引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>n是a，c，g或t

<400>18

cgcggattca ggcctcagta ngaraawgaa ccngtrttra artc 44

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC扩增引物

<400>19

actgtcgagc tcagtatatg gaattgacgg ctcatc 36

<210>20

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC扩增引物

<400>20

actgacgcgt cgacgtatca tttgtagccc acgccacc 38

<210>21

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC 3’侧翼区扩增引物

<400>21

cctcccccgg gctgatagaa gggtgatatg taatt 35

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC 3’侧翼区扩增引物

<400>22

ccaagagtta tggggcccca gttg 24

<210>23

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC 3’侧翼区扩增引物

<400>23

actgacgccc cgggtagtta gatagttggc tacccactta ccaagagat 49

<210>24

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC 3’侧翼区扩增引物

<400>24

gggacgggcc caatagagag tgacctatcc aagct 35

<210>25

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK启动子扩增引物

<400>25

gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg 36

<210>26

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK启动子扩增引物

<400>26

tggactagta catgcatgcg gtgagaaagt agaaagcaaa cattgttgtt gttgttgtcg 60

ttgtttttg 69

<210>27

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2基因的扩增引物

<400>27

tccccggtcg accggaactt agcttactcg tc 32

<210>28

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2基因的扩增引物

<400>28

ttgcgaggat cctgagtgca gtagctgtac ac 32

<210>29

<211>706

<212>DNA

<213>耐热克鲁维氏酵母

<400>29

cactcgcaag ctgtgccatc gcccaacggt taattataag aaatcaacat cagccaacaa 60

ctattttcgt ccccctcttt tcagtggtaa cgagcaatta cattagtaag agactatttt 120

cttcagtgat ttgtaatttt ttttcagtga tttgtaattc tttctcgaaa tatgcgggct 180

waamtaatcc ggacattcac tacatgcaag gaaaaacgag aaccgcggag atttcctcag 240

taagtaacaa tgatgatctt tttacgcttc atcatcactt tccaaagttc taagctataa 300

gttcaagcct agatacgctg aaaaactcct gaccaacaat gtaaagaaaa caattacaat 360

tgtaaggttg aaaacatcta aaaatgaaat attttattgt acatgcacac cctgatagtc 420

attctcttac ttcatccctg aaagacgtgg ctgtacaaga gttggaatcg caaggtcatg 480

aggttaaagt tagtgatctt tatgctcaaa agtggaaggc ctcaatagac cgtgacgacw 540

wmaaaaaama aamrmaagaa gagaggttaa aaatacccca agcttcttat gaagcgtatg 600

ccagaggagc attaacaaaa gacgtaaatc aggaacagga aaaacttatt tgggcggact 660

ttgtcatttt gtcgtttcct atatggtggt cttctatgcc ggctag 706

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>耐热克鲁维氏酵母的扩增引物

<400>30

tgtcagcatg cactcgcaag ctgtgccatc 30

<210>31

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>耐热克鲁维氏酵母的扩增引物.

<400>31

aaccttgtcg actagccggc atagaagacc acc 33

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>耐热克鲁维氏酵母的扩增引物

<400>32

tgtcaggatc cactcgcaag ctgtgccatc 30

<210>33

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>耐热克鲁维氏酵母的扩增引物

<400>33

aaccttcccg ggtagccggc atagaagacc acc 33

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2基因的扩增引物

<400>34

ctggatctac agcgattctc 20

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2基因的扩增引物

<400>35

tgtaccggct gtccttaaac 20

<210>36

<211>4160

<212>DNA

<213>东方伊氏酵母

<220>

<221>misc_feature

<222>(609)..(609)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(770).，(770)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(949)..(949)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(1592)..(1592)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(3716)..(3716)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(3849)..(3849)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(3903)..(3903)

