JP2006296377A - 有機酸生産用形質転換体 - Google Patents

Abstract

【課題】有機酸の発酵生産に際し、相応の対遺伝子導入数効果又は対遺伝子導入数効果の高い遺伝子発現系を提供する。
【解決手段】複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを保持するように形質転換体を作製する。複数種類のプロモーターによって有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを発現させることで、単一プロモーターによる発現時より高い発現増強効果が得られる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、有機酸生産に使用するための形質転換体に関し、詳しくは、微生物による有機酸生産に関し、対遺伝子導入数効果の高い複数種類のプロモーターを組み合わせて備える形質転換体に関する。

遺伝子組換え酵母などの遺伝子組換え微生物を培養すると、発酵生産により大量の目的遺伝子を生産させることが可能であるが、こうした遺伝子組換え技術を利用して物質生産を行う場合には、高発現プロモーターが必要である。例えば、Ｌ−乳酸やＤ−乳酸脱水素酵素遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエ属に導入して、乳酸を生産する試みに関しては多数の報告がなされているが、そのほとんどにおいて十分な生産量が得られていない。こうしたなかで、本出願人らは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣ１）プロモーターが遺伝子組換え酵母による乳酸などの発酵生産において高い乳酸生産量を得られるプロモーターであることを見出し既に開示している（特許文献１）。また、染色体中のＰＤＣ１遺伝子を破壊するとともに当該遺伝子のプロモーターの下流に乳酸脱水素酵素遺伝子を結合させることでＰＤＣ１遺伝子のプロモーター機能を利用して乳酸脱水素酵素遺伝子を発現させつつ、本来のＰＤＣ１タンパク質の機能を制御したシステムも見出している（特許文献２）。
特開２００３−１６４２９４ 特開２００３−１６４２９５

組換え微生物における発酵生産においては、常に一層の大量生産が要請される。ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを利用した上記システムを用いて乳酸を高生産するには、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを用いて乳酸脱水素酵素を複数個導入した組換え微生物の利用が試みられることが多い。しかしながら、ＰＤＣ１プロモーターを利用して外来遺伝子を複数コピー導入した場合には、相応の生産量（効果）が得られる。しかしながら、外来遺伝子の導入数が多いと宿主酵母の生育能が低下し、グルコースの消費能が低下するといった問題があることもわかった。グルコース消費能の低下は、発酵速度が遅延して培養期間が長期間化することになる。

そこで、本発明は、有機酸の発酵生産に際し、相応の対遺伝子導入数効果又は対遺伝子導入数効果の高い遺伝子発現系を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、複数個遺伝子導入しても、グルコースなど炭素原代謝能を維持又は増大させることができる遺伝子発現系を提供することを他の一つの目的とする。さらに、本発明は、乳酸の発酵生産に適した遺伝子発現系を提供することを他の一つの目的とする。

本発明者らは、上記した課題を解決するために検討を重ねたところ、予想に反し、複数種類のプロモーターを組み合わせることにより、強力なプロモーターであるＰＤＣ１遺伝子プロモーターを用いた場合の対遺伝子導入数効果を上回る対遺伝子導入数効果を得ることを見出し、本発明を完成した。本発明によれば、以下の手段が提供される。

本発明の一つの態様によれば、複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを保持する形質転換体が提供される。

前記複数種類のプロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２（ＴＤＨ２）遺伝子プロモーター、熱ショックタンパク質３０（ＨＳＰ３０）遺伝子プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７（ＨＸＴ７）遺伝子プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１（ＡＨＰ１）遺伝子プロモーター、膜タンパク質１（ＭＲＨ１）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１（ＴＤＨ１）遺伝子プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１（ＴＰＩ１）遺伝子プロモーター、細胞壁関連タンパク質１２（ＣＣＷ１２）遺伝子及びリボゾーマルプロテインＳ３１（ＲＳＰ３１）遺伝子プロモーターからなる群から選択されることが好ましい。

また、前記複数種類のプロモーターの少なくとも一種類はＰＤＣ１遺伝子プロモーターとすることができ、このとき、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターにより有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを少なくとも２コピーを保持していることが好ましい。

さらに、前記有機酸は乳酸であり、前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質とすることができる。この場合、前記有機酸はＤ−乳酸であり、前記タンパク質は、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及びＴＤＨ２遺伝子プロモーターから選択することができる。特に、前記複数種類のプロモーターは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及びＴＤＨ２遺伝子プロモーターとすることができる。また、前記複数種類のプロモーターにより合計１０コピー以下のＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが染色体上に導入されていることが好ましい。さらにまた、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを２コピーと、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及び／又はＴＤＨ２遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを２コピー以上と、を備えることも好ましい。

また、前記有機酸は、Ｌ−乳酸であり、前記タンパク質は、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター、ＴＤＨ２遺伝子プロモーター、ＴＤＨ３遺伝子プロモーター及びＨＯＲ７遺伝子プロモーターから選択することもできる。この複数種類のプロモーターは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターとＨＯＲ７遺伝子プロモーターとすることができる。また、前記複数種類のプロモーターにより合計１０コピー以下のＬ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが染色体上に導入されていることが好ましい。さらにまたＰＤＣ１遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを６コピー以上と、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及び／又はＴＤＨ２遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを２コピー以上と、を備えることも好ましい。

これらのいずれかの形質転換体においては、前記複数種類のプロモーターと前記コードＤＮＡとは、いずれも染色体上に保持されていることが好ましい。また、前記形質転換体は、酵母とすることができ、この場合、サッカロマイセス・セレビシエ属酵母とすることができる。

また、これらのいずれかの形質転換体においては、前記染色体上に保持される少なくとも一つの前記コードＤＮＡが染色体上のＰＤＣ１遺伝子を破壊していることが好ましい。

本発明の他の一つの態様によれば、有機酸生産用形質転換体の製造方法であって、
少なくとも、以下の２種類のＤＮＡ構築物：
ＰＤＣ１遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを備える第１のＤＮＡ構築物及び
ＰＤＣ１遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを備える第２のＤＮＡ構築物、
を宿主に導入することにより、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含む複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを保持する形質転換体を作製する工程を備える、製造方法が提供される。

また、本発明の他の一つの態様によれば、
有機酸の生産方法であって、
上記したいずれかの形質転換体を準備する工程と、
この形質転換体を培地において培養して有機酸を生産する工程と、
を備える、有機酸生産方法が提供される。

本発明は、複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを保持している形質転換体、その製造、その形質転換体を利用した有機酸生産、有機酸生産のために選択されるプロモーター群等に関する。以下、本発明の各種の態様について説明する。

