JP2006006271A

JP2006006271A - 乳酸生産酵母および乳酸生産方法

Info

Publication number: JP2006006271A
Application number: JP2004191562A
Authority: JP
Inventors: Tateo Tokuhiro; 健郎徳弘; Nobuhiro Ishida; 亘広石田; Eiji Nagamori; 英二長森; Haruo Takahashi; 治雄高橋; Satoshi Saito; 聡志齋藤; Toru Onishi; 徹大西
Original assignee: Toyota Motor Corp; Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Toyota Motor Corp; Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 2004-06-29
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2006-01-12

Abstract

【課題】酵母における乳酸生産に好ましい乳酸高発現系を構築する。
【解決手段】乳酸生産酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素活性およびアルコール脱水素酵素活性がそれぞれ低下され、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備える、酵母が提供される。この有機酸生産酵母においては、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されていることが好ましい態様であり、さらに、アルコール脱水素酵素遺伝子が破壊されていることが好ましい態様である。
【選択図】図１

Description

本発明は、乳酸生産酵母および乳酸生産方法に関する。

Ｌ−乳酸などの乳酸を酵母を利用して生産することが試みられている。例えば、図１に示すように、乳酸を生産するために、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエ属に導入し、ピルビン酸から乳酸を生産させる試みがなされている。これらの試みの多くは、酵母本来のエタノール発酵を抑制して酵母における乳酸生産を高めるために、アルコール発酵経路の強力でかつ構成的酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）の発現を抑制するものである（特許文献１、２）。また、酵母染色体中のピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子プロモーターの下流に目的とする有用遺伝子（この場合は、Ｌ−乳酸脱水素酵素遺伝子）を結合させると同時に、酵母染色体中のＰＤＣ１遺伝子を破壊することによって、ＰＤＣ１プロモーター機能を利用して乳酸脱水素酵素遺伝子を発現させつつ、当該プロモーターによって本来発現されるべきＰＤＣ１の発現を排除するシステムも開発されている（特許文献３）。このようなＰＤＣ遺伝子の破壊は乳酸生産量を明らかに増大させた。

また、酵母のアルコール発酵経路においてピルビン酸脱炭酸酵素の後段の酵素であるアルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）遺伝子を破壊してこの酵素の発現を抑制する試みもなされている（非特許文献１）。この試みによれば、染色体上のＡＤＨ１遺伝子を破壊しＬＤＨをコードするＤＮＡを発現するプラスミドが導入された形質転換酵母は、ＡＤＨ１遺伝子を維持する野生型酵母に同様のプラスミドを導入した形質転換酵母よりもエタノール生産量は減ったものの乳酸生産量が顕著に低下していた。また、ＰＤＣ活性が低下した酵母に同様のプラスミドを導入した形質転換酵母の乳酸生産量よりも低い生産量であった。すなわち、ＡＤＨ１遺伝子の破壊によるＡＤＨ１の発現抑制は必ずしも乳酸生産に有効ではなかった。

特表２００１−５１６５８４号特表２００３−５０００６２号特開２００３−１６４２９５号ＪＩｎｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）３０：２２−２７（英国）

このようにアルコール発酵経路のピルビン酸脱炭酸酵素の後段の酵素であるアルコール脱水素酵素活性の抑制はピルビン酸脱炭酸酵素活性の抑制による乳酸生産効果を上回るものではなく、逆に好ましくない結果をもたらしていた。以上のことから、その活性を抑制することが酵母において効率的な乳酸生産をさせるのに有効であろうと推測されるアルコール発酵系酵素やＴＣＡ回路系酵素は多数存在するものの、現在までのところ、ピルビン酸脱炭酸酵素以外に活性抑制が有効な酵素や組み合わせは見出されていない。

そこで、本発明では、酵母における乳酸生産に好ましい乳酸高発現系を構築することをその目的とする。具体的には、乳酸の高生産が可能な乳酸生産酵母を提供することを一つの目的とし、さらに、効率的な乳酸の生産方法を提供することを他の一つの目的とする。

本発明者らは、ＰＤＣ破壊酵母と同等あるいはそれを上回る乳酸生産を可能とする高発現系を確立すべく、酵母における乳酸生産のための活性抑制が有効な酵素を探索した。ＡＤＨは、ＰＤＣよりも後段の酵素であるため、既にＰＤＣが破壊されてＰＤＣの発現が抑制されている場合、ＡＤＨを破壊しても乳酸の生産性を向上させることは期待できないと考えられた。また、上記背景技術からもＡＤＨの破壊はアセトアルデヒドの蓄積により細胞の増殖に悪影響がある可能性が高かった。しかしながら、本発明者らがＰＤＣ遺伝子を破壊するとともにＡＤＨ遺伝子をも破壊した上で、外来ＬＤＨをコードするＤＮＡを発現させたところ、上記した推測に反し高率で乳酸生産することを見出した。この知見に基づき、本発明者らは発明を完成した。すなわち、本発明によれば、この知見に基づき以下の手段が提供される。

本発明によれば、乳酸生産酵母であって、ピルビン酸脱炭酸酵素活性およびアルコール脱水素酵素活性がそれぞれ低下され、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備える、酵母が提供される。この有機酸生産酵母においては、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されていることが好ましい態様であり、さらに、アルコール脱水素酵素遺伝子が破壊されていることが好ましい態様である。さらにまた、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられていることが好ましい態様であり、より好ましくは、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられている。また、上記した有機酸生産酵母のいずれかにおいて、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられていることが好ましく、より好ましくは、酵母染色体上のアルコール脱水素酵素遺伝子の制御下で発現可能に備えられている。

また、本発明によれば、乳酸生産酵母であって、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されるとともに破壊された該遺伝子のプロモーターの制御下で乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備え、染色体上のアルコール脱水素酵素遺伝子が破壊されるとともに破壊された該遺伝子のプロモーターの制御下に乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備える、酵母が提供される。

これらのいずれかの形態の乳酸生産酵母において、前記ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子であることが好ましく、前記アルコール脱水素酵素遺伝子はアルコール脱水素酵素１遺伝子であることが好ましい。

また、上記いずれかの酵母において、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質はウシ由来であり、前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを複数有することが好ましく、前記酵母はサッカロマイセス属に属することが好ましい。さらに、サッカロマイセス・セレビジエであることが好ましい。

