JP4649109B2 - カンジダ菌種の細胞における有機生成物の産生のための方法及び材料 - Google Patents

Description

本出願は、２０００年１１月２２日出願の米国特許仮出願番号第６０／２５２，５４１号に基づく優先権を主張する、２００１年１１月２３日出願の米国特許出願番号第０９／９９２，４３０号の一部継続出願である。

工業的に重要な有機生成物を合成するための微生物の使用は広く知られている。有機生成物を産生するための生合成アプローチは、大規模化学合成に比べて極めて効率的でありうる。有機生成物を製造するために生合成アプローチが化学合成アプローチに対して有しうる利点は、より迅速でより効率的な生成物収率、異性体純度及び低いコストを含む（Ｔｈｏｍａｓら、２００２、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２３８−４２参照）。

乳酸は、化学的処理及び合成、化粧品、薬剤、プラスチック、及び食品産生における使用を含む、幅広い工業上の適応性を持つ。乳酸は比較的単純な有機分子であり、化学合成によって又は微生物中での発酵（生合成）によって産生することができる。微生物の遺伝子操作がより一層進歩すると共に、乳酸産生のための発酵工程が化学合成よりも商業的に選択されるようになってきた。この選択の１つの理由は、遺伝的に修飾された微生物を使用することは光学的に純粋な（すなわちＬ（＋）又はＤ（−）異性体のいずれか）生成物の産生を可能にするということである。そのような方法は、ラセミ体混合物を分離する必要性を取り除き、それによってコストを低下させる。

それにもかかわらず、有機生成物を産生するための微生物の使用にはある種の制限がある。例えば、細菌は発酵条件下で大量の有機生成物を産生するが、細菌自体及び増殖培地中の有機生成物の蓄積は細菌の増殖を阻害する又は細胞死を引き起こすことがありうる。好酸性酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの、より丈夫な生物を構築して産生のために使用するときであってさえも、有機生成物は細胞増殖の抑制を導き、有機生成物の全体的収率を低下させうる。そこで、当技術分野では、バイオリアクターにおける使用のため、及び工業的に重要な有機生成物を産生するための他の生合成方法に関して、遺伝子操作しやすい強健な微生物の必要性が依然として存在する。

発明の概要
本発明は、生合成によって有機生成物を産生するための方法と試薬、特に細胞及び組換え細胞を提供する。本発明は特に、有機生成物の合成のために有用な少なくとも１つのタンパク質をコードする組換え核酸構築物、前記構築物を含む細胞、特にクラブトリー（Ｃｒａｂｔｒｅｅ）陰性細胞、そのような細胞を作製するための方法、そのような細胞を培養するための方法、及び数多くの有機生成物をインビボで合成するための方法と試薬を提供する。

１つの局面では、本発明は、有機生成物の合成のために有用な少なくとも１つのタンパク質をコードする配列を含む組換え核酸構築物を提供する。好ましい実施形態では、前記組換え核酸構築物は乳酸デヒドロゲナーゼをコードする。この局面の１つの実施形態では、前記組換え核酸構築物は、有機生成物の合成のために有用なタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、そのプロモーターは、カンジダ菌種、好ましくは前記組換え核酸構築物を含むカンジダ菌種からのプロモーターである。

もう１つの局面では、本発明は、有機生成物の合成のために有用な少なくとも１つのタンパク質をコードする組換え核酸構築物を含む、カンジダ属からの形質転換クラブトリー陰性細胞を提供する。好ましい実施形態では、前記組換え核酸構築物は乳酸デヒドロゲナーゼをコードする。この局面の１つの実施形態では、前記組換え核酸構築物は、有機生成物の合成のために有用なタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、そのプロモーターは、カンジダ菌種、好ましくは前記組換え核酸構築物を含むカンジダ菌種からのプロモーターである。もう１つの局面では、本発明は、ピルビン酸をエタノールに代謝する効率を低下させるように遺伝的に操作されたカンジダ菌種の細胞を提供する。本発明のこの局面の好ましい実施形態では、細胞は、有機生成物の合成のために有用な少なくとも１つのタンパク質をコードする本発明の組換え核酸構築物をさらに含む。好ましい実施形態では、前記組換え核酸構築物は乳酸デヒドロゲナーゼをコードする。この局面の１つの実施形態では、前記組換え核酸構築物は、有機生成物の合成のために有用なタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、そのプロモーターは、カンジダ菌種、好ましくは前記組換え核酸構築物を含むカンジダ菌種からのプロモーターである。

もう１つの局面では、本発明は、本発明の組換え核酸構築物を含むカンジダ属からのクラブトリー陰性細胞を、前記有機生成物の生合成を可能にする条件下で発酵させることを含む、有機生成物を産生するための方法を提供する。本発明のこの局面の好ましい実施形態では、前記有機生成物は乳酸である。好ましい実施形態では、前記組換え核酸構築物は乳酸デヒドロゲナーゼをコードする。この局面の１つの実施形態では、前記組換え核酸構築物は、有機生成物の合成のために有用なタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、そのプロモーターは、カンジダ菌種、好ましくは前記組換え核酸構築物を含むカンジダ菌種からのプロモーターである。

本明細書で提供される形質転換細胞が「クラブトリー陰性（Ｃｒａｂｔｒｅｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）」表現型を示すことは、本発明の１つの利点である。クラブトリー陰性生物は、増進する発酵状態へと誘導される能力を特徴とする。天然に生じる生物及び遺伝的に修飾された生物の両方が、クラブトリー陰性と特徴づけることができる。クラブトリー効果は、微生物を高濃度グルコース（例えば＞５ｍＭグルコース）の存在下において好気条件下で培養する場合において、微生物における酸素消費抑制と定義される。クラブトリー陽性生物は、グルコースの存在下で酸素のアベイラビリティーに関わりなく発酵（呼吸ではなく）し続けるが、クラブトリー陰性生物はグルコースを介した酸素消費の抑制を示さない。この特性は、細胞が、高い基質濃度で増殖するが酸化的リン酸化の有益なエネルギー効果を保持することを可能にするので、有機生成物合成のために有用である。多くの酵母及び真菌がクラブトリー陰性表現型を有しており、非限定的な例としてＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ属、及びカンジダ属を含む。

当技術分野では酵母及び二相性真菌として様々に特徴付けられているカンジダ菌種は、クラブトリー陰性表現型を示しうる（Ｆｒａｎｚｂｌａｕ ＆ Ｓｉｎｃｌａｉｒ，１９８３，Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉａ ８２：１８５−１９０）。一部の種は、グルコースならびに他の炭素源を発酵させることができ、高温（すなわち３７℃以上）で増殖することが可能であり、低ｐＨストレスに耐性でありうる。カンジダ種は、有機生成物製造の生合成方法において使用される生物の望ましい特性のいくつかを備える：遺伝子操作の受け入れやすさ、多様な炭素源を処理する能力、クラブトリー陰性表現型、及び様々な環境ストレスの下で増殖する能力。

本発明の特定の好ましい実施形態は、特定の好ましい実施形態についての下記のより詳細な説明及び特許請求の範囲より明らかになるであろう。

発明の詳細な説明
本明細書で使用する、「有機生成物（ｏｒｇａｎｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、炭素原子を含むあらゆる化合物である。有機生成物の非限定的な例は、カルボン酸塩（例えば乳酸塩、アクリル酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、オキサロ酢酸塩）、炭水化物（例えばＤ−キシロース）、アルジトール（例えばキシリトール、アラビトール、リビトール）、アミノ酸（例えばグリシン、トリプトファン、グルタミン酸）、脂質、エステル、ビタミン（例えばＬ−アスコルビン酸塩）、ポリオ−ル（例えばグリセロール、１，３−プロパンジオール、エリトリトール）、アルデヒド、アルケン、アルキン、及びラクトンを含む。従って、有機生成物は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の炭素原子を含みうる。さらに、有機生成物は、約１，０００ダルトン未満（例えば約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００又は１００ダルトン未満）である分子量を有しうる。例えば、Ｄ−キシロース（Ｃ_５Ｈ_１０Ｏ_５）は１５０ダルトンの分子量を有する有機生成物である。さらに、有機生成物は発酵生成物でありうる。

本明細書で使用する用語「発酵生成物（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、発酵工程によって産生されるあらゆる有機生成物を表す。一般に、発酵工程は、ＡＴＰの形態でエネルギーを産生する、有機化合物（例えば炭水化物）の、エチルアルコールなどの化合物への嫌気性酵素変換を含みうる。細胞発酵は、分子酸素ではなく有機生成物を電子受容体として使用するという点で細胞呼吸とは異なる。発酵生成物の非限定的な例は、酢酸塩、エタノール、酪酸塩及び乳酸塩である。

有機生成物はピルビン酸塩から誘導することもできる。本明細書で使用する「ピルビン酸塩由来生成物（ｐｙｒｕｖａｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、１５以下の酵素段階の中でピルビン酸塩から合成されるあらゆる化合物を表す。１つの酵素段階は、酵素活性を有する１つのポリペプチドによって触媒される何らかの化学反応又は一連の反応とみなされる。そのようなポリペプチドは、１又は複数の反応の完了時にそれ自体は破壊されずに又は変化せずに、他の物質の化学反応を触媒するあらゆるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸チオキナーゼ、コハク酸デビドロゲナーゼ、フマラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、２，５−ジオキソ吉草酸デヒドロゲナーゼ、５−デヒドロ−４−デオキシ−Ｄ−グルカレートデヒドロゲナーゼ、グルカレートデヒドラターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルクロノラクトンレダクターゼ、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−ペンタン酸アルドラーゼ、キシロン酸デヒドラターゼ、キシロノラクトナーゼ、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＣｏＡ−トランスフェラーゼ、アシルＣｏＡデヒドラターゼ、又はアクリリル−ＣｏＡヒドラターゼに関連する活性の非限定的な例を含む、あらゆるタイプの酵素活性を有しうる。

本発明のカルボキシレート生成物は、遊離酸又は塩の形態である可能性があり、交換可能に言及されうる（例えば「乳酸」又は「乳酸塩」）。特に異なる記載がない限り、いずれかの用語の使用は他方を包含するとみなされる。好ましい実施形態では、本発明は遊離酸形態のカルボキシレートを提供する。

用語「核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」又は「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を表す。この用語は、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンなどの（但しこれらに限定されない）、ＤＮＡ及びＲＮＡのあらゆる既知の塩基類似体から形成される分子を包含する。

用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に伝達するために使用されるあらゆる分子（例えば核酸、プラスミド又はウイルス）を表すために使用される。

用語「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞の形質転換に適しており、挿入した異種核酸配列の発現を指令する及び／又は制御する核酸配列を含むベクターを表す。発現は、転写、翻訳、及びイントロンが存在する場合はＲＮＡスプライシングなどの工程を含むが、これらに限定されない。

用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、本明細書では、配列が互いに連結されており、それらの通常の機能を果たすように配置又は構築されている、配列の配置を表すために使用される。従って、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された配列は、そのコード配列に隣接して、コード配列の複製及び／又は転写を生じさせうる。例えば、コード配列は、プロモーターがそのコード配列の転写を指令することができるとき、そのプロモーターに作動可能に連結されている。フランキング配列は、それが正しく機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。従って、例えば、介在非翻訳転写配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在することが可能であり、そのプロモーター配列は、それでもやはりコード配列に「作動可能に連結されている」とみなすことができる。

用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、核酸配列が導入された又は核酸配列で形質転換された、又は核酸配列で形質転換することができ、その後対象選択遺伝子を発現することができる、細胞を表すために使用される。この用語は、その子孫がもとの親と形態的に又は遺伝的形質において同一であるか否かに関わらず、親細胞の子孫を包含する。

本明細書で使用する用語「内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」は、外来性ではない、すなわちその細胞に導入されたのではないゲノム材料を表す。そのような内因性ゲノム材料は通常、生物、組織又は細胞内で発生し、組換え技術によって挿入又は修飾されない。内因性ゲノム材料は、天然に生じる変異体を包含する。

本明細書で使用する用語「外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」又は「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は、内因性でないゲノム材料、すなわちその細胞に導入された物質を表す。典型的には、そのような物質は組換え技術によって挿入又は修飾される。

本明細書で使用する用語「遺伝的に修飾された（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」は、そのゲノムが遺伝物質の付加、置換又は欠失という非限定的な例を含む方法によって修飾された生物を表す。そのような遺伝子操作の方法は当技術分野においてよく知られており、１個又は複数の個別ヌクレオチド残基の挿入、欠失及び置換を含むランダム突然変異誘発、点突然変異、ノックアウトテクノロジー、ならびに、安定な及び一過性の形質転換体の両方を含む、組換え技術を用いた核酸配列による生物の形質転換を含むが、これらに限定されない。

用語「嫌気性（ａｎａｅｒｏｂｉｃ）」及び「嫌気的条件（ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、溶液、典型的には培養培地中の溶解酸素の量が検出不能である（すなわち約０％）であるか、あるいは大気中の酸素の量が約０％から２％までであることを意味するとみなされる。

ベクター及び宿主細胞
対象有機生成物の合成のために有用なポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的な結合技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）を用いて適切なクローニング又は発現ベクターに挿入される。そのベクターは、典型的には使用する個々の宿主細胞において機能性である（すなわちそのベクターが、遺伝子の複製、増幅及び／又は発現が起こりうるように宿主細胞機構と適合性である）ように選択される。対象有機生成物の合成のために有用なポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、あらゆる適切な細胞中で増幅し、あらゆる宿主細胞において、最も好ましくはクラブトリー陰性宿主細胞において発現することができる。

好ましいクラブトリー陰性宿主細胞は、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ、Ｃ．ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｎａｅｏｄｅｎｄｒａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｂｌａｎｋｉｉ、及びＣ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａという非限定的な例を含む、カンジダ属からのものを含む。

フランキング配列（プロモーター及びターミネーターを含む）は、同種（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は菌株から）、異種（すなわち宿主細胞の種又は菌株以外の種から）、雑種（すなわち２つ以上のソースからのフランキング配列の組合せ）、又は合成である可能性があり、あるいはフランキング配列は、対象遺伝子の発現を調節するために正常に機能する天然配列でもよい。それ自体、フランキング配列のソースは、そのフランキング配列が宿主細胞機構において機能性であり、宿主細胞機構によって活性化されうることを条件として、いかなる原核又は真核生物、脊椎又は無脊椎生物、若しくは植物であってもよい。

本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当技術分野でよく知られているいくつかの方法のいずれかによって入手しうる。典型的には、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピングによって及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によってあらかじめ特定しておき、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて生物学的ソースから単離することができる。一部の例では、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知であることがある。そのような場合は、核酸合成又はクローニングのための、当業者によく知られた方法ならびに本明細書で述べる方法を用いて、そのフランキング配列を合成してもよい。

フランキング配列の全部又は一部だけが既知である場合は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのインビトロ増幅手法を用いて、及び／又はゲノムライブラリーを適切なオリゴヌクレオチド及び／又は同じか若しくは別の種からのフランキング配列フラグメントを用いてスクリーニングすることによって、完全な機能性フランキング配列を入手しうる。フランキング配列が既知でない場合は、フランキング配列を含有するＤＮＡのフラグメントを、例えばコード配列又は１個若しくは複数の別の遺伝子を含有しうる、より大きなＤＮＡの断片から単離しうる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適切なＤＮＡフラグメントを生成し、その後アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、又は当業者に既知の他の方法を用いて単離することによって実施しうる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者には容易に明白である。

選択マーカー遺伝子又はエレメントは、選択培地で増殖する宿主細胞の生存及び増殖のために必要なタンパク質をコードする。有用な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシンに対する耐性を宿主細胞に与える；（ｂ）Ｌｅｕ２欠損などの宿主細胞の栄養要求欠損を補う；又は（ｃ）天然培地からは得られない必須栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、ゼオシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子及びヒグロマイシン耐性遺伝子の非限定的な例を含む。

発現する遺伝子を増幅するために他の選択遺伝子を使用してもよい。増幅は、増殖にとって重要なタンパク質を産生するためにより需要の大きい遺伝子を、連続する世代の組換え細胞の染色体内で縦列反復する過程である。哺乳類細胞のための適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びプロモーターなしチミジンキナーゼを含む。哺乳類細胞形質転換体は、その形質転換体だけが、ベクター内に存在する選択遺伝子によって独自に生存に適応する、選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択物質の濃度を漸次上昇させ、それによって選択遺伝子と有機生成物を合成するために有用なポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換細胞を培養することによって課せられる。

本発明の発現及びクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、そして有機生成物を合成するために有用なポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結された、プロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の翻訳開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置する非転写配列（一般には約１００から１０００ｂｐ以内）であり、構造遺伝子の転写を制御する。プロモーターは慣例的に２つのクラスのいずれかに分類される：誘導的プロモーター及び構成的プロモーター。誘導的プロモーターは、栄養素の存在若しくは不存在又は温度変化などの培養条件の何らかの変化に応答して、それらの制御下でＤＮＡからの高いレベルの転写を開始させる。構成的プロモーターは、他方で、連続的な遺伝子産物の産生を開始させる；すなわち、遺伝子発現の調節はほとんど若しくは全く存在しない。様々な潜在的宿主細胞によって認識される、両方のプロモータータイプの数多くのプロモーターは、当技術分野においてよく知られている。適切なプロモーターは、制限酵素消化によってソースＤＮＡからそのプロモーターを取り出すことにより、又はインビトロ増幅によってプロモーターフラグメントを作製し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することにより、有機生成物を合成するために有用なポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結する。有機生成物を合成するために有用なポリペプチドをコードする核酸分子の増幅及び／又は発現を指令するために、天然プロモーター配列を使用してもよい。しかしながら、異種プロモーターが、天然プロモーターに比べてより大きな転写及び発現タンパク質のより高い収率を可能にし、且つ使用のために選択した宿主細胞系と適合性である場合には、異種プロモーターが好ましい。

酵母宿主細胞に関する使用のために適切なプロモーターもまた、当技術分野においてよく知られており、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースデヒドロゲナーゼ（ＴＤＨ）、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、及びアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を含む酵母遺伝子からのプロモーターの非限定的な例を含む。本発明の好ましいプロモーターは、ＰＧＫ及びＴＤＨプロモーターを含む。プロモーターに比較的近接して位置するときに発現を増加させる配列である酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に好都合に使用される。

細胞を形質転換する方法は当技術分野においてよく知られており、エレクトロポレーション法、及び塩化カルシウム又は酢酸リチウムに基づく形質転換法などの非限定的な例を含みうる。

本発明の実施例で開示するベクターのいくつかはこれまでに構築されており、ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４０４１号の出願において述べられている。簡単に述べると、ベクターｐＭＩ２３４、ｐＭＩ２３８、ｐＭＩ２４６、ｐＭＩ２４７、及びλファージ中のＰＤＣ２を次のように構築した。

Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ遺伝子の単離（λファージ中のＰＤＣ２）：Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ アクセッション番号３２１０９）を、Ｅａｓｙ ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＹＰＤ中で一晩増殖させた細胞から単離した。ＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分消化し、スクロース密度勾配遠心分離によってサイズ分別した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）。約２２ｋｂのＤＮＡフラグメントは、ＢａｍＨＩ消化し、ホスファターゼ処理したλファージＤＡＳＨ（商標）ベクターアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、そして連結混合物は、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてλファージ粒子に充填した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＲＡ Ｐ２に感染させるためにそのλファージ粒子を使用した。

ライブラリーからＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ遺伝子を単離するために使用するプローブは、Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＥＸＴポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、配列特異的プライマー、及び鋳型としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ又はＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓのゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ増幅によって、次のように調製した。

●Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＤＨ１遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド、ＴＧＴ ＣＡＴ ＣＡＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＴ（配列番号：１７）及びＴＴＡ ＡＧＣ ＣＴＴ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＴＡ ＴＴ（配列番号：１８）を使用して、ゲノムＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＤＮＡからのＴＤＨ遺伝子のフラグメントを増幅した。

●Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＰＧＫ１遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド、ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＴＣＣ ＴＡＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＣＴ ＡＡＴ ＴＴＧ Ｃ（配列番号：１９）及びＣＧＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＴＡ ＧＴＴ ＴＴＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＡＣ（配列番号：２０）を使用して、ゲノムＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＤＮＡからのＰＧＫ１遺伝子のフラグメントを増幅した。

●Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ２６Ｓ ｒＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチド、ＴＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＴＴ ＧＣＣ ＴＴＡ ＧＴ（配列番号：２１）及びＣＴＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＧＡ ＴＣＡ ＴＴＡ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＡＴ ＣＣＴ ＡＧＧ（配列番号：２２）を使用して、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡからの２６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子のフラグメントを増幅した。

●Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＣ１、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ ＰＤＣ１及びＰＤＣ２の間で保存されている、ピルビン酸デカルボキシラーゼアミノ酸配列の部分、ＷＡＧＮＡＮＥＬＮＡ（配列番号：２５）とＤＦＮＴＧＳＦＳＹＳ（配列番号：２６）、ならびにＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ＰＤＣ１及びＰＤＣ３の不完全な配列に基づき、オリゴヌクレオチド、ＣＣＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＴＧＧ ＧＣＷ ＧＧＫ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＡＹ ＧＡＲ ＴＴＲ ＡＡＴ ＧＣ（配列番号：２３）及びＣＧＣ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＣＴ ＣＡＧ ＴＡＮ ＧＡＲ ＡＡＷ ＧＡＡ ＣＣＮ ＧＴＲ ＴＴＲ ＡＡＲ ＴＣ（配列番号：２４）を設計した。これらのプライマーを使用して、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡからのＰＤＣ遺伝子のフラグメントを増幅した。これらのプライマーによるＰＣＲ反応は、ＰＤＣ１及びＰＤＣ２と称される、異なるヌクレオチド配列の２つのフラグメントを生成した。

●真菌アルコールデヒドロゲナーゼ配列において見られる保存領域に基づき、オリゴヌクレオチド、ＴＣＴＧＴＴＭＣＣＴＡＣＲＴＡＡＧＡ（配列番号：２７）及びＧＴＹＧＧＴＧＧＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧＣ（配列番号：２８）を設計した。これらのプライマーを使用して、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡからのＡＤＨ遺伝子のフラグメントを増幅した。これらのプライマーによるＰＣＲ反応は、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２及びＡＤＨ３と称される、異なるヌクレオチド配列の３つのフラグメントを生成した。

上述したように生成したＰＣＲフラグメントを用いてライブラリーをスクリーニングし、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて生成物を^３２Ｐ α−ｄＣＴＰで標識した。放射性プローブとのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬ ニシン精子ＤＮＡ、１μｇ／ｍＬ ポリＡ ＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩インキュベートすることによって実施した。ＴＤＨ１、ＰＧＫ１及びＰＤＣ１プローブについては、ハイブリダイゼーション後にフィルターを２×ＳＳＣの溶液中室温で５分間洗浄して繰り返し、次いで１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳの溶液中６８℃で３０分間の洗浄を２回反復した。ｒＤＮＡ及びＰＤＣ２プローブについてのハイブリダイゼーション後洗浄は、２×ＳＳＣ中室温で５分間を２回、次に０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中６８℃で３０分間の洗浄を２回実施した。

製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の指示に従って陽性プラークを単離し、精製した。ＤＮアーゼＩ処理を除くこと及びＰＥＧ６０００を用いて溶解宿主細胞から放出されたファージ粒子を沈殿させることによって修正した、従来の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）を使用して、バクテリオファージを精製した。次に前記ファージ粒子をＳＭ緩衝液に溶解し、クロロホルムで抽出して、Ｋｏｎｔｒｏｎ ＴＳＴ４１．１４ローターにおいて２５，０００ｒｐｍで２時間遠心分離してペレット化し、再びＳＭ緩衝液に溶解した。ファージ粒子をプロテイナーゼＫで消化し、次にフェノール抽出して、エタノール沈殿させることにより、λファージＤＮＡを単離した。

Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡ挿入物を、配列特異的プライマーを使用して部分的に配列決定した。既知の遺伝子又はタンパク質との相同性を使用して、ファージ挿入物によって全体的に又は部分的にコードされる遺伝子を特定するために、それらから推定したヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を配列データベースと比較した。得られた配列は、各々のクローンを単離するために使用されるプローブに依存して、真菌ｒＤＮＡ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、又はピルビン酸デカルボキシラーゼと有意の類似性を有していた。Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１、ＰＤＣ１及びＴＤＨ１の配列をコードするオープンリーディングフレームの開始点及び終止点をそれによって特定した。

（「基礎単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ−ｂｌｏｃｋ）」ベクター、ｐＭＩ２０３、ｐＭＩ２０５（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓについてのゼオシン耐性ベクター）、ｐＶＲ２４及びｐＶＲ２７）
実施例で述べるベクターの構築にこれらのプラスミドを使用し、またこれらはＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４０４１の中で記述されている。これらのベクターの構築を簡単に述べる。

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＴＥＦ１プロモーターの制御下にあるゼオシン耐性マーカーを含むプラスミドｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、相同的組換えの標的を提供するためにＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ｒＤＮＡフラグメントを付加することによって修飾した。Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ２６Ｓ ｒＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号Ｕ７０１８５）に対応する、下記のオリゴヌクレオチドプライマー：
ＴＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＡＡ ＣＣＡ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＴＴ ＧＣＣ ＴＴＡ ＧＴ（配列番号：２９）及び
ＣＴＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＧＡ ＴＣＡ ＴＴＡ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＡＴ ＣＣＴ ＡＧＧ（配列番号：３０）
を使用してＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡを増幅し、２６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅フラグメントを提供した。生じたＰＣＲ産物フラグメントを制限酵素ＳｐｅＩ及びＸｂａＩで消化し、ＸｂａＩで消化したｐＴＥＦ／Ｚｓｅｏプラスミドに連結した。生じたプラスミドをｐＭＩ２０３（図２３Ｂ）と称した。

ｐＭＩ２０３に含まれるＴＥＦ１プロモーターを、別のカンジダ菌種からの遺伝子のプロモーター、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＰＧＫ１プロモーターに置換した。入手可能なＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＰＧＫ１配列（Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号Ｕ２５１８０）に基づき、下記のオリゴヌクレオチドプライマー：
ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＧ ＴＣＣ ＴＡＧ ＡＡＴ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＣＴ ＡＡＴＴＴＧＣ（配列番号：３１）及び
ＡＣＴ ＴＧＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＡＧ ＴＴＡ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＧＣ ＡＡＴＴＧＡ（配列番号：３２）
を設計した。これらのプライマーを使用し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＰＧＫ１オープンリーディングフレームの上流領域からの７００ｂｐフラグメントを増幅した。フラグメントのクローニングを容易にするために、制限部位ＸｂａＩ及びＳｐｅＩ（前記の下線部）をプライマーに付加した。増幅後、フラグメントを単離し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化して、その後ＸｈｏＩ及びＮｃｏＩで消化したプラスミドｐＭＩ２０３に連結した。生じたプラスミドをｐＭＩ２０５（図２３Ｂ）と称した。

ｐＶＲ２４及びｐＶＲ２７：プラスミドｐＢＦＹ００４（所有者、ＮＲＥＬ）をＮｏｔＩ制限酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で消化して、１２３５ｂｐフラグメント（配列番号：３３）を結果として生成した。そのフラグメントを単離し、ＮｏｔＩ消化したｐＧＥＭ５ｚＦ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｒｔｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に連結した。大腸菌（ｔｏｐ１０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、標準エレクトロポレーション・プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、同上）を用いて、連結混合物で形質転換した。生じたプラスミドをｐＮＣ００２と称した。

ＬＤＨ遺伝子をコードする巨大菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＤＮＡを次のように単離した。巨大菌は、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手し（ＡＴＣＣ アクセッション番号６４５８）、標準条件下で増殖させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の「Ｅａｓｙ−ＤＮＡ」キットを使用し、製造者のプロトコールに従って、これらの細胞からゲノムＤＮＡを精製した。巨大菌からのＬ−ＬＤＨに関するＧｅｎｂａｎｋで入手可能な配列（Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号Ｍ２２３０５）に基づいて、プライマーを設計した。標準手法を用いてＰＣＲ増幅反応を実施し、各々の反応は、巨大菌ゲノムＤＮＡ（６ｎｇ／μＬ）、４つのｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、及び増幅プライマーＢＭ１２７０及びＢＭ１７９（各々１μＭ）を含んだ。プライマーは次の配列を有する：
ＢＭ１２７０ ＣＣＴＧＡＧＴＣＣＡＣＧＴＣＡＴＴＡＴＴＣ（配列番号：３４）及び
ＢＭ１７９ ＴＧＡＡＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＴＡＣ（配列番号：３５）。

反応は次の熱サイクリング条件に従って実施した：９５℃で１０分間の初期インキュベーション、次に９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間から成る３５サイクル。１１００塩基対（ｂｐ）の強い生成物フラグメントを従来の手順を用いてゲル精製し、クローン化して、配列決定した。生じた配列は、既知のＬ−ＬＤＨコード遺伝子と高い相同性を示すポリペプチドに翻訳することができた。

本明細書で開示する、巨大菌ＬＤＨコード遺伝子についてのコード配列を、どちらもＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母からの、ＰＧＫ１遺伝子からのプロモーター及びＧＡＬ１０遺伝子からの転写ターミネーターに作動可能に連結した。前記遺伝子のコード配列の両末端に制限部位を導入するために、この配列に基づいて２つのオリゴヌクレオチドプライマー、Ｂｍｅｇ５’及びＢｍｅｇ３’を設計した：
Ｂｍｅｇ５’ ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴＴＴＡＣＡＣＣ（配列番号：３６）及び
Ｂｍｅｇ３’ ＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＡＡＡＡＧＣＴＣＴＧＴＣＧＣ（配列番号：３７）。

この増幅反応は、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者から供給される緩衝液中で使用して、上述したｄＮＴＰ及びプライマー濃度を用いて実施した。熱サイクリングは、反応混合物を９５℃で３分間初期インキュベートし、次に９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の２０サイクル、その後７２℃で９分間の最終インキュベーションによって実施した。その生成物を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、その後プラスミドｐＮＣ００２のＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ部位に連結した。この連結により、巨大菌ＬＤＨコード配列に作動可能に連結されるＰＧＫプロモーター及びＧＡＬ１０ターミネーターが生成された（ｐＶＲ２４；図２１）。

Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨを含有するベクターを創造し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＧＫ１プロモーターの制御下で発現させるために、ｐＶＲ２７（図２２）の構築を行った。標準条件下で増殖させた細胞（ＡＴＣＣ アクセッション番号９３６３）から精製した（「Ｅａｓｙ−ＤＮＡ」キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲノムＤＮＡ由来のＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅから、ＬＤＨを単離した。Ｒ．ｏｒｙｚａｅからのＬＤＨに関するＧｅｎｂａｎｋで入手可能な配列（Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号ＡＦ２２６１５４）に基づいて、プライマーを設計した。標準手法を用いてＰＣＲ増幅反応を実施し、各々の反応は、Ｒ．ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡ（６ｎｇ／μＬ）、４つのｄＮＴＰの各々（０．２ｍＭ）、及び増幅プライマーＲａｌ−５’及びＲａｌ−３’の各々（１μＭ）を含んだ。増幅プライマーは次の配列を有した：
Ｒａｌ−５’ ＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＴＡＡＴＴＣ（配列番号：３８）及び
Ｒａｌ−３’ ＡＣＴＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＴＧ（配列番号：３９）。

反応は次のサイクリング条件に従って実施した：９５℃で１０分間の初期インキュベーション、次に９５℃で３０秒間、４１℃で３０秒間、７２℃で６０秒間から成る３５サイクル。１１００ｂｐの強い生成物フラグメントをゲル精製し、ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にてクローニングして、配列決定した。生じた配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおける既知のＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨコード遺伝子（アクセッション番号ＡＦ２２６１５４）と高い相同性を示すポリペプチドに翻訳することができた。

本明細書で開示する、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨコード遺伝子についてのコード配列を、どちらもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母からの、ＰＧＫ１遺伝子からのプロモーター及びＧＡＬ１０遺伝子からの転写ターミネーターに作動可能に連結した。この構築物を作製するときに、次のオリゴヌクレオチドを調製し、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ＬＤＨ挿入物を含むプラスミドからのコード配列を増幅するために使用した。前記遺伝子のコード配列の両末端に制限部位を導入するために、この配列に基づいて２つのオリゴヌクレオチドプライマー、Ｒａｐｇｋ５及びＰａｐｇｋ３’を設計した：
Ｒａｐｇｋ５ ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＧＧＴＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＴＣＧ（配列番号：４０）及び
Ｐａｐｇｋ３ ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＧ（配列番号：４１）。

この増幅反応は、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者から供給される緩衝液中で使用して、上述したｄＮＴＰ及びプライマー濃度を用いて実施した。熱サイクリングは、反応混合物を９５℃で３分間初期インキュベートし、次に９５℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で６０秒間の２０サイクル、その後７２℃で９分間の最終インキュベーションによって実施した。その生成物を制限酵素ＸｂａＩで消化し、その後プラスミドｐＮＣ００２のＸｂａＩ部位に連結した。

この連結により、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨコード配列に作動可能に連結されるＰＧＫプロモーター及びＧＡＬ１０ターミネーターが生成された（ｐＶＲ２７；図２２）。

ｐＭＩ２３４及びｐＭＩ２３８：Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体についての陽性選択を生じさせるために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５遺伝子（Ｎａｕｍｏｖら、１９９０、ＭＧＧ ２２４：１１９−１２８；Ｔｕｒａｋａｉｎｅｎら、１９９４、Ｙｅａｓｔ １０：１５５９−１５６８；Ｇｅｎｂａｎｋ アクセッション番号Ｚ３７５１１）を、プラスミドｐＭＥＬ５−３９からの２１６０ｂｐ ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩフラグメントとして入手し、ＥｃｏＲＩとＳｐｅＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結した。ＭＥＬ５遺伝子内のＥｃｏＲＩ部位はイニシエーターＡＴＧの５１０ｂｐ上流に位置し、ＳｐｅＩ部位はＭＥＬ５の終止コドンの２５０ｂｐ下流に位置する。生じたプラスミドをｐＭＩ２３３（図２３Ｃ）と称した。

Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓの１５００ｂｐ ＰＧＫ１プロモーターを、上記のように単離したＰＧＫ１λファージクローンからのＤＮＡを鋳型として使用して、次の配列：
ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＡＡ ＧＴＧ ＡＴＧ（配列番号：５）及び
ＴＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＴＧＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＧＡ ＡＡＧ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＡＴＡ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＡＧ（配列番号：４２）
を有するプライマーで増幅した。３’プライマーは、オープンリーディングフレームのすぐ上流のＰＧＫ１プロモーター内に存在するヌクレオチド及びＭＥＬ５オープンリーディングフレームの５’末端に対応するヌクレオチドに対応するので、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーターとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５との間の融合を作り出すことができる。生じた増幅フラグメントを制限酵素ＳｐｈＩとＸｈｏＩで消化し、ＳｐｈＩとＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＭＩ２３３（図２３Ｃ）に連結した。このプラスミド内に生じた構築物は、ＭＥＬ５オープンリーディングフレームの上流に位置し、ＭＥＬ５オープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーターを含み、図５においてｐＭＩ２３４として特定されている。

同様に、６５０ｂｐのＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーターは、上記のように単離したＴＤＨ１λファージクローンからのＤＮＡを鋳型として使用して、次の配列：
ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＡＣ ＡＣＴ ＡＣＡ Ｃ（配列番号：３）及び
ＴＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣＡ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＴＧＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＧＡ ＡＡＧ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＴＴＧ ＡＴＴ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＧＴ ＴＴＧ（配列番号：４３）
を有するプライマーで増幅した。３’プライマーは、オープンリーディングフレームのすぐ上流のＴＤＨ１プロモーター内に存在するヌクレオチド及びＭＥＬ５オープンリーディングフレームの５’末端に対応するヌクレオチドに対応するので、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーターとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５との間の融合を創造することができる。増幅したフラグメントをＳｐｈＩとＸｈｏＩで消化し、ＳｐｈＩとＸｈｏＩで消化したプラスミドｐＭＩ２３３（図２３Ｃ）に連結した。図６においてｐＭＩ２３８として特定される、生じたプラスミドは、ＭＥＬ５オープンリーディングフレームの上流に位置し、ＭＥＬ５オープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーターを含む。

ｐＭＩ２４６及びｐＭＩ２４７：プラスミドｐＭＩ２０５を使用して、選択マーカーとしてのＭＥＬ５遺伝子とＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおける乳酸の産生を可能にするためのＬＤＨ遺伝子とを含有するプラスミドを作製した。生じたプラスミドにおいて、ｐＭＩ２０５内のゼオシン耐性遺伝子をヘルベチカス菌（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）ＬＤＨ遺伝子に置換した。

ＬＤＨ遺伝子及びＣＹＣ１ターミネーターを含むｐＶＲ１の１３２９ｂｐ ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＭＩ２０５（図２３Ｂ）の３４１３ｂｐ ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに連結して、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子をＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＰＧＫ１プロモーターの制御下に置いた；生じたプラスミドをｐＭＩ２１４と称した。第二段階では、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ ＰＧＫ１プロモーターをＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーターに置換した。Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーターを、次の配列：
ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＡＡ ＧＴＧ ＡＴＧ（配列番号：５）及び
ＡＣＴ ＴＧＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＴＡＴ ＡＴＡ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＡＧ（配列番号：４４）
を有するプライマーを使用して、上述したような単離λファージクローンからの増幅によって単離し、そのＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＮｃｏＩで消化して、ＸｈｏＩとＮｃｏＩで消化したｐＭＩ２１４に連結した。このプラスミドをｐＭＩ２７７と称し、図１９に示している。

ｐＭＩ２２７からのＬＤＨ発現カセットとｐＭＩ２３４からのＭＥＬ５マーカーカセットは、ｐＭＩ２２７（図２３Ａ）の３３７７ｂｐ ＡｖｒＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントをＳｐｅＩ消化したｐＭＩ２３４（図２３Ｃ）と連結することによって同じベクター内に組み入れた。生じたプラスミドをｐＭＩ２４６と称し、図８に示している。

ｐＭＩ２２７からのＬＤＨ発現カセットとｐＭＩ２３８からのＭＥＬ５マーカーカセットは、ｐＭＩ２２７の３３７７ｂｐ ＡｖｒＩＩ−ＮｈｅＩフラグメントをＳｐｅＩ消化したｐＭＩ２３８と連結することによって同じベクター内に組み入れた。生じたプラスミドをｐＭＩ２４７と称し、図９に示している。