１．形質転換体
本発明の形質転換体は、Eshrichia coli、Bacillus subtilisなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）などのサッカロマイセス属酵母、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、ｓｆ９、ｓｆ２１等の昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞など、遺伝子組換え細胞として利用可能な従来公知の宿主細胞から形質転換により有機酸生産が可能な細胞を用いることができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行う微生物あるいは耐酸性微生物である。酵母のエタノール発酵の酵素系列、特に、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子の破壊と当該遺伝子のプロモーターによる制御によって外来遺伝子を高発現可能であるからである。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属酵母が好ましい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株を例示できる。

本発明の形質転換体は、有機酸生産用とすることができる。本発明において「有機酸」とは、酸性を示す有機化合物であるが、有機酸が備える酸性基としては好ましくはカルボン酸基である。また、「有機酸」には、遊離の酸の他、有機酸塩を含む。このような有機酸として、具体的には、乳酸、酪酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸、マロン酸、プロピオン酸、アスコルビン酸、アジピン酸などを挙げることができ、好ましくは、乳酸である。乳酸には、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、及びＤＬ−乳酸があるが、これらのいずれをも含む。

１−１．プロモーター
本発明の形質転換体は、複数種類のプロモーターと、これらのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、コードＤＮＡという。）と、を保持している。以下、本形質転換体におけるプロモーターについて説明する。

本形質転換体における複数種類のプロモーターとしては、形質転換体においてプロモーター活性を発現可能なプロモーターの集合（プロモーター群）から選択される２種以上とすることができる。このようなプロモーター群としては、ピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）プロモーター、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）プロモーター、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）プロモーター及び細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）及びリボゾーマルプロテインＳ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーターから選択される２種類以上が挙げられる。これらはいずれも酵母における内在性プロモーターであり、本発明の形質転換酵母において好ましく用いられる。

こうしたプロモーター群から選択される複数種類のプロモーターとしては、少なくともＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。ＰＤＣ１プロモーターは、一定の遺伝子導入数以上でその遺伝子導入数に見合った遺伝子発現増強効果が得られにくくなるものの、単独で強力なプロモーターであるとともに、酵母において有機酸を生産させるのに有効なプロモーターであるからである。特に、酵母のＰＤＣ１遺伝子を破壊するとともにＰＤＣ１遺伝子プロモーターの制御下で有機酸生産に関与するタンパク質をコードする外来ＤＮＡを発現させることに有効である。

好ましい組み合わせのプロモーターを選択できるプロモーター群としては、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及びＴＤＨ２遺伝子プロモーターからなるプロモーター群が挙げられる。このプロモーター群から選択される２種類又は３種類のプロモーターの組み合わせは、Ｄ−乳酸の生産に適している。このプロモーター群に基づくプロモーターの組み合わせは、必ずしもＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含んでいる必要はないが、好ましくは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含んでいる。ＰＤＣ１遺伝子プロモーターに対して、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及びＴＤＨ２遺伝子プロモーターのいずれをも組み合わせることができるが、これら３種全てを含む組み合わせであってもよい。ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードＤＮＡを導入した形質転換体では、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを単独で利用して同導入数のコードＤＮＡを導入した形質転換体よりも高いＤ−乳酸生産量が得られる。また、このような形質転換体は、炭素源代謝能を維持又は向上させることができる。したがって、ＰＤＣ１多コピー導入のデメリットを回避することができる。

また、好ましい他のプロモーター群は、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター、ＴＤＨ２遺伝子プロモーター及びＴＤＨ３遺伝子プロモーターからなる群が挙げられる。このプロモーター群によれば、特に、Ｌ−乳酸の生産に適したプロモーターの組み合わせを得ることができる。このプロモーター群から構成される組み合わせにおいても、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含むことが好ましい。また、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターに対して、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター、ＴＤＨ２遺伝子プロモーター及びＴＤＨ３遺伝子プロモーターのいずれか又は２種類以上を組み合わせることが可能である。ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードＤＮＡを導入した形質転換体は、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを単独で利用して同導入数のコードＤＮＡを導入した形質転換体よりも高いＤ−乳酸生産量が得られ、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターによる多コピー数導入のデメリットを回避できる。ＰＤＣ１遺伝子プロモーターに組み合わせるプロモーターとしては、ＨＯＲ７遺伝子プロモーターが好ましい。

なお、本発明のプロモーターを構成するポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであってもよく、また、化学的な手法等により人工的に得られたＤＮＡであってもよい。

こうしたプロモーターとしては、配列番号１〜１２に記載される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。配列番号１〜１２に記載された塩基配列で示されるプロモーターは、それぞれ、酵母サッカロマイセスセレビジエのピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２遺伝子（ＴＤＨ２遺伝子）プロモーター、熱ショックタンパク質３０遺伝子（ＨＳＰ３０遺伝子）プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７遺伝子（ＨＸＴ７遺伝子）プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１遺伝子（ＡＨＰ１遺伝子）プロモーター、膜タンパク質１関連遺伝子（ＭＲＨ１遺伝子）プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１遺伝子（ＴＤＨ１遺伝子）プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（ＴＰＩ１遺伝子）プロモーター、細胞壁関連タンパク質１２遺伝子（ＣＣＷ１２遺伝子）リボゾーマルプロテインＳ３１遺伝子（ＲＳＰ３１遺伝子）プロモーターの各プロモーター活性を有するＤＮＡ断片として取得されたものである。本発明のプロモーターは、これらのプロモーターの他、他の酵母や微生物などから上記した塩基配列又はその一部に基づいてハイブリダイゼーション技術や、ＰＣＲ技術を利用して得られかつ同等のプロモーター活性を有するこれらのプロモーターの相同体を含んでいる。

プロモーターの相同体は、上記各配列番号に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその一部とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが挙げられる。具体的には、各配列番号に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部のＤＮＡをプローブとして、一般的なハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ＥＭ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９７５，９８，５０３．）により得ることができる。また、かかるＤＮＡは、各配列番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉ，ＲＫ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２３０，１３５０．， ｅｔ ａｌ．，Ｓａｉｋｉ， ＲＫ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９，４８７）により合成することもできる。こうしたＤＮＡの単離に好ましく用いられるストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であるハイブリダイゼーション条件あるいはこれと同様のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を意味している。よりストリンジェンシーの高い条件によれば、より相同性の高いＤＮＡを単離できる。かかるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が約４２℃、さらにストリンジェンシーの高い条件としては、５０％ホルムアミド存在下で約６５℃のハイブリダイゼーション条件を挙げることができる。