また、本発明によれば、上記いずれかの乳酸生産酵母を培養する工程を備える、乳酸生産方法が提供される。

本発明の乳酸生産酵母は、ピルビン酸脱炭酸酵素活性およびアルコール脱水素酵素活性がそれぞれ低下され、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備えている。この乳酸生産酵母によれば、アルコール発酵経路の酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素とアルコール脱水素酵素とがそれぞれ低下されている一方、同じくピルビン酸を基質とする乳酸脱水素酵素がピルビン酸脱炭酸酵素プロモーターの制御下に発現可能に備えられているため、ピルビン酸は乳酸脱水素酵素によって代謝されやすくなっており、乳酸の生産が促進されている。アルコール発酵経路の第１の酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素活性が低下されていることにより、酵母のアルコール発酵は効果的に抑制されることは従来からも知られている。こうしたピルビン酸脱炭酸酵素活性が低下した系においてさらにアルコール脱水素酵素活性が抑制されることは、基質であるピルビン酸の代謝経路をアルコール発酵経路から乳酸発酵経路へと大きく変化させるものとは考えにくいが、本発明によれば、意外にもアルコール生産量を低下させるとともに乳酸生産量を増大させることができる。すなわち、アルコール脱水素酵素活性を低下させてもアセトアルデヒドの生成による細胞の増殖阻害等を抑制して細胞増殖を確保し乳酸生産量を増大させることができる。

以下、本発明の乳酸生産酵母について説明するとともに、この酵母を用いた乳酸生産方法について説明する。

（乳酸生産酵母）
本発明の乳酸生産酵母は、外来の乳酸脱水素酵素遺伝子を有する形質転換酵母である。本乳酸生産酵母を得るための酵母としては、アルコール発酵を行う酵母であって、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Scizosaccharomyces pombe）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、などの酵母を挙げることができる。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母である。好ましい酵母の一例としては、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株を例示できる。

また、本乳酸生産酵母および乳酸生産方法において乳酸とは、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれであってもよい。

（ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素）
本乳酸生産酵母においては、ピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）活性およびアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）活性が低下されている。これらの酵素は、酵母のアルコール発酵経路の酵素であり、アルコール発酵を行う酵母がその染色体上に本来的に有している。ピルビン酸脱炭酸酵素は、いわゆるオートレギュレーション機構を有する酵素であり、ピルビン酸脱炭酸酵素１，５，６がある。これらのうちいずれか１種あるいは２種以上が破壊されていればよいが、好ましくは最も活性が高いあるいは大量に発現されているピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）の活性が低下されていることが好ましい。また、アルコール脱水素酵素においても各種の亜種（ＡＤＨ１，２，３，４，５，６，７）があるが、アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）が大量に発現されている。したがってアルコール脱水素酵素１の活性が低下されていることが好ましい。

ピルビン酸脱炭酸酵素活性およびアルコール脱水素酵素活性が低下されているとは、人工的な操作によりあるいはスクリーニングによって、野生型よりも低い活性の該酵素が生産されているかあるいは該酵素の生産量が野生型よりも少ないものであることが好ましい。このような酵素活性の低下のための人工的操作としては、この酵素遺伝子を破壊（ノックアウト）することが好ましい。染色体上の特定遺伝子を破壊する手法は、当業者において周知である。

（乳酸脱水素酵素）
本乳酸生産酵母は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを保持している。ＬＤＨをコードするＤＮＡは、酵母においては外来性である。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。また、ＬＤＨとしては、Ｌ−ＬＤＨであってもＤ−ＬＤＨであってもよい。ＬＤＨとしては、好ましくは、ラクトバシルス・ヘルベティカス、ラクトバシルス・カゼイ、クルイベロマイセス・サーモトレランス、トルラスポラ・デルブルッキ、シゾサッカロミセス・ポンビ、リゾプス・オリゼ、Ｂ．メガテリウムなどの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。例えば、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。例えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列番号：２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、かかるＬＤＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号：１に記載される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。したがってＬＤＨをコードするＤＮＡとして、これらのいずれかのＬＤＨをコードするＤＮＡを用いることができる。本乳酸生産酵母は、ＬＤＨをコードするＤＮＡを少なくとも一つ、好ましくは二以上保持している。より好ましくは三以上保持している。さらに好ましくは四つ以上保持している。

ＬＤＨをコードするＤＮＡは、酵母染色体外で維持されるプラスミドやＹＡＣなどにおいて保持されていてもよいが、好ましくは酵母染色体に組み込まれて保持される。

（ＰＤＣプロモーター）
ＬＤＨをコードするＤＮＡは、強力なプロモーター活性を有するプロモーターの制御下に発現可能に備えられていることが好ましい。例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター（ＰＤＣプロモーター）の制御下に発現可能に備えられていることが好ましい。なかでも、十分に強力なプロモーターであるＰＤＣ１プロモーターを用いることが好ましい。より好ましくは、サッカロマイセス属（好ましくはセレビシエ）のＰＤＣ１プロモーターである。

ＬＤＨをコードするＤＮＡは、好ましくは、酵母染色体上のＰＤＣプロモーターの制御下に発現可能である。既に述べたように、本乳酸生産酵母においては、ＰＤＣ遺伝子が破壊されていることが好ましい。このため、ＬＤＨをコードするＤＮＡは、染色体においてＰＤＣプロモーターによって制御可能であってかつＰＤＣ遺伝子を破壊するように酵母染色体に組み込まれていることが好ましい。こうすることで、ＰＤＣ活性を効果的に低下させると同時に、本来ＰＤＣ遺伝子発現に作用していた強力なＰＤＣ遺伝子のプロモーター活性をＬＤＨをコードするＤＮＡ発現にスイッチさせることができる。破壊されそしてそのプロモーターがＬＤＨをコードするＤＮＡの発現に利用されるＰＤＣ遺伝子は、好ましくはＰＤＣ１遺伝子である。最も強力なＰＤＣ１プロモーターによって制御されるＰＤＣ１遺伝子が破壊されてＬＤＨをコードするＤＮＡが代わりに発現されることで効果的にＰＤＣ活性低下とＬＤＨ活性発現とを実現できる。

例えば、ＰＤＣ１プロモーターとしては、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡの他、同等の機能を有する限り、該ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、該塩基配列において１あるいは２以上の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された配列からなるＤＮＡ、あるいは、該ＤＮＡとの相同性が７０％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であるＤＮＡを用いることができる。すなわち、酵母染色体上のＰＤＣ１プロモーターが、同一ではないが同等の機能を有するこれらのプロモーター活性を有するＤＮＡによって相同組換え等を介して置換されていてもよい。

ストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であるハイブリダイゼーション条件あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味している。よりストリンジェンシーの高い条件によれば、より相同性の高いＤＮＡを単離できる。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が約４２℃、さらにストリンジェンシーの高い条件としては、５０％ホルムアミド存在下で約６５℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。

また、本明細書において、ＤＮＡなどの核酸の相同性については、なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ），ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ＳＩＴ／ＦＡＳＴＡ．ｈｔｍｌ）などによって決定することができる。