<223>n是a，c，g或t

<400>36

tcaaatagta tctcattgta tactaagata gtttgtattt gtgtgtgtgt gtcagtgtaa 60

gtgttagtat acttgttttc ctctttcccc tagagttggt ggtgtgtttt gttggaacgt 120

acattagatg cataatgcgt gacaccgcca tgatggttgt attctaccaa tgagacatgg 180

ccgctgatcc tgttgtgtgg gtcatgggac atcacctctt gggggggatt ctcctataat 240

tggcaccgtg tatgcctcaa ccactaactt ccaccctata actgaatata ttacataagc 300

aaatctactt tttgtttgtg ttgatcgcca tcgttgaaat tcgcgcaact tctggtggct 360

caacgctgct gttctatcgg tatcctaaga gatgtctttg ccctgagtct agggtaaact 420

atccaccttc gttgctgttt gactagacag ctactaactt tacggtagta aatgaataac 480

ggctcgctct catgatcact tctctacatc accctaacaa gtgtattatt tttttttcag 540

gtgggtgttg ctgttggtgc tagccttagt gccctcgtta atagttgaac aaacactggc 600

atttggagna taatgaaaag ggatcactac cccccgcttc ctgttccgct tctcccttcc 660

ggaaaaacca cccacccttt cttttccccc actaatgtat gaatttttcc gttcccaggg 720

gaatggccca cttggttctc tgttaaccca cacaattttg acgcatcccn cacacctttt 780

ttttttcata ccccacactt tcccttgaaa atctccaatt tgaactggca atttcacccc 840

cccaccactt gcattcatta gtgagtcaat ccatccccgc ggtcggagat tcggaatcca 900

cctactggta atctgtaatc tatattcccg ctgacccttt ataaatganc tattgtcgtc 960

aattgcggta gtgctccaac aaattgtaag gaccttcttt aaccttttcg attcaatcca 1020

tctccacata aacctagttg cacacaatgt tactcagatc actaaactct tctgctcgtt 1080

gtgtcaaaca aacaaccaga acaaaggtta ggtatctcag ccacgtcagt ggtgcaagca 1140

tggcgaaacc tacattgaag aacaactcga gagaatccaa caaatccaga aactatctaa 1200

ttgctgctgt gacagcattg gctgtatcaa cctcaattgg agttgccgta catgtgaagg 1260

accccttgta taacgatgct accggcagtg attctccgag aagtatatct gttgacgagt 1320

ttgtcaagca taattcacaa aacgactgtt ggattgcaat caatggcaag gtttatgatt 1380

tcactgattt tattccaaac catccaggtg gggtacctcc attagttaat catgctggtt 1440

atgatggtac taaactttat gagaaattgc atccaaaagg tacaattgag aaattcttgc 1500

caaaggataa gtttctgggt gtgttagatg gtgaagcgcc aaaattggaa gcagactatt 1560

tggttgacga tgatgaacaa gagcgactgg antatttggg caacttacct cctttgtcat 1620

ctattcagaa tgtttatgat ttcgaatact tggccaagaa gattttacct aaagatgcct 1680

gggcatatta ttcttgtggt gccgatgatg aaatcacaat gagagaaaac cattatgctt 1740

atcaaagagt ttatttcaga ccaagaattt gtgttgatgt caaggaagtt gatacttctt 1800

atgaaatgtt aggcactaaa acctctgttc ctttttatgt atctgccacc gctttggcta 1860

aattaggcca tcctgatggt gaatgctcaa ttgctagagg cgctggtaag gaaggtgtcg 1920

ttcaaatgat ttcgaccctt tcctcaatgt cattagatga aattgccgct gctagaattc 1980

caggtgcaac ccaatggttc caattataca ttaatgagga tagaaatgtc gctaaaggtc 2040

tggtcaaaca tgcagaagac ttgggtatga aggctatctt tataactgtt gatgctcctt 2100

ctctaggtaa cagagaaaag gataaaagat taaagtttgt taatgacacc gatgtcgatt 2160

tgggtgattc cgcagatcga aacagtggtg cttcaaaggc actatcttcg ttcattgatg 2220

cttctgtctc ttggaatgac gtcaaagcgg tcaagtcgtg gactaaattg cctgtcttag 2280

ttaaaggtgt tcaaacagtt gaagacgtta ttgaagctta cgatgctggt tgtcaaggtg 2340

ttgttttgtc aaaccacggt ggtaggcaac tagatactgc tcctcctcca atcgaattat 2400

tagctgaaac tgttccaact ttgaagagat tgggtaaatt aagaccagat tttgaaattt 2460

taattgacgg tggtgtcaaa agaggtaccg atattttgaa agcagtcgca atcggtggcc 2520

aagatgtcag agtttcagtt ggtatgggta gacctttctt atatgccaac tcttgctatg 2580

gtgaagcagg tgttagaaaa ttaattcaaa atctaaagga tgaattagaa atggatatga 2640

gattgttggg tgtcactaaa atggaccagc tatcttcgaa acatgtcgat actaaacgtt 2700

tgattggtag agatgcgatc aactatttgt atgataatgt atacagccca atcgaaaccg 2760

ttaaattcaa caatgaagat tgattgttgg aaatatatta ttcataaagg cgaaaacatt 2820

cccttggtat tttattccaa atttatgata catagacgta ttttttatat ataaagttat 2880

attattaatg attcaagaaa aagttcaaat aaactaatgg atcaacctat ttcgaccctt 2940

tcttcattgc tacttcttcc ttaagcaaca gatgattaag tagatactgt ttttttagcc 3000

aatagtatct cgccgaggag ttatacttga ctagctcttg ctcaagaatc ttcctaagac 3060

gtactagcct agcatagtaa tctgtttgtt tctgtattgt ttgttctaac tgttctacag 3120

tcattgaatc aatatctcca atgtcttcga cgttgacaac tttccccccc ttggcagcat 3180

tctctttttt gttggaatac gacattaaag attccttgat tttctgggta ccttcaatga 3240

ccattgaggg attaaatttg atttctttga ttttataatg gtcggctatt agctcttcca 3300

cttcgtcatc atgatcatca gatatgtcac gttgcctttt caatttatta aaattgttta 3360

tcagtttatt gtgatcttgt atcaattcat tgcgtactct tttctcaata tcaaaagcta 3420

ttttcttccc gctagactca aaatcaactc tgaagtcatt ttctcgctgg aattcatgta 3480

tttcatggat taattctcta ttgatattct catatgcatc ctgtaaactg ttgccgttga 3540

tattatgaac cgcctttaaa tgtttcaata aggcatctgc tctagtaaat gccttcagac 3600

attcaggtaa taaacagtaa aatggcttct cggctgtatg cgtcctaata tgagacaata 3660

gcgcaaatct actgtgttgt ggagtaccat atcttggaca atttccccac ttacangaat 3720

ggtctgtgtt gggttgttta aaatgattag tattcatgtg attaaccatc tcatccattt 3780

ctctgaactg tgtcgagcag tcgtcccaac ggcaaatatg aatatctttg ggatccaatt 3840

ttgcctctnc ctccgaaata gtgtccttgt ctgattttag cctaaggcag tccatacttt 3900

tgnactcttg ttcgagatcc tcatcggtta tccgcctagc aaacactata tcacttgtca 3960

tcagttctga tggtatgttc attcccaata agttgccgcc tttcctgtct aaacttcgtg 4020

tttcgttact tctcctacta tccctcatga aaataaagta ctcattcaca ttcattcccc 4080

tgtttttgaa tttctgtgtt ttcttttcgc tcacaaaaat tctcaatttt tcacttaatt 4140

agtttctcaa atattgaacg 4160

<210>37

<211>3840

<212>DNA

<213>东方伊氏酵母

<220>

<221>misc_feature

<222>(2042)..(2042)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(2044)..(2044)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(2970)..(2970)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(3240)..(3240)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(3654)..(3654)