また、プロモーターの相同体は、各配列番号に記載の塩基配列において１あるいは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって酸性条件下でプロモーター活性を有するものが挙げられる。このようなＤＮＡは、既に述べたハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術等によって得ることもできるし、また、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ．＆ Ｆｒｉｔｚ，ＨＪ．，Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７，１５４，３５０）によって、各配列番号に記載の塩基配列に人工的に変異を導入することによっても得ることができる。

なお、これらのプロモーターの相同体における各配列番号記載の塩基配列との相同性は、単離されたＤＮＡにおいて７０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上である。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ），ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ＳＩＴ／ＦＡＳＴＡ．ｈｔｍｌ）などによって決定することができる。

本発明のプロモーターは、本プロモーター活性を有する限りこのような各種形態のＤＮＡの一部分であってもよい。

１−２.有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ
本形質転換体は、本プロモーターに対して機能的に結合された所望のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、コードＤＮＡともいう。）を備えている。コードＤＮＡは、ｃＤＮＡのみならず、転写されても翻訳されないＤＮＡ配列を含むものであってもよい。タンパク質は特に限定しないが、コードＤＮＡは乳酸等の有機酸生産のためのＤＮＡ、すなわち、有機酸生産に関連する酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとすることができる。かかるタンパク質をコードするＤＮＡを本プロモーターに対して機能的に結合させることで、相乗的に有機酸生産が促進されることが期待される。このような酵素としては、乳酸生産の場合には、Ｌ−乳酸脱水素酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素等の酵素、ピルビン酸生産の場合にはピルビン酸キナーゼ等、酢酸生産の場合にはピルビン酸オキシダーゼ等、コハク酸生産の場合にはスクシニルＣｏＡシンテターゼ等、リンゴ酸の場合にはフマル酸ヒドラターゼ等、クエン酸生産の場合にはクエン酸シンテターゼ等を例示できる。

乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）としては、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明において使用する乳酸脱水素酵素としては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。ＬＤＨとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。Ｌ−ＬＤＨとしては、ウシ由来のＬＤＨ（Ｌ−ＬＤＨ）である。例えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列番号１４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。また、かかるＬＤＨをコードするＤＮＡとしては、配列番号１３に記載される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。また、Ｄ−ＬＤＨとしては、大腸菌、タコ及び乳酸菌由来のものなどが挙げられる。好ましくは乳酸菌由来のＤ−ＬＤＨである。

１−３．プロモーターとコードＤＮＡとの保持形態
本発明の形質転換体は、本プロモーターと、コードＤＮＡとを備えるが、これらのセットは、細胞質あるいは宿主細胞において宿主染色体外において保持されていてもよいし、また、宿主染色体に組み込まれて保持されていてもよい。好ましくは染色体上に保持されている。

これらのセットが染色体上に保持されるときには、これらの染色体組み込みと同時に宿主染色体上の所望の遺伝子を破壊することができる。破壊する遺伝子は、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子であることが好ましいが、これについては後述する。例えば、サッカロマイセス属酵母などの酵母において、有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを用いて有機酸を生産する場合、ＰＤＣ１遺伝子を破壊することが好ましい。ＰＤＣ１遺伝子はオートレギュレーション機構が存在する遺伝子であるとともに、強力なプロモーターであるＰＤＣ１遺伝子プロモーターによって制御されるため、この遺伝子を破壊することにより、有機酸生産酵素と競合する関係にあるエタノール生産酵素であるピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制することができる。

特に、乳酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを用いて乳酸を生産する場合には、当該破壊形態が一層有効である。ＰＤＣ１遺伝子は、乳酸脱水素酵素の基質であるピルビン酸を基質とし乳酸脱水素酵素に対して競合的に作用するからである。該遺伝子を破壊することで、ピルビン酸脱炭酸酵素の発現を抑制し乳酸脱水素酵素を発現させることができ、同時に乳酸脱水素酵素は本プロモーターＤＮＡにより有機酸（乳酸）存在下において発現が活性化されるため、乳酸生産がより一層促進されるものと期待される。

ＰＤＣ１遺伝子を破壊する場合、ＰＤＣ１遺伝子座においてコードＤＮＡを発現させるのに用いるプロモーターは、上記したプロモーターのいずれであってもよいが、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター下でコードＤＮＡを発現させることが好ましい。ＰＤＣ１遺伝子プロモーターは、内在性のものであってもよいし、コードＤＮＡと同様に外来性であってもよい。

なお、ＰＤＣ１遺伝子は、本発明者らが既に開示しているように、オートレギュレーション機構が存在する遺伝子である（特開２００３−１６４２９５号）。オートレギュレーション機構とは、同じ機能を有する遺伝子が同一生物において複数存在し、通常、そのうちの少なくとも一つは発現しているが、残りは抑制されており、通常発現している遺伝子が破壊などにより機能しなくなった場合にのみ、残りの遺伝子が発現されてその機能を継続する機構を意味している。かかる機構が存在するため、例えば、酵母のＰＤＣ１遺伝子が破壊されたとしても、ＰＤＣ５遺伝子が活性化され、酵母のエタノール生産機能は維持され、生理的機能が維持されることになる。このようなオートレギュレーション機構が存在する遺伝子を破壊することで、生物自体の生存、増殖機能を維持することができて、結果として、外来ＤＮＡを保持する形質転換体の増殖を維持しながら目的産物を効果的に生産させることができる。

なお、多数のコピー数で本プロモーターの制御下でコードＤＮＡを宿主染色体に導入する場合、遺伝子の導入部位は特に限定しないが、副生成物であるグリセロール量を低減するという目的では、グリセロール生産に関与する遺伝子であるＧＰＤ１遺伝子、ＧＰＤ２遺伝子に導入し、これら遺伝子を破壊することが好ましい。この他、副生成物を低減させる目的であればその副生成物の生産に関連する遺伝子を破壊することが好ましい。これらの遺伝子座には、それぞれプロモーターとコードＤＮＡとのセットが１セットのみ導入されることが好ましい。

１−４．コードＤＮＡのコピー数
コードＤＮＡは、プロモーターの下流に機能的に結合された状態で保持される。こうした状態で保持されるコードＤＮＡのコピー数の合計は、２コピー又は３コピー以上である。コピー数は、用いるプロモーターの種類にもよるが、好ましくは１０コピー以下である。コピー数が１０を大きく超えると、宿主の増殖機能等の維持が難しくなる場合があるからである。