ＰＤＣ１遺伝子は、本発明者らが既に開示しているように、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子である（特開２００３−１６４２９５号）。オートレギュレーション機構とは、同じ機能を有する遺伝子が同一生物において複数存在し、通常、そのうちの少なくとも一つは発現しているが、残りは抑制されており、通常発現している遺伝子が破壊などにより機能しなくなった場合にのみ、残りの遺伝子が発現されてその機能を継続する機構を意味している。かかる機構が存在するため、例えば、酵母のＰＤＣ１遺伝子が破壊されたとしても、ＰＤＣ５遺伝子が発現し、酵母の生理的機能が維持されることになる。このようなオートレギュレーション機構が存在する遺伝子を破壊することで、生物自体の生存、増殖機能を維持することができて、結果として、外来ＤＮＡを保持する形質転換体の増殖を維持しながら目的産物を効果的に生産させることができる。

（ＡＤＨプロモーター）
また、ＬＤＨをコードするＤＮＡは、ＡＤＨ遺伝子のプロモーター（ＡＤＨプロモーター）の制御下に発現可能に備えることもできる。ＡＤＨは既に述べたようにアルコール発酵経路においてＰＤＣのすぐ後続の酵素である。ＡＤＨプロモーターとしては、十分に強力なプロモーターであるＡＤＨ１プロモーターを用いることが好ましい。

ＬＤＨをコードするＤＮＡは、好ましくは、酵母染色体上のＡＤＨプロモーターの制御下に発現可能である。また、既に述べたように、本乳酸生産酵母においては、ＡＤＨ遺伝子が破壊されていることが好ましい。このため、ＬＤＨをコードするＤＮＡは、ＡＤＨプロモーターによって制御可能であってかつＡＤＨ遺伝子を破壊するように酵母染色体に組み込まれていることが好ましい。こうすることで、アルコール発酵経路における代謝活性を効果的に低下させると同時に、本来ＡＤＨ遺伝子発現に作用していたＡＤＨプロモーター活性をＬＤＨをコードするＤＮＡ発現にスイッチさせることができる。また、ＡＤＨ遺伝子は、好ましくはＡＤＨ１遺伝子である。強力なあるいは構成的なＡＤＨ１プロモーターによって制御されるＡＤＨ１遺伝子が破壊されてＬＤＨをコードするＤＮＡが代わりに発現されることで効果的にＡＤＨ活性低下とＬＤＨ活性発現とを実現できる。

なお、ＡＤＨ１プロモーターは、酵母の染色体上のＡＤＨ１プロモーターと同等の機能を有する限り、該プロモーターのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ、該塩基配列において１あるいは２以上の塩基が置換、欠失、付加、及び／又は挿入された配列からなるＤＮＡ、あるいは、ＡＤＨ１プロモーターとの相同性が８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上であるＤＮＡを用いることができる。すなわち、酵母染色体上のＰＤＣ１プロモーターが、同一ではないが同等の機能を有するこれらのプロモーターによって相同組換え等により置換されていてもよい。

（他のプロモーター）
ＬＤＨをコードするＤＮＡは、酵母サッカロマイセス・セレビジエの高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子、ガラストース一リン酸キナーゼ１（ＧＡＬ１）遺伝子、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子及び転写エンハンサー因子−１（ＴＥＦ）遺伝子のプロモーターの制御下に発現可能に導入することもできる。これらの他のプロモーターとしては、酵母、あるいはサッカロマイセス属酵母のこれらの遺伝子のプロモーター活性を有するＤＮＡのほかかかるプロモーター領域に一定以上（７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上）の相同性を有し、各プロモーター活性を有するＤＮＡであってもよい。

本発明者らによれば、これらの他の酵母由来プロモーターのいずれもが乳酸存在時において高い遺伝子発現を示すプロモーターであるという知見を有している。したがって、かかるプロモーターの制御下にＬＤＨをコードするＤＮＡを導入することで、乳酸の生産量の増大によって乳酸の生産が抑制されない、あるいは乳酸の生産量の増大によってさらに乳酸の生産が促進される実用的な乳酸生産酵母などの形質転換体を得ることがおおいに期待される。

ＬＤＨをコードするＤＮＡは、ＰＤＣプロモーターやＡＤＨプロモーターにおけるのと同様、酵母染色体上にあるこれらの他のプロモーターの制御下にある内在性遺伝子を破壊するとともに該プロモーターの制御下に発現可能に組み込むこともできる。また、これらの他のプロモーターの制御下に発現可能に連結したＬＤＨをコードするＤＮＡを、ＰＤＣ遺伝子および／またはＡＤＨ遺伝子を破壊するように酵母染色体に組み込みこともできる。

なお、明らかなように、ＰＤＣプロモーター、ＡＤＨプロモーター及び他のプロモーターのＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであってもよく、また、化学的に合成されたＤＮＡであってもよい。

本乳酸生産酵母においては、上記したＰＤＣ活性及びＡＤＨ活性を低下させる態様、各種のＬＤＨをコードするＤＮＡ発現態様を各種組み合わせて採ることができる。好ましい乳酸生産酵母は、染色体上のＰＤＣ（好ましくはＰＤＣ１）遺伝子が破壊されるとともに破壊された該遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨをコードするＤＮＡを発現可能に備えるとともに、染色体上のＡＤＨ（好ましくはＡＤＨ１）遺伝子が破壊されている。また、この態様において、破壊された該ＡＤＨ（好ましくはＡＤＨ１）遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨをコードするＤＮＡを発現可能に備えることができる。こうした乳酸生産酵母においては、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上のＬＤＨをコードするＤＮＡを染色体上に備えている。また、さらに、酵母染色体上の上記他のプロモーターの制御下にＬＤＨをコードするＤＮＡを発現可能に備えることができる。

本乳酸生産酵母を取得するには、宿主酵母に対して、ＰＤＣ遺伝子及びＡＤＨ遺伝子の破壊を行うとともに、ＬＤＨをコードするＤＮＡを発現可能に導入する。酵母に対してこのような遺伝子修飾を行うには、組換え用ＤＮＡ構築物を利用する。組換え用ＤＮＡ構築物は、特に限定しないで、線状等のＤＮＡ断片、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）等に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。

ＰＤＣ遺伝子及びＡＤＨ遺伝子の破壊のためのＤＮＡ構築物は、これらの遺伝子部位に導入して遺伝子を破壊するために相同組換え用の配列を備えている。相同組換え用ＤＮＡ配列は、破壊しようとするＰＤＣ遺伝子及びＡＤＨ遺伝子であるターゲット部位あるいはその近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡ配列は、一つのターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも１箇所に相同である１の配列を有しており、好ましくは、ターゲット遺伝子あるいはその近傍の少なくとも２箇所にそれぞれ相同な配列を備えている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡ配列を、染色体上のターゲット遺伝子の上流側と下流側のＤＮＡとのそれぞれに相同なＤＮＡ配列とし、これらの相同組換え用ＤＮＡ配列の間に遺伝子を破壊するためのＤＮＡを備えるＤＮＡ構築物を酵母染色体に相同組換えにより導入することでターゲット部位の遺伝子を破壊することができる。