<223>n是a，c，g或t

<400>37

gcattaaaaa acattaacat tcgccacatt cgacacattc gctgcattcg ccacaacgtc 60

acgtgaggca tcgtagtttt gagttttttt tttttgataa atctcgtttc ctgtgatatg 120

tttgccgtgc gcctggtcga ttttcacctt ctttgaaatc cgagttcggg aatgcaattg 180

ggaaaaagcc aaggagaaag aaaacaaaaa gagagttgcg tagaaactcg gaatgctcga 240

agaaaccaga cagttgatgg ctggtttccg ttttgaggac gcttggtgtg tgtaacttgg 300

atttgcacac tagagccgtc tctgcattgt attaaggtgt aaggacggtg aatcatcgcg 360

atggagcggg gttttttctt ttggcaggtt tttccgcgga aggcgagagg gcggaagggg 420

ggggggtgta tgtagttcat atttcggcat tactacaagg atgtttccgt acattgcatg 480

gtactggggt tctccttttc ttgcacatct ccataaacta aatatcaata gatgtatccg 540

tttggaatct catgactttt ggtgtgtggt ctgtgtcttc ccagttatct acttgagtga 600

ttatgaacca gttttcacca ttggttacat accaaacaga gaacttatac gcaccagaac 660

gccttttgtg tctttttgtt tctcaagtat ttctatcagt ttccttcatg tatcccggga 720

ctccattgtc ctcggtagtg cctaccaatt taatgtttga ctcctgcgtt ttctcctgtc 780

gcggacaaac ggtgcggctc ccccgatgat tcacgtaata agccggagtc aaccacagag 840

gtcccctatg actcaacaag gcctcgtaga aactcggctt ctcggagaaa gagtcttttc 900

tttttcactg gaaaatattt tttttttcct ttatattctt ttgaaccaaa atgtggctac 960

tataaaagtg cctttattcc ccagcttttc tagcatgatt gagtcacctt ccacaatgag 1020

tcttctttgt tgttagtatt gtgaatatta tccgtgcagt tttcaagaac gttaatcaac 1080

agcagtgata ataccttcaa aatgttaaga tcccagttca aaaacatttt gaaaaatgtt 1140

aacaagaacc attctctaag gagaactttt acttccagca cctcaaaggc tggaaaaaat 1200

gcttcataca atgccaagat tatatctgca accgtggcct cgattgttgc agcagctggc 1260

tcttatatgt tggtccagcc ttcactagct aatgatgagg cacagtctgc taatccaact 1320

aggaagatct ctgttgacga atttgttaaa cacaaccatg ccgatgattg ttggatcact 1380

gttaacggta acgtctatga cttgactgat ttcatttcaa tgcatccagg tggtactacc 1440

ccattgattc aaaatgcagg tcacgacgca actgaaattt acaacaagat tcatccaaag 1500

ggtacaatcg agaacttctt accaaaggaa aagcaattgg gtgttttgga tggtgaagct 1560

cctaaaatcg aagttgtgct tgacgaaaag gagaaacaca gattggagtt gttgaatcat 1620

ctccctgctc tttccagaat tcaaaacatt tatgatttcg aacatattgc ttctagagtt 1680

ttgagcgacc aagcatggaa ctactattca tgtggtgccg aagatgaaat caccttgagg 1740

gaaaatcatt atgcttacca aagaatctac tttaagccaa aatgttgtgt caatgttgca 1800

gaagttgata cctctcatga aattttaggt acaaaagctt ctgttccttt ctacgtttcc 1860

gcagccgctt ctgcaaagtt ggggcacgag gatggtgaat gttccattgc tagaggtgca 1920

ggtaaggaag gcgttattca aatgatttct tccttctctt ccaactcttt ggaggaaatt 1980

gcagaatcca gaattcctgg tgcaacacaa tggtttcaat tatacgttaa tgaagacaag 2040

gntnttgtga agaagacttt aaaaagggcc gaaaacttgg gtatgaaggc catctttgtc 2100

actgtggacg ctgctagtag aggtaataga gaaaaagaca ttacaatgag aattaccgaa 2160

gatacagatg agttaataga cgattcttct gttagagctg gttctacctc tggtgcattg 2220

ccagctttca ttgacaagag gctgacttgg gatgaagtta aggatatcat ttcatggacc 2280

aagttaccag ttttgctgaa gggtgttcaa agaactgatg atattgagaa ggcaattgat 2340

attggttgta agggtgttgt cttgtccaat catggtggta gacaattaga tacttctcct 2400

cctccaatag aagttatggc tgaatctgtt ccaatcctaa agcaaaaggg taaactggat 2460

ccaaatttca gtattttcgt tgatggtggt gttagaagag gtacagatat tttgaaagct 2520

ttggctattg gtggcagaga ctgtaaagtt gctgttggtc tgggtagacc tttcctttat 2580

gcaaatactg gttatggtga aaagggtgtc agaaaggccg tgcaaattct aagagaagaa 2640

ttaaaggctg acatgagaat gttgggcgtt acctctttga acgagctaga cgactcttac 2700

attgacacca gaagattact aggtagagat gctgttaacc acatatacaa caacaactac 2760

tacccaatgt ctaagattca attcaaaaac gaaaaataag tctgatattt gctaaattga 2820

aatgaacctt accatgccac atctatagac atcaaaacca ttttcaattt gtcgatatct 2880

tttgcatatc aaagtaatac caagcatgtt caaaaagaaa agaaagcata actttaatac 2940

tctattcgaa acactccgat ccacaacacn ttagtctttt tagacccgtt gttcatcttt 3000

ctattacttt attcctaact gtatttttat aattccgggt ttataaaaga ttaaactaat 3060

atagcgcatt ctttttgggt acaaacatac ataacggagc tcattcatac atcgcttttc 3120

agttccgact ggtgtttcgg atgcctcttt ttctaaggag ctagattctg gccccacact 3180

agtctttgaa ctcgttgctc ccttaccacc cttaccacca gccttacttg taggtttttn 3240

agtagcatac tctgcgtgtt tgactaaatt cccttcctta actttgtgcc agcttggcca 3300

tatcattaaa tacccactga aacttctaac aactcttcga ccttcctgat gggcctttga 3360

aattgtatct accaaacctg ccttcaaggg atgttcttta tatcccctga cgtctttcat 3420

actttgaact tcctctggga cgtcttcctt tccatatttt tcccattggc ccggcttgtt 3480

tttagatttg tctatctcac ggaaaattga ggggttcata cttaatccac tcacaccaac 3540

cctgatgtta gaagacagtt ttgctaaatt atttacattc tgacttgtgt ttgtcgatat 3600

aactgaatca gatggtttca tcgatgattc tcgggagact ggttctgatg gcgntcaccg 3660

gggtctcaga tgctgctgga tttagcttta atttgagccg tttaataggt tcttcattta 3720

atgtttgttt tctttttttg tcgtagaaat gtgctgtgag atcaggaaat tgttcaagct 3780

gttcacgact tagttttagg gtgacatact tggttttttt aggtgccatt tctgtacaac 3840

<210>38

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MEL5基因的扩增引物

<400>38

aaaaaagtcg accgataaca agctcatgca aag 33

<210>39

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>MEL5基因的扩增引物

<400>39

aaaaaaagat ctgcgtaacg aaataaatcc gc 32

<210>40

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 3’侧翼区的扩增引物

<400>40

aaaaaacccg ggcttcctcc gctgcaggtt ca 32

<210>41

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 3’侧翼区的扩增引物

<400>41

aaaaaagagc tcgaagtctc tggatcctct tc 32

<210>42

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 5’侧翼区的扩增引物.

<400>42

aaaaaagacg tcctggctcg atacttctta ttc 33

<210>43

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 5’侧翼区的扩增引物

<400>43

aaaaaaggcg ccgctggcag atactagttc ag 32

<210>44

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>耐热克鲁维氏酵母的扩增引物

<400>44

tggactagtc actcgcaagc tgtgccatcg ccca 34

<210>45

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>耐热克鲁维氏酵母的扩增引物

<400>45

ggcccgcggc cgctagccgg catagaagac caccata 37

<210>46

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>耐热克鲁维氏酵母的扩增引物

<400>46

actgacgcgt cgaccactcg caagctgtgc catcgccca 39

<210>47

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>耐热克鲁维氏酵母的扩增引物

<400>47

actgacgcgt cgactagccg gcatagaaga ccaccata 38

<210>48

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 3’侧翼区的扩增引物

<400>48

cctcccccgg ggatatcaaa gttatattat taatgattca ag 42

<210>49

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 3’侧翼区的扩增引物

<400>49

ggacgagagc tcgggcccat gacttcagag ttgattttga gtc 43

<210>50

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA3基因扩增引物

<400>50

aagmaracha ayttrtgtgc 20

<210>51

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA3基因扩增引物

<400>51

aaharkcctc tccaacaat 19

<210>52

<211>2880

<212>DNA

<213>东方伊氏酵母

<220>

<221>misc_feature

<222>(2747)..(2747)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(2866)..(2866)

<223>n是a，c，g或t

<400>52

gaaggtaatt ccataagtgt gagtgtaccg cacaaccatc atggatatac aaaagatcaa 60

actaatgata atgaaggcaa aaggaaactt gatgatggag atgtagaaga ggcacgtgac 120

agcaaaatct tgaagaagcc aaaaacagag gaaacttcaa tcgtcgaaga agataagcca 180

caaattaggt tgaggaccag aagtatggtt aataatgaaa acacagtcaa aaaatttcag 240

caattatccc tacctatact aacaaatatt tcgtcgcatc gtatcgcttc aatgtttttg 300

acgccagtca atgctatgga agagcctgat tattttaaag taattaagaa accaattgac 360

ttgaagacta taataaaaaa ggtcaggaac ttttctataa acaccctcga agagcttgaa 420

tttgaaatgc aactgatgtt cacgaatgcg ataatgtaca atacaagtga taaagttgaa 480

ggaatatcgg atatgatgaa agaatggcaa gatctagtag taatattgaa agaaaatatg 540

taataggtat agtccgtcag ttatattgga agataataag aaaagaatat caaaactatt 600

taattagtta attgtataaa ctgtatgtca ttataaacag ggaaggttga cattgtctag 660

cggcaatcat tgtctcattt ggttcattaa cttttggttc tgttcttgga aacgggtacc 720

aactctctca gagtgcttca aaaatttttc agcacatttg gttagacatg aactttctct 780

gctggttaag gattcagagg tgaagtcttg aacacaatcg ttgaaacatc tgtccacaag 840

agatgtgtat agcctcatga aatcagccat ttgcttttgt tcaacgatct tttgaaattg 900

ttgttgttct tggtagttaa gttgatccat cttggcttat gttgtgtgta tgttgtagtt 960

attcttagta tattcctgtc ctgagtttag tgaaacataa tatcgccttg aaatgaaaat 1020

gctgaaattc gtcgacatac aatttttcaa actttttttt tttcttggtg cacggacatg 1080

tttttaaagg aagtactcta taccagttat tcttcacaaa tttaattgct ggagaataga 1140

tcttcaacgc tttaataaag tagtttgttt gtcaaggatg gcgtcataca aagaaagatc 1200

agaatcacac acttcccctg ttgctaggag acttttctcc atcatggagg aaaagaagtc 1260

taacctttgt gcatcattgg atattactga aactgaaaag cttctctcta ttttggacac 1320

tattggtcct tacatctgtc tagttaaaac acacatcgat attgtttctg attttacgta 1380

tgaaggaact gtgttgcctt tgaaggagct tgccaagaaa cataatttta tgatttttga 1440

agatagaaaa tttgctgata ttggtaacac tgttaaaaat caatataaat ctggtgtctt 1500

ccgtattgcc gaatgggctg acatcactaa tgcacatggt gtaacgggtg caggtattgt 1560

ttctggcttg aaggaggccg cccaagaaac aaccagtgaa cctagaggtt tgctaatgct 1620

tgctgagtta tcatcaaagg gttctttagc atatggtgaa tatacagaaa aaacagtaga 1680

aattgctaaa tctgataaag agtttgtcat tggttttatt gcgcaacacg atatgggcgg 1740

tagagaagaa ggttttgact ggatcattat gactccaggg gttggtttag atgacaaagg 1800

tgatgcactt ggtcaacaat atagaactgt tgatgaagtt gtaaagactg gaacggatat 1860

cataattgtt ggtagaggtt tgtatggtca aggaagagat cctgtagagc aagctaaaag 1920

ataccaacaa gctggttgga atgcttattt aaacagattt aaatgattct tacacaaaga 1980

tttgatacat gtacactagt ttaaataagc atgaaaagaa ttacacaagc aaaaaaaaat 2040

taaatgaggt actttacgtt cacctacaac caaaaaaact agatagagta aaatcttatg 2100

atttagaaaa agttgtttaa caaaggcttt agtatgtgaa tttttaatgt agcaaagcga 2160

taactaataa acataaacaa aagtatggtt ttctttatca gtcaaatcat tatcgattga 2220

ttgttccgcg tattctaagt gttttatatc attcatagtt aacgattgct tttgtttatt 2280

ctgtattctc agcataagat agtaaaggat accggtgaac gccataattg aaaaggaagc 2340

ttccatggca tgtatcccca tcggatactt tggtgcttga gaacctttga aaaaatatgg 2400

accgataatg ttaccaactg cataccaaac tgcaacagaa acatacatga acgtcttctt 2460

ggtagatcct gaggtgtttg aagataccaa cgccaacatt aatgtccatg gcacattgta 2520

gaatcccatc aaataaattc cagctaatgc agcatgtcga ttttcgtgtg gatcaatctt 2580

atttaccata atagccccag ctaaagcagg tagacacgtt aatacccaca ataaacacct 2640

aatattatga atccacatgc agattgctgt tatcagcata ccacctccca aggcaactgc 2700

tgcctgagga gacgccataa gtgttgtttt gagagcagaa aacccanaac ctttgattat 2760

aagaggattg aaatttgtta gtcccgaatt acagatggac tgacatataa taaatgcaac 2820

aacaatataa tatttgggat ccaacaaagc ctcccagatt tgatanattt tcaatttgtg 2880

<210>53

<211>262

<212>PRT

<213>东方伊氏酵母

<400>53

Met Ala Ser Tyr Lys Glu Arg Ser Glu Ser His Thr Ser Pro Val Ala

1 5 10 15

Arg Arg Leu Phe Ser Ile Met Glu Glu Lys Lys Ser Asn Leu Cys Ala

20 25 30

Ser Leu Asp Ile Thr Glu Thr Glu Lys Leu Leu Ser Ile Leu Asp Thr

35 40 45

Ile Gly Pro Tyr Ile Cys Leu Val Lys Thr His Ile Asp Ile Val Ser

50 55 60

Asp Phe Thr Tyr Glu Gly Thr Val Leu Pro Leu Lys Glu Leu Ala Lys

65 70 75 80

Lys His Asn Phe Met Ile Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp Ile Gly

85 90 95

Ash Thr Val Lys Asn Gln Tyr Lys Ser Gly Val Phe Arg Ile Ala Glu

100 105 110

Trp Ala Asp Ile Thr Asn Ala His Gly Val Thr Gly Ala Gly Ile Val

115 120 125

Ser Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gln Glu Thr Thr Ser Glu Pro Arg Gly

130 135 140

Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Leu Ala Tyr Gly

145 150 155 160

Glu Tyr Thr Glu Lys Thr Val Glu Ile Ala Lys Ser Asp Lys Glu Phe

165 170 175

Val Ile Gly Phe Ile Ala Gln His Asp Met Gly Gly Arg Glu Glu Gly

180 185 190

Phe Asp Trp Ile Ile Met Thr Pro Gly Val Gly Leu Asp Asp Lys Gly

195 200 205

Asp Ala Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Val Asp Glu Val Val Lys Thr

210 215 220

Gly Thr Asp Ile Ile Ile Val Gly Arg Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Arg

225 230 235 240

Asp Pro Val Glu Gln Ala Lys Arg Tyr Gln Gln Ala Gly Trp Asn Ala

245 250 255

Tyr Leu Asn Arg Phe Lys

260

<210>54

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA3 3’侧翼区的扩增引物

<400>54

ctcccccggg caacaaagcc tcccagattt gata 34

<210>55

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA3 3’侧翼区的扩增引物

<400>55

ggacgggccc cctaggtatt gcggctgttt atac 34

<210>56

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA3 5’侧翼区的扩增引物

<400>56

ggacatgcat gcgagctctc aaaactattt aattagttaa ttg 43

<210>57

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA3 5’侧翼区的扩增引物

<400>57

ggacatgcat gctacgtacc ctgcagggtg aagaataact ggtatagagt ac 52

<210>58

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA 3测序引物

<400>58

gatatgatga aagaatggca agatctag 28

<210>59

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>URA3测序引物

<400>59

sattgctcgt taccactgaa aagagg 26

<210>60

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并引物

<400>60

ggkgctaach tbgcymcmga r 21

<210>61

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并引物

<400>61

dgtratbara tcrgcvacac c 21

<210>62

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并寡核苷酸

<400>62

krtygghycy ggtaactggg 21

<210>63

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>简并寡核苷酸

<400>63

rtgraagtad ggtckgtgga a 21

<210>64

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR正向引物

<400>64

ccattgccgg tgcactcaag aatgtcg 27

<210>65

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR反向引物

<400>65

cgacattctt gagtgcaccg gcaatgg 27

<210>66

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套PCR引物

<400>66

ggctgctgga tttgtcgaag gtttagg 27

<210>67

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套PCR引物

<400>67

ccttgccttt acctctgaaa tcgtccg 27

<210>68

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 3’侧翼区PCR引物

<400>68

cctcccccgg ggatatcaaa gt tatat tat taatgattca ag 42

<210>69

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 3’侧翼区PCR引物

<400>69

ggacgagagc tcgggcccat gact tcagag ttgattttga gtc 43

<210>70

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 5’侧翼区引物

<400>70

ggacatgcat gcgagctcaa tgcgtgacac cgccatgatg gttg 44

<210>71

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 5’侧翼区引物

<400>71

ggacatgcat gctacgtacc ctgcagggca ccaacagcaa cacccacctg aa 52

<210>72

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 5’侧翼区引物

<400>72

ggacatgcat gcgagctcat agttgaacaa acactggcat ttg 43

<210>73

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 5’侧翼区引物

<400>73

ggacatgcat gctacgtacc ctgcaggtgt gtgcaactag gtttatgtgg ag 52

<210>74

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 3’侧翼区引物

<400>74

cctcccccgg ggatatctag ttagatagct cctcctccaa tcgaattatt agc 53

<210>75

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CYB2 3’侧翼区引物

<400>75

ggacgagagc tcgggcccta cgtctatgta tcataaattt gg 42

<210>76

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1基因引物

<400>76

aaaaaacata tggagatgtt aatatgtggg tct 33

<210>77

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>77

ttttttcctg caggtcagta ataacagtgg aga 33

<210>78

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1基因引物

<400>78

aaaaaacccg gggtgcctta tcaggtgcta 30

<210>79

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>79

ttttttgaat tcaaggttgc agcatgacag 30

<210>80

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>80

gagttcaccc gtccagatag 20

<210>81

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>81

ggacaacgta catggacgat tc 22

<210>82

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>82

ctatctggac gggtgaactc 20

<210>83

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>83

ggactggggg tgtacaat 18

<210>84

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>84

cttgtgcagg ctcagacttg 20

<210>85

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>85

caaggcattc tggcagcttc 20

<210>86

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>86

cggcttccaa agcggactta cc 22

<210>87

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>GPD1引物

<400>87

aaggccgaca gcccattcaa gg 22

<210>88

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1引物

<400>88

ccggaattcg atatctgggc wggkaatgcc aaygarttra atgc 44

<210>89

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>n是a，c，g或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>n是a，c，g或t

<400>89

cgcggattca ggcctcagta ngaraawgaa ccngtrt tra artc 44

<210>90

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1测序引物

<400>90

atggcaagag aggaaaaacc tcgtaaag 28

<210>91

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1测序引物

<400>91

ccacgaagag tcattgacga accttaa 27

<210>92

<211>714

<212>DNA

<213>膜醭毕赤氏酵母

<400>92

gggtatgaag ctgatggata ctccagagtc aacggctttg catgcctggt taccaccttc 60

ggtgtcggcg aattgtctgc tgtcaacgcc gttgcaggtg cgtatgcaga gcacattcca 120

ttaatccacg tggtcggtat gccttccatc tccgccgaga agcaaaagct tctacttcac 180

cacacgttag gtgattcgag gttcgatgat tttaccgcaa tgtcccagaa gatcagcatc 240

aagctcaagg ttatcactga gtttgacgat gcaccaaagg ttataaacga cttgattgaa 300

acagccatac tcaccaagag accggtttat ctcggtttcc caagtaactt ttcagaggca 360

ttgataccag cctccgattt gacaaagtac aagcttaagt tgtctttgcc tccaaacaat 420

gaagagtctg aaaatgagtt tgtggaaaac gttattcagc tgatggagaa ggctaagaac 480

cctgtgattt tggttgatgc ctgtgcttcc cgtcatgctg tcattgaaca agttgaagaa 540

gttgctagac ttacaaagtt cccagttttt accactccaa tgggtaaagg ctctttcaac 600

gaagacaata gcgaatatta cggtatgtac attggtgctt tatctgctcc tgatgttaag 660

gagatcgtcg agtccacaga ctgtatcatc tctatcggtg ggttattatc agat 714

<210>93

<211>957

<212>DNA

<213>巨大芽孢杆菌

<400>93

atgaaaacac aatttacacc aaaaacacga aaagttgccg ttatcggaac tggttttgtt 60

ggctcaagct aogctttttc aatggtgaat caaggtattg ccaatgaatt agtgttaatc 120

gatatgaaca aagaaaaagc agaaggtgaa gcacgtgata tcaatcatgg aatgccattt 180

gccacaccga tgaaaatctg ggctggagat tataaagact gtgctgacgc tgatttagca 240

gttattacag cgggcgctaa tcaagctcca ggggaaacac gcttagatct agttgaaaaa 300

aacgttaaaa ttttcgaatg cattgtaaaa gatattatga acagcggatt tgacggcatc 360

attttagtgg caacaaatcc agttgatatt ctcgcacacg ttacacaaaa agtatcagga 420

ttaccaaacg gacgggtaat tggttcagga acgattcttg acacagctcg cttccgctac 480

ttgttaagcg actatttcga agtagattct cgcaacgtcc acgcttatat tatgggggaa 540

catggagata cggaatttcc tgtttggagc cacgcgcaaa ttggcggtgt gaagctcgaa 600

cattttatca atactgccgc tattgaaaaa gaaccggata tgcagcatct attcgaacaa 660

acccgcgatg cggcttacca tattattaat cgaaaaggag cgacttatta cggaattgca 720

atggggcttg tacgcattac caaggctatt ttagatgatg aaaattctat tttaacagta 780

tctgctttat tagaaggaca atacggtatt tctgatgtgt atatcggcgt accagctatc 840

attaataaaa acggcgtgcg tcaaattatt gaattgaatt taactcctca cgaacagcag 900

cagctcgagc actctgctag cattcttaag caaactcgcg acagagcttt tgtgtaa 957

<210>94

<211>972

<212>DNA

<213>瑞士乳杆菌

<400>94

atggcaagag aggaaaaacc tcgtaaagtt attttagtcg gtgatggtgc tgtaggttct 60

acctttgcat tttcaatggt acaacaaggt atcgctgaag aattaggtat tatcgatatc 120

gctaaggaac acgttgaagg tgacgcaatc gatttagctg acgcaactcc ttggacttct 180

ccaaagaaca tttacgcagc tgactaccca gattgtaagg atgctgactt agttgttatt 240

actgctggtg ctccacaaaa gccaggcgaa actcgtcttg atcttgttaa caagaacttg 300

aagattttat catcaatcgt tgaaccagtt gttgaatcag gttttgaagg tattttctta 360

gtagttgcta acccagttga tatcttaact cacgcaactt ggagaatgtc aggcttccct 420

aaggatcgtg ttatcggttc aggtacttca cttgatactg gtcgtcttca aaaagttatt 480

ggtaaaatgg aaaacgttga cccaagttca gttaatgcat acatgcttgg tgaacacggt 540

gatactgaat tcccagcatg gagctacaac aatgttgctg gcgtaaaggt tgctgactgg 600

gttaaggctc acaacatgcc tgaatctaag cttgaagaca tccaccaaga agttaaggac 660

atggcttacg acattattaa caagaaaggt gctaccttct acggtatcgg tactgcttca 720

gcaatgatcg ctaaggctat cttgaacgat gaacaccgtg tacttccact ttcagtacca 780

atggatggtg aatatggttt acacgatctt cacatcggta ctcctgcagt tgttggccgc 840

aagggtcttg aacaagttat cgaaatgcca ttaagcgata aggaacaaga attaatgact 900

gcttcagcag atcaattaaa gaaggttatg gacaaggcct tcaaagaaac tggcgttaag 960

gttcgtcaat aa 972

<210>95

<211>318

<212>PRT

<213>巨大芽孢杆菌

<400>95

Met Lys Thr Gln Phe Thr Pro Lys Thr Arg Lys ValAla Val Ile Gly

1 5 10 15

Thr Gly Phe Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Met Val Asn Gln Gly

20 25 30

Ile Ala Asn Glu Leu Val Leu Ile Asp Met Asn Lys Glu Lys Ala Glu

35 40 45

Gly Glu Ala Arg Asp Ile Asn His Gly Met Pro Phe Ala Thr Pro Met

50 55 60

Lys Ile Trp Ala Gly Asp Tyr Lys Asp Cys Ala Asp Ala Asp Leu Ala

65 70 75 80

Val Ile Thr Ala Gly Ala Asn Gln Ala Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

85 90 95

Leu Val Glu Lys Asn Val Lys Ile Phe Glu Cys Ile Val Lys Asp Ile

100 105 110

Met Asn Ser Gly Phe Asp Gly Ile Ile Leu Val Ala Thr Asn Pro Val

115 120 125

Asp Ile Leu Ala His Val Thr Gln Lys Val Ser Gly Leu Pro Asn Gly

130 135 140

Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Tyr

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asp Tyr Phe Glu Val Asp Ser Arg Asn Val His Ala Tyr

165 170 175

Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala

180 185 190

Gln Ile Gly Gly Val Lys Leu Glu His Phe Ile Asn Thr Ala Ala Ile

195 200 205

Glu Lys Glu Pro Asp Met Gln His Leu Phe Glu Gln Thr Arg Asp Ala

210 215 220

Ala Tyr His Ile Ile Asn Arg Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala

225 230 235 240

Met Gly Leu Val Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asp Asp Glu Asn Ser

245 250 255

Ile Leu Thr Val Ser Ala Leu Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Ile Ser Asp

260 265 270

Val Tyr Ile Gly Val Pro Ala Ile Ile Asn Lys Asn Gly Val Arg Gln

275 280 285

Ile Ile Glu Leu Asn Leu Thr Pro His Glu Gln Gln Gln Leu Glu His

290 295 300

Ser Ala Ser Ile Leu Lys Gln Thr Arg Asp Arg Ala Phe Val

305 310 315

<210>96

<211>323

<212>PRT

<213>瑞士乳杆菌

<400>96

Met Ala Arg Glu Glu Lys Pro Arg Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly

1 5 10 15

Ala Val Gly Ser Thr Phe Ala Phe Ser Met Val Gln Gln Gly Ile Ala

20 25 30

Glu Glu Leu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys Glu His Val Glu Gly Asp

35 40 45

Ala Ile Asp Leu Ala Asp Ala Thr Pro Trp Thr Ser Pro Lys Asn Ile

50 55 60

Tyr Ala Ala Asp Tyr Pro Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile

65 70 75 80

Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val

85 90 95

Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Ser Ser Ile Val Glu Pro Val Val Glu

100 105 110

Ser Gly Phe Glu Gly Ile Phe Leu Val Val Ala Asn Pro Val Asp Ile

115 120 125

Leu Thr His Ala Thr Trp Arg Met Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val

130 135 140

Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Gly Arg Leu Gln Lys Val Ile

145 150 155 160

Gly Lys Met Glu Asn Val Asp Pro Ser Ser Val Asn Ala Tyr Met Leu

165 170 175

Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Ala Trp Ser Tyr Asn Asn Val

180 185 190

Ala Gly Val Lys Val Ala Asp Trp Val Lys Ala His Asn Met Pro Glu

195 200 205

Ser Lys Leu Glu Asp Ile His Gln Glu Val Lys Asp Met Ala Tyr Asp

210 215 220

Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Ser

225 230 235 240

Ala Met Ile Ala Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu His Arg Val Leu Pro

245 250 255

Leu Ser Val Pro Met Asp Gly Glu Tyr Gly Leu His Asp Leu His Ile

260 265 270

Gly Thr Pro Ala Val Val Gly Arg Lys Gly Leu Glu Gln Val Ile Glu

275 280 285

Met Pro Leu Ser Asp Lys Glu Gln Glu Leu Met Thr Ala Ser Ala Asp

290 295 300

Gln Leu Lys Lys Val Met Asp Lys Ala Phe Lys Glu Thr Gly Val Lys

305 310 315 320

Val Arg Gln

<210>97

<211>1728

<212>DNA

<213>东方伊氏酵母

<400>97

atgactgaca aaatctccct aggtacttat ctgtttgaaa agttaaagga agcaggctct 60

tattccatct ttggtgttcc tggtgatttc aatttggcat tgttggacca cgtcaaggaa 120

gttgaaggca ttagatgggt cggtaacgct aacgagttga atgccggcta cgaagctgat 180

ggttatgcaa gaatcaatgg atttgcatcc ctaatcacca cctttggtgt cggtgaattg 240

tctgccgtca atgccattgc aggttcttat gctgaacacg tcccattgat ccatattgtt 300

ggtatgcctt ccttgtctgc tatgaagaac aacttgttgt tacaccatac cttgggtgac 360

acaagattcg acaacttcac cgaaatgtca aagaaaatca gtgcaaaggt tgaaattgtt 420

tacgatttgg aatcagctcc aaaattaatt aataacttga ttgaaaccgc ttatcacaca 480

aagagaccag tctacttggg acttccttcc aactttgctg atgaattggt tccagcggca 540

ttagttaagg aaaacaagtt acatttagaa gaacctctaa acaaccccgt tgctgaagaa 600

gaattcattc ataacgttgt tgaaatggtc aagaaggcag aaaaaccaat cattctcgtt 660

gacgcttgtg ctgcaagaca taacatttct aaggaagtga gagagttggc taaattgact 720

aaattccctg tcttcaccac cccaatgggt aaatctactg ttgatgaaga tgatgaagaa 780

ttctttggct tatacttggg ttctctatct gctccagatg ttaaggacat tgttggccca 840

accgattgta tcttatcctt aggtggttta ccttctgatt tcaacaccgg ttccttctca 900

tatggttaca ccactaagaa tgtcgttgaa ttccattcca actactgtaa attcaaatct 960

gcaacttatg aaaacttgat gatgaagggc gcagtccaaa gattgatcag cgaattgaag 1020

aatattaagt attccaatgt ctcaacttta tctccaccaa aatctaaatt tgcttacgaa 1080

tctgcaaagg ttgctccaga aggtatcatc actcaagatt acctgtggaa gagattatct 1140

tacttcttaa agccaagaga tatcattgtc actgaaactg gtacttcctc ctttggtgtc 1200

ttggctaccc acttaccaag agattcaaag tctatctccc aagtcttatg gggttccatt 1260

ggtttctcct taccagctgc agttggtgct gcatttgctg ctgaagatgc acacaaacaa 1320

actggcgaac aagaaagaag aactgttttg tttattggtg atggttcttt acaattgact 1380

gtccaatcaa tctcagatgc tgcaagatgg aacatcaagc catacatctt catcttaaac 1440

aacagaggtt acactatcga aaagttgatc cacggtcgtc atgaggacta caaccaaatt 1500

caaccatggg atcaccaatt gttattgaag ctctttgctg acaagaccca atatgaaaac 1560

catgttgtta aatccgctaa ggacttggac gctttgatga aggatgaagc attcaacaag 1620

gaagataaga ttagagtcat tgaattattc ttggatgaat tcgatgctcc agaaatcttg 1680

gttgctcaag ctaaattatc tgatgaaatc aactctaaag ccgcttaa 1728

Claims

1.东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝中的物种的基因修饰的酵母细胞，其具有至少一种外源乳酸脱氢酶(LDH)基因。

2.权利要求1的酵母细胞，其是物种东方伊氏酵母、Pichiagaleiformis、毕赤氏酵母种YB-4149(NRRL名称)、Candida ethanolica、P.deserticola、膜醭毕赤氏酵母或发酵性毕赤氏酵母的细胞。

3.权利要求1的酵母细胞，其中所述外源LDH基因整合到酵母细胞的基因组中。

4.权利要求1的酵母细胞，其中所述外源LDH基因是与物种瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸片球菌、原牛或米根霉中的任何一个物种的功能性L-LDH基因具有至少35％同一性的功能性L-LDH基因。

5.权利要求1的酵母细胞，其中所述外源LDH基因是编码与物种瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸片球菌、原牛或米根霉中的任何一个物种的功能性L-LDH基因编码的蛋白具有至少80％同一性的蛋白的功能性L-LDH基因。

6.权利要求1的酵母细胞，其中所述外源LDH基因编码与SEQ.ID.NO.93、SEQ.ID.NO.94、SEQ.ID.NO.95或SEQ.ID.NO.96中的至少一个序列具有至少60％同一性的功能性蛋白。

7.权利要求1的酵母细胞，其中所述外源LDH基因是与物种瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和乳酸片球菌的任何一个物种的功能性D-LDH基因具有至少45％同一性的功能性D-LDH基因。

8.权利要求1的酵母细胞，其中所述外源LDH基因是编码与物种瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和乳酸片球菌的任何一个物种的功能性D-LDH基因编码的蛋白具有至少45％同一性的蛋白的功能性D-LDH基因。

9.权利要求1-8的任一项的酵母细胞，其具有天然丙酮酸脱羧酶(PDC)基因的缺失或破坏。

10.权利要求9的酵母细胞，其不能产生乙醇。

11.权利要求1-8的任一项的酵母细胞，其中所述外源LDH基因处于酵母细胞的天然启动子的转录控制下。

12.权利要求11的酵母细胞，其中所述启动子是宿主细胞的天然启动子。

13.权利要求1-8的任一项的酵母细胞，其中所述LDH基因整合在天然PDC基因的基因座上。

14.权利要求1-8的任一项的酵母细胞，其中所述宿主细胞是东方伊氏酵母或膜醭毕赤氏酵母。

15.权利要求9的酵母细胞，其中所述宿主细胞是东方伊氏酵母或膜醭毕赤氏酵母。

16.权利要求10的酵母细胞，其中所述宿主细胞是东方伊氏酵母或膜醭毕赤氏酵母。

17.权利要求1-8的任一项的酵母细胞，进一步具有至少一种选自下组的额外的基因修饰：(1)插入功能性的外源木糖异构酶基因，(2)缺失或破坏产生催化木糖转化为木糖醇的酶的天然基因，(3)缺失或破坏功能性木糖醇脱氢酶基因和/或(4)导致细胞超量表达功能性木酮糖激酶的修饰。

18.东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝的物种的酵母细胞，其具有选自下组的至少一种额外的基因修饰：(1)插入功能性的外源木糖异构酶基因，(2)缺失或破坏产生催化木糖转化为木糖醇的酶的天然基因，(3)缺失或破坏功能性木糖醇脱氢酶基因和/或(4)导致细胞超量表达功能性木酮糖激酶的修饰。

19.权利要求18的酵母细胞，其是物种东方伊氏酵母、Pichiagaleiformis、毕赤氏酵母种YB-4149(NRRL名称)、Candida ethanolica、P.deserticola、膜醭毕赤氏酵母或发酵性毕赤氏酵母的细胞。

20.一种发酵方法，其中在包含可发酵的糖的发酵培养液中在发酵条件下培养权利要求1的基因修饰的酵母细胞，以便生产乳酸或其盐。

21.权利要求20的发酵方法，其中所述可发酵的糖包括葡萄糖。

22.权利要求20或21的方法，其中在发酵的至少一部分时间中发酵培养液的pH是在约1.5-约4.5的范围内。

23.权利要求22的方法，其中在发酵的至少一部分时间中发酵培养液的pH是在约1.9-约3.5的范围内。

24.权利要求23的方法，其中在整个发酵过程中发酵培养液的pH是在约1.9-约3.5的范围内。

25.权利要求23的方法，其中在发酵开始时发酵培养液的pH是约3.5-约6，并且发酵过程中pH降低到约1.9-约3.5。

26.权利要求20或21的方法，其是需氧或微需氧发酵。

27.权利要求20或21的方法，其是无氧或准无氧发酵。

28.权利要求20或21的方法，其中用葡萄糖产生乳酸的产率是0.55-0.95g/g。

29.权利要求20的方法，进一步包括从发酵培养液回收乳酸。

30.权利要求29的方法，进一步包括从回收的乳酸产生交酯。

31.权利要求30的方法，进一步包括使交酯聚合形成聚(交酯)聚合物。

32.一种酵母转化载体，包含操作性连接于东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝的物种的天然启动子序列的功能性乳酸脱氢酶基因。

33.权利要求32的酵母转化载体，其中所述启动子序列是东方伊氏酵母、Pichia galeiformis、毕赤氏酵母种YB-4149(NRRL名称)、Candidaethanolica、P.deserticola、膜醭毕赤氏酵母或发酵性毕赤氏酵母的天然启动子序列。

34.权利要求32或33的酵母转化载体，其中所述外源LDH基因是与物种瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸片球菌、原牛或米根霉中的任何一个物种的功能性L-LDH基因具有至少35％同一性的功能性L-LDH基因。

35.权利要求32或33的酵母转化载体，其中所述外源LDH基因是编码与物种瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、巨大芽孢杆菌、乳酸片球菌、原牛或米根霉中的任何一个物种的功能性L-LDH基因编码的蛋白具有至少80％同一性的蛋白的功能性L-LDH基因。

36.权利要求32的酵母转化载体，其中所述外源LDH基因编码与SEQ.ID.NO.93、SEQ.ID.NO.94、SEQ.ID.NO.95或SEQ.ID.NO.96中的至少一个序列具有至少60％同一性的功能性蛋白。

37.权利要求32或33的酵母转化载体，其中所述外源LDH基因是与物种瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和乳酸片球菌的任何一个物种的功能性D-LDH基因具有至少45％同一性的功能性D-LDH基因。

38.权利要求32或33的酵母转化载体，其中所述外源LDH基因是编码与物种瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和乳酸片球菌的任何一个物种的功能性D-LDH基因编码的蛋白具有至少45％同一性的蛋白的功能性D-LDH基因。

39.一种酵母转化载体，包含位于上游(5’)和下游(3’)序列之间的LDH基因盒，所述LDH基因盒包含功能性连接于启动子和终止子的功能性乳酸脱氢酶基因，所述启动子和终止子在东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝的至少一种酵母种中均是操作性的，并且所述上游(5’)和下游(3’)序列是东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝的酵母种中天然基因的上游和下游侧翼区。

40.权利要求39的酵母转化载体，其中包含标记基因的至少一种标记基因盒也位于所述上游和下游序列之间，所述标记基因功能性连接于启动子序列和终止子序列，所述启动子序列和终止子序列在东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝的酵母种中均是操作性的。

41.权利要求39或40的酵母转化载体，其中所述上游和下游序列分别是东方伊氏酵母丙酮酸脱羧酶基因的5’和3’侧翼区。

42.权利要求39或40的酵母转化载体，其中所述LDH基因盒中的启动子是东方伊氏酵母基因的天然启动子。

43.东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝中的物种的基因修饰的酵母细胞，其具有产生乳酸的能力。

44.一种发酵方法，其中在包含可发酵的糖的发酵培养液中在发酵条件下培养权利要求43的基因修饰的酵母细胞，以便生产乳酸或其盐。

45.东方伊氏酵母/发酵性毕赤氏酵母进化枝中的物种的基因修饰的细胞。