プロモーターとしてＰＤＣ１遺伝子プロモーターを利用する場合、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターは２コピー以上であることが好ましい。酵母においては宿主染色体上にＰＤＣ１遺伝子プロモーターを有しており、この遺伝子座を利用することでＰＤＣ１遺伝子プロモーターを２コピー保持することができる。また、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターは、コピー数におおよそ応じた範囲の発現増強効果が得られる範囲内で３コピー以上が保持されていてもよい。生産しようとする有機酸の種類や利用する宿主の種類等によりＰＤＣ１遺伝子プロモーターが有効に働くコピー数が異なる。

例えば、酵母におけるＤ−乳酸の製造にあたっては、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するコードＤＮＡは２コピーであることが好ましい。Ｄ−乳酸の生産にあたっては、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターによるコピー数が３以上であると、発現増強効果がコピー数に対応しなくなる傾向があるからである。

また、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを好ましくは２コピーと、この群のＰＤＣ１遺伝子プロモーター以外のプロモーターを好ましくは合計で２コピー以上、より好ましくは合計で４コピー以上備える形質転換酵母は、同数のコピー数でＰＤＣ１遺伝子プロモーターが導入された形質転換酵母よりも高いＤ−乳酸生産能を備えることができるとともに高い炭素源代謝能を備えることができる。特に、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターと、ＨＯＲ７遺伝子プロモーターとＴＤＨ２遺伝子プロモーターとの組み合わせが好ましく用いられる。

また、Ｌ−乳酸の生産にあたっては、好ましくは４コピー以上であり、より好ましくは６コピー以上、さらに好ましくは８コピー以上である。Ｌ−乳酸の場合、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターのコピー数が８コピー程度までは、コピー数におおよそ見あった発現増強効果が得られるからである。さらに、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを６コピー以上、より好ましくは８コピー以上とこのプロモーター群のＰＤＣ１遺伝子プロモーター以外の他のプロモーターを１コピー以上好ましくは２コピー以上保持する形質転換酵母は、同数のコピー数でＰＤＣ１遺伝子プロモーターが導入された形質転換酵母よりも極めて高いＬ−乳酸生産能を備えることができる。ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含むこれらの組み合わせを用いてコードＤＮＡを導入した形質転換体では、これらのプロモーターの総導入数と同導入数でＰＤＣ１遺伝子プロモーターを単独で利用してコードＤＮＡを導入した形質転換体よりも高いＤ−乳酸生産量が得られる。特に、ＨＯＲ７遺伝子プロモーターが好ましく用いられる。

２．形質転換体の製造方法
以上説明した形質転換体は、本プロモーターとコードＤＮＡとを備えるＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入し形質転換させることにより得ることができる。したがって、本発明の一つの態様として有機酸を生産する形質転換体の作製用のＤＮＡ構築物も包含する。プロモーターの少なくとも一つはＰＤＣ１遺伝子プロモーターであることから、少なくとも、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを備える第１のＤＮＡ構築物と、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを備える第２のＤＮＡ構築物とを宿主に導入することが好ましい。

（ＤＮＡ構築物）
ＤＮＡ構築物は、特に限定しないで、ＤＮＡそのもの、プラスミド（ＤＮＡ）、ウイルス（ＤＮＡ）バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の種類に応じて選択してベクターとしての形態をとることができる。

本発明におけるＤＮＡ構築物は、本プロモーターやコードＤＮＡを染色体上に組み込むためには、例えば、染色体のＰＤＣ１遺伝子座等の所定部位への相同組換え用のＤＮＡ配列を備えるようにする。このような染色体上への組み込みを実現するための相同組換え用ＤＮＡ配列の選択は、当業者において周知であり、当業者であれば必要に応じて適切な相同組換え用ＤＮＡ配列を選択して相同組換え用ＤＮＡ構築物を構成することができる。

なお、ＤＮＡ構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性Ｇ４１８遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、シクロヘキサミド耐性遺伝子等を使用することができる。

なお、ＤＮＡ構築物は、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。これにより本発明の形質転換体を得ることができる。本ＤＮＡ構築物の導入後、その宿主細胞は、選択培地で培養される。

なお、本ＤＮＡ構築物が宿主に導入されたか否か、あるいは染色体上の所望の部位に本ＤＮＡ構築物が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物については、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。

３．有機酸の生産方法
本発明の有機酸の生産方法は、これらの形質転換体のいずれかを準備する工程と、この形質転換体を培養する工程と、を備えている。本発明の形質転換体を培養することにより、培養液などの培地中に外来遺伝子の発現産物であるタンパク質を生成させることができる。このような有機酸生産方法によれば、複数種類のプロモーターによりコードＤＮＡの発現が促進されるため、有機酸を大量に生産させることができる。

本発明の方法において、前記培養工程の培養条件は適宜設定することができるが、例えば、乳酸製造のためには、静置培養、振とう培養、または通気攪拌培養等の通気条件を適宜選択して行うことができる。温度は、２５℃〜３５℃程度とし、ｐＨ４．０〜８．０の範囲とし、培養時間は２４〜７２時間程度とすることができる。なお、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。

この他、培養工程においては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。乳酸などの有機酸の生産にあたっては、必要に応じて産物である乳酸等の中和を行うかあるいは、連続的に乳酸を除去する等の処理を行うこともできる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。

培地から有機酸を分離する工程を実施することにより、有機酸を得ることができる。なお、本発明において培地とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。本方法の培養工程において有機酸を中和している場合には、適当な脱塩工程を実施することでフリーの有機酸を採取できる。必要に応じて、有機酸含有画分及びその精製物に対してエステル化等を行うことにより、各種の乳酸誘導体を得ることができる。

以下に、本発明の具体例を記載するが、本発明を以下の具体例に限定する趣旨ではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の態様で実施できる。

（２コピー染色体導入型ベクター）
（１）ＰＤＣ１プロモーター発現のベクター
ＰＤＣ１プロモーター下でＤ−乳酸脱水素酵素を発現させるためのｐＢＴｒｐ−ＰＤＣＩＰ−ＤＬＤＨＭＥベクターを作製した。なお、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣＩＰ−ＤＬＤＨＭＥベクターの構成図を図１に示す。

（２）ＴＤＨ２プロモーター発現用ベクターの作製
ＴＤＨ２プロモーター下でＤ−乳酸脱水素酵素を発現させるためのベクターを、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣＩＰ−ＤＬＤＨＭＥベクターのＤ−ＬＤＨ・ＣＹＣ１Ｔカセットを制限酵素ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩで切り出して、ｐＢＴｒｐ−ＴＤＨ２Ｐ−ＬＤＨベクターのＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩサイトに導入してｐＢＴｒｐ−ＴＤＨ２Ｐ−ＬＤＨベクターを構築した。なお、ｐＢＴｒｐ−ＴＤＨ２Ｐ−ＬＤＨベクターを図２に示す。