このような染色体上への組み込みを実現するための相同組換え用ＤＮＡの選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用ＤＮＡを選択して相同組換え用ＤＮＡ構築物を構成することができる。例えば、ＰＤＣプロモーターの少なくとも一部と、ＰＤＣ遺伝子あるいはターミネーターの少なくとも一部とにそれぞれ相同なＤＮＡ配列を相同組換え用ＤＮＡ配列として用いることができる。同様に、ＡＤＨプロモーターの少なくとも一部とＡＤＨ遺伝子あるいはターミネーターの少なくとも一部とにそれぞれ相同なＤＮＡ配列を相同組換え用ＤＮＡ配列として用いることができる。

ＰＤＣ遺伝子を破壊するＤＮＡ構築物には、ＰＤＣ遺伝子をターゲットとするための相同組換え用ＤＮＡとともにＰＤＣ遺伝子を置換可能な形態でＬＤＨをコードするＤＮＡを有することができる。このようなＤＮＡ構築物によれば、ＰＤＣ遺伝子の破壊とともにＰＤＣプロモーターの制御下にＬＤＨをコードするＤＮＡを発現可能に導入できる。

また、ＰＤＣ遺伝子を破壊するとともに、破壊した該ＰＤＣ遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨをコードするＤＮＡを導入することもできるが、相同組換えにより染色体上のＰＤＣプロモーターに替えて同等のプロモーターを導入することもできる。例えば、既に述べたＰＤＣ１プロモーターのホモログ等である。

なお、ＡＤＨ遺伝子を破壊するとともに、破壊した該ＡＤＨ遺伝子のプロモーターの制御下にＬＤＨをコードするＤＮＡを導入するためのＤＮＡ構築物も、上記したＰＤＣ遺伝子についてのＤＮＡ構築物と同様に構築することができる。

なお、ＤＮＡ構築物には、ＣＹＣ１ターミネーターやＴＤＨ３ターミネーターなどのターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性Ｇ４１８遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、シクロヘキサミド耐性遺伝子等を使用することができる。

ＤＮＡ構築物を、酵母に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。ＤＮＡ構築物の導入後、酵母は、選択培地で培養される。

なお、ＤＮＡ構築物が酵母に導入されたか否か、あるいは染色体上の所望の部位に本ＤＮＡ構築物が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。

（乳酸の生産方法）
本乳酸生産酵母を適当な炭素源の存在下で培養することにより、培養物中にＬＤＨをコードするＤＮＡの発現産物である乳酸を生成させることができる。本乳酸生産方法によれば、培養系から乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。

本発明の乳酸生産酵母の培養にあたっては、酵母の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。乳酸の生産にあたっては、必要に応じて産物である乳酸等の中和を行うかあるいは、連続的に乳酸を除去する等の処理を行うこともできる。酵母を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。

培養は、通常、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等の、嫌気条件下または微好気条件下、３０℃〜３５℃で６〜７２時間行う。培養期間中、ｐＨは２．０〜７．０に保持することが好ましい。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。

培養終了後、培養物から乳酸を分離するには、通常の乳酸精製手段を使用することができる。例えば、酵母内に生産された場合は、常法により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加圧破砕などで細胞を破壊して、乳酸を細胞と分離することができる。この場合、必要に応じてプロテアーゼを添加する。また、菌体外に乳酸が生産された場合には、この培養液等を、ろ過、遠心分離などにより固形分を除去する。

これらの粗抽出画分に対しては、従来公知の各種精製分離法等を利用して、乳酸を精製することができる。また、必要に応じて、当該粗抽出画分及びその精製物に対してエステル化等を行うことにより、各種の乳酸誘導体を得ることができる。

以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。

以下に述べる遺伝子組換え操作はMolecular Cloning: A Laboratory Manual (T. Maniatis, et al., Cold Spring Harbor Laboratory) に従い行った。PCRによる遺伝子増幅は、特に述べない限り、KOD plus DNA polymerase（TOYOBO）を用い、添付のプロトコルに従って行った。PCR増幅反応は94℃で２分間の熱処理を行った後、94℃で15秒と53℃で30秒と68℃でX分（X：増幅遺伝子の大きさが1kbにつき1分とした）との３つの温度変化を1サイクルとし、これを25サイクル繰り返し、最後に4℃とした。PCR増幅装置はGene Amp PCR system 9700（PE Applied Biosystems）を使用した。ライゲーション反応にはLigaFast Rapid DNA Ligation System（Promega）を用いた。大腸菌の形質転換は、JM109株のコンピテント細胞（TOYOBO）を用い、添付のプロトコルに従って行った。大腸菌の形質転換体の選抜はアンピシリン100μg/mlを含むLBプレートを用いて行った。大腸菌からのプラスミドの抽出にはQIA Prep Spin Miniprepkit (QIAGEN)を用いた。DNA断片末端の平滑化にはT4 DNA polymerase（TaKaRa）を用いた。酵母のゲノムDNAの調製はFast DNA Kit（Bio 101）を用い、添付のプロトコルに従って行った。酵母の形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II（ZYMO RESEARCH）を用い、添付のプロトコルに従って行った。

（PDC1破壊株の作製）
PDC1破壊株は、図２に示すpBTrp-PDC1-LDHKCBベクターを用いて作製した。すなわち、pBTrp-PDC1-LDHKCBベクターを制限酵素SacIおよびApaIで消化した断片をもちいて、宿主である酵母IFO2260株のトリプトファン要求性変異株の形質転換を行った。形質転換処理を行った菌体をトリプトファン選択培地（SD-Trp）に塗沫し、生育してきたコロニーを新たなトリプトファン選択培地に画線培養してコロニーを純化した。純化された選抜株について、1 mlのYPA培地（2% 酢酸カリウム、2% ペプトン、1% 酵母エキス）に接種し、一晩振とう培養を行った。増殖した菌体を滅菌水で2回洗浄した後、胞子誘導プレート（1% 酢酸カリウム、0.1% ペプトン、0.05% グルコース、1.5% アガー）に塗布し、室温で4日間培養して胞子を誘導した。プレート上の菌体をかきとり、0.25 u/mlのZymolyase（ZYMO RESERCH）溶液中で15分間処理して子嚢壁を消化した。次にマイクロマニピュレータを用いて胞子を解剖し、YPDプレート上で分離した。30℃で4日間培養して生育したクローンをトリプトファン選択培地にレプリカし、同時にゲノムDNAを調製した。このゲノムDNAを鋳型として、ゲノム上のPCRプライマーであるPDC1-1000Fとベクター上のPCRプライマーであるLDHKCB-Rを用いてPCRを行ったところ、トリプトファン選択培地で生育したコロニーのみで２kbのバンド増幅された。さらにゲノム上のPCRプライマーであるPDC1+1300Rとベクター上のPCRプライマーであるTRP1-Fを用いてPCRを行ったところ、トリプトファン選択培地で生育したコロニーのみで1.5kbのバンド増幅された。このことから、トリプトファン選択培地で生育したコロニーはPDC1構造遺伝子部分が破壊され、PDC1プロモータの下流にLDHが挿入されていることが確認された。この操作で得られた株はPDC1構造遺伝子がホモ破壊されており、破壊されたPDC1構造遺伝子上流のPDC1プロモータによって発現するLDH遺伝子が2コピー導入されている。そこでこの株をPDC1破壊株（PDC1p-LDH２コピー体）と称した。用いたPCRプライマーの配列は以下の通りである。