１つの実施形態では、本発明は、カンジダ属において機能性であるプロモーターに作動可能に連結された、有機生成物の生合成のために有用なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸構築物を提供する。

関連する実施形態では、そのヌクレオチド配列は乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする。好ましい実施形態では、前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、それが導入されるカンジダ酵母細胞にとって異種である。最も好ましい実施形態では、前記乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、例えば細菌又は真菌などの微生物からであり、本発明の方法に従って産生される有機生成物は乳酸（又は乳酸塩）である。

典型的には、乳酸を産生するための本発明の方法は、炭水化物基質がヘキソース、例えばグルコースであるとき、（産生される乳酸のグラム数／消費される炭水化物基質のグラム数 に基づき）約６０％又はそれ以上、好ましくは約７０％又はそれ以上、より好ましくは約８０％又はそれ以上、最も好ましくは約９０％又はそれ以上を産することができる。

乳酸を産生するための本発明の方法は、約７５ｇ／Ｌ又はそれ以上、好ましくは約９０ｇ／Ｌ又はそれ以上、最も好ましくは約１００ｇ／Ｌ又はそれ以上の乳酸力価を生じることができる。本発明の細胞は、グルコースなどのヘキソース炭水化物基質を産生のために使用するとき、約０．２０又はそれ以上、好ましくは約０．３０又はそれ以上、最も好ましくは約０．５０又はそれ以上の乳酸産生の特異的産生性（産生される乳酸のグラム数／時間当たりの乾燥細胞重量のグラム数 に関して）を有する。

１つの実施形態では、本発明のクラブトリー陰性細胞は、自然に又は遺伝的修飾により、デンプンを異化することができる。さらなる実施形態では、前記細胞を、真菌ベースのセルラーゼなどの分子の添加を通してセルロース類を異化するように遺伝的に修飾する。

関連する実施形態では、本発明の細胞は、グルコース又は他の単糖類ヘキソース以外の糖類、特にキシロース及びＬ−アラビノースの非限定的な例を含むペントースを代謝することができる。

本発明のクラブトリー陰性細胞は、好ましくはカンジダ菌株 Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ、Ｃ．ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｎａｅｏｄｅｎｄｒａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｂｌａｎｋｉｉ及びＣ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａから選択される。好ましい実施形態では、前記細胞はＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ及びＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ細胞である。

本発明の細胞によって産生される有機生成物を単離するための方法は、当技術分野においてよく知られている。特に、低ｐＨ発酵混合物を含む発酵混合物から乳酸を分離するための方法は、Ｅｙａｌら（１９９９年４月２２日公開の国際公開第ＷＯ９９／１９２９０号）によって開示されている。乳酸を単離するためのそのような方法は、抽出、吸着、蒸留／蒸発、膜を通しての分離、結晶化、及び相分割を含む。（Ｖｉｃｋｒｏｙ，１９８５，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｍｏｏ−Ｙｏｕｎｇ編集）、第３巻、３８章、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｄａｔｔａら、１９９５、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１６：２２１−２３１；米国特許第４，７７１，００１号；米国特許第５，１３２，４５６号；米国特許第５，５１０，５２６号；及び米国特許第５，４２０，３０４号も参照のこと）。

発酵条件
本発明の様々な局面に関して様々な発酵工程が使用できる（例えば、Ｗｏｌｆ，１９９６，Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ、及びＷａｌｋｅｒ，２０００、Ｙｅａｓｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ参照）。当業者は、発酵条件が、特定の宿主生物及び所望の生成物に依存して、（中でも特に）生成物の収率、培養の産生性、及び培養物の健康状態（ｃｕｌｔｕｒｅ ｈｅａｌｔｈ）を含む発酵の様々な局面を改善するように変化させうることを認識するであろう。発酵条件を調整する上でカンジダ菌種の良好な特性を利用することは特に好都合である。したがって、ｐＨは、処理の様々な段階において約２．５から約９．０までの範囲を有しうる。酸素レベルは、培地上方の大気中で測定される又は培地に溶解するものとして、約０％から約１００％まで（空気中で認められる酸素含量に対して）変化させうる。酸素レベルは、分圧、Ｏ_２電極、容積／容積、又はガス流速（ＶＶＭ）を含む一般的な方法によって測定又は算定することができる。温度範囲は、ほぼ室温（２３℃）から約４０℃及びそれ以上まで（例えば約４５℃まで）にわたりうる。

好ましい発酵条件は、約４から約５までのｐＨ範囲の維持を含む。バイオマス産生の間及び乳酸産生の間、約５のｐＨを維持することが特に好ましい。好ましくは、塩基、例えばＣａ（ＯＨ）_２の自動添加によって発酵工程全体を通じてそのｐＨを維持する。バイオマス産生の間の温度は、好ましくは約３５℃に維持する。好ましくは、乳酸産生のための適切な細胞量が達成されるまで、培養培地が好ましくは攪拌されて気流供給される好気的条件下でバイオマスを産生する。乳酸産生の間、攪拌速度及び気流は、好ましくはバイオマス産生中のそれらの速度に比べて緩やかである。

上記で詳述した好ましい条件下においてグルコース培地で、３つの異なる発酵槽培養から下記のデータを生成した。

下記の実施例は本発明の一部の実施形態を例示するためのものであり、下記の実施例によって本発明の範囲又は精神は限定されない。

実施例
実施例１：Ｇ４１８耐性ベクター及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体の選択のためのＧ４１８の使用
有機生成物の合成のために有用なタンパク質をコードする組換え核酸構築物を含む酵母細胞形質転換体の選択を可能にする、Ｇ４１８耐性を形質転換酵母細胞に付与するベクターを次のように調製した。Ｇ４１８耐性マーカーを、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１又はＴＤＨ１プロモーターのいずれかの転写制御下でクローン化し、それらの構築物をそれぞれｐＭＩ２６８（図２）及びｐＭＩ２６９（図３）と称した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーターを両方の場合に使用した。

Ｇ４１８耐性遺伝子を、次の配列：
ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡ ＡＣＡ ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＡＴ ＡＴＴ ＣＡＡ ＣＧＧ ＧＡＡ ＡＣＧ（Ｇ４１８ ５’；配列番号：１）及び
ＣＧＣ ＧＧＡＴＣＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＣＡＴ ＣＡＡ ＡＴＧ（Ｇ４１８ ３’；配列番号：２）
を有する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＥＸＴ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手）を鋳型として使用した。ＰＣＲは、反応混合物を９５℃で５分間初期インキュベートし、次に９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間の２９サイクル、その後７２℃で５分間の最終インキュベーションによって実施した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで消化し、８００ｂｐフラグメントを単離した。このフラグメントをｐＮＣ１０１（ＮＲＥＬのＥｒｉｃ Ｊａｒｖｉｓより入手）の４２２６ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントに連結した。プラスミドｐＮＣ１０１は、標準クローニング手法（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、同上）を用いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｐＰＧＫ）及びＧＡＬ１０ターミネーター配列から構築した。このプラスミドはまた、ＢａｍＨＩ部位と共に、酵母プロモーターとターミネーター配列との間に認められるポリリンカー領域内に含まれる、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩ部位との間に挿入されたＫ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓからのＬＤＨ遺伝子も含有する。このプラスミドは、前記酵母プロモーター及びターミネーターの制御下で、様々な遺伝子又は選択マーカーの発現を可能にする。

これらの操作から生じるプラスミドは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＧＫ１プロモーターとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーターとの間にＧ４１８耐性遺伝子を含み、これをｐＭＩ２６０と称した。このプラスミドの構造の概略を図１に示す。

Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓの６００ｂｐ ＴＤＨ１プロモーターは、ｐＭＩ２３８を鋳型として使用して（上記「ベクター及び宿主細胞」参照；図６に示されている）、次の配列：
ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＡ ＴＧＴ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＡＣ ＡＣＴ ＡＣＡ Ｃ（５４４１；配列番号：３）及び
ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴ ＴＧＴ ＴＴＧ ＡＴＴ ＴＧＴ ＴＴＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＴＴＴ ＴＧＴ ＴＴＧ（Ｃｓ１；配列番号：４）
を有する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＥＸＴ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、反応混合物を最初に９５℃で５分間インキュベートし、次に９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間の２９サイクル、及び７２℃で５分間の最終インキュベーションによって実施した。そのＰＣＲ産物を、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの各々で平滑末端にして、その後制限酵素ＸｂａＩで消化した。生じた６００ｂｐフラグメントをｐＭＩ２６０の４２１６ｂｐ ＰｓｔＩ（Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にした）−ＸｂａＩフラグメントに連結した。生じたプラスミドは、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーターに作動可能に連結されたＧ４１８耐性遺伝子を含み、これをｐＭＩ２６９と称した。このプラスミドの構造の概略を図３に示す。

１５００ｂｐのＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーターは、ｐＭＩ２３４を鋳型として使用して（上記「ベクター及び宿主細胞」参照；図５に示されている）、次の配列：
ＧＣＧ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＣＣ ＡＴＣ ＣＡＡ ＧＴＧ ＡＴＧ（５４２３；配列番号：５）及び
ＣＴＡ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＡＴＡ ＧＴＣ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＴＴ ＡＴＴ ＡＧ（Ｃｓ２；配列番号：６）
を有する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＥＸＴ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、反応混合物を最初に９５℃で５分間インキュベートし、次に９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間の２９サイクル、及び７２℃で１０分間の最終インキュベーションによって実施した。１５００ｂｐのＰＣＲ産物フラグメントを、クレノウポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの各々で平滑末端にして、その後制限酵素ＸｂａＩで消化した。その１５００ｂｐ ＰＧＫ１プロモーターフラグメントをｐＭＩ２６０の４２１６ｂｐ ＰｓｔＩ（Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にした）−ＸｂａＩフラグメントに連結した。生じたプラスミドは、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーターに作動可能に連結されたＧ４１８耐性遺伝子を含み、これをｐＭＩ２６８と称した。このプラスミドの構造の概略を図２に示す。

前記の２つの構築物ｐＭＩ２６８及びｐＭＩ２６９を制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化し、Ｇｉｅｔｚら（１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１４２５）に従った化学的方法を用いてＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓに形質転換した。この形質転換手法をこれらの実施例全体を通じて使用しており、下記のように簡単に説明する。

０．８−１．５のＯＤ_６００まで増殖させたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓの一晩培養物からの細胞を遠心分離によって収集し、最初に過剰の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液で洗浄し、次に過剰の１００ｍＭ酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液で洗浄して、その後１００ｍＭ ＬｉＡｃ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液２ｍＬに再懸濁した。細胞（２ｍＬ懸濁液を約５０μＬ）を、形質転換ＤＮＡを約１０μｇ及び４０％ＰＥＧ４０００、１００ｍＭ ＬｉＡｃ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液３００μＬと混合した。細胞を、緩やかに振とうしながら３０℃で３０分間インキュベートした。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；４０μＬ）を加え、細胞を４２℃の水浴中で１５分間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、過剰の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液で洗浄し、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン及び２０ｇ／Ｌグルコースを含む）に再懸濁して、３０℃で３−７時間インキュベートした。場合により、ＹＰＤインキュベーションは一晩継続しうる。

選択を適用する前に、細胞を液体ＹＰＤ中で少なくとも３時間又は一晩インキュベートした。形質転換体を、１００μｇ／ｍＬ又は２００μｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８抗生物質を添加したＹＰＤ寒天平板（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース及び２％寒天を含む）上で増殖させた。平板を３０℃で２−５日間インキュベートし、その後形質転換体を新鮮な選択平板に再び線条接種した。Ｇ４１８耐性コロニーから単離した全ＤＮＡのサザン分析は、Ｇ４１８耐性遺伝子が形質転換体のゲノムに組み込まれたことを示した。

これらの結果は、Ｇ４１８耐性遺伝子を本明細書で述べるように調製した構築物から発現できること、及びそれがＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換のための適切な選択であることを示した。

実施例２：ヒグロマイシン耐性（ｈｇｈ）ベクター及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体の選択のためのヒグロマイシンＢの使用
有機生成物の合成のために有用なタンパク質をコードする組換え核酸構築物を含む酵母細胞形質転換体の選択を可能にする、ヒグロマイシン耐性を形質転換酵母細胞に付与するベクターを次のように調製した。ヒグロマイシン耐性マーカー（大腸菌ｈｐｈ）を、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１及びＴＤＨ１プロモーターのいずれかの転写制御下でクローン化し、それらの構築物をそれぞれｐＭＩ２７０（図４）及びｐＭＩ２７１と称した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーターを両方の場合に使用した。

ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与する大腸菌ｈｐｈ遺伝子をプラスミドｐＲＬＭｅｘ３０（Ｍａｃｈら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２５，５６７−５７０）から得た。ｐＲＬＭｅｘ３０を制限酵素ＮｓｉＩで線状化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にして、その後ＸｂａＩで消化した。

実施例１で調製したｐＭＩ２６８プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、クレノウポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの各々で平滑末端にして、その後ＸｂａＩで消化した。生じた４９００ｂｐフラグメントをｐＲＬＭｅｘ３０の１０３５ｂｐ ｈｐｈフラグメントに連結した。この連結は、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーターに作動可能に連結されたヒグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを生成し、それをｐＭＩ２７０と命名した。このプラスミドの構造の概略を図４に示す。

実施例１で調製したｐＭＩ２６９プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、クレノウポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの各々で平滑末端にして、その後ＸｂａＩで消化した。生じた４０００ｂｐフラグメントをｐＲＬＭｅｘ３０の１０３５ｂｐ ｈｐｈフラグメントに連結した。これは、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーターに作動可能に連結されたヒグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを生成し、それをｐＭＩ２７１と命名した。このプラスミドの構造の概略を図７に示す。

酵母細胞を、上記実施例１で述べたようにＧｉｅｔｚら（１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１４２５）に従い、化学的方法を用いて形質転換した。２つの構築物ｐＭＩ２７０及びｐＭＩ２７１を制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで消化した。この形質転換混合物をＹＰＤ中３０℃で３時間インキュベートした後、選択平板に塗布した。形質転換体を、１５０−３００μｇ／ｍＬの濃度のヒグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加したＹＰＤ寒天平板上で２−５日間、３０℃で増殖させた。形質転換体を新鮮な選択平板に再び線条接種した。ヒグロマイシン耐性形質転換体のゲノム内に形質転換したＤＮＡが存在することを、次の配列：
ＣＣＧＧＡＣＴＡ ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＡＧ ＡＡＣ ＴＴＧ ＴＡＡ ＡＣＡ ＡＴＴ ＣＧＧ（ＳｃｅｒＧａｌ１０ｔ；配列番号：７）及び
ＴＡＴ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＴＡ ＴＣＡ ＴＴＴ ＣＣＴＣＣ（５４３６；配列番号：８）
を有する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって確認した。ＰＣＲは、最初に反応混合物を９４℃で３分間インキュベートし、次に９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間の２９サイクル、その後７２℃で１０分間の最終インキュベーションによって実施した。

これらの結果は、本明細書で述べる構築物を用いて大腸菌ｈｐｈ遺伝子を発現することができ、それがＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおいて機能すること、及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体を選択するためにヒグロマイシンＢを使用できることを示している。

実施例３：ヘルベチカス菌ＬＤＨの発現のため及びＰＤＣ１遺伝子座への形質転換ＤＮＡの標的組込みのためのベクター
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１遺伝子座への標的組込みのためのヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含むベクターを次のように調製した。ｐＭＩ２４６ベクターは、図８に概略図が示されている、ＭＥＬ５発現カセットとヘルベチカス菌ＬＤＨ発現カセットとを含む（上記「ベクター及び宿主細胞」参照）。Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１遺伝子座への標的組込み及びＰＤＣ１タンパク質コード領域の置換を可能にするベクターを構築するために、ＰＤＣ１タンパク質コード領域のすぐ上流及び下流の配列に対応するＤＮＡフラグメントをｐＭＩ２４６に付加した。

ＰＤＣ１ターミネーターは、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、次の配列：
ＧＧＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＧ ＡＡＧ ＴＧＡ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＡＡＧ ＧＡＣ ＴＴＡ ＡＡＴＴＣＡＣＣ（Ｃｓ７；配列番号：９）及び
ＡＡＧＧＣＣＴ ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＴＧ ＧＴＴ ＡＧＡ ＡＡＡ ＧＧＴ ＴＧＴ ＧＣＣ ＡＡＴ ＴＴＡ ＧＣＣ（Ｃｓ８；配列番号：１０）
を有するオリゴヌクレオチドプライマーを用い、Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＥＸＴ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、最初に反応混合物を９５℃で５分間インキュベートし、次に９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間の２９サイクル、その後７２℃で１０分間の最終インキュベーションによって実施した。９２０ｂｐのＰＣＲ産物フラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、その９２０ｂｐフラグメントを精製して、ｐＭＩ２４６からの８９００ｂｐ ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメントに連結した。生じたプラスミドをｐＭＩ２５６と命名し、図１８に概略図を示す。

ＰＤＣ１プロモーターは、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、次の配列：
ＧＧＧ ＡＣＧ ＧＧＣ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＡＡ ＧＴＧ ＡＴＴ ＣＡＴ ＴＣＡ ＴＴＣ ＡＣＴ（Ｃｓ５；配列番号：１１）及び
ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＧＡ ＴＧＡ ＴＴＴ ＡＧＣ ＡＡＧ ＡＡＴ ＡＡＡ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＧＧ（Ｃｓ６；配列番号：１２）
を有する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓから増幅した。ＰＣＲは、最初に反応混合物を９５℃で５分間インキュベートし、次に９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間の２９サイクル、その後７２℃で１０分間の最終インキュベーションによって実施した。ＰＣＲ産物フラグメントをＡｐａＩで消化し、その８００ｂｐフラグメントを精製して、９７６０ｂｐのＡｐａＩ線状化ｐＭＩ２５６に連結した（上記「ベクター及び宿主細胞」参照；図１８）。生じたプラスミドをｐＭＩ２５７と命名し、図１０に概略図を示す。ｐＭＩ２５７は、順に、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１プロモーター、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター、ヘルベチカス菌ＬＤＨに作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＹＣ１ターミネーター、次にＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１ターミネーターを含む。

ｐＭＩ２５７をＮｏｔＩで消化し、ＰＤＣ１ ５’側及び３’側領域に隣接されたＭＥＬ５及びＬＤＨ発現カセットを含む７３００ｂｐフラグメントを切り取った。この７３００ｂｐフラグメントを使用して、上記実施例１で述べた方法によってＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓを形質転換し、その形質転換体をＭＥＬ５マーカーの発現に基づいてスクリーニングした。形質転換体を、α−ガラクトシダーゼの色素産生基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−α−ｇａｌ；ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を４０μｇ／ｍＬの濃度で添加したＹＰＤ寒天平板上で増殖させた。平板を３０℃で１−３日間インキュベートし、その後４℃に移した。Ｘ−α−ｇａｌ酵母の存在下で、機能性ＭＥＬ５発現カセットで形質転換したコロニーは青色に変わったが、非形質転換コロニーは白色であった。青色コロニーを新鮮な指標平板に再び線条接種することによって精製した。ＮｏｔＩ消化したｐＭＩ２５７によるＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓの形質転換から生じる形質転換体を、２５７−１から２５７−１５、２５７−４１、２５７−４２及び２５７−４５と称した。