（３）ＨＯＲ７プロモーター発現用ベクターの作製
ＨＯＲ７プロモーター下でＤ−乳酸脱水素酵素を発現させるためのベクターを、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣＩＰ−ＤＬＤＨＭＥベクターのＤ−ＬＤＨ・ＣＹＣ１Ｔカセットを制限酵素ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩで切り出して、ｐＢＴｒｐ−ＨＯＲ７Ｐ−ＬＤＨベクターのＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩサイトに導入してｐＢＴｒｐ−ＨＯＲ７Ｐ−ＬＤＨベクターを構築した。なお、ｐＢＴｒｐ−ＨＯＲ７Ｐ−ＬＤＨベクターを図３に示す。

（４コピー染色体導入型ベクターの作製）
（１）ＨＯＲ７発現用ベクター
ｐＢＴｒｐ−ＨＯＲ７−ＬＤＨベクターのＨＯＲ７Ｐ・Ｄ−ＬＤＨ・ＣＹＣ１Ｔカセットを制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで切り出して、ｐＢＣＡＴ−ＰＴベクターのＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩサイトに導入して、ｐＢＣＡＴ−ＨＯＲ７Ｐ−ＤＬＤＨｐｒｅベクターを構築した。次いで、このベクターに、ＰＣＲ増幅して得たＧＰＤ１下流断片とＧＰＤ１上流断片を順次連結して、ｐＢＣＨＯ−ＤＬＤＨベクター（図４）を構築した。なお、ＧＰＤ１上流及び下流断片のＰＣＲ増幅には、表１に示すプライマーを用いるとともに、ＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑ（商標）を用い、Ｇｅｎｅ ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製）で９４℃、１分の処理後、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒及び７２℃で３０秒を１サイクルとする反応を２５サイクル実施後、４℃で保冷して増幅断片を得た。鋳型ＤＮＡは、酵母ＩＦＯ２２６０のゲノムを用いた。なお、ｐＢＣＡＴ−ＰＴベクターを、図５に示す。

（２）ＰＤＣ１プロモーター発現のベクター
ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＤＬＤＨＭＥベクターのプロモーターカセットを制限酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで切り出して、ｐＢＣＨＯ−ＤＬＤＨベクターのＮｏｔＩ／ＳｐｅＩサイトに導入して、ｐＢＣＰＤ−ＤＬＤＨｐｒｅベクターを構築した。次いで、このベクターのＮｏｔＩサイトにＧＰＤ１上流断片を連結して、ｐＢＣＰＤ−ＤＬＤＨベクター（図６）を構築した。

（３）ＴＤＨ２プロモーター発現用ベクター
ｐＢＴｒｐ−ＴＤＨ２Ｐ−ＤＬＤＨベクターのプロモーターカセットを制限酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで切り出して、ｐＢＣＨＯ−ＤＬＤＨベクターのＮｏｔＩ／ＳｐｅＩサイトに導入して、ｐＢＣＰＤ−ＤＬＤＨｐｒｅベクターを構築した。次いで、このベクターのＮｏｔＩサイトにＧＰＤ１上流断片を連結して、ｐＢＣＴＤ−ＤＬＤＨベクター（図７）を構築した。

（６コピー染色体導入型ベクターの作製）
（１）ＨＯＲ７プロモーター発現用ベクター
ｐＢｈｐｈ−ＰＴベクターのＴＤＨ３・ハイグロマイシン・ＣＹＣ１Ｔカセットを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで切り出して、ｐＢＣＨＯ−ＤＬＤＨのＳｐｅＩ／ＸｈｏＩサイトに導入して、ｐＢＨＨＯ−ＤＬＤＨベクターを構築した。次いで、本ベクターにＰＣＲ増幅したＧＰＤ２下流断片及びＧＰＤ２上流断片を順次連結して、ｐＢＨＨＯ２−ＤＬＤＨベクター（図８）を構築した。なお、ＧＰＤ２上流及び下流断片のＰＣＲ増幅には、表２に示すプライマーを用いるとともに、ＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑ（商標）を用い、Ｇｅｎｅ ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製）で９４℃、１分の処理後、９４℃で３０秒、５３℃で３０秒及び７２℃で３０秒を１サイクルとする反応を２５サイクル実施後、４℃で保冷して増幅断片を得た。鋳型ＤＮＡは、酵母ＩＦＯ２２６０のゲノムを用いた。なお、ｐＢｈｐｈ−ＰＴベクターを、図９に示す。

（２）ＴＤＨ２プロモーター発現用ベクター
ｐＢＴｒｐ−ＴＤＨ２Ｐ−ＤＬＤＨベクターのプロモーターカセットを制限酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで切り出して、ｐＢＨＨＯ−ＤＬＤＨベクターのＮｏｔＩ／ＳｐｅＩサイトに導入して、ｐＢＨＴＤ−ＤＬＤＨｐｒｅベクターを構築した。次いで、このベクターのＮｏｔＩサイトにＧＰＤ２上流断片及び下流断片を順次連結して、ｐＢＨＴＤ２−ＤＬＤＨベクター（図１０）を構築した。

（２）ＰＤＣ１プロモーター発現用ベクター
ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１Ｐ−ＤＬＤＨＭＥベクターのプロモーターカセットを制限酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで切り出して、ｐＢＨＨＯ−ＤＬＤＨベクターのＮｏｔＩ／ＳｐｅＩサイトに導入して、ｐＢＨＰＤ−ＤＬＤＨｐｒｅベクターを構築した。次いで、このベクターのＮｏｔＩサイトにＧＰＤ２上流断片及び下流断片を順次連結して、ｐＢＨＰＤ２−ＤＬＤＨベクター（図１１）を構築した。

なお、上記の一連のＤＮＡ連結反応は、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ（プロメガ社製）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。また、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応溶液のコンピテント細胞への形質転換には、大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社製）を使用した。いずれの場合も、抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレート下でコロニー選抜を行い、各コロニー用いたコロニーＰＣＲを行うことで、目的のベクターであるかを確認した。なお、エタノール沈殿処理、制限酵素処理等の一連操作の詳細なマニュアルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ “Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ”（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ． １９８９）に従った。