PDC1-1000F（配列番号６）：5'- aaa atg aag gcc aaa tca agg cgg gaa ggg -3'
LDHKCB-R（配列番号７）：5'- tta tta aaa ttg caa ttc ttt ttg aat acc -3'
TRP1-F（配列番号８）：5'- ctc tgc aag ccg caa act ttc acc aat gga -3'
PDC1+1300R（配列番号９）：5'- gat caa ttt ctt cag cag cga aag cag cac -3'

なお、pBTrp-PDC1-LDHKCBベクターは、以下の方法で構築したものである。
１．ウシ由来のL-乳酸脱水素酵素を、酵母サッカロマイセス・セレビシエにおいて効率的に生産するために、ウシ由来のL-乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコードするDNAに対して使用コドンを酵母の発現に最適化した遺伝子配列（配列番号：４）を設計し、長鎖DNAの合成方法として知られている藤本らの方法（藤本英也、合成遺伝子の作成法、植物細胞工学シリーズ７、植物のPCR実験プロトコール、1997、集潤社、p95-100）を用いて該DNAを全合成した（合成したDNAをLDHKCBと称した）。LDHKCBを制限酵素EcoRIで消化したものをLDHKCB断片と称した。
２. PDC1プロモータ断片（PDC1P, 0.7kb）は、サッカロマイセス・セレビシエYPH499株のゲノムDNAを鋳型として使用したPCR反応により増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・PDC1P-LDH-U（配列番号１０）ata tat gga tcc gcg ttt att tac cta tct c（BamHIサイトを付加）
・PDC1P-LDH-D（配列番号１１）ata tat gaa ttc ttt gat tga ttt gac tgt g（EcoRIサイトを付加）
得られたPCR増幅断片を制限酵素BamHIおよびEcoRIにより消化したものをPDC1P断片と称した。
３. PDC1遺伝子下流領域断片（PDC1D, 0.5kb）は、サッカロマイセス・セレビシエYPH499株のゲノムDNAを鋳型として使用したPCR反応により増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・PDC1D-LDH-U（配列番号１２）ata tat ctc gag gcc agc taa ctt ctt ggt cga c（XhoIサイトを付加）
・PDC1D-LDH-D（配列番号１３）ata tat gaa ttc ttt gat tga ttt gac tgt g（ApaIサイトを付加）
得られたPCR増幅断片を制限酵素XhoIおよびApaIにより消化したものをPDC1D断片と称した。
４. トリプトファン要求性マーカー（TRP1, 1.3kb）は、pRS404ベクター（Stratagene）を制限酵素AatIIおよびSspIで消化して切り出し、末端を平滑化した。得られた断片をTRP1断片と称した。
５. TDH3ターミネーター（TDH3t, 0.15kb）はサッカロマイセス・セレビシエYPH499株のゲノムDNAを鋳型として使用したPCR反応により増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・TDH3t-F（配列番号１４）tcg act tgg ttg aac acg ttg cca agg ctt a
・TDH3t-R（配列番号１５）aaa gct ttc aat caa tga atc gaa aa
得られたPCR増幅断片をTDH3t断片と称した。
６. 上記操作で得られた各断片（PDC1P断片、LDHKCB断片、TDH3t断片、TRP1断片およびPDC1D断片）を、順次pBluescriptII SK+ベクター（TOYOBO）のマルチクローニングサイトに連結して、染色体導入型ベクターpBTrp-PDC1-LDHKCBを構築した（図２）。

（染色体導入型ベクターの構築）
他の遺伝子を破壊することなく、染色体上にLDH遺伝子を導入するための染色体導入型ベクターpBble-LDHKCB（図３）を以下の方法で構築した。
（フレオマイシン耐性マーカーカセットの構築）
抗生物質フレオマイシン耐性遺伝子を大腸菌XL1-Blue MRF’ Kan株（STRATAGENE）のゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより増幅した。大腸菌のゲノムDNAは、LB培地にて一晩振盪培養を行った後、集菌、洗浄したものを98℃ 10分間の加熱処理したのち遠心分離した上清を、エタノール沈殿し、滅菌水50μlに溶解することにより調製した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・Tn5ble-U（配列番号１６）ata tat gaa ttc atg acc gac caa gcg acg c （EcoRIサイトを付加）
・Tn5ble-D（配列番号１７）ata tat aag ctt tca tga gat gcc tgc aag c（HindIIIサイトを付加）
得られたPCR増幅断片（0.4kb）を制限酵素EcoRIおよびHindIIIで消化したものをTn5 ble断片と称した。

Tn5 bleを酵母菌体内で発現できるようにするために、CYC1プロモータ配列およびCYC1ターミネーター配列を酵母IFO2260株のゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・CYCP-U（配列番号１８）ata tat gga tcc gac agc atc gtc gaa tat g（BamHIサイトを付加）
・CYCP-D（配列番号１９）ata tat gaa ttc tat taa ttt agt gtg tgt att tg（EcoRIサイトを付加）
・CYCT-U（配列番号２０）ata tat aag ctt aca ggc ccc ttt tcc ttt g（HindIIIサイトを付加）
・CYCT-D（配列番号２１）ata tat gtc gac gtt aca tgc gta cac gcg （SalIサイトを付加）

PCRプライマーCYCP-UおよびCYCP-Dを用いて増幅されたCYC1プロモータ配列（0.5kb）を制限酵素BamHIおよびEcoRIで消化したものをCYC1P断片と称した。PCRプライマーCYCT-UおよびCYCT-Dをもちいて増幅されたCYC1ターミネーター配列（0.2kb）を制限酵素HindIIIおよびSalIで消化したものをCYC1T断片と称した。

上記操作で得られたCYC1P断片、Tn5 ble断片およびCYC1T断片を、この順番で並ぶように順次pBluescriptII SK+ベクターのマルチクローニングサイトに連結してフレオマイシン耐性マーカーカセットを構築した。得られたベクターを制限酵素SpeIおよびApaIで消化することによりフレオマイシン耐性マーカーカセットを切り出し、末端を平滑化したものをフレオマイシン耐性マーカーカセット断片と称した。