形質転換ｐＭＩ２５７ ＤＮＡによるＰＤＣ１オープンリーディングフレームの予想される置換が起こった形質転換体を特定するために、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１プローブを用いて、ｐＭＩ２５７形質転換体から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。形質転換体２５７−３、２５７−９、２５７−１２、２５７−１５及び２５７−４１においてＰＤＣ１ハイブリダイズバンドが存在しないことは、ＰＤＣ１遺伝子が欠失していることを示唆した。他のｐＭＩ２５７形質転換体及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓは、ＰＤＣ１ハイブリダイゼーションにおいて陽性シグナルを生じた。ヘルベチカス菌ＬＤＨプローブとのハイブリダイゼーションは、ＬＤＨ遺伝子がｐｄｃ１欠失体に１コピー存在することを示した。形質転換体２５７−６、２５７−７及び２５７−８は、ゲノム内にランダムに組み込まれたヘルベチカス菌ＬＤＨの２コピーを含んだ。他のｐＭＩ２５７形質転換体は、ゲノム内にランダムに組み込まれた１コピーのＬＤＨを有していた。

これらの結果は、ＰＤＣ１遺伝子座への形質転換ｐＭＩ２５７ ＤＮＡの標的組込みが、ＰＤＣ１プロモーターとターミネーター配列との間の相同的組換えを通して起こったことを示している。これらの結果はまた、ＰＤＣ１がＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおける単一コピー遺伝子であることも示している。加えて、ＰＤＣ１遺伝子座の外での組込み事象が起こった。一部の形質転換体では、ＬＤＨ遺伝子がゲノム内に１コピーより多く組み込まれた。

実施例４：巨大菌ＬＤＨの発現のため及びＰＤＣ１遺伝子座への形質転換ＤＮＡの標的組込みのためのベクター
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１遺伝子座への標的組込みのための巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含むベクターを次のように調製した。これらのベクターでは、ｐＭＩ２５７内のヘルベチカス菌ＬＤＨを巨大菌ＬＤＨに置換した。

ｐＭＩ２５７をＮｃｏＩで線状化し、５’突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの混合物で部分充填し、ｄＧＴＰはこの反応から省いた。これに続いて、マングビーンヌクレアーゼでの処理によって一本鎖延長部（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）を除去した。次にそのＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、９２００ｂｐフラグメントを電気泳動分離後に０．８％アガロースゲルから単離した。巨大菌ＬＤＨを含むベクターｐＶＲ２４を巨大菌ゲノムＤＮＡから生成し、図２１に示している。ＬＤＨ遺伝子を、アクセッション番号Ｍ２２３０５から設計したプライマーを使用したＰＣＲによってゲノムＤＮＡからクローン化し、市販のベクターに連結した（上記「ベクター及び宿主細胞」参照）。巨大菌ＬＤＨを含む９７６ｂｐフラグメントをＸｂａＩ消化によってｐＶＲ２４から切り出し、次いで５’突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、及び４つのｄＮＴＰの各々によって充填して、ＢａｍＨＩで消化した。ｐＭＩ２５７からの９２００ｂｐ ＮｃｏＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩフラグメントとｐＶＲ２４からの９７６ｂｐ ＸｂａＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩフラグメントを連結して、生じたプラスミドをｐＭＩ２６５と称し、図１１に示している。ｐＭＩ２６５は、順に、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１プロモーター、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター、巨大菌ＬＤＨに作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１ターミネーターを含む。ｐＭＩ２６５をＮｏｔＩで消化し、ＰＤＣ１ ５’側及び３’側領域に隣接されたＭＥＬ５及びＬＤＨ発現カセットから成る７３００ｂｐフラグメントを切り出した。この７３００ｂｐフラグメントを使用して、実施例１で述べたようにＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓを形質転換し、その形質転換体を、４０μｇ／ｍＬの濃度のＸ−α−ｇａｌを添加したＹＰＤ平板上でスクリーニングした。形質転換体は、Ｘ−α−ｇａｌ（４０μｇ／ｍＬ）を添加したＹＰＤ寒天平板上で増殖させた。ＮｏｔＩ消化したｐＭＩ２６５によるＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓの形質転換から生じる形質転換体を、２６５−１から２６５−６０までと称した。

形質転換ｐＭＩ２６５ ＤＮＡによるＰＤＣ１オープンリーディングフレームの予想される置換が起こった形質転換体を特定するために、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１プローブを用いて、ｐＭＩ２６５形質転換体から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。形質転換体２６５−５、２６５−７、２６５−１５、２６５−１７、２６５−３３、２６５−３４、２６５−３５、２６５−３８、２６５−３９、２６５−４２、２６５−４３、２６５−４７、２６５−４８、２６５−４９、２６５−５１及び２６５−６０においてＰＤＣ１ハイブリダイズバンドが存在しないことは、ＰＤＣ１遺伝子が欠失していることを示唆した。他のｐＭＩ２６５形質転換体及び非形質転換Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓは、ＰＤＣ１ハイブリダイゼーションに関して陽性シグナルを生じた。巨大菌ＬＤＨプローブとのハイブリダイゼーションは、ＬＤＨ遺伝子がｐｄｃ１欠失体に１コピー存在することを示した。ＰＤＣ１ハイブリダイズ陽性形質転換体２６５−１４、２６５−２２及び２６５−２３は、そのゲノム内にランダムに組み込まれたＬＤＨ遺伝子の２コピーを含み、２６５−５６は３コピーを含んだ。他のｐＭＩ２６５形質転換体は、ゲノム内にランダムに組み込まれた１コピーのＬＤＨを有していた。

これらの結果は、ＰＤＣ１遺伝子座への形質転換ｐＭＩ２６５ ＤＮＡの標的組込みが、ＰＤＣ１プロモーターとターミネーター配列との間の相同的組換えを通して起こったことを示した。これらの結果はまた、ＰＤＣ１がＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおける単一コピー遺伝子であることを確認した。ｐｄｃ１を欠失した形質転換体は生存可能であり、これは、ＰＤＣ１がＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおける必須遺伝子ではないことを示唆した。ＰＤＣ１欠失組込みに加えて、ある形質転換体ではＰＤＣ１遺伝子座の外で組込み事象が起こった。一部の形質転換体では、ＬＤＨ遺伝子がゲノム内に１コピーより多く組み込まれた。

実施例５：Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨの発現のため及びＰＤＣ１遺伝子座への形質転換ＤＮＡの標的組込みのためのベクター
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１遺伝子座への標的組込みのためのＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含むベクターを次のように調製した。これらのベクターでは、ｐＭＩ２５７内のヘルベチカス菌ＬＤＨコード配列をＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨに置換した。

上記実施例３で述べたｐＭＩ２５７プラスミドをＮｃｏＩで線状化し、５’突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの混合物で部分充填し、ｄＧＴＰはこの反応から省いた。これに続いて、マングビーンヌクレアーゼでの処理によって一本鎖延長部を除去した。次にそのＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、９２００ｂｐフラグメントを電気泳動分離後に０．８％アガロースゲルから単離した。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨをコードするＤＮＡのコード配列は、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１遺伝子の転写ターミネーターに作動可能に連結した。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨを含むベクターｐＶＲ２７をＲ．ｏｒｙｚａｅゲノムＤＮＡから生成し、図２２に示している。ＬＤＨ遺伝子を、アクセッション番号ＡＦ２２６１５４から設計したプライマーを使用したＰＣＲによってゲノムＤＮＡからクローン化し、市販のベクターに連結した（上記「ベクター及び宿主細胞」参照）。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨを含む９７８ｂｐフラグメントをＸｂａＩ消化によってｐＶＲ２７から切り出し、次いで５’突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、及び４つのｄＮＴＰの各々によって充填して、ＢａｍＨＩで消化した。ｐＭＩ２５７からの９２００ｂｐ ＮｃｏＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩフラグメントとｐＶＲ２７からの９７８ｂｐ ＸｂａＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩフラグメントを連結して、生じたプラスミドをｐＭＩ２６６と称し、図１２に概略図を示す。ｐＭＩ２６６は、順に、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１プロモーター、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ Ａに作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１ターミネーターを含む。ｐＭＩ２６６をＮｏｔＩで消化し、ＰＤＣ１ ５’側及び３’側領域に隣接されたＭＥＬ５及びＬＤＨ発現カセットから成る７３００ｂｐフラグメントを切り出した。この７３００ｂｐフラグメントを使用して、上記実施例１で述べた方法によってＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓを形質転換し、その形質転換体を、４０μｇ／ｍＬの濃度のＸ−α−ｇａｌを添加したＹＰＤ平板上でスクリーニングした。ＮｏｔＩ消化したｐＭＩ２６６によるＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓの形質転換から生じる形質転換体を、２６６−１から２６６−１３までと称した。

形質転換ｐＭＩ２６６ ＤＮＡによるＰＤＣ１オープンリーディングフレームの予想される置換が起こった形質転換体を特定するために、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１プローブを用いて、ｐＭＩ２６６形質転換体から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。形質転換体２６６−１、２６６−３、２６６−４及び２６６−１１においてＰＤＣ１ハイブリダイズバンドが存在しないことは、ＰＤＣ１遺伝子が欠失していることを示唆した。これに対し、ｐＭＩ２６６形質転換体２６６−２、２６６−７及び２６６−８、及び非形質転換Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓは、ＰＤＣ１ハイブリダイゼーションにおいて陽性シグナルを生じた。ＬＤＨプローブとのハイブリダイゼーションは、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子がすべての形質転換体に１コピー存在することを示した。

これらの結果は、ＰＤＣ１遺伝子座への形質転換ｐＭＩ２６６ ＤＮＡの標的組込みが、ＰＤＣ１プロモーターとターミネーター配列との間の相同的組換えを通して起こったことを示した。さらに、ＰＤＣ１遺伝子座の外での組込み事象が起こった。

実施例６：ＬＤＨを含まないＰＤＣ１の置換のためのベクター
外来性ＬＤＨコード配列を導入せずにＰＤＣ１を置換するためのベクターを調製した。ＬＤＨ遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＹＣ１ターミネーターを除去するために、上記実施例３で述べたｐＭＩ２５７プラスミドをＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化した。５’突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、及び４つのｄＮＴＰの各々によって充填した。その９２００ｂｐフラグメントをアガロースゲル電気泳動後に精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）４００Ｕ及び製造者が推奨する適切な緩衝液の存在下において４０ｎｇ／μＬの濃度でのインキュベーションによって再環状化させた。生じたプラスミドをｐＭＩ２６７と称し、図１３に概略図を示す。ｐＭＩ２６７は、順に、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１プロモーター、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター、及びＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１ターミネーターを含む。

ｐＭＩ２６７をＮｏｔＩで消化し、ＰＤＣ１ ５’側及び３’側領域に隣接されたＭＥＬ５カセットから成る６３００ｂｐフラグメントを切り出した。この６３００ｂｐフラグメントを使用して、上記実施例１で述べた方法によってＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓを形質転換し、その形質転換体を、４０μｇ／ｍＬの濃度のＸ−α−ｇａｌを添加したＹＰＤ平板上でスクリーニングした。ＮｏｔＩ消化したｐＭＩ２６７によるＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓの形質転換から生じる形質転換体を、２６７−１から２６７−１０までと称した。

ＰＤＣ１オープンリーディングフレームが欠失された形質転換体を特定するために、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ１プローブを用いて、ｐＭＩ２６７形質転換体から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。形質転換体２６７−１及び２６７−１０においてＰＤＣ１ハイブリダイズバンドが存在しないことは、ＰＤＣ１遺伝子が欠失していることを示唆した。

これらの結果は、ＰＤＣ１遺伝子座への形質転換ｐＭＩ２６７ ＤＮＡの標的組込みが、ＰＤＣ１プロモーターとターミネーター配列との間の相同的組換えを通して起こったことを示した。ＬＤＨの発現は、ｐｄｃ１欠失菌株の生存能力を維持するために必要ではなかった。さらに、ＰＤＣ１遺伝子座の外での組込み事象が起こった。

実施例７：巨大菌ＬＤＨ遺伝子及びＧ４１８マーカーを含むＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓベクターの構築
Ｇ４１８耐性遺伝子及び巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含むベクターを次のように調製した。これらのベクターでは、プラスミドｐＭＩ２６５からの巨大菌ＬＤＨ発現カセットとプラスミドｐＭＩ２６９からのＧ４１８耐性マーカーカセットとを同じベクター内で組み合わせた。実施例１で述べたｐＭＩ２６９プラスミドはＥｃｏＲＩで消化し、５’突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、及び４つのｄＮＴＰの各々によって充填して、その後前記ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した。ｐＭＩ２６９の４８００ｂｐ ＥｃｏＲＩ（平滑末端）−ＢａｍＨＩフラグメントを、実施例４で述べたｐＭＩ２６５プラスミドからの２８００ｂｐ ＭｓｃＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと連結した。生じたプラスミドをｐＭＩ２７８と命名し、これは、順に、Ｇ４１８耐性遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーター及びＭＥＬ５ターミネーター、次に巨大菌ＬＤＨに作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーターを含み、図１４に概略図を示している。

実施例８：Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨと巨大菌ＬＤＨを同時に発現するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ菌株の構築
Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨがｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれた、２６６−３と称するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体を、上記実施例４で述べた巨大菌ＬＤＨ構築物による第二の形質転換のための宿主として選択した。形質転換体２６６−３を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ消化したｐＭＩ２７８でさらに形質転換し、その形質転換体を、２００μｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８抗生物質を添加したＹＰＤ寒天平板上で選択した。平板を選択のために３０℃で２−５日間インキュベートした；形質転換体を新鮮な選択平板に再び線条接種することによって精製した。生じた形質転換体を２７８−１から２７８−２０までと称した。これらの形質転換体のうち１９のゲノム内に巨大菌ＬＤＨが存在することは、巨大菌ＬＤＨ遺伝子をプローブとして使用して、ＨｉｎｄＩＩＩ消化した酵母ＤＮＡのサザンブロット分析によって確認した。形質転換体の一部は、ゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨの１コピーより多くを有していた。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子をプローブとしてサザンブロット分析を反復し、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨがまだ存在することを確認した。

この実験は、種々のマーカーを用いてＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓを独立して多重形質転換できることを示した。このようにして、宿主ゲノム内の対象遺伝子（ＬＤＨ）のコピー数を増加させることが可能であることが明らかになった。

実施例９：巨大菌ＬＤＨの発現のため及びＰＤＣ２遺伝子座への形質転換ＤＮＡの標的組込みのためのベクター
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２遺伝子座への標的組込みのための巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含むベクターを次のように調製した。Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２プロモーターを、Ｄｙｎａｚｙｍｅ ＥＸＴ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び次の配列：
ＧＧＧ ＡＣＧ ＧＧＣ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＴ ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＡＡＣ ＡＡＧ ＴＧＡＴＧＣＣ（Ｃｓ２６；配列番号１３）及び
ＣＣＣ ＴＧＧ ＧＣＣ ＣＣＴ ＣＧＡ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＴＧＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＡＡＧＡＧＡＡ（Ｃｓ２７；配列番号１４）
を有する１対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。ラムダベクターにクローニングしたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２のゲノムコピーを鋳型として使用した（上記参照）。ＰＣＲは、最初に反応混合物を９４℃で３分間インキュベートし、次に９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間の２９サイクル、その後７２℃で１０分間の最終インキュベーションによって実施した。１０００ｂｐのＰＣＲ産物をＴＯＰＯ ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、生じたプラスミドをＰＭＩ２７７と称し、図１９に概略図を示している。ＰＤＣ２プロモーターをＥｃｏＲＩ消化によって遊離し、クレノウポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの各々で平滑末端にした。

実施例７で述べたように調製したｐＭＩ２７８プラスミドをＳａｌＩで線状化し、５’突出末端をクレノウポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの各々によって充填して、その後ｐＭＩ２７７プラスミドの１０００ｂｐ ＥｃｏＲＩ（平滑末端）フラグメントに連結した。所望の方向に挿入物を含むプラスミドをｐＭＩ２７９と命名し、図２０に概略図を示している。

ＰＤＣ２ターミネーターを、ラムダベクターにクローニングしたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２遺伝子のゲノムコピーを鋳型として使用して、次の配列：
ＴＧＧＡＣＴＡＧＴＴＡＧＡＴＡＧ ＣＡＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＡ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＣＡ ＴＴＡＣＣ（Ｃｓ２９；配列番号１５）及び
ＧＧＣ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＴＡ ＡＴＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＴＡＧ ＴＴＡ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＧＧ（Ｃｓ３０；配列番号１６）
を有する１対のオリゴヌクレオチドプライマーとＤｙｎａｚｙｍｅ ＥＸＴ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲによって増幅した。ｐｄｃ２ターミネーターフラグメントは、２３９個のＣ末端アミノ酸に対応するオープンリーディンフレームの部分を含む。ターミネーターフラグメント内の最後の２３９個のＣ末端アミノ酸タンパク質に対応するヌクレオチドの上流の３つのフレームすべてにおいて、ＰＣＲオリゴヌクレオチドＣｓ２９に翻訳終止コドンを導入した。ＰＣＲは、最初に反応混合物を９４℃で３分間インキュベートし、次に９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間の２９サイクル、その後７２℃で１０分間の最終インキュベーションによって実施した。ＰＣＲ産物をクレノウポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰの各々によって平滑末端にし、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。そのＰＣＲ産物を、標準条件下で（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上、参照）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び１ｍＭの濃度のｒＡＴＰでリン酸化した。８００ｂｐのＰＤＣ２ターミネーターフラグメントを、アガロースゲル電気泳動後に精製し、仔ウシ腸ホスファターゼで脱リン酸化したＮｃｏＩ（平滑末端）消化ｐＭＩ２７９に連結した。生じたプラスミドをｐＭＩ２８６と命名し、このプラスミドは、順に、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２プロモーター、Ｇ４１８耐性遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５ターミネーター、巨大菌ＬＤＨ遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１０ターミネーター、次にＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２ターミネーターを含む。この構築物の概略を図１５に示す。

ｐＭＩ２８６プラスミドをＮｏｔＩで消化し、ＰＤＣ２ ５’側及び３’側領域に隣接されたＧ４１８耐性及びＬＤＨ発現カセットから成る６４００ｂｐフラグメントを切り出した。この６４００ｂｐフラグメントを使用して、上記実施例１で述べた方法によってＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓを形質転換した。その形質転換体を、２００μｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８抗生物質を添加したＹＰＤ寒天平板上で増殖させた。平板を３０℃で２−５日間インキュベートし、その後形質転換体を新鮮な選択平板に再び線条接種した。それらの形質転換体を２８６−１から２８６−４０までと称した。

巨大菌ＬＤＨがＰＤＣ２遺伝子座に組み込まれた形質転換体を特定するために、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２プローブ（欠失領域のヌクレオチドに対応する）を用いて、ｐＭＩ２８６形質転換体から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。形質転換体２８６−１、２８６−２、２８６−４、２８６−１９及び２８６−３０においてＰＤＣ２ハイブリダイズバンドが存在しないことは、ＰＤＣ２遺伝子が欠失していることを示唆した。他のｐＭＩ２８６形質転換体及び非形質転換Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓは、ＰＤＣ２ハイブリダイゼーションにおいて陽性シグナルを生じた。巨大菌ＬＤＨプローブとのハイブリダイゼーションは、ＬＤＨがｐｄｃ２欠失体に１コピー存在することを示した。ＰＤＣ２遺伝子座へ標的組込みの頻度は１５％であった。