（Ｄ−乳酸生産形質転換酵母の作製）
（１）２コピー導入株の作製
宿主である酵母ＩＦＯ２２６０株（社団法人・発酵研究所に登録されている菌株）のトリプトファン合成能が欠損した株をＹＰＤ培養液１０ｍｌにて、３０℃で対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）まで培養した。これにＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例１にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素ＰｖｕＩＩ処理し、遺伝子導入した。なお、具体的な導入ベクターは、ｐＢＴＲＰ−ＰＤＣ１Ｐ−ＤＬＤＨＭＥベクター、ｐＢＴＲＰ−ＴＤＨ２Ｐ−ＤＬＤＨベクター、ｐＢＴＲＰ−ＨＯＲ７Ｐ−ＤＬＤＨベクターの３種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、１００μｌの滅菌水に溶解させてトリプトファン選抜培地に塗沫し、それぞれについて３０℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。

得られたそれぞれのコロニーを新たなトリプトファン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をＹＰＤ培養液２ｍｌで一晩培養し、コロニーＰＣＲ解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。

この株を胞子形成培地（１％酢酸カリウム、２％アガ−含有）において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行った。２倍体である染色体のＰＤＣ１遺伝子領域の両方にＰＤＣ１遺伝子が破壊されたＤ−ＬＤＨ遺伝子が組み込まれている株を取得した。このうち、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子のプロモーターがＰＤＣ１遺伝子プロモーターであるものをＴＣ１４株、ＴＤＨ２遺伝子プロモーターであるものをＴＤ１０株、ＨＯＲ７遺伝子プロモーターであるものをＴＤ９株とした。

（２）４コピー導入株の作製
Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が２コピー導入されたＴＣ１４株の一つであるＴＣ１４−６−３Ａ株をＹＰＤ培養液１０ｍｌにて、３０℃で対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）まで培養した。これにＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例２にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｓｔＸＩで処理し、遺伝子導入した。なお、具体的な導入ベクターは、ｐＢＣＴＤ−ＤＬＤＨベクター、ｐＢＣＨＯ−ＤＬＤＨベクター、ｐＢＣＰＤ−ＤＬＤＨベクターの３種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、１００μｌの滅菌水に溶解させてクロラムフェニコール選抜培地に塗沫し、それぞれについて３０℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。

得られたそれぞれのコロニーを新たなクロラムフェニコール選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をＹＰＤ培養液２ｍｌで一晩培養し、コロニーＰＣＲ解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。

この株を胞子形成培地（１％酢酸カリウム、２％アガ−含有）において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行った。２倍体である染色体のＧＰＤ１遺伝子領域の両方にＧＰＤ１遺伝子が破壊されたＤ−ＬＤＨ遺伝子が組み込まれている株を取得した。この株は、既にＰＤＣ１遺伝子が破壊されてＤ−ＬＤＨ遺伝子が２コピー組み込まれているので、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が４コピー導入されていることになる。このうち、ＧＰＤ１遺伝子破壊部分のＤ−ＬＤＨ遺伝子のプロモーターがＴＤＨ２遺伝子プロモーターであるものをＴＤ３株、ＨＯＲ７遺伝子プロモーターであるものをＴＤ１株、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターであるものをＴＤ１５株とした。

（２）６コピー導入株の作製
Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が４コピー導入されたＴＤ１株の一つであるＴＤ１−１９−４Ａ株及びＴＤ１５−１３−１２Ｂ株をＹＰＤ培養液１０ｍｌにて、３０℃で対数増殖期（ＯＤ６００ｎｍ＝０．８）まで培養した。これにＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＩＩキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例３にて構築した染色体導入型ベクターを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｓｔＸＩで処理し、遺伝子導入した。

なお、ＴＤ１−１９−４Ａ株に導入した具体的な導入ベクターは、ｐＢＨＨＯ２−ＤＬＤＬＨベクター、ｐＢＨＴＤ２−ＤＬＤＨベクターの２種類であった。また、ＴＤ１５−１２−１２Ｂ株に導入した具体的な導入ベクターは、ｐＢＨＴＤ２−ＤＬＤＨベクターの２種類であった。これらの形質転換試料を洗浄後、１００μｌの滅菌水に溶解させてハイグロマイシン選抜培地に塗沫し、それぞれについて３０℃静置培養下で形質転換体の選抜を行った。

得られたそれぞれのコロニーを新たなハイグロマイシン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をＹＰＤ培養液２ｍｌで一晩培養し、コロニーＰＣＲ解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株とした。

この株を胞子形成培地（１％酢酸カリウム、２％アガ−含有）において胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して２倍化を行った。２倍体である染色体のＧＰＤ２遺伝子領域の両方にＧＰＤ２遺伝子が破壊されたＤ−ＬＤＨ遺伝子が組み込まれている株を取得した。この株は、既にＤ−ＬＤＨ遺伝子が４コピー組み込まれているので、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子が６コピー導入されていることになる。ＴＤ１−１９−４Ａ株のＧＰＤ２破壊部分のＤ−ＬＤＨ遺伝子のプロモーターがＨＯＲ７遺伝子プロモーターであるものをＴＤ５株、ＴＤＨ２遺伝子プロモーターであるものをＴＤ６株とした。また、ＴＤ１５−１３−１２Ｂ株のＧＰＤ２遺伝子破壊部分のＤ−ＬＤＨ遺伝子のプロモーターがＰＤＣ１遺伝子プロモーターであるものをＴＤ１６株とした。なお、ＴＤ５株及びＴＤ６株は、それぞれ２種類及び３種類のプロモーターが含まれており、ＴＤ１６株は、ＰＤＣ１プロモーターのみとなっている。

（発酵試験による乳酸の生産（ＹＰＤ培地））
得られた形質転換酵母をＹＰＤ液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩、振とう培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝１．２のものを初発菌体とした。このうちの２ｍｌを１０％グルコース含有ＹＰＤ培養液４０ｍｌに植菌し（全量４２ｍｌ）、中和剤として炭酸カルシウム（ナカライテスク社製）１ｇを添加したものを、３０℃で、３日間振とう培養した。

培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるＤ−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサＢＦ−４装置（王子計測機器社製）を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。これらの結果を図１２及び図１３に示す。尚、グルコースは検出されなかった。

図１２に示すように、各プロモーターによるＤ−ＬＤＨ遺伝子２コピー株を比較するとＰＤＣ１遺伝子プロモーターを用いた系が最も優れており（Ｄ−乳酸生産量４．５％）、ＴＤＨ２遺伝子プロモーター及びＨＯＲ７遺伝子プロモーターは互いに同等であった（同３．９％）。これに対して、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子の４コピー株では、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター（同６％）よりも、ＰＤＣ１プロモーターに他のプロモーターを組み合わせたものの方がＤ−乳酸生産量が大幅に向上していた（ＴＤＨ２遺伝子プロモーターを組み合わせた株（ＴＤ３−１７−８Ｂ株）：７％、ＨＯＲ７遺伝子プロモーターを組み合わせた株（ＴＤ１−１９−４Ａ）：６．８％）。加えて、理由は定かでないが、副生成物のエタノールの生産量も抑えることができた。