（染色体導入型ベクターpBble-LDHKCBの構築）
先に構築したpBTrp-PDC1-LDHKCBを制限酵素BamHIおよびPstIにより消化して切り出したものをLDHKCB発現カセット断片（PDC1P断片、LDHKCB断片およびTDH3t断片がこの順番で連結された断片）と称した。

相同組み換え配列であるPDC5遺伝子下流領域配列およびSLX4遺伝子上流領域配列を、酵母IFO2260株のゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・PDC5D-U（配列番号２２） cca tga tta gat ggg gtt tg
・PDC5D-D（配列番号２３） ctg gaa gac agg aca gaa
・SLX4-F（配列番号２４）aat tat gtc gac ggt taa aga tta gct tct aat （SalIサイトを付加）
・SLX4-R（配列番号２５）ata taa ggt acc caa ctg aac tac tgg tta tta tta tg（KpnIサイトを付加）
PCRプライマーPDC5D-UおよびPDC5D-Dをもちいて増幅されたPDC5遺伝子下流領域配列（0.6kb）をPDC5D断片と称した。PCRプライマーSLX4-FおよびSLX4-Rをもちいて増幅されたSLX4遺伝子上流領域配列（0.7kb）を制限酵素SalIおよびKpnIで消化したものをSLX4断片と称した。
上記操作で得られた各断片（PDC5D断片、LDHKCB発現カセット断片、フレオマイシン耐性マーカーカセット断片およびSLX4断片）を、順次pBluescriptII SK+ベクターのマルチクローニングサイトに連結して、染色体導入型ベクターpBble-LDHKCB（図３）を構築した。

（４コピー体の作製）
pBble-LDHKCBベクターを制限酵素SacIおよびKpnIで消化した断片をもちいて、実施例１で作製されたPDC1破壊株（PDC1p-LDH２コピー体）の形質転換を行った。形質転換処理を行った菌体をフレオマイシン選択培地（10μg/mlのフレオマイシンを含むYPD培地）に塗沫し、生育してきたコロニーを新たなフレオマイシン選択培地に画線培養してコロニーを純化した。純化された選抜株について、実施例1と同様な方法で胞子を誘導し、胞子解剖を行った。YPDプレート上で分離した胞子を30℃で4日間培養して、生育したクローンをフレオマイシン選択培地にレプリカし、同時にゲノムDNAを調製した。このゲノムDNAを鋳型として、ゲノム上のPCRプライマーであるPDC5-320Fとベクター上のPCRプライマーであるLDHKCB-R（配列番号７）を用いてPCRを行ったところ、トリプトファン選択培地で生育したコロニーのみで４kbのバンド増幅された。さらにゲノム上のPCRプライマーであるPDC5+2788Rとベクター上のPCRプライマーであるTCYC-F1を用いてPCRを行ったところ、フレオマイシン選択培地で生育したコロニーのみで1.9kbのバンド増幅された。このことから、フレオマイシン選択培地で生育したコロニーは酵母染色体上のPDC5遺伝子とSLX4遺伝子の間に、両遺伝子を破壊することなく挿入されていることが確認された。この操作で得られた株はPDC1構造遺伝子がホモ破壊されており、PDC1プロモータによって発現するLDH遺伝子が４コピー導入されている。そこでこの株をPDC1破壊株（PDC1p-LDH４コピー体）と称した。用いたPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・PDC5-320F（配列番号２６）5'- atg gga aaa gcc tcc ata tcc aaa ggt c -3'
・PDC5+2788R（配列番号２７）5'- ttc gta gtc tct tgc gtc ata g -3'
・TCYC-F1（配列番号２８）5'- ttg tct aac tcc ttc ctt ttc g -3'

（ADH1遺伝子破壊用ベクターの構築）
本実施例では、酵母の染色体上に存在するアルコール脱水素酵素をコードするADH1遺伝子を破壊すると同時に、破壊された該ADH1プロモーターの制御下にウシ由来LDH遺伝子を挿入することのできるDNA構築物を構築した。操作過程を図４に示す。

まず、既に取得したウシ由来のLDH遺伝子にTDH3ターミネーターを接続し、さらに酵母用マーカーセット（ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを含むベクター（pBHPH-LDHKCBpreと称する。）を作製した（図５）。作製方法を以下に示す。

既知文献（K.R.Kaster, S.G.Burgett, R.N.Rao, T.D.Ingolia Analysis of a bacterial hygromycin B resistance gene by transcriptional and translational fusions and by DNA sequencing. Nucleic Acids Research. Vol.11 (19), p6895-6911 (1983)、および L.Gritz, J.Davies Plasmid-encoded hygromycin B resitance; the sequence of hygromycin B phospotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Gene. Vol.25, p179-188 (1983)）に基づいてHPH遺伝子配列情報を取得して、以下のPCRプライマーを合成した。
・HPH-U（配列番号２９）5’- atg aaa aag cct gaa ctc acc -3’
・HPH-D （配列番号３０）5’- cta ttc ctt tgc cct cgg acg -3’
次に大腸菌K12株ゲノムDNAを鋳型としたPCR反応によりHPH遺伝子（１kb）を増幅したものをHPH断片と称した。

HPH遺伝子を酵母菌体内で発現できるようにするためにTDH3プロモーターを酵母IFO2260株のゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・TDH3P-U（配列番号３１）5’-ata tat gga tcc tag cgt tga atg tta gcg tca ac -3’（BamHIサイトを付加）
・TDH3P-D（配列番号３２）5’-ata tat ccc ggg ttt gtt tgt tta tgt gtg ttt att cg -3’（SmaIサイトを付加）
増幅されたTDH3プロモータ配列（0.8kb）を制限酵素BamHIおよびSmaIで消化したものをTDH3P断片と称した。
上記操作で得られたTDH3P断片と、HPH遺伝子断片および実施例２のCYC1T断片を、この順番で並ぶように順次pBluescriptII SK+ベクターのマルチクローニングサイトに連結して得られたベクターをpBHPH-PTベクターと称した。次にpBHPH-PTベクター中に実施例2のLDHKCB発現カセット断片を連結して得られたベクターをpBHPH-LDHKCBpre（図５）と称した。

次に、pBHPH-LDHKCBpreベクターを鋳型とするPCR法により、ADH1プロモーターの直後にウシ由来のLDH遺伝子とTDH3ターミネーターと上記マーカーとが導入されて、ADH1遺伝子の全長が破壊されるとともに、ADH1プロモーターの制御下にLDH遺伝子が導入されるような染色体導入を可能とするＤＮＡ断片が得られるような相同組換え用ＤＮＡ配列を含むPCRプライマー１(配列番号３３)及びプライマー２(配列番号３４)を合成した。これらのプライマー１、２を用いpBHPH-LDHKCBpreベクターを鋳型としてPCR法を行うことで目的のＤＮＡ断片を増幅した。

なお、上記プライマー配列１、２においては、それぞれ５'側の75mer（上流側）と77mer（下流側）とが付加された相同組換え用配列である。Ex-Taq（TaKaRa）の付属のプロトコールに従って３００μＬのPCR反応液を調製した。PCR反応サイクルは、９４℃で１分の後、９４℃で１５分と５０℃で３０分および７２℃で３．７分を１サイクルとし、合計３０サイクル実施した。PCR反応後、反応液１μＬをアガロースゲル電気泳動にかけて３．７Ｋｂの目的のＤＮＡ断片がシングルバンドで確認することができた。

（PDC1／ADH1破壊株の作製）
実施例２で得たPCR反応液の残液の全量をエタノール沈殿して得られたＤＮＡ約１０μｇを用いて、実施例１で作製したPDC1破壊株（PDC1p-LDH／2コピー体）を形質転換した。

形質転換を行った菌体をYPD培地で２日間振とう培養し、その培養液50μlを、ハイグロマイシン選択プレート（150μg/mlハイグロマイシンを含有するYPDプレート）に塗布した。30℃で３日間培養して生育したコロニーを、新しいハイグロマイシン選択プレートに画線培養してコロニーを純化した。純化された選抜株について、実施例1と同様な方法で胞子を誘導し、胞子解剖を行った。YPDプレート上で分離した胞子を30℃で4日間培養して、生育したクローンをハイグロマイシン選択培地にレプリカし、同時にゲノムDNAを調製した。

このゲノムＤＮＡを鋳型とし、PCRをプライマーとして図４に示す３種（ADH1-206F、ADH1+857R、LDH-R）を（Ａ）ADH1-206FとADH1+857R、（Ｂ）ADH1-206FとLDH-Rの組み合わせで用いてPCRを行ったところ、（Ａ）の組み合わせではハイグロマイシン選択プレートで生育できなかったクローンのみで1.1Kbのバンドが増幅され、（Ｂ）の組み合わせではハイグロマイシン選択プレートで生育したクローンのみで1.2Kbのバンドが増幅された。このことから、ハイグロマイシン選択プレートで生育したクローンは、ADH1が破壊され、ADH1プロモーターの下流にLDHが挿入されていることが確認された。以上により、PDC1／ADH1破壊株を取得した。PDC1／ADH1破壊株では、染色体上のPDC1遺伝子の全長が破壊されるとともにPDC1プロモーターの制御下にLDH遺伝子が導入されていると同時に染色体上のADH1遺伝子の全長が破壊されているとともにADH1プロモーターの制御下にLDH遺伝子が導入されていた。この破壊株においてはLDH遺伝子は計４コピー存在することになる。なお、用いたプライマー配列は以下のとおりであった。
・ADH1-206F（配列番号：３５）5’- taa tga gca acg gta tac gg -3’
・ADH1+857R（配列番号：３６）5’- acg act tgg ttg aag aca tca g -3’
・LDH-R（配列番号：３７）5’- tta tta aaa ttg caa ttc ttt ttg aat -3’

（発酵試験）
実施例４で作製したPDC1／ADH1破壊株を、５ｍｌのYPD2（グルコース濃度２％のYPDである。）を入れた試験管に接種し、３０℃で１日間回転振とう培養（１３０ｒｐｍ）して前培養を行った。生育した菌体を遠心分離により集菌して前培養菌体とした。本培養は次のように行った。１００ｍｌ容の三角フラスコに２０ｍｌのYPD10（グルコース濃度１０％のYPDである。）を加え、中和剤として５％（ｗ／ｖ）の炭酸カルシウムを添加した。そこに前培養菌体を初発菌体濃度がＯＤ６００＝３．８となるように接種し、シリコン栓をして３０℃、８０ｒｐｍで回転振とう培養を行った。経時的に培養液を採取して遠心分離した上清中のＬ−乳酸、エタノール濃度を酵素センサー（王子計測機器、バイオセンサーＢＦ−４）により測定した。なお、同様に、実施例１および実施例２で作製したPDC1破壊株（PDC1p-LDH２コピー体および4コピー体）についても発酵試験を行った。各株の乳酸生産量の経時変化を図６に示し、各株のエタノール生産量の経時変化を図７に示す。

図６及び図７に示すように、PDC1破壊株（PDC1p-LDH２コピー体および4コピー体）（最大４．１％及び５．１％）よりもPDC1／ADH1破壊株の方が高い乳酸生産量（８％）を示した。すなわち、PDC1破壊株においてコピー数を倍にしてもほとんど乳酸生産量は増加しなかったが、ADH1遺伝子を破壊し、該プロモーターの制御下にLDH遺伝子を導入することにより、約２倍の乳酸生産量となった。また、PDC1／ADH1破壊株においては、エタノール生産量もPDC1破壊株の約１／３となっており、酵母のエタノール発酵が効果的にかつ十分に低く抑制されていることがわかった。

図６からも明らかなように、PDC1破壊株においては、LDH遺伝子のコピー数は倍になっているものの、ほとんど乳酸生産量は増えておらず、PDC1破壊株においては必ずしもLDH遺伝子のコピー数に応じて乳酸生産量が増加するとはいえなかった。このような状況下、ADH1破壊によって乳酸生産量がおおよそ倍加しているということは予想を越えるものであり、本実施例のPDC1／ADH1破壊株は、乳酸生産に高度に最適化された高発現系を備えているといえる。

（HOR7プロモーターによるLDH発現株の作製）
HOR7プロモーターによるLDH発現株は、図８に示すpBTrp-HOR7p-LDHベクターを用いて作製した。すなわち、pBTrp-HOR7p-LDHベクターを制限酵素SacIおよびApaIで消化した断片をもちいて、宿主である酵母IFO2260株のトリプトファン要求性変異株の形質転換を行った。形質転換処理を行った菌体について、実施例１と同様な操作によってPDC1破壊株（HOR7p-LDH２コピー体）を作製した。この株は、染色体上のPDC1構造遺伝子部分が破壊され、HOR7プロモータの制御下でLDHが発現されている。