これらの結果は、ＰＤＣ２遺伝子座への形質転換ｐＭＩ２８６ ＤＮＡの標的組込みが、ＰＤＣ２プロモーターとＰＤＣ２ターミネーター配列との間の相同的組換えを通して起こることを示した。これらの結果はまた、ＰＤＣ２がＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおける単一コピー遺伝子であることを示している。さらに、ＰＤＣ２の外での組込み事象が起こった。一部の形質転換体では、ＬＤＨ遺伝子がゲノム内に１コピーより多く組み込まれた。

実施例１０：ｐｄｃ１を欠失し、ｐｄｃ２を破壊され、ｐｄｃ１及びｐｄｃ２遺伝子座にゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨの２コピーを含有する、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ菌株の構築
ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨを有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体２６５−１５を、巨大菌ＬＤＨによる第二の形質転換のための宿主として選択した。形質転換体２６５−１５を、上記実施例１で述べた方法を用いて、ＮｏｔＩ消化したｐＭＩ２８６でさらに形質転換し、その形質転換体を、２００μｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８抗生物質を添加したＹＰＤ寒天平板上で選択した。平板を選択のために３０℃で２−５日間インキュベートし、それによって得た形質転換体を、新鮮な選択平板に再び線条接種することによって精製した。それらの形質転換体をＣ４４／２８６−１からＣ４４／２８６−４０までと称した。

ＰＤＣ２プローブ（欠失領域内のヌクレオチドに対応する）を使用してｐｄｃ２遺伝子の破壊を確認した。形質転換体Ｃ４４／２８６−１０、Ｃ４４／２８６−２６、Ｃ４４／２８６−２７、Ｃ４４／２８６−２８、Ｃ４４／２８６−２９、Ｃ４４／２８６−３０、Ｃ４４／２８６−３１、Ｃ４４／２８６−３２及びＣ４４／２８６−３３においてＰＤＣ２ハイブリダイズバンドが存在しないことは、ＰＤＣ２遺伝子が欠失していることを示唆した。ｐｄｃ１、ｐｄｃ２二重欠失体においてゲノム内に巨大菌ＬＤＨが２コピー存在することは、巨大菌ＬＤＨ遺伝子をプローブとして使用して、ＨｉｎｄＩＩＩ消化した酵母ＤＮＡのサザン分析によって確認した。

これらの結果は、ＰＤＣ２遺伝子座への形質転換ｐＭＩ２８６ ＤＮＡの標的組込みが、ＰＤＣ２プロモーターとＰＤＣ２ターミネーター配列との間の相同的組換えを通して起こることを示した。これらの結果はまた、ＰＤＣ２がＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおける単一コピー遺伝子であること、及びＰＤＣ２遺伝子座の外で組込み事象が起こりうることを確認している。一部の形質転換体では、ＬＤＨ遺伝子がゲノム内に１コピーより多く組み込まれた。ｐｄｃ１を欠失し、同時にｐｄｃ２を破壊された形質転換体は生存可能である。

この実施例はまた、種々のマーカーを使用するとき、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓを独立して多重形質転換できることを確認した。このようにして、宿主ゲノム内の対象遺伝子（ＬＤＨ）のコピー数を増加させることも可能である。

実施例１１：ｐｄｃ１−ｐｄｃ２−菌株によるエタノールの産生
ＰＤＣ１及び／又はＰＤＣ２遺伝子の欠失又は破壊を有するカンジダ菌株におけるエタノール産生を次のように分析した。Ｃ４４／２８６−１０、Ｃ４４／２８６−２６及びＣ４４／２８６−３３と称する形質転換体、及び対照として含めた他の４つの菌株を、２５０ｍＬ振とうフラスコ内のＹＰ＋５％グルコース５０ｍＬ中、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃の温度で増殖させた。試料を毎日回収し、細胞を遠心分離によって取り出した。接種の５６時間後に採取した培養上清試料を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のエタノールＵＶ法によってエタノールに関して分析した（表１）。これらの結果は、ｐｄｃ１とｐｄｃ２の両方を欠失した形質転換体によるエタノール産生は、無傷ＰＤＣ１又はＰＤＣ２遺伝子を含む菌株に比べて１０倍以上低いことを示した。

これらの結果は、両方の遺伝子を同時に欠失したときにのみエタノール産生の著しい低下が認められるので、ＰＤＣ１及びＰＤＣ２の両方が機能性ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードすることを明らかにした。これらの結果はまた、ＰＤＣ２オープンリーディングフレームの約６０％を除去するＰＤＣ２の破壊はＰＤＣ２機能を消滅させることを示唆した。

実施例１２：ＬＤＨを含まないＰＤＣ２の破壊のためのベクター
外来性ＬＤＨコード配列を導入せずにＰＤＣ２を置換するためのベクターを調製した。巨大菌ＬＤＨ遺伝子を、１２７６ｂｐのＳｐｅＩ−ＸｂａＩフラグメントとして、実施例９で述べたｐＭＩ２８６プラスミドから除去した。ｐＭＩ２８６をＳｐｅＩで消化し、その線状化した分子をＸｂａＩで部分消化した。８１００ｂｐのＳｐｅＩ−ＸｂａＩフラグメントをゲル電気泳動後に単離し、再環状化させた。ｐＭＩ２８７と称する、生じたプラスミドは、順に、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２プロモーター、Ｇ４１８耐性遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５ターミネーター、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター、次にＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２ターミネーターを含み、図１６に概略図を示している。

ｐＭＩ２８７をＮｏｔＩで消化し、ＰＤＣ２ ５’側及び３’側領域に隣接されたＧ４１８発現カセットから成る５１００ｂｐフラグメントを切り出した。この５１００ｂｐフラグメントを使用して、上記実施例１で述べた方法によってＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓを形質転換した。形質転換体を、２００μｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８抗生物質を添加したＹＰＤ寒天平板上で増殖させた。平板を３０℃で２−５日間インキュベートし、形質転換体を新鮮な選択平板に再び線条接種した。

形質転換体を２８７−１から２８７−５７までと称した。成功した形質転換体を特定するために、欠失領域のヌクレオチドに対応するＰＤＣ２プローブを用いて、ｐＭＩ２８７形質転換体から単離したゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。形質転換体２８７−６及び２８７−１６ではＰＤＣ２ハイブリダイズバンドは認められず、ＰＤＣ２遺伝子が欠失していることを示唆した。

実施例１３：ヘルベチカス菌ＬＤＨの発現のため及びＰＤＣ２遺伝子座への形質転換ＤＮＡの標的組込みのためのベクター
ｐＭＩ２８６内の巨大菌ＬＤＨをコードする配列を、ヘルベチカス菌ＬＤＨをコードするＤＮＡで置換するために、実施例９で述べたｐＭＩ２８６を制限酵素ＳｐｅＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、及び４つのｄＮＴＰの各々で平滑末端にして、その後ＢｓｐＭＩで消化した。図９に示すプラスミドｐＭＩ２４７をＢａｍＨＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ断片、及び４つのｄＮＴＰの各々で平滑末端にして、その後ＢｓｐＭＩで消化した。ｐＭＩ２８６の６８００ｂｐ ＳｐｅＩ（平滑末端）−ＢｓｐＭＩフラグメントとｐＭＩ２４７の２７００ｂｐ ＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＢｓｐＭＩフラグメントとを連結した。ｐＭＩ２８８と称する、生じたプラスミドは、順に、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２プロモーター、Ｇ４１８耐性遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＭＥＬ５ターミネーター、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーター及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＹＣ１ターミネーター、次にＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２ターミネーターを含み、図１７に概略図を示している。

ｐＭＩ２８８をＮｏｔＩで消化し、ＰＤＣ２ ５’側及び３’側領域に隣接されたＧ４１８耐性及びＬＤＨ発現カセットから成る６４００ｂｐフラグメントを切り出した。ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれたヘルベチカス菌ＬＤＨを有する、２５７−３と称するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体を、ヘルベチカス菌ＬＤＨによる第二の形質転換のための宿主として選択した。形質転換体２５７−３を、上記実施例１で述べた方法によって、ｐＭＩ２８８の６４００ｂｐのＮｏｔＩフラグメントでさらに形質転換した。形質転換体を、２００μｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８抗生物質を添加したＹＰＤ寒天平板上で選択した。平板を３０℃で２−５日間インキュベートし、それによって得られた形質転換体を、新鮮な選択平板に再び線条接種することによって精製した。これらの形質転換体をＣ４０／２８８−１からＣ４０／２８８−４０までと称した。

前記遺伝子座の欠失領域内のヌクレオチドに対応するＰＤＣ２プローブを使用して、ｐｄｃ２遺伝子の破壊を確認した。形質転換体Ｃ４０／２８８−２、Ｃ４０／２８８−１１、Ｃ４０／２８８−２９、Ｃ４０／２８８−３４及びＣ４０／２８８−３８においてＰＤＣ２ハイブリダイズバンドが存在しないことは、ＰＤＣ２遺伝子が欠失していることを示唆した。ｐｄｃ１、ｐｄｃ２二重欠失体においてゲノム内にヘルベチカス菌ＬＤＨが２コピー存在することは、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子をプローブとして使用して、ＨｉｎｄＩＩＩ消化した酵母ＤＮＡのサザンブロット分析によって確認した。

これらの結果は、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＤＣ２遺伝子座への外来性ＬＤＨ配列の標的組込みが達成され、ＰＤＣ２遺伝子座が破壊された細胞が提供されることを明らかにした。

実施例１４：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌又は巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、好気性試験管培養における特定グルコース培地又は濃厚グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞及び上記実施例で開示したその形質転換体（すなわち、２４６−２７、２４７−１１、２６５−０３、２６５−０５、２６５−０６、２６５−０７、２６５−１１、２６５−１２、２６５−１４、２６５−１５、２６５−１７、２６５−１８、２６５−２２、２６５−２３、２６５−２９、２６５−３３、２６５−３４、２６５−３５、２６５−３８、２６５−３９、２６５−４２、２６５−４３、２６５−４４、２６５−４５、２６５−４６、２６５−４７、２６５−４８、２６５−４９、２６５−５１、２６５−５２、２６５−５５、２６５−５６、２６５−５７及び２６５−６０）を、ＹＰＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加したＹＰ、ｐＨ５．５）又はＹＤ培地（２％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）で培養した。各々の形質転換体からの２つの独立したコロニーを、ＹＰＤ又はＹＤ培地５ｍＬを含む１４ｍＬ使い捨てプラスチックチューブに接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養中に試料を回収し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集し、培養上清をＨＰＬＣによって乳酸、グルコース及びエタノールに関して分析した。ＨＰＬＣ分析は、Ｗａｔｅｒｓ ５１０ ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ ７１７＋自動試料採取器、ならびに、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ ４１０ 示差屈折計）及びＵＶ検出器（Ｗａｔｅｒｓ ２４８７ デュアルλＵＶ検出器）を備えたＷａｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｔｅｒｆａｓｅ Ｍｏｄｕｌｅ液体クロマトグラフィーコンプレックス（ｃｏｍｐｌｅｘ）を用いて実施した。Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈイオン排除カラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、３５℃において水中５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４で平衡させ、０．６ｍＬ／分の流速で水中５ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４で試料を溶出した。データの捕捉と管理はＷａｔｅｒｓ Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍソフトウエアを用いて実施した。２つの独立した試料から得られた数値を平均した。これらの結果を表２及び３に示す。

特定培地での１３時間の培養後、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体２４６−２７及び２４７−１１は０．１−０．４ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１９時間後には１．８−３．９ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

特定培地での１３時間の培養後、１コピーのゲノム内の未知の部位に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体２６５−０３、２６５−０６、２６５−１１、２６５−１２、２６５−１８、２６５−２９、２６５−４４、２６５−４５、２６５−４６、２６５−５２、２６５−５５及び２６５−５７は、０．５−１．９ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１９時間後には４．０−６．３ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

特定培地での１３時間の培養後、ゲノム内の未知の部位に組み込まれた２コピーの巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体２６５−１４、２６５−２２及び２６５−２３は、０．５−１．２ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１９時間後には３．８−６．１ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

特定培地での１３時間の培養後、３コピーの巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体２６５−５６は、０．７ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１９時間後には５．２ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

特定培地での１３時間の培養後、ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む（ｐｄｃ１遺伝子型）形質転換体２６５−０５、２６５−０７、２６５−１５、２６５−１７、２６５−３３、２６５−３４、２６５−３５、２６５−３８、２６５−３９、２６５−４２、２６５−４３、２６５−４７、２６５−４８、２６５−４９、２６５−５１及び２６５−６０は、０．４−２．７ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１９時間後には３．４−７．５ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

濃厚培地での１２時間の培養後、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体２４６−２７及び２４７−１１は、０．５−１．７ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１７時間後には３．７−６．１ｇ／Ｌの乳酸を産生した。これに対し、宿主菌株は１７時間の培養後０．１ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

濃厚培地での１２時間の培養後、巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体２６５−０３、２６５−０６、２６５−１１、２６５−１２、２６５−１８、２６５−２９、２６５−４４、２６５−４５、２６５−４６、２６５−５２、２６５−５５及び２６５−５７は、１．４−４．３ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１７時間後には７．２−９．８ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

濃厚培地での１２時間の培養後、２コピーの巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体２６５−１４、２６５−２２及び２６５−２３は、２．１−１．９ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１７時間後には６．３−６．８ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

濃厚培地での１２時間の培養後、３コピーの巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体２６５−５６は、２．６ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１７時間後には７．５ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

濃厚培地での１２時間の培養後、ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む（ｐｄｃ１遺伝子型）形質転換体２６５−０５、２６５−０７、２６５−１５、２６５−１７、２６５−３３、２６５−３４、２６５−３５、２６５−３８、２６５−３９、２６５−４２、２６５−４３、２６５−４７、２６５−４８、２６５−４９、２６５−５１及び２６５−６０は、２．０−４．７ｇ／Ｌの乳酸を産生し、１７時間後には７．１−１０．７ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

これらの結果は、宿主菌株が乳酸を産生しなかったときにＬＤＨ形質転換体は乳酸を産生したことを示している。巨大菌及びヘルベチカス菌ＬＤＨはＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおいて活性であることを示した。これらの異種ＬＤＨは、従って、ＰＤＣの存在下でピルビン酸塩に関して有効に競合しうる。ｐｄｃ１の欠失は、乳酸塩の全体的収率及び産生に影響を及ぼさないと思われた。２コピー（２６５−１４、２６５−２２、２６５−２３）又は３コピー（２６５−５６）を含む形質転換体では、残留グルコースはより高く、エタノール濃度はより低かった。より高いＬＤＨコピー数はまた、グルコースからのより高い乳酸収率、より低いエタノール産生、及び乳酸対エタノールのより高い比率をもたらした。生物量（ＯＤ_６００）の上昇は、１コピーより多くの巨大菌ＬＤＨを含む菌株ではより少なかった。

実施例１５：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌、巨大菌又はＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、好気性試験管培養における特定グルコース培地又は濃厚グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞及び上記で開示したその形質転換体（すなわち、２４６−２７、２４７−１１、２６５−３９、２６５−５、２６５−１５、２６５−４４、２６６−１、２６６−２、２６６−４、２６６−６、２６６−７、２６６−８、２６６−１１、２７８−２、２７８−３、２７８−４、２７８−６、２７８−７、２７８−８、２７８−９、２７８−１１、２７８−１２、２７８−１３、２７８−１４、２７８−１５、２７８−１７、２７８−１８、２７８−１９、２７８−２０、２５７−３、２５７−５、２５７−６、２５７−８、２５７−９、２５７−１０、２５７−１１及び２５７−１２）を、ＹＰＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加したＹＰ、ｐＨ５．５）又はＹＤ培地（２％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）で培養した。各々の形質転換体からのコロニーを、ＹＰＤ又はＹＤ培地５ｍＬを含む１４ｍＬ使い捨てプラスチックチューブに接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養中、１２及び１７時間目の時点で試料を回収し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集し、上述したように培養上清をＨＰＬＣによって乳酸、グルコース及びエタノールに関して分析した。ＨＰＬＣ分析は上記実施例１４で詳述したように実施した。これらの結果を表４及び５に示す。

特定培地での１２時間の培養後、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体は、０．１−０．７ｇ／Ｌの乳酸を産生した。濃厚培地では、これらの細胞によって０．９−２．７ｇ／Ｌの乳酸が産生された。

特定培地での１２時間の培養後、巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体は、０．１−０．５ｇ／Ｌの乳酸を産生した。濃厚培地では、これらの細胞によって１．９−３．２ｇ／Ｌの乳酸が産生された。

特定培地での１２時間の培養後、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体は、０．２−０．６ｇ／Ｌの乳酸を産生した。濃厚培地では、これらの細胞によって０．９−２．７ｇ／Ｌの乳酸が産生された。

特定培地での１２時間の培養後、ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれたＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子及び巨大菌ＬＤＨ遺伝子の両方を含む形質転換体は、０．１−０．９ｇ／Ｌの乳酸を産生した。濃厚培地では、これらの細胞によって１．０−３．３ｇ／Ｌの乳酸が産生された。

特定培地での１７時間の培養後、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体は、０．９−２．１ｇ／Ｌの乳酸を産生した。濃厚培地では、これらの細胞によって６．６−９．９ｇ／Ｌの乳酸が産生された。

特定培地での１７時間の培養後、巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体は、０．８−１．７ｇ／Ｌの乳酸を産生した。濃厚培地では、これらの細胞によって８．７−１１．０ｇ／Ｌの乳酸が産生された。

特定培地での１７時間の培養後、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含む形質転換体は、０．７−１．３ｇ／Ｌの乳酸を産生した。濃厚培地では、これらの細胞によって７．３−９．５ｇ／Ｌの乳酸が産生された。

特定培地での１７時間の培養後、ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれたＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子及び巨大菌ＬＤＨ遺伝子の両方を含む形質転換体は、０．７−３．０ｇ／Ｌの乳酸を産生した。濃厚培地では、これらの細胞によって５．０−１０．７ｇ／Ｌの乳酸が産生された。

これらの結果は、３つの異種ＬＤＨすべてがＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおいて活性であり、乳酸を産生するために使用しうることを示した。これらのＬＤＨは、ＰＤＣの存在下でピルビン酸塩と有効に競合しうる。これらのＬＤＨ遺伝子のいずれかの発現は、特に濃厚培地において、グルコース利用、増殖及びエタノール産生を低下させた。グルコース利用率及び増殖の低下は、ヘルベチカス菌ＬＤＨを含む菌株で最も強く、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨを含む菌株において最も軽度であり、巨大菌ＬＤＨ形質転換体は中間的な挙動を示した。２つの由来のＬＤＨを含む形質転換体では、巨大菌ＬＤＨの存在によってその作用が隠蔽された。

実施例１６：ゲノム内に組み込まれた巨大菌又はＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、微好気性振とうフラスコ培養における、緩衝剤を含む又は含まない特定グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む（すなわち２６５−２３及び２６５−５５）又はＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含む（２６６−８）Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体を、特定グルコース培地で培養した。前培養物をＹＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）で増殖させ、細胞を遠心分離によって収集し、培養実験のためＯＤ_６００が１５になるようにＹＤ培地（１０％グルコースを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基）５０ｍＬに再懸濁した。酵母は、ＣａＣＯ_３ ４ｇを含む又は含まない２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中、１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養中に試料を回収し、ＣａＣＯ_３を含まない培養物からＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集し、培養上清をＬ−乳酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社のＬ−乳酸ＵＶ法によって）及びグルコース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社のグルコース／ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ法によって）に関して分析した。これらの結果を表６に示す。