また、図１３に示すように、６コピー株において比較するとＰＤＣ１単独での６コピー株（ＴＤ１６−３−２Ａ）よりも、複数種類のプロモーターを利用した６コピー体（ＴＤ１５−４９−１Ｄ株、ＴＤ６−６−４Ａ株）の方がＤ−乳酸生産量が高いことが認められた。

（発酵試験による乳酸の生産（糖蜜含有培地））
得られた形質転換酵母を糖蜜含有液体培地（スクロース９．７％、糖蜜０.６％）６０ｍｌに菌体濃度が０．５％となるように接種し、中和剤として炭酸カルシウム（ナカライテスク社製）１ｇを添加したものを、３０℃で、３日間振とう培養した。

培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるＤ−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサＢＦ−４装置（王子計測機器社製）を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。また、Ｄ−乳酸の対糖収率（Ｄ−乳酸生産量％／初発のスクロース濃度％）を算出した。これらの結果を図１４に示す。

図１２に示すように、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを単独で利用した４コピー株（比較例：ＴＤ１５−３−２Ｂ株）に比べて、複数種類のプロモーターを用いた４コピー株（実施例：ＴＤ３―１７−８Ｂ株及び６コピー株（実施例：ＴＤ６−６−４Ａ株）は、Ｄ−乳酸生産量が大幅に増大しており、対糖収率も８３％、８８％であった。

また、実施例ではグルコースも完全に消費されているとともに、エタノールの生産量が抑えられていた。複数種類のプロモーターを用いることで栄養源に乏しい培地でも乳酸を高生産できることがわかった。

本実施例では、Ｌ−乳酸生産における複数種類のプロモーターの利用について検証した。形質転換体の作製にあたっては、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを利用して８コピーのＬ−ＬＤＨ遺伝子を導入した株を親株として用い、計１０コピーのＬ−ＬＤＨ遺伝子を導入した形質転換酵母を作製し、発酵試験を行った。

（１０コピー発現用ベクターの構築）
（１）ＰＤＣ１遺伝子プロモーター発現用ベクター
既に構築したｐＢＨＰＨ−ＰＴベクターに制限酵素ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩによりＬ−ＬＤＨ断片、制限酵素ＳａｃＩ及びＮｏｔＩよりＲＣＳ断片、制限酵素ＡｐａＩ及びＫｐｎＩによりＲＳＢ９断片を順次導入し、ｐＢＨＰＨ−ＬＤＨプレベクターを構築した。これらに、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩによりＰＤＣ１プロモーター断片を連結させ、最終ベクターであるｐＢＨＰＨ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した（図１５）。プロモーター及び各断片はＰＣＲによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを、表３に示す。

（２）ＴＤＨ２プロモーター発現用ベクター
ｐＢＨＰＨ−ＬＤＨプレベクターに、制限酵素、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩによりＴＤＨ２遺伝子プロモーター断片を連結して、最終ベクターであるｐＢＨＰＨ−ＴＤＨ２Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した（図１６）。プロモーター及び各断片はＰＣＲによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを表３に示す。

（３）ＴＤＨ３プロモーター発現用ベクター
ｐＢＨＰＨ−ＬＤＨプレベクターに、制限酵素、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩによりＴＤＨ３遺伝子プロモーター断片を連結して、最終ベクターであるｐＢＨＰＨ−ＴＤＨ３Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した（図１７）。プロモーター及び各断片はＰＣＲによって増幅を行った。プロモーター及び各断片はＰＣＲによって増幅を行った。なお、プロモーター断片の増幅に用いたプライマーを表３に示す。

（４）ＨＯＲ７発現用ベクター
ｐＢＣＡＴ−ＰＴベクターに、制限酵素ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩによりＬ−ＬＤＨ断片、制限酵素ＳａｃＩ及びＮｏＩによりＧＰＤ２上流断片、ＡｐａＩ及びＫｐｎにより、ＧＰＤ２下流断片を順次導入し、ｐＢＣＡＴ−ＬＤＨプレベクターを構築した。次いで、このベクターに、制限酵素ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩによりＨＯＲ７遺伝子プロモーター断片を連結させて、最終ベクターであるｐＢＣＡＴ−ＨＯＲ７Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した（図１８）。

（Ｌ乳酸生産形質転換酵母の作製）
（１）１０コピー導入株の作製
既に構築した乳酸生産酵母ＴＣ１０−１−３Ｂ株、ＴＣ２０−２−１Ｃ株（いずれもＬ−ＬＤＨ遺伝子をＰＤＣ１遺伝子プロモーター下において８コピー保持する形質転換酵母である。）を宿主として、上記４種類の発現用ベクターを用いて形質転換した。形質転換の方法は、適切な選抜培地を用いて実施例４と同様に行い、コロニーＰＣＲ解析を行い、導入遺伝子の存在が確認できたものを形質転換体とした。さらに、適切な選抜培地を用いて実施例４と同様に新たに導入したプロモーターとＬ−ＬＤＨ遺伝子とを２コピー備える形質転換体を取得した。これらの形質転換体においては、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を合計１０コピー保持することとなる。得られた形質転換体におけるプロモーターの組み合わせは以下の表４に示す。

（発酵試験による乳酸の生産（ＹＰＤ培地））
得られた形質転換酵母をＹＰＤ液体培地５ｍｌに植菌し、３０℃、１３０ｒｐｍで一晩、振とう培養を行い、ＯＤ６００ｎｍ＝１．２のものを初発菌体とした。このうちの２ｍｌを１０％グルコース含有ＹＰＤ培養液４に植菌し（全量４２ｍｌ）、中和剤として炭酸カルシウム（ナカライテスク社製）１ｇを添加したものを、３０℃で、３日間微好気条件下で振とう培養を行った。

培養終了後、発酵液を採取し、本液中に含まれるＬ−乳酸量、エタノール生産量及びグルコース残存量を測定した。測定には、多機能バイオセンサＢＦ−４装置（王子計測機器社製）を用い、仕様の詳細は付属のマニュアルに従った。これらの結果を図１９及び図２０に示す。

図１４に示すように、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター制御下でＬＤＨ遺伝子を８コピー導入した株に対して、ＬＤＨ遺伝子を１０コピー導入した株はいずれも乳酸生産量の増大及びエタノール生産量の減少が認められた。また、プロモーターとして、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター単独よりもＰＤＣ１遺伝子プロモーターとＴＨＤ２、ＴＤＨ３、ＨＯＲ７遺伝子プロモーターを利用してＬＤＨ遺伝子を導入した株においてより大きな生産量の向上が認められた。以上のことから、Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を複数コピー発現させる場合においても、単一種類のプロモーターでなく、複数種類のプロモーターを用いることが有効であることがわかった。