なお、pBTrp-HOR7p-LDHベクターは、以下の方法で構築したものである。
１．pBTRP-PDC1-LDHKCBベクターを制限酵素ApaIとPstIで消化して得られたTRP1-PDC1D断片を、同じ制限酵素で消化したpBluescriptII SK+ベクターに導入し、pBTRP-PDC1Dベクターを構築した。
２. 相同組み換え配列であるSTU2配列を、酵母IFO2260株のゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・STU2-U（配列番号：３８）ata tat gag ctc gga cgt caa cta tga aa（SacIサイトを付加）
・STU2-D（配列番号：３９）ata tat gcg gcc gcg gta tgg gtg cag tg（NotIサイトを付加）
増幅されたSTU2配列（0.7kb）を制限酵素SacIとNotIで消化したものをSTU2断片と称した。
３. HOR7遺伝子プロモータ配列を、酵母IFO2260株のゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・HOR7P-U（配列番号：４０）ata tat gcg gcc gct cgc agc cac ggg tca acc cg（NotIサイトを付加）
・HOR7P-D（配列番号：４１）ata tat act agt ttt tat tat tag tct ttt ttt ttt ttg ac（SpeIサイトを付加）
増幅されたHOR7遺伝子プロモータ配列（0.8kb）を制限酵素NotIとSpeIで消化したものをHOR7P断片と称した。
４. LDHKCB-TDH3T配列を、pBTrp-PDC1-LDHKCB鋳型にしてPCRにより増幅した。使用したPCRプライマーの配列は以下の通りであった。
・LDHKCB-F（配列番号：４２）ata att act agt aca atg gct act ttg aaa gat caa （SpeIサイトを付加）
・TDH3t-BR（配列番号：４３）tta att gga tcc aaa gct ttc aat caa tga atc gaa aa（BamHIサイトを付加）
増幅されたLDHKCB-TDH3T配列を制限酵素SpeIとBamHIで消化したものをLDHKCB-TDH3T断片と称した。
５. 上記操作で得られた各断片（STU2断片、HOR7P断片、LDHKCB-TDH3T断片）を、順次前記のpBTRP-PDC1Dベクターに連結して、染色体導入型ベクターpBTrp-HOR7-LDHを構築した（図８）。

（PDC1／ADH1破壊株の作製）
実施例４と同様の操作により、実施例６で作製したPDC1破壊株（HOR7p-LDH２コピー体）のADH1遺伝子を破壊すると同時に、破壊された該ADH1プロモーターの制御下にウシ由来LDH遺伝子が発現する組換え体を作製した。本実施例で作製されたPDC1／ADH1破壊株では、染色体上のPDC1遺伝子の全長が破壊されるとともにHOR7プロモーターの制御下にLDH遺伝子が導入されていると同時に染色体上のADH1遺伝子の全長が破壊されているとともにADH1プロモーターの制御下にLDH遺伝子が導入されていた。この破壊株においてはLDH遺伝子は計４コピー存在することになる。

（発酵試験）
実施例７で作製したPDC1／ADH1破壊株を、５ｍｌのYPD2（グルコース濃度２％のYPDである。）を入れた試験管に接種し、３０℃で１日間回転振とう培養（１３０ｒｐｍ）して前培養を行った。生育した菌体を遠心分離により集菌して前培養菌体とした。本培養は次のように行った。１００ｍｌ容の三角フラスコに２０ｍｌのYPD10（グルコース濃度１０％のYPDである。）を加え、中和剤として５％（ｗ／ｖ）の炭酸カルシウムを添加した。そこに前培養菌体を初発菌体濃度がＯＤ６００＝３．８となるように接種し、シリコン栓をして３０℃、８０ｒｐｍで回転振とう培養を行った。経時的に培養液を採取して遠心分離した上清中のＬ−乳酸、エタノール濃度を酵素センサー（王子計測機器、バイオセンサーＢＦ−４）により測定した。なお、同様に、実施例６で作製したPDC1破壊株（HOR71p-LDH２コピー体）についても発酵試験を行った。両株の乳酸生産量の経時変化を図９に示し、両株のエタノール生産量の経時変化を図10に示す。

図９及び図10に示すように、PDC1破壊株（HOR7p-LDH２コピー体）（最大7.4％）よりもPDC1／ADH1破壊株の方が高い乳酸生産量（9.3％）を示した。すなわち、PDC1破壊株（HOR7p-LDH２コピー体）のADH1遺伝子を破壊し、該プロモーターの制御下にLDH遺伝子を導入することにより、約1.25倍の乳酸生産量となり、糖から乳酸への変換効率（対糖収率）は93％と非常に高い値を示した。また、PDC1／ADH1破壊株においては、エタノール生産量もPDC1破壊株の約１／３となっており、酵母のエタノール発酵が効果的にかつ十分に低く抑制されていることがわかった。

配列番号：４合成ＤＮＡ
配列番号：６〜４３
プライマー

酵母におけるピルビン酸からのアルコール発酵経路と乳酸生産の経路とを示す図。染色体導入型ベクターpBTrp-PDC1-LDHKCBを示す図。染色体導入型ベクターpBble-LDHKCBを示す図。ＰＤＣ１／ＡＤＨ１破壊株の作製スキームを示す図。ベクターpBHPH-LDHKCBpreを示す図。ＰＤＣ１破壊株およびＰＤＣ１／ＡＤＨ１破壊株のＬ−乳酸生産量を示すグラフ。ＰＤＣ１破壊株およびＰＤＣ１／ＡＤＨ１破壊株のエタノール生産量を示すグラフ。染色体導入型ベクターpBTrp-HOR7p-LDHを示す図。ＰＤＣ１破壊株およびＰＤＣ１／ＡＤＨ１破壊株のＬ−乳酸生産量を示すグラフ。ＰＤＣ１破壊株およびＰＤＣ１／ＡＤＨ１破壊株のエタノール生産量を示すグラフ。

Claims

乳酸生産酵母であって、
ピルビン酸脱炭酸酵素活性およびアルコール脱水素酵素活性がそれぞれ低下され、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備える、酵母。
ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されている、請求項１に記載の酵母。
アルコール脱水素酵素遺伝子が破壊されている、請求項１または２に記載の酵母。
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられている、請求項１〜３のいずれかに記載の酵母。
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質のコードするＤＮＡは、酵母染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられている、請求項４に記載の酵母。
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられている、請求項１〜４のいずれかに記載の酵母。
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、酵母染色体上のアルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現可能に備えられている、請求項６に記載の酵母。
乳酸生産酵母であって、
染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子が破壊されるとともに破壊された該遺伝子のプロモーターの制御下で乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備え、
染色体上のアルコール脱水素酵素遺伝子が破壊されるとともに破壊された該遺伝子のプロモーターの制御下で乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを発現可能に備える、酵母。
前記ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子は、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子である、請求項１〜８のいずれかに記載の酵母。
前記アルコール脱水素酵素遺伝子は、アルコール脱水素酵素１遺伝子である、請求項１〜９のいずれかに記載の酵母。
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質はウシ由来である、請求項１〜１０のいずれかに記載の酵母。
前記乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを複数有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の酵母。
前記酵母はサッカロマイセス属に属する、請求項１〜１２のいずれかに記載の酵母。
前記酵母は、サッカロマイセス・セレビジエである、請求項１３に記載の酵母。
有機酸の生産方法であって、
請求項１〜１４のいずれかに記載の乳酸生産酵母を培養する工程を備える、生産方法。