２４時間の培養後、巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２６５−５５は、ＣａＣＯ_３緩衝剤を含む場合は３５．７ｇ／Ｌの乳酸を産生し、緩衝剤なしの場合はｐＨが２．７５に低下したとき６．１６ｇ／Ｌの乳酸を産生した。２コピーの巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２６５−２３は、ＣａＣＯ_３緩衝剤を含む場合は３８．２ｇ／Ｌの乳酸を産生し、緩衝剤なしの場合はｐＨが２．６８に低下したとき６．８１ｇ／Ｌの乳酸を産生した（２４時間の培養）。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２６６−８は、ＣａＣＯ_３緩衝剤を含む場合は３５．４ｇ／Ｌの乳酸を産生し、緩衝剤なしの場合はｐＨが２．８３に低下したとき３．０５ｇ／Ｌの乳酸を産生した（２４時間の培養）。

これらの結果は、ｐＨ６．５のＣａＣＯ_３の存在下では、乳酸の産生及びグルコース利用がｐＨ３以下の非緩衝条件におけるよりも高かった。ＣａＣＯ_３の存在下ではより高い乳酸力価が達成された。

実施例１７：ＣａＣＯ _３ 緩衝及び非緩衝培養における細胞内乳酸
上記実施例１６で述べたように、特定グルコース培地で培養した、巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む（すなわち２６５−２３及び２６５−５５）又はＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含む（２６６−８）Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体からの細胞ペレットを分析して、細胞内乳酸濃度を測定した。培養中、８時間目と２４時間目に試料（２ｍＬ）を回収し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集した。上清を廃棄し、各々のペレットを、２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した、氷冷１０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５ １ｍＬで洗浄した。洗浄した細胞ペレットを同じ緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、−７０℃で保存した。試料を解凍し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０（１ｍＬ）で１回洗浄して、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。ペレットを氷冷５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１ｍＬに懸濁し、１分間渦動攪拌した。渦動攪拌後、試料を約３０分間氷上に保持した。氷上でのインキュベーション後、試料を１分間渦動攪拌し、４℃で３０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。収集した上清において乳酸レベルを測定した。酵素的方法によって（Ｌ−乳酸ＵＶ法、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社）又はＨＰＬＣによって（実施例１４におけるように）、乳酸濃度を分析した。乳酸の細胞内濃度を次のように算定した：

１．細胞（試料中の）の細胞内容量：
培養物の乾燥重量（ｇ／Ｌ） × 試料の容量（Ｌ） × ２ｍＬ／ｇ細胞 ＝ 細胞容量（ｍＬ）。

細胞容量を、０．００１を乗じてリットルに換算する。細胞１グラム（乾燥重量）は細胞容量２ｍＬに相当する（Ｇａｎｃｅｄｏ ＆ Ｓｅｒｒａｎｏ，１９８９，“Ｅｎｅｒｇｙ Ｙｉｅｌｄｉｎｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ”、Ｔｈｅ ｙｅａｓｔｓより（Ｒｏｓｅ ＆ Ｈａｒｒｉｓｏｎ編集）、第３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ）。

２．細胞中の乳酸量：
測定した乳酸濃度（ｇ／Ｌ） × 使用した５％ＴＣＡの容量（Ｌ） ＝ 試料中の乳酸量（ｇ）。細胞中の乳酸濃度を算定するには、試料中の乳酸量（ｇ）を細胞容量（Ｌ）で除する。

２４時間の培養後、巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２６５−５５は、ＣａＣＯ_３緩衝剤を含む場合は２８．２ｇ／Ｌの細胞内乳酸濃度、緩衝剤なしでは７．２ｇ／Ｌの細胞内乳酸濃度を有していた。２コピーの巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２６５−２３は、２４時間の培養後、ＣａＣＯ_３緩衝剤を含む場合は４６．１ｇ／Ｌ、緩衝剤なしでは８．２ｇ／Ｌの細胞内乳酸濃度を有していた。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２６６−８は、ＣａＣＯ_３緩衝剤を含む場合は４５．４ｇ／Ｌ、緩衝剤なしでは４．９ｇ／Ｌの細胞内乳酸濃度を有していた（２４時間の培養）。これらの結果を表７に示す。

これらの結果は、８時間の培養後、非緩衝培養中で増殖したときの形質転換体２６５−５５及び２６５−２３では細胞内乳酸レベルが細胞外レベルよりも２倍高いことを示した。他の形質転換体についての培養８時間目では、細胞内レベルと細胞外レベルの差は小さく、約１０％であった。ＣａＣＯ_３を培養物に含めたとき、すべての菌株において細胞内及び細胞外乳酸レベルはＣａＣＯ_３なしの培養物よりも高かった。ＣａＣＯ_３緩衝培養物では、すべての菌株で細胞内及び細胞外乳酸濃度が８時間目から２４時間目まで上昇した。非緩衝培養物での細胞内乳酸濃度は、８時間目と２４時間目で同様である。菌株２６６−８における細胞内乳酸レベルは、その他の菌株のレベルよりも低い。

実施例１８：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌又は巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓにおける乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼの酵素活性
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体（すなわち、２４６−２７、２４７−１１、２５７−３、２５７−１２、２５７−６、２４７−９、２４６−２７、２４７−１１、２６５−３９、２６５−１５、２６５−４４、２６５−５５、２６５−２３、２６５−２２、２６５−５６、２７８−１４、２７８−１７、２８６−４、２８６−３０及び２８６−１）を、２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中、ＹＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）５０ｍＬにおいて、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でＯＤ_６００ １０まで培養した。遠心分離によって細胞を採集し、その培養上清をＨＰＬＣによって分析した。酵素活性測定に使用する細胞試料（２ｍＬ）を遠心分離によって収集し、２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した、氷冷１０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５ １ｍＬで洗浄した。洗浄した細胞ペレットを同じ緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、−７０℃で保存した。試料を室温で解凍し、超音波破砕緩衝液（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）（２ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び１０ｍＭ ＤＴＴを添加した１００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．５）中で１回洗浄した（１ｍＬ）。洗浄した試料を超音波破砕緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、ビーズビーター（Ｂｅａｄ Ｂｅａｔｅｒ）ホモジナイザーでガラスビーズ０．５ｍＬを用いて１分間ホモジナイズした。ホモジナイズ後、試料を４℃で３０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清試料を収集し、そして乳酸デヒドロゲナーゼ活性は、０．４ｍＭ ＮＡＤＨ、５ｍＭ フルクトース−１，６−ジホスフェート、１ｍＭ グリオキシル酸及び２ｍＭ ピルビン酸塩を含む、酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）（ヘルベチカス菌ＬＤＨ）又はイミダゾール緩衝液（４０ｍＭ 塩酸イミダゾール、ｐＨ６．５）（巨大菌ＬＤＨ）中、３０℃で、Ｃｏｂａｓ ＭＩＲＡ自動分析器によって分光光度測定した（Ａ_３４０）。タンパク質濃度をローリー法（Ｌｏｗｒｙら、１９５１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）によって測定した。ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）をタンパク質標準品として使用した。ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭ チアミンピロリン酸（コカルボキシラーゼ）、９０単位のＡＤＨ及び５０ｍＭ ピルビン酸塩を含むイミダゾール緩衝液（４０ｍＭ 塩酸イミダゾール、ｐＨ６．５）中、３０℃で、Ｃｏｂａｓ ＭＩＲＡ自動分析器によって分光光度測定した（Ａ_３４０）。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ^＋に変換する活性の量と定義した。これらの結果を表８に示す。

この実施例は、細胞内ＬＤＨ活性がゲノム内のＬＤＨ遺伝子のコピー数に相関することを明らかにした。ヘルベチカス菌ＬＤＨの１コピーを含有する菌株での算定ＬＤＨ活性は８Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質であり、２コピーを含有する菌株での活性は１５又は３５Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質であった。乳酸力価及びグルコースからの収率は多コピー数のＬＤＨ遺伝子を含む細胞ではより高かったが、エタノール力価は１コピーだけのＬＤＨ遺伝子を含む菌株においてよりも低かった。巨大菌ＬＤＨの１コピーを含有する菌株での算定ＬＤＨ活性は２−３Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質、２コピーを含有する菌株での活性は１０Ｕ／ｍｇ、及び３コピーを含有する菌株での活性は４０Ｕ／ｍｇであった。

ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は、典型的には、無傷ＰＤＣ２遺伝子を含有する菌株において２−４Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質であった。ｐｄｃ２を破壊したとき、ＰＤＣ活性は０．４Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質以下に低下した。ｐｄｃ１とｐｄｃ２の両方を欠失又は破壊した場合は（菌株Ｃ４４／２８６−１０）、ＰＤＣ活性は０．０７Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質に低下した。

実施例１９：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌、巨大菌又はＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨコード遺伝子、あるいは巨大菌とＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子の両方を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、特定グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞及びその形質転換体（すなわち、２６６−７、２６６−８、２４６−２７、２４７−１１、２５７−３、２５７−１２、２５７−６、２４７−９、２６５−３９、２６５−１５、２６５−４４、２６５−５５、２６５−２３、２６５−２２、２６５−５６、２６６−３、２７８−１４、２７８−１７、２８６−４、２８６−３０及び２８６−１）を、ＹＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）で培養し、遠心分離によって収集した。細胞をＹＤ（１０％グルコースを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基）５０ｍＬ中に再懸濁して、培養実験のためにＯＤ_６００を１５とした。細胞を、１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で、ＣａＣＯ_３ ４ｇを含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中で培養した。培養中に試料を回収し、遠心分離によって細胞を採集して、増殖培地を上述したように（実施例１４）ＨＰＬＣによって、乳酸、グルコース及びエタノールに関して分析した。これらの結果を表９−１３に示す。

培養上清中の最大乳酸力価は、典型的には、すべてのグルコースが消費された後、培養中７２時間目又はそれ以後に達成された。種々の遺伝的背景に基づいて分類した最大乳酸力価及び収率は次の通りであった：
−１コピーのＲ．ｏｒｙｚａｅ菌ＬＤＨ（菌株２６６−７）：９６時間目に８１ｇ／Ｌ及び収率７９％
−１コピーの巨大菌ＬＤＨ（菌株２６５−５５）：９６時間目に８５ｇ／Ｌ及び収率８２％
−１コピーのヘルベチカス菌ＬＤＨ（菌株２５７−３）：９６時間目に８５ｇ／Ｌ及び収率８４％
−２コピーの巨大菌ＬＤＨ（菌株２６５−２２）：７２時間目に８７ｇ／Ｌ及び収率８４％
−３コピーの巨大菌ＬＤＨ（菌株２６５−５６）：７２時間目に８３ｇ／Ｌ及び収率８０％
−２コピーのヘルベチカス菌ＬＤＨ（菌株２４７−９）：７２時間目に９０ｇ／Ｌ及び収率８９％
−１コピーのＲ．ｏｒｙｚａｅ菌ＬＤＨ及び１コピーの巨大菌ＬＤＨ（菌株２７８−１７）：７２時間目に７９ｇ／Ｌ及び収率７６％
−１コピーのＲ．ｏｒｙｚａｅ菌ＬＤＨ及び２コピーの巨大菌ＬＤＨ（菌株２７８−１４）：９６時間目に８９ｇ／Ｌ及び収率８６％。

すべてのグルコースが消費された後、次の培養物では乳酸カルシウム沈殿物が形成された：２４６−２７、２４７−１１、２６５−３９、２６５−１５、２６５−４４、２６５−２３、２６５−２２、２７８−１４、２７８−１７、２８６−４、２８６−３０及び２８６−１。沈殿物形成はまた、非常に高い乳酸力価が得られたことを示唆した。

これらの結果は、ヘルベチカス菌、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ又は巨大菌ＬＤＨを過剰発現するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓは、ｐＨ６．５のＣａＣＯ_３緩衝特定培地中でグルコースから高い最終乳酸力価（＞８０ｇ／Ｌ）及び収率（＞８０％）を達成することを明らかにした。ヘルベチカス菌と巨大菌ＬＤＨ形質転換体は基本的に等しく良好な成績であり、わずかに低い乳酸力価及び収率を生じたＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ形質転換体よりも良好であった。ＬＤＨコピー数は特に副産物形成に影響を及ぼした：より高いＬＤＨコピー数及びＬＤＨ活性は、より低いエタノール及び酢酸塩産生をもたらした。ヘルベチカス菌及び巨大菌ＬＤＨ形質転換体の両方が、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ形質転換体よりもより低いエタノール及び酢酸塩を産生した。グリセロール及びピルビン酸塩を含む、他の測定された副産物は、無視しうる量で存在し、ＰＤＣ＋、ｐｄｃ１−又はｐｄｃ２−遺伝子型の間で有意差がなかった。

実施例２０：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌又はＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨコード遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、窒素スパージした（ｓｐａｒｇｅｄ）チューブにおける特定グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
形質転換Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞におけるＬ−乳酸の産生を次のようにして明らかにした。Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞及びヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含む（すなわち２４６−１４、２４６−１８、２４６−２３、２４６−２７、２４７−７、２４７−８、２４７−１１及び２５７−３）又はＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含む（２６６−３及び２６６−４）その形質転換体を、ＹＤ培地（１２％グルコース及び０．４Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）で培養した。前培養物を、２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコにおいて２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で、ＹＤ培地（６．５％グルコース及び０．４Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）５０ｍＬ中で増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、０．９％ＮａＣｌで１回洗浄して、培養実験のためにＯＤ_６００が１１になるようにＹＤ培地５０ｍＬに再懸濁した。酵母を、窒素でスパージした５０ｍＬ使い捨てプラスチックチューブにおいて２５０ｒｐｍで浸透しながら３０℃で培養した（（ほぼ）嫌気性条件）。培養中に試料を回収し、その後チューブを窒素でスパージした。ＯＤ_６００を測定し、遠心分離によって細胞を採集して、培養上清を、乳酸、グルコース及びエタノールに関して、上述したようにＨＰＬＣによって分析した。これらの結果を表１４−２０に示す。

９４時間の培養後、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体は、６．９−７．２ｇ／Ｌの乳酸（収率６６−８４％に等しい）及び１−１．４ｇ／Ｌのエタノールを産生し、一方、宿主菌株は０．１ｇ／Ｌの乳酸及び４０ｇ／Ｌのエタノールを産生した。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体は、９４時間の培養後、７．２−８．８ｇ／Ｌの乳酸（収率１３−１８％に等しい）及び１７−２８ｇ／Ｌのエタノールを産生した。Ｒ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨ形質転換体によるグルコース消費及びエタノール産生は、ヘルベチカス菌形質転換体よりも迅速であった。

これらの結果は、ヘルベチカス菌ＬＤＨ又はＲ．ｏｒｙｚａｅ ＬＤＨで形質転換したＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが、窒素スパージしたチューブでの培養においてグルコースから乳酸を産生したことを示した。

実施例２１：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌又は巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、微好気性振とうフラスコ培養における緩衝剤を含まない濃厚グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
形質転換Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞におけるＬ−乳酸の産生を次のようにして明らかにした。上記で開示した巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含む（すなわち２６５−２３及び２８６−１）又はヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含む（２４６−２７及び２４７−１１）Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体を、２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコにおいて２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で、ＹＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）５０ｍＬ中で培養した。細胞を遠心分離によって収集し、培養実験のためＯＤ_６００が１５になるように、５％グルコースを添加したＹＰ培地５０ｍＬに再懸濁した。細胞を、２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中、１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養中に試料を回収し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集した。培養上清を、Ｌ−乳酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社のＬ−乳酸ＵＶ法によって）、グルコース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社のグルコース／ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ法によって）、酢酸塩（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社の酢酸ＵＶ法によって）、及びエタノール（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社のエタノールＵＶ法によって）に関して分析した。これらの結果を表１５−２０に示す。

酵母ゲノム内にランダムに組み込まれたヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２４６−２７及び２４７−１１（ＰＤＣ＋遺伝子型）は、２４時間の培養後、７．８−９．０ｇ／Ｌの乳酸（収率２４−２９％に等しい）を産生した。ｐｄｃ２遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２８６−１（ｐｄｃ２−遺伝子型）は、２４時間の培養後、８．９ｇ／Ｌの乳酸（収率３１％に等しい）を産生した。ゲノム内にランダムに組み込まれた２コピーの巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体２６５−２３（ＰＤＣ＋遺伝子型）は、２４時間の培養後、９．１ｇ／Ｌの乳酸（収率３０％に等しい）を産生した。２４時間の培養後、巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体は、グルコースからの収率が３０−３１％に等しい、８．９−９．１ｇ／Ｌの乳酸を産生した。ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体は、グルコースからの収率が２４−２９％に等しい、７．８−９．０ｇ／Ｌの乳酸を産生した。２４時間目には一部のグルコースが消費されていなかったが、最終的にはすべてのグルコースが消費された（１２０時間目）。しかし、２４時間目以降は、乳酸濃度のさらなる上昇は起こらなかった。すべての菌株によるグルコース消費は非常に類似していた。培養培地のｐＨは、この実験中は３．４−３．８であった。２コピーの巨大菌ＬＤＨを含有する形質転換体２６５−２３は、培養の初期にはより少ないエタノール及び酢酸塩を産生したが、ｐｄｃ２−形質転換体２８６−１は、培養の終了時近くで、その他の菌株よりもエタノール及び酢酸塩の産生が少なかった。

これらの結果は、ヘルベチカス菌ＬＤＨ又は巨大菌ＬＤＨで形質転換したＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが低ｐＨの微好気性条件下でグルコースから９ｇ／Ｌまでの乳酸を産生できることを明らかにした。

実施例２２：ゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、濃厚グルコース培地でのバイオリアクターにおけるＬ−乳酸の産生
上述した２６５−５５、２８６−３０及び２６５−１５と称するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体を好気性バイオリアクターで培養した。２Ｌの作業容量で、実験室用バイオリアクター（Ｂｉｏｓｔａｔ ＣＴ−ＤＣＵ３、Ｂｒａｕｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において３５℃でバッチ培養を実施した。産生期の間、ｐＨは、５．０±０．１に維持するか、あるいは培養の４８時間後に５Ｍ 水酸化カリウム（ＫＯＨ）の自動添加によって６．０±０．１に上昇させた。１５０ｇ／Ｌグルコースを添加したＹＰ培地でバイオマスを産生した。バイオマス産生期に、２３％（ｗ／ｖ）グリセロール中−８０℃で保存した培養物２０ｍＬを、０．７−１の初期ＯＤ_６００で接種した。バイオリアクターを１．０Ｌ／分の流速の１００％空気で洗い流し、この期間中８００ｒｐｍで攪拌した。２３．５時間の培養後、１０−２１ｇ／Ｌの細胞量が産生された（乾燥重量）（使用したグルコースのグラム数につき０．２−０．３ｇ乾燥重量に等しい）。２４時間のバイオマス産生後、バイオリアクターを空にし、遠心分離によって（４０００ｒｐｍ、２０℃、１０分間）細胞を収集した。乳酸塩産生のための培地（１００ｇ／Ｌグルコースを添加したＹＰ培地）をポンプでバイオリアクターに供給し、バイオマス産生期から収集した細胞を５ｇ／Ｌ乾燥重量に相当する密度になるように接種した。バイオリアクターを１．０Ｌ／分の流速の１０％空気−９０％窒素ガスで洗い流し、５００ｒｐｍで攪拌した。

培養中に試料を回収した。各々の試料について、乾燥細胞重量を測定し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集した。培養上清を上述したようにＨＰＬＣによって、乳酸、グルコース、エタノール及び酢酸塩に関して分析した。これらの結果を表２１及び２２に示す。

ゲノム内にランダムに組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２６５−５５、ＰＤＣ＋遺伝子型）は、乳酸塩産生期での５２時間の培養後、ｐＨ５．０で２８ｇ／Ｌの乳酸（収率６７％に等しい）を産生した。同じ形質転換体は、産生期での７２時間の培養後、ｐＨ６．０で２８ｇ／Ｌの乳酸（収率６０％に等しい）を産生した。

ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２６５−１５、ｐｄｃ１−遺伝子型）は、乳酸塩産生期での５１時間の培養後、ｐＨ５．０で２３ｇ／Ｌの乳酸（収率６６％に等しい）を産生した。

ｐｄｃ２遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２８６−３０、ｐｄｃ２−遺伝子型）は、乳酸塩産生期での４６時間の培養後、ｐＨ５．０で２７ｇ／Ｌの乳酸（収率５４％に等しい）を産生した。

４６−５２時間の乳酸産生期後、形質転換体は２３−２８ｇ／Ｌの乳酸（収率５４−６７％に等しい）を産生した。

これらの結果は、異種乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を過剰発現するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが、微好気性条件下での（例えば大気中０％−２％Ｏ_２）バッチ発酵においてグルコースから乳酸を産生することを明らかにした。

細胞内乳酸及びピルビン酸塩
細胞内乳酸及びピルビン酸塩濃度は、試料容量が１ｍＬであったこと及び細胞ペレットを１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で洗浄し（１ｍＬ）、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、−７０℃で保存したことを除いて、実施例１７で上述したように測定した。解凍後、ペレットを氷冷５％ＴＣＡ １ｍＬに直接懸濁した。細胞内ピルビン酸濃度を試料から酵素的に分析した（ピルビン酸塩キット、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。これらの結果を表２４−２７に示す。

ゲノム内にランダムに組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２６５−５５、ＰＤＣ＋遺伝子型）は、ｐＨ５．０で、乳酸塩産生期での５２時間の培養後、細胞内で６０．９ｇ／Ｌの乳酸を産生した。同じ形質転換体は、乳酸塩産生期での７２時間の培養後、ｐＨ６．０で、３８．７ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２６５−１５、ｐｄｃ１−遺伝子型）は、乳酸塩産生期での５１時間の培養後、細胞内で１３．４ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

ｐｄｃ２遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２８６−３０、ｐｄｃ２−遺伝子型）は、乳酸塩産生期での４９時間の培養後、１４．３ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

ゲノム内にランダムに組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２６５−５５、ＰＤＣ＋遺伝子型）は、ｐＨ５．０及びｐＨ６．０での培養期間中、細胞内で０．１ｇ／Ｌのピルビン酸塩を産生した。

ｐｄｃ１遺伝子座（２６５−１５、ｐｄｃ１−遺伝子型）又はｐｄｃ２遺伝子座（２８６−３０、ｐｄｃ２−遺伝子型）に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体は、培養期間中細胞内で０．３ｇ／Ｌのピルビン酸塩を産生した。

これらの結果は、ｐｄｃ１の欠失及びｐｄｃ２の破壊は細胞内ピルビン酸塩レベルの上昇を生じさせることを示した。ＰＤＣ＋菌株では、培養の終了時近くで細胞内乳酸レベルが上昇したが、ｐｄｃ１−及びｐｄｃ２−菌株ではこの傾向はそれほど明らかではなかった。

乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼ活性
乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を次のようにして測定した。酵素活性測定のための試料（２ｍＬ）を遠心分離によって収集し、細胞ペレットを、２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した氷冷１０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５ １ｍＬで洗浄した。洗浄したペレットを同じ緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、−７０℃で保存した。試料を室温で解凍し、ホモジナイズ緩衝液（２ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び１０ｍＭ ＤＴＴを添加した１００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．５）中で１回洗浄した（１ｍＬ）。洗浄した試料をホモジナイズ緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、ビーズビーターホモジナイザーでガラスビーズ０．５ｍＬを用いて１分間ホモジナイズした。ホモジナイズ後、試料を４℃で３０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清試料を収集し、乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を、グリオキシル酸を使用しなかったことを除いて、実施例１８で上述したように分光光度測定した（Ａ_３４０）。これらの結果を表２８−３１に示す。

ゲノム内にランダムに組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２６５−５５、ＰＤＣ＋遺伝子型）は、ｐＨ５．０の乳酸塩産生期での培養５２時間目に、１．４Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質の乳酸デヒドロゲナーゼ活性及び０．８Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を生じた。同じ形質転換体は、乳酸塩産生期での培養７２時間目に、ｐＨ６．０で、１．２Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質の乳酸デヒドロゲナーゼ活性及び０．４Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を生じた。

ｐｄｃ１遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２６５−１５、ｐｄｃ１−遺伝子型）は、乳酸塩産生期での培養５１時間目に、１．５Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質の乳酸デヒドロゲナーゼ活性及び０．５Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を生じた。

ｐｄｃ２遺伝子座に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体（２８６−３０、ｐｄｃ２−遺伝子型）は、乳酸塩産生期での培養４９時間目に、０．７Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質の乳酸デヒドロゲナーゼ活性及び０．１Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質のピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を生じた。

これらの結果は、ゲノム内に組み込まれた１コピーの巨大菌ＬＤＨを含有するすべての菌株においてＬＤＨ活性は同様であることを明らかにした。ＬＤＨ活性はＰＤＣ活性よりも高く（Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質）、それ故ＬＤＨはピルビン酸塩に関してＰＤＣと効率よく競合することができた。ｐｄｃ２−菌株２８６−３０は、野生型に比べて明らかに低いＰＤＣ活性を有する。ｐｄｃ１−菌株２６５−１５において認められたＰＤＣ活性へのｐｄｃ１欠失の影響は、経時的な、より緩やかな活性の低下であった。

実施例２３：ゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、濃厚グルコース培地でのバイオリアクターにおけるＬ−乳酸の嫌気的産生
上述した２６５−５５と称するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体をバイオリアクターで培養した。２Ｌの作業容量で、実験室用バイオリアクター（Ｂｉｏｓｔａｔ ＣＴ−ＤＣＵ３、Ｂｒａｕｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において３５℃でバッチ培養を実施した。１５０ｇ／Ｌグルコースを添加したＹＰ培地で好気的にバイオマスを産生した。バイオマス産生期に、２３％（ｗ／ｖ）グリセロール中−８０℃で保存した培養物２０ｍＬを接種した。バイオリアクターを１．０Ｌ／分の流速の１００％空気で洗い流し、８００ｒｐｍで攪拌した。溶解酸素濃度を酸素電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）で継続的にモニターした。２２．５時間のバイオマス産生後、バイオリアクターを空にし、遠心分離によって（４０００ｒｐｍ、２０℃、１０分間）細胞を収集した。乳酸産生のための培地（１００ｇ／Ｌグルコースを添加したＹＰ）をポンプでバイオリアクターに供給し、遠心分離したバイオマスを４．５ｇ／Ｌ細胞乾燥重量に等しい密度になるように接種した。バイオリアクターを１．０Ｌ／分の流速の１００％窒素で洗い流し、５００ｒｐｍで攪拌した。ｐＨは、５Ｍ 水酸化カリウム（ＫＯＨ）の自動添加によって５．０±０．１に維持した。

培養中に試料を回収した。細胞乾燥重量を計量し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集した。培養上清を、Ｌ−乳酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のＬ−乳酸ＵＶ法によって）及びグルコース含量（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のグルコース／ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ法によって）に関して分析した。これらの結果を表３２及び３３に示す。

１２０時間の培養後、４．７ｇ／Ｌの乳酸がグルコースから産生された（収率５２％に等しい）。

この実施例は、異種乳酸デヒドロゲナーゼを過剰発現するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが、嫌気性バッチ発酵下でグルコースから乳酸を産生しうることを明らかにした。

実施例２４：ゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、Ｃａ（ＯＨ） _２ 緩衝濃厚グルコース培地でのバイオリアクターにおけるＬ−乳酸の産生
上述した２６５−５５と称するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体を、実施例２３で述べたように、３５℃でバイオリアクター（Ｂｉｏｓｔａｔ ＣＴ−ＤＣＵ３、Ｂｒａｕｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）におけるバッチ培養によって培養した。１８．５時間のバイオマス産生後、バイオリアクターを空にし、遠心分離によって（４０００ｒｐｍ、２０℃、１０分間）細胞を収集した。乳酸産生のための培地（１００ｇ／Ｌグルコースを添加したＹＰ）をポンプでバイオリアクターに供給し、遠心分離したバイオマスを６．７ｇ／Ｌ細胞乾燥重量に等しい密度になるように接種した。バイオリアクターを１．０Ｌ／分の流速の９０％窒素及び１０％空気で洗い流し、５００ｒｐｍで攪拌した。ｐＨは、２．５Ｍ 水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）_２）の自動添加によって５．０±０．１に維持した。

培養中に試料を回収した。細胞乾燥重量を計量し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集した。培養上清を、Ｌ−乳酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のＬ−乳酸ＵＶ法によって）及びグルコース含量（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のグルコース／ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ法によって）に関して分析した。これらの結果を表３４及び３５に示す。

５３時間の培養後、２６ｇ／Ｌの乳酸がグルコースから産生された（収率６７％に等しい）。

これらの結果は、巨大菌乳酸デヒドロゲナーゼを過剰発現するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが、水酸化カルシウム緩衝剤を伴う微好気性バッチ発酵（２％Ｏ_２）においてグルコースから乳酸を産生しうることを明らかにした。

実施例２５：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、濃厚グルコース培地でのバイオリアクターにおけるＬ−乳酸の産生
上述した２４７−５及び２４７−１１と称するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体を、
２Ｌの作業容量で、３０℃（菌株２４７−１１）又は３５℃（菌株２４７−５）で、実験室用バイオリアクター（Ｂｉｏｓｔａｔ ＣＴ−ＤＣＵ３、Ｂｒａｕｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）におけるバッチ培養によって培養した。培地は４０ｇ／Ｌグルコースを添加したＹＰであった。前培養物をＹＰＤ培地でＯＤ_６００ １１−１６まで増殖させ、細胞を遠心分離によって収集して、ＯＤ_６００が１になるようにバイオリアクターに接種した。すべてのグルコースが消費されるまで培養を続けた。ｐＨは、５Ｍ 水酸化カリウム（ＫＯＨ）の自動添加によって５．０±０．１に維持した。バイオリアクターを０．５Ｌ／分の流速の５％空気及び９５％窒素ガスで洗い流し、５００ｒｐｍで攪拌した。溶解酸素濃度を酸素電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）で継続的にモニターした。

培養中に試料を回収した。細胞乾燥重量を計量し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集した。培養上清を、乳酸、グルコース、エタノール及び酢酸塩に関して上述したようにＨＰＬＣによって分析した。これらの結果を表３６及び３７に示す。

５２−６９時間の培養後、形質転換体はグルコースから２６−２９ｇ／Ｌの乳酸を産生した（収率６７−７２％に等しい）。

これらの結果は、ヘルベチカス菌乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を過剰発現するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが、微好気性バッチ発酵においてグルコースから乳酸を産生しうることを明らかにした。

実施例２６：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞による特定キシロース培地でのＬ−乳酸の産生
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞及び前記で開示した形質転換体（すなわち、２４６−１、２４６−１０、２４７−２及び２４７−５）をＹＸ培地（０．３％尿素及び５％キシロースを添加した、硫酸アンモニウム及びアミノ酸を含まない酵母窒素塩基）で培養した。前培養物をＹＰＤ培地で増殖させ、細胞を遠心分離によって収集して、ＹＸ培地で１回洗浄し、その後培養実験のためにＯＤ_６００が１４−２２になるようにＹＸ培地５０ｍＬに再懸濁した。酵母細胞を、１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。ｐＨが約３．５に達したとき、０．２％固体炭酸カルシウムを加えた。培養中に試料を回収し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集し、培養上清を上述したようにＨＰＬＣによって分析した。これらの結果を表３８に示す。

７１時間の培養後、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体は、キシロースからの収率１８−３４％に等しい、３．６−５．０ｇ／Ｌの乳酸を産生し、一方、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ宿主は検出可能な乳酸を産生しなかった。バイオマスは、１６７時間の実験期間中に１０％未満増加した。形質転換体は、１０−３０ｇ／Ｌのキシロースを利用し、４−９ｇ／Ｌの乳酸を産生した。使用されたキシロースの３分の１が形質転換体２４６−１０及び２４７−５によって乳酸に変換された。

これらの結果は、異種乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を過剰発現するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓが、キシロースから乳酸を産生しうることを明らかにした。

実施例２７：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる特定Ｌ−アラビノース培地でのＬ−乳酸の産生
Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞及び上述した形質転換体（すなわち、２４６−１、２４６−１０、２４７−２及び２４７−５）をＹＡ培地（０．３％尿素及び２％Ｌ−アラビノースを添加した、硫酸アンモニウム及びアミノ酸を含まない酵母窒素塩基）で培養した。前培養物をＹＰＤ培地で増殖させ、細胞を遠心分離によって収集して、ＹＡ培地で１回洗浄し、培養実験のためにＯＤ_６００が１４−２０になるようにＹＡ培地５０ｍＬに再懸濁した。酵母細胞を、１００ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中１００ｒｐｍで振とうしながら（微好気性条件）３０℃で培養した。ｐＨが約３．５に達したとき、０．２％固体炭酸カルシウムを加えた。培養中に試料を回収し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集し、培養上清を、上述したようにＨＰＬＣによって、乳酸及びキシロースに関して分析した。これらの結果を表３９に示す。

７１時間の培養後、ヘルベチカス菌ＬＤＨ遺伝子を含有する形質転換体は、アラビノースからの収率１４−３４％に等しい２．３−３．２ｇ／Ｌの乳酸を産生し、一方、対照菌株は検出可能な乳酸を産生しなかった。バイオマスは、１６７時間の実験期間中に２０−６０％増加した。形質転換体は、最初に供給した２０ｇ／Ｌのアラビノースのほとんどすべてを使用し、３．３−４．５ｇ／Ｌの乳酸を産生した。使用されたアラビノースの約２０％が形質転換体２４６−１０及び２４７−５によって乳酸に変換された。

この実施例は、異種ＬＤＨ遺伝子を発現するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓがアラビノースから乳酸を産生することを示した。

実施例２８：Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａの形質転換及びゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨを含有する菌株による乳酸の産生
Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａを、乳酸産生のために、上述したＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓベクターｐＭＩ２７８で形質転換した。ｐＭＩ２７８をＳａｌＩ及びＮｏｔＩで消化した。実施例１で上述したＧｉｅｔｚら（１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１４２５）の方法の変更に従い、酢酸リチウム形質転換を行った。ＯＤ_６００＝０．９−１．１に増殖させたＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａの一晩培養物からの細胞を遠心分離によって収集し、最初に過剰の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液で洗浄し、次に過剰の１００ｍＭ ＬｉＡｃ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液で洗浄して、１００ｍＭ ＬｉＡｃ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液２ｍＬに再懸濁した。細胞５０μＬを、形質転換ＤＮＡ１０μｇ及び熱変性ニシン精子ＤＮＡ５０μｇと混合した。それらの細胞に、１００ｍＭ ＬｉＡｃ／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中の４０％ＰＥＧ−４０００溶液３００μＬを加え、次に、緩やかに振とうしながら３０℃で３０分間細胞をインキュベートした。その後ＤＭＳＯ（４０μＬ）を加え、細胞を４２℃の水浴中で１５分間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、過剰の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の溶液で洗浄し、ＹＰＤに再懸濁し、３０℃で一晩インキュベートした。細胞を、２００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含む固体ＹＰＤ培地に塗布し、３−５日間３０℃でインキュベートした。形質転換体を新鮮な選択平板に２回線条接種した。それらの形質転換体をＣｍ／２７８−１からＣｍ／２７８−７４までと称した。

形質転換体を、次のようにして、Ｌ−乳酸を産生する能力に関して試験した。１０ｍＬプラスチックチューブ中のＹＰＤ５ｍＬに、Ｇ４１８平板上で増殖させたコロニーを接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした。細胞を遠心分離によって採集し、その上清を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社のＬ−乳酸ＵＶ法を用いてＬ−乳酸に関して分析した。Ｌ−乳酸は２．３−４．３ｇ／Ｌで産生された。ゲノム内に単一コピーの巨大菌ＬＤＨ遺伝子が存在することを、巨大菌ＬＤＨ遺伝子をプローブとして使用して、ＨｉｎｄＩＩＩ消化した酵母ＤＮＡのサザンブロット分析によって確認した。

これらの結果は、巨大菌ＬＤＨがＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａにおいて機能することができ、グルコースから乳酸を産生することを示した。巨大菌ＬＤＨは、Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａにおいて異種遺伝子の発現を駆動することができるＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＰＧＫ１プロモーターに作動可能に連結されている。さらに、Ｇ４１８耐性遺伝子に作動可能に連結されたＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＴＤＨ１プロモーターはまた、Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａにおいて機能することができる。

実施例２９：ゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａによる、緩衝剤を含まない濃厚グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
上記で開示したＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ形質転換体の１つ（Ｃｍ／２７８−１）をＹＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）で培養した。次に遠心分離によって細胞を収集し、５％グルコースを添加したＹＰ５０ｍＬに、ＯＤ_６００が１６になるように再懸濁した。酵母細胞を、２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養中に試料を回収し、ＯＤ_６００を測定して、遠心分離によって細胞を採集し、そして培養上清を、Ｌ−乳酸（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社のＬ−乳酸ＵＶ法によって）、グルコース（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社のグルコース／ＧＯＤ−Ｐｅｒｉｄ法によって）、酢酸塩（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社の酢酸ＵＶ法によって）、及びエタノール（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、Ｒｏｃｈｅ社のエタノールＵＶ法によって）に関して分析した。これらの結果を表４０に示す。

２４時間の培養後、形質転換体はグルコースから８．１ｇ／Ｌの乳酸（収率１９％に等しい）を産生し、ｐＨは３．５に低下した。

これらの結果は、異種ＬＤＨを過剰発現するＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａが、低ｐＨの濃厚培地でグルコースから乳酸を産生することを明らかにした。

実施例３０：ゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａによる、ＣａＣＯ _３ 緩衝特定グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
上記で開示した形質転換Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ細胞（すなわち、Ｃｍ／２７８−１及びＣｍ／２７８−１４と称する形質転換体）及び非形質転換宿主菌株（Ｃｍ）をＹＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）で培養した。次に細胞を遠心分離によって収集して、培養実験のためＹＤ培地（１０％グルコースを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基）５０ｍＬに、ＯＤ_６００が１５になるように再懸濁した。酵母細胞を、ＣａＣＯ_３ ４ｇを含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養期間を通じて培養培地のｐＨは６．５であった。培養中に試料を回収し、遠心分離によって細胞を採集して、培養上清を、上述したようにＨＰＬＣによって、乳酸、グルコース及びエタノールに関して分析した。これらの結果を表４１−４４に示す。

形質転換体は培養９６時間目にグルコースを消費し、６３−６５ｇ／Ｌの乳酸（収率６３−６４％に等しい）及び６．５−６．９ｇ／Ｌのエタノールを産生した。宿主菌株（Ｃｍ）は培養１２０時間目までにすべてのグルコースを消費し、２３ｇ／Ｌのエタノールを産生し、乳酸は産生しなかった。

これらの結果は、異種ＬＤＨ遺伝子を過剰発現するＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ細胞が、中性ｐＨの特定培地でグルコースから乳酸を産生することを明らかにした。６３−６５ｇ／Ｌという高い乳酸力価及び６３−６４％の収率が達成された。

実施例３１：乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼの酵素活性、ならびにゲノム内に組み込まれた巨大菌ＬＤＨ遺伝子を含有するＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａによる特定グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
上記で開示したＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ形質転換体（Ｃｍ／２７８−１及びＣｍ／２７８−１４）をＹＤ培地（５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、ｐＨ５．５）５０ｍＬ中で培養した。酵母細胞を、２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で、ＯＤ_６００が１０になるように培養した。試料を収集し（２ｍＬ）、遠心分離によって細胞を採集した。その培養上清をＨＰＬＣによって分析した。

酵素活性測定のために、細胞ペレットを氷冷１０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１ｍＬで洗浄した。洗浄したペレットを同じ緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、−７０℃で保存した。試料を室温で解凍し、超音波破砕緩衝液（１００ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．５）１ｍＬで１回洗浄した。洗浄した試料を超音波破砕緩衝液０．５ｍＬに再懸濁し、ビーズビーターホモジナイザーでガラスビーズ０．５ｍＬを用いて１分間ホモジナイズした。ホモジナイズ後、試料を４℃で３０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清試料を収集し、乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を、実施例１８で上述したように分光光度測定した（Ａ_３４０）。これらの結果を表４５に示す。

培養の２０時間目に、形質転換体２７８−１及び２７８−１４は、それぞれ０．６９及び０．３３ｇ／Ｌの乳酸（グルコースから収率の７及び４％に等しい）を産生した。その時点で、形質転換体２７８−１及び２７８−１４において、それぞれ乳酸デヒドロゲナーゼ活性は０．０５及び０．１６Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質であり、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性は０．７１及び０．５３Ｕ／ｍｇ総細胞タンパク質であった。

これらの結果は、異種ＬＤＨ遺伝子を過剰発現するＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ細胞において乳酸デヒドロゲナーゼ活性が検出されることを明らかにし、それらの細胞がグルコースから乳酸を産生できることを確認した。低い活性は、主として細胞増殖と少量の乳酸産生を生じさせる、低いＯＤ_６００初期値と高い通気（２５０ｒｐｍ）が原因であったと考えられる。

実施例３２：ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌又は巨大菌ＬＤＨをコードする遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、及び巨大菌ＬＤＨをコードする遺伝子を含有するＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａによる、特定キシロース培地での乳酸の産生
特定培地で培養したＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ及びＣ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａのＣａＣＯ_３緩衝培養物においてキシロースから乳酸を産生した。細胞バイオマスをグルコース又はキシロースのいずれかで２段階で生成した後、キシロース含有産生培地に移した。

Ａ）グルコースでのバイオマス生成及びキシロースでの乳酸産生
ＹＰ＋５％グルコース培地５ｍＬに、ＹＰＤ平板で増殖させた酵母コロニー（菌株Ｃ４０／２８８−３４）を接種した。培養物を２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした。２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中のＹＤ培地（酵母窒素塩基、アミノ酸を含まず、５％グルコース及び０．５Ｍ ＭＥＳを添加、ｐＨ５．５）５０ｍＬを初期ＯＤ_６００ ０．１で接種し、ＯＤ_６００ １０が達成されるまで２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした。細胞をＹＸ培地（５％キシロースを添加した、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基）５０ｍＬに再懸濁し、ＯＤ_６００が１１−１３になるようにした。細胞を、ＣａＣＯ_３ ２ｇを含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養中に試料を回収した。遠心分離によって細胞を採集し、培養上清を、上述したように（実施例１４）ＨＰＬＣによって、乳酸及びキシロースに関して分析した。２つの独立した実験を実施し、それらの結果を表４６に示している。

Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体Ｃ４０／２８８−３４は、７−８日間で５０ｇ／Ｌのキシロースを消費し、キシロースからの２８−３２％乳酸収率に相当する、１３−１６ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

Ｂ）キシロースでのバイオマス生成及びキシロースでの乳酸産生
巨大菌ＬＤＨを含有する形質転換体２６５−５５及び２６５−４４（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、ヘルベチカス菌ＬＤＨを含有する形質転換体Ｃ４０／２８８−３４、Ｃ４０／２８８−３６、２５７−３及び２４６−２７（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、ならびに巨大菌ＬＤＨを含有する形質転換体Ｃｍ／２７８−１及びＣｍ／２７８−４２（Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）を使用した。

２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中のＹＰ＋５％キシロース培地５０ｍＬに、ＹＰ＋２％キシロース平板で増殖させた酵母コロニーを接種した。培養物を、ＯＤ_６００ １０が達成されるまで２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で一晩インキュベートし、その後２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中のＹＸ培地（酵母窒素塩基、アミノ酸添加なし、５％キシロース及び０．５Ｍ ＭＥＳ、ｐＨ５．５）５０ｍＬを初期ＯＤ_６００ ０．２になるように接種した。細胞を、ＯＤ_６００ ７−１０が達成されるまで２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で一晩インキュベートした。細胞をＹＸ培地（酵母窒素塩基、アミノ酸添加なし、５％キシロース）５０ｍＬに再懸濁して、ＯＤ_６００が１１−１２になるようにした。細胞を、ＣａＣＯ_３ ２ｇを含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中１００ｒｐｍで振とうしながら３０℃で培養した。培養中に試料を回収した。遠心分離によって細胞を採集し、培養上清を、上述したように（実施例１４）ＨＰＬＣによって、乳酸及びキシロースに関して分析した。それらの結果を表４７に示す。

Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体は、典型的には５−６日間で、５０ｇ／Ｌのキシロースを消費した。最大乳酸力価は、少なくとも９５％のキシロースが消費されたときである、ＣａＣＯ_３緩衝キシロース培地に移した後４−５日目に測定された。産生された乳酸の量は、キシロースからの６３−７６％乳酸収率に相当する、３０−３７ｇ／Ｌであった。

Ｃ．ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ形質転換体は、典型的には５−６日間で、５０ｇ／Ｌのキシロースを消費した。最大乳酸力価は、少なくとも９５％のキシロースが消費されたときである、ＣａＣＯ_３緩衝キシロース培地に移した後４−５日目に測定された。形質転換体は、キシロースからの１６−２８％乳酸収率に相当する、８−１４ｇ／Ｌの乳酸を産生した。

この実施例は、培養条件及び接種材料の来歴がキシロースからの乳酸産生に大きな影響を及ぼすことを明らかにした。バイオマスをグルコースで生成したとき、Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ ＬＤＨ形質転換体Ｃ４０／２８８−３４は、キシロース含有培地に移した後、約３０％の収率でキシロースを乳酸に変換した。これに対して、バイオマスをキシロースで生成したとき、同じ形質転換体は、キシロース含有培地に移した後、はるかに高い収率（６３−７６％）でキシロースを乳酸に変換した。キシロースで増殖させたバイオマスはまた、乳酸産生条件下でグルコース増殖バイオマスよりも迅速にキシロースを消費した。これらのデータは、それらをキシロース含有乳酸産生培地に移す前にキシロース含有培地上で増殖させることによって、細胞をグルコース以外の糖類、例えばキシロースに「適応させる」とき、高い乳酸収率が得られることを示唆している。

実施例３３：欠失ｐｄｃ１遺伝子及び破壊ｐｄｃ２遺伝子を含み、ゲノム内に組み込まれたヘルベチカス菌ＬＤＨコード遺伝子を含有するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓによる、特定グルコース培地でのＬ−乳酸の産生
２５７−３、Ｃ４０／２８８−２、Ｃ４０／２８８−３４及びＣ４０／２８８−１１と称するＣ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ形質転換体（実施例１３で上述した）を、乳酸産生期のためにＯＤ_６００＝１８になるように懸濁したことを除いて、実施例１９で述べたように培養し、分析した。培養上清を、上述したように、乳酸、グルコース及びエタノールに関して分析した。これらの結果を表４８に示す。

ｐｄｃ１−菌株２５７−３（ｐｄｃ１が欠失している）は、４８時間で、グルコースからの収率９３％に相当する（ｇ／ｇ）、８９ｇ／Ｌの乳酸を産生した。ｐｄｃ１−（欠失）ｐｄｃ２−（ｐｄｃ２が破壊されている）菌株Ｃ４０／２８８−２、Ｃ４０／２８８−３４及びＣ４０／２８８−１１は、７２時間で、グルコースからの収率８９−９０％に相当する（ｇ／ｇ）、８６−８７ｇ／Ｌの乳酸を産生した。これらの時点でエタノールは検出されなかった。

本発明を前記の詳細な説明及び実施例に関連付けて説明しているが、それらは例示を意図するものであり、添付する特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲又は精神を限定することを意図しないことは明白である。他の局面、利点及び変更は本発明の請求項の範囲内である。

図１は、ＰＧＫプロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって駆動され、及びＧＡＬ１０（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに連結された、Ｇ４１８耐性コード遺伝子を含む、ｐＭＩ２６０として説明されるベクターの概要図である。 図２は、ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動され、及びＧＡＬ１０（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに連結された、Ｇ４１８耐性コード遺伝子を含む、ｐＭＩ２６８として説明されるベクターの概要図である。 図３は、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動され、及びＧＡＬ１０（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに連結された、Ｇ４１８耐性コード遺伝子を含む、ｐＭＩ２６９として説明されるベクターの概要図である。 図４は、ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動され、及びＧＡＬ１０（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに連結された、ヒグロマイシン耐性コード遺伝子を含む、ｐＭＩ２７０として説明されるベクターの概要図である。 図５は、ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子を含む、ｐＭＩ２３４として説明されるベクターの概要図である。 図６は、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子を含む、ｐＭＩ２３８として説明されるベクターの概要図である。 図７は、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動され、及びＧＡＬ１０（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに連結された、ヒグロマイシン耐性コード遺伝子を含む、ｐＭＩ２７１として説明されるベクターの概要図である。 図８は、各々ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＬＤＨ（ヘルベチカス菌）遺伝子を含む、ｐＭＩ２４６として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子は、Ｓ２６ ｒＲＮＡ（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）領域の上流に位置するＣＹＣ１ターミネーターに連結されている。 図９は、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（ヘルベチカス菌）遺伝子を含む、ｐＭＩ２４７として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子は、Ｓ２６ ｒＲＮＡ（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）領域の上流に位置するＣＹＣ１ターミネーターに連結されている。 図１０は、ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（ヘルベチカス菌）遺伝子を含む、ｐＭＩ２５７として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子はＣＹＣ１ターミネーターに連結されている。この発現カセット全体が、ＰＤＣ１プロモーターとターミネーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の間に挿入されている。 図１１は、ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（巨大菌；ベクターｐＶＲ２４より）遺伝子を含む、ｐＭＩ２６５として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子はＰＤＣ１（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ターミネーターに連結されている。この発現カセット全体が、ＰＤＣ１プロモーターとターミネーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の間に挿入されている。 図１２は、ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ；ベクターｐＶＲ２７より）遺伝子を含む、ｐＭＩ２６６として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子はＰＤＣ１（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ターミネーターに連結されている。この発現カセット全体が、ＰＤＣ１プロモーターとターミネーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の間に挿入されている。 図１３は、ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子を含む、ｐＭＩ２６７として説明されるベクターの概要図である。この発現カセット全体が、ＰＤＣ１プロモーターとターミネーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の間に挿入されている。 図１４は、ＭＥＬ５ターミネーターに作動可能に連結された、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＧ４１８耐性コード遺伝子、及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（巨大菌）遺伝子を含む、ｐＭＩ２７８として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子はＧＡＬ１０（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに連結されている。 図１５は、ＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに作動可能に連結された、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＧ４１８耐性コード遺伝子、及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（巨大菌）遺伝子を含む、ｐＭＩ２８６として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子はＧＡＬ１０（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに連結されている。この発現カセット全体が、ＰＤＣ２プロモーターとターミネーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の間に挿入されている。 図１６は、ＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに作動可能に連結された、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＧ４１８耐性コード遺伝子を含む、ｐＭＩ２８７として説明されるベクターの概要図である。この発現カセットは、ＰＤＣ２プロモーターとターミネーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の間に挿入されている。 図１７は、ＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに作動可能に連結された、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＧ４１８耐性コード遺伝子、及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（ヘルベチカス菌）遺伝子を含む、ｐＭＩ２８８として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子はＣＹＣ１ターミネーターに連結されている。この発現カセット全体が、ＰＤＣ２プロモーターとターミネーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の間に挿入されている。 図１８は、ＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）遺伝子及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（ヘルベチカス菌）遺伝子を含む、ｐＭＩ２５６として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子はＣＹＣ１ターミネーターに連結されている。この発現カセット全体が、ＰＤＣ１ターミネーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の上流に挿入されている。 図１９は、ＰＤＣ２プロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）を含む、ｐＭＩ２７７として説明されるベクターの概要図である。 図２０は、ＭＥＬ５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ターミネーターに作動可能に連結された、ＴＤＨプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＧ４１８耐性コード遺伝子、及びＰＧＫプロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）によって駆動されるＬＤＨ（巨大菌）遺伝子を含む、ｐＭＩ２７９として説明されるベクターの概要図である。ＬＤＨ遺伝子はＧＡＬ１０ターミネーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に連結されている。この発現カセット全体が、ＰＤＣ２プロモーター（Ｃ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）の下流に挿入されている。 図２１は、ｐＶＲ２４として説明されるベクターの概要図である。 図２２は、ｐＶＲ２７として説明されるベクターの概要図である。 図２３Ａ−Ｃは、ｐＭＩ２１４、ｐＭＩ２０３、ｐＭＩ２０５、ｐＭＩ２２７、ｐＭＩ２３３及びｐＭＩ２３４を含むベクターの概要図である。

配列表

Claims (37)

1. カンジダ属菌種からの酵母細胞中で機能性のプロモーターに作動可能に連結された乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含む核酸構築物を含むカンジダ属菌種由来の組換え酵母細胞。
2. 前記ヌクレオチド配列が巨大菌からの乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
3. 前記ヌクレオチド配列がヘルベチカス菌からの乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
4. 前記ヌクレオチド配列がＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ菌からの乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードする、請求項１に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
5. 前記プロモーターが、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｎａｅｏｄｅｎｄｒａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｌａｎｋｉｉ又はＣａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅであるカンジダ菌種からである、請求項１に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
6. 選択薬剤に対する耐性をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
7. 選択薬剤に対する耐性をコードする前記遺伝子が、細菌のネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子又はゼオシン耐性遺伝子である、請求項６に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
8. 単糖類ヘキソース以外の炭素源を処理するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
9. 前記遺伝子がα−ガラクトシダーゼをコードする、請求項８に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
10. 前記遺伝子が酵母ＭＥＬ５である、請求項９に記載の核酸構築物を含む組換え酵母細胞。
11. 少なくとも１つの外来性ＬＤＨ遺伝子を含む、カンジダ属からの遺伝的に修飾された細胞。
12. 前記細胞がさらに、低いピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性を発現する、請求項１１に記載の細胞。
13. 前記低いＰＤＣ活性が、少なくとも１つのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の欠失から生じる、請求項１２に記載の細胞。
14. 前記低いＰＤＣ活性が、少なくとも１つのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子の遺伝的破壊から生じる、請求項１２に記載の細胞。
15. Ｃａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｎａｅｏｄｅｎｄｒａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｌａｎｋｉｉ又はＣａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ細胞である、請求項１１に記載の細胞。
16. ｐｄｃ１遺伝子座における欠失、ｐｄｃ２遺伝子座における破壊、及びｐｄｃ１とｐｄｃ２遺伝子座の各々の細胞ゲノム内に２又はそれ以上のコピー数の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、カンジダ菌細胞。
17. ２又はそれ以上のコピー数の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が各々、カンジダ菌細胞において転写活性であるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１６に記載の細胞。
18. 規定量のグルコースの存在下で又はグルコースに富む培地中で培養したときエタノール産生が少なくとも１０倍低いことを特徴とする、非機能性ｐｄｃ１若しくはｐｄｃ２遺伝子を含むように又はｐｄｃ１若しくはｐｄｃ２遺伝子の欠失を含むように遺伝的に修飾されたカンジダ菌細胞。
19. 乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１８に記載の細胞。
20. 乳酸デヒドロゲナーゼがｐｄｃ１又はｐｄｃ２プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１９に記載の細胞。
21. 前記細胞が、形質転換されていないカンジダ菌細胞に比べて高い乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項１１に記載のカンジダ菌細胞。
22. ａ）請求項１から１１のいずれか１項に記載の細胞を、その細胞が増殖できる条件下で培養すること；及び
    ｂ）（ａ）の細胞培養物を、形質転換されていないカンジダ菌細胞によって乳酸に変換される糖の量に比べて前記細胞によって乳酸に変換される糖の量が増加する条件下で、糖を含む栄養培地中で発酵させること、
    の段階を含む、乳酸を産生するための方法。
23. 前記乳酸がＬ−乳酸である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記細胞がＣａｎｄｉｄａ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ細胞である、請求項２２に記載の方法。
25. 前記細胞が、ヘルベチカス菌、巨大菌、若しくはＲ．ｏｒｙｚａｅ菌乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である少なくとも１つの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、又はそれらの組合せを含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記細胞がＣａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ細胞である、請求項２２に記載の方法。
27. 前記細胞が、ヘルベチカス菌、巨大菌、若しくはＲ．ｏｒｙｚａｅ菌乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子である少なくとも１つの乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、又はそれらの組合せを含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記細胞を、栄養培地中においてｐＨをｐＨ５からｐＨ９までに維持するように緩衝されている、緩衝培地である培地中で培養する、請求項２２に記載の方法。
29. 乳酸産生後の培養培地中の最終ｐＨがｐＨ２．６からｐＨ５までである、請求項２２に記載の方法。
30. 前記発酵段階を、２％以下の酸素を含む大気下で実施する、請求項２２に記載の方法。
31. 前記発酵段階を嫌気性条件下で実施する、請求項２２に記載の方法。
32. 前記栄養培地中の糖が、１又は複数のヘキソース、１又は複数のペントース、又はそれらの組合せである、請求項２２に記載の方法。
33. 前記栄養培地中の糖が、グルコース、キシロース又はＬ−アラビノース、又はそれらの組合せである、請求項２２に記載の方法。
34. 前記栄養培地中の糖がグルコースであり、前記細胞によって消費されるグルコースの量に対する乳酸の収率が少なくとも６０重量％である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記栄養培地中の糖がキシロースであり、前記細胞によって消費されるキシロースの量に対する乳酸の収率が少なくとも１５重量％である、請求項３３に記載の方法。
36. 前記栄養培地中の糖がＬ−アラビノースであり、前記細胞によって消費されるＬ−アラビノースの量に対する乳酸の収率が少なくとも２０重量％である、請求項３３に記載の方法。
37. カンジダ菌細胞が、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｉｄｄｅｎｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｎａｅｏｄｅｎｄｒａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｌａｎｋｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ又はＣａｎｄｉｄａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ細胞である、請求項２２に記載の方法。

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