配列番号１５〜３０：合成プライマー

ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣＩＰ−ＤＬＤＨＭＥベクターの構成図である。 ｐＢＴｒｐ−ＴＤＨ２Ｐ−ＬＤＨベクターの構成図である。 ｐＢＴｒｐ−ＨＯＲ７Ｐ−ＬＤＨベクターの構成図である。 ｐＢＣＨＯ−ＤＬＤＨベクターの構成図である。 ｐＢＣＡＴ−ＰＴベクターの構成図である。 ｐＢＣＰＤ−ＤＬＤＨベクターの構成図である。 ｐＢＣＴＤ−ＤＬＤＨベクターの構成図である。 ｐＢＨＨＯ２−ＤＬＤＨベクターの構成図である。 ｐＢｈｐｈ−ＰＴベクターの構成図である。 ｐＢＨＴＤ２−ＤＬＤＨベクターの構成図である。 ｐＢＨＰＤ２−ＤＬＤＨベクターの構成図である。 各種形質転換酵母株におけるＤ−乳酸発酵試験の結果（ＹＰＤ培養液）を示すグラフ図である。 各種形質転換酵母株におけるＤ−乳酸発酵試験の結果（ＹＰＤ培養液）を示すグラフ図である。 各種形質転換酵母株におけるＤ−乳酸発酵試験の結果（糖蜜培地）を示すグラフ図である。 ｐＢＨＰＨ−ＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターの構成図である。 ｐＢＨＰＨ−ＴＤＨ２Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターの構成図である。 ｐＢＨＰＨ−ＴＤＨ３Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターの構成図である。 ｐＢＣＡＴ−ＨＯＲ７Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターの構成図である。 各種形質転換酵母株におけるＬ−乳酸発酵試験の結果（ＹＰＤ培養液）を示すグラフ図である。 各種形質転換酵母株におけるＬ−乳酸発酵試験の結果（ＹＰＤ培養液）を示すグラフ図である。

Claims (19)

1. 複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを保持する形質転換体。
2. 前記複数種類のプロモーターは、ピルビン酸脱炭酸酵素１（ＰＤＣ１）遺伝子プロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（ＨＯＲ７）プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素２（ＴＤＨ２）遺伝子プロモーター、熱ショックタンパク質３０（ＨＳＰ３０）遺伝子プロモーター、ヘキソース輸送タンパク質７（ＨＸＴ７）遺伝子プロモーター、チオレドキシンペルオキシダーゼ１（ＡＨＰ１）遺伝子プロモーター、膜タンパク質１（ＭＲＨ１）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素３（ＴＤＨ３）遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素１（ＴＤＨ１）遺伝子プロモーター、トリオースリン酸イソメラーゼ１（ＴＰＩ１）遺伝子プロモーター、細胞壁関連タンパク質１２（ＣＣＷ１２）遺伝子及びリボゾーマルプロテインＳ３１（ＲＳＰ３１）遺伝子プロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の形質転換体。
3. 前記複数種類のプロモーターの少なくとも一種類はＰＤＣ１遺伝子プロモーターである、請求項１又は２に記載の形質転換体。
4. ＰＤＣ１遺伝子プロモーターと当該プロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを少なくとも２コピー保持している、請求項３に記載の形質転換体。
5. 前記有機酸は乳酸であり、前記タンパク質は、乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質である、請求項１〜４のいずれかに記載の形質転換体。
6. 前記有機酸はＤ−乳酸であり、前記タンパク質は、Ｄ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及びＴＤＨ２遺伝子プロモーターから選択される、請求項５に記載の形質転換体。
7. 前記複数種類のプロモーターは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター、ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及びＴＤＨ２遺伝子プロモーターである、請求項６に記載の形質転換体。
8. 前記複数種類のプロモーターにより合計１０コピー以下のＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが染色体上に導入されている、請求項６又は７に記載の形質転換体。
9. ＰＤＣ１遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを２コピーと、
   ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及び／又はＴＤＨ２遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを２コピー以上と、
   を備える、請求項６〜８のいずれかに記載の形質転換体。
10. 前記有機酸は、Ｌ−乳酸であり、前記タンパク質は、Ｌ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、前記複数種類のプロモーターは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーター、ＴＤＨ２遺伝子プロモーター、ＴＤＨ３遺伝子プロモーター及びＨＯＲ７遺伝子プロモーターから選択される、請求項５に記載の形質転換体。
11. 前記複数種類のプロモーターは、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターとＨＯＲ７遺伝子プロモーターある、請求項１０に記載の形質転換体。
12. 前記複数種類のプロモーターにより合計１０コピー以下のＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが染色体上に導入されている、請求項１０又は１１に記載の形質転換体。
13. ＰＤＣ１遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを６コピー以上と、
    ＨＯＲ７遺伝子プロモーター及び／又はＴＤＨ２遺伝子プロモーターにより導入されるＤ−乳酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを２コピー以上と、
    を備える、請求項１０〜１２のいずれかに記載の形質転換体。
14. 前記複数種類のプロモーターと前記コードＤＮＡとは、いずれも染色体上に保持されている、請求項１〜１３のいずれかに記載の形質転換体。
15. 前記形質転換体は、酵母である、請求項１〜１４のいずれかに記載の形質転換体。
16. 前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ属酵母である、請求項１５に記載の形質転換体。
17. 前記染色体上に保持される少なくとも一つの前記コードＤＮＡは、染色体上のＰＤＣ１遺伝子を破壊している、請求項１４〜１６のいずれかに記載の形質転換体。
18. 有機酸生産用形質転換体の製造方法であって、
    少なくとも、以下の２種類のＤＮＡ構築物：
    ＰＤＣ１遺伝子プロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを備える第１のＤＮＡ構築物及び
    ＰＤＣ１遺伝子プロモーター以外のプロモーターと、このプロモーターに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを備える第２のＤＮＡ構築物、
    を宿主に導入することにより、ＰＤＣ１遺伝子プロモーターを含む複数種類のプロモーターと、これらのプロモーターのそれぞれに機能的に結合された有機酸生産に関与するタンパク質をコードするＤＮＡとを保持する形質転換体を作製する工程を備える、製造方法。
19. 有機酸の生産方法であって、
    請求項１〜１７のいずれかに記載の形質転換体を準備する工程と、
    この形質転換体を培地において培養して有機酸を生産する工程と、
    を備える、有機酸生産方法。

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