HU219016B - Rekombináns eljárás és gazdasejt xilitol előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát hasznos kémiai vegyületek genetikailag módosítottmikroorganizmusok alkalmazásával történő előállítására szolgálóeljárások (metabolikus génsebészeti eljárások) képezik. A találmánytárgyát közelebbről olyan génsebészeti úton előállítottmikroorganizmus-törzsek alkalmazásán alapuló eljárások képezik,amelyek könnyen hozzáférhető szénforrásokból, például D-glükózbólértékesebb termékeket, például xilitolt képesek előállítani. Atalálmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárásokvégrehajtására alkalmas rekombináns gazdasejtek is. ŕ

Description

A találmány tárgyát hasznos kémiai vegyületek genetikailag módosított mikroorganizmusok alkalmazásával történő előállítására szolgáló eljárások (metabolikus génsebészeti eljárások) képezik. A találmány tárgyát közelebbről olyan génsebészeti úton előállított mikroorganizmus-törzsek alkalmazásán alapuló eljárások képezik, amelyek könnyen hozzáférhető szénforrásokból, például D-glükózból értékesebb termékeket, például xilitolt képesek előállítani.

A találmány tárgyát képezik a találmány szerinti eljárások végrehajtására alkalmas rekombináns gazdasejtek is.

A xilitol igen értékes, édesítőszerként használt kémiai vegyület. Körülbelül ugyanolyan édes, mint a szacharóz, nem toxikus és nem okoz fogszuvasodást.

A xilitolt jelenleg D-xilóz kémiai úton történő hidrogénezésével állítják elő. A D-xilózt különböző növényi anyagok hidrolizátumából nyerik, ahol az mindig egyéb pentózokkal és hexózokkal együtt alkotott elegyben található. A xilóz, valamint a xilitol tisztítása tehát jelentős problémát jelent. Számos ilyen típusú eljárás ismert. Lásd például a 3 784 408, 4 066 711, 4 075 406, valamint a 4 008 285 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat.

A D-xilóznak xilitollá történő redukálását egy mikrobiológiai folyamat során is megvalósíthatjuk a természetből izolált törzsek [Barbosa M. F. S. és munkatársai: J. Industrial Microbiol., 3, 241-251 (1988)] vagy génsebészeti eljárással előállított törzsek [Hallbom J. és munkatársai: Biotechnology, 9,1090-1095 (1991)] felhasználásával. Jelentős problémát jelent azonban magának a szubsztrátnak, a D-xilóznak élesztőben fermentálható formában történő előállítása is, mivel az olcsó xilózforrások, mint például a cellulóz- vagy papírfeldolgozás során keletkező szulfitsav az élesztő szaporodását gátló szennyező anyagokat tartalmaznak.

Egy másik előnyös eljárás szerint a xilitolt egy olcsó és könnyen hozzáférhető szubsztrát, például D-glükóz fermentációjával állíthatnánk elő. Nem ismert azonban olyan mikroorganizmus, amely a xilitolhoz szerkezetileg igen közel álló D-xilózon vagy D-xilulózon kívül valamely közönséges szénfonásból egy lépésből álló fermentáció során jelentős mennyiségű xilitolt állítana elő.

Másrészről számos mikroorganizmus, különösen az ozmofil élesztők, mint például a ZygoSaccharomyces rouxii, a Candida polymorpha és a Torulopsis candida D-glükózból jelentős mennyiségű, a xilitollal közeli rokonságban álló pentitolt, D-arabitolt képesek előállítani [Lewis D. H. és Smith D. C.: New Phytol., 66,143-184 (1967)]. Az ozmofil élesztők fenti sajátságát felhasználva H. Onishi és T. Suzuki egy olyan eljárást fejlesztettek ki, amelyben a D-glükózt három egymást követő fermentációs lépésben xilitollá alakították át [App. Microbiol., 18,1031-1035 (1969)]. A fenti eljárás során egy ozmofil élesztőtörzzsel végzett fermentációval a D-glükózt először D-arabitollá alakították át. Egy második lépésben a D-arabitolt Acetobacter suboxydans segítségével végzett fermentációval D-xilulózzá oxidálták. Végül a D-xilulózt egy harmadik fermentációs lépésben számos olyan élesztőtörzs egyikének felhasználásával, amely képes D-xilulózt xilitollá redukálni, xilitollá redukálták. Ennek az eljárásnak nyilvánvaló hátránya, hogy három különböző fermentációs lépést tartalmaz, melyek mindegyike 2-5 napot vesz igénybe; továbbá szükség van kiegészítő lépésekre, mint például sterilizációra és a sejtek eltávolítására, ily módon az előállítás költségei megnövekednek. Az egymást követő lépésekből álló fermentációs eljárás hatásfoka alacsony, és a melléktermékek aránya magas. Szükség van tehát olyan eljárásokra, melyek segítségével mikrobiológiai rendszerben, könnyen hozzáférhető szubsztrátokból, gazdaságosan tudunk xilitolt előállítani.

A találmány tárgyát rekombináns gazdasejtek előállítására szolgáló eljárások, valamint a fenti eljárásokkal előállított rekombináns gazdasejtek képezik. A találmány szerinti gazdasejtek képesek csak D-xilulóztól, D-xilóztól, azok polimerjeitől, oligomeijeitől és azok keverékeitől eltérő szénforrásokat tartalmazó tápfolyadékon tenyésztve xilitol előállítására. A találmány szerinti gazdasejt által hasznosított szénforrások olcsók és könnyen hozzáférhetők. A találmány szerinti mikroorganizmus ugyancsak képes a szintetizált xilitolnak a tápfolyadékba történő szekretálására. Ezt a célt a kívánt mikroorganizmus anyagcseréjének, előnyösen egy, a természetben előforduló élesztő-mikroorganizmus anyagcseréjének módosításával érjük el oly módon, hogy abba a kívánt heterológ géneket bejuttatjuk és expresszáljuk. Ezenkívül a fenti célkitűzés megvalósítása érdekében a kívánt mikroorganizmus anyagcseréjét úgy módosítjuk, hogy az bizonyos, a natív állapotú mikroorganizmusban található homológ géneket nagy mennyiségben expresszáljon és/vagy azok aktivitását vagy expresszióját inaktiváljuk.

A találmány tárgyát tehát xilitol előállítására szolgáló olyan eljárások képezik, mely eljárásokban a xilitolt egy olyan új mikroorganizmus-törzs, azaz egy rekombináns gazdasejt felhasználásával állítjuk elő, melyet itt génsebészeti eljárással előállított mikroorganizmusnak is nevezünk, és az említett, génsebészeti eljárással előállított mikroorganizmus de novo vagy a natív - génsebészeti eljárással nem módosított - mikroorganizmussal összehasonlítva nagyobb mennyiségben állít elő xilitolt.

A találmány tárgyát képezik továbbá xilitol előállítására szolgáló olyan eljárások, mely eljárások egy, a mikroorganizmusba génsebészeti eljárással beépített új reakcióutat hasznosítanak, és amely reakcióút az említett mikroorganizmusban xilitol de novo vagy fokozott mértékű szintéziséhez vezet.

A találmány tárgyát képezik továbbá xilitol előállítására szolgáló olyan eljárások, melyek a fenti új reakcióutat hasznosítják, az említett reakcióutat a D-arabitol-szintézis és/vagy -metabolizmus módosításával hoztuk létre, és az említett reakcióutat úgy módosítottuk, hogy a mikroorganizmus olyan szénforrások fermentációja során, melyekből a módosítatlan gazdasejt D-arabitolt képez, ezután xilitolt állítson elő.

A találmány tárgyát képezik továbbá xilitol előállítására szolgáló olyan eljárások, melyek a fenti megváltoztatott D-arabitol-reakcióutat hasznosítják, és az említett

HU 219 016 Β reakcióutat vagy a már előzőleg meglévő D-arabitolbioszintézis-reakcióút kiterjesztésével (a D-arabitol hasznosítására további lépések beiktatásával) vagy a Darabitol-reakcióút során egy vagy több lépésnek hasonló lépésekkel való helyettesítésével úgy módosítottuk, hogy az xilitol keletkezéséhez vezessen.

A találmány tárgyát képezik továbbá xilitol előállítására szolgáló olyan eljárások, melyek a fenti módosított D-arabitol reakcióutat hasznosítják, és ahol az említett reakcióutat a már előzőleg meglévő D-arabitol-bioszintézis-reakcióút kiterjesztésével oly módon módosítottuk, hogy a D-xilulóz-képzéshez szükséges D-arabitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.11), valamint xilulóz-dehidrogenázt kódoló géneket (EC 1.1.1.9) egy D-arabitol-képző mikroorganizmusba juttattuk, és nagy mennyiségben expresszáltuk.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti új mikroorganizmusok felhasználásával xilitol előállítására szolgáló olyan eljárások, melyek a fenti módosított D-arabitol-reakcióutat hasznosítják, és az említett reakcióutat az említett mikroorganizmusban úgy módosítottuk tovább, hogy a transzketoláz (EC

2.2.1.1) vagy a D-xilulokináz (EC 2.7.1.17) enzimeket kódoló géneket kémiai úton létrehozott mutagenezissel vagy a génfolytonosság megszakításával inaktiváltuk.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti új mikroorganizmus felhasználásával xilitol előállítására szolgáló olyan eljárások, melyek szerint az említett mikroorganizmusban a pentóz-foszfát-reakcióút oxidatív ágához tartozó enzimeket, közelebbről a Dglükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.49) és/vagy a 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.44) enzimeket kódoló géneket génsebészeti eljárással létrehozott módosítással nagy mennyiségben expresszáljuk.

A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti új mikroorganizmus felhasználásával xilitol előállítására szolgáló olyan eljárások, melyek szerint az említett mikroorganizmusban a pentóz-foszfát-reakcióút oxidatív ágához tartozó enzimeket kódoló géneket, valamint a D-ribulóz-5-foszfátepimeráz-gént (EC

5.1.3.1) génsebészeti eljárással létrehozott módosítással nagy mennyiségben expresszáljuk.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábra a pARL2-plazmidban található inszert restrikciós térképét mutatja. Az inszert a Phpl jelzésű Klebsiella terrigena törzs kromoszomális lokuszát képviseli, és a K. terrigerra arabitol dehidrogenázgént tartalmazza. A világos mező a K. terrigena eredetű kromoszomális DNS-t jelöli. A nyíl a D-arabitol-dehidrogenáz (EC 1.1.1.11) gén helyét és a transzkripció irányát mutatja a fenti DNS-ben.

A 2. ábra a pYARD-plazmidnak a pADH-, valamint a pAAH5-plazmidból történő előállításának menetét mutatja. A plazmiddiagramokon az egyszerű vonal (-) bakteriális szekvenciákat jelöl; a hullámos vonal 2 pm-es S. cerevisiae DNS-t jelöl; a világos nyíl az ADCI-promoterszekvenciát jelöli (az ADCI-gén az S. cerevisiae alkohol-dehidrogenáz, vagy ADCI-génjét, korábban ADHI-génnek nevezett génjét kódolja); a világos rombusz az ADCI-gén transzkripciós terminátorszekvenciáját jelöli; a négyszögű terület a LEU2-gént mutatja; a satírozott nyíl a D-arabitol dehidrogenázgént jelöli.

A 3. ábra a pJDB(AX)-16-plazmid előállításának menetét mutatja. Az XXL2-gén a Pichia stipitis xilitoldehidrogenáz-génje. A dalD a D-arabitol-dehidrogenáz gén. Az ADC1 az ADCI-gén transzkripcióját szabályozó terület (promoter), amely a dalD kódolószekvenciát megelőzi, és ahhoz funkcionálisan kapcsolt. A jelölések nem azonosak a 4. ábrán használtakkal. A plazmiddiagramokon az egyszerű vonal (-) bakteriális eredetű DNSszekvenciát és a körülbelül 2 pm-es DNS-t jelöli; a sötét nyíl az ADC1 promoterszekvenciát jelöli; a satírozott rombusz az ADCI transzkripciós terminátorszekvenciát jelöli; a négyszögű terület a LEU2-markergént jelöli; a bekockázott nyíl a XIL2-gént jelöli; a csíkozott négyszög pedig a dalD-gént jelöli.

A 4. ábra a pSRT(AX)-9 E. coli-Z. rouxii ingázóvektor (shuttle vektor) előállítását mutatja. A jelölések megegyeznek a 3. ábrán használtakkal.

Az 5. ábra a klónozott T. candida rDNS-ffagmens restrikciós térképét mutatja.

A 6. ábra a pTC(AX)-plazmid előállításának menetét mutatja.

A 7. ábra a klónozott T. candida rDNS-ffagmens restrikciós térképét mutatja.

A 7A. ábra a pCPU(AX)-plazmid előállításának menetét mutatja.

A 8. ábra a ZWF1-, valamint a gnd-gén klónozását mutatja.

A 8A. ábra a PAAH(gnd)-plazmid előállításának menetét mutatja.

A 9. ábra a pSRT(ZG)-plazmid előállításának menetét mutatja.

A 10. ábra a Z. rouxii [pSRT(AX)-09] törzs (ATCC 13356 nyilvántartási számú törzs) fermentorban történő tenyésztésének folyamatát mutatja.

A 11. ábra a Z. rouxii [pSRT(AX)-09] törzsből (ATCC 13356 nyilvántartási számú törzsből) származó mutáns fermentorban történő tenyésztését mutatja.

A leírás további részében számos, a rekombináns DNS-technológiában alkalmazott szakkifejezést használunk. Annak érdekében, hogy a leírás és az igénypontok világosan és egyértelműen értelmezhetők legyenek, az alábbi definíciókat adjuk meg.

Xilóztól és xilulóztól eltérő egyéb szénforrás. A „Dxilulóztól és D-xilóztól eltérő egyéb szénfonás” kifejezés D-xilulóztól, D-xilóztól, azok polimeqeitől, oligomerjeitől és az előbbiek keverékeitől (mint például xilántól vagy hemicellulóztól) eltérő egyéb, xilitol előállításra alkalmas széntartalmú szubsztrátra vonatkozik. Előnyös esetben a szénforrás elősegíti a találmány szerinti, génsebészeti eljárással módosított mikrobiális gazdasejtek növekedését, valamint az élesztőgazdasejtekben végbemenő fermentációt. A találmány szerinti mikrobiális gazdasejtekben történő xilitolszintézisre számos olcsó és könnyen hozzáférhető vegyület felhasználható szénforrásként, például D-glükóz, különböző Dglükóz tartalmú szirupok, valamint D-glükóznak egyéb

HU 219 016 Β cukrokkal alkotott elegyei. Idetartoznak a találmány szerinti gazdasejtek, például élesztők és gombák által asszimilálható egyéb cukrok, mint például különböző aldoés ketohexózok (például D-fruktóz, D-galaktóz és Dmannóz), valamint azok oligomeijei, polimeijei (például szacharóz, laktóz, keményítő, inulin és maltóz). A fenti meghatározásba foglaltatnak xilózon és xilulózon kívül egyéb pentózok, nem szénhidrát természetű szénforrások, például glicerin, etanol, különböző növényi olajok vagy szénhidrogének (előnyösen 14-16 szénatomot tartalmazó alánok). A találmány szerinti gazdasejtekben történő xilitolszintézisnél szubsztrátként felhasználható szénforrások spektruma a mikrobiális gazdasejttől függően változik.

Gén. Génnek egy RNS-polimeráz számára templátként szolgáló DNS-szekvenciát nevezünk. A génről átíródott RNS kódolhat egy proteint, de az is lehet, hogy nem kódol proteint. A proteint kódoló RNS-t hírvivő RNS-nek (mRNS-nek) nevezzük, és azt eukariótákban az RNS-polimeráz-II úja át. Előállítható olyan RNSpolimeráz-II enzim számára templátot képző gén, amelyben (egy RNS-polimeráz-II-függő promoter jelenlétének következtében) olyan RNS-szekvencia íródik át, amely egy adott mRNS-sel komplementer szekvenciát tartalmaz, de normális körülmények között nem transzlálódik. A leírásban az ilyen gént antiszenszRNS-génnek, az átírt RNS-t pedig antiszensz-RNS-nek nevezzük. Az antiszensz-RNS-ek normális körülmények között az antiszensz-RNS-szekvenciában található transzlációs stopkodonok jelenléte következtében nem transzlálódnak.

„Komplementer-DNS”- vagy „cDNS”-géneknek nevezzük például a közti szekvenciákat (intronokat) nem tartalmazó mRNS reverz transzkripciójával szintetizált rekombináns géneket. A genomi-DNS-ből kiindulva klónozott gének rendszerint tartalmaznak intronokat.

Klónozóvektor. „Klónozóvektoron” olyan plazmidDNS-t, fág-DNS-t vagy egyéb DNS-szekvenciát értünk, amely egy gazdasejtbe képes genetikai információt, specifikusan DNS-t bejuttatni. A klónozóvektorban gyakran egy vagy néhány endonukleázfelismerő hely található, amely helyeken az említett DNS-szekvencia a vektor lényeges biológiai funkciójának elvesztése nélkül meghatározott módon hasítható, és ahová egy kívánt DNS a gazdasejtbe történő klónozás céljából beépíthető. A klónozóvektor tartalmazhat továbbá a klónozóvektorral transzformált sejtek azonosítását megkönnyítő markert, valamint egy vagy több, prokariótaés eukarióta-gazdasejtben a vektor fennmaradását és replikációját lehetővé tevő replikációs origót. Markerek például a tetraciklinrezisztencia- vagy az ampicillinrezisztencia-markerek. A „klónozóvektort” néha csak „vektor”-nak nevezzük. „Klónozóvektor” lehet például egy „plazmid”, amely legalább egy gazdasejtben fennmaradásra képes, önállóan replikálódó, általában cirkuláris DNS.

Expressziós vektor. Az „expressziós vektor” vagy „vektor” hasonló a klónozóvektorhoz, azonban egy gazdasejtbe történő transzformációját követően elősegíti a belé klónozott gén expresszióját. A klónozott gént általában bizonyos szabályozószekvenciák, például egy promoterszekvencia vezérlése alá helyezzük (például funkcionálisan hozzákapcsoljuk), mely szekvenciákat szolgáltathatja a vektor, de beépíthetjük a klónozott gén rekombináns előállítása során is. Az expressziós szabályozószekvenciák különbözők lehetnek attól függően, hogy a vektor segítségével a funkcionálisan hozzákapcsolt gént prokarióta- vagy eukarióta-gazdasejtben kívánjuk expresszálni, tartalmazhatnak továbbá transzkripciós elemeket, például enhanszerelemeket (5’-irányban elhelyezkedő, upstream aktiválószekvenciákat), transzkripciós terminátorszekvenciákat és/vagy transzlációs start-, valamint terminátorszekvenciákat.

Gazdasejt. A gazdasejt olyan prokarióta- vagy eukariótasejt, amely rekombináns anyag befogadójaként és hordozójaként használható.

A találmány szerinti gazdasejt. „A találmány szerinti gazdasejt” olyan mikrobiális gazdasejt, amely D-xilóztól, D-xilulóztól, azok polimeijeitől, oligomeijeitől és az előbbiek keverékeitől eltérő szokásos szénforrások fermentációja során eredetileg nem termel jelentős mennyiségű xilitolt, melyet azonban a találmány szerinti eljárásokkal úgy módosítottunk, hogy jelentős menynyiségű xilitolt termeljen. „Jelentős mennyiség” alatt olyan mennyiséget értünk, amelyből tiszta formában xilitol izolálható, vagy olyan mennyiséget, amely a mikrobiális fermetációs tápfolyadékban szénhidrátok meghatározására szokásosan alkalmazott analitikai módszerekkel megbízhatóan mérhető.

Arabitol-dehidrogenáz. Két típusú D-arabitol-dehidrogenáz létezik: a D-xilulóz-képző (EC 1.1.11) és a Dribulóz-képző. A D-ribulóz-képző dehidrogenázok vad típusú élesztőkben és gombákban találhatók. D-xilulóz-képző arabitol-dehidrogenázok ismereteink szerint csak baktériumokban fordulnak elő. A találmány leírása során, hacsak másképp nem jelöljük, a D-xilulóz-képző arabitol-dehidrogenázzal foglalkozunk, és azt nevezzük arabitol-dehidrogenáznak.

A pentóz-foszfát-reakcióút oxidatív ága. A „pentózfoszfát-reakcióút oxidatív ága” a pentóz-foszfát-sönt azon része, amely oxidatív reakciókat katalizál, idetartoznak a D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.49) és a 6-foszfo-D-glukonát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.44) enzimek által katalizált reakciók, és amely során hexózszubsztrátokból pentóz-foszfátok jönnek létre. A pentóz-foszfát-reakcióút „nem oxidatív” részét (amely D-glükózból végül szintén ribóz keletkezését katalizálja) nem oxidatív izomerizációs reakciók jellemzik, mint például a ribóz-5-foszfát-izomeráz, a D-ribulóz-5-foszfát-3-epimeráz és a transzaldoláz által katalizált reakciók [lásd: H. R. Mahler és Ε. H.: Biological Chemistry, Cordes, Harper és Row kiadó, New York, 448-454(1966)].

Funkcionális származék. Egy protein vagy nukleinsav „funkcionális származéka” egy olyan molekula, amely az említett protein vagy nukleinsav kémiai vagy biokémiai származéka (abból lett előállítva), és amely a natív proteint vagy nukleinsavat jellemző biológiai aktivitást (funkcionális vagy strukturális aktivitást) megtartotta. A „funkcionális származék” kifejezés a molekulá4

HU 219 016 Β nak a natív molekula kívánt aktivitását megtartó „ffagmenseire”, „variánsaira”, „analógjaira” és „kémiai származékaira” is vonatkozik.

A találmány szerint egy molekula egy másik molekula „kémiai származéka”, ha az normális körülmények között a molekula részét nem képző járulékos kémiai csoportokat tartalmaz. Az ilyen csoportok javíthatják a molekula oldékonyságát, abszorpcióját, biológiai felezési idejét stb. A csoportok csökkenthetik a molekula toxicitását, vagy megszüntethetik, vagy gyengíthetik a molekula valamilyen nem kívánt mellékhatását stb. Ilyen hatások közvetítésére képes csoportokat írnak le a „Remington’s Pharmaceutical Sciences” (1980) című kiadványban.

Fragmens. Egy molekula, azaz egy protein- vagy nukleinsavmolekula „fragmense” alatt a natív aminosavszekvencia vagy nukleotidszekvencia, különösen pedig a találmány szerinti funkcionális származék valamely részletét értjük.

Variáns vagy analóg. Egy protein vagy nukleinsav „variánsa” vagy „analógja” olyan molekula, melynek szerkezete és biológiai aktivitása alapvetően hasonlít a natív molekuláéhoz vagy egy funkcionális alléi által kódolt molekuláéhoz.

Az alábbiakban a xilitol-bioszintézist szolgáló anyagcsere-reakcióutak találmány szerinti kialakítását ismertetjük.

A találmány szerint a mikrobiális gazdasejt natív anyagcsere-reakcióútjait úgy módosítjuk, hogy a szénnek xilitol előállításon kívül egyéb célú felhasználását csökkentsük vagy megszüntessük. A találmány szerinti valamennyi gazdasejt egy lépésből álló fermentáció során képez xilitolt. A találmány egyik megvalósítási módjában a találmány szerinti gazdasejt a xilitol előállításhoz elegendő xilitol-dehidrogenáz (EC 1.1.1.9.) aktivitással rendelkezhet. Amint azonban az alábbiakban ismertetjük, azon gazdasejtek esetében, melyekben fokozott xilitol-dehidrogenáz-aktivitást kívánunk elérni, a gazdasejtbe xilitol-dehidrogenáz-enzimet kódoló rekombináns géneket transzformálhatunk. A találmány gyakorlati megvalósításában a találmány szerinti öszszes gazdasejt nem csupán D-xilózból és/vagy D-xilulózból képes xilitolt előállítani, hanem szerkezetileg rokonságot nem mutató szénforrásokból, például D-glükózból is. A találmány szerinti gazdasejt az előállított xilitolt képes a tápfolyadékba is kiválasztani.

Közelebbről a példákkal alátámasztott és előnyös megvalósítási módokban a találmány szerinti gazdasejtet két reakcióút közül az egyik jellemzi. Az első reakcióút szerint a xilitol-előállítás köztiterméke arabitol, a második reakcióút szerint xilulóz-5-foszfát alakul át defoszforiláláson és redukciós reakción keresztül xilitollá. A fentiek alapján a találmány szerinti gazdasejtet az alábbi genetikai módosítások közül legalább az egyik jellemzi:

(1) a gazdasejtbe D-xilulóz-képzéshez szükséges D-arabitol-dehidrogenáz-aktivitással (EC 1.1.1.11) rendelkező proteint kódoló gént klónozunk, ily módon lehetővé téve, hogy D-arabitolból D-xilulóz jöjjön létre (ez az I. típusú reakcióút jellemzője); és/vagy (2) a natív gazdasejtben a transzketolázaktivitást kódoló gént inaktiváljuk (ez a II. típusú reakcióút jellemzője).

Az említett gazdasejt xilitoltermelő képességének fokozására a gazdasejtekben további különböző módosítások hozhatók létre. Az (1) és (2) pontban leírt gazdasejtek az alábbiak szerint módosíthatók tovább:

(3) a gazdasejtbe xilitol-dehidrogenáz (EC 1.1.1.9) aktivitással rendelkező proteint kódoló gént klónozunk;

(4) a natív gazdasejtben a D-xilulokinázt (EC 2.7.1.17) kódoló gént inaktiváljuk;

(5) a gazdasejtbe D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.49) aktivitással rendelkező proteint kódoló gént klónozunk;

(6) a gazdasejtbe 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.44) aktivitással rendelkező proteint kódoló gént klónozunk;

(7) a gazdasejtbe D-ribulóz-5-foszfát-3-epimeráz (EC 5.1.3.1) aktivitással rendelkező proteint kódoló gént klónozunk.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja esetén a találmány szerinti gazdasejtre a fent ismertetett genetikai módosítások közül egynél több jellemző. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint például, a szénatom D-arabitolból „közvetlenül” (azaz, egy lépésben) D-xilulózba jut, és D-xilulózból „közvetlenül” xilitolba jut. Ennek megfelelően a fenti megvalósítási mód szerint a találmány szerinti gazdasejtet oly módon módosítottuk, hogy egy, a D-xilulóz-képzéshez szükséges D-arabitol-dehidrogenáz-aktivitással rendelkező proteint kódoló gént, valamint egy xilitol-dehidrogenázt kódoló gént (EC 1.1.1.9) klónoztunk a gazdasejtbe. Megjegyezzük, hogy sok megvalósítási mód szerint a D-arabitol a találmány szerinti gazdasejtben egyéb szénforrásokból a sejten belül szintetizálódik, D-arabitolt külső forrásból is adhatunk közvetlenül a tápfolyadékhoz.

A találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint a xilitol-bioszintézis reakcióútja során nem szerepel köztitermékként arabitol. Ehelyett a szénatom Dxilulóz-5-foszfátból D-xilulózba, majd xilitolba jut. Abban az esetben, ha D-glükózt használunk szénforrásként, a szénatom útja a pentóz-foszfát-reakcióút oxidatív részén keresztül vezet, D-glükózból D-glükóz-6foszfátba, abból 6-foszfo-D-glükonátba, abból Dribulóz-5-foszfátba. Ezt követően a D-ribulóz-5-foszfát D-xilulóz-5-foszfáttá epimerizálódik, D-xilulózzá defoszforilálódik, majd xilitollá redukálódik. A fenti megvalósítási mód kivitelezésére alkalmas találmány szerinti gazdasejt tehát olyan gazdasejt, amelyben:

(al) a gazdasejtbe D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.49) aktivitással rendelkező proteint kódoló gént klónozunk, vagy a gazdasejt natív génjét nagy mennyiségben expresszáljuk; és/vagy (a2) a gazdasejtbe 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.44) aktivitással rendelkező proteint kódoló gént klónozunk vagy a gazdasejt natív génjét nagy mennyiségben expresszáljuk; és/vagy (a3) a gazdasejtbe D-ribulóz-5-foszfát-3-epimerázaktivitással rendelkező proteint kódoló gént kiónozunk

HU 219 016 Β vagy a gazdasejt natív génjét nagy mennyiségben expresszáljuk; és/vagy (a4) a gazdasejtbe xilitol-dehidrogenáz (EC 1.1.1.9) aktivitással rendelkező proteint kódoló gént klónozunk, vagy a gazdasejt natív génjét nagy mennyiségben expresszáljuk;

(b) a natív transzketolázgént inaktiváljuk; és/vagy (c) a gazdasejtben a xilulokináz (EC 2.7.1.17) aktivitást kódoló natív gént inaktiváljuk.

Az egyetlen olyan lépés, melyet olyan enzim katalizál, melyet tiszta formában nem jellemeztek, a defoszforilálási lépés (a D-xilulóz-foszfát átalakulása xilulózzá). Az ozmofil élesztőkben a natív D-arabitol-képző reakcióút során szereplő hasonló lépésért (a D-ribulóz5-foszfátnak D-ribulózzá történő átalakításáért) felelős enzimaktivitásról azonban, a korábbiakban kimutatták, hogy az nem specifikus, és a xilulóz-5-foszfát defoszforilálását is képes katalizálni [Ingram, J. M. és Wood W. A.: J. Bacteriol., 89,1186 (1965)]. A transzketoláz mutációja és az oxidatív pentóz-foszfát-reakcióúthoz tartozó két dehidrogenáz nagy mennyiségben történő expresszálása kettős célt szolgál. Először ezáltal fokozzuk az I. típusú reakcióút hatékonyságát, hogy növeljük a sejtben a ribulóz-5-foszfát mennyiségét, következésképp az arabitol- és xilitoltermelést. Másodszor ugyanazon módosítások kombinációjának következtében nagy mennyiségben felhalmozódik a II. típusú reakcióút működéséhez szükséges xilulóz-5-foszfát.

A találmány szerint tehát a természetben előforduló különböző szénforrásokból D-arabitol szintéziséhez vezető és ennek két további reakcióval való meghosszabbításával D-arabitolból xilitol keletkezéséhez vezető reakciómat hasznosító eljárások nem jelentik az egyetlen lehetséges reakciómat. Előállíthatok olyan anyagcserevégtermékként xilitolt eredményező reakcióutak is, melyekben D-arabitol nem szerepel köztitermékként. A xilitolnak D-ribulóz-5-foszfátból történő előállítása tehát több reakcióláncon át is megvalósítható. A D-ribulóz-5foszfát D-ribulóz-5-foszfát-3-epimerázzal hatékonyan átalakítható D-xilulóz-5-foszfáttá, és ha a transzketolázgénben létrehozott mutációval megakadályozzuk a Dxilulóz-5-foszfát további átalakulását, a felhalmozódott D-xilulóz-5-foszfát ugyanazzal a nem specifikus foszfatázzal defoszforilálható, mint a D-ribulóz-5-foszfát [Ingram J. M. és munkatársai: J. Bacteriol., 89,1186 (1965)], majd xilitol dehidrogenázzal xilitollá redukálható. Ennek a reakcióútnak a megvalósításához szükség lehet továbbá a D-xilulokináz-gén inaktiválására, hogy az alábbi felesleges hurok következtében fellépő energiaveszteséget minimalizáljuk: D-xilulokináz-5-foszfát->D-xilulóz->D-xilulóz-5-foszfát. Egy további génsebészeti módosítással - a D-ribulokináz-gén (EC 2.7.1.47) beiktatásával és (nagy mennyiségben való) expreszszálásával - az említett törzsekben azáltal minimalizálhatjuk az egyidejű D-arabitol-képzést, hogy így meggátoljuk a nem specifikus foszfatáz által képzett D-ribulóz tovább alakulását. A D-ribulóz visszaalakul D-ribulóz-5-foszfáttá, majd átalakul D-xilulóz-5-foszfáttá.

Az alábbiakban a találmány szerinti gazdasejtek előállítását ismertetjük.

A találmány szerinti gazdasejtek génsebészeti módszerekkel történő előállítását elősegíthetjük, ha a kérdéses enzimaktivitással rendelkező tiszta proteint izoláljuk és részlegesen szekvenáljuk, vagy polimerázláncreakciós eljárás alkalmazásával az említett proteint kódoló génszekvenciákat klónozzuk, valamint az említett génszekvenciákat expresszáljuk. A leírásban „génszekvenciákon” egy nukleinsavmolekulát (előnyösen DNS-t) értünk. Proteint kódoló génszekvenciák különböző forrásokból származhatnak. Ezek a források lehetnek genomi eredetű DNS, cDNS, mesterségesen előállított DNS, valamint az előbbiek kombinációi. Genomi eredetű DNS-t előnyös esetben élesztőgénkönyvtárból nyerünk. A cDNS előnyös esetben olyan cDNS-könyvtárból származik, melyet ismereteink szerint a kívánt mRNS vagy protein expresszióját elősegítő feltételek mellett tenyésztett élesztőből nyert mRNS-templát alapján állítottunk elő.

A találmány szerinti cDNS nem tartalmaz a természetben előforduló intronokat, ha a cDNS-t érett mRNS-templát felhasználásával állítottuk elő. A találmány szerinti genomi eredetű DNS vagy tartalmaz vagy nem tartalmaz természetben előforduló intronokat. Továbbá az említett genomi eredetű DNS előállítható a génszekvenciák 5’-végi promoter régiójával és/vagy a 3’-végi transzkripciós terminátor régiójával kapcsoltan. Ezenkívül az említett genomi eredetű DNS előállítható az mRNS 5’-végi nem transzlálódó régióját kódoló génszekvenciákkal és/vagy a 3’-végi nem transzlálódó régiót kódoló génszekvenciákkal kapcsoltan. Oly mértékben lehet a natív gén 5’-végi és/vagy 3’-végi át nem íródó régióit és/vagy az mRNS 5’-végi és/vagy 3’-végi nem transzlálódó régióit megtartani és a transzkripció vagy a transzláció szabályozására felhasználni, amennyire a gazdasejt képes az mRNS és a protein expressziójával kapcsolatos transzkripciós és/vagy transzlációs szabályozójeleket felismerni.

Genomi eredetű DNS-t a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal [lásd, például: „Guide fór Molecular Cloning Techniques”, szerkesztő: S. L. Berger és munkatársai, Academic Press (1987)] bármely gazdasejtből extrahálhatunk és tisztíthatunk, különösen a kívánt proteint természetes körülmények között expresszáló gombagazdasejtből. Előnyös esetben a felhasznált mRNS-készítményben feldúsíthatjuk a kívánt proteint kódoló mRNS-t, ezt megvalósíthatjuk természetes úton oly módon, hogy az mRNS-t a proteint nagy mennyiségben előállító sejtekből izoláljuk, vagy in vitro mRNS-készítményekben specifikus szekvenciák feldúsítására szokásosan alkalmazott módszerekkel, például szacharózsűrűséggradiens-centrifugálással vagy mindkét módszer alkalmazásával.

Vektorba történő klónozás céljára az ilyen alkalmas DNS-készítményeket (genomi eredetű DNS-t vagy cDNS-t) véletlenszerűen daraboljuk vagy enzimatikusan hasítjuk, majd megfelelő vektorokba Egáljuk, hogy rekombináns (genomi eredetű vagy cDNS) génkönyvtárat kapjunk.

Egy kívánt proteint vagy annak funkcionális származékait kódoló DNS-szekvenciát szokásos eljárásokkal

HU 219 016 Β inszertálhatunk egy DNS-vektorba, mely eljárások többek között a következők lehetnek: ligálás céljából tompa végek vagy túlnyúló végek létrehozása, restrikciós enzimmel végzett emésztésekkel megfelelő végek kialakítása, kívánt esetben a ragadós végek feltöltése, végek alkalikus foszfatázzal történő kezelése a nem kívánt összekapcsolódás megakadályozása céljából, és ligálás megfelelő ligázokkal. Az említett kezelésekre szolgáló technikákat ír le Maniatis T. [Maniatis T. és munkatársai, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, második kiadás (1988)], melyek a technika állása szerint jól ismertek.

A kívánt gént kódoló szekvenciákat tartalmazó génkönyvtárak átvizsgálhatok, és a kívánt génszekvenciát bármely olyan módszerrel azonosíthatjuk, amely az említett gént vagy proteint kódoló szekvenciára specifikus szelekciót tesz lehetővé, ilyenek például: a) az említett proteint kódoló DNS-re specifikus szekvenciát tartalmazó megfelelő nukleinsavpróbával (próbákkal) történő hibridizálás, vagy b) hibridizációs kiválasztáson alapuló transzlációs analízis, melyben a kérdéses klónnal hibridizáló natív mRNS-t in vitro transzláljuk, és a transzláció termékeit tovább jellemezzük, vagy c) ha a klónozott génszekvenciák önmagukban képesek mRNS expresszióját vezérelni, a kiónt tartalmazó gazdasejt által termelt proteinterméket immunprecipitációval vizsgálhatjuk.

Az említett proteint előállító kiónok azonosítására alkalmazható, meghatározott proteinre specifikus oligonukleotidpróbákat a protein aminosavszekvenciájának ismerete alapján vagy az említett proteint, vagy azzal rokonságot mutató proteint kódoló DNS nukleinsavszekvenciájának ismerete alapján tervezhetünk. Más eljárás szerint a protein tisztított formája ellen ellenanyagokat termelhetünk, és azokat használhatjuk a kívánt klónozott proteint expresszáló transzformánsokban egyedi proteindeterminánsok jelenlétének kimutatására. A találmány leírása során egy peptid aminosavszekvenciájának jelölésére vagy az aminosavak szokásosan használt hárombetűs jelölést vagy azok egyetlen betűből álló jelölését alkalmazzuk. Ezeknek a három- és egybetűs jelöléseknek a listája szakkönyvekben megtalálható [lásd például, Biochemistry, Lehninger A., Worth Publishers, New York, N. Y. (1970)]. Abban az esetben, ha az aminosavszekvenciát vízszintesen haladva soroltuk fel, ha különben másképp nem jelöljük, az aminoterminális vég található a bal oldalon és a karboxiterminális vég található a jobb oldalon. Hasonlóképpen, ha különben másképp nem jelöljük vagy a szövegösszefüggésből nem nyilvánvaló, a nukleinsavszekvenciát úgy ábrázoltuk, hogy az 5’-vég található balra.

A genetikai kodon degeneráltságának következtében egy adott aminosavat több kodon kódolhat [Watson

J. D., Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás, W. A. Benjámin, Inc., Menlo Park, CA, 356-357 (1977)].

A peptidfragmenst megvizsgáljuk, hogy olyan aminosavszekvenciákat azonosítsunk, melyeket a lehetséges legkisebb degeneráltsági fokkal rendelkező oligonukleotidok kódolnak. Ezt előnyösen olyan szekvenciák azonosításával érhetjük el, amelyek csupán egyetlen kodon által kódolt aminosavakat tartalmaznak.

Ritkán előfordul ugyan, hogy egy aminosavszekvenciát csak egyetlen oligonukleotidszekvencia kódolhat, gyakoribb eset azonban, hogy az aminosavszekvenciát egy hasonló oligonukleotidokból álló kombináció bármelyike kódolhatja. Lényeges, hogy míg ennek a kombinációnak mindegyik tagja olyan oligonukleotidszekvenciákat tartalmaz, amely elvileg ugyanazt a peptidfragmenst kódolhatja, tehát potenciálisan, a peptidfragmenst kódoló génnel azonos oligonukleotidszekvenciával rendelkezik, a kombinációnak csak egyetlen tagja tartalmaz a gén szekvenciáját kódoló exonnal azonos nukleotidszekvenciát. Mivel ez a tag megtalálható a kombinációban és a kombináció egyéb tagjainak jelenlétében is képes a DNS-sel hibridizálni, a frakcionálatlan oligonukleotidkombinációt ugyanolyan módon alkalmazhatjuk a peptidet kódoló gén klónozására, mint egyetlen oligonukleotidot.

A genetikai kód ismeretében, az aminosavszekvencia alapján egy vagy több különböző oligonukleotidot azonosíthatunk, melyek mindegyike kódolhatja a kívánt proteint. Annak a valószínűsége, hogy egy adott oligonukleotid az aktuális proteint kódoló szekvenciával ténylegesen megegyezik, megbecsülhető a nem szabályos bázispárképződési viszonyok figyelembevételével, valamint annak a gyakoriságnak a figyelembevételével, amellyel az adott kodon eukariótasejtekben (egy adott aminosav kódolására) aktuálisan felhasználásra kerül. „Kodonhasználati szabályok” alkalmazásával megállapítható egyetlen olyan oligonukleotidszekvencia vagy egy oligonukleotidszekvencia-kombináció, amely tartalmazza a proteinszekvenciát kódoló, elméletileg „legvalószínűbb” nukleotidszekvenciát.

Az adott gén fragmensét kódoló (vagy az ilyen oligonukleotiddal vagy oligonukleotidkombinációval komplementer) oligonukleotid vagy oligonukleotidkombináció a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal állítható elő [lásd, például: Synthesis and Application of DNA and RNA, S. A. Narang, szerkesztő, (1987) Academic Press, San Diego, CA], és a technika állása szerint ismert technikákkal próbaként felhasználható az említett gént tartalmazó klón azonosítására és izolálására. Nukleinsavhibridizációs eljárásokat és kiónok azonosítására szolgáló technikákat írnak le Maniatis, T. és munkatársai [lásd Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)], valamint Hames B. D. és munkatársai [lásd Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)]. Ezután a fent leírt génkönyvtár azon tagjait, melyek hibridizációs képességgel rendelkeztek, tovább vizsgáljuk, hogy a bennük található kódolószekvenciák méretét és tulajdonságait megállapítsuk.

A kívánt DNS-kódoló szekvencia kimutatásának megkönnyítésére a fent leírt DNS-próbát egy kimutatható csoporttal jelöljük. Ilyen kimutathatóságot megkönnyítő csoport bármely kimutatható fizikai vagy kémiai sajátsággal rendelkező anyag lehet. Számos ilyen

HU 219 016 Β anyagot kifejlesztettek a nukleinsavhibiridizációs területen történő alkalmazás céljára, és a találmány szerinti megoldásban általában szinte bármely, az ilyen eljárásoknál alkalmazott jelölőanyag használható. Különösen előnyösek a radioaktív jelölőanyagok, mint például ³²P, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I vagy hasonlók. Bármely megfelelőjelet adó és elég hosszú felezési idővel rendelkező radioaktív jelölőanyag használható. Az egyszálú oligonukleotidokban kinázreakciókkal hozhatunk létre radioaktív jelölést. Más eljárás szerint nem radioaktív markerekkel, mint például biotinnal, enzimmel vagy egy fluoreszcens csoporttal jelölt polinukleotidokat is felhasználhatunk nukleinsavhibridizációs próbaként.

Összefoglalva tehát egy részleges proteinszekvencia kiderítése lehetővé teszi annak az elméletileg „legvalószínűbb” DNS-szekvenciának vagy ilyen szekvenciákból álló kombinációnak a meghatározását, melyek az adott peptidet kódolhatják. Ezzel az elméleti szekvenciával komplementer oligonukleotidnak (vagy a „legvalószínűbb” oligonukleotidokból álló kombinációval komplementer oligonukleotidkombinációnak) az előállításával olyan DNS-molekulát (vagy DNS-molekulákból álló kombinációt) kapunk, amely adott gént tartalmazó kiónok azonosítására és izolálására próbaként (próbákként) alkalmazható.

Egy gén klónozásánál eljárhatunk úgy is, hogy egy expressziós vektor felhasználásával génkönyvtárat hozunk létre oly módon, hogy a protein expressziójára képes sejtből előállított DNS-t vagy előnyösebben cDNS-t egy expressziós vektorba klónozzuk. Ezt követően kiszelektáljuk a génkönyvtár azon kiónjait, melyek a kívánt proteint expresszálják például oly módon, hogy a génkönyvtárat a protein ellen termelt ellenanyagokkal átvizsgáljuk.

A fent ismertetett eljárások lehetővé teszik egy proteint vagy az említett protein biológiailag aktív vagy antigén hatású fragmenseit kódoló génszekvenciák azonosítását. Az említett génszekvenciák további jellemzésére, valamint a rekombináns protein előállításának céljából kívánatos az említett szekvenciák által kódolt protein expresszálása. Az expresszió révén azonosíthatók azok a kiónok, melyek a kívánt proteinnel megegyező sajátságokkal rendelkező proteineket expresszálnak. Ilyen tulajdonságok többek között egy ellenanyaghoz való specifikus kötődés képessége, az a képesség, hogy a proteinek a natív, nem rekombináns proteinhez kötődő ellenanyagok termelését váltják ki, az a képesség, hogy a sejtnek a proteinnel megegyező enzimaktivitást kölcsönöz, valamint az a képesség, hogy a recipiens sejtnek egy nem enzimatikus (de specifikus) működést kölcsönöz.

Egy DNS-szekvenciát a technika állása szerint ismert eljárásokkal rövidíthetünk meg abból a célból, hogy a kromoszomális régióból, amely a találmány szerinti gazdasejtben történő felhasználás céljára szükséges információnál többet tartalmaz, egy kívánt gént izoláljunk. A teljes hosszúságú szekvenciát például restrikciós enzimmel végzett emésztéssel a kívánt helyen hasíthatjuk.

Más eljárás szerint vagy ezenkívül egy adott szekvenciát a DNS-molekula 3’-végéről hasító nukleázokkal végzett emésztéssel rövidíthetünk meg, majd a kívánt hosszúságú szekvenciát gélelektroforézissel és DNS-szekvenálással azonosíthatjuk és tisztíthatjuk. Ilyen nukleázok például az Exonukláz-III és a Bal31. Egyéb nukleázok is jól ismertek a technika állása szerint.

A találmány gyakorlati megvalósításában a Z. rouxii nevezetű ozmofil élesztőt használtuk modellként. A Z rouxii alkalmazása összeférhető az élelmiszer-előállítással, hiszen Japánban hagyományosan használják szójaszósz előállítására. Az élesztőt leírják például a „The Yeast” című kiadványban (A Taxonomic Study, Kreger-van Rij (szerkesztő), Elsevier Science publishers Β. V., Amsterdam 3984, 462-465. oldal). A találmány szerinti gazdasejtként felhasználhatók egyéb D-arabitol-termelő élesztők, például a Candida polymorpha, a Torulopsis candida, a Candida tropicalis, a Pichia farinosa, a Torulaspora hansenii stb., valamint felhasználhatók D-arabitol-képző gombák, mint például a Dendryphiella salina vagy a Schizophyllum commune.

A D-arabitolt D-xilulózzá oxidáló enzimek (EC 1.1.1.11) ismereteink szerint megtalálhatók baktériumokban, de nem fordulnak elő élesztőkben vagy gombákban. A találmány szerint a D-arabitol-dehidrogenáz (D-xilulóz-képző) gént előnyösen a Klebsiella terrigena baktériumból állítjuk elő, mivel ez egy nem kórokozó talajbaktérium, és magas, indukálható D-arabitol-dehidrogenáz-aktivitással rendelkezik. A példákban szereplő Phpl jelzésű Klebsiella terrigena törzset K. Haahtelától kaptuk (Helsinki University). [A törzs izolálását lásd Haahtela és munkatársai, Appl. Env. Microbiol., 45, 563-570 (1983)]. A D-arabitol-dehidrogenáz-gént könnyen izolálhatjuk oly módon, hogy egy alkalmas vektorban, például a jól ismert és a kereskedelemben hozzáférhető pUC19-plazmidban K. terrigena kromoszomális génkönyvtárat hozunk létre. Ezzel a génkönyvtárral a számos olyan E. coli törzs egyikét transzformáljuk, amely egyedüli szénforrásként képes D-xilulózt hasznosítani, de nem képes D-arabitolt hasznosítani. Megfelelő törzs például a Stratagene cégtől beszerezhető SCSI E. coli törzs. A transzformánsokat ezután olyan táptalajra oltjuk, amely egyedüli szénforrásként D-arabitolt tartalmaz, és izoláljuk a fenti táptalajon kinövő kiónokat. A K. terrigena D-arabitol-dehidrogenáz-enzimének kódolórégióját egy 1,38 kb nagyságú Bcll-Clal-fragmensként könnyen izolálhatjuk, és azt megfelelő promoter és transzkripciós terminátorszekvenciákkal fuzionálhatjuk. Amennyiben gazdasejtként Z rouxii-t alkalmazunk, a találmány szerinti megoldásban használható transzkripciós szabályozóelemek, például a Saccharomyces cerevisiae ADCI-promoterszekvenciája és transzkripciós terminátorszekvenciája. Az ADCI szekvenciája a „GenBank”-tól hozzáférhető.

Bár a legtöbb élesztő és gomba rendelkezik xilitoldehidrogenáz-génnel (EC 1.1.1.9), a találmány megvalósítási módjában tipikusan szükség van az említett gén nagy mennyiségben történő expresszálására. A Pichia stipilis-böl származó, xilitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.9) kódoló XYL2-gént polimerázlánc-reakciós technológiá8

HU 219 016 Β val, az XYL2-gén nukleotidszekvenciáját közlő információ felhasználásával könnyen klónozhatjuk [Kötter és munkatársai, Curr. Génét., 18, 493-500 (1990)]. A gént bármely módosítás nélkül egyéb élesztőfajba juttathatjuk, és saját promoterének szabályozása alatt expresszálhatjuk, vagy a promoterszekvenciát más erős élesztőpromoterre cserélhetjük.

Genetikailag stabil transzformánsokat előállíthatunk vektorrendszerekkel vagy transzformációs rendszerekkel, miáltal a kívánt gén a gazdasejt kromoszómájába épül be. Ilyen integráció létrejöhet a sejtben de novo vagy elősegíthetjük létrejöttét olyan vektorokkal történő transzformációval, például fággal, retrovírusvektorokkal, transzpozonokkal, vagy egyéb, DNS-szekvenciák kromoszómába történő beépülését elősegítő DNS-elemekkel történő transzformációval, melyek önmaguk funkcionálisan beépülnek a gazdasejt kromoszómájába.

A megfelelő promoterek szabályozása alatt álló, a D-arabitol-dehidrogenázt és a D-xilitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.9) kódoló géneket egy plazmidkonstrukcióba együttesen is beépíthetjük, és transzformációval egy Darabitol-dehidrogenáz-termelő organizmus gazdasejtjeibe juttathatjuk. A plazmidvektor fajtája a gazdasejttől függ. A találmány szerinti előnyös megoldásban, Z. rouxii esetében a pSRl-kriptoplazmid-DNS-t [Ushio K. és munkatársai, J. Ferment. Technoi., 66, 481 (1988)] magában foglaló vektorokat használunk. Más olyan élesztőfajok vagy gombafajok esetében, melyekben autonóm replikálódó plazmidok nem ismertek, a xilitoldehidrogenáz (EC 1.1.1.9) és a D-arabitol-dehidrogenázgéneket a gazdasejt kromoszómájába építhetjük be. Előnyös megoldás, ha a beépítést célzottan a gazdasejt riboszomális DNS-lokuszában (a riboszomális-RNS-t kódoló DNS-ben) hozzuk létre, ily módon a két dehidrogenázgén nagy kópiaszámban történő beépülését és magas szintű expresszióját érhetjük el, az említett célzott beépítés úgy valósítható meg, hogy a rekombináns konstrukciót az említett lokuszba történő beépülés irányítására alkalmas rekombináns DNS-szekvenciákkal látjuk el. A D-arabitol-termelő mikroorganizmus transzformálására használt genetikai markerek előnyösen domináns markerek, melyek különböző antibiotikumokkal, például gentamicinnel vagy phleomycinnel, vagy nehézfémekkel, mint például rézzel vagy hasonlókkal szembeni rezisztenciát közvetítenek. A szelekciót lehetővé tevő markergéneket közvetlenül az expresszálandó DNS-génszekvenciákhoz köthetjük, vagy kotranszformációval juttathatjuk ugyanabba a sejtbe.

A D-arabitol-dehidrogenáz és a D-xilitol-dehidrogenáz (EC 1.1.1.9) gének bejuttatásán kívül egyéb genetikai módosítások is alkalmazhatók új, xilitoltermelő törzsek előállítására. Nagy mennyiségben expresszálhatók például az oxidatív pentóz-foszfát-reakcióút enzimjeit kódoló gének, hogy ily módon fokozzuk a Darabitol prekurzorát képező D-ribulóz-5-foszfát szintézisének arányát. Szokásos módszerekkel létrehozott mutagenezissel vagy a génfolytonosság megszakítására alkalmazott technikákkal ugyancsak inaktiválhatjuk a transzketolázenzimet - a pentulóz-5-foszfátok vagy pentóz-5-foszfátok katabolizmusát katalizáló enzimet kódoló gént, így az öt szénatomot tartalmazó cukorfoszfátok fokozott felhalmozódását érjük el. A xilitoltermelés hatásfokát növelhetjük a D-xilulokináz-gén inaktiválásával, mivel így meggátoljuk a foszforilezés révén létrejövő D-xilulóz-veszteséget. Egy, az előbbiektől eltérő xilitoltermelő reakcióúthoz jutunk, ha a transzketoláz mutációval létrehozott inaktiválását és a D-ribulóz-5-epimeráz nagy mennyiségben történő expresszálását kombináljuk, mely reakcióútban D-arabitol nem szerepel köztitermékként.

Hogy a kívánt proteint és/vagy annak aktív származékait expresszálhassuk, a megfelelő gazdasejt által felismert transzkripciós és transzlációs jelekre van szükség. A fenti módszerekkel klónozott, előnyösen kettős szálú formában nyert kódolószekvenciákat az expresszió transzkripciós részét szabályozó szekvenciákhoz funkcionálisan kapcsolva egy expressziós vektorba ligálhatjuk, majd egy prokarióta- vagy eukarióta-gazdasejtbe juttathatjuk, hogy a rekombináns proteint vagy annak funkcionális származékát előállítsuk. Attól függően, hogy a kódolószekvenciának melyik szálát kapcsoltuk funkcionálisan az expresszió transzkripciós részét szabályozó szekvenciákhoz, expresszálhatjuk az „antiszensz”-RNS-t vagy annak funkcionális származékát is.

Egy proteinnek különböző gazdasejtekben történő expressziója a transzlációt követően a protein sajátságait megváltoztató különböző módosulásokat eredményezhet. A találmány szerint a proteint vagy annak funkcionális származékát előnyösen eukariótasejtben, előnyösebben élesztőben expresszáljuk.

Egy nukleinsavmolekuláról, például DNS-ről, akkor mondjuk, hogy „képes expresszálni” egy polipeptidet, ha a transzkripciót szabályozó információkat hordozó expressziós szabályozószekvenciákat tartalmaz, és az említett szekvenciák a polipeptidet kódoló nukleinsavszekvenciához funkcionálisan vannak kapcsolva.

Működőképes kapcsolaton olyan kötést értünk, amelyben egy szekvencia oly módon kapcsolódik egy szabályozószekvenciához (szekvenciákhoz), hogy a szekvencia expressziója a szabályozószekvencia befolyása vagy szabályozása alatt menjen végbe. Akkor mondjuk két DNS-szekvencáról (például egy kódolószekvenciáról és annak 5’-végéhez kapcsolódó promoterrégió-szekvenciáról), hogy funkcionálisan kapcsolódnak, ha a promoterműködés indukálása a kívánt proteint kódoló mRNS átíródását eredményezi, és ha a két DNS-szekvencia közti kötés természete (1) nem változtatja meg a kódolószekvencia leolvasási fázisát (2), nem gátolja, hogy az expressziós szabályozószekvenciák a protein vagy „antiszensz-RNS” expresszióját irányítsák, vagy (3) nem gátolják a DNS-templát átíródását. Tehát egy promoterrégió funkcionálisan kapcsolódik egy DNS-szekvenciához, ha a promoter képes az adott DNS-szekvencia átíródását eredményezni.

A génexpresszióhoz szükséges szabályozórégiók pontos sajátságai fajtól és sejttípustól függően változhatnak, de szükség szerint általában tartalmaznak olyan, a transzkripció vagy transzláció megindításával kapcsolatos 5’-végi át nem íródó és 5’-végi nem transzlálódó (nem kódoló) szekvenciákat, mint például a

HU 219 016 Β „TATA-box”, a „capping’-szekvencia, a CAAT-szekvencia és hasonlók. Az ilyen 5’-végi át nem íródó szabályozószekvenciák főként tartalmaznak egy, a funkcionálisan kapcsolt gén transzkripcióját szabályozó promoterszekvenciát magában foglaló régiót. Ilyen transzkripciós szabályozószekvenciák kívánt esetben enhanszerszekvenciákat vagy 5’-irányú aktivátorszekvenciákat is tartalmazhatnak.

Egy proteinnek eukarióta-gazdasejtben, például élesztőben történő expressziójához az említett gazdasejtben működőképes szabályozórégiókat, előnyösen élesztőből származó szabályozórendszereket kell alkalmaznunk.

A gazdasejt fajtájától függően különböző transzkripciós és transzlációs szabályozószekvenciák széles skálája alkalmazható. Előnyös esetben ezek a szabályozójelek natív állapotban egy olyan génnel kapcsolódnak, amely a gazdasejtben magas szinten képes expresszálódni. Eukariótákban, ahol a transzkripció nem kapcsolódik össze a transzlációval, az ilyen szabályozórégiók attól függően tartalmaznak metionin (AUG) startkodont, vagy nem tartalmaznak ilyet, hogy a klónozott szekvencia tartalmaz-e ilyen metioninkodont. Az ilyen régiók általában tartalmaznak egy, a gazdasejtben az RNS-szintézis megindításának irányítására alkalmas promoterrégiót. A találmány szerint az olyan élesztőgénekből származó promoterek alkalmazása előnyös, amelyek transzlálódásra képes mRNS-terméket kódolnak, különösen az erős promoterek alkalmazhatók, feltéve, hogy a gazdasejtben is képesek promoterként működni. Előnyösen alkalmazható élesztőből származó erős promoterek a GALl-gén promotere, a glikolitikus gének promoterei - például a foszfoglicerokináz (PGK) promotere - vagy a konstitutív alkohol-dehidrogenáz (ADC1) promoter [Ammerer G., Meth. Enzymol., 101C: 192 (1983); Aho, FEBS Lett., 291, 45 (1991)].

Amint az jól ismert, az eukarióta-mRNS transzlációja az első metionint kódoló kodonnál kezdődik el. Ezért biztosítanunk kell, hogy az eukariótapromoter és a kívánt proteint vagy annak funkcionális származékát kódoló szekvencia közti kapcsolódás nem tartalmaz semmiféle olyan köztes kodont, amely metionint kódolhat. Ilyen kodonoknak a jelenléte vagy fúziós proteinek keletkezéséhez vezet (ha az AUG-kodon a proteint kódoló DNS-szekvenciával azonos leolvasási fázis esik), vagy fáziseltolódással járó mutációt okoz (ha az AUGkodon nem esik azonos leolvasási fázisba a proteint kódoló szekvenciával).

Választhatunk a transzkripció megindítását szabályozó, represszálást vagy aktiválást lehetővé tevő jeleket, melyek segítségével a funkcionálisan kapcsolt gének expresszióját szabályozhatjuk. Lényegesek a hőmérsékletre érzékeny szabályozójelek - melyek alkalmazásával a hőmérséklet változtatásával az expresszió represszálható vagy megindítható - és a kémiai szabályozás alatt, például metabolitok szabályozása alatt működő szabályozójelek. Amennyiben „antiszensz-RNS”szekvenciákat kívánunk expresszálni, transzlációs jelek alkalmazása nem szükséges.

Kívánt esetben, a fent ismertetett klónozási eljárásokkal megkaphatjuk a kívánt proteint kódoló szekvenciától 3 ’-irányban található, át nem íródó és/vagy nem transzlálódó régiókat. A 3’-végi át nem íródó régiót az ott található transzkripciós terminátorszekvencia-elemek kedvéért megtarthatjuk; a 3’-végi nem transzlálódó régiót az ott található transzláció befejezését szabályozó szekvenciaelemek kedvéért vagy az eukariótasejtekben a poliadenilezést irányító elemek kedvéért tarthatjuk meg. Amennyiben az eredeti expressziós szabályozószekvencia-jelek a gazdasejtben nem működnek kielégítően, azok a gazdasejtben működőképes szekvenciákra cserélhetők.

A találmány szerinti vektorok tartalmazhatnak továbbá egyéb funkcionálisan kapcsolt szabályozóelemeket, például antibiotikummal szembeni rezisztenciát közvetítő DNS-elemeket vagy a vektornak egy vagy több gazdasejtben való fennmaradását biztosító replikációs origót

A találmány másik előnyös megvalósítási módjában, különösen Z rouxii esetében a bejuttatott szekvenciát a recipiens sejtben önálló replikációra képes plazmidba építjük be. A fenti célra számos különböző vektor bármelyike alkalmazható.

Az adott plazmid- vagy vírusvektor kiválasztásánál lényeges szempont, hogy a vektort tartalmazó recipiens sejteket könnyű legyen felismerni és elkülöníteni a vektort nem tartalmazó recipiens sejtektől; az adott gazdasejtben hány vektorkópiát kívánunk létrehozni; valamint kívánjuk-e azt, hogy a vektor különböző fajokhoz tartozó gazdasejtek között képes legyen ingázni.

Az előnyösen alkalmazható élesztőplazmidok a gazdasejttől függően változnak. A Z. rouxii esetében, a pSRl-kriptoplazmidon [Toh E. és munkatársai, J. Bacteriol., 151, 1380 (1982)] alapuló vektorok, a pSBl-, a pSB2-, a pSB3-, valamint a pSB4-plazmidok [Toh E. és munkatársai, J. Gén. Microbiol., 130,2527 (1984)] alkalmazása előnyös. ZygoSaccharomyces élesztőben például a pSRT303D-pazmidvektor [Jeampipatkul A. és munkatársai Mól. Gén. Génét., 206. 88 (1987)] alkalmazható.

Miután az expresszálandó konstrukciót (konstrukciókat) tartalmazó vektort vagy DNS-szekvenciát előállítottuk, a DNS-konstrukciót (konstrukciókat) számos rendelkezésre álló módszer valamelyikének alkalmazásával, például transzformációval egy megfelelő gazdasejtbe juttatjuk. A vektor bejuttatását követően a recipiens sejteket egy olyan szelektív táptalajban tenyésztjük, amely a vektort tartalmazó sejtek növekedésére szelektál. A klónozott génszekvencia (génszekvenciák) expressziója a kívánt protein vagy az említett protein fragmenseinek termelődéséhez vezet. A transzformált sejtben ez az expresszió végbemehet folyamatosan vagy szabályozott módon, például az expresszió indukálásával.

Olyan találmány szerinti gazdasejtek előállítására, melyeket úgy módosítottunk, hogy azok ne legyenek képesek többé bizonyos géntermék expressziójára, a technika állása szerint ismert eljárásokat alkalmazhatjuk, például helyspecifikus mutagenezissel megszakíthatjuk a gén folytonosságát [Rothstein R. S., Meth. Enzymol., 101C, 202 (1983)].

Az alábbiakban a találmány szerinti xilitol-előállítási eljárást ismertetjük.

HU 219 016 Β

Amennyiben a találmány szerinti gazdasejtként arabitolt termelő rekombináns élesztőt, előnyösen ozmofil élesztőt alkalmazunk, és azt magas ozmotikus nyomású tápfolyadékban, például 10-60% D-glükózt, előnyösen 25% D-glükózt tartalmazó tápfolyadékban tenyészthetjük. (A szokásos tápfolyadékok általában csupán 2-3% D-glükózt tartalmaznak.) A magas ozmotikus nyomású tápfolyadék a vad típusú ozmofil élesztőtörzsekben, mint például a Z. rouxii törzsekben indukálja a Darabitol-képzést. A rekombináns és a kontroll- (vad típusú) törzsek tenyésztőfolyadékában a technika állása szerint ismert módszerekkel, különböző tenyésztési időpontokban meghatározzuk a xilitoltartalmat. A maximális D-arabitol-képzés szempontjából nem optimális tenyésztési feltételek mellett a kísérletek során használt ATCC 13 356 nyilvántartási számú Z. rouxii [pSRT(AX)-9]-törzs mind xilitolt, mind D-arabitolt termelt, illetve szekretált a tenyésztőfolyadékba. A kontrolltörzs tenyésztőfolyadékában csak D-arabitol volt kimutatható. Az első kísérletek során 48 órás tenyésztést követően körülbelül 7,7 g/1 xilitol szintet értünk el.

A xilitolt a találmány szerinti gazdasejtek tenyésztőfolyadékából bármely, a technika állása szerint ismert technikával tisztíthatjuk. A teljes egészében a kitanítás részét képező 5 081 026 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban kromatográfiás eljárással választják el a xilitolt az élesztőtenyészettől. Tehát a fermentációs lépésből származó xilitolt az 5 081 026 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerinti kromatográfiás eljárással a tenyésztőfolyadékból tisztíthatjuk, majd kristályosíthatjuk.

Miután a találmány szerinti megoldást általánosságban ismertettük, a továbbiakban azt a pontosabb értelmezhetőség céljából konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, kivéve, ha kifejezetten másképp kötjük ki.

1. példa.

A bakteriális D-arabitol-dehidrogenáz-gén klónozása

A Phpl jelzésű Klebsiella terrigena törzset [melyet

K. Haahtelától kaptunk, Helsinki University, lásd, Haahtela K. és munkatársai, Appl. Env. Microbiol., 45, 563 (1983)] 1 liter LB-tápfolyadékban (1% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 1% NaCl), egy éjszakán át, 30 °C-on tenyésztettük. A baktériumsejteket (körülbelül 5 grammot) centrifugálással összegyűjtöttük, TE-pufferben (10 mmol/1 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 7,5) egyszer mostuk, majd 1% nátrium-dodecil-szulfátot, valamint 200 pg/ml proteináz-K-t tartalmazó TE-pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenziót 37 °C-on 30 percig inkubáltuk, majd egyszer azonos mennyiségű fenollal, kétszer kloroformmal extraháltuk. Ehhez (1/10 térfogatnyi) 3 mol/1 nátrium-acetátot és (3 térfogatnyi) etanolt adtunk, a kicsapott nukleinsavat centrifugálással összegyűjtöttük, és 5 ml TE-pufferben oldottuk. Az RNS-t oly módon távolítottuk el, hogy az oldatot 25 ml térfogatú 1 mol/1 NaCl-oldaton keresztül egy éjszakán át 30 000 fordulat/perc értéken Beckmann TÍ50.2 típusú rotorban centrifugáltuk. A fenti módszerrel nyert Klebsiella terrigena kromoszomális DNS-ffagmenseinek átlagos mérete meghaladta az 50 000 bázispárt (bp). Ezután a DNS-t a gyártó (Boehringer) által mellékelt pufferben, 5 egység/mg enzim/DNS-arány mellett Sau3A restrikciós endonukleázzal emésztettük, míg az átlagos DNS-fragmens mérete (agarózgélelektroforézis-vizsgálat alapján) körülbelül 5-10 kb-ra nem csökkent. Az emésztett DNS-t egy 20x10x0,6 cm méretű, 0,6%-os agarózgélen, TBE-pufferben (0,09 mol/1 Tris-bórsav, 1 mmol/1 EDTA, pH 8,3), 5 V/cm feszültség mellett egy éjszakán át végzett elektroforézissel frakcionáltuk, körülbelül 5 kb fragmensméretnek megfelelő pozícióban az agarózgélbe egy vályulatot vágtunk, a vályulat hosszában egy dialízismembránt rögzítettünk, és addig folytattuk az elektroforézist, amíg lényegében minden 5 kb-nál nagyobb DNS-fragmens a membránra adszorbeálódott. A pUC19-plazmid-DNS-t (Pharmacia) BamHI restrikciós endonukleázzal és bakteriális alkalikus foszfatázzal emésztettük a gyártó által mellékelt puffer- és reakciófeltételek alkalmazásával. A pUC19-plazmid lineáris formáját a fent ismertetett membránelúciós módszer alkalmazásával végzett preparatív gélelektroforézissel megtisztítottuk, és a Klebsiella terrigena kromoszomális DNS 5-15 kb nagyságú frakciójával ligáltuk. A ligációs eleggyel kompetens E. co/i-SCSl sejteket (Stratagene) transzformáltuk, hogy ampicillinre rezisztens sejteket kapjunk. Ebben a kísérletben körülbelül 10 000 rekombináns kiónt kaptunk. A transzformánsokat tartalmazó lemezekről összegyűjtött sejteket egyedüli szénforrásként D-arabitolt (1%) tartalmazó minimállemez-táptalajra oltottuk. Két napig tartó, 37 °C-on végzett inkubálást követően több kiónt kaptunk. Ezek közül (a leggyorsabban szaporodó) két kiónból plazmid-DNS-t izoláltunk, és azzal egy, a D-arabitol felhasználására képtelen, de D-xilulóz felhasználására képes E. coli HB101-törzset transzformáltunk. D-arabitolt tartalmazó McConkey agarlemezeken (Difco) tenyésztve mindegyik transzformáns képesnek bizonyult D-arabitol-felhasználásra, míg az összes kontrollklón (pUC19plazmiddal transzformált azonos törzs) negatív volt. Restrikciós vizsgálattal kimutattuk, hogy a két izolált klón azonos plazmidokat tartalmaz. A két izolált plazmid közül az egyiket (melyet pARL2-nek neveztünk) tovább jellemeztük. Az 1. ábra mutatja pARL2-plazmidban a D-arabitol-dehidrogenáz-gént tartalmazó (körülbelül) 9,5 kb nagyságú klónozott K. terrigena DNS-fragmens restrikciós térképét.

2. példa

A bakteriális D-arabitol-dehidrogenáz-gén expreszszálása élesztőben

A D-arabitol-dehidrogenáz-gént tartalmazó, 9,5 kb nagyságú K. terrigena DNS-t tartalmazó eredeti kiónból szokásos rekombináns DN S-technikák alkalmazásával abból egy körülbelül 1,8 kb hosszúságú SaclHindlII-fragmenst szubklónoztunk, és azt találtuk, hogy az tartalmazza a D-arabitol-dehidrogenáz-gént. Ezt a pUC 19-vektorban található DNS-fragmenst tartalmazó plazmidot (pADH-plazmidot, ahol ADH a D-ara11

HU 219 016 Β bitol-dehidrogenázt jelöli) izoláltuk az E. co/z'-JMllO törzsből, Bell és Clal restrikciós endonukleázokkal emésztettük, és abból preparatív agarózgél-elektroforézissel egy 1,38 kb nagyságú DNS-fragmenst izoláltunk. Ezt a DNS-fragmenst a négy dezoxinukleotidtrifoszfát jelenlétében DNS-polimeráz-I Klenow-fragmensével kezeltük, majd a HindlII-enzimmel emésztett és Klenow-fragmenssel kezelt pAAH5 jelzésű élesztőexpressziós vektorral [Ammerer, Meth. Enzymol., 101, 192 (1983)] ligáltuk (lásd a 2. ábrát). Az így kapott pYARD nevű expressziós plazmid egy E. coli és Saccharomyces cerevisiae között ingázó vektor, amely bakteriális eredetű (E. coli) replikációs origót és ampicillin-rezisztencia-gént tartalmaz, valamint tartalmaz egy élesztőből (S. cerevisiae-ből) származó 2 pm-es DNS-ből álló replikációs origót, és élesztőben történő szelekció céljára tartalmazza az élesztőből (S. cerevisiae-ből) származó LEU2-gént. Az expressziós kazetta tartalmaz egy, a K. terrigena D-arabitol-dehidrogenáz-génjét határoló és ahhoz működőképesen kapcsolt élesztő-alkohol-dehidrogenáz-I (ADCI) promoterszekvenciát, valamint ADCI-transzkripciós terminátorszekvenciát.

A fent leírt pYARD elnevezésű D-arabitol-dehidrogenáz expressziós vektorral mind a Saccharomyces cerevisiae GRF18-törzset [MAT-α, leu2-3, 112, his311,15], mind a 5. cerevisiae DBY746-törzset (ATCC 44773 nyilvántartási szám; MAT-alfa, leu2-3, 112, his3-A 1 ura3-52 trpl-289) azonos eredménnyel transzformáltuk. A transzformációt a szokásos lítium-kloridos módszerrel végeztük [Ito és munkatársai, Bacteriol., 153, 163 (1983)], a transzformánsok szelektálására a pYARD LEU2-markerét használtuk. A transzformánsokat folyékony tenyészetben, minimál-tápfolyadékban [0,67% élesztő-nitrogénbázis (Difco); 2% Dglükóz, 100 mg/ml hisztidin és triptofán] tenyésztettük 30 °C-on egy éjszakán át rázás mellett. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, minimális térfogatú, 1 mmol/1 NAD⁺-ot tartalmazó, 0,1 mol/1 koncentrációjú kálium-foszfát-pufferben (pH 6,8) szuszpendáltuk, majd egy „Bead beater” készülékben (Biospec Products) 0,5 mm átmérőjű üveggyöngyökkel jéghűtés mellett, 6 percig roncsoltuk. A fent ismertetettek szerint meghatároztuk a D-arabitol-dehidrogenáz-aktivitást. Az előbbi kísérletek során pozitív kontrollként egy D-arabitolon tenyésztett K. terrigena sejtextraktumát használtuk, negatív kontrollként pAAH5-pazmiddal transzformált DBY746-törzset használtunk. A 2. táblázatban bemutatott eredmények szerint a K. terrigena baktériumból izolált D-arabitol-dehidrogenáz-gén jó hatásfokkal expresszálódott élesztőben.

2. táblázat

Mikroorganizmus- törzs	D-arabitol-dehidrogenázaktivitás (önkényes egységek)
K. terrigena Phpl	3,5
DBY746[pYARD]	1,0
DBY746[pAAH5]	0,00

3. példa

Elesztövektorok előállítása xilitol-dehidrogenáz- és arabitol-dehidrogenáz-enzimek nagy mennyiségben történő expresszálására

Egy élesztőből (Pichia stipitis-ből) származó xilitol-dehidrogenáz-gént, az XYL2-gént [Kötter és munkatársai, Curr. Génét., 18, 493 (1990)] kódoló ismert nukleotidszekvencia alapján olyan oligonukleotidokat szintetizáltunk, melyek felhasználásával az előbbi gént polimeráz-láncreakciós eljárással klónozni tudtuk. A két alábbi oligonukleotidot, a [CGAATTCTAGACCACCCTAA GTCGTCCC (5’-oligonukleotid) (1. azonosító számú szekvencia) oligonukleotidot és a TTCAAGAATTCAAG AAACTCACGTGATGC (3’-oligonukleotid) (2. azonosító számú szekvencia)] oligonukleotidot úgy terveztük, hogy azok a PCR-eljárással kapott termék 5’- és 3’-végén megfelelő Xba és EcoRI restrikciós hasítási helyeket tartalmazzanak. Kötter és munkatársai szerinti számozás szerint [Curr. Génét., 18, 493 (1990)] az 5’-oligonukleotid az 1-24. pozícióban, a 3’-oligonukleotid pedig az 1531-1560. pozícióban kapcsolódik az XYL2-génhez.

A Pichia stipitis CBS6054-törzset (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Postafiók 273, 3740 AG Baam, Hollandia) egy éjszakán át YEPDtápfolyadékban tenyésztettük (1% élesztőkivonat, 2 pepton, 2% D-glükóz), a sejteket centrifugálással öszszegyűjtöttük, egyszer 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó, 1 mol/1 szorbitololdattal (pH 7,5) mostuk, az előbbi oldattal megegyező összetételű oldatban szuszpendáltuk, majd Lyticase-zal (Sigma) emésztettük.

Az emésztést oly módon szabályoztuk, hogy a sejtszuszpenzió 1% SDS-ben felvett 1:100 arányú hígításának optikai denzitását 600 nm-en folyamatosan követtük. Az emésztést akkor állítottuk le, amikor ez az érték körülbelül az eredeti egyhetedére csökkent. A szferoplasztszuszpenziót ezután 1 mol/1 szorbitololdattal négyszer mostuk. A szferoplasztokat 1% SDS-ben lizáltuk, majd 37 °C-on 30 percig 200 pg/ml proteináz-K-val kezeltük. Miután egyszer fenollal, kétszer kloroformmal extraháltuk, a nukleinsavakat etanollal kicsaptuk, és kis térfogatú TE-pufferben szuszpendáltuk. A kromoszomális DNS épségét agarózgél-elektroforézissel ellenőriztük. Az átlagos DNS-fragmensek mérete nagyobb volt, mint 50 kb. PCR-eljárást alkalmaztunk Taq-DNS-polimeráz (Boehringer) és a gyártó által mellékelt puffer felhasználásával. Az alábbi termálciklust alkalmaztuk: 93 °C-on 30 másodperc, 55 °C-on 30 másodperc és 72 °C-on 60 másodperc. A PCReljárással nyert terméket kloroformmal extraháltak, etanollal kicsaptuk, majd standard körülmények között EcoRI-, valamint Xbal-enzimekkel emésztettük. Miután a DNS-fragmenseket agarózgélen tisztítottak, azokat Xbal- és EcoRI-enzimekkel hasított pUC18-plazmidba klónoztak [pUC(XYL2)-plazmid]. Ezután restrikciós enzimekkel végzett vizsgálattal igazoltuk, hogy a klónozott fragmens restrikciós térképe megfelel a P. stipitis XYL2-gén nukleotidszekvenciájának.

A D-arabitol-dehidrogenáz, valamint a xilitol-dehidrogenáz nagy mennyiségben történő expresszálása cél12

HU 219 016 Β jából élesztőplazmidokat állítottunk elő a 3. és 4. ábrán bemutatottak szerint. Abból a célból, hogy a pYARDplazmidban található D-arabitol-dehidrogenáz-expreszsziós kazettában a határoló restrikciós helyeket kicseréljük, az egész kazettát BamHI-enzimmel végzett emész- 5 téssel kivágtuk, és BamHI-enzimmel hasított pUC18pazmidba klónoztuk. Az így kapott pUC(YARD)plazmidot Sáli- és EcoRI-enzimekkel emésztettük, és preparativ gélelektroforézissel az egyetlen 2,0 kb nagyságú DNS-fragmenst izoláltuk. Ezt a fragmenst a pUC(XYL2)-pIazmidból izolált 1,6 kb nagyságú HindlII-EcoRI DNS-fragmenssel, valamint a HindlIIés Sall-enzimmel emésztett pJDB207 E. co/i-élesztő ingázóvektorból [Beggs J. D., Natúré, 275,104 (1978)] származó 6,6 kb nagyságú fragmenssel ligáltuk.

Miután az előbbi ligációs eleggyel E. coliA transzformáltunk, a pJDB(AX)-16-plazmidot izoláltuk. Ez a plazmid mind E. co/t-ban, mind Saccharomyces cerevisiae-ben képes replikálódni. Az előbbi plazmid S. cerevisiae-ben a D-arabitol-dehidrogenáz, valamint a 20 xilitol-dehidrogenáz magas szintű szintézisét irányítja.

A pSRT(AX)-9-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pJDB(AX)-9-plazmidból nyert 4,7 kb nagyságú Sallfragmenst és a pSRT303D-plazmid [Jeampipatkul és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 206, 88 (1987)] részle- 25 ges Sall-hidrolízissel kapott lineáris formáját ligáltuk.

4. példa

Xilitolt szekretáló élesztőtörzsek előállítása Az előbbiekben ismertetett módszer kismértékben módosított változatával [Ushio K. és munkatársai, J. Ferment. Technoi., 66, 481 (1988)] a pSRT(AX)-9-plazmiddal egy ZygoSaccharomyces rouxii törzset (ATCC 13356) transzformáltunk. Röviden, egy éjszakán át Z rouxii sejteket tenyésztettünk YEPD-tápfolyadékban, (a 35 tenyészet 600 nm-en meghatározott optikai denzitása 3-5 volt), a sejteket alacsony fordulatszámon végzett centrifugálással összegyűjtöttük, 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó 1 mol/1 szorbitololdattal (pH 7,5) kétszer mostuk, majd a fenti oldattal megegyező összetételű, de 1% 2- 40 merkapto-etanolt tartalmazó oldatban a tenyészet eredeti térfogata egyötödének megfelelő térfogatban szuszpendáltuk, és szobahőmérsékleten lyticase-zal (Sigma) emésztettük. Az emésztést követően a sejtszuszpenzió megfelelő térfogatát 1% SDS-oldatban hígítottuk, és a hí- 45 gított minta optikai denzitását 600 nm-en mértük. Amikor ez az érték az eredeti egyhetedére csökkent, az emésztést oly módon állítottuk le, hogy a szuszpenziót jégen lehűtöttük, és a sejteket a szorbitololdattal (10 percig, 1000 fordulat/perc értéken, 0 °C-on végzett centrifugálással) addig mostuk, míg a merkapto-etanol szaga nem volt már érezhető. A szferoplasztokat hideg, 1 mol/1 szorbitolban oldott 0,3 mol/1 kalcium-klorid-oldattal egyszer mostuk, és a fenti oldatban az eredeti tenyészet körülbelül egynegyedének megfelelő térfogatban szuszpendáltuk. Ebből a szuszpenzióból 200 pl térfogatú mintá10 kát elegyítettünk 10-20 pg plazmid-DNS-sel, és a mintákat 0 °C-on 40 percig inkubáltuk. A szferoplasztszuszpenzióhoz 0,8 ml 0,3 mol/1 kalcium-kloridot tartalmazó jéghideg, 50%-os PEG-6000-oldatot adtunk, és 1 órán át hidegben folytattuk az inkubálást. A szferoplasztokat 15 asztali centrifugában végzett centrifugálással (4000 fordulat/perc, 10 perc) koncentráltuk, 1 mol/1 szorbitolt tartalmazó 2 ml YEPD-tápfolyadékban szuszpendáltuk, és egy éjszakán át szobahőmérsékleten regenerálódni hagytuk. A regenerálódott sejteket 50-100 pg/ml gentamicint tartalmazó YEPD-lemeztáptalajokra oltottuk, és 30 °C-on 46 napig inkubáltuk.

A transzformánsokat folyékony YEPD-tápfolyadékban tenyésztettük, a S. cerevisiae esetében leírtak szerint (lásd a 2. példát) sejtextraktumot készítettünk, és meghatároztuk a D-arabitol-dehidrogenáz-, valamint xilitol-dehidrogenáz-aktivitást. Ezeknek a méréseknek az eredményeit összehasonlítottuk a 3. táblázatban szereplő egyéb organizmusokban végzett hasonló mérésekkel. Az eredmények azt mutatták, hogy mindkét gén ha30 tékonyan expresszálódik Z. rouxii-ban.

A pSRT(AX)-9-plazmiddal transzformált Z. rouxii sejteket (ATCC 13356) két napig 50 ml térfogatú, 50 pg/ml gentamicint tartalmazó YEPD-tápfolyadékban tenyésztettük, centrifugálással összegyűjtöttük, majd azzal 100 ml, 25% (tömeg/térfogat) glükózt tartalmazó YEPD-tápfolyadékot oltottunk be. Ezt a tenyészetet egy 1000 ml térfogatú palackban, körkörös mozgást végző rázókészüléken (200 fordulat/perc) 30 °C-on tenyésztettük. Egy másik kísérletben (2. kísérlet) élesztőkivonatot nem tartalmazó, egyébként azonos összetételű tápfolyadékot (alacsony foszfáttartalmú tápfolyadékot) használtunk. A tenyésztőfolyadékban a xilitoltartalmat standard HPLC-eljárással és gázkromatográfiával határoztuk meg. Az eredményeket a 4. táblázatban összegeztük. Az azonos összetételű (de gentamicint nem tartalmazó) tápfolyadékban tenyésztett transzformálatlan Z. rouxii tenyésztőfolyadékában nem volt xilitol kimutatható.

3. táblázat

Különböző organizmusokban és törzsekben kimutatható D-arabitol-dehidrogenázés xilitol-dehidrogenáz-aktivitások

Organizmus és törzs	Plazmid (*)	D-arabitol-dehidrogenáz (nemzetközi cgység/mg protein)	Xilitol-dehidrogenáz (nemzetközi egység/mg protein)
Klebsiella terrigena Phpl	nincs	0,48	nem kimutatható (**)
S. cerevisiae DBY746	nincs	0,00	<0,01
S. cerevisiae DBY746	pJDB(YARD)	3,0	<0,01

HU 219 016 Β

3. táblázat (folytatás)

Organizmus és törzs	Plazmid (*)	D-arabitol-dehidrogenáz (nemzetközi egység/mg protein)	Xilitol-dehidrogenáz (nemzetközi egység/mg protein)
S. cerevisiae DBY746	pJDB(AX)-16	1,9	1,2
Z rouxii ATCC 13356	nincs	0,00	<0,02
Z. rouxii ATCC 13356	pSRT(AX)-9	1,3	0,7

(*) A plazmidokat úgy terveztük, hogy azok a következő enzimeket expresszálják: pJDB(YARD)-D-arabitol-dehidrogenázt, pJDB(AX)-16-D-arabitol-dehidrogenázt és xilitol dehidrogenázt, pSRT(AX)-9-D-arabitol-dehidrogenázt és xilítol-dehidrogenázt.

(**) nem kimutatható.

4. táblázat

A pSRT(AX)-9-plazmidot hordozó Z. rouxii (ATCC 13356) törzs xilitoltermelése (g/1)

Tenyésztési idő (óra)	1. kísérlet (élesztőkivonatot tartalmazó folyadék)	2. kísérlet (élesztőkivonat-mentes tápfolyadék)
0	0,0	0,0
48	7,7	0,5
144	7,5	6,1

Hasonló megközelítést alkalmazva előállíthatok olyan törzsek is, amelyek más szénfonásokból képesek xilitolt előállítani. Például a Candida tropicalis jó hatásfokkal képes n-alkánokat D-arabitollá alakítani [Hattori K. és Suzuki T., Agric. Bioi. Chem., 38, 1875 (1974)]. A pJDB(AX)-9-plazmidban található 4,7 kb nagyságú Sall-fragmenst a pCUl-plazmidba inszertálhatjuk, és ezzel a plazmiddal SU-2 (ura3) C. tropicalis törzset transzformálhatunk. Más eljárás szerint a fenti expressziós kazettát egy domináns szelektív markert hordozó plazmidvektorba építve azt egy prototrof C. tropicalis törzsbe transzformálhatjuk.

5. példa

Egy arabitol-dehidrogenáz és xilitol-dehidrogenáz expressziójára, valamint Torulopsis candida transzformációjára felhasználható integrálódó domináns szelekciós vektor előállítása

Az ATCC-20214 nyilvántartási számú T. candida törzsből a 5. cerevisiae esetében alkalmazott standard eljáráshoz hasonló módon kromoszomális DNS-t állítottunk elő. A T. candida szferoplasztok előállításánál azonban hatékony sejtfaloldás elérésére nagyobb Lyticase (Sigma) koncentrációt (10 g sejtre körülbelül 50 000 egységet), és hosszú inkubációs időt (szobahőmérsékleten, néhány órától egy éjszakáig tartó inkubálást) kellet alkalmaznunk. A szferoplaszt-előállításnál az alábbi összetételű puffért használtuk: 1 mol/1 szorbitolt és 1 merkapto-etanolt tartalmazó 1 mmol/1 koncentrációjú EDTA (pH 8). A szferoplasztokat ezzel megegyező összetételű (de merkapto-etanolt nem tartalmazó) pufferrel háromszor mostuk, majd 15 ml 1%-os SDS-ben oldottuk. Az elegyet közvetlenül a sejtlízist követően kétszer fenollal extraháltuk, a DNS-t 2-szeres térfogatú etanol hozzáadásával kicsaptuk, majd centrifugáltuk (5 percig, 1000 fordulat/perc értéken). A DNS-t 70%-os etanollal kétszer mostuk, és vákuum alatt szárítottuk. A DNS-t 5 ml, 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó 10 mmol/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferben oldottuk, 10 pg/ml koncentrációban ribonukleáz-A-t adtunk hozzá, és az oldatot 1 órán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A DNS épségét agarózgél-elektroforézissel ellenőriztük, molekulatömeg-standardként lambdaDNS-t használtunk.

200 pg T. candida kromoszomális-DNS-t HindlII-, és EcoRI-enzimekkel hasítottunk, az emésztett elegyet egy 0,7%-os preparatív agarózgélre (8x15x0,8 cm), egy 6 cm széles vályulatba vittük fel, és elektroforézissel szétválasztottuk. A gélből egy 1 cm széles gélcsíkot kivágtunk, és a mintát egy pozitív töltésű nejlonmembránra (Boehringer 1209 299) blotoltuk. A blotot a pAT68-plazmidból Sall-enzimmel kivágott, ZygoSaccharomyces bailii rDNS-ből származó, 10 kb nagyságú DNS-ffagmenspróbával vizsgáltuk [Sugihara K. és munkatársai, Agric. Bioi. Chem., 50, (6) 1503 (1986)]. A próba jelölését és a biot előhívását digoxigénnel jelölt DNS-jelölő és -kimutató reagenskészlettel („DIG DNA Labeling and Detection Kit”) (Boehringer 1093 657) végeztük a gyártó utasításai szerint. Három hibridizációs jelet adó csíkot észleltünk, melyek körülbelül 4,5, 2,7 és 1,1 kb nagyságú DNS-fragmenseknek feleltek meg. A biot alapján a preparatív gél megmaradt részéből a legnagyobb hibridizáló DNS-fragmensnek (4,5 kb) megfelelő csíkot kivágtuk, a DNS-t elektroeluáltuk, és EcoRI-, valamint HindlII-enzimmel hasított pUC19-plazmidba klónoztuk.

HU 219 016 Β

A ligációs eleggyel E. coli-t transzformáltunk. A transzformált baktériumokat ampicillint tartalmazó LB-lemeztáptalaj agarfelszínére helyezett töltéssel rendelkező nejlonmembránra (Bio-Rad 162-0164) oltottuk. 24 órás 37 °C-on végzett inkubálást követően a membránt eltávolítottuk, és a baktériumtelepeket a gyártó utasításai szerint helyben feloldottuk. Másolatlemezekre nem volt szükség, mivel az E. coli ezen a típusú membránon átjut, és a membrán eltávolítását követően az agarfelszínen mindegyik baktériumtelepnek látható nyoma marad. A membránt a fenti Z. bailii r-DNS-fragmens-próbával, a fenti DIG-gel jelölt DNS-kimutató reagenskészlet felhasználásával vizsgáltuk. Számos pozitív kiónt (körülbelül az összes klón 2-5%-ának megfelelő kiónt) azonosítottunk. Nyolc pozitív hibridizációs jelet adó és négy hibridizációs jelet nem adó klónból előállított „miniprep” (kis mennyiségű plazmid-DNS-készítményt) EcoRI, Hindin, valamint EcoRV restrikciós enzimek elegyével vizsgáltunk. Mindegyik pozitív hibridizációs jelet adó klón azonos restrikciósfragmensmintát mutatott (jellemzően egy 0,55 és egy 1,5 kb nagyságú fragmenst), míg a hibridizációval negatívnak bizonyult kiónoknál ugyanaz a minta minden esetben eltérő volt. A hibridizációval pozitívnak bizonyult kiónok egyikéből preparatív mértékben plazmid-DNS-t izoláltunk, és azt pTCrDNS-nek neveztük. Megállapítottuk, hogy a klónozott darab egy I candida rDNS-fragmens volt, mivel: 1) erősen hibridizált a Z. bailii rDNS-sel; 2) a részlegesen dúsított, emésztett T. candida kromoszomálisDNS-ből nagy frekvenciával klónoztuk (ismeretes, hogy az élesztőben körülbelül 100 rDNS-kópia található). A klónozott DNS-fragmens részleges restrikciós térképét az 5. ábra mutatja.

Egy domináns szelekciós markert, valamint a T. candida rDNS-fragmenst tartalmazó plazmidot az alábbiak szerint állítottunk elő. A pUT332-plazmidot [Gatignol A. és munkatársai, Gene, 91, 35 (1990)] HindlII- és KpnI-enzimekkel hasítottuk, az 1,3 kb nagyságú DNSfragmenst agarózgél-elektroforézissel izoláltuk, és a

4,5 kb nagyságú HindlII-EcoRI pTCrDNS-fragmenssel, valamint az EcoRI-, valamint KpnI-enzimekkel emésztett pUC19-plazmiddal ligáltuk (lásd a 6. ábrát). A ligációs eleggyel E. coli-t transzformáltunk, és restrikciós vizsgálattal azonosítottuk a pTC(PHLE)-plazmidot tartalmazó kiónt.

A PTC(PHLE)-plazmidot Sall-enzimmel részlegesen emésztettük, és a plazmid lineáris formáját agarózgélelektroforézissel tisztítottuk. Ezt a pJDB(AX)-16-plazmidból (lásd a 2. példák) származó 5 kb nagyságú Sallfragmenssel ligáltuk. Miután ezzel a ligációs eleggyel E. coli-t transzformáltunk, a kapott kiónok közül azonosítottuk a pTC(AX)-plazmidot (lásd a 6. ábrát). Ez a plazmid a következő működési elemeket tartalmazza:

a) egy élesztőből származó promoter, valamint transzkripciós terminátor szabályozása alatt működő bakteriális eredetű phleomycinrezisztencia-gént, mely lehetővé teszi az említett plazmiddal transzformált élesztősejtek direkt szelekcióját;

b) egy T. candida rDNS-darabot, amely a T. candida kromoszomális-DNS-sel történő homológ rekombináció célpontját képezi, és fokozza a transzformáció hatékonyságát;

c) az arabitol-dehidrogenáz és xilitol-dehidrogenázgéneket tartalmazó expressziós kazettát, amely az arabitolból xilitolképződést eredményező reakcióút számára a két enzim szintézisét biztosítja.

6. példa

A T. candida transzformációja és a xilitoltermelés vizsgálata

A pTC(AX)-plazmiddal az ATCC 20214 nyilvántartási számú Torulopsis candida törzset transzformáltuk. A T. candida törzset 36 óráig 10% glükózt tartalmazó YEPD-tápfolyadékban tenyésztettük. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük (2000 fordulat/perc, 10 perc, 4 °C), és steril 1 mol/1 koncentrációjú szorbitollal háromszor mostuk. A sejtüledéket azonos térfogatú, 1 mol/1 koncentrációjú hideg szorbitolban szuszpendáltuk, 200 μΐ térfogatú mintákat pUT(AX)-DNS-sel (20-100 pg) elegyítettünk, majd jéghideg, 2 mm elektródtávolsággal rendelkező elektroporációs küvettákba vittünk át, és azokat „Invitrogen ElectroPorator” készülékkel, az alábbi beállítások mellett elektroporáltuk: 1800 volt, 50 pF kapacitás, 150 ohm párhuzamos ellenállás. A sejteket 2 ml 1 mol/1 szorbitolt tartalmazó YEPD-tápfolyadékba vittük át, és egy éjszakán át, 30 °C-on rázókészüléken inkubáltuk. A transzformált sejteket alacsony fordulatszámú centrifugálással összegyűjtöttük, és 30 pg/ml phleomycint tartalmazó, pH 7,5-re titrált YEPD-táptalajt tartalmazó lemezekre oltottuk. A lemezeket 30 °C-on 7-10 napig inkubáltuk. A fenti időtartam alatt kifejlődött élesztőtelepek többsége háttérmutáns volt, hiszen a kontroli-lemezeken (amelyek hasonló módon kezelt sejteket tartalmaztak, azzal az eltéréssel, hogy DNS-t nem adtunk hozzájuk) hasonló számú telep jelent meg. Abból a célból, hogy a valódi transzformánsokat a spontán mutánsoktól el tudjuk különítem, a fent leírt T. candida kromoszomálisDNS-előállítására kis méretben végrehajtott eljárással kromoszomális DNS-t izoláltunk 72 különálló élesztőklónból. A fenti DNS-készítmények mindegyikéből 10 pg mennyiséget EcoRI- és BamHI-enzimek elegyével hasítottunk. Az emésztett elegyeket 1%-os agarózgéleken szétválasztottuk, majd azokról az 5. példában leírtak szerint pozitív töltésű nejlonmembránokon blotot készítettünk. A biotokat a pADH-plazmidból (lásd 2. példa) nyert DNS-próbával vizsgáltuk, amely arabitol-dehidrogenáz-szekvenciákat, valamint pUC-szekvenciákat tartalmaz, azonban (hogy elkerüljük a lehetséges homológ élesztőszekvenciák közti hibridizációt) nem tartalmaz élesztőből származó DNS-fragmenst. A próba jelölését és a biot előhívását a „DIG DNA Labeling and Detection” reagenskészlettel (Boehringer 1093 657) végeztük. Csak egyetlen olyan kiónt találtunk [T. candida: :pTC(AX)], amely a transzformációra használt plazmid szerkezetének megfelelő hibridizációs jelet adott (a 2-3 kb régióban három csíkot), ami a transzformáció igen alacsony hatásfokára utalt. Még egy klón esetében mutattunk ki pozitív hibridizációs jelet, azonban az egyetlen hibridizáló csík pozíciója (kö15

HU 219 016 Β rülbelül 5-7 kb) arra utalt, hogy a pTC(AX)-plazmidnak vagy csak egy fragmense épült be az élesztőkromoszómába, vagy a beépülés helyén valamilyen átrendeződés történt. Arra következtettünk, hogy a plazmid beépült a T. candida kromoszómájába. Ez a feltevés összevág azzal a megfigyeléssel, hogy nem szelektív tápfolyadékban történő tenyésztést és klónozást követően mindegyik T candida ; :pTC(AX)-klónnál megmaradt a phleomycinrezisztens fenotípus.

A T candida: :pTC(AX)-transzfonnánst 36 óráig, 10% glükózt tartalmazó YEPD-tápfolyadékban tenyésztettük, és az arabitol-dehidrogenáz-, valamint a xilitoldehidrogenáz-aktivitást a 4. példában leírtak szerint mértük. Az eredményeket az 5. táblázatban foglaltuk össze.

5. táblázat

Arabitol-dehidrogenáz- és xilitol-dehidrogenázaktivitás a vad típusú és a pTC(AX)-plazmiddal transzformált T. candida törzsben (nemzetközi egység/mg protein)

T candida	Arabitol- dehidrogenáz	Xilitol- dchidrogenáz
Vad típusú	0,02	0,03
Transzformáns	0,03	0,05

A xilitol-dehidrogenáz-aktivitás nem haladta meg szignifikánsan a T. candida endogén xilitol-dehidrogenáz-aktivitásának szintjét. A plazmid kódolta arabitol-dehidrogenáz-aktivitást (EC 1.1.1.11) nehéz volt elkülöníteni az igen hasonló, de mégis kissé eltérő aktivitású, (ribulózképződéshez vezető EC 1.1.1.) endogén arabitol-dehidrogenáz-aktivitásától. A fenti kísérletből levonható egyetlen határozott következtetés az, hogy mindkét enzim expressziós szintje sokkal alacsonyabb volt mint Z. rouxii-ban. Nem voltak sikeresek azon próbálkozásaink, melyek a plazmidkópiák számát kísérelték meg növelni, vagy a T. candida: :pTC(AX) növekvő phleomycinkoncentrációjú tápfolyadékban történő tenyésztésével próbálták a beépült plazmid által kódolt két dehidrogenáz expressziójának szintjét fokozni.

Vizsgáltuk a T. candida : :pTC(AX) xilitoltermelését 5-7 napig 10% glükózt tartalmazó YEPD-tápfolyadékban történő tenyésztést követően. Három különböző kísérlet során HPLC-vizsgálat alapján a transzformáns 1,1,1,6 és 0,9 g/1 xilitolt termelt, míg a vad típusú T. candida tenyésztőfolyadékában nem volt xilitol kimutatható. Az általunk alkalmazott analitikai módszer kimutathatósági küszöbe kisebb mint 0,1 g/1. Levonható tehát a következtetés, hogy a T. candida: :pTC(AX) xilitoltermelése valóban plazmid által meghatározott.

7. példa

Candida polymorpha arabitol-dehidrogenáz- ésxilitol-dehidrogenáz-génekkel történő transzformációja

Abból a célból, hogy az arabitol-dehidrogenáz-, valamint xilitol-dehidrogenáz-géneket Candida polymorpha törzsbejuttassuk, Boeke és munkatársai módosított eljárásával [Boeke J. D. és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 197, 345 (1984)] egy, az orotidin-foszfát-dekarboxiláz-génben mutáns törzset (a továbbiakban URA3) izoláltunk. Az ATCC 20213 nyilvántartási számú C. polymorpha törzset 24 órán keresztül YEPD-tápfolyadékban tenyésztettük, a sejteket centrifügálással összegyűjtöttük (2000 fordulat/perc, 10 perc), vízzel kétszer mostuk, és háromszoros térfogatú steril, 0,1 mol/1 koncentrációjú nátrium-foszfát-pufferben (pH 7,0) szuszpendáltuk. Ehhez 1% végkoncentrációban etil-metánszulfonátot adtunk, és a sejteket 2 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A reakciót oly módon állítottuk le, hogy a sejteket 0,1 mol/1 nátrium-tioszulfát-oldatba vittük át, majd háromszor steril vízzel mostuk. A mutagenizált sejteket 0,5 1 YEPD-tápfolyadékba vittük át, és 2 napig 30 °C-on rázás mellett tenyésztettük. Az élesztősejteket centrifügálással összegyűjtöttük, vízzel kétszer mostuk, 1 1 térfogatú 0,7% Yeast Nitrogén Base-t (Difco), valamint 2% glükózt tartalmazó tápfolyadékba (SC-tápfolyadék) vittük át, majd körkörös mozgást végző rázókészüléken 24 óráig 30 °C-on inkubáltuk. A tenyészethez 1 mg nisztatint adtunk, és az inkubálást további 4 órán át folytattuk. A nisztatinnal kezelt sejteket centrifügálással szétválasztottuk a tápfolyadéktól, vízzel kétszer mostuk, és 1150 mg/1 uracilt tartalmazó SCtápfolyadékba vittük át. A sejteket egy körkörös mozgást végző rázókészüléken 5 napig inkubáltuk, majd 50 mg/1 uracilt, valamint 1 g/1 fluoroorotiksavat tartalmazó SC-lemeztáptalajra oltottuk. Miután a lemezeket két hétig 30 °C-on inkubáltuk, körülbelül 400 fluoroorotiksavra rezisztens telepet kaptunk, mindegyiket megvizsgáltuk uracil auxotrófiára nézve. Öt uracildependens kiónt izoláltunk. Három klón azonban, bár csökkent mértékben, uracilmentes táptalajon is növekedett. Két egyértelműen uracildependens fenotípussal rendelkező kiónt (C. polymorpha U-2 és C. polymorpha U-5) használtunk transzformációs kísérletekben.

A C. polymorpha URA3-génjét szokásos stratégia alkalmazásával klónoztuk. Az 5. példában leírtak szerint kromoszomális DNS-t izoláltunk. A DNS-t Sau3Aenzimmel részlegesen hasítottuk, és agarózgéleken frakcionáltuk. Több frakciót összegyűjtöttünk, és azok molekulaméret-megoszlását analitikai gélelektroforézissel ellenőriztük. A klónozási kísérletek során az 5-10 kb közé eső frakciókat használtuk. A génkönyvtár előállítására felhasznált vektor a pYEpl3-vektor volt [Broach és munkatársai, Gene, 8, 121 (1979)], amely tartalmazza a S. cerevisiae LEU2-génjét, 2 pm-es replikációs origót és tartalmaz egy egyedi BamHI-restrikciós helyet. A vektort BamHI-enzimmel hasítottuk, agarózgélelektroforézissel tisztítottuk, és bakteriális eredetű alkalikus foszfatázzal defoszforiláltuk. Kis mennyiségű mintákkal végzett kísérletekben több független vektorkészítményt és ligációs feltételt vizsgáltunk (melyek során a vektornak az inszerthez való arányát és a reakciótérfogatot változtattuk), hogy a feltételeket úgy optimalizáljuk, hogy a legnagyobb számú transzformánst és a legnagyobb százalékos arányú rekombináns kiónt kapjuk (melyeket véletlenszerűen kiválasztott klónokból előállított ,/niniprep”-plazmidkészítmények restrikciós analízisével vizsgáltunk). A nagy mennyiségben végzett ligálást az optimalizált feltételek mellett végeztük, és a

HU 219 016 Β ligációs eleggyel XL1-BLUE E. coli törzset transzformáltunk. Az így kapott génkönyvtár körülbelül 15 000 elsődleges transzformánst tartalmazott, melyeknek körülbelül 90%-a tartalmazott inszertet.

A DBY746-jelzésű élesztőtörzset (MAT-α, leu2-3, 112, his3-Al, trpl-289, ura3-52) C. polymorpha génkönyvtárral transzformáltuk. Mindegyik teljes génkönyvtárral, körülbelül 20 pg plazmid-DNS felhasználásával külön-külön S. cerevisiae-t transzformáltunk, a transzformációs elegyet egy uracillal, triptofánnal és hisztidinnel kiegészített lemezre oltottuk (azaz csak a leucinszelekciót alkalmaztuk). Lemezenként 3000-10 000 élesztőtranszformánst kaptunk. Az élesztőtranszformánsokat tartalmazó lemezről ezután triptofánnal és hisztidinnel kiegészített minimáltáptalajt tartalmazó lemezre másolatot készítettünk (uracil-mínusz) lemezekre. Kontrollmásolatokat készítettünk hisztidinhisztidin (uracil-mínusz) lemezekre. Ugyancsak kontrollmásolatokat készítettünk hisztidinmentes és triptofánmentes lemezekre. Csaknem mindegyik lemezen 1-4 uracilindependens klón jelent meg. Hisztidinindependens és triptofánindependens izolátumokat is kaptunk, azonban ezek száma 2-3-szor kisebb volt, mint az URA3 izolátumoké.

Hat uracilindependens kiónból a plazmidot E. coliba mentettük, preparatív mennyiségben izoláltuk, és azzal újból DBY746-törzset transzformáltunk leucinprototrófia átvitelére. Mindegyik transzformációból 10-20 véletlenszerűen kiválasztott telepet ellenőriztünk uracildependenciára nézve. A hat átmentett plazmid közül öt átvitte a DBY746-törzsre a Leu⁺ Ura⁺ fenotípust. Az említett öt plazmid restrikciós vizsgálata igen hasonló restrikciós mintát mutatott. Ezek a minták túl összetettek voltak ahhoz, hogy a klónozott fragmens restrikciós térképét egyértelműen meg lehessen állapítani. Megállapítottuk azonban, hogy a HindlII-emésztés mindegyik kiónban egy olyan fragmenst eredményezett, amely átfedte a DNS-inszert legnagyobb részét (körülbelül 4,5 kb-t). A C. polymorpha URA3-izolátumok egyikéből, a pCP291 jelzésű izolátumból ezt a fragmenst agarózgél-elektroforézissel tisztítottuk, és HindlII-enzimmel részlegesen emésztett pJDB(AX)plazmidba szubklónoztuk. A fenti klónozási kísérlet eredményeképpen izolált pCPU(AX)-plazmid szerkezetét a 7A. ábra mutatja.

A 6. példában leírt elektroporációs feltételek alkalmazásával megkíséreltük mind a C. polymorpha U-2, mind a C. polymorpha U-5 transzformációját. Az elektroporált sejteket egy éjszakán át 1 mol/1 szorbitolt tartalmazó YEPD-tápfolyadékban történő rázást követően SC-lemeztáptalajra oltottuk. Miután a lemezeket 10 napig 30 °C-on inkubáltuk, a pCPU(AX)-plazmiddal transzformált C. polymorpha U-2 transzformánsokat tartalmazó lemezen körülbelül 100 telepet figyeltünk meg, míg a kontroli-lemezen (amely a fenti törzs hasonló módon kezelt sejtjeit tartalmazta hozzáadott DNS nélkül) csak 14 telep volt megfigyelhető. A transzformációs kísérletben a C. polymorpha U-5 esetében nem volt szignifikáns hatás kimutatható a hozzáadott DNS-t tartalmazó kontrolihoz képest. A C. polymorpha U-2 transzformánsokat tartalmazó lemezