CN100402644C - 用于在假丝酵母细胞中生产有机产物的方法和物质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物催化剂，它们是一种细胞，优选负Grabtree效应表型的细胞，所述的细胞含有编码异源基因的表达载体，所述基因能够增加有机产物的产量。更具体的说，本发明涉及遗传修饰的假丝酵母属细胞、这些假丝酵母属细胞的制备方法并涉及它们在生产有机产物、特别是乳酸中的应用。

Description

用于在假丝酵母细胞中生产有机产物的方法和物质

本申请是2001年11月23日提交的美国专利申请顺序号09/992,430的部分继续申请，它要求2000年11月22日提交的美国临时申请顺序号60/252,541的优先权。

背景技术

微生物在合成工业上重要的有机产物中的应用是众所周知的。当与大规模化学合成相比时，用于生产有机产物的生物合成手段可以是极其有效的。生物合成手段在生产有机产物中可以具有优于化学合成手段的优势，包括更为迅速和更为有效的产率、异构体纯度和降低的成本(参见Thomas等，2002，Trends Biotechnol.20：238-42)。

乳酸具有广泛的工业化应用，包括在化学处理与合成、化妆品、药物、塑料和食品生产中的应用。乳酸是相对简单的有机分子，可以通过化学合成或通过在微生物中发酵(生物合成)生产。当微生物的遗传操作已经得到进一步提高时，用于乳酸生产的发酵法在商业上则优于化学合成。这种优先选择的一个原因在于使用遗传修饰的微生物能够产生旋光纯(即L(+)或D(-)异构体)的产物。这类方法避免了对分离外消旋产物混合物的需求，由此降低了成本。

尽管如此，但是微生物在生产有机产物中的应用仍存在一定限制。例如，细菌在发酵条件下产生大量的有机产物，但有机产物在细菌自身和生长培养基中的累积可以抑制细菌增殖或导致细胞死亡。即使对诸如嗜酸性酵母啤酒糖酵母这样更耐用的生物体进行改造并用于生产，有机产物也可以导致细胞生长抑制，从而降低有机产物的总产率。因此，本领域中存在对适合于遗传操作的耐用微生物、在生物反应器中的应用和用于生产工业上重要有机产物的其它生物合成方法存在需求。

发明概述

本发明提供了通过生物合成生产有机产物的方法和试剂、特别是细胞和重组细胞。本发明特别提供了编码至少一种用于合成有机产物的蛋白质的重组核酸构建体、包括所述构建体的细胞、特别是负Grabtree效应细胞、这类细胞的制备方法和培养方法，体内合成大量有机产物的方法和试剂。

本发明在一个方面中提供了包括编码至少一种用于合成有机产物的蛋白质的序列的重组核酸构建体。在优选的实施方案中，该重组核酸构建体编码乳酸脱氢酶。在该方面的一个实施方案中，该重组核酸构建体包括可操作地与编码用于合成有机产物的蛋白质的核酸连接的启动子，其中该启动于是来自假丝酵母属的种类、优选包括所述重组核酸构建体的假丝酵母属种类的启动子。

本发明在另一个方面中提供了来自假丝酵母属的转化的负Grabtree效应细胞，它包括编码至少一种用于合成有机产物的蛋白质的重组核酸构建体。在优选的实施方案中，该重组核酸构建体编码乳酸脱氢酶。在该方面的一个实施方案中，该重组核酸构建体包括可操作地与编码用于合成有机产物的蛋白质的核酸连接的启动子，其中该启动子是来自假丝酵母属的种类、优选包括所述重组核酸构建体的假丝酵母属种类的启动子。本发明在另一个方面中提供了遗传操作的假丝酵母属种类的细胞，使得它在将丙酮酸代谢成乙醇方面的效率降低。在本发明该方面的优选实施方案中，所述的细胞进一步包括编码至少一种用于合成有机产物的蛋白质的本发明重组核酸构建体。在优选的实施方案中，该重组核酸构建体编码乳酸脱氢酶。在该方面的一个实施方案中，该重组核酸构建体包括可操作地与编码用于合成有机产物的蛋白质的核酸连接的启动子，其中该启动子是来自假丝酵母属的种类、优选包括所述重组核酸构建体的假丝酵母属种类的启动子。

本发明在另一个方面中提供了有机产物的生产方法，该方法包括在对所述有机产物进行生物合成的条件下发酵来自假丝酵母属的包括本发明重组核酸构建体的负Grabtree效应细胞的步骤。在本发明该方面的优选实施方案中，所述的有机产物是乳酸。在优选的实施方案中，所述的重组核酸构建体编码乳酸脱氢酶。在该方面的一个实施方案中，该重组核酸构建体包括可操作地与编码用于合成有机产物的蛋白质的核酸连接的启动子，其中该启动子是来自假丝酵母属的种类、优选包括所述重组核酸构建体的假丝酵母属种类的启动子。

本发明的优点在于本文提供的转化细胞表现出″负Grabtree效应″表型。负Grabtree效应生物体的特征在于受诱导后增加发酵状态的能力。天然出现的生物体和遗传修饰的生物体的特征均为负Grabtree效应。将克拉布特效应定义为当在有高浓度葡萄糖(例如＞5mM葡萄糖)存在的需氧条件下培养微生物时，微生物中的耗氧抑制。正Grabtree效应生物体在有葡萄糖存在的情况下持续发酵(而不是呼吸)而与氧的利用量无关；而负Grabtree效应生物体不会表现出葡萄糖介导的耗氧抑制。这种特性可用于有机产物的合成，这是因为它允许细胞在高底物浓度下生长而保留了氧化磷酸化的有益能量效应。许多酵母和真菌具有负Grabtree效应表型，包括非限制性实例克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)、汉逊氏酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)、Yamadazyma和假丝酵母属(Candida)。

本领域中分别被鉴定为酵母和双态性真菌的假丝酵母属种类可以表现出负Grabtree效应表型(Franzblau&Sinclair，1983，Mycopathologia 82：185-190)。一些种类可以发酵葡萄糖和可选的碳源、可以在升温(即高于37℃)下生长，可以耐受低pH压力。假丝酵母属的种类具有用于有机产物生产的生物合成方法中的生物体的数种所需特征：对遗传操作的适应性；加工各种碳源的能力；负Grabtree效应表型；和在各种环境压力下增殖的能力。

从下面对一些优选实施方案的详细描述和权利要求中显然可以得出本发明的具体优选实施方案。

附图说明

图1示pMI260载体，其包括编码G418抗性的基因，该基因由PGK启动子(啤酒糖酵母)驱动并与GAL10(啤酒糖酵母)终止子连接。

图2示pMI268载体，其包括编码G418抗性的基因，该基因由PGK启动子(C.sonorensis)驱动并与GAL10(啤酒糖酵母)终止子连接。

图3示pMI269载体，其包括编码G418抗性的基因，该基因由TDH启动子(C.sonorensis)驱动并与GAL10(啤酒糖酵母)终止子连接。

图4示pMI270载体，其包括编码潮霉素抗性的基因，该基因由PGK启动子(C.sonorensis)驱动并与GAL10(啤酒糖酵母)终止子连接。

图5示pMI234载体，它包括由PGK启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)基因。

图6示pMI238载体，包括由TDH启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)基因。

图7示pMI271载体，包括编码潮霉素抗性的基因，该基因由TDH启动子(C.sonorensis)驱动并与GAL10(啤酒糖酵母)终止子连接。

图8示pMI246载体，包括各自由PGK启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)和LDH(瑞士乳杆菌)基因。LDH基因与来自S26rRNA(C.sonorensis)区下游的CYC1终止子连接。

图9示pMI247载体，包括TDH启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)基因和PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(瑞士乳杆菌)基因。LDH基因与来自S26rRNA(C.sonorensis)区下游的CYC1终止子连接。

图10示pMI257载体，包括PGK启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)基因和PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(瑞士乳杆菌)基因。LDH基因与CYC1终止子连接。将这一完整的表达盒插在PDC1启动子与终止子(C.sonorensis)之间。

图11示pMI265载体，包括PGK启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)基因和PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(巨大芽孢杆菌；来自载体pVR24)基因。LDH基因与PDC1(C.sonorensis)终止子连接。将这一完整的表达盒插在PDC1启动子与终止子(C.sonorensis)之间。

图12示pMI266载体，包括PGK启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)基因和PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(米根霉；来自载体pVR27)基因。LDH基因与PDC1(C.sonorensis)终止子连接。将这一完整的表达盒插在PDC1启动子与终止子(C.sonorensis)之间。

图13示pMI267载体，包括PGK启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)基因。将该表达盒插在PDC1启动子与终止子(C.sonorensis)之间。

图14示pMI278载体，包括编码G418抗性、由TDH启动子(C.sonorensis)驱动并与MEL5终止子可操作连接的基因，和由PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(巨大芽孢杆菌)基因。LDH基因与GAL10(啤酒糖酵母)终止子连接。

图15示pMI286载体，包括编码G418抗性、由TDH启动子(C.sonorensis)驱动并与MEL5(啤酒糖酵母)终止子可操作地连接的基因，和由PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(巨大芽孢杆菌)基因。LDH基因与GAL10(啤酒糖糖母)终止子连接。将这一完整的表达盒插在PDC2启动子与终止子(C.sonorensis)之间。

图16示pMI287载体，包括编码G418抗性、由TDH启动子(C.sonorensis)驱动并与MEL5(啤酒糖酵母)终止子可操作地连接的基因。将该表达盒插在PDC2启动子与终止子(C.sonorensis)之间。

图17示pMI288载体，包括编码G418抗性、由TDH启动子(C.sonorensis)驱动并与MEL5(啤酒糖酵母)终止子可操作地连接的基因和由PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(瑞士乳杆菌)基因。LDH基因与CYC1终止子连接。将这一完整的表达盒插在PDC2启动子与终止子(C.sonorensis)之间。

图18示pMI256载体，包括由PGK启动子(C.sonorensis)驱动的MEL5(啤酒糖酵母)基因和由PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(瑞士乳杆菌)基因。LDH基因与CYC1终止子连接。将这一完整的表达盒插在PDC1终止子(C.sonorensis)的上游。

图19示MI277载体，包括PDC2启动子(C.sonorensis)。

图20示pMI279载体，包括编码G418抗性、由TDH启动子(C.sonorensis)驱动并与MEL5(啤酒糖酵母)终止子可操作地连接的基因和由PGK启动子(C.sonorensis)驱动的LDH(巨大芽孢杆菌)基因。LDH基因与GAL10(啤酒糖酵母)终止子连接。将这一完整的表达盒插在PDC2启动子(C.sonorensis)的下游。

图21是pVR24载体的示意图。

图22是pVR27载体的示意图。

图23A-C是包括pMI214、pMI203、pMI205、pMI227、pMI233和pMI234在内的载体的示意图。

发明详述

本文所用的″有机产物″是含有碳原子的任意化合物。有机产物的非限制性实例包括羧酸(例如乳酸、丙烯酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、草酰乙酸)、碳水化合物(例如D-木糖)、糖醇类(例如木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇)、氨基酸(例如甘氨酸、色氨酸、谷氨酸)、脂类、酯类、维生素(例如L-抗坏血酸)、多元醇类(例如甘油、1，3-丙二醇、赤藓糖醇)、醛类、烯类、炔类和内酯类。因此，有机产物可以含有一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十个以上碳原子。此外，有机产物可以具有小于约1,000(例如小于约900、800、700、600、500、400、300、200或100)道尔顿的分子量。例如，D-木糖(C₅H₁₀O₅)是具有150道尔顿分子量的有机产物。此外，有机产物可以是发酵产物。

本文所用的术语″发酵产物″指的是通过发酵过程产生的任何有机化合物。一般来说，发酵过程可以包括将有机化合物(例如碳水化合物)以厌氧酶促方式转化成诸如乙醇这样的化合物，从而产生ATP形式的能量。细胞发酵不同于细胞呼吸的方面在于将非分子氧的有机产物用作电子受体。发酵产物的非限制性实例是乙酸、乙醇、丁酸和乳酸。

有机产物还可以来源于丙酮酸。本文所用的″丙酮酸衍生的产物″指的是在不超过15个酶促步骤中由丙酮酸合成的任意化合物。这里将一个酶步骤认为是由具有酶活性的多肽催化的任意化学反应或系列反应。这类多肽是催化其它物质的化学反应，而其自身在反应完成时未被破坏或未改变的任意多肽。这些多肽可以具有任意类型的酶活性，包括与顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸硫激酶、琥珀酸脱氢酶、延胡索酸酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶、2，5-二氧戊酸脱氢酶、5-脱氢-4-脱氧-D-葡糖二酸脱氢酶、葡糖二酸脱水酶、醛脱氢酶、葡糖醛酸内酯还原酶、L-古洛糖酸内酯氧化酶、2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸醛缩酶、木糖酸脱水酶、xylonolactonase、D-木糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、CoA-转移酶、lacyl-CoA脱水酶或丙烯酰-CoA水化酶相关的活性的非限制性实例。

本发明的羧酸产物可以是游离酸或盐的形式，可以互换使用(例如“乳酸”或“乳酸盐”)。除非另有说明，可以认为其中任一术语的应用包括另一种含义。本发明在优选的实施方案中提供了游离酸形式的羧酸。

术语“核酸序列”或“核酸分子”指的是DNA或RNA分子。该术语包括由任意已知DNA和RNA的碱基类似物形成的分子，诸如、但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶-胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基-甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异-戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧羰基-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。

术语″载体″用于指用于将编码蛋白质的信息转入宿主细胞的任意分子(例如核酸、质粒或病毒)。

术语″表达载体″指的是适合于转化宿主细胞并含有指导和/或控制插入的异源核酸序列表达的核酸序列的载体。表达包括、但不限于诸如转录、翻译等过程，如果存在内含子，则还包括RNA剪接。

本文所用的术语″可操作地连接″指的是序列排列，其中所述序列彼此连接并构成或装配成发挥正常功能的状态。因此，与编码蛋白质的序列可操作地连接的序列可以位于该编码序列的侧翼，能够对该编码序列进行复制和/或转录。例如，编码序列可操作地与启动子连接，此时该启动子能够指导所述编码序列的转录。侧翼序列不需要与所述编码序列邻接，只要它正确地起作用。因此，例如，在启动子序列与所述编码序列之间可以存在未翻译但已转录的间插序列，仍然可以认为所述启动子序列与所述编码序列“可操作地连接”。

术语“宿主细胞”用于指已经导入或转化的细胞或能够用核酸序列转化，然后能够表达选定的靶基因的细胞。该术语包括亲代细胞的子代，无论该子代是否在形态或遗传装配上是否与原始的亲代相同。

本文所用的术语″内源性″指的是非外源性的、即并非导入细胞的基因组物质。这类内源性基因组物质通常在生物体、组织或细胞内产生，无法通过重组技术插入或修饰。内源性基因组物质包括天然出现的变化形式。

本文所用的术语″外源性″或″异源″指的是非内源性的、即导入细胞的基因组物质。一般通过重组技术插入或修饰这类物质。

本文所用的术语″遗传修饰的″指的是已经通过包括添加、取代或缺失遗传物质这样的非限制性实例在内的方法修饰了基因组的生物体。这类遗传操作方法在本领域中是众所周知的，包括、但不限于：随机诱变；点突变，包括插入、缺失和取代一个或多个独立的核苷酸残基；剔除技术；和使用重组技术用核酸序列转化生物体，包括稳定和瞬时转化。

认为术语″厌氧″和″厌氧条件″指的是在溶液、一般是在培养基中溶解的氧的量不可检测到(即约0％)或可以是在空气中氧的量约为0％-2％。

载体和宿主细胞

对于可用于合成目的有机产物的多肽，可将编码其氨基酸序列的核酸分子使用标准连接技术插入适宜的克隆载体或表达载体(例如，参见Sambrook等，2001，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3^rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。一般选择在所用特定宿主细胞中起作用的载体(即该载体与宿主细胞机制相容以使基因的复制、扩增和/或表达可以发生)。对用于合成目的有机产物的多肽而言，可以在任意合适的细胞中扩增编码其氨基酸序列的核酸分子，并在任意宿主细胞、最优选在负Grabtree效应宿主细胞中表达它们。

优选的负Grabtree效应宿主细胞包括那些来自假丝酵母属的细胞，包括C.sonorensis、C.methanosorbosa、迪丹氏假丝酵母(C.diddensiae)、近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)、C.naeodendra、克鲁斯氏假丝酵母(C.krusei)、布蓝克氏假丝酵母(C.blankii)和C.entomophila这样的非限制性实例。

侧翼序列(包括启动子和终止子)可以是同源的(即来自与宿主细胞相同的种类和/或菌株)、异源的(即来自非宿主细胞种类或菌株的种类)、杂交的(即来自不止一种来源的侧翼序列的组合)、或合成的、或者该侧翼序列可以是通常起调节目的基因表达的作用的天然序列。照此，侧翼序列的来源可以是任意的原核或真核生物体、任意的脊椎动物或无脊椎动物生物体、或任意的植物，条件是该侧翼序列在宿主细胞机制中起作用，可以被宿主细胞机制活化。

可以通过本领域中众所周知的几种方法中的任意一种获得用于本发明载体的侧翼序列。一般来说，本文所用的侧翼序列可以预先通过作图和/或通过限制性内切核酸酶消化来鉴定，由此可以使用适宜的限制性内切核酸酶从生物来源中分离它们。在一些情况中，侧翼序列的完整核苷酸序列可以是已知的。在这类情况中，可以使用本领域技术人员众所周知用于核酸合成或克隆的方法以及本文所述的那些方法合成所述的侧翼序列。

如果侧翼序列的全部或仅部分是已知的，那么可以使用诸如聚合酶链反应(PCR)等体外扩增技术和/或通过用适宜的寡核苷酸和/或来自相同或另一种类的侧翼序列片段筛选基因组文库，来获得完整的功能性侧翼序列。如果侧翼序列是未知的，那么可以从含有例如编码序列乃至另一种基因或多种基因的较大DNA片段中分离含有侧翼序列的DNA片段。分离可以通过下列步骤完成：用限制性内切核酸酶消化以产生合适的DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化、Qiagen

柱色谱法(Chatsworth，CA)或本领域技术人员所公知的其它方法进行分离。为达到该目的而选择合适的酶对本领域技术人员而言是显而易见的。

可选择的标记基因或元件编码对宿主细胞在选择培养基中存活和生长而言必不可少的蛋白质。有用的选择标记基因编码具有下列特性的蛋白质：(a)使宿主细胞中产生对抗生素或其它毒素、例如氨苄西林、四环素或卡那霉素的耐受性；(b)补充宿主细胞的营养缺陷、诸如Leu2缺陷；或(c)提供从复合培养基中无法得到的关键营养物。优选的选择标记包括zeocin抗性基因、G418抗性基因和潮霉素抗性基因这样的非限制性实例。

其它选择基因可以用于扩增所表达的基因。扩增是一种过程，其中对生长而言关键的蛋白质的生产所大量需要的基因以串联方式重复排列在连续多代重组细胞的染色体中。用于哺乳动物细胞的合适的选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子的胸苷激酶。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中仅转化体才适合于借助载体中的选择标记存活。通过在培养基中选择剂的浓度逐步增加的条件下培养转化的细胞来施加选择压力，由此使选择基因和编码用于合成有机产物的DNA扩增。

本发明的表达和克隆载体一般含有由宿主生物体识别，可操作地与编码用于合成有机产物的多肽的分子连接的启动子。启动子是未转录的位于结构基因翻译起始密码子上游(即5′)的序列(一般在约100-1000bp范围内)，控制该结构基因的转录。通常将启动子分成两类：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子应对诸如有或没有营养物或温度改变等培养条件的改变而启动在其控制下的DNA的转录水平增加。另一方面，组成型启动子启动连续基因产物的生产，即几乎没有或不调节基因表达。由不同宿主细胞识别的两种启动子类型中的大量启动子在本领域中是众所周知的。通过用限制酶消化从源DNA中取出启动子或通过体外扩增产生启动子片段并将所需启动子序列插入载体，可以使合适的启动子可操作地与编码用于合成有机产物的多肽的DNA连接。天然启动子序列可以用于指导扩增和/或表达编码用于合成有机产物的多肽的核酸分子。不过，优选异源启动子，条件是与天然启动子相比它使表达的蛋白质的转录增加，产量更高，条件是它与已经选择应用的宿主细胞相容。

用于酵母宿主细胞的合适的启动子在本领域中也是众所周知的，包括来自酵母基因的启动子的非限制性实例，所述基因包括磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙糖脱氢酶(TDH)、丙酮酸脱羧酶(PDC)、磷酸丙糖异构酶(TPI)和醇脱氢酶(ADH)。本发明优选的启动子包括PGK和TDH启动子。酵母增强子(即在位于与启动子相对邻近的位置时增加表达的序列)有利地与酵母启动子一起使用。

细胞的转化方法在本领域中是众所周知的，可以包括诸如电穿孔和基于氯化钙或乙酸锂的转化方法这类非限制性实例。

已经预先构建了本发明实施例中公开的几种载体，它们描述在PCT/US01/44041申请中。简单的说，如下构建载体pMI234、pMI238、pMI246、pMI247和λPDC2。

C.sonorensis基因分离(λPDC2)：使用Easy DNA试剂盒(Invitrogen)从在YPD中生长过夜的细胞中分离C.sonorensis(ATCC保藏号32109)的基因组DNA。用Sau3A对DNA进行部分消化，蔗糖梯度离心进行大小分级分离(Sambrook等，文献同上)。使约22kb的DNA片段与经过BamHI消化和磷酸酶处理的λDASH^TM载体臂(Stratagene)连接，使用Gigapack II GoldPackaging Extract(Stratagene)将连接混合物包装入λ颗粒。将所述λ颗粒用于感染大肠杆菌MRAP2。

如下通过使用Dynazyme EXT聚合酶(Finnzymes，Espoo，Finland)、序列特异性引物，以及作为模板的啤酒糖酵母、白色假丝酵母或C.sonorensis基因组DNA，经PCR扩增制备用于从文库中分离C.sonorensis基因的探针。

·将对应于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)TDH1基因的寡核苷酸TGT CAT CAC TGC TCC ATC TT(SEQ ID No.17)和TTA AGC CTT GGCAAC ATA TT(SEQ ID No.18)用于从啤酒糖酵母基因组DNA扩增TDH基因片段。

·将对应于白色假丝酵母(Candida albicans)PGK1基因的寡核苷酸GCGATC TCG AGG TCC TAG AAT ATG TAT ACT AAT TTG C(SEQ ID No.19)和CGC GAA TTCCCA TGGTTA GTT TTT GTT GGA AAG AGC AAC(SEQ IDNo.20)用于从白色假丝酵母DNA扩增PGK1基因片段。

·将对应于C.sonorensis 26 S rRNA的寡核苷酸TGG ACT AGT AAACCA ACA GGG ATT GCC TTA GT(SEQ ID No.21)和CTA GTC TAG AGATCA TTA CGC CAG CAT CCT AGG(SEQ ID No.22)用于从C.sonorensis基因组DNA扩增26S rDNA基因片段。

·基于在啤酒糖酵母PDC1、具柄毕赤氏酵母(Pichia stipitis)PDC1和PDC2之间保守的部分丙酮酸脱羧酶氨基酸序列WAGNANELNA(SEQ ID No.25)和DFNTGSFSYS(SEQ ID No.26)，以及白色假丝酵母PDC1和PDC3的不完全序列，来设计寡核苷酸CCG GAA TTC GAT ATC TGG GCW GGKAAT GCC AAY GAR TTR AAT GC(SEQ ID No.23)和CGC GGA TTC AGG CCT CAG TAN GAR AAW GAA CCN GTR TTR AAR TC(SEQ ID No.24)。将这些引物用于从C.sonorensis基因组DNA扩增PDC基因片段。用这些引物进行PCR反应产生两种具有不同核苷酸序列的片段、称作PDC1和PDC2。

·基于真菌醇脱氢酶序列中发现的保守区设计寡核苷酸TCTGTTMCCTACRTAAGA(SEQ ID No.27)和GTYGGTGGTCACGAAGGTGC(SEQ ID No.28)。将这些引物用于从C.sonorensis基因组DNA扩增ADH基因片段。用这些引物进行的PCR反应产生三种具有不同核苷酸序列的片段、称作ADH1、ADH2和ADH3。

文库用如上所述产生的PCR片段筛选，产物用随机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim)用³²Pα-dCTP标记产物。与放射性探针的杂交通过在42℃含有50％甲酰胺、5x Denhardt′s、5x SSPE、0.1％SDS、100μg/mL鲱精DNA、1μg/mL polyA DNA的溶液中保温过夜来进行。就TDH1、PGK1和PDC1探针而言，在室温下的2x SSC溶液中杂交5分钟后洗涤滤膜并重复该步骤，随后在68℃用1x SSC-0.1％SDS溶液洗涤两次，每次30分钟。在rDNA和PDC2探针的情况下，杂交后在室温下用2x SSC进行两次洗涤，每次5分钟，随后在68℃用0.1x SSC-0.1％SDS进行两次洗涤，每次30分钟。

按照制造商的说明(Stratagene)分离和纯化阳性噬斑。按常规方法(Sambrook等，文献同上)纯化噬菌体，不同的是取消DNAseI处理并使用PEG6000来沉淀从裂解的宿主细胞中释放的噬菌体颗粒。然后将所述的噬菌体颗粒溶于SM缓冲液并用氯仿提取、通过用Kontron TST41.14转子以25，000rpm离心2小时进行沉淀并再溶于SM缓冲液中。通过用蛋白酶K消化噬菌体颗粒、随后进行酚提取和乙醇沉淀来分离λDNA。

使用序列特异性引物对C.sonorensis基因组DNA插入片段进行测序。将核苷酸序列和由此公认的氨基酸序列与序列数据库进行比较以便利用与已知基因或蛋白质的同源性来鉴定完全或部分由噬菌体插入片段编码的基因。根据分离每一克隆所用的探针的不同，所得的序列与真菌rDNA、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶或丙酮酸脱羧酶具有显著的相似性。由此鉴定了编码C sonorensis PGK1、PDC1和TDH1的序列的可读框的起点和终点。

“构件(building-block)”载体pMI203、pMI205(用于C.sonorensis的Zeocin 抗性载体)、pVR24和pVR27

将这些质粒用于构建实施例的载体，它们描述在PCT申请PCT/US01/44041中。简单的说，描述了这些载体的构建。

质粒pTEF1/Zeo(Invitrogen)含有在啤酒糖酵母TEF1启动子控制下的zeocin抗性标记，通过添加C.sonorensis rDNA片段对该质粒进行修饰以便为同源重组提供靶物。将下列对应于C.sonorensis26SrRNA(Genbank登记号U70185)的寡核苷酸引物用于扩增C.sonorensis基因组DNA，以便提供PCR-扩增的26S rDNA基因片段：TGG ACT AGT AAA CCA ACA GGG ATTGCC TTA GT (SEQID No.29)和CTA GTC TAG AGA TCA TTA CGC CAGCAT CCT AGG(SEQ ID No.30)。所得的PCR产物片段用限制酶SpeI和XbaI消化并与用XbaI消化的pTEF/zseo质粒连接。将所得的质粒命名为pMI203(图23B)。

用来自另一假丝酵母属种类的基因的启动子白色假丝酵母PGK1启动子取代pMI203中所含的TEF1启动子。基于可得到的白色假丝酵母PGK1序列(Genbank登记号U25180)设计下列寡核苷酸引物：GCG ATC TCG AGGTCC TAG AAT ATG TAT ACT AATTTGC(SEQID No.31)和ACT TGG CCATGG TGA TAG TTA TTC TTC TGC AATTGA(SEQID No.32)。将白色假丝酵母基因组DNA用作模板，用这些引物从白色假丝酵母PGK1可读框的上游区扩增700bp片段。将限制位点XbaI和SpeI(上述加下划线的)添加到所述引物中以有利于克隆所述片段。扩增后，分离该片段并用限制酶XhoI和NcoI消化，然后与用SoI和NcoI消化的质粒pMI203连接。将所得质粒命名为pMI205(图23B)。

PVR24和pVR27：用NotI限制酶(Invitrogen)消化质粒pBFY004(专利权人，NREL)，得到1235bp片段(SEQID No：33)。分离该片段并与NotI消化的pGEM5zF(+)(Promega North，Madison，WI)连接。使用该连接混合物、应用标准电穿孔方案(Sambrook，文献同上)转化大肠杆菌(前10个(top10))(Invitrogen)。将所得质粒命名为pNC002。

如下分离编码LDH基因的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)DNA。巨大芽孢杆菌获自美国典型培养物保藏中心(ATCC保藏号#6458)并使它们在标准条件下生长。使用Invitrogen的″Easy-DNA″试剂盒、按照制造商的方案从这些细胞中纯化基因组DNA。基于在Genbank中得到的巨大芽孢杆菌L-LDH(Genbank登记号#M22305)的序列设计引物。使用标准技术进行PCR扩增反应，其中每一反应体系中均含有巨大芽孢杆菌基因组DNA(6ng/μL)、4dNTPs(0.2mM)以及扩增引物BM1270和BM179(各为1μM)。这些引物具有如下序列：BM1270CCTGAGTCCACGTCATTATTC(SEQ ID No：34)和BM179TGAAGCTATTTATTCTTGTTAC(SEQ ID No：35)。

按照如下热循环条件进行反应：开始在95℃保温10分钟；随后是由95℃30秒、50℃30秒、72℃60秒组成的35个循环。使用常规步骤对1100个碱基对(bp)的明显(strong)产物片段进行凝胶纯化、克隆并测序。可以将所得序列翻译成表现出与已知L-LDH-编码基因具有高度同源性的多肽。

本文公开的编码巨大芽孢杆菌LDH的编码序列可操作地与来自PGK1基因的启动子和来自GAL10基因的转录终止子连接，这两者均来自啤酒糖酵母。基于该序列设计两种寡核苷酸引物Bmeg5′和Bmeg3′以便在该基因编码序列的末端导入限制位点：Bmeg5′GCTCTAGATGAAAACACAATTTACACC(SEQ ID No：36)和Bmeg3′ATGGATCCTTACACAAAAGCTCTGTCGC(SEQ ID No：37)。

使用上述dNTP和引物浓度、应用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)在制造商提供的缓冲液中进行该扩增反应。通过开始在95℃将反应混合物保温3分钟、然后是由95℃30秒、50℃30秒、72℃60秒组成的20个循环、随后是在72℃最终保温9分钟来进行热循环。产物用限制酶XbaI和BamHI消化，然后使其连入质粒pNC002的XbaI和BamHI位点。这种连接使PGK启动子和GAL10终止子可操作地与巨大芽孢杆菌LDH编码序列连接(pVR24；图21)。

进行pVR27构建(图22)以生成含有在啤酒糖酵母PGK1启动子控制下表达的米根霉(Rhizopus oryzae)LDH的载体。从在标准条件下生长的细胞(ATCC保藏号#9363)纯化的(″Easy-DN A″试剂盒，Invitrogen)米根霉基因组DNA中分离LDH。基于Genbank中可得到的米根霉LDH(Genbank登记号#AF226154)的序列设计引物。使用标准技术进行PCR扩增反应，其中每一反应体系中均含有米根霉基因组DNA(6ng/μL)、4种dNTPs中的每一种(0.2mM)以及扩增引物Ral-5′和Ral-3′中的每一种(1μM)。扩增引物具有如下序列：Ral-5′CTTTATTTTTCTTTACAATATAATTC(SEQ ID No：38)和Ral-3′ACTAGCAGTGCAAAACATG(SEQ ID No：39)。

按照下列循环条件进行反应：开始在95℃保温10分钟；随后是由95℃30秒、41℃30秒、72℃60秒组成的35个循环。对1100bp的明显产物片段进行凝胶纯化、克隆到TA载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中并测序。可以将所得序列翻译成表现出与Genbank中已知编码米根霉LDH基因的序列(登记号#AF226154)具有高度同源性的多肽。

本文公开的编码米根霉LDH的基因的编码序列可操作地与来自PGK1的启动子和来自GAL10基因的转录终止子连接，它们两者均来自啤酒糖酵母。在制备该构建体的过程中，制备下列寡核苷酸并将它们用于扩增来自含有根霉LDH插入片段的质粒的编码序列。基于该序列设计两种寡核苷酸引物Rapgk5和Papgk3′以便在所述基因的编码序列末端导入限制位点。

Rapgk5 GCTCTAGATGGTATTACACTCAAAGGTCG(SEQ ID No：40)和Papgk3GCTCTAGATCAACAGCTACTTTTAGAAAAG(SEQ ID No：41)

使用如上所述的dNTP和引物浓度、应用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)在制造商提供的缓冲液中进行该扩增反应。通过开始在95℃将反应混合物保温3分钟、然后是由95℃30秒、53℃30秒、72℃60秒组成的20个循环、随后是在72℃最终保温9分钟来进行热循环。用限制酶XbaI消化产物，然后使其连入质粒pNC002的XbaI位点。

这种连接使PGK启动子和GAL10终止子可操作地与米根霉LDH编码序列连接(pVR27；图22)。

pMI234和pMI238：为了对C.sonorensis转化体进行阳性选择，获得啤酒糖酵母MEL5基因(Naumov等，1990，MGG 224：119-128；Turakainen等，1994，Yeast 10：1559-1568；Genbank登记号Z37511)，具体是来自质粒pMEL5-39的2160bp EcoRI-SpeI片段，将其与用EcoRI和SpeI消化的pBluescript II KS(-)(Stratagene)连接。MEL5基因中的EcoRI位点位于起始密码子ATG的510bp上游，而SpeI位点位于MEL5终止密码子的250bp下游。将所得质粒命名为pMI233(图23C)。

用具有如下序列的引物扩增C.sonorensis的1500 bp PGK1启动子：GCGATC TCG AGA AAG AAA CGA CCC ATC CAA GTG ATG(SEQID No.5)和TGG ACT AGT ACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGA AAG CAA ACATTG TATATA GTC TTT TCTATTATTAG(SEQ ID No.42)，其中使用来自上述分离的PGK1λ克隆作为模板。3′引物可以使C.sonorensisPGK1启动子与啤酒糖酵母MEL5产生融合体，这是因为它对应于PGK1启动子中紧接可读框上游的核苷酸以及MEL5可读框5′末端的核苷酸。所得的扩增片段用限制酶SphI和XhoI消化并与用SphI和XhoI消化的质粒pMI233(图23C)连接。在该质粒中所得的构建体含有C.sonorensis PGK1启动子，它在MEL5可读框的上游可操作地与之连接，将该质粒鉴定为pMI234，见图5。

按照类似的方式，用具有如下序列的引物扩增650bp的C.sonorensisTDH1启动子：GCG ATC TCG AGA AAA TGT TAT TAT AAC ACT ACA C(SEQ ID No.3)和TGG ACT AGT ACA TGC ATG CGG TGA GAA AGT AGAAAG CAA ACA TTT TGT TTG ATT TGT TTG TTT TGT TTT TGT TTG(SEQID No.43)，其中使用来自上述分离的TDH1λ克隆的DNA作为模板。3′引物可以使C.sonorensis TDH1启动子与啤酒糖酵母MEL5产生融合体，这是因为它对应TDH1启动子中紧接可读框上游的核苷酸以及MEL5可读框5′末端的核苷酸。所得的扩增片段用限制酶SphI和XhoI消化并使其与用SphI和XhoI消化的质粒pMI233(图23C)连接。所得质粒鉴定为pMI238，见图6，它含有位于MEL5可读框上游，可操作地与之连接的C.sonorensis TDH 1启动子。

pMI246和pMI247：用质粒pMI205生产含有作为选择标记的MEL5基因和能够在C.sonorensis中生产乳酸的LDH基因的质粒。在所得质粒中，用瑞士乳杆菌(L.helveticus)LDH基因取代pMI205中的zeocin抗性基因。

使pVR1中含有LDH基因和CYC1终止子的1329bp NcoI-BamHI片段与pMI205(图23B)中携带瑞士乳杆菌LDH基因的3413bp NcoI-BamHI片段连接，使其在白色假丝酵母PGK1启动子控制下；将所得质粒命名为pMI214。在第二个步骤中，用C.sonorensis PGK1启动子取代白色假丝酵母PGK1启动子。使用具有如下序列的引物，从如上所述的分离的λ克隆中扩增得到C.sonorensis PGK1启动子：GCG ATC TCG AGA AAG AAA CGA CCCATC CAA GTG ATG(SEQ ID No.5)和ACT TGG CCA TGG TAT ATA GTCTTT TCT ATT ATT AG(SEQID No.44)；将PCR产物用XhoI和NcoI消化并连入用XhoI和NcoI消化的pMI214。将该质粒命名为pMI277，见图19。

通过将pMI227(图23A)的3377bp AvrII-NheI片段与用SpeI-消化的pMI234(图23C)连接而将来自pMI227的LDH表达盒和来自pMI234的MEL5标记盒合并入同一载体。将所得质粒命名为pMI246，见图8。

通过将pMI227的3377bp AvrII-NheI片段与用SpeI-消化的pMI238连接而将来自pMI227的LDH表达盒和来自pMI238的MEL5标记盒合并入同一载体。将所得质粒命名为pMI247，见图9。

本发明在一个实施方案中提供了重组核酸构建体，包括编码用于生物合成有机产物的多肽的核苷酸序列，它可操作地与在假丝酵母属中起作用的启动子连接。

在相关实施方案中，所述的核苷酸序列编码乳酸脱氢酶基因。在优选的实施方案中，所述的乳酸脱氢酶基因与导入了它的假丝酵母属酵母细胞异源。在最优选的实施方案中，所述的乳酸脱氢酶基因来自微生物，诸如：例如细菌或真菌；，按照本发明方法生产的有机产物是乳酸(或乳酸盐(lactate))。

一般来说，当糖底物是己糖、例如葡萄糖时，用于生产乳酸的本发明方法的产量可以是(以产生的乳酸克数/消耗的糖底物克数计)约60％或60％以上、优选约70％或70％以上、更优选约80％或80％以上，最优选约90％或90％以上的乳酸。

用于生产乳酸的本发明方法可以得到约75克/L或75克/L以上、优选约90克/L或90克/L以上，最优选约100克/L或100克/L以上的乳酸滴度(lacticacid titer)。当将己糖底物、诸如葡萄糖用于生产时，本发明的细胞具有约0.20或0.20以上、优选约0.30或0.30以上，最优选约0.50或0.50以上的特定乳酸生产能力(以产生的乳酸克数/克干细胞重/h计)。

在一个实施方案中，本发明的负Grabtree效应细胞因天然或遗传修饰而可以进行淀粉的分解代谢。在其它实施方案中，将这些细胞遗传修饰以便通过添加诸如基于真菌的纤维素酶这样的分子而对纤维素类进行分解代谢。

在相关实施方案中，本发明的细胞可以代谢非葡萄糖或其它单糖己糖类的糖类，特别是戊糖类，包括木糖和L-阿拉伯糖这样的非限制性实例。

本发明的负Grabtree效应细胞优选自假丝酵母属菌株C.sonorensis、C.methanosorbosa、迪丹氏假丝酵母、近平滑假丝酵母、C naeodendra、克鲁斯氏加丝酵母、布蓝克氏加丝酵母和C.entomophila。在优选的实施方案中，所述细胞是C.sonorensis和C.methanosorbosa细胞。

用于分离由本发明细胞产生的有机产物的方法在本领域中是众所周知的。特别地，Eyal等(International Patent Application，Publication No.WO99/19290，1999年4月22日公开)公开了从发酵混合物、包括低pH发酵混合物中分离乳酸的方法。这类分离乳酸的方法包括提取、吸附、蒸馏/汽化、通过膜分离、结晶和相分裂(phase splitting)。(另外，参见：Vickroy，1985，Comprehensive Biotechnology.(Moo-Young，ed.)，Volume 3，Chapter 38Pergamon Press，Oxford；Datta等，1995，FEMS Microbiol.Rev.16：221-231；美国专利US 4,771,001；美国专利US 5,132,456；美国专利US 5,510,526；和美国专利US 5,420,304)。

发酵条件

各种发酵方法可以用于本发明的不同方面。(例如，参见Wolf，1996，Nonconventional Yeasts in Biotechnology，Springer-Verlag Berlin，；和Walker，2000，Yeast Physiology and Biotechnology，John Wiley&Sons，England)。本领域技术人员认为发酵条件可以改变以改善发酵的各个方面，包括产率(product yield)、培养物生产能力(culture productivity)和培养物卫生(culturehealth)(等)，这取决于具体的宿主生物体和所需产物。特别有利的是使用假丝酵母属在调节发酵条件上的有利特性。因此，在加工的不同阶段中pH可以具有约2.5-约9.0的范围。氧水平可以在约0％-约100％(相对于在空气中发现的氧含量而言)之间变化，正如在培养基以上的空气中所测定的或在培养基中溶解的。可以通过任意常用方法测定或计算氧水平，包括分压、O₂电极、体积/体积、或气体流速(VVM)。温度范围可以在约环境温度(23℃)-约40℃和40℃以上(例如约达45℃)。

优选的发酵条件包括将pH范围维持在约4-约5。在生物质(biomass)生产过程和乳酸生产过程中特别优选将pH维持在约5。优选在整个发酵过程中通过自动添加碱、例如Ca(OH)₂来维持该pH。优选将生物质生产过程中的温度维持在约35℃。优选在需氧条件下生产生物质，其中优选搅拌培养基并提供气流，直到获得用于乳酸生产的足量细胞质量为止。在乳酸的生产过程中，优选使搅拌速率和气流与在生物质生产过程中相比减慢。

在上述具体的优选条件下在葡萄糖培养基上进行三种不同发酵罐培养，得到下列数据。

总产率和生产能力                                          生产能力

菌株批号       CDW   pH^*    碱       LA    Glu      产率  时间/h  g/l/h  g/g-细胞/h

              (g/l)                  g/L   (最终)  (％)

602C40/288-34  5,1   5      Ca(OH)₂  73    0       81     34      2,15  0,42

802C40/288-34  5     5/4    Ca(OH)₂  49    3       70     90      0,54  0,11

902C40/288-34        4/4    Ca(OH)₂

^*生物质生产过程中的pH/乳酸生产过程中的pH

乳酸生产阶段中的产率和生产能力                                                生产能力

菌株批号      CDW     pH      Glu     Glu     LA      LA      时间    产率    g/l/h  g/g-细

              (g/l)           (开始)  (最终)  (开始)  (最终)  /h      (％)           胞/h

602C40/288-34 5,1    5         63     0       12,5    73     21,5    96     2,81  0,55

802C40/288-34 5      4         58     3       2       49     77      87     0,61  0,12

902C40/288-34        4

下列实施例用于解释本发明的一些实施方案而不限定其范围或实质。

实施例

实施例1：G418抗性载体和G418在选择C.sonorensis转化体中的应用

如下制备对转化的酵母细胞提供G418抗性的载体，它们允许选择包括编码用于合成有机产物的蛋白质的核酸构建体的酵母细胞转化体。克隆G418抗性标记，使之受C.sonorensis PGK1或TDH1启动子的转录控制，并将这些构建体分别命名为pMI268(图2)和pMI269(图3)。在两种情况中均使用啤酒糖酵母GAL10终止子。

用Dynazyme EXT聚合物(Finnzymes，Espoo，Finland)以及具有如下序列的寡核苷酸对，通过聚合酶链反应(PCR)扩增G418抗性基因：CTAGTCTAGAACA ATG AGC CAT ATT CAA CGG GAA ACG(G4185′；SEQ ID NO：1)和CGC GGATCC GAA TTC TTA GAA AAA CTC ATC GAG CAT CAAATG(G4183′；SEQ ID NO：2)。将质粒pPIC9K(获自Invitrogen)用作模板。通过开始在95℃将该反应混合物保温5分钟、随后进行95℃45秒、55℃45秒和72℃2分钟组成的29个循环以及最终在72℃保温5分钟来进行PCR。用限制酶BamHI和XbaI消化PCR产物并分离800bp片段。使该片段与pNC101(获自NREL的Eric Jarvis)的4226bp BamHI-XbaI片段连接。使用标准克隆技术(例如，参见Sambrook等，文献同上)由磷酸甘油酸激酶启动子(pPGK)和来自啤酒糖酵母的GAL10终止子序列构建质粒pNC101。该质粒中还含有插入在XbaI与EcoRI位点之间的耐热克鲁维氏酵母(K.thermotolerans)LDH基因，上述两位点，以及BamHI位点都包含在酵母启动子与终止子序列之间的多接头区中。该质粒允许在所述酵母启动子和终止子控制下表达各种基因或选择标记。

从这些操作得到的质粒在啤酒糖酵母PGK1启动子与啤酒糖酵母GAL10终止子之间含有G418抗性基因，该质粒被命名为pMI260，其质粒结构见图1。

使用Dynazyme EXT聚合酶与具有如下序列的寡核苷酸引物对，经PCR扩增C.sonorensis的600bp TDH1启动子：GCG ATC TCG AGA AAA TGTTAT TAT AAC ACT ACA C(5441；SEQ ID NO：3)和CTAGTCTAGATT TGTTTG ATT TGT TTG TTT TGT TTT TGT TTG(Cs1；SEQID NO：4)，其中将pMI238用作模板(参见上文″载体和宿主细胞″部分；见图6)。通过开始在95℃将该反应混合物保温5分钟、随后进行95℃45秒、55℃45秒和72℃2分钟组成的29个循环以及最终在72℃保温5分钟来进行PCR。用克列诺(klenow)聚合酶和4种dNTPs中的每一种使该PCR产物钝端化，然后用限制酶XbaI消化。使所得600bp片段与pMI260的4216 bp PstI(用T4聚合酶使其钝端化)-XbaI片段连接。所得质粒含有与C.sonorensis TDH1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子可操作连接的G418抗性基因，将该质粒命名为pMI269，其结构见图3。

使用Dynazyme EXT聚合酶与具有如下序列的寡核苷酸引物对，经PCR扩增1500bp的C.sonorensis PGK1启动子：GCGATC TCGAGAAAGAAACGA CCC ATC CAA GTG ATG(5423；SEQ ID NO：5)和CTAGTC TAG ATGTAT ATA GTC TTT TCT ATT ATT AG(Cs2；SEQ ID NO：6)，其中将pMI234用作模板(参见上文″载体和宿主细胞″部分；图5)。通过开始在95℃将该反应混合物保温5分钟、随后进行95℃45秒、55℃45秒和72℃10分钟组成的29个循环以及最终在72℃保温10分钟来进行PCR。用克列诺聚合酶和4种dNTPs中的每一种使该PCR产物钝端化，然后用限制酶XbaI消化。使1500bpPGK1启动子片段与pMI260的4216bp PstI(用T4聚合酶使其钝端化)-XbaI片段连接。所得质粒含有可操作地与C.sonorensis PGK1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子连接的G418抗性基因，将该质粒命名为pMI268，其结构见图2。

用限制酶SalI和NotI消化两种构建体pMI268和pMI269并使用Gietz等的化学方法用其转化C.sonorensis(1992，Nucleic Acids Res.20：1425)。这种转化技术在这些实施例的全过程中使用，简述如下。

通过离心收集来自生长至OD₆₀₀为0.8-1.5的C.sonorensis过夜培养物的细胞并首先用过量的10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)溶液洗涤，随后用过量的100mM乙酸锂(LiAc)、10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)的溶液洗涤，然后将其重悬于2mL 100mM LiAc、10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)的溶液中。将细胞与约10μg的转化DNA和300μl的40％PEG4000、100mM LiAc、10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)的溶液混合(约50μL的2mL混悬液)。将细胞在30℃保温30分钟，同时进行缓慢振荡。加入二甲亚砜(DMSO；40μL)并将细胞在42℃的水浴中保温15分钟。通过离心收集细胞、用过量的10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)的溶液洗涤、重新悬浮在YPD培养基(含有10g/L酵母提取物、20g/L胨和20g/L葡萄糖)中并在30℃保温3-7小时。可以任选使YPD保温持续过夜。

在进行选择前，将细胞在液体YPD中至少保温3小时或保温过夜。使转化体生长在补充了浓度为100μg/mL或200μg/mL的G418抗生素的YPD琼脂平板(含有10g/L酵母提取物、20g/L胨、20g/L葡萄糖和2％琼脂)上。将该平板在30℃保温2-5天，然后在新制的选择平板上给转化体重新划线。对从G418抗性菌落中分离的总DNA进行的Southern分析显示，已将G418抗性基因整合入了转化体的基因组。

这些结果证实，G418抗性基因可以由如本文所述制备的构建体表达，它适于对C.sonorensis转化进行选择。

实施例2：潮霉素抗性(hgh)载体和潮霉素B在选择C.sonorensis转化体中的应用

如下制备对转化的酵母细胞提供潮霉素抗性的载体，它们允许选择包括编码用于合成有机产物的蛋白质的重组核酸构建体的酵母细胞转化体。克隆潮霉素抗性标记(大肠杆菌hph)，它在C.sonorensis PGK1或TDH1启动子的转录控制下，将这些构建体分别命名为pMI270(图4)和pMI271。在两种情况中均使用啤酒糖酵母GAL10终止子。

提供潮霉素B抗性的大肠杆菌hph基因获自质粒pRLMex30(Mach等1994，Curr.Genet.25，567-570)。用限制酶NsiI使pRLMex30线性化并用T4DNA聚合酶使其钝端化，然后用XbaI消化。

用EcoRI消化实施例1中制备的pMI268质粒并用克列诺聚合酶和4种dNTPs中的每一种使其钝端化，然后用XbaI消化。使所得4900bp片段与来自pRLMex30的1035 bphph片段连接。这种连接产生一种质粒，它含有可操作地与C.sonorensis PGK1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子连接的潮霉素抗性基因，将该质粒命名为pMI270，其结构见图4。

用EcoRI消化实施例1中制备的pMI269质粒并用克列诺聚合酶和4种dNTPs中的每一种使其钝端化，然后用XbaI消化。使所得4000bp片段与来自pRLMex30的1035 bphph片段连接。这种连接产生一种质粒，它含有可操作地与C.sonorensis TDH1启动子和啤酒糖酵母GAL10终止子连接的潮霉素抗性基因。将该质粒命名为pMI271，其结构见图7。

使用如上述实施例1中所述Gietz等的化学方法(1992，Nucleic Acids Res.20：1425)转化酵母细胞。用限制酶XhoI和NotI消化两种构建体pMI270和pMI271。在30℃的YPD中将该转化混合物保温3小时，此后将其铺在选择平板上。使转化体在30℃的补充了浓度为150-300μg/mL潮霉素B(Calbiochem)的YPD琼脂平板上生长2-5天。在新制的选择平板上给转化体重新划线。通过使用具有如下序列的寡核苷酸引物对的PCR验证潮霉素抗性转化体基因组中转化DNA的存在：CCGGACTA GTT GGT ACA GAGAAC TTGTAA ACA ATT CGG(ScerGallOt；SEQ ID NO：7)和TAT AAA TACTTA TCA TTT CCTCC (5436；SEQ ID NO：8)。通过开始将该反应混合物在94℃保温3分钟、随后是由94℃45秒、55℃45秒、72℃2分钟从组成的29个循环和最终在72℃保温10分钟来进行PCR。

这些结果证实，大肠杆菌hph基因可以使用本文所述的构建体表达、它在C.sonorensis中起作用，可以将潮霉素B用于选择C.sonorensis转化体。

实施例3：用于表达瑞士乳杆菌LDH并将转化的DNA靶向整合入PDC1基因座的载体。

如下制备包含可以被靶向整合入C.sonorensis PDC1基因座的瑞士乳杆菌LDH基因的载体。pMI246载体含有MEL5表达盒和瑞士乳杆菌LDH表达盒，以图式表示在图8中(参见上文″载体和宿主细胞″部分)。为了构建能够使靶向整合进入C.sonorensis PDC1基因座并取代PDC1蛋白编码区的载体，将对应于紧靠PDC 1蛋白-编码区上游和下游序列的DNA片段加入到pMI246中。

用Dynazyme EXT聚合酶(Finnzymes，Espoo，Finland)与具有如下序列的寡核苷酸引物进行PCR来扩增PDC1终止子：GGG ACT AGT GGA TCC TTGAAG TGA GTC AGC CAT AAG GAC TTA AATTCACC(Cs7；SEQ ID NO：9)和AAGGCCT TGT CGA CGC GGC CGC TTG GTT AGA AAA GGT TGTGCC AAT TTA GCC(Cs8；SEQ ID NO：10)，其中将C.sonorensis基因组DNA用作模板。通过开始将该反应混合物在95℃保温5分钟、随后是由95℃45秒、55℃45秒、72℃2分钟组成的29个循环和最终在72℃保温10分钟来进行PCR。用限制酶BamHI和NotI消化920bp PCR产物片段，纯化920bp片段，与来自pMI246的8900bp BamHI-NotI片段连接。将所得质粒命名为pMI256并将其以图式表示在图18中。

使用具有如下序列的寡核苷酸引物对从C.sonorensis中扩增PDC1启动子：GGG ACG GGC CCG CGG CCG CTA CAA GTG ATT CAT TCA TTCACT(Cs5；SEQID NO：11)和CCC TGG GCC CCT CGA GGA TGA TTT AGCAAG AAT AAA TTA AAA TGG(Cs6；SEQ ID NO：12)，其中将C.sonorensis基因组DNA用作模板。通过开始将该反应混合物在95℃保温5分钟、随后是由95℃45秒、55℃45秒、72℃2分钟组成的29个循环和最终在72℃保温10分钟来进行PCR。用ApaI消化PCR产物片段，纯化800bp片段，与9760bp ApaI线性化pMI256(参见上文″载体和宿主细胞″部分；图18)连接。将所得质粒命名为pMI257并将其以图式表示在图10中。pMI257依次含有C.sonorensis PDC1启动子、可操作地与啤酒糖酵母MEL5基因连接的C.sonorensis PGK1启动子、可操作地与瑞士乳杆菌LDH连接的C.sonorensisPGK1启动子、啤酒糖酵母CYC1终止子、后面是C.sonorensis PDC1终止子。

用NotI消化pMI257以便切除含有MEL5和LDH表达盒，侧翼为PDC15′和3′区的7300bp片段。按照实施例1的方法将该7300bp片段用于转化C.sonorensis并基于MEL5标记的表达筛选转化体。使转化体生长在补充了浓度为40μg/mL的α-半乳糖苷酶显色底物、即5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃半乳糖苷(X-α-gal；ICN Biochemicals)的YPD琼脂平板上。将该平板在30℃保温1-3天，然后转至4℃。在有X-α-gal存在的情况下，用功能性MEL5表达盒转化的酵母菌落变成蓝色，而未转化的菌落为白色。通过在新制的指示平板上给蓝色菌落重新划线来纯化它们。用经过NotI消化的pMI257转化C.sonorensis，将所得转化体命名为257-1-257-15、257-41、257-42和257-45。

使用C.sonorensis PDC1探针对分离自pMI257转化体的基因组DNA进行Southern印迹分析，以鉴定出转化体，它们已经发生了由转化的pMI257DNA对PDC1可读框的预期取代。在转化体257-3、257-9、257-12、257-15和257-41中没有PDC1杂交带，表明PDC1基因已缺失。其它pMI257转化体和C.sonorensis在PDC1杂交过程中产生了阳性信号。与瑞士乳杆菌LDH探针杂交表明在pdcl缺失体中存在LDH基因的一个拷贝。转化体257-6、257-7和257-8中含有随机整合入所述基因组的瑞士乳杆菌LDH的两个拷贝。其它pMI257转化体含有随机整合入基因组的一个LDH拷贝。

这些结果证实，转化的pMI257DNA靶向整合入PDC1基因座这一过程通过在PDC1启动子与终止子序列之间的同源重组而发生。这些结果还证实PDC1在C.sonorensis中是单拷贝基因。此外，在PDC1基因座外也发生整合。在一些转化体中，LDH基因以一个以上的拷贝整合入基因组。

实施例4：用于表达巨大芽孢杆菌LDH并将转化的DNA靶向整合入PDC1基因座的载体

如下制备包括靶向整合入C.sonorensis PDC1基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的载体。在这些载体中，用巨大芽孢杆菌LDH取代pMI257中的瑞士乳杆菌LDH。

用NcoI使pMI257线性化并用DNA聚合物I、克列诺片段及dATP、dCTP、和dTTP的混合物对5′突出端进行部分填补，而在该反应中不使用dGTP。此后通过用绿豆核酸酶处理而除去单链延伸。然后用BamHI消化DNA并在电泳分离后从0.8％琼脂糖凝胶上分离9200bp片段。由巨大芽孢杆菌基因组DNA生成含有巨大芽孢杆菌LDH的载体pVR24，见图21。通过使用根据寄存号M22305设计的引物进行的PCR，由基因组DNA克隆出LDH基因并将其连入商购载体(参见上文″载体和宿主细胞″部分)。通过XbaI消化从pVR24上切下含有巨大芽孢杆菌LDH的976bp片段、随后用DNA聚合酶I、克列诺片段和4种dNTPs中的每一种补平5′突出端，用BamHI消化。连接来自pMI257的9200 bp NcoI(钝端化)-BamHI片段和来自pVR24的976 bp XbaI(钝端化)-BamHI片段并将所得质粒命名为pMI265，见图11。pMI265依次含有C.sonorensis PDC1启动子、可操作地与啤酒糖酵母MEL5基因连接的C.sonorensis PGK1启动子、可操作地与巨大芽孢杆菌LDH连接的C.sonorensis PGK1启动子和C.sonorensis PDC 1终止子。用NotI消化pMI265以切除由MEL5和LDH表达盒及其侧翼的PDC15′和3′区组成的7300bp片段。如实施例1中所述将该7300bp片段用于转化C.sonorensis并在补充了浓度为40μg/mL的X-α-gal的YPD平板上筛选转化体。使这些转化体生长在补充了X-α-gal(40μg/mL)的YPD琼脂平板上。用经过NotI-消化的pMI265转化C.sonorensis，所得转化体命名为265-1-265-60。

使用C.sonorensis PDC1探针对分离自pMI265转化体的基因组进行Southern印迹分析，以鉴定出转化体，它们已经发生了由转化的pMI265DNA对PDC1可读框的预期取代。在转化体265-5、265-7、265-15、265-17、265-33、265-34、265-35、265-38、265-39、265-42、265-43、265-47、265-48、265-49、265-51和265-60中没有PDC1杂交带，表明PDC1基因已缺失。其它pMI265转化体和未转化的C.sonorensis产生PDC1杂交的阳性信号。与巨大芽孢杆菌LDH探针的杂交表明在pdcl缺失体中存在LDH基因的一个拷贝。PDC1-杂交阳性(Positively)转化体265-14、265-22和265-23中含有随机整合入基因组的LDH基因的两个拷贝，265-56含有三个拷贝。其它pMI265转化体含有随机整合入基因组的一个LDH拷贝。

这些结果证实，转化的pMI265 DNA靶向整合入PDC1基因座这一过程通过在PDC1启动子与终止子序列之间的同源重组而发生。这些结果还证实，PDC1在C.sonorensis中是单拷贝基因。缺失pdcl的转化体是存活的，表明PDC1在C.sonorensis中并非是必需的基因。除PDC1缺失型整合外，在一些转化体中也发生PDC1基因座外的整合。在一些转化体中，LDH基因以一个以上的拷贝整合入基因组。

实施例5：用于表达米根霉LDH并将转化的DNA靶向整合入PDC1基因座的载体

如下制备包括靶向整合入C.sonorensis PDC1基因座的米根霉LDH基因的载体。在这些载体中，用米根霉LDH取代pMI257中编码瑞士乳杆菌LDH的序列。

用NcoI使上述实施例3的pMI257质粒线性化并用DNA聚合物I、克列诺片段、及dATP、dCTP、和dTTP的混合物对5′突出端进行部分补平，而在该反应中不使用dGTP。此后通过用绿豆核酸酶处理而除去单链延伸。然后用BamHI消化DNA并在电泳分离后从0.8％琼脂糖凝胶上分离9200bp片段。米根霉LDH DNA的编码序列可操作地与C.sonorensis PGK1启动子和C.sonorensis PDC1基因的转录终止子连接。由米根霉基因组DNA生成含有米根霉LDH的载体pVR27，见图22。通过使用根据寄存号M226154设计的引物进行的PCR，由基因组DNA克隆出LDH基因并将其连入商购载体(参见上文″载体和宿主细胞″部分)。通过XbaI消化从pVR27上切下含有米根霉LDH的978bp片段、随后用DNA聚合酶I、克列诺片段和4种dNTPs中的每一种补平5′突出端并用BamHI消化。连接来自pMI257的9200bp NcoI(钝端化)-BamHI片段和来自pVR27的978bp XbaI(钝端化)-BamHI并将所得质粒命名为pMI266，以图式表示在图12中。pMI266中依次含有C.sonorensis PDC1启动子、可操作地与啤酒糖酵母MEL5基因连接的C.sonorensis PGK1启动子、可操作地与米根霉LDH A连接的C.sonorensisPGK1启动子和C.sonorensis PDC1终止子。用NotI消化pMI266以切下由MEL5和LDH表达盒及其侧翼的PDC15′和3′区组成的7300bp片段。按照实施例1的方法将该7300bp片段用于转化C.sonorensis，在补充了浓度为40μg/mL的X-α-gal的YPD平板上筛选转化体。用经过NotI-消化的pMI266转化C.sonorensis，所得转化体命名为266-1-266-13。

使用C.sonorensis PDC1探针对分离自pMI266转化体的基因组DNA进行Southern印迹分析以鉴定转化体，它们已经发生了由转化的pMI266 DNA对PDC1可读框的预期取代。在转化体266-1、266-3、266-4和266-11中没有PDC1杂交带，表明PDC1基因缺失。相反，pMI266转化体266-2、266-7和266-8和未转化的C.sonorensis在PDC1杂交过程中产生阳性信号。与LDH探针杂交表明，在所有转化体中存在米根霉LDH基因的一个拷贝。

这些结果证实，转化的pMI266 DNA靶向整合入PDC1基因座这一过程通过在PDC1启动子与终止子序列之间的同源重组而发生。此外，PDC1基因座外也发生整合。

实施例6：用于在没有LDH的情况下取代PDC1的载体

制备用于在未导入外源性LDH-编码序列的情况下取代PDC1的载体。用NcoI和BamHI消化上述实施例3的pMI257质粒以便除去LDH基因和啤酒糖酵母CYC1终止子。用DNA聚合酶I、克列诺片段和4种dNTPs中的每一种补平5′突出端。在琼脂糖凝胶电泳后纯化出9200bp片段，以40ng/μL的浓度在有400U T4DNA连接酶(New England Biolabs)和由制造商推荐的适宜缓冲液存在的情况下保温，使之重新环化。将所得质粒命名为pMI267，以图式表示在图13中。pMI267中依次含有C.sonorensis PDC1启动子、可操作地与啤酒糖酵母MEL5基因连接的C.sonorensis PGK1启动子和C.sonorensis PDC1终止子。

用NotI消化pMI267以切下6300bp片段，它由MEL5盒及其侧翼的PDC 15′和3′区组成。按照实施例1的方法将该6300bp片段用于转化C.sonorensis并在补充了浓度为40μg/mL的X-α-gal的YPD平板上筛选转化体。用经过NotI-消化的pMI267转化C.sonorensis，所得转化体命名为267-1-267-10。

使用C.sonorensis PDC1探针对分离自pMI267转化体的基因组DNA进行Southern印迹分析以鉴定缺失了PDC1可读框的转化体。在转化体267-1和267-10中没有PDC1杂交带，表明PDC1基因已缺失。

这些结果证实，转化的pMI267 DNA靶向整合入PDC1基因座这一过程通过在PDC1启动子与终止子序列之间的同源重组而发生。LDH表达并不是维持pdcl-缺失菌株的存活力所必需的。此外，PDC1基因座外也发生整合。

实施例7：含有巨大芽孢杆菌LDH基因和G418标记的C.sonorensis载体的构建

如下制备包括G418抗性基因和巨大芽孢杆菌LDH基因的载体。在这些载体中，将来自质粒pMI265的巨大芽孢杆菌LDH表达盒和来自质粒pMI269的G418抗性标记盒合并入同一载体。用EcoRI消化实施例1的pMI269质粒并用DNA聚合酶I、克列诺片段和4种dNTPs中的每一种补平5′突出端，随后用BamHI消化该DNA。使pMI269的4800bp EcoRI(钝端化)-BamHI片段与来自实施例4中所述pMI265质粒的2800bp MscI-BamHI片段连接。将所得质粒命名为pMI278，它依次含有、可操作地与G418抗性基因连接的C.sonorensis TDH1启动子、MEL5终止子、后面是可操作地与巨大芽孢杆菌LDH连接的C.sonorensis PGK1启动子、和啤酒糖酵母GAL10终止子，以图式表示在图14中。

实施例8：同时表达米根霉LDH和巨大芽孢杆菌LDH的C.sonorensis菌株的构建

C.sonorensis转化体266-3已将米根霉LDH整合入pdcl基因座，将其选作宿主，用上述实施例4的巨大芽孢杆菌LDH构建体进行二次转化。转化体266-3用经过SalI-NotI消化的pMI278进一步转化并在补充了浓度为200μg/mL G418抗生素的YPD琼脂平板上选择转化体。将平板在30℃保温2-5天用于选择；通过在新制的选择平板上重新划线来纯化转化体。将所得转化体命名为278-1-278-20。使用巨大芽孢杆菌LDH基因作为探针，对经过HindE消化的酵母DNA进行Southern印迹分析，从而证实其中19个转化体的基因组中存在巨大芽孢杆菌LDH。这些转化体中的一些含有一个以上整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH拷贝。使用米根霉LDH基因作为探针重复Southern印迹分析以便验证还存在米根霉LDH。

本实验证实，可以对C.sonorensis进行多重转化，与不同的标记无关。按照这种方式证实能够在宿主基因组中增加所关注基因(LDH)的拷贝数。

实施例9：用于表达巨大芽孢杆菌LDH并将转化的DNA靶向整合入PDC2基因座的载体

如下制备包括靶向整合入C.sonorensis PDC2基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的载体。使用Dynazyme EXT聚合酶和具有如下序列的寡核苷酸引物对进行PCR，以便扩增C.sonorensis PDC2启动子：GGG ACG GGC CCGCGG CCG CTT ACA GCA GCA AAC AAG TGATGCC(Cs26；SEQ ID NO：13)和CCC TGG GCC CCT CGA GTT TGA TTT ATT TGC TTT GTA AAGAGAA(Cs27；SEQ ID NO：14)。将克隆在λ载体中的C.sonorensis PDC2的基因组拷贝用作模板(参见上文)。通过开始将该反应混合物在94℃保温3分钟、随后是由94℃45秒、55℃45秒、72℃2分钟组成的29个循环和最终在72℃保温10分钟来进行PCR。将1000bp PCR产物克隆入TOPO TA载体(Invitrogen)并将所得质粒命名为pMI277，以图式表示在图19中。通过EcoRI消化释放PDC2启动子并用克列诺聚合酶和4种dNTPs中的每一种使其钝端化。

用SalI使如实施例7中制备的pMI278质粒线性化并用克列诺聚合酶和4种dNTPs中的每一种补平5′突出端，然后与pMI277质粒的1000bp EcoRI(钝端化)连接。将含有处在所需方向的插入片段的该质粒命名为pMI279，以图式表示在图20中。

通过使用Dynazyme EXT聚合酶与具有如下序列的寡核苷酸引物对进行PCR，来扩增PDC2终止子：TGGACTAGTTAGATAG CAA TTC TTA CTTGAA AAA TTA ATT GAA GCA TTACC(Cs29；SEQID NO：15)和GGC CCGCGG CCG CTA AAT ATA ATT ATC GCT TAG TTA TTA AAA TGG(Cs30；SEQID NO：16)，其中将克隆在λ载体中的C.sonorensis PDC2基因组拷贝用作模板。pdc2终止子片段包括相当于239C-末端氨基酸的部分可读框。将翻译终止密码子导入PCR寡核苷酸Cs29中，使之位于与终止子片段中最末239C-末端氨基酸蛋白质对应的核苷酸上游的所有三个读框中。通过开始将该反应混合物在94℃保温3分钟、随后是由94℃45秒、55℃45秒、72℃2分钟组成的29个循环和最终在72℃保温10分钟来进行PCR。用克列诺聚合酶和4种dNTPs中的每一种使PCR产物钝端化，并用Qiaquick柱(Qiagen)纯化。在标准条件下(参见Sambrook等，文献同上)用T4多核苷酸激酶和1mM浓度的rATP使PCR产物磷酸化。在琼脂糖凝胶电泳后纯化800bp PDC2终止子片段并与经过NcoI(钝端化)消化并已用牛小肠磷酸酶脱磷酸化的pMI279连接。将所得质粒命名为pMI286，它依次含有C.sonorensis PDC2启动子、可操作地与G418抗性基因和啤酒糖酵母MEL5终止子连接的C.sonorensis TDH1启动子、可操作地与巨大芽孢杆菌LDH基因连接的C.sonorensis PGK1启动子、啤酒糖酵母GAL10终止子、后面是C.sonorensisPDC2终止子。将该构建体以图式表示在图15中。

用NotI消化pMI286质粒以切下由G418抗性盒和LDH表达盒及其侧翼的PDC25′和3′区组成的6400bp片段。通过实施例1的方法将该6400bp片段用于转化C.sonorensis。使这些转化体生长在补充了浓度为200μg/mL的G418抗生素的YPD琼脂平板上。将该平板在30℃保温2-5天，然后在新制的选择平板上给这些转化体再划线。将这些转化体命名为286-1-286-40。

使用C.sonorensis PDC2探针(对应于缺失区中的核苷酸)对分离自pMI286转化体的基因组DNA进行Southern印迹分析以，以便鉴定出已将巨大芽孢杆菌LDH整合入PDC2基因座的那些转化体。转化体286-1、286-2、286-4、286-19和286-30中没有PDC2杂交带，表明PDC2基因已缺失。其它pMI286转化体和未转化的C.sonorensis在PDC2杂交中产生阳性信号。与巨大芽孢杆菌LDH探针杂交证实在pdc2缺失体中存在LDH的一个拷贝。靶向整合入PDC2基因座的频率为15％。

这些结果证实，转化的pMI286 DNA靶向整合入PDC2基因座的过程通过在PDC2启动子与PDC2终止子序列之间的同源重组而发生。这些结果还证实PDC2在C.sonorensis中是单拷贝基因。此外，PDC2外也发生整合。在一些转化体中，LDH基因以一个以上拷贝整合入基因组。

实施例10：构建pdc1缺失且pdc2中受损的C.sonorensis菌株，其含有两个巨大芽孢杆菌LDH拷贝，它们已经整合到基因组的pdc1与pdc2基因座上

选取已在pdcl基因座上整合了巨大芽孢杆菌LDH的C.sonorensis转化体265-15，作为用巨大芽孢杆菌LDH进行二次转化的宿主。转化体265-15使用上述实施例1的方法用经过NotI消化的pMI286进一步转化并在补充了浓度为200μg/mL的G418抗生素的YPD琼脂平板上选择转化体。将该平板在30℃保温2-5天，所得的转化体通过在新制的选择平板上再划线而纯化。将这些转化体命名为C44/286-1-C44/286-40。

使用PDC2探针(对应于缺失区中的核苷酸)验证pdc2基因的受损情况。转化体C44/286-10、C44/286-26、C44/286-27、C44/286-28、C44/286-29、C44/286-30、C44/286-31、C44/286-32和C44/286-33中没有PDC2杂交带，表明PDC2基因已缺失。使用巨大芽孢杆菌LDH基因作为探针，对经过HindIII消化的酵母DNA进行Southern印迹分析，以此验证在pdc1、pdc2双缺失体的基因组中存在两个巨大芽孢杆菌LDH拷贝。

这些结果证实，转化的pMI286DNA靶向整合入PDC2基因座的过程通过在PDC2启动子与PDC2终止子序列之间的同源重组而发生。这些结果还证实PDC2在C.sonorensis中是单拷贝基因，PDC2外可以发生整合。在一些转化体中，LDH基因以一个以上拷贝整合入基因组。同时发生pdc1缺失和pdc2上受损的转化体都存活。

本实施例还证实，C.sonorensi可以进行多重转化，也可以使用不同标记进行独立地转化。按照这种方式还能够在宿主基因组中增加所关注基因(LDH)的拷贝数。

实施例11：由pdc1-pdc2-菌株生产乙醇

如下检测含有PDC1和/或PDC2基因缺失或受损的假丝酵母属菌株的乙醇生产。使转化体C44/286-10、C44/286-26和C44/286-33以及其它4种对照菌株，在250mL振荡烧瓶中的50mL YP+5％葡萄糖中，以250rpm的振荡速度30℃进行培养。每天取样，离心除去细胞。对于接种后56小时所取的培养物上清样品，用Boehringer Mannheim的乙醇UV法分析乙醇(表1)。这些结果表明，同时缺失了pdc1和pdc2乙醇的转化体的乙醇产量比含有完整PDC1或PDC2基因的菌株的乙醇产量减少了10倍以上。

这些结果证实，PDC1和PDC2均编码功能性丙酮酸脱羧酶，因为只有在同时缺失两种基因时，才观察到乙醇产量显著下降。这些结果还表明，除去约60％的PDC2可读框所导致的PDC2受损消除了PDC2的功能。

表1.C.sonorensis转化体在YP+5％葡萄糖上培养后56小时的乙醇产量

菌株	基因型	乙醇g/L
			C44/286-10	2拷贝BmLDH，pdc1-pdc2-	0.2
C44/286-26	2拷贝BmLDH，pdc1-pdc2-	0.1
			C44/286-33	2拷贝BmLDH，pdc1-pdc2-	0.1
265-15	1拷贝BmLDH，pdc1-	6
			286-1	1拷贝BmLDH，pdc2-	6
286-30	1拷贝BmLDH，pdc2-	3
			265-23	2拷贝BmLDH，PDC+	4

实施例12：用于在没有LDH的情况下破坏PDC2的载体

制备用于在未导入外源性LDH-编码序列的情况下取代PDC2的载体。从实施例9的pMI286质粒中除去作为1276bp SpeI-XbaI片段的巨大芽孢杆菌LDH基因。用SpeI消化pMI286并用XbaI对该线性化分子进行部分消化。在进行凝胶电泳后分离8100bp SpeI-XbaI片段并重新环化。所得称作pMI287的质粒依次由C.sonorensis PDC2启动子、可操作地与G418可以基因和啤酒糖酵母MEL5终止子连接的C.sonorensis TDH1启动子、C.sonorensis PGK1启动子、及后面的C.sonorensis PDC2终止子组成，见图16。

用NotI消化pMI287以便切下由G418表达盒及其侧翼的PDC25′和3′区组成的5100bp片段。按照实施例1的方法用该5100bp片段转化C.sonorensis。使转化体生长在补充了浓度为200μg/mL的G418抗生素的YPD琼脂平板上。将该平板在30℃保温2-5天，然后在新制的选择平板上给这些转化体再划线。

将这些转化体命名为287-1-287-57。使用对应于缺失区中核苷酸的PDC2探针对分离自pMI287转化体的基因组DNA进行Southern印迹分析以便鉴定成功的转化体。在转化体287-6和287-16中没有观察到PDC2杂交带，表明PDC2基因已缺失。

实施例13：用于表达瑞士乳杆菌LDH并将转化的DNA整合入PDC2基因座的载体

为了用编码瑞士乳杆菌LDH的DNA取代pMI286中编码巨大芽孢杆菌LDH的序列，用限制酶SpeI消化实施例9的pMI286并用DNA聚合酶I、克列诺片段和4种dNTPs中的每一种使其钝端化，然后用BspMI消化。图9的质粒pMI247用BamHI消化并用DNA聚合酶I、克列诺片段和4种dNTPs中的每一种使其钝端化，然后用BspMI消化。连接pMI286的6800bp SpeI(钝端化)-BspMI片段和pMI247的2700bp BamHI(钝端化)-BspMI片段。所得称作pMI288的质粒依次由C.sonorensis PDC2启动子、可操作地与G418抗性基因和啤酒糖酵母MEL5终止子连接的C.sonorensis TDH1启动子、可操作地与瑞士乳杆菌LDH基因和啤酒糖酵母CYC1终止子连接的C.sonorensisPGK1启动子、及后面的PDC2终止子组成，以图式表示在图17中。

用NotI消化pMI288以便切下由G418抗性和LDH表达盒及其侧翼的PDC25′和3′区组成的6400bp片段。C.sonorensis转化体257-3含有整合在pdc1基因座的瑞士乳杆菌LDH，用该转化体作为瑞士乳杆菌LDH二次转化的宿主。转化体257-3用pMI288的6400bp NotI片段按照实施例1的方法进一步转化。在补充了浓度为200μg/mL的G418抗生素的YPD琼脂平板上选择转化体。将该平板在30℃保温2-5天，所得转化体通过在新制的选择平板上再划线来纯化。将这些转化体命名为C40/288-1-C40/288-40。

使用对应于基因座中缺失区核苷酸的PDC2探针验证pdc2基因的受损情况。转化体C40/288-2、C40/288-11、C40/288-29、C40/288-34和C40/288-38中没有PDC2杂交带，表明PDC2基因已缺失。使用瑞士乳杆菌LDH基因作为探针，对经过HindIII消化的酵母DNA进行Southern印迹分析，以此证实pdc1、pdc2双缺失体的基因组中存在两个瑞士乳杆菌LDH拷贝。

这些结果证实，外源LDH确实已经靶向整合到C.sonorensis PDC2基因座中，，产生了含有受损的PDC2基因座的细胞。

实施例14：用含有整合入基因组的瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌LDH基因的C.sonorensis在需氧试管培养物的限定(defined)葡萄糖或富含葡萄糖的培养基上产生L-乳酸

在YPD培养基(补充了5％葡萄糖和0.5M MES的YP，pH 5.5)或YD培养基(不含氨基酸的补充了2％葡萄糖和0.5M MES的酵母氮基质，pH 5.5)上培养上述实施例中公开的C.sonorensis细胞和转化体(即246-27、247-11、265-03、265-05、265-06、265-07、265-11、265-12、265-14、265-15、265-17、265-18、265-22、265-23、265-29、265-33、265-34、265-35、265-38、265-39、265-42、265-43、265-44、265-45、265-46、265-47、265-48、265-49、265-51、265-52、265-55、265-56、265-57和265-60)。将来自每一种转化体的两个独立的菌落接种入含有5mL YPD或YD培养基的14mL一次性塑料试管内，在30℃以250rpm振荡培养。培养期间取样、测定OD₆₀₀，离心除去细胞，通过HPLC分析培养上清中的乳酸、葡萄糖和乙醇。使用Waters 510 HPLC泵，Waters 717+自动取样器和Water System Interfase Module液相色谱仪以及折光率检测器(Waters 410差示折光计)和UV--检测器(Waters 2487双λUV检测器)进行HPLC分析。使用Aminex HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm，Bio-Rad)，该柱用5mM H₂SO₄水溶液35℃平衡，样品用5mM H₂SO₄水溶液以0.6mL/分钟的流速洗脱。使用Waters Millennium软件进行数据采集和控制。由两份独立样品求平均值。这些结果见表2和3。

在确定成分培养基上培养13小时后，含有瑞士乳杆菌LDH基因的转化体246-27和247-11产生了0.1-0.4g/L乳酸；19小时后产生了1.8-3.9g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养13小时后，在基因组未知位点上整合了一个巨大芽孢杆菌LDH基因拷贝的转化体265-03、265-06、265-11、265-12、265-18、265-29、265-44、265-45、265-46、265-52、265-55和265-57产生了0.5-1.9g/L乳酸；19小时后产生了4.0-6.3g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养13小时后，在基因组未知位点上整合了两个巨大芽孢杆菌LDH基因拷贝的转化体265-14、265-22和265-23产生了0.5-1.2g/L乳酸；19小时后产生了3.8-6.1g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养13小时后，含有三个巨大芽孢杆菌LDH基因拷贝的转化体265-56产生了0.7g/L乳酸；19小时后产生了5.2g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养13小时后，含有整合入pdc1基因座(pdc1-基因型)的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体265-05、265-07、265-15、265-17、265-33、265-34、265-35、265-38、265-39、265-42、265-43、265-47、265-48、 265-49、265-51和265-60产生了0.4-2.7g/L乳酸；19小时后产生了3.4-7.5g/L乳酸。

在丰富培养基上培养12小时后，含有瑞士乳杆菌LDH基因的转化体246-27和247-11产生了0.5-1.7g/L乳酸，在17小时后产生了3.7-6.1g/L乳酸。与之相比，宿主菌株在17小时培养后产生了0.1g/L乳酸。

在丰富培养基上培养12小时后，含有巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体265-03、265-06、265-11、265-12、265-18、265-29、265-44、265-45、265-46、265-52、265-55和265-57产生了1.4-4.3g/L乳酸，在17小时后产生了7.2-9.8g/L乳酸。

在丰富培养基上培养12小时后，含有两个巨大芽孢杆菌LDH基因拷贝的转化体265-14、265-22和265-23产生了2.1-1.9g/L乳酸，在17小时后产生了6.3-6.8g/L乳酸。

在丰富培养基上培养12小时后，含有三个拷贝巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体265-56产生了2.6g/L乳酸，在17小时后产生了7.5g/L乳酸。

在丰富培养基上培养12小时后，含有整合入pdc1基因座(pdc1-基因型)的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体265-05、265-07、265-15、265-17、265-33、265-34、265-35、265-38、265-39、265-42、265-43、265-47、265-48、265-49、265-51和265-60产生了2.0-4.7g/L乳酸，17小时后产生了7.1-10.7g/L乳酸。

这些结果证实，当宿主菌株不产乳酸时，LDH转化体产生乳酸。经证实巨大芽孢杆菌和瑞士乳杆菌LDH在C.sonorensis中具有活性。这些异源LDH由此可以在有PDC存在的情况下有效竞争丙酮酸。看起来pdc1缺失对乳酸的总产率和产量没有影响。在含有两个(265-14、265-22、265-23)或三个(265-56)拷贝的转化体中残余的葡萄糖浓度较高，而乙醇浓度较低。较高的LDH拷贝数也导致从葡萄糖产生更多的乳酸、产生更少的乙醇，且乳酸相对于乙醇的比例较高。生物质(OD₆₀₀)在含有一个以上巨大芽孢杆菌LDH拷贝的菌株中增加得较少。

表2.C.sonorensis和LDH转化体在确定成分培养基上的OD₆₀₀、残余的葡萄糖、乳酸和乙醇产量

菌株

OD<sub>600</sub>13h

OD<sub>600</sub>19h

葡萄糖13h

葡萄糖19h

乳酸13h

乳酸19h

乙醇13h

乙醇19h

菌株	OD<sub>600</sub>13h	OD<sub>600</sub>19h	葡萄糖13h	葡萄糖19h	乳酸13h	乳酸19h	乙醇13h	乙醇19h
									C.sonorensis	1.87	7.54	16.24	5.53	0.00	0.00	0.83	4.08
246-27	1.04	6.33	18.66	8.06	0.40	3.93	0.06	1.70
									247-11	0.43	4.08	19.91	14.26	0.08	1.78	0.00	0.73
265-03	2.45	7.45	15.54	3.17	1.22	6.01	0.60	2.97
									265-06	2.93	7.22	15.69	3.18	1.34	6.02	0.52	2.94
265-11	2.66	7.48	15.63	3.24	1.33	6.09	0.48	2.87
									265-12	3.58	7.04	17.28	5.60	0.86	4.96	0.27	2.37
265-18	2.03	6.82	18.15	7.66	0.56	4.00	024	2.22
									265-44	2.52	7.52	17.74	5.65	0.86	4.86	0.22	2.38
265-45	2.04	5.20	18.96	7.85	0.53	4.07	0.11	1.89
									265-46	2.96	6.96	16.05	2.65	1.23	6.06	0.55	3.05
265-52	1.94	7.11	18.54	7.32	0.59	4.18	0.23	1.99
									265-55	3.22	7.67	15.71	2.86	1.63	6.28	0.64	2.86
265-57	2.03	7.12	18.37	7.58	0.66	3.96	0.28	2.01
									265-29	3.27	7.11	14.59	2.78	1.93	6.30	0.71	2.85
265-14	1.65	5.84	19.05	10.42	0.45	3.75	0.05	1.06
									265-22	1.94	6.33	18.33	8.10	0.67	5.10	0.11	1.37
265-23	2.52	6.76	16.95	6.01	1.23	6.14	0.23	1.62
									265-56	1.86	5.81	19.14	10.26	0.65	5.22	0.00	0.56
265-05	2.19	7.01	16.38	4.95	0.99	4.80	0.46	2.59
									265-07	2.54	7.25	16.35	4.35	1.18	5.32	0.43	2.78
265-15	2.82	7.47	15.63	3.09	1.38	5.70	0.62	3.09
									265-17	1.79	6.41	18.88	8.66	0.39	3.50	0.06	1.86
265-33	3.85	7.89	13.67	1.74	2.17	6.53	0.96	3.55
									265-34	3.96	7.85	12.52	0.15	2.74	7.50	1.19	3.51
265-35	2.71	7.58	16.89	4.82	0.98	4.84	0.36	2.68
									265-38	2.66	8.20	17.01	4.56	1.02	5.25	0.36	2.80
265-39	2.38	7.71	17.57	5.76	0.73	4.63	0.28	2.45
									265-42	2.64	7.50	17.28	5.34	0.97	4.98	0.35	2.44
265-43	1.81	6.79	18.86	8.94	0.51	3.44	0.11	1.78
									265-47	2.71	7.41	17.09	4.30	0.99	5.18	0.38	2.68
265-48	2.90	7.66	16.66	3.86	1.14	5.47	0.45	2.81
									265-49	2.73	7.42	16.57	4.07	1.18	5.26	0.41	2.67
265-51	2.71	7.66	16.91	4.06	1.14	5.35	0.37	2.71
									265-60	2.41	7.71	17.50	5.54	0.85	4.63	0.35	2.48

以g/L计的葡萄糖、乳酸和乙醇浓度

表3.C.sonorensis和LDH转化体在丰富培养基上的OD₆₀₀、残余的葡萄糖、乳酸和乙醇产量

菌株	OD<sub>600</sub>12h	OD<sub>600</sub>17h	葡萄糖12h	葡萄糖17h	乳酸12h	乳酸17h	乙醇12h	乙醇17h
									C.sonorensis	3.78	13.28	41.37	22.86	0.00	0.09	1.90	10.05
246-27	3.10	7.33	43.81	32.49	1.68	6.12	0.63	3.27
									247-11	2.13	5.60	46.38	38.36	0.52	3.70	0.11	2.18
265-03	3.63	8.53	41.70	28.49	2.07	7.29	0.95	4.53
									265-06	4.13	9.25	41.76	26.30	2.75	7.99	1.32	5.28
265-11	4.08	9.15	42.47	28.34	2.27	7.39	0.98	4.97
									265-12	4.55	9.98	40.67	25.05	2.81	8.66	1.55	5.40
265-18	4.73	10.38	40.85	23.97	2.61	8.45	1.53	5.72
									265-44	5.35	10.30	40.09	23.76	3.60	9.20	1.82	6.00
265-45	4.68	9.90	41.41	26.30	2.55	8.31	1.37	5.88
									265-46	4.43	10.05	41.66	27.31	2.33	7.64	1.26	5.13
265-52	4.10	9.38	43.35	29.35	2.48	7.24	1.01	4.53
									265-55	4.80	9.30	41.63	29.37	2.92	8.26	1.13	4.67
265-57	6.28	11.25	38.24	21.19	4.30	9.79	2.25	6.83
									265-29	5.20	9.80	20.87	23.78	3.67	9.27	1.69	5.90
265-14	3.25	6.70	44.57	34.95	1.57	6.79	0.33	2.25
									265-22	3.25	6.75	44.27	34.50	1.49	6.31	0.31	2.38
265-23	3.15	6.73	41.97	33.79	1.89	6.80	0.42	2.27
									265-56	4.25	8.18	44.51	33.82	2.57	7.45	0.58	2.57
265-05	4.75	10.85	39.74	23.43	3.02	8.50	1.73	6.21
									265-07	4.15	10.05	41.68	26.04	2.26	7.86	1.36	5.46
265-15	5.05	9.98	39.47	22.92	2.77	8.83	1.84	6.56
									265-17	4.53	10.10	40.66	24.61	2.75	7.76	1.38	5.87
265-33	4.63	10.28	41.42	24.33	2.42	8.01	1.40	5.94
									265-34	5.00	9.93	39.60	24.99	3.09	8.63	1.75	5.44
265-35	5.73	11.33	36.08	19.29	4.74	10.66	2.94	7.24
									265-38	4.98	10.45	40.58	25.53	2.64	7.99	1.42	5.65
265-39	4.33	10.45	41.49	27.30	2.41	7.79	1.24	5.08
									265-42	6.08	11.15	37.74	21.15	4.37	9.68	2.32	6.79
265-43	4.23	9.60	41.10	29.83	2.02	7.20	0.90	4.61
									265-47	4.08	9.43	42.66	28.06	2.32	7.40	1.18	5.12
265-48	4.43	10.23	42.48	27.89	2.28	7.10	1.27	5.00

菌株	OD<sub>600</sub>12h	OD<sub>600</sub>17h	葡萄糖12h	葡萄糖17h	乳酸12h	乳酸17h	乙醇12h	乙醇17h
									265-49	5.20	10.20	39.29	25.17	3.18	8.55	1.86	5.94
265-51	4.48	10.15	42.28	26.89	2.34	7.72	1.30	5.60
									265-60	4.38	9.45	42.56	28.13	2.41	7.66	1.13	5.11

以g/L计的葡萄糖、乳酸和乙醇浓度

实施例15：含有整合入基因组的瑞士乳杆菌、巨大芽孢杆菌或米根霉LDH基因的C.sonorensis在需氧试管培养物的确定成分或丰富葡萄糖培养基上产生L-乳酸

在YPD(补充了5％葡萄糖和0.5M MES的YP，pH 5.5)或YD培养基(不含氨基酸的补充了2％葡萄糖和0.5M MES的酵母氮基质，pH 5.5)上培养上述公开的C.sonorensis细胞和转化体(即246-27、247-11、265-39、265-5、265-15、265-44、266-1、266-2、266-4、266-6、266-7、266-8、266-11、278-2、278-3、278-4、278-6、278-7、278-8、278-9、278-11、278-12、278-13、278-14、278-15、278-17、278-18、278-19、278-20、257-3、257-5、257-6、257-8、257-8、257-9、257-10、257-11和257-12)。将来自每一种转化体的两个独立的菌落接种入含有5mL YPD或YD培养基的14mL一次性塑料试管内，在30℃以250rpm振荡培养。在培养过程中的12和17小时时取样，测定OD₆₀₀，离心收集细胞，如上所述通过HPLC分析培养上清中的乳酸、葡萄糖和乙醇。如上述实施例14中具体所述进行HPLC分析。这些结果见表4和5。

在确定成分培养基上培养12小时后，含有瑞士乳杆菌LDH基因的转化体产生了0.1-0.7g/L乳酸。这些细胞在丰富培养基上产生了0.9-2.7g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养12小时后，含有巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体产生了0.1-0.5g/L乳酸。这些细胞在丰富培养基上产生了1.9-3.2g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养12小时后，含有米根霉LDH基因的转化体产生了0.2-0.6g/L乳酸。这些细胞在丰富培养基上产生了0.9-2.7g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养12小时后，含有整合入pdc1基因座的米根霉LDH基因并含有巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体产生了0.1-0.9g/L乳酸。这些细胞在丰富培养基上产生了1.0-3.3g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养17小时后，含有瑞士乳杆菌LDH基因的转化体产生了0.9-2.1g/L乳酸。这些细胞在丰富培养基上产生了6.6-9.9g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养17小时后，含有巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体产生了0.8-1.7g/L乳酸。这些细胞在丰富培养基上产生了8.7-11.0g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养17小时后，含有米根霉LDH基因的转化体产生了0.7-1.3g/L乳酸。这些细胞在丰富培养基上产生了7.3-9.5g/L乳酸。

在确定成分培养基上培养17小时后，含有整合入pdc1基因座的米根霉LDH基因并含有巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体产生了0.7-3.0g/L乳酸。这些细胞在丰富培养基上产生了5.0-10.7g/L乳酸。

这些结果证实，所有三种异源LDH在C.sonorensis中具有活性，可以用于生产乳酸。这些LDH可以在有PDC存在的情况下有效竞争丙酮酸。这些LDH基因中任一个的表达减少了葡萄糖利用率、生长和乙醇产量，尤其在丰富培养基中更是如此。葡萄糖利用率和生长的下降在含有瑞士乳杆菌LDH的菌株中最为剧烈，在含有米根霉LDH的菌株中最为适度，而巨大芽孢杆菌LDH转化体表现出居间特性(intermediate behavior)。在含有两种来源的LDH的转化体中巨大芽孢杆菌LDH的存在掩盖了这些作用。

表4.C.sonorensis和LDH转化体在确定成分培养基上的OD₆₀₀、残余的葡萄糖、乳酸和乙醇产量

菌株	OD<sub>600</sub>12h	OD<sub>600</sub>17h	葡萄糖12h	葡萄糖17h	乳酸12h	乳酸17h	乙醇12h	乙醇17h
									C.sonorensis	3.78	7.65	15.07	6.86	0.00	0.00	1.16	3.20
246-27	1.56	4.95	19.10	13.41	0.22	0.99	0.00	1.02
									247-11	2.16	5.35	17.82	10.40	0.43	1.40	0.22	1.59
265-39	2.30	6.05	17.88	10.08	0.45	1.73	0.28	1.78
									265-5	1.04	3.85	19.96	14.50	0.13	0.83	0.00	0.82
265-15	1.68	5.20	18.40	11.45	0.33	1.45	0.11	1.46
									265-44	1.62	5.00	18.38	12.55	0.27	1.36	0.09	1.62
266-1	3.22	7.80	15.68	6.68	0.48	1.27	0.87	2.93
									266-2	3.52	7.75	15.49	7.42	0.60	1.19	0.82	2.65
266-3	1.80	6.55	18.07	10.53	0.22	0.71	0.28	1.95
									266-4	2.58	7.00	17.10	9.00	0.33	1.00	0.48	2.83

菌株	OD<sub>600</sub>12h	OD<sub>600</sub>17h	葡萄糖12h	葡萄糖17h	乳酸12h	乳酸17h	乙醇12h	乙醇17h
									266-7	2.84	7.95	16.38	7.50	0.43	1.32	0.67	2.66
266-8	1.96	6.45	17.77	10.30	0.28	1.20	0.35	2.08
									266-11	3.00	7.50	15.64	7.14	0.47	1.28	0.82	2.87
278-2	1.78	5.25	18.31	11.97	0.40	2.27	0.10	1.17
									278-3	1.62	4.35	18.52	13.85	0.29	1.17	0.00	0.86
278-4	1.72	5.00	18.43	12.63	0.40	1.89	0.00	0.94
									278-6	2.24	6.10	17.59	10.39	0.45	1.57	0.25	1.74
278-7	1.98	5.80	17.70	11.00	0.41	1.65	0.21	1.56
									278-8	2.76	6.45	15.96	8.65	0.89	2.55	0.46	2.27
278-9	1.78	4.35	18.21	13.43	0.26	0.90	0.00	0.92
									278-11	2.80	6.80	16.02	8.83	0.53	2.36	0.54	2.13
278-12	1.96	5.80	17.31	10.71	0.36	1.31	0.18	1.57
									278-13	2.30	6.25	17.01	9.22	0.51	1.97	0.29	1.99
278-14	1.84	5.65	17.77	10.69	0.50	2.11	0.12	1.46
									278-15	1.46	4.00	18.78	14.66	0.25	1.03	0.00	0.52
278-17	2.38	6.60	16.92	8.60	0.63	2.01	0.37	2.05
									278-18	2.26	5.75	17.44	10.27	0.70	3.02	0.16	1.65
278-19	2.62	6.60	16.87	9.06	0.54	1.69	0.35	2.01
									278-20	1.34	3.75	19.17	15.66	0.14	0.70	0.00	0.34
257-3	2.20	5.60	17.62	10.57	0.45	1.45	0.24	1.69
									257-5	2.44	6.35	17.55	10.38	0.45	1.62	0.25	2.15
257-6	2.10	5.70	17.88	10.58	0.72	2.12	0.12	1.34
									257-8	1.58	4.50	18.70	13.21	0.31	1.64	0.00	1.03
257-9	1.34	4.60	19.56	13.93	0.14	0.86	0.00	0.98
									257-10	2.88	6.90	16.22	8.18	0.67	1.60	0.52	2.39
257-11	1.24	4.05	19.64	14.99	0.10	0.98	0.00	0.94
									257-12	2.16	6.10	17.74	10.53	0.39	1.46	023	1.73

以g/L计的葡萄糖、乳酸和乙醇浓度

表5.C.sonorensis和LDH转化体在丰富培养基上的OD₆₀₀、残余的葡萄糖、乳酸和乙醇产量

菌株	OD<sub>600</sub>12h	OD<sub>600</sub>17h	葡萄糖12h	葡萄糖17h	乳酸12h	乳酸17h	乙醇12h	乙醇17h
									C.sonorensis	8.36	18.20	37.48	11.41	0.29	0.34	4.06	14.58
246-27	2.50	7.75	45.77	32.83	1.09	6.94	0.60	3.40

菌株	OD<sub>600</sub>12h	OD<sub>600</sub>17h	葡萄糖12h	葡萄糖17h	乳酸12h	乳酸17h	乙醇12h	乙醇17h
									247-11	3.76	8.50	42.59	29.53	2.36	9.39	1.18	4.53
265-39	5.76	11.05	38.25	18.56	3.22	10.97	2.57	7.65
									265-5	4.20	10.85	42.29	23.69	2.04	9.03	1.53	6.42
265-15	4.82	10.65	41.50	22.52	2.09	9.67	1.88	7.38
									265-44	3.98	9.80	42.74	25.44	1.91	8.73	1.49	6.07
266-1	7.34	15.95	35.67	5.47	2.49	8.13	3.99	14.28
									266-2	6.12	15.45	38.62	11.72	2.15	7.79	2.96	11.97
266-3	6.74	16.65	38.31	9.83	2.03	7.38	3.19	12.88
									266-4	10.18	16.55	27.26	0.00	4.11	9.53	6.72	16.93
266-7	7.72	16.05	34.83	4.54	2.79	8.49	4.56	14.76
									266-8	7.16	16.60	36.67	6.56	2.34	7.93	4.03	14.27
266-11	6.30	16.15	38.99	10.97	1.90	7.34	2.95	13.06
									278-2	4.40	9.90	42.30	28.67	2.42	9.24	1.29	5.40
278-3	3.70	8.75	42.95	27.58	1.59	7.45	1.41	5.71
									278-4	3.88	9.30	43.39	27.92	2.11	7.60	1.06	4.86
278-6	3.84	10.20	43.69	24.57	1.60	8.22	1.21	6.34
									278-7	4.44	11.10	41.90	23.21	2.16	8.64	1.62	7.79
278-8	4.56	10.90	40.59	23.41	2.59	10.06	1.67	6.92
									278-9	3.76	8.25	43.22	27.87	1.71	7.31	1.46	5.64
278-11	4.70	12.65	41.29	19.13	2.00	7.60	1.97	8.58
									278-12	4.64	10.70	41.99	23.98	1.85	9.43	1.54	7.13
278-13	5.90	10.80	38.64	18.92	3.20	10.74	2.34	8.20
									278-14	4.22	8.05	42.35	30.46	3.23	9.77	1.38	3.31
278-15	2.94	5.40	44.64	35.52	1.84	6.61	0.60	2.24
									278-17	5.22	10.45	39.23	19.69	3.28	10.51	2.61	7.65
278-18	2.48	5.30	46.55	37.17	1.04	5.01	0.63	2.56
									278-19	4.64	11.10	41.03	21.87	2.52	10.17	2.00	7.47
278-20	3.22	7.90	44.53	30.92	1.59	6.55	1.10	3.38
									257-3	3.74	7.95	43.93	29.12	1.97	8.75	1.02	4.21
257-5	3.86	8.45	43.67	28.38	2.19	8.96	1.24	4.51
									257-6	3.06	6.00	45.26	36.88	1.90	8.03	0.50	1.63
257-8	3.42	6.20	44.21	34.58	2.67	8.18	0.57	1.98
									257-9	4.02	8.20	43.16	28.31	2.24	9.16	1.22	4.41
257-10	4.60	10.00	42.66	25.14	2.09	9.69	1.54	5.36
									257-11	2.70	8.00	45.80	33.33	0.85	6.57	0.49	3.45
257-12	4.48	9.60	42.09	26.58	2.40	9.91	1.47	4.55

以g/L计的葡萄糖、乳酸和乙醇浓度

实施例16：含有整合入基因组的巨大芽孢杆菌或米根霉LDH基因的C.sonorensis在微好氧振荡烧瓶培养中缓冲或未缓冲的确定成分葡萄糖培养基上产生L-乳酸

在确定成分的葡萄糖培养基上培养含有巨大芽孢杆菌LDH基因的C.sonorensis转化体(即265-23和265-55)或含有米根霉LDH基因的C.sonorensis转化体(266-8)。使预培养物生长的YD培养基(不含氨基酸的补充了5％葡萄糖和0.5M MES的酵母氮基质，pH 5.5)上，离心收集细胞，使其重悬于50mL YD培养基(酵母氮基质，不含氨基酸，补充了10％葡萄糖)至OD₆₀₀为15，以用于培养实验。将酵母在含有或不含4g CaCO₃的250mL依式烧瓶(Erlenmeyer flask)中30℃以100rpm进行振荡培养。培养期间取样，测定不含CaCO₃的培养物的OD₆₀₀，离心收集细胞，分析培养上清中的L-乳酸(用Boehringer Mannheim，Roche的L-乳酸UV法)和葡萄糖(用Boehringer Mannheim，Roche的葡萄糖/GOD-Perid法)。这些结果见表6。

培养24小时后，含有巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体265-55在pH降至2.75时，使用CaCO₃缓冲产生了35.7g/L乳酸，而不使用缓冲产生了6.16g/L乳酸。含有两个巨大芽孢杆菌LDH基因拷贝的转化体265-23在pH降至2.68(培养24小时)时，使用CaCO₃缓冲产生了38.2g/L乳酸，而不使用缓冲则产生了6.81g/L乳酸。含有米根霉LDH基因的转化体266-8在pH降至2.83(培养24小时)时，使用CaCO₃缓冲产生了35.4g/L乳酸，而不使用缓冲则产生了3.05g/L乳酸。

这些结果证实，在pH 6.5和有CaCO₃存在的条件下，乳酸的产量和葡萄糖的利用率均高于pH 3以下的未缓冲条件下乳酸的产量和葡萄糖的利用率。在有CaCO₃存在的条件下达到了较高的乳酸滴度。

表6.LDH转化体在确定成分培养基上的OD₆₀₀、残余葡萄糖(g/L)和乳酸(g/L)产量，″C″表示在培养过程中存在CaCO₃。

菌株	0h	4h	8h	12h	24h
						265-55，OD<sub>600</sub>	16.1	15.7	14.1	13.1	12.2
265-23，OD<sub>600</sub>	15.9	14.6	12.6	10.2	12.3
						266-8，OD<sub>600</sub>	17.6	17.4	14.9	13.0	14.5

菌株	0h	4h	8h	12h	24h
						265-55C，OD<sub>600</sub>	17.4	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
265-23C，OD<sub>600</sub>	14.0	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
						266-8C，OD<sub>600</sub>	17.7	n.d.	n.d.	n.d.	n.d.
265-55，葡萄糖g/L	125.4	105.1	99.08	99.52	85.01
						265-23，葡萄糖g/L	109.4	100.8	92.16	77.31	70.93
266-8，葡萄糖g/L	109.8	81.27	87.98	62.02	51.11
						265-55C，葡萄糖g/L	106.6	91.94	93.03	78.08	49.83
265-23C，葡萄糖g/L	86.66	110.6	73.13	75.00	46.56
						266-8C，葡萄糖g/L	105.1	101.0	73.13	75.66	41.48
265-55，乳酸g/L	0.67	3.35	4.33	5.58	6.16
						265-23，乳酸g/L	0.69	3.52	4.53	5.76	6.81
266-8，乳酸g/L	0.67	3.43	4.58	4.22	3.05
						265-55C，乳酸g/L	0.57	6.92	12.21	18.73	35.73
265-23C，乳酸g/L	0.64	7.26	13.28	17.90	38.18
						266-8C，乳酸g/L	0.35	5.01	10.36	15.76	35.36

实施例17：CaCO₃-缓冲和未缓冲的培养中的胞内乳酸

对上述实施例16中，在确定成分的葡萄糖培养基上培养的C.sonorensis转化体的细胞沉淀进行分析，以便测定胞内乳酸浓度，所述C.sonorensis转化体含有巨大芽孢杆菌LDH基因(即265-23和265-55)或含有米根霉LDH基因(266-8)。在培养过程中的8小时和24小时时取样(2mL)，测定OD₆₀₀，离心收集细胞。弃去上清液，用补充了2mM EDTA的1mL冰冷的10mMK₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 7.5洗涤各沉淀。将洗涤过的细胞沉淀重悬于0.5mL相同缓冲液中并储存在-70℃。使样品解冻并用1M Tris-HCl，pH 9.0洗涤(1mL)一次，以13,000rpm离心1分钟。将沉淀悬浮于1mL冰冷的5％三氟乙酸(TCA)中并涡旋1分钟。涡旋后，将样品保持在冰上约30分钟。在冰上保温后，将该样品涡旋1分钟并在4℃以13,000rpm离心30分钟。测定收集的上清液中的乳酸浓度。使用酶法(L-乳酸UV法，Boehringer Mannheim，Roche)或用HPLC(如实施例14中所述)分析样品中的乳酸浓度。如下计算乳酸的胞内浓度：

1.细胞的胞内体积(样品中)：

培养物干重(g/L)*样品体积(L)*2mL/g细胞＝细胞体积(mL)。

将细胞体积通过乘以0.001而转化成升。1克细胞(干重)相当于2mL细胞体积(Gancedo&Serrano，1989，″能量产生代谢，″The yeasts.(Rose&Harrison，eds.)，Vol 3.Academic Press：London)。

2.细胞中的乳酸量：

测定的乳酸浓度(g/L)*所用的5％TCA的体积(L)＝样品中乳酸的量(g)。为了计算细胞中乳酸的浓度：将样品中乳酸的量(g)除以细胞体积(L)。

在培养24小时后，含有巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体265-55在用CaCO₃缓冲时胞内浓度为28.2g/L乳酸，而在未缓冲时胞内浓度为7.2g/L乳酸。在培养24小时后，含有两个巨大芽孢杆菌LDH基因拷贝的转化体265-23在用CaCO₃缓冲时胞内浓度为46.1g/L乳酸，而在未缓冲时胞内浓度为8.2g/L乳酸。含有米根霉LDH基因的转化体266-8在用CaCO₃缓冲时胞内浓度为45.4g/L乳酸，而在未缓冲时胞内浓度为4.9g/L乳酸(培养24小时)。这些结果见表7。

这些结果证实，培养8小时后，胞内乳酸浓度为在未缓冲培养中生长时转化体265-55和265-23所得胞外浓度的两倍。对其它转化体培养8小时时，胞内与胞外浓度之差较小，约为10％。当培养中包括CaCO₃时，所有菌株中的胞内和胞外乳酸浓度均高于不使用CaCO₃而培养的情况。在CaCO₃缓冲培养中，8小时-24小时内所有菌株中的胞内和胞外乳酸浓度均增加。未缓冲培养物中的胞内乳酸浓度在8小时和24小时时类似。菌株266-8的胞内乳酸浓度低于其它菌株的胞内乳酸浓度。

表7.胞内乳酸浓度(g/L)。″C″表示培养中存在CaCO₃。

转化体	8h	24h
			265-55	10.42	7.16
265-23	10.18	8.16
			266-8	4.77	4.87
265-55C	11.38	28.15
			265-23C	11.85	46.11
266-8C	8.53	45.40

实施例18：在含有整合入基因组的瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌LDH基因的C.sonorensis中乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的酶活性

在30℃的250mL依式烧瓶内的50mLYD-培养基(不含氨基酸的补充了5％葡萄糖和0.5M MES的酵母氮基质，pH 5.5)中通过以250rpm振荡将C.sonorensis转化体(即246-27、247-11、257-3、257-12、257-6，247-9、246-27、247-11、265-39、265-15、265-44、265-55、265-23、265-22、265-56、278-14、278-17、286-4、286-30和286-1)培养至OD₆₀₀为10。离心收集细胞，用HPLC分析培养上清。离心收集用于测定酶活性的细胞样品(2mL)，用补充了2mMEDTA的1mL冰冷的10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 7.5洗涤。将洗涤过的细胞沉淀重悬于0.5mL相同缓冲液中并储存在-70℃。使样品在室温解冻，用超声处理缓冲液(补充了2mM MgCl₂和10mM DTT的100mMK₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 7.5)洗涤(1mL)一次。将洗涤的样品重悬于0.5mL超声处理缓冲液中，用Bead Beater匀浆器与0.5mL玻璃珠一起匀浆1分钟。匀浆后，在4℃以14,000rpm将样品离心30分钟。收集上清液样品，在30℃用Cobas MIRA自动分析仪通过分光光度法(A₃₄₀)在含有0.4mM NADH、5mM果糖-1，6-二磷酸、1mM二羟乙酸和2mM丙酮酸的乙酸钠缓冲液(50mMNa-乙酸pH 5.2)(瑞士乳杆菌LDH)或咪唑缓冲液(40mM咪唑-HCl，pH 6.5)(巨大芽孢杆菌LDH)中测定乳酸脱氢酶活性。用Lowry法(Lowry等，1951，J.Biol.Chem.193：265-275)测定蛋白质浓度。将牛血清清蛋白(Sigma)用作蛋白质标准品。在30℃用Cobas MIRA自动分析仪通过分光光度法(A₃₄₀)在含有0.2mM NADH、50mM MgCl₂、0.2mM硫胺素焦磷酸(辅羧酶)、90个单位的ADH和50mM丙酮酸的咪唑缓冲液(40mM咪唑-HCl pH 6.5)中测定丙酮酸脱羧酶活性。将1U的酶活性定义为每分钟将1μmol NADH转化成NAD⁺的活性的量。这些结果见表8。

本实施例证实胞内LDH活性与基因组中LDH基因的拷贝数相关。含有一个瑞士乳杆菌LDH拷贝的菌株中计算的LDH活性为8U/mg总细胞蛋白。而含有两个拷贝的菌株中的活性为15或35U/mg总细胞蛋白。来自葡萄糖的乳酸滴度和产率高于在含有多个LDH基因拷贝的菌株中的乳酸滴度和产率，然而，乙醇滴度低于仅含有一个LDH基因拷贝的菌株中的乙醇滴度。含有一个巨大芽孢杆菌LDH拷贝的菌株中计算的LDH活性为2-3U/mg总细胞蛋白，含有2个拷贝的菌株中的活性为10U/mg，而含有3个拷贝的菌株中的活性为40U/mg。

在含有完整PDC2基因的菌株中丙酮酸脱羧酶活性一般为2-4U/mg总细胞蛋白。当pdc2受损时，PDC活性降至0.4U/mg总细胞蛋白以下。如果pdc1和pdc2均缺失或受损(菌株C44/286-10)，那么PDC活性降至0.07U/mg总细胞蛋白。

表8.由生长在YD-培养基上的培养物测定的培养上清中的LDH和PDC酶活性、葡萄糖、乳酸和乙醇浓度、乳酸产率。n.d.：未测定。1x、2x和3x表示LDH基因拷贝数。

菌株	基因型	LDHU/mg总细胞蛋白	PDCU/mg总细胞蛋白	葡萄糖g/L	乳酸g/L	乙醇g/L	乳酸产率(％)
								246-27	1xLhLDH，PDC+	8.01	3.82	31.8	4.73	2.63	26.00
247-11	1xLhLDH，PDC+	7.00	3.58	30.7	5.10	2.90	26.44
								257-3	1xLhLDH，pdc1-	8.70	3.81	29.6	5.76	2.96	28.25
257-12	1xLhLDH，pdc1-	8.00	2.85	34.1	3.60	2.19	22.64
								257-6	2x LhLDH，PDC+	15.0	3.73	34.1	5.79	1.31	36.51
247-9	2x LhLDH，PDC+	35.2	9.69	33.1	7.87	0.64	46.57
								278-14	1xRo+2x BmLDH，pdc1-	5.99	3.59	28.6	5.50	3.37	25.71
278-17	1xRo+1xBmLDH，pdc1-	0.48	2.46	33.84	4.11	0.61	25.43
								265-39	1xBmLDH，pdc1-	2.73	2.89	31.99	7.03	1.82	39.03
265-15	1xBmLDH，pdc1-	2.00	1.86	33	8.28	0.92	48.71
								265-44	1xBmLDH，PDC+	3.48	3.42	33.33	7.89	1.02	47.33
265-55	1xBmLDH，PDC+	1.81	1.15	28.75	3.56	4.5	16.75
								265-23	2x BmLDH，PDC+	8.56	0.95	36.95	5.51	3.36	42.22
265-22	2x BmLDH，PDC+	11.1	2.37	28.97	7.13	2.45	33.90
								265-56	3x BmLDH，PDC+	40.7	5.01	29.38	7.02	2.24	34.04
286-4	1xBmLDH，pdc2-	0.43	0.22	34.6	3.13	0.59	20.32
								286-30	1xBmLDH，pdc2-	2.51	0.13	28.63	3.25	0.44	15.21
286-1	1xBmLDH，pdc2-	3.28	0.35	28.71	3.5	0.48	16.44
								C44/286-10	2x BmLDH，pdc1-，pdc2-	9.30	0.07	n.d.	n.d.	n.d	n.d.

实施例19：用含有整合入基因组的瑞士乳杆菌、巨大芽孢杆菌或米根霉LDH编码基因或巨大芽孢杆菌和米根霉LDH基因的C.sonorensis在确定成分的葡萄糖培养基中生产乳酸

在YD培养基(不含氨基酸的补充了5％葡萄糖和0.5M MES的pH 5.5的酵母氮基质)中培养C.sonorensis细胞和转化体(即266-7、266-8、246-27、247-11、257-3、257-12、257-6、247-9、265-39、265-15、265-44、265-55、265-23、265-22、265-56、266-3、278-14、278-17、286-4、286-30、286-1)，离心收集。将细胞重悬于50mLYD(酵母氮基质，不含氨基酸，补充了10％葡萄糖)至OD₆₀₀为15，以便进行培养实验。在30℃含有4g CaCO₃的250mL依式烧瓶中以100rpm振荡培养细胞。培养期间取样，通过离心收集细胞，如上所述(实施例14)通过HPLC分析生长培养基中的乳酸、葡萄糖和乙醇。这些结果见表9-13。

培养72小时或更长时间后所有葡萄糖耗尽，此时培养上清中的乳酸滴度一般达到最大值。基于不同遗传背景分类所得最大乳酸滴度和产率如下：

-1个米根霉LDH拷贝(菌株266-7)：96小时时为81g/L和79％的产率；

-1个巨大芽孢杆菌LDH拷贝(菌株265-55)：96小时时为85g/L和82％的产率；

-1个瑞士乳杆菌LDH拷贝(菌株257-3)：96小时时为85g/L和84％的产率；

-2个巨大芽孢杆菌LDH拷贝(菌株265-22)：72小时时为87g/L和84％的产率；

-3个巨大芽孢杆菌LDH拷贝(菌株265-56)：72小时时为83g/L和80％的产率；

-2个瑞士乳杆菌LDH拷贝(菌株247-9)：72小时时为90g/L和89％的产率；

-1个米根霉LDH拷贝和1个巨大芽孢杆菌LDH拷贝(菌株278-17)：72小时时为79g/L和76％的产率；

-1个米根霉LDH拷贝和2个巨大芽孢杆菌LDH拷贝(菌株278-14)：96小时时为89g/L和86％的产率。

在所有葡萄糖耗尽后，在下列培养物中形成了乳酸钙沉淀：菌株246-27、247-11、265-39、265-15、265-44、265-23、265-22、278-14、278-17、286-4、286-30和286-1。沉淀形成还表明获得了极高的乳酸滴度。

这些结果证实，过表达瑞士乳杆菌、米根霉或巨大芽孢杆菌LDH的C.sonorensis在经过CaCO₃缓冲的确定成分培养基(pH 6.5)中从葡萄糖获得了较高的最终乳酸滴度(＞80g/L)和产率(＞80％)。瑞士乳杆菌和巨大芽孢杆菌LDH转化体的表现也基本上同样良好，且优于获得稍低乳酸滴度和产率的米根霉LDH转化体。LDH拷贝数尤其影响副产物的形成：较高LDH拷贝数和LDH活性使乙醇和乙酸产量减少。瑞士乳杆菌和巨大芽孢杆菌LDH转化体产生的乙醇和乙酸少于米根霉LDH转化体。所测定其它的副产物，包括甘油和丙酮酸的量可以忽略不计，在PDC⁺、pdc1-或dc2-基因型之间没有显著差异。

表9.用C.sonorensis LDH转化体在CaCO₃缓冲的确定成分培养基上培养时的最大乳酸滴度和产率以及乙醇和乙酸产量。1x、2x和3x表示LDH基因的拷贝数。

LDH基因理	最高LA产量g/g所用葡萄糖	最高LA滴度g/L	EtOHg/L	乙酸g/L	hrs	乳酸钙沉淀	菌株	PDC
									1xRoLDH	0.76	79	＜0.02	2	120	无	266-3	pdc1-
1xRoLDH	0.77	78	0.9	5	96	无	266-11	pdc1-
									1xRoLDH	0.78	81	0.4	4	96	无	266-7	PDC+
1xRoLDH	0.77	80	0.7	5	96	无	266-8	PDC+
									1xBmLDH	0.82	85	0.0	＜0.01	72	有	265-39	pdc1-
1xBmLDH	0.82	85	＜0.02	＜0.01	72	有	265-15	pdc1-
									1xBmLDH	0.80	83	＜0.02	＜0.01	72	有	265-44	PDC+
1xBmLDH	0.82	85	＜0.02	＜0.01	96	有	265-55	PDC+
									1xBmLDH	0.77	80	＜0.02	＜0.01	72	有	286-4	pdc2-
1xBmLDH	0.77	80	＜0.02	＜0.01	72	有	286-30	pdc2-
									1xBmLDH	0.73	76	0.2	＜0.01	48	有	286-1	pdc2-
1xLhLDH	0.79	80	＜0.02	＜0.01	120	无	246-27	PDC+
									1xLhLDH	0.79	80	＜0.02	＜0.01	144	无	247-11	PDC+
1xLhLDH	0.84	85	＜0.02	＜0.01	96	无	257-3	pdc1-
									1xLhLDH	0.81	82	＜0.02	＜0.01	144	无	257-12	pdc1-
1xLhLDH	0.81	84	＜0.02	＜0.01	72	有	246-27	PDC+
									1xLhLDH	0.82	85	＜0.02	＜0.01	72	有	247-11	PDC+
2xBmLDH	0.80	83	＜0.02	＜0.01	72	有	265-23	PDC+
									2xBmLDH	0.84	87	＜0.02	＜0.01	72	有	265-22	PDC+
3xBmLDH	0.80	83	＜0.02	＜0.01	72	无	265-56	PDC+
									2xLhLDH	0.77	78	＜0.02	＜0.01	120	无	257-6	PDC+
2xLhLDH	0.89	90	＜0.02	＜0.01	72	无	247-9	PDC+
									1xRoLDH+1xBmLDH	0.76	79	＜0.02	＜0.01	72	有	278-17	pdc1-
1xRoLDH+	0.86	89	＜0.02	＜0.01	96	有	278-14	pdc1-

LDH基因型	最高LA产量g/g所用葡萄糖	最高LA滴度g/L	EtOHg/L	乙酸g/L	hrs	乳酸钙沉淀	菌株	PDC
									2xBmLDH

表10.不同时间点的葡萄糖g/L。n.d.＝未测定；^*＝乳酸钙沉淀。

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96	120h	144h
											C.sonorensis	100.04	81.49	73.03	66.6	59.77	41.03	31.81	31.19	16.21	0.41
C.sonorensis	99.33	83.46	75.43	69.44	57.14	46.84	38.55	41.97	29.81	20.78
											266-3	99.79	83.58	79.35	73.54	57.52	43.14	33.63	36.48	29	17.12
266-11	101.71	79.68	74.38	65.46	39.54	2.29	0.00	0.00	0.00	0.00
											266-7	98.72	82.13	74.22	64.9	44.61	17.3	1.29	0.00	0.00	0.00
266-8	100.01	82.07	71.6	62.67	42.13	15.63	0.87	0.00	0.00	0.00
											246-27	100.32	85	77.22	74.09	58.28	33.65	23.01	13.99	0.00	0.00
247-11	101.89	84.23	76.25	n.d.	58.09	33.9	22.68	8.28	0.00	0.00
											257-3	104.51	84.1	73.31	n.d.	53.18	27.2	16.14	0.00	0.00	0.00
257-12	99.69	81.74	77.63	n.d.	52.95	29.22	15.69	2.55	0.00	0.00
											257-6	101.32	84.78	78.34	72.66	60.85	40.53	34.2	17.44	0.00	0.00
247-9	100.78	85.97	77.99	68.14	50.65	9.7	0.00	0.00	0.00	0.00
											246-27	69.69	82.04	64.32	57.84	34.01	0.00	0.00	*
247-11	98.29	83.26	79.02	62.51	45.27	10.76	0.00	0.00	*
											C.sonorensis	95.67	80.28	72.24	56.24	39.83	16.38	0.26	0.00	0.00	0.00
C.sonorensis	91.63	81.42	69.91	61.29	47.36	30.73	19.69	7.91	0.00	0.00
											265-39	96.51	83.44	79.68	40.33	44.55	13.96	0.00	*
265-15	94.7	89.05	74.6	65.28	37.52	6.58	0.00	*
											265-44	95.32	86.01	72.89	65.3	49.24	12.38	0.00	0.00	*
265-55	91.56	90.02	70.48	68.18	49.91	24.81	4.06	0.00	0.00	0.00
											265-23	93.34	84.3	73.42	64.48	45.73	9.2	0.00	*
265-22	92.13	85.92	70.78	65.54	46.82	8.19	0.00	*
											265-56	91.85	89.76	73.76	69.46	54.69	24.35	0.00	0.00	0.00	0.00
266-3	90.68	86.01	70.34	63.32	35.98	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
											278-14	92.44	89.84	74.84	67.31	50.96	20.31	0.00	0.00	*
278-17	97.57	88.18	71.68	61.92	43.86	6.90	0.00	*
											286-4	96.11	85.80	71.01	63.90	45.67	6.08	0.00	*
286-30	92.22	83.59	68.22	61.48	40.07	0.42	0.00	*
											286-1	96.42	84.21	68.06	60.66	46.22	0.00	*

表11.乳酸g/L；n.d.＝未测定；^*＝乳酸钙沉淀

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h	144h
											C.sonorensis	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.18	0.00	0.00
C.sonorensis	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.48	0.00	0.00
											266-3	0.34	3.15	6.27	9.41	20.34	29.26	39.2	44.51	45.82	50.54
266-11	0.46	5.5	12.27	18.65	37.6	65.04	77.75	77.71	76.81	77.69
											266-7	0.46	5.7	11.88	17.64	35.15	57.11	74.23	80.88	76.81	78.78
266-8	0.48	5.87	12.04	18.21	36.34	58.92	75.07	80.45	74.72	77.76
											246-27	0.48	5.37	10.16	15.16	28.75	40.7	58.15	70.84	80.06	77.72
247-11	0.49	5.38	10.27	n.d.	29.24	45.05	58.11	76.73	79.92	80.27
											257-3	0.57	6.64	12.34	n.d.	34.72	52.53	71.92	85.71	81.50	80.98
257-12	0.51	5.76	11.46	n.d.	32.55	51.57	56.12	81.15	80.02	82.48
											257-6	0.55	5.82	10.09	14.02	24.78	38.11	53.13	66.47	78.03	77.82
247-9	0.63	5.44	11.46	16.50	35.7	57.83	89.75	89.66	88.58	88.47
											246-27	0.26	8.74	15.51	23.23	43.69	76.83	84.09	*
247-11	0.32	6.71	14.17	17.98	37.32	73.23	85.56	84.08	*
											C.sonorensis	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
C.sonorensis	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	1.49
											265-39	0.18	6.85	14.67	12.27	40.22	69.97	85.02	*
265-15	0.23	7.43	13.78	19.78	40.3	76.86	85.17	*
											265-44	0.21	6.91	11.63	17.11	33.47	(37.27)	83.02	70.25	*
265-55	0.24	7.05	10.97	17.46	32.41	59.35	79.00	85.32	78.81	87.49
											265-23	0.2	7.49	13.28	19.27	37.36	69.74	83.44	*
265-22	0.22	7.26	12.65	19.67	38.60	74.97	87.36	*
											265-56	0.18	6.58	10.50	15.82	30.69	55.16	83.20	76.95	80.08	78.47
266-3	0.14	5.77	11.34	17.43	39.25	75.38	75.31	74.41	79.04	72.06
											278-14	0.16	6.77	11.60	17.36	34.13	66.85	87.54	89.33	*
278-17	0.25	7.51	12.62	18.58	38.91	78.41	79.16	*
											286-4	0.23	6.02	10.91	17.13	37.77	75.62	79.59	*
286-30	0.28	7.95	13.52	20.08	39.68	80.22	81.63	*
											286-1	0.39	8.33	14.44	21.51	36.82	75.68	*

表12.乙醇g/L。低于检测极限的值(0.02g/L)未显示。n.d.＝未测定。

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h	144h
											C.sonorensis	0.48	2.84	5.5	7.71	11.29	14.86	13.33	15.91	17.29	20.75
C.sonorensis	0.4	2.52	4.88	6.77	10.37	0.82	11.34	11.8	10.47	11.4
											266-3	0.29	0.81	1.43	2.05	3.14	0.27	1.5	0.47
266-11	0.36	0.93	1.53	2.28	3.85	3.46	2.21	0.94
											266-7	0.33	0.89	1.34	1.92	2.92	2.38	1.65	0.35

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h	144h
											266-8	0.4	1.05	1.72	2.43	3.38	2.29	2.06	0.72
246-27		0.21	0.26	0.21	0.12
											247-11		0.2	0.17	n.d.
257-3	0.12	0.12	0.17	n.d.
											257-12	0.09	0.11	0.14	n.d.
257-6
											247-9
246-27	0.05	0.18	0.21
											247-11	0.06	0.14	0.12
C.sonorensis	0.56	4.1	7.38	6.41	10.67	15.91	18.11	16.19	13.53	20.9
											C.sonorensis	0.54	3.66	6.58	5.21	8.05	9.48	11.51	12.05	10.88	13.13
265-39	0.09	0.21	0.15				0.03
											265-15	0	0.23	0.26	0.02	0.15
265-44	0	0.16
											265-55	0	0.13
265-23
											265-22		0.14
265-56
											266-3	0.27	1.38	1.18	1.65	2.15	2.13	1.52	0.47
278-14
											278-17		0.31	0.1	0.13	0.09	0.03
286-4		0.22	0.15	0.21	0.29	0.37
											286-30		0.24	0.1	0.17	0.21	0.23
286-1		0.23	0.09	0.14		0.16

表13.乳酸(g/g消耗的葡萄糖)。n.d.＝未测定；^*＝乳酸钙沉淀。

	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h	144h
											C.sonorensis	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
C.sonorensis	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.01	0.00	0.00
											266-3	0.28	0.18	0.29	0.34	0.47	0.51	0.58	0.69	0.64	0.60
266-11	0.00	0.26	0.46	0.52	0.61	0.66	0.77	0.77	0.76	0.77
											266-7	0.20	0.30	0.44	0.49	0.62	0.68	0.74	0.80	0.76	0.78
266-8	0.48	0.31	0.41	0.48	0.62	0.69	0.75	0.80	0.74	0.77
											246-27	0.71	0.34	0.43	0.56	0.67	0.60	0.75	0.81	0.79	0.77
247-11	0.00	0.32	0.41	n.d.	0.68	0.67	0.74	0.83	0.79	0.79
											257-3	0.00	0.39	0.45	n.d.	0.73	0.71	0.85	0.85	0.81	0.80
257-12	0.39	0.30	0.49	n.d.	0.68	0.72	0.66	0.82	0.79	0.82

	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h	144h
											257-6	0.00	0.36	0.45	0.49	0.62	0.63	0.80	0.80	0.77	0.77
247-9	2.86	0.36	0.50	0.50	0.71	0.63	0.89	0.89	0.88	0.88
											246-27	0.01	0.40	0.39	0.50	0.65	0.74	0.81	*
247-11	0.06	0.32	0.57	0.43	0.64	0.79	0.82	0.81	*
											C.sonorensis	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
C.sonorensis	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.01
											265-39	0.02	0.33	0.60	0.19	0.68	0.78	0.82	*
265-15	0.02	0.50	0.47	0.51	0.61	0.79	0.82	*
											265-44	0.02	0.38	0.37	0.44	0.61	(0.41)	0.80	0.68	*
265-55	0.02	0.50	0.33	0.49	0.60	0.75	0.79	0.82	0.76	0.84
											265-23	0.02	0.38	0.43	0.49	0.64	0.74	0.80	*
265-22	0.02	0.40	0.38	0.51	0.68	0.78	0.84	*
											265-56	0.01	0.46	0.35	0.46	0.62	0.69	0.80	0.72	0.77	0.75
266-3	0.01	0.32	0.34	0.43	0.58	0.72	0.72	0.74	0.76	0.69
											278-14	0.01	0.48	0.40	0.47	0.64	0.80	0.84	0.86	*
278-17	0.04	0.47	0.39	0.44	0.65	0.81	0.76	*
											286-4	0.03	0.33	0.33	0.43	0.65	0.77	0.77	*
286-30	0.02	0.39	0.38	0.47	0.62	0.77	0.78	*
											286-1	0.05	0.42	0.40	0.50	0.64	0.73	*

实施例20：用含有整合入基因组的瑞士乳杆菌或米根霉LDH编码基因的C.sonorensis在氮喷雾试管内确定成分的葡萄糖培养基中生产乳酸

如下证实经转化的C.sonorensis细胞中L-乳酸的生产。在YD培养基(不含氨基酸的补充了12％葡萄糖和0.4M MES的pH 5.5的酵母氮基质)中培养含有瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis细胞和转化体(即246-14、246-14、246-18、246-23、246-27、247-7、247-8、247-11和257-3)或含有米根霉LDH基因的C.sonorensis细胞和转化体(266-3和266-4)。预培养物在250mL依式烧瓶内的50mL YD培养基(酵母氮基质，不含氨基酸，补充了6.5％葡萄糖和0.4M MES，pH 5.5)中30℃以250rpm振荡培养。离心收集细胞，用0.9％NaCl洗涤一次，然后重悬于50mL YD培养基中至OD₆₀₀为11，以便进行培养实验。酵母在30℃喷射了氮气的50mL一次性塑料试管内以250rpm振荡培养((近似)厌氧条件)。在培养期间取样，此后给试管中喷射氮气。测定OD₆₀₀，离心收集细胞，如上所述通过HPLC分析培养上清中的乳酸、葡萄糖和乙醇。这些结果见表14-20。

培养94小时后，含有瑞士乳杆菌LDH基因的转化体产生了6.9-7.2g/L乳酸(相当于66-84％的产率)和1-1.4g/L乙醇，而宿主菌株产生了0.1g/L乳酸和40g/L乙醇。在培养94小时后，含有米根霉LDH基因的转化体产生了7.2-8.8g/L乳酸(相当于13-18％产率)和17-28g/L乙醇。米根霉LDH转化体的葡萄糖消耗和乙醇产生均快于瑞士乳杆菌转化体的葡萄糖消耗和乙醇产生。

这些结果证实，用瑞士乳杆菌LDH或米根霉LDH转化的C.sonorensis在喷射氮气的试管培养物中由葡萄糖产生了乳酸。

表14.乳酸g/g消耗的葡萄糖

菌株	0h	27h	46h	70h	94h
						247-7	0	0.93	1.04	0.90	0.75
247-8	0	1.09	0.98	0.90	0.66
						247-11	0	0.84	0.91	0.88	0.80
246-14	0	1.02	1.02	0.91	0.78
						246-18	0	1.08	0.91	0.77	0.71
246-23	0	0.89	0.94	0.87	0.84
						246-27	0	0.83	0.95	0.88	0.83
C.sonorensis	0	0.00	0.00	0.00	0.00
						266-3	0	0.37	0.22	0.17	0.13
266-4	0	0.32	0.26	0.22	0.18
						257-3	0	1.00	0.88	0.93	0.76

实施例21：用含有整合入基因组的瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌LDH基因的C.sonorensis在不进行缓冲的微需氧振荡烧瓶培养物中的丰富葡萄糖培养基上生产L-乳酸

如下证实经转化的C.sonorensis细胞中L-乳酸的产生。C.sonorensis转化体在250mL依式烧瓶内的50mL YD培养基(酵母氮基质，不含氨基酸，补充了5％葡萄糖和0.5M MES，pH 5.5)中30℃以250rpm振荡培养，所述转化体含有巨大芽孢杆菌LDH基因(即265-23和286-1)或瑞士乳杆菌LDH基因(246-27和247-11)。离心收集细胞，重悬于补充了5％葡萄糖的50mL YP中直至OD₆₀₀为15，以便进行培养实验。培养期间取样，测定OD₆₀₀，离心收集细胞。分析培养上清中的乳酸(Boehringer Mannheim，Roche的L-乳酸UV法)、葡萄糖(Boehringer Mannheim，Roche的葡萄糖/GOD-Perid法)、乙酸(Boehringer Mannheim，Roche的乙酸UV法)和乙醇(Boehringer Mannheim，Roche的乙醇UV法)。这些结果见表15-20。

培养24小时后，含有随机整合入酵母基因组的瑞士乳杆菌LDH基因的转化体246-27和247-11(PDC+基因型)产生了7.8-9.0g/L乳酸(相当于24-29％的产率)。在培养24小时后，含有整合入pdc2基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体286-1(pdc2-基因型)产生了8.9g/L乳酸(相当于31％产率)。在培养24小时后，含有随机整合入酵母基因组的两个巨大芽孢杆菌LDH基因拷贝的转化体265-23(PDC+基因型)产生了9.1g/L乳酸(相当于30％的产率)。在培养24小时后，含有巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体产生了8.9-9.1g/L乳酸，相当于由葡萄糖得到30-31％的产率。含有瑞士乳杆菌LDH基因的转化体产生了7.8-9.0g/L乳酸，相当于由葡萄糖得到24-29％的产率。在第24小时，有一些葡萄糖未被消耗，但最终所有葡萄糖都被消耗(在120小时时)。然而，24小时后不再有乳酸浓度增加。所有菌株的葡萄糖消耗量均极为相似。在本实验过程中培养基的pH在3.4-3.8之间。含有两个巨大芽孢杆菌LDH拷贝的转化体265-23在培养早期产生的乙醇和乙酸较少，而pdc2-转化体286-1直至培养结束时产生的乙醇和乙酸均少于其它菌株。

这些结果证实，用瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌LDH转化的C.sonorensis能够在微需氧条件和低pH下由葡萄糖产生至多9g/L的乳酸。

表15.吸收度OD₆₀₀

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										265-23	17.40	16.1	15.2	15.30	18.40	15.4	13.6	14.8	17.8
286-1	15.80	16.4	15.6	15.30	20.40	16.2	16.5	20.1	25.0
										246-27	16.20	15.9	15.8	16.90	18.20	15.1	14.1	17.0	23.7
247-11	15.80	15.4	16.3	15.40	18.60	15.8	13.4	16.1	23.3

表16.不同时间点的葡萄糖g/L

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										265-23	n.d.	n.d.	n.d.	27.1	19.51	10.2	8.4	6.7	2.8
286-1	n.d.	n.d.	n.d.	25.5	21.6	13.2	8.1	0.9	0.0
										246-27	n.d.	n.d.	n.d.	25.3	18.0	9.9	6.8	2.3	0.0
247-11	n.d.	n.d.	n.d.	24.6	18.9	11.2	7.3	2.4	0.0

表17.乳酸g/L

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										265-23	0.46	4.41	6.31	7.57	9.10	6.49	6.04	5.78	4.35
286-1	0.46	4.62	5.57	7.57	8.85	7.43	5.55	5.68	5.01
										246-27	0.49	4.38	5.23	7.75	7.75	6.96	5.97	7.12	5.86
247-11	0.49	4.35	5.18	7.40	8.97	8.18	6.08	7.39	5.06

表18.乙醇g/L

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										265-23	0.28	0.55	0.82	1.50	3.62	6.29	7.47	8.12	6.45
286-1	0.25	0.77	1.14	1.57	3.84	5.43	6.23	6.96	4.50
										246-27	0.31	0.72	1.22	1.97	4.14	6.47	7.33	7.43	5.48
247-11	0.33	0.70	1.16	1.64	4.04	6.44	7.50	7.76	6.06

表19.pH

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										265-23	5.11	3.79	3.66	3.55	3.41	3.58	3.69	3.7	3.66
286-1	4.98	3.73	3.62	3.58	3.38	3.54	3.57	3.51	3.66
										246-27	5.09	3.74	3.66	3.57	3.41	3.53	3.68	3.63	3.62
247-11	5.05	3.73	3.57	3.53	3.43	3.49	3.54	3.6	3.61

表20.乙酸g/L

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										265-23	0.1	0.4	0.9	1.1	2.8	5.5	6.1	4.7	1.2
286-1	0.1	0.5	1.1	1.3	2.8	3.8	2.1	1.3	0.1
										246-27	0.1	0.5	1.1	1.4	3.0	5.0	4.6	1.4	0.0
247-11	0.1	0.5	1.0	1.2	2.7	4.4	4.1	1.4	0.0

实施例22：用含有整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的C.sonorensis在生物反应器内的丰富葡萄糖培养基中生产L-乳酸

在需氧生物反应器中培养上述命名为265-55、286-30和265-15的C.sonorensis转化体。在实验室生物反应器(Biostat CT-DCU3，Braun，Germany)中35℃进行批量培养，工作体积为2L。在生产阶段中，将pH维持在5.0±0.1或在培养48小时后通过自动添加5M氢氧化钾(KOH)使其增加至6.0±0.1。用补充了150g/L葡萄糖的YP培养基生产生物质。在生物质生产阶段接种储存在-80℃23％(w/v)甘油中的20mL培养物，直至最初的OD₆₀₀为0.7-1。用100％的空气以1.0L/分钟的流速冲洗(flush)生物反应器并在该阶段中以800rpm搅拌。培养23.5小时后，产生10-21g/L细胞质量(干重)(相当于0.2-0.3g干重/所用葡萄糖克数)。经过24小时的生物质生产后，排空生物反应器，离心收集细胞(4000rpm，20℃，10分钟)。将用于乳酸生产的培养基(补充了100g/L葡萄糖的YP)泵入生物反应器并给其接种从生物质生产阶段中收集的细胞至密度相当于5g/L干重。用10％空气-90％氮气以1.0L分钟^-1的流速冲洗生物反应器并以500rpm搅拌。

在培养期间取样。对每一样品测定细胞干重、测定OD₆₀₀，离心收集细胞。如上所述通过HPLC分析培养上清中的乳酸、葡萄糖、乙醇和乙酸。这些结果见表21和22。

在乳酸产生阶段的52小时培养后，含有随机整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(265-55，PDC⁺基因型)在pH 5.0产生了28g/L乳酸(相当于67％产率)。在该产生阶段的72小时培养后，相同转化体在pH 6.0产生了28g/L乳酸(相当于60％产率)。

在乳酸产生阶段的51小时培养后，含有整合入pdc1基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(265-15，pdc1-基因型)在pH 5.0产生了23g/L乳酸(相当于66％产率)。

在乳酸产生阶段的46小时培养后，含有整合入pdc2基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(286-30，pdc2-基因型)在pH 5.0产生了27g/L乳酸(相当于54％产率)。

在乳酸产生阶段的46-52小时后，所述转化体产生了23-28g/L乳酸(相当于54-67％产率)。

这些结果证实，过表达异源乳酸脱氢酶编码基因的C.sonorensis在微需氧条件下(例如空气中含有0％-2％O₂)的分批发酵中由葡萄糖产生了乳酸。

表21：在含有YPD培养基和150g/L葡萄糖的生物反应器中培养时的生物质生产

C.sonorensis转化体	培养时间(h)	起始OD<sub>600</sub>	最终OD<sub>600</sub>	葡萄糖耗量(g/L)	最终生物质(细胞干重g/L)
						265-55	23.5	0.68	90	96	20.8
265-55	21.5	0.69	98	73	20.5
						286-30	23.5	1.01	42	65	21.3

C.sonorensis转化体	培养时间(h)	起始OD<sub>600</sub>	最终OD<sub>600</sub>	葡萄糖耗量(g/L)	最终生物质(细胞干重g/L)
						265-15	23.5	0.85	41	46	10.0

表22：C.sonorensis在含有YPD培养基和100g/L葡萄糖的生物反应器中培养时的乳酸生产。当获得峰值乳酸浓度时的葡萄糖消耗量、乳酸浓度和乳酸产率。^*＝48小时时pH增加至6.0。

C.sonorensis转化体	起始生物质(细胞干重g/L)	峰值LA时的发酵时间	葡萄糖耗量(g/L)	L.A.(g/L)	LA产量(g LA/g葡萄糖用量)
						265-55	4.5	52h	42	28	67％
265-55<sup>*</sup>	6.4	72h	47	28	60％
						286-30	4.3	46h	50	27	54％
265-15	5.3	51h	35	23	66％

表23：C.sonorensis在含有YPD培养基和100g/L葡萄糖的生物反应器中培养时的副产物生产。当获得峰值乳酸浓度时的副产物浓度。^*＝48小时时pH增加至6.0。

C.sonorensis转化体	起始生物质(干重g/L)	峰值LA时的发酵时间	乙醇(g/L)	乙酸(g/L)	甘油(g/L)	丙酮酸(g/L)
							265-55	4.5	52h	1.9	4.5	0	0.71
265-55<sup>*</sup>	6.4	72h	0.6	10.6	0	0.79
							286-30	4.3	46h	2.3	5.0	0	0.39
265-15	5.3	51h	1.4	5.0	0	0.06

胞内乳酸和丙酮酸

如上述实施例17中所述测定胞内乳酸和丙酮酸浓度，但样品体积为1mL，用1M Tris-HCl pH 9.0洗涤细胞沉淀(1mL)，以13,000rpm离心1分钟，在-70℃储存。解冻后，将该沉淀直接悬浮于1mL冰冷的5％TCA中。以酶促方式分析样品中的胞内丙酮酸浓度(丙酮酸试剂盒，Sigma Diagnostics)。这些结果见表24-27。

在乳酸生产阶段培养52小时时，含有随机整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(265-55，PDC⁺基因型)于H 6.0时在细胞中产生了60.9g/L乳酸。在乳酸产生阶段培养72小时时，相同转化体在pH 6.0产生了38.7g/L乳酸。

在乳酸产生阶段培养51小时时，含有整合入pdc1基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(265-15，pdc1-基因型)产生了13.4g/L乳酸。

在乳酸产生阶段培养49小时时，含有整合入pdc2基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(286-30，pdc2-基因型)产生了14.3g/L乳酸。

在pH 5.0以及在pH 6.0的培养中，含有随机整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(265-55，PDC⁺基因型)在细胞中产生0.1g/L丙酮酸。

在培养期间，含有整合入pdc1基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(265-15，pdc1-基因型)或含有整合入pdc2基因座的巨大芽孢杆菌LDH的转化体(286-30，pdc2-基因型)在细胞中产生了0.3g/L乳酸。

这些结果证实，pdc1缺失和pdc2受损使胞内丙酮酸水平增加。在PDC⁺菌株中，胞内乳酸水平增加直至培养结束，不过，这种趋势在pdc1-和pdc2-菌株中并不明显。

表24.菌株265-55(PDC⁺，pH 5.0)中的胞内乳酸和丙酮酸浓度(g/L)

时间(h)	乳酸(g/L)	丙酮酸(g/L)
			0	15.9	0.1
3.1	17.0	0.1
			6.1	13.9	0.1
9.0	17.9	0.0
			20.9	20.9	0.1
24.2	40.6	0.1
			27.9	25.2	0.1
44.8	28.4	0.0
			49.1	40.3	0.1
51.6	60.9	0.2

表25.菌株265-55(PDC⁺，pH 6.0)中的胞内乳酸和丙酮酸浓度(g/L)

时间(h)	乳酸(g/L)	丙酮酸(g/L)
			0	10.67	0.2
4.7	11.15	0.1
			21.1	12.97	0.2
19.4	95.83	0.2
			22.4	23.08	0.1
24.5	24.89	0.1
			48.3	39.67	0.1

时间(h)	乳酸(g/L)	丙酮酸(g/L)
			71.7	38.7	0.1
91.6	42.0	0.1
			96.1	53.4	0.1
97.9	55.5	0.1

表26.菌株286-30(pdc2-，pH 5.0)中的胞内乳酸和丙酮酸浓度(g/L)

时间(h)	乳酸(g/L)	丙酮酸(g/L)
			1.7	14.3	0.4
3.1	15.0	0.1
			22.2	24.2	0.2
24.5	26.0	0.2
			39.1	15.1	0.3
48.7	14.3	0.3
			66.7	45.8	0.4
70.5	43.7	0.5

表27.菌株265-15(pdc1-，pH 5.0)中的胞内乳酸和丙酮酸浓度(g/L)

时间(h)	乳酸(g/L)	丙酮酸(g/L)
			1.3	11.8	0.2
16.6	11.1	0.3
			19.7	14.6	0.2
22.4	17.7	0.2
			50.6	13.4	0.3
76.1	13.4	0.3
			89.0	41.5	0.2
94.8	23.5	0.1

乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶活性

如下测定乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶活性。通过离心收集用于酶活性测定的样品(2mL)，用补充了2mM EDTA的1mL冰冷的pH 7.5的10mMK₂HPO₄/KH₂PO₄洗涤细胞沉淀。将洗涤过的细胞沉淀重悬于0.5mL相同缓冲液中，在-70℃储存。使样品在室温解冻，用匀浆缓冲液(100mMK₂HPO₄/KH₂PO₄，pH 7.5，补充了2mM MgCl₂和10mM DTT)洗涤(1mL)一次。将洗涤过的样品重悬于0.5mL匀浆缓冲液中，用Bead Beater匀浆器与0.5mL玻璃珠一起匀浆1分钟。匀浆后，在4℃以14,000rpm将样品离心30分钟。收集上清液样品并如上所述实施例18中所述通过分光光度法(A₃₄₀)测定乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶活性，但不使用二羟乙酸。这些结果见表28-31。

在pH 5.0的乳酸产生阶段培养52小时时，含有随机整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(265-55，PDC⁺基因型)产生了1.4U/mg总细胞蛋白的乳酸脱氢酶活性和0.8U/mg总细胞蛋白的丙酮酸脱羧酶活性。在pH6.0的乳酸产生阶段培养72小时时，相同转化体产生了1.2U/mg总细胞蛋白的乳酸脱氢酶活性和0.4U/mg的丙酮酸脱羧酶活性。

在乳酸产生阶段培养51小时时，含有整合入pdc1基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(265-15，pdc1-基因型)产生了1.5U/mg总细胞蛋白的乳酸脱氢酶活性和0.5U/mg的丙酮酸脱羧酶活性。

在乳酸产生阶段培养49小时时，含有整合入pdc2基因座的巨大芽孢杆菌LDH基因的转化体(286-30，pdc2-基因型)产生了0.7U/mg总细胞蛋白的乳酸脱氢酶活性和0.1U/mg的丙酮酸脱羧酶活性。

这些结果证实，LDH活性在含有一个整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH拷贝的所有菌株中均相似。LDH活性高于PDC活性(U/mg总细胞蛋白)，由此LDH可以有效地与PDC竞争丙酮酸。pdc2-菌株286-30与野生型相比显著降低了PDC活性。在pdc1-菌株265-15中观察到的pdc1缺失对PDC活性的影响是，在一段时间内使活性更逐步地下降。

表28.乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶活性(265-55(PDC⁺，pH 5.0))

小时	LDH(U/mg总细胞蛋白)	PDC(U/mg总细胞蛋白)
			0	1.9	0.41
3.1	1.83	0.58
			6.08	1.78	0.79
8.95	1.74	0.82
			20.92	1.6	0.95
24.17	1.92	0.98
			27.93	2.13	0.92
44.83	n.d.	1
			49.13	1.88	0.97
51.62	1.35	0.77

表29.乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶活性(265-55(PDC⁺，pH 6.0))

小时	LDH(U/mg总细胞蛋白)	PDC(U/mg总细胞蛋白)
			0	1.13	0.28
2.08	1.11	0.3
			4.73	0.75	0.31
19.35	1.19	0.5
			22.35	1.14	0.51
24.47	1.8	0.55
			48.33	1.09	0.46
71.73	1.21	0.35
			91.63	0.69	0.27
96.08	n.d.	0.22
			97.88	1.72	0.23

表30.乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶活性(265-15(pdc1-，pH 5.0))

小时	LDH(U/mg总细胞蛋白)	PDC(U/mg总细胞蛋白)
			16.63	0.91	0.52
19.65	1.09	0.57
			22.38	0.78	0.52
50.58	1.54	0.46
			76.08	4.38	0.34
88.95	2.25	0.16
			94.83	1.41	0.21

表31.乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶活性(286-30(pdc2-，pH 5.0))

小时	LDH(U/mg总细胞蛋白)	PDC(U/mg总细胞蛋白)
			1.65	0.82	0.19
3.08	1.09	0.23
			22.22	0.78	0.14
24.52	1.56	0.26
			39.05	0.85	0.15
48.73	0.72	0.12
			66.67	0.17	0.06
70.5	0.26	0.08

实施例23：含有整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的C.sonorensis在生物反应器内的丰富葡萄糖培养基中厌氧生产L-乳酸

在生物反应器中培养上述命名为265-55的C.sonorensis转化体。在实验室生物反应器(Biostat CT-DCU3，Braun，Germany)中35℃进行批量培养，工作体积为2L。在补充了150g/L葡萄糖的YP培养基中以需氧方式生产生物质。在生物质生产阶段中接种储存在-80℃23％(w/v)甘油中的20mL培养物。用100％的空气以1.0L/分钟的流速冲洗生物反应器并在该阶段中以800rpm搅拌。使用氧电极(Mettler Toledo)连续监测溶解氧浓度。经过22.5小时的生物质生产后，排空生物反应器，离心收集细胞(4000rpm，20℃，10分钟)。将用于乳酸生产的培养基(补充了100g/L葡萄糖的YP)泵入生物反应器，并接种经过离心的生物质，直至密度相当于4.5g/L细胞干重。用100％的空气以1.0L/分钟的流速冲洗生物反应器并以500rpm搅拌。通过自动添加5M氢氧化钾(KOH)将pH维持在5.0±0.1。

在培养期间取样。测定细胞干重、测定OD₆₀₀，离心收集细胞。分析培养上清中的L-乳酸(Boehringer Mannheim的L-乳酸UV法)和葡萄糖含量(Boehringer Mannheim的葡萄糖/GOD-Perid法)。这些结果见表32和33。

培养120小时后，由葡萄糖生产了4.7g/L乳酸(当于52％的产率)。

本实施例证实过表达异源乳酸脱氢酶的C.sonorensis能够在厌氧分批发酵条件下由葡萄糖产生乳酸。

表32：在含有YPD培养基和150g/L葡萄糖的生物反应器中进行培养时需氧生物质的生产

C.sonorensis转化体	培养时间(小时)	最初OD<sub>600</sub>	最终OD<sub>600</sub>	最终生物质(细胞干重g/L)
					265-55	22.5	0.77	74	20.1

表33：过表达巨大芽孢杆菌LDH的C.sonorensis在含有YPD培养基和100g/L葡萄糖的生物反应器中厌氧培养时的乳酸生产：葡萄糖消耗量、乳酸浓度和乳酸产率

C.sonorensis转化体	起始生物质(细胞干重g/L)	发酵时间	消耗的葡萄糖(g/L)	乳酸(g/L)	LA.产率(gLA/g消耗的葡萄糖)
						265-55	4.5	120小时	9	4.7	0.52

实施例24：使用含有整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH的C.sonorensis在生物反应器中Ca(OH)₂-缓冲的丰富葡萄糖培养基上进行L-乳酸生产

如实施例23中所述在35℃的生物反应器(Biostat CT-DCU3，Braun，Germany)中批量培养上述命名为265-55的C.sonorensis转化体。在18.5小时的生物质生产后，排空生物反应器，离心收集细胞(4000rpm，20℃，10分钟)。将用于乳酸生产的培养基(补充了100g/L葡萄糖的YP)泵入生物反应器并给其接种离心的生物质，使得密度相当于6.7g/L细胞干重。用90％的氮气和10％的空气以1.0L/分钟的流速冲洗生物反应器并以500rpm搅拌。通过自动添加2.5M氢氧化钙(Ca(OH)₂)将pH维持在5.0+0.1。

在培养期间取样。测定细胞干重、测定OD₆₀₀，离心收集细胞。分析培养上清中的L-乳酸(Boehringer Mannheim的L-乳酸UV法)和葡萄糖含量(Boehringer Mannheim的葡萄糖/GOD-Perid法)。这些结果见表34和35。

培养53小时后，由葡萄糖生产了26g/L乳酸(当于67％的产率)。

这些结果证实，过表达巨大芽孢杆菌乳酸脱氢酶的C.sonorensis能够在微需氧分批发酵并有氢氧化钙缓冲的条件下(2％，O₂)由葡萄糖产生乳酸。表34：在含有YPD培养基和150g/L葡萄糖的生物反应器中

培养时的需氧生物质生产

C.sonorensis转化体	培养时间(小时)	最初OD<sub>600</sub>	最终OD<sub>600</sub>	最终生物质(细胞干重g/L)
					265-55	18.5	2.19	46	16.5

表35：过表达巨大芽孢杆菌LDH的C.sonorensis在含有YPD培养基和100g/L葡萄糖的生物反应器中培养时的乳酸生产：葡萄糖消耗量、乳酸浓度和乳酸产率

C.sonorensis转化体	起始生物质(细胞干重g/L)	发酵时间	消耗的葡萄糖(g/L)	乳酸(g/L)	L.A.产率(gL.A./g消耗的葡萄糖)
						265-55	6.7	53小时	39	26	0.67

实施例25：使用含有整合入基因组的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis在生物反应器中丰富葡萄糖培养基上进行的L-乳酸生产

在实验室生物反应器(Biostat CT-DCU3，Braun，Germany)中批量培养上述C.sonorensis转化体247-5(35℃)和247-11(30℃)，工作体积为2L。培养基是补充了40g/L葡萄糖的YP培养基。使预培养物在YPD培养基上生长至OD₆₀₀为11-16，通过离心收集细胞并给该生物反应器接种直至OD₆₀₀为1。持续培养至至所有葡萄糖都被消耗。通过自动添加5M氢氧化钾(KOH)将pH维持在5.0+0.1。用5％的空气和95％的氮气以0.5L/分钟的流速冲洗生物反应器并以500rpm搅拌。用氧电极(Mettler Toledo)连续监测溶解氧浓度。

在培养期间取样。测定细胞干重，测定OD₆₀₀，离心收集细胞。如上所述通过HPLC分析培养上清中的乳酸、葡萄糖、乙醇和乙酸。这些结果见表36和37。

培养52-69小时后，所述转化体由葡萄糖产生了26-29g/L乳酸(当于67-72％的产率)。

这些结果证实，过表达瑞士乳杆菌乳酸脱氢酶基因的C.sonorensis能够在微需氧分批发酵条件下由葡萄糖产生乳酸。

表36：过表达瑞士乳杆菌LDH的C.sonorensis在含有YPD培养基和40g/L葡萄糖的生物反应器中进行两轮培养时的乳酸生产：发酵结束时(所有葡萄糖都被利用)的葡萄糖消耗量、乳酸浓度和乳酸产率

C.sonorensis转化体	起始生物质(细胞干重g/L)	发酵时间	葡萄糖用量(g/L)	L.A.(g/L)	L.A.产率(g L.A./g葡萄糖耗量)
						247-5	0.25	52小时	40.0	28.9	0.72
247-11	0.26	69小时	39.5	26.6	0.67

表37：过表达瑞士乳杆菌LDH的C.sonorensis在含有YPD培养基和40g/L葡萄糖的生物反应器中进行两轮培养时的乳酸生产：副产物浓度

C.sonorensis转化体	起始生物质(干重g/L)	发酵时间	最终生物质(干重g/L)	乙醇(g/L)	乙酸(g/L)	甘油(g/L)
							247-5	0.25	52小时	1.5	0.76	0.21	0
247-11	0.26	69小时	1.8	1.91	0.30	0

实施例26：使用含有整合入基因组的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis细胞在确定成分的木糖培养基上进行的L-乳酸生产

在YX-培养基(酵母氮基质，不含硫酸铵和氨基酸，补充了0.3％脲和5％木糖)中培养C.sonorensis细胞和上述公开的转化体(特别是246-1、246-10、247-2和247-5)。使预培养物在YPD培养基上生长，细胞通过离心收集并用YX-培养基洗涤一次，然后重悬于50mL YX培养基中直至OD₆₀₀为14-22，以进行培养实验。在100mL依式烧瓶中30℃以100rpm振荡培养酵母细胞。当pH达到约3.5时，加入0.2％固体碳酸钙。在培养期间取样。测定OD₆₀₀，离心收集细胞，如上所述通过HPLC分析培养上清。这些结果见表38。

培养71小时后，含有瑞士乳杆菌LDH的转化体由木糖产生了3.6-5.0g/L乳酸，相当于18-34％的产率；而C.sonorensis宿主没有产生可检测到的乳酸。在167小时的实验过程中，生物质的增加不到10％。这些转化体利用了10-30g/L木糖并产生了4-9g/L乳酸。转化体246-10和247-5将所用木糖的三分之一转化成了乳酸。

这些结果证实，过表达异源乳酸脱氢酶基因的C.sonorensis能够由木糖产生乳酸。

表38.C.sonorensis和瑞士乳杆菌LDH转化体在确定成分的木糖培养基上的OD₆₀₀、木糖残余和乳酸产量

菌株	1h	3h	24h	48h	71h	167h
							C.sonorensis，OD<sub>600</sub>	18.0	19.1	18.4	18.8	19.1	23.7
246-1，OD<sub>600</sub>	22.4	25.7	24.6	23.9	23.4	25.3
							247-2，OD<sub>600</sub>	20.5	21.2	21.3	21.7	18.8	23.2
246-10，OD<sub>600</sub>	19.5	19.3	17.3	18.8	18.4	16.2
							247-5，OD<sub>600</sub>	14.8	14.9	15.4	14.9	13.9	14.9
C.sonorensis，木糖g/L	45.00	43.99	40.32	34.95	26.79	7.22
							246-1，木糖g/L	42.67	42.56	40.53	35.43	29.79	13.15
247-2，木糖g/L	44.61	44.45	41.81	33.63	23.66	11.18
							246-10，木糖g/L	45.21	44.90	44.01	38.8	35.44	33.73
247-5，木糖g/L	45.31	44.74	42.94	37.81	30.34	17.75
							C.sonorensis，乳酸g/L	0	0	0	0	0	0
246-1，乳酸g/L	0.45	0.55	1.18	2.44	4.12	5.84
							247-2，乳酸g/L	0.00	0.10	1.16	3.01	4.09	6.42
246-10，乳酸g/L	0.30	0.40	0.95	2.18	3.55	4.12
							247-5，乳酸g/L	0.26	0.37	1.09	3.08	4.97	9.02
C.sonorensis，乳酸g/g DW	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
							246-1，乳酸g/g DW	0.07	0.07	0.16	0.34	0.59	0.77
247-2，乳酸g/g DW	0.00	0.02	0.18	0.46	0.72	0.92
							246-10，乳酸g/g DW	0.05	0.07	0.18	0.39	0.64	0.85
247-5，乳酸g/g DW	0.06	0.08	0.24	0.69	1.19	2.02

菌株	1h	3h	24h	48h	71h	167h
							C.sonorensis，乳酸g/所用木糖g	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
246-1，乳酸g/所用木糖g	0.14	0.16	0.21	0.23	0.25	0.18
							247-2，乳酸g/所用木糖g	0.00	0.06	0.28	0.24	0.18	0.18
246-10，乳酸g/所用木糖g	0.38	0.36	0.48	0.30	0.34	0.34
							247-5，乳酸g/所用木糖g	0.38	0.29	0.36	0.38	0.32	0.32

实施例27：使用含有整合入基因组的瑞士乳杆菌LDH基因的C.sonorensis细胞在确定成分的L-阿拉伯糖培养基上进行的L-乳酸生产

在YA-培养基(酵母氮基质，不含硫酸铵和氨基酸，补充了0.3％脲和2％L-阿拉伯糖)中培养C.sonorensis细胞和上述公开的转化体(特别是246-1、246-10、247-2和247-5)。使预培养物在YPD培养基上生长，细胞通过离心收集并用YA-培养基洗涤一次，然后重悬于50mL YA培养基中直至OD₆₀₀为14-20，以进行培养实验。在100mL依式烧瓶中30℃以100rpm振荡(微需氧条件)培养酵母细胞。当pH达到约3.5时，加入0.2％固体碳酸钙。在培养期间取样。测定OD₆₀₀，离心收集细胞，如上所述通过HPLC分析培养上清中的乳酸和木糖。这些结果见表39。

培养71小时后，含有瑞士乳杆菌LDH的转化体由阿拉伯糖产生了2.3-3.2g/L乳酸，相当于14-34％的产率；而对照菌株没有产生可检测到的乳酸。在167小时的实验过程中生物质增加了20-60％。这些转化体利用了最初提供的20g/L阿拉伯糖的几乎全部并产生了3.3-4.5g/L乳酸。转化体246-10和247-5将约20％的所用阿拉伯糖转化成了乳酸。

本实施例证实表达异源LDH基因的C.sonorensis能够由阿拉伯糖产生乳酸。

表39.C.sonorensis和瑞士乳杆菌LDH转化体在确定成分的阿拉伯糖培养基(OD₆₀₀)上的OD₆₀₀、木糖残余和乳酸产量

菌株	1h	3h	24h	48h	71h	167h
							C.sonorensis，OD<sub>600</sub>	18.2	19.0	19.0	20.7	22.1	29.2
246-1，OD<sub>600</sub>	19.7	22.2	22.6	29.5	23.2	31.2
							247-2，OD<sub>600</sub>	18.4	19.1	19.2	22.1	23	27.5
246-10，OD<sub>600</sub>	17.2	21.7	17.7	20.5	18.5	24.4
							247-5，OD<sub>600</sub>	14	14.5	13.9	14.2	14	18.2

菌株	1h	3h	24h	48h	71h	167h
							C.sonorensis，阿拉伯糖g/L	19.01	18.11	16.74	12.79	9.24	0
246-1，阿拉伯糖g/L	17.77	17.17	15.72	12.90	9.68	0
							247-2，阿拉伯糖g/L	19.20	19.11	16.40	11.72	5.78	0.58
246-10，阿拉伯糖g/L	18.09	18.24	17.05	13.72	10.73	0.32
							247-5，阿拉伯糖g/L	18.89	18.52	17.11	14.67	2.82	0
C.sonorensis，乳酸g/L	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.01
							246-1，乳酸g/L	0.44	0.52	0.78	1.54	2.50	3.54
247-2，乳酸g/L	0.00	0.00	0.43	1.64	2.31	3.28
							246-10，乳酸g/L	0.25	0.30	0.64	1.75	3.16	4.41
247-5，乳酸g/L	0.28	0.32	0.76	1.51	2.37	3.40
							C.sonorensis，乳酸g/g DW	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
246-1，乳酸g/gDW	0.07	0.08	0.11	0.17	0.36	0.38
							247-2，乳酸g/gDW	0.00	0.00	0.07	0.25	0.34	0.40
246-10，乳酸g/g DW	0.05	0.05	0.12	0.28	0.57	0.60
							247-5，乳酸g/g DW	0.07	0.07	0.18	0.36	0.57	0.62
C.sonorensis，乳酸g/所用阿拉伯糖g	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00
							246-1，乳酸g/所用阿拉伯糖g	0.20	0.18	0.18	0.22	0.24	0.18
247-2，乳酸g/所用阿拉伯糖g	0.00	0.00	0.12	0.20	0.16	0.17
							246-10，乳酸g/所用阿拉伯糖g	0.13	0.17	0.22	0.28	0.34	0.22
247-5，乳酸g/所用阿拉伯糖g	0.25	0.21	0.26	0.28	0.14	0.17

实施例28：使用含有整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH的菌株转化C.methanosorbosa并生产乳酸

用上述C.sonorensis载体pMI278转化C.methanosorbosa，以便生产乳酸。pMI278用SalT和NotI消化。按照实施例1所述的Gietz法(1992，NucleicAcids Res.20：1425)的改良法进行乙酸锂转化。C.methanosorbosa过夜培养直至OD₆₀₀＝0.9-1.1，离心收集细胞，先用过量的10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)溶液洗涤，然后用过量的100mM LiAc/10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)溶液洗涤，重悬于2mL 100mM LiAc/10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)中。将50μL细胞与10μg转化DNA和50μg加热变性的鲱精DNA混合。向细胞中加入300μL 40％PEG-4000溶于100mM LiAc/10mMTris-HCl、1mM EDTA(pH 7.5)所得的溶液，然后将细胞在30℃保温30分钟，同时缓慢振荡。随后加入DMSO(40μl)并将细胞在42℃水浴中保温15分钟。细胞通过离心收集，用过量的10mM Tris-HCl、1mM EDTA (pH 7.5)溶液洗涤，重悬于YPD中，30℃保温过夜。使细胞分散在含有200μg/mL G418的固体YPD培养基上，30℃保温3-5天。在新制的选择平板上将转化体划线两次。将转化体命名为Cm/278-1-Cm/278-74。

如下测试转化体产生L-乳酸的能力。将G418平板上的菌落接种在10mL塑料试管内的5mL YPD中，30℃以250rpm振荡保温过夜。离心除去细胞，用Boehringer Mannheim的L-乳酸UV法分析上清液中的L-乳酸。发现产生了2.3-4.3g/L的L-乳酸。酵母DNA经HindIII消化后，用巨大芽孢杆菌LDH基因作为探针进行Southern印迹分析，以此验证基因组中存在巨大芽孢杆菌LDH基因的单拷贝。

这些结果证实，巨大芽孢杆菌LDH能够在C.methanosorbosa中起作用并由葡萄糖产生乳酸。巨大芽孢杆菌LDH与能驱动C.methanosorbosa中异源基因表达的C.sonorensis PGK1启动子可操作连接。此外，与G418抗性基因可操作连接的C.sonorensis TDH1启动子也能在C.methanosorbosa中起作用。

实施例29：使用含有整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的C.methanosorbosa在不进行缓冲的丰富葡萄糖培养基中进行的L-乳酸生产

在YD-培养基(酵母氮基质，不含氨基酸，补充了5％葡萄糖和0.5MMES，pH5.5)中培养上述C.methanosorbosa转化体之一(Cm/278-1)。细胞通过离心收集并重悬于补充了5％葡萄糖的50mL YP中，直至OD₆₀₀为16。在250mL依式烧瓶中30℃以100rpm振荡培养酵母细胞。在培养期间取样，测定OD₆₀₀，离心收集细胞并分析培养上清中的L-乳酸(Boehringer Mannheim，Roche的L-乳酸UV法)、葡萄糖(Boehringer Mannheim，Roche的葡萄糖/GOD-Perid法)、乙酸(Boehringer Mannheim，Roche的乙酸UV法)和乙醇(Boehringer Mannheim，Roche的乙醇UV法)。这些结果见表40。

培养24小时后，转化体由葡萄糖产生了8.1g/L乳酸(相当于19％的产率)，pH降至3.5。

这些结果证实，过表达异源LDH的C.methanosorbosa在低pH下的丰富培养基上由葡萄糖产生了乳酸。

表40.菌株Cm/278-1的培养上清中的OD₆₀₀、残余葡萄糖、乳酸、乙醇和乙酸产量以及pH

	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h	144h
											OD<sub>600</sub>	16.0	17.9	18.5	18.7	22.3	17.3	17.3	16.8	26.4	17.0
葡萄糖	41.2	33.2	21.6	20.4	8.7	n.d.	0.6	0.0	0.0	0.0
											乳酸	0.2	2.9	4.5	6.7	8.1	5.8	5.6	6.9	6.4	5.6
乙醇	0.3	2.2	5.6	7.4	10.1	12.2	11.9	11.0	9.4	8.3
											pH	5.5	3.9	3.7	3.6	3.5	3.6	3.7	3.6	3.5	3.6
Acetate	0.1	0.2	0.7	0.9	2.3	3.5	4.1	4.2	3.9	3.8

葡萄糖、乳酸、乙醇和乙酸按g/L计。

实施例30：使用含有整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的C.methanosorbosa在CaCO₃缓冲的确定成分葡萄糖培养基中生产L-乳酸

在YD-培养基(不含氨基酸的补充了5％葡萄糖和0.5M MES的pH5.5的酵母氮基质)中培养上述经转化的C.methanosorbosa细胞(特别是转化体Cm/278-1和Cm/278-14)。细胞通过离心收集并重悬于50mL YD培养基(酵母氮基质，不含氨基酸，补充了10％葡萄糖)中直至OD₆₀₀为15，以便进行培养实验。在含有4g CaCO₃的250mL依式烧瓶中30℃以100rpm振荡培养酵母细胞。整个培养过程中培养基的pH为6.5。在培养期间取样，离心收集细胞，用HPLC分析培养上清中的乳酸、葡萄糖和乙醇，如上所述。这些结果见表41-44。

在培养96小时时转化体已经消耗葡萄糖并产生了63-65g/L乳酸(相当于63-64％的产率)和6.5-6.9g/L乙醇。截止到培养120小时时宿主菌株(Cm)已利用了全部葡萄糖并产生了23g/L乙醇，但未产生乳酸。

这些结果证实，过表达异源LDH基因的C.methanosorbosa细胞在中性pH的确定培养基中由葡萄糖产生了乳酸，得到了较高的乳酸滴度63-65g/L和产率63-64％。

表41.葡萄糖g/L

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										278-1	99.81	83.83	80.72	75.18	63.28	33.17	16.08	0.0	0.0
278-14	102.07	85.14	81.51	75.01	63.01	33.28	16.36	0.0	0.0
										Cm	89.18	87.29	79.69	72.78	60.28	36.40	22.56	2.11	0.0

表42.乳酸g/L

菌株

0h

4h

8h

12h

24h

48h

72h

96h

120h

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										278-1	0.25	1.77	4.19	6.86	13.24	33.34	53.18	63.22	59.54
278-14	0.25	2.31	4.59	7.00	13.41	35.49	54.38	64.98	64.60
										Cm	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.68	0.40	0.00

表43.乙醇g/L

菌株	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										278-1		0.62	1.45	2.07	3.13	4.53	6.17	6.51	4.18
278-14		1.11	1.68	2.12	2.36	4.58	6.16	6.91	5.71
										Cm	0.3	1.75	3.66	5.47	9.80	14.83	21.7	27.08	23.51

表44.乳酸g/所用葡萄糖g

	0h	4h	8h	12h	24h	48h	72h	96h	120h
										278-1	0.21	0.10	0.21	0.27	0.35	0.49	0.63	0.63	0.59
278-14	0.00	0.15	0.24	0.27	0.35	0.52	0.64	0.64	0.64
										Cm	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.00	0.01	0.00	0.00

实施例31：含有整合入基因组的巨大芽孢杆菌LDH基因的C.methanosorbosa在确定成分的葡萄糖培养基中的乳酸脱氢酶活性和丙酮酸脱羧酶活性以及L-乳酸生产

在50mL YD-培养基(酵母氮基质，补充了5％葡萄糖和0.5M MES，pH5.5)中培养上述C.methanosorbosa转化体(Cm/278-1和Cm/278-14)。在250mL依式烧瓶中30℃以250rpm振荡培养酵母细胞，直至OD₆₀₀为10。收集样品(2mL)，离心收集细胞。通过HPLC分析培养上清。

为了测定酶活性，用1mL冰冷的10mM K₂HPO₄/KH₂PO₄、2mMEDTA(pH 7.5)洗涤细胞沉淀。将洗涤过的沉淀重悬于0.5mL相同缓冲液中并储存在-70℃。使样品在室温解冻并用1mL超声处理缓冲液(100mMK₂HPO₄/KH₂PO₄、2mM MgCl₂、10mM DTT，pH 7.5)洗涤一次。将洗涤过的样品重悬于0.5mL超声处理缓冲液中并在Bead Beater匀浆器中用0.5mL玻璃珠匀浆1分钟。匀浆后，在4℃以14,000rpm将样品离心30分钟。收集上清液样品，如上述实施例18所述通过分光光度法(A₃₄₀)测定乳酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶活性。这些结果见表45。

在培养20小时后，转化体278-1和278-14分别产生了0.69和0.33g/L乳酸(相当于由葡萄糖得到了7和4％的产率)。此时，转化体278-1和278-14中乳酸脱氢酶活性分别为0.05和0.16U/mg总细胞蛋白，丙酮酸脱羧酶活性分别为0.71和0.53U/mg总细胞蛋白。

这些结果表明，在过表达异源LDH基因的C.metharnosorbosa细胞中检测到了乳酸脱氢酶活性，且证实这些细胞能够由葡萄糖生产乳酸。活性较低可归因于起始OD₆₀₀较低而通气较多(250rpm)，导致细胞生长占主导而仅产生少量乳酸。

表45.表达巨大芽孢杆菌LDH的C.methanosorbosa培养上清中的胞内LDH和PDC酶活性(U/mg总细胞蛋白)和残余葡萄糖、乳酸和乙醇(g/L)

菌株		LDHU/mg	PDC U/mg	葡萄糖g/L	乳酸g/L	乙醇g/L
							Cm/278-1	Cm/BmLDH	0.05	0.71	40.8	0.69	1.31
Cm/278-14	Cm/BmLDH	0.16	0.53	41.9	0.33	0.92

实施例32.含有整合入基因组的瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌LDH编码基因的C.sonorensis和含有整合入基因组的瑞士乳杆菌或巨大芽孢杆菌LDH编码基因的C.methanosorbosa在确定成分的木糖培养基中生产乳酸

C.sonorensis和C.methanosorbosa在经CaCO₃缓冲的确定成分培养基上培养，从木糖生产乳酸。分两步在葡萄糖或在木糖上产生细胞生物质，此后将它们转入含有木糖的生产培养基。

A)在葡萄糖上产生生物质和在木糖上产生乳酸

给5mL YP+5％葡萄糖培养基接种生长在YPD平板上的酵母菌落(菌株C40/288-34)。将该培养物在30℃以250rpm振荡保温过夜。在250mL依式烧瓶中的50mLYD-培养基(酵母氮基质，未添加氨基酸，补充了5％葡萄糖和0.5M MES，pH 5.5)中接种起始OD₆₀₀为0.1的培养物，并在30℃以250rpm振荡保温过夜，直到OD₆₀₀达到10。将细胞重悬于50mLYX-培养基(酵母氮基质，不含氨基酸，补充了5％木糖)中至OD₆₀₀为11-13。在含有2g CaCO₃的250mL依式烧瓶中30℃以100rpm振荡培养细胞。在培养期间取样。离心除去细胞，如上所述(实施例14)通过HPLC分析培养上清中的乳酸和木糖。进行两次独立的实验，结果见表46。

C.sonorensis转化体C40/288-34在7-8天内消耗了50g/L木糖并产生了13-16g/L乳酸，相当于由木糖得到了28-32％的乳酸产率。

表46.使用葡萄糖生长的细胞在经CaCO₃缓冲的确定成分培养基上培养时由木糖产生乳酸。在峰值乳酸浓度(168或198小时)计算产率。数据来自两次独立的实验。

菌株	基因型	时间h	木糖残量g/L	L.A.g/L	源自木糖的L.A.产量g/g
						40/288-34	2xLhLDH pdc1-pdc2-	168	0	13	0.28
C40/288-34	2xLhLDH pdc1-pdc2-	198	2.2	16	0.32

B)在木糖上产生生物质和在木糖上生产乳酸

使用含有巨大芽孢杆菌LDH的转化体265-55和265-44(C.sonorensis)，含有瑞士乳杆菌LDH的转化体C40/288-34、C40/288-36、257-3和246-27(C.sonorensis)，以及含有巨大芽孢杆菌LDH的Cm/278-1和Cm/278-42(C.methanosorbosa)。

在250mL振荡烧瓶内的50mL YP+5％木糖培养基中，接种生长在YP+2％木糖平板上的酵母菌落。将该培养物在30℃以250rpm振荡保温过夜，直到OD₆₀₀达到10，然后在250mL依式烧瓶中的50mL YX-培养基(酵母氮基质，未添加氨基酸，含有5％木糖和0.5M MES，pH 5.5)中接种起始OD₆₀₀为0.2的培养物。细胞在30℃以250rpm振荡过夜来保温，直到OD₆₀₀达到7-10。将细胞重悬在50mL YX-培养基(酵母氮基质，无氨基酸添加物，和5％木糖)中，直至OD₆₀₀为11-12。在含有2g CaCO₃的250mL依式烧瓶中30℃以250rpm振荡培养细胞。在培养期间取样。离心除去细胞，如上所述(实施例14)通过HPLC分析培养上清中的乳酸和木糖。结果见表47。

C.sonorensis LDH转化体一般在5-6天内消耗了50g/L木糖。在转入CaCO₃-缓冲的木糖培养基的4-5天后，测出了最大乳酸滴度，此时消耗了至少95％的木糖。产生的乳酸量为30-37g/L，相当于由木糖得到了63-76％的乳酸产率。

C.methanosorbosa LDH转化体一般在5-6天内消耗了50g/L木糖。在转入CaCO₃-缓冲的木糖培养基的4-5天后，测出了最大乳酸滴度，此时消耗了至少95％的木糖。转化体产生了8-14g/L乳酸，相当于由木糖得到了16-28％的乳酸产率。

表47.使用在木糖上生长的细胞在CaCO₃-缓冲的确定成分培养基上由木糖生产乳酸。在峰值乳酸浓度计算产率。

菌株	基因型	时间h	木糖残量g/L	L.A.g/L	源自木糖的L.A.产量g/g
						265-55	1xBmLDH PDC+	96	1.5	36	0.74
265-44	1xBmLDH PDC+	96	0.9	37	0.76
						C40/288-34	2xLhLDH pdc1-pdc2-	96	3.0	33	0.71
C40/288-36	2xLhLDH pdc1-PDC2+	96	1.9	36	0.76
						257-3	1xLhLDH pdc1-PDC2+	120	2.2	30	0.63
246-27	1xLhLDH PDC+	120	1.2	32	0.66
						C.sonorensis	PDC+	96	17.3	0	0.00
						Cm/278-1	1xBmLDH PDC+	120	1.2	14	0.28
Cm/278-42	1xBmLDH PDC+	96	1.8	8	0.16
						C.methanosorbosa	PDC+	96	1.6	0	0.00

本实施例证实，培养条件和接种史对由木糖生产乳酸具有主要影响。当在葡萄糖上生产生物质时，C.sonorensis LDH转化体C40/288-34在转入含有木糖的培养基后将木糖转化成乳酸，产率约为30％。与之相比，当在木糖上生产生物质时，相同的转化体在转入含有木糖的培养基后将木糖转化成乳酸的产率高得多(63-76％)。在乳酸生产条件下，生长在木糖上的生物质对木糖的消耗也快于生长在葡萄糖上的生物质。数据提示，当细胞“适应了”除葡萄糖以外的糖类、例如木糖时，通过在含有木糖的培养基中生长、此后将其转入含有木糖的乳酸生产培养基中，可以增加乳酸产率。

实施例33.在确定成分的葡萄糖培养基上由C.sonorensis生产L-乳酸，所述C.sonorensis含有缺失的pdc1基因和受损的pdc2基因并含有整合入基因组的瑞士乳杆菌LDH编码基因

如实施例19所述培养并测试C.sonorensis转化体257-3、C40/288-2、C40/288-34和C40/288-11(上述实施例13中所述)，但在乳酸生产阶段将细胞悬浮至OD₆₀₀＝18。如上所述分析培养上清中的乳酸、葡萄糖和乙醇。这些结果见表48。

pdc1-菌株257-3(其中pdc1缺失)在48小时后产生了89g/L乳酸，相当于由葡萄糖得到了93％产率(g/g)。pdc1-(缺失)pdc2-(其中pdc2受损)菌株C40/288-2、C40/288-34和C40/288-11在72小时后产生了86-87g/L乳酸，相当于由葡萄糖得到了89-90％产率(g/g)。在这些时间点处没有检测到乙醇。

表48.在消耗全部葡萄糖后，在经CaCO₃-缓冲并含有葡萄糖的确定成分培养基上获得的乳酸滴度和产率(最初96g/L)。

菌株	基因型	时间h	L.A.g/L	源自葡萄糖的L.A.产量g/g
					257-3	2xLhLDH pdc1-PDC2+	48	89	0.93
C40/288-2	2xLhLDH pdc1-pdc2-	72	87	0.90
					C40/288-34	2xLhLDH pdc1-pdc2-	72	86	0.90
C40/288-11	2xLhLDH pdc1-pdc2-	72	86	0.89

应理解尽管结合上述具体描述和实施例描述了本发明，但是它们用于解释而不用来限定由待批权利要求所定义的本发明的范围或实质。其它方面、优点和修改也属于权利要求的范围内。

序列表

<110>维尼特.拉杰加希亚(Rajgarhia，Vineet)

马加.伊尔门(Ilmen，Marja)

卡里.科伊武兰塔(Koivuranta，Kari)

默加.彭蒂拉(Penttila，Merja)

劳拉.劳霍南(Ruohonen，Laura)

皮尔科.斯沃米南(Suominen，Pirkko)

<120>用于在假丝酵母细胞中生产有机产物的方法和物质

<130>MBHB00-1237-D

<160>50

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G418抗性基因的引物

<400>1

ctagtctaga acaatgagcc atattcaacg ggaaacg       37

<210>2

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>G418抗性基因的引物(3′)

<400>2

cgcggatccg aattcttaga aaaactcatc gagcatcaaa tg 42

<210>3

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TDH1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>3

gcgatctcga gaaaatgtta ttataacact acac          34

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TDH1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>4

ctagtctaga tttgtttgat ttgtttgttt tgtttttgtt tg   42

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>5

gcgatctcga gaaagaaacg acccatccaa gtgatg          36

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>6

ctagtctaga tgtatatagt cttttctatt attag           35

<210>7

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>潮霉素抗性基因引物(大肠杆菌(E.coli))

<400>7

ccggactagt tggtacagag aacttgtaaa caattcgg        38

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>潮霉素抗性基因引物(大肠杆菌(E.coli))

<400>8

tataaatactta tcatttcc tcc                        23

<210>9

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>9

gggactagtg gatccttgaa gtgagtcagc cataaggact taaattcacc       50

<210>10

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>10

aaggccttgt cgacgcggcc gcttggttag aaaaggttgt gccaatttag cc    52

<210>11

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>11

gggacgggcc cgcggccgct acaagtgatt cattcattca ct              42

<210>12

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>12

ccctgggccc ctcgaggatg atttagcaag aataaattaa aatgg           45

<210>13

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC2启动子(C.sonorensis)的引物

<400>13

gggacgggcc cgcggccgct tacagcagca aacaagtgat gcc             43

<210>14

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC2启动子(C.sonorensis)的引物

<400>14

ccctgggccc ctcgagtttg atttatttgc tttgtaaaga gaa              43

<210>15

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC2终止子(C.sonorensis)的引物

<400>15

tggactagtt agatagcaat tcttacttga aaaattaatt gaagcattac c   51

<210>16

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC2终止子(C.sonorensis)的引物

<400>16

ggcccgcggc cgctaaatat aattatcgct tagttattaa aatgg         45

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TDH(啤酒糖酵母(S.cerevisiae))的引物

<400>17

tgtcatcact gctccatctt                                     20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TDH(啤酒糖酵母(S.cerevisiae))的引物

<400>18

ttaagccttg gcaacatatt                                     20

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1(白色假丝酵母(C.albicans))的引物

<400>19

gcgatctcga ggtcctagaa tatgtatact aatttgc             37

<210>20

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1(白色假丝酵母(C.albicans))的引物

<400>20

cgcgaattcc catggttagt ttttgttgga aagagcaac           39

<210>21

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>26 S rRNA(C.sonorensis)的引物

<400>21

tggactagta aaccaacagg gattgcctta gt                  32

<210>22

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>26 S rRNA(C.sonorensis)的引物

<400>22

ctagtctaga gatcattacg ccagcatcct agg                 33

<210>23

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于分离PDC的引物

<400>23

ccggaattcg atatctgggc wggkaatgcc aaygarttra atgc    44

<210>24

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于分离PDC的引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>n表示任何核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>n表示任何核苷酸

<400>24

cgcggattca ggcctcagta ngaraawgaa ccngtrttra artc    44

<210>25

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>酵母中保守的PDC区

<400>25

Trp Ala Gly Asn Ala Asn Glu Leu Asn Ala

1               5                   10

<210>26

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>酵母中保守的PDC区

<400>26

Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser

1               5                   10

<210>27

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ADH基因的引物

<400>27

tctgttmcct acrtaaga                                       18

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ADH基因的引物

<400>28

gtyggtggtc acgaaggtgc                                     20

<210>29

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>26 S rRNA(C.sonorensis)的引物

<400>29

tggactagta aaccaacagg gattgcctta gt                       32

<210>30

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>26 S rRNA(C.sonorensis)的引物

<400>30

ctagtctaga gatcattacg ccagcatcct agg                     33

<210>31

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1序列(白色假丝酵母(C.albicans))的引物

<400>31

gcgatctcga ggtcctagaa tatgtatact aatttgc                 37

<210>32

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1序列(白色假丝酵母(C.albicans))的引物

<400>32

acttggccat ggtgatagtt attcttctgc aattga                               36

<210>33

<211>1235

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>1,235kbp经NotI消化的片段，含有啤酒糖酵母(S.cerevisiae)PGK启动子，多克隆位点以及Ga110终止子

<400>33

ggccgcggat cgctcttccg ctatcgatta attttttttt ctttcctctt tttattaacc     60

ttaattttta ttttagattc ctgacttcaa ctcaagacgc acagatatta taacatctgc    120

acaataggca tttgcaagaa ttactcgtga gtaaggaaag agtgaggaac tatcgcatac    180

ctgcatttaa agatgccgat ttgggcgcga atcctttatt ttggcttcac cctcatacta    240

ttatcagggc cagaaaaagg aagtgtttcc ctccttcttg aattgatgtt accctcataa    300

agcacgtggc ctcttatcga gaaagaaatt accgtcgctc gtgatttgtt tgcaaaaaga    360

acaaaactga aaaaacccag acacgctcga cttcctgtct tcctattgat tgcagcttcc    420

aatttcgtca cacaacaagg tcctagcgac ggctcacagg ttttgtaaca agcaatcgaa    480

ggttctggaa tggcgggaaa gggtttagta ccacatgcta tgatgcccac tgtgatctcc    540

agagcaaagt tcgttcgatc gtactgttac tctctctctt tcaaacagaa ttgtccgaat    600

cgtgtgacaa caacagcctg ttctcacaca ctcttttctt ctaaccaagg gggtggttta    660

gtttagtaga acctcgtgaa acttacattt acatatatat aaacttgcat aaattggtca    720

atgcaagaaa tacatatttg gtcttttcta attcgtagtt tttcaagttc ttagatgctt    780

tctttttctc ttttttacag atcatcaagg aagtaattat ctacttttta caacaaatct    840

agaattcgga tccggtagat acattgatgc tatcaatcaa gagaactgga aagattgtgt    900

aaccttgaaa aacggtgaaa cttacgggtc caagaccctc tacagatttt cctgatttgc    960

cagcttacta tccttcttga aaatatgcac tctatatctt ttagttctta attgcaacac   1020

atagatttgc tgtataacga attttatgct attttttaaa tttggagttc agtgataaaa   1080

gtgtcacagc gaatttcctc acatgtagga ccgaattgtt tacaagttct ctgtaccacc   1140

atggagacat caaagattga aaatctatgg aaagatatgg acggtagcaa caagaatata   1200

gcacgagccg cggatttatt tcgttacgca tgcgc                             1235

<210>34

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于分离LDH(巨大芽孢杆菌(B.megaterium))的引物

<400>34

cctgagtcca cgtcattatt c                                              21

<210>35

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于分离LDH(巨大芽孢杆菌(B.megaterium))的引物

<400>35

tgaagctattt attcttgtt ac                                           22

<210>36

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引入限制性位点所用的引物

<400>36

gctctagatg aaaacacaat ttacacc                                      27

<210>37

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引入限制性位点所用的引物

<400>37

atggatcctt acacaaaagc tctgtcgc                                     28

<210>38

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于分离LDH(米根霉(R.oryzae))的引物

<400>38

ctttattttt ctttacaata taattc                                         26

<210>39

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于分离LDH(米根霉(R.oryzae))的引物

<400>39

actagcagtg caaaacatg                                                 19

<210>40

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引入限制性位点时所用的引物

<400>40

gctctagatg gtattacact caaaggtcg                                      29

<210>41

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引入限制性位点时所用的引物

<400>41

gctctagatc aacagctact tttagaaaag                                     30

<210>42

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>42

tggactagta catgcatgcg gtgagaaagt agaaagcaaa cattgtatat agtcttttct    60

attattag                                                             68

<210>43

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TDH1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>43

tggactagta catgcatgcg gtgagaaagt agaaagcaaa cattttgttt gatttgtttg     60

ttttgttttt gtttg                                                      75

<210>44

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PGK1启动子(C.sonorensis)的引物

<400>44

acttggccat ggtatatagt cttttctatt attag                                35

<210>45

<211>957

<212>DNA

<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(957)

<223>巨大芽孢杆菌(B.megaterium)LDH蛋白

<400>45

atg aaa aca caa ttt aca cca aaa aca cga aaa gtt gcc gtt atc gga       48

Met Lys Thr Gln Phe Thr Pro Lys Thr Arg Lys Val Ala Val Ile Gly

1               5                   10                  15

act ggt ttt gtt ggc tca agc tac gct ttt tca atg gtg aat caa ggt       96

Thr Gly Phe Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Met Val Asn Gln Gly

            20                  25                  30

att gcc aat gaa tta gtg tta atc gat atg aac aaa gaa aaa gca gaa      144

Ile Ala Asn Glu Leu Val Leu Ile Asp Met Asn Lys Glu Lys Ala Glu

        35                  40                  45

ggt gaa gca cgt gat atc aat cat gga atg cca ttt gcc aca ccg atg      192

Gly Glu Ala Arg Asp Ile Asn His Gly Met Pro Phe Ala Thr Pro Met

    50                  55                  60

aaa atc tgg gct gga gat tat aaa gac tgt gct gac gct gat tta gca      240

Lys Ile Trp Ala Gly Asp Tyr Lys Asp Cys Ala Asp Ala Asp Leu Ala

65                  70                  75                  80

gtt att aca gcg ggc gct aat caa gct cca ggg gaa aca cgc tta gat      288

Val Ile Thr Ala Gly Ala Asn Gln Ala Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

                85                  90                  95

cta gtt gaa aaa aac gtt aaa att ttc gaa tgc att gta aaa gat att      336

Leu Val Glu Lys Asn Val Lys Ile Phe Glu Cys Ile Val Lys Asp Ile

            100                 105                 110

atg aac agc gga ttt gac ggc atc att tta gtg gca aca aat cca gtt      384

Met Asn Ser Gly Phe Asp Gly Ile Ile Leu Val Ala Thr Asn Pro Val

        115                 120                 125

gat att ctc gca cac gtt aca caa aaa gta tca gga tta cca aac gga      432

Asp Ile Leu Ala His Val Thr Gln Lys Val Ser Gly Leu Pro Asn Gly

    130                 135                 140

cgg gta att ggt tca gga acg att ctt gac aca gct cgc ttc cgc tac      480

Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Tyr

145                 150                 155                 160

ttg tta agc gac tat ttc gaa gta gat tct cgc aac gtc cac gct tat      528

Leu Leu Ser Asp Tyr Phe Glu Val Asp Ser Arg Asn Val His Ala Tyr

                165                 170                 175

att atg ggg gaa cat gga gat acg gaa ttt cct gtt tgg agc cac gcg      576

Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala

            180                 185                 190

caa att ggc ggt gtg aag ctc gaa cat ttt atc aat act gcc gct att      624

Gln Ile Gly Gly Val Lys Leu Glu His Phe Ile Asn Thr Ala Ala Ile

        195                 200                 205

gaa aaa gaa ccg gat atg cag cat cta ttc gaa caa acc cgc gat gcg      672

Glu Lys Glu Pro Asp Met Gln His Leu Phe Glu Gln Thr Arg Asp Ala

    210                 215                 220

gct tac cat att att aat cga aaa gga gcg act tat tac gga att gca      720

Ala Tyr His Ile Ile Asn Arg Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala

225                 230                 235                 240

atg ggg ctt gta cgc att acc aag gct att tta gat gat gaa aat tct      768

Met Gly Leu Val Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asp Asp Glu Asn Ser

                245                 250                 255

att tta aca gta tct gct tta tta gaa gga caa tac ggt att tct gat      816

Ile Leu Thr Val Ser Ala Leu Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Ile Ser Asp

            260                 265                 270

gtg tat atc ggc gta cca gct atc att aat aaa aac ggc gtg cgt caa      864

Val Tyr Ile Gly Val Pro Ala Ile Ile Asn Lys Asn Gly Val Arg Gln

        275                 280                 285

att att gaa ttg aat tta act cct cac gaa cag cag cag ctc gag cac      912

Ile Ile Glu Leu Asn Leu Thr Pro His Glu Gln Gln Gln Leu Glu His

    290                 295                 300

tct gct agc att ctt aag caa act cgc gac aga gct ttt gtg taa          957

Ser Ala Ser Ile Leu Lys Gln Thr Arg Asp Arg Ala Phe Val

305                 310                 315

<210>46

<211>318

<212>PRT

<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400>46

Met Lys Thr Gln Phe Thr Pro Lys Thr Arg Lys Val Ala Val Ile Gly

1               5                   10                  15

Thr Gly Phe Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Met Val Asn Gln Gly

            20                  25                  30

Ile Ala Asn Glu Leu Val Leu Ile Asp Met Asn Lys Glu Lys Ala Glu

        35                  40                  45

Gly Glu Ala Arg Asp Ile Asn His Gly Met Pro Phe Ala Thr Pro Met

    50                  55                  60

Lys Ile Trp Ala Gly Asp Tyr Lys Asp Cys Ala Asp Ala Asp Leu Ala

65                  70                  75                  80

Val Ile Thr Ala Gly Ala Asn Gln Ala Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

                85                  90                  95

Leu Val Glu Lys Asn Val Lys Ile Phe Glu Cys Ile Val Lys Asp Ile

            100                 105                 110

Met Asn Ser Gly Phe Asp Gly Ile Ile Leu Val Ala Thr Asn Pro Val

        115                 120                 125

Asp Ile Leu Ala His Val Thr Gln Lys Val Ser Gly Leu Pro Asn Gly

    130                 135                 140

Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Tyr

145                 150                 155                 160

Leu Leu Ser Asp Tyr Phe Glu Val Asp Ser Arg Asn Val His Ala Tyr

                165                 170                 175

Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala

            180                 185                 190

Gln Ile Gly Gly Val Lys Leu Glu His Phe Ile Asn Thr Ala Ala Ile

        195                 200                 205

Glu Lys Glu Pro Asp Met Gln His Leu Phe Glu Gln Thr Arg Asp Ala

    210                 215                 220

Ala Tyr His Ile Ile Asn Arg Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala

225                 230                 235                 240

Met Gly Leu Val Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asp Asp Glu Asn Ser

                245                 250                 255

Ile Leu Thr Val Ser Ala Leu Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Ile Ser Asp

            260                 265                 270

Val Tyr Ile Gly Val Pro Ala Ile Ile Asn Lys Asn Gly Val Arg Gln

        275                 280                 285

Ile Ile Glu Leu Asn Leu Thr Pro His Glu Gln Gln Gln Leu Glu His

    290                 295                 300

Ser Ala Ser Ile Leu Lys Gln Thr Arg Asp Arg Ala Phe Val

305                 310                 315

<210>47

<211>963

<212>DNA

<213>米根霉(Rhizopus oryzae)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(963)

<223>米根霉(R.oryzae)LDH蛋白

<400>42

atg gta tta cac tca aag gtc gcc atc gtt gga gct ggt gca gta gga       48

Met Val Leu His Ser Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Ala Val Gly

1               5                   10                  15

gcc tcc act gct tat gca ctt atg ttt aaa aac att tgt aca gaa atc       96

Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Leu Met Phe Lys Asn Ile Cys Thr Glu Ile

            20                  25                  30

att att gtt gat gtt aat cct gac atc gtt caa gct caa gtc ctt gac      144

Ile Ile Val Asp Val Asn Pro Asp Ile Val Gln Ala Gln Val Leu Asp

        35                  40                  45

ctt gca gat gct gcc agt ata agt cac acg ccc atc cga gca ggt agc     192

Leu Ala Asp Ala Ala Ser Ile Ser His Thr Pro Ile Arg Ala Gly Ser

    50                  55                  60

gca gag gag gca ggg cag gca gat att gtt gtc atc acg gcc ggt gcg      240

Ala Glu Glu Ala Gly Gln Ala Asp Ile Val Val Ile Thr Ala Gly Ala

65                  70                  75                  80

aaa caa agg gaa ggt gag cct cgg aca aag ctc att gaa cga aac ttc      288

Lys Gln Arg Glu Gly Glu Pro Arg Thr Lys Leu Ile Glu Arg Asn Phe

                85                  90                  95

aga gtg ttg caa agt atc att ggt ggc atg caa ccc att cga cca gac      336

Arg Val Leu Gln Ser Ile Ile Gly Gly Met Gln Pro Ile Arg Pro Asp

            100                 105                 110

gca gtc atc ttg gtg gta gca aat cca gtc gat atc ttg aca cac att      384

Ala Val Ile Leu Val Val Ala Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr His Ile

        115                 120                 125

gca aag acc ctc tct gga ctg cct cca aac cag gtc att ggc tcc ggt      432

Ala Lys Thr Leu Ser Gly Leu Pro Pro Asn Gln Val Ile Gly Ser Gly

    130                 135                 140

acc tac ctt gac acg acc cgt ctt cgc gtc cat ctt ggc gat gtc ttt      480

Thr Tyr Leu Asp Thr Thr Arg Leu Arg Val His Leu Gly Asp Val Phe

145                 150                 155                 160

gat gtc aat cct caa tcg gtc cat gct ttt gtc ttg ggt gaa cat ggg      528

Asp Val Asn Pro Gln Ser Val His Ala Phe Val Leu Gly Glu His Gly

                165                 170                 175

gat tcc cag atg atc gct tgg gag gct gct tcg att ggt ggc cag ccg     576

Asp Ser Gln Met Ile Ala Trp Glu Ala Ala Ser Ile Gly Gly Gln Pro

            180                 185                 190

ttg aca agt ttc ccg gaa ttc gca aag ctg gat aaa aca gca att tca     624

Leu Thr Ser Phe Pro Glu Phe Ala Lys Leu Asp Lys Thr Ala Ile Ser

        195                 200                 205

aaa gcg ata tca ggt aaa gcg atg gag atc att cgt ttg aaa gga gcc     672

Lys Ala Ile Ser Gly Lys Ala Met Glu Ile Ile Arg Leu Lys Gly Ala

    210                 215                 220

acg ttt tat gga att ggt gcc tgt gca gcg gat tta gtg cac act atc     720

Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Ala Cys Ala Ala Asp Leu Val His Thr Ile

225                 230                 235                 240

atg ttg aat agg aaa tca gta cat cca gtt tct gtt tat gtt gaa aag     768

Met Leu Asn Arg Lys Ser Val His Pro Val Ser Val Tyr Val Glu Lys

                245                 250                 255

tat gga gcc act ttt tct atg cct gct aaa ctt gga tgg aga ggt gtt     816

Tyr Gly Ala Thr Phe Ser Met Pro Ala Lys Leu Gly Trp Arg Gly Val

            260                 265                 270

gaa cag atc tat gaa gta cca ctg acg gaa gaa gaa gaa gcg ttg ctt     864

Glu Gln Ile Tyr Glu Val Pro Leu Thr Glu Glu Glu Glu Ala Leu Leu

        275                 280                 285

gta aaa tct gta gag gca ttg aaa tca gtt gaa tat tca tct aca aaa     912

Val Lys Ser Val Glu Ala Leu Lys Ser Val Glu Tyr Ser Ser Thr Lys

    290                 295                 300

gtt cca gaa aaa aag gtt cat gct act tcc ttt tct aaa agt agc tgt     960

Val Pro Glu Lys Lys Val His Ala Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Cys

305                 310                 315                 320

tga                                                                 963

<210>48

<211>320

<212>PRT

<213>米根霉(Rhizopus oryzae)

<400>48

Met Val Leu His Ser Lys Val Ala Ile Val Gly Ala Gly Ala Val Gly

1               5                   10                  15

Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Leu Met Phe Lys Asn Ile Cys Thr Glu Ile

            20                  25                  30

Ile Ile Val Asp Val Asn Pro Asp Ile Val Gln Ala Gln Val Leu Asp

        35                  40                  45

Leu Ala Asp Ala Ala Ser Ile Ser His Thr Pro Ile Arg Ala Gly Ser

    50                  55                  60

Ala Glu Glu Ala Gly Gln Ala Asp Ile Val Val Ile Thr Ala Gly Ala

65                  70                  75                  80

Lys Gln Arg Glu Gly Glu Pro Arg Thr Lys Leu Ile Glu Arg Asn Phe

                85                  90                  95

Arg Val Leu Gln Ser Ile Ile Gly Gly Met Gln Pro Ile Arg Pro Asp

            100                 105                 110

Ala Val Ile Leu Val Val Ala Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr His Ile

        115                 120                 125

Ala Lys Thr Leu Ser Gly Leu Pro Pro Asn Gln Val Ile Gly Ser Gly

    130                 135                 140

Thr Tyr Leu Asp Thr Thr Arg Leu Arg Val His Leu Gly Asp Val Phe

145                 150                 155                 160

Asp Val Asn Pro Gln Ser Val His Ala Phe Val Leu Gly Glu His Gly

                165                 170                 175

Asp Ser Gln Met Ile Ala Trp Glu Ala Ala Ser Ile Gly Gly Gln Pro

            180                 185                 190

Leu Thr Ser Phe Pro Glu Phe Ala Lys Leu Asp Lys Thr Ala Ile Ser

        195                 200                 205

Lys Ala Ile Ser Gly Lys Ala Met Glu Ile Ile Arg Leu Lys Gly Ala

    210                 215                 220

Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Ala Cys Ala Ala Asp Leu Val His Thr Ile

225                 230                 235                 240

Met Leu Asn Arg Lys Ser Val His Pro Val Ser Val Tyr Val Glu Lys

                245                 250                 255

Tyr Gly Ala Thr Phe Ser Met Pro Ala Lys Leu Gly Trp Arg Gly Val

            260                 265                 270

Glu Gln Ile Tyr Glu Val Pro Leu Thr Glu Glu Glu Glu Ala Leu Leu

        275                 280                 285

Val Lys Ser Val Glu Ala Leu Lys Ser Val Glu Tyr Ser Ser Thr Lys

    290                 295                 300

Val Pro Glu Lys Lys Val His Ala Thr Ser Phe Ser Lys Ser Ser Cys

305                 310                 315                 320

<210>49

<211>972

<212>DNA

<213>瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(972)

<223>瑞士乳杆菌(L.helveticus)LDH蛋白.

<400>49

atg gca aga gag gaa aaa cct cgt aaa gtt att tta gtc ggt gat ggt       48

Met Ala Arg Glu Glu Lys Pro Arg Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly

1               5                   10                  15

gct gta ggt tct acc ttt gca ttt tca atg gta caa caa ggt atc gct       96

Ala Val Gly Ser Thr Phe Ala Phe Ser Met Val Gln Gln Gly Ile Ala

            20                  25                  30

gaa gaa tta ggt att atc gat atc gct aag gaa cac gtt gaa ggt gac      144

Glu Glu Leu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys Glu His Val Glu Gly Asp

        35                  40                  45

gca atc gat tta gct gac gca act cct tgg act tct cca aag aac att      192

Ala Ile Asp Leu Ala Asp Ala Thr Pro Trp Thr Ser Pro Lys Asn Ile

    50                  55                  60

tac gca gct gac tac cca gat tgt aag gat gct gac tta gtt gtt att      240

Tyr Ala Ala Asp Tyr Pro Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile

65                  70                  75                  80

act gct ggt gct cca caa aag cca ggc gaa act cgt ctt gat ctt gtt      288

Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val

                85                  90                  95

aac aag aac ttg aag att tta tca tca atc gtt gaa cca gtt gtt gaa      336

Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Ser Ser Ile Val Glu Pro Val Val Glu

            100                 105                 110

tca ggt ttt gaa ggt att ttc tta gta gtt gct aac cca gtt gat atc      384

Ser Gly Phe Glu Gly Ile Phe Leu Val Val Ala Asn Pro Val Asp Ile

       115                 120                 125

tta act cac gca act tgg aga atg tca ggc ttc cct aag gat cgt gtt      432

Leu Thr His Ala Thr Trp Arg Met Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val

    130                 135                 140

atc ggt tca ggt act tca ctt gat act ggt cgt ctt caa aaa gtt att      480

Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Gly Arg Leu Gln Lys Val Ile

145                 150                 155                 160

ggt aaa atg gaa aac gtt gac cca agt tca gtt aat gca tac atg ctt      528

Gly Lys Met Glu Asn Val Asp Pro Ser Ser Val Asn Ala Tyr Met Leu

                165                 170                 175

ggt gaa cac ggt gat act gaa ttc cca gca tgg agc tac aac aat gtt      576

Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Ala Trp Ser Tyr Asn Asn Val

            180                 185                 190

gct ggc gta aag gtt gct gac tgg gtt aag gct cac aac atg cct gaa      624

Ala Gly Val Lys Val Ala Asp Trp Val Lys Ala His Asn Met Pro Glu

        195                 200                 205

tct aag ctt gaa gac atc cac caa gaa gtt aag gac atg gct tac gac      672

Ser Lys Leu Glu Asp Ile His Gln Glu Val Lys Asp Met Ala Tyr Asp

    210                 215                 220

att att aac aag aaa ggt gct acc ttc tac ggt atc ggt act gct tca      720

Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Ser

225                 230                 235                 240

gca atg atc gct aag gct atc ttg aac gat gaa cac cgt gta ctt cca      768

Ala Met Ile Ala Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu His Arg Val Leu Pro

                245                 250                 255

ctt tca gta cca atg gat ggt gaa tat ggt tta cac gat ctt cac atc      816

Leu Ser Val Pro Met Asp Gly Glu Tyr Gly Leu His Asp Leu His Ile

            260                 265                 270

ggt act cct gca gtt gtt ggc cgc aag ggt ctt gaa caa gtt atc gaa      864

Gly Thr Pro Ala Val Val Gly Arg Lys Gly Leu Glu Gln Val Ile Glu

        275                 280                 285

atg cca tta agc gat aag gaa caa gaa tta atg act gct tca gca gat      912

Met Pro Leu Ser Asp Lys Glu Gln Glu Leu Met Thr Ala Ser Ala Asp

    290                 295                 300

caa tta aag aag gtt atg gac aag gcc ttc aaa gaa act ggc gtt aag      960

Gln Leu Lys Lys Val Met Asp Lys Ala Phe Lys Glu Thr Gly Val Lys

305                 310                 315                 320

gtt cgt caa taa                                                       972

Val Arg Gln

<210>50

<211>323

<212>PRT

<213>瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)

<400>50

Met Ala Arg Glu Glu Lys Pro Arg Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly

1               5                 10                 15

Ala Val Gly Ser Thr Phe Ala Phe Ser Met Val Gln Gln Gly Ile Ala

            20                  25                  30

Glu Glu Leu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys Glu His Val Glu Gly Asp

        35                  40                  45

Ala Ile Asp Leu Ala Asp Ala Thr Pro Trp Thr Ser Pro Lys Asn Ile

    50                  55                  60

Tyr Ala Ala Asp Tyr Pro Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile

65                  70                  75                  80

Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val

                85                  90                  95

Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Ser Ser Ile Val Glu Pro Val Val Glu

            100                 105                 110

Ser Gly Phe Glu Gly Ile Phe Leu Val Val Ala Asn Pro Val Asp Ile

                                        94

        115                 120                 125

Leu Thr His Ala Thr Trp Arg Met Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val

    130                 135                 140

Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Gly Arg Leu Gln Lys Val Ile

145                 150                 155                 160

Gly Lys Met Glu Asn Val Asp Pro Ser Ser Val Asn Ala Tyr Met Leu

                165                 170                 175

Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Ala Trp Ser Tyr Asn Asn Val

            180                 185                 190

Ala Gly Val Lys Val Ala Asp Trp Val Lys Ala His Asn Met Pro Glu

        195                 200                 205

Ser Lys Leu Glu Asp Ile His Gln Glu Val Lys Asp Met Ala Tyr Asp

    210                 215                 220

Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Ser

225                 230                 235                 240

Ala Met Ile Ala Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu His Arg Val Leu Pro

                245                 250                 255

Leu Ser Val Pro Met Asp Gly Glu Tyr Gly Leu His Asp Leu His Ile

            260                 265                 270

Gly Thr Pro Ala Val Val Gly Arg Lys Gly Leu Glu Gln Val Ile Glu

        275                 280                 285

Met Pro Leu Ser Asp Lys Glu Gln Glu Leu Met Thr Ala Ser Ala Asp

    290                 295                 300

Gln Leu Lys Lys Val Met Asp Lys Ala Phe Lys Glu Thr Gly Val Lys

305                 310                 315                 320

Val Arg Gln

Claims (36)

1.来自假丝酵母属的遗传修饰的细胞，包括至少一种外源LDH基因。

2.权利要求1所述的细胞，其中该细胞进一步表达降低的丙酮酸脱羧酶活性。

3.权利要求2所述的细胞，其中丙酮酸脱羧酶活性降低是因缺失了至少一种丙酮酸脱羧酶基因导致的。

4.权利要求2所述的细胞，其中丙酮酸脱羧酶活性降低是因至少一种丙酮酸脱羧酶基因的遗传破坏导致的。

5.权利要求1所述的细胞，为Candida sonorensis、近平滑假丝酵母、Candida naeodendra、Candida methanosorbosa、Candida entomophila、克鲁斯氏假丝酵母、布蓝克氏假丝酵母或迪丹氏假丝酵母的细胞。

6.权利要求1-5之一的来自假丝酵母属的细胞，该细胞包含重组表达构建体，所述重组表达构建体包含编码乳酸脱氢酶蛋白的核酸且该核酸与在所述细胞中起作用的启动子可操作地连接，其中所述细胞表达乳酸脱氢酶蛋白。

7.权利要求6所述的细胞，其中所述核苷酸序列编码来自巨大芽孢杆菌、和/或瑞士乳杆菌、和/或米根霉的乳酸脱氢酶蛋白。

8.权利要求6所述的细胞，其中所述重组核酸构建体进一步包括编码选择剂抗性的基因。

9.权利要求8所述的细胞，其中所述编码选择剂抗性的基因是细菌新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因或zeocin抗性基因。

10.权利要求6所述的细胞，其中所述重组核酸构建体进一步包括编码可加工除了单糖己糖以外的碳源的蛋白质的基因。

11.权利要求10所述的细胞，其中所述基因编码α-半乳糖苷酶。

12.权利要求11所述的细胞，其中所述基因是酵母MEL5。

13.权利要求6所述的细胞，其中所述启动子是来自假丝酵母属种类的细胞的启动子。

14.权利要求13所述的细胞，其中所述假丝酵母属种类是Candidasonorensis、近平滑假丝酵母、Candida naeodendra、Candida methanosorbosa、Candida entomophila、克鲁斯氏假丝酵母、布蓝克氏假丝酵母或迪丹氏假丝酵母。

15.权利要求6所述的细胞，其中所述启动子是来自非假丝酵母属种类的细胞的启动子。

16.权利要求1的假丝酵母属细胞，其含有pdc1基因座上的缺失、pdc2基因座上的受损，以及在细胞基因组中pdc1与pdc2各自基因座上的乳酸脱氢酶基因的两个或多个拷贝。

17.权利要求16所述的细胞，其中乳酸脱氢酶基因的两个或多个拷贝各自与在假丝酵母属细胞中具有转录活性的启动子可操作地连接。

18.权利要求1的假丝酵母属细胞，其经遗传修饰含有非功能性或缺失的pdc1或pdc2基因，其特征在于当在确定成分葡萄糖或丰富葡萄糖培养基中培养时，乙醇的产量至少减少了10倍。

19.权利要求18所述的细胞，其中乳酸脱氢酶与pdc1或pdc2启动子可操作地连接。

20.权利要求1所述的假丝酵母属细胞，其中该细胞具有比未转化的假丝酵母属细胞增加的乳酸脱氢酶活性。

21.乳酸的生产方法，包括下列步骤：

a)在使细胞增殖的条件下培养权利要求1-20之一的细胞；和

b)在含糖的营养培养基中发酵a)的细胞培养物，所用的条件导致由所述细胞将所述糖转化成乳酸的量与由未转化的假丝酵母属细胞将所述糖转化成乳酸的量相比得到增加。

22.权利要求21所述的方法，其中所述乳酸是L-乳酸。

23.权利要求21所述的方法，其中所述细胞是Candida sonorensis细胞。

24.权利要求23所述的方法，其中所述细胞包括来自瑞士乳杆菌、巨大芽孢杆菌或米根霉的至少一种乳酸脱氢酶基因或其组合。

25.权利要求21所述的方法，其中所述细胞是Candida methanosorbosa细胞。

26.权利要求25所述的方法，其中所述细胞包括来自瑞士乳杆菌、巨大芽孢杆菌或米根霉的至少一种乳酸脱氢酶基因或其组合。

27.权利要求21所述的方法，其中在属于缓冲培养基的培养基中培养所述细胞，其中该培养基经过缓冲可以将营养培养基中的pH维持在pH 5-pH9。

28.权利要求21所述的方法，其中在乳酸产生后培养基的最终pH为pH2.6-pH5。

29.权利要求21所述的方法，其中在含有不超过2％氧的空气环境中进行发酵步骤。

30.权利要求21所述的方法，其中在厌氧条件下进行所述的发酵步骤。

31.权利要求21所述的方法，其中营养培养基中的糖是一种或多种己糖类、一种或多种戊糖类或其组合。

32.权利要求21所述的方法，其中营养培养基中的糖是葡萄糖、木糖或L-阿拉伯糖或其组合。

33.权利要求32所述的方法，其中营养培养基中的糖是葡萄糖，其中相对于所述细胞消耗的葡萄糖量而言的乳酸产率按重量计至少为60％。

34.权利要求32所述的方法，其中营养培养基中的糖是木糖，其中相对于所述细胞消耗的木糖量而言的乳酸产率按重量计至少为15％。

35.权利要求32所述的方法，其中营养培养基中的糖是L-阿拉伯糖，其中相对于所述细胞消耗的L-阿拉伯糖量而言的乳酸产率按重量计至少为20％。

36.权利要求21所述的方法，其中假丝酵母属细胞是Candidadiddensiae、近平滑假丝酵母、Candida naeodendra、克鲁斯氏假丝酵母、布蓝克氏假丝酵母、Candida methanosorbosa或迪丹氏假丝酵母的细胞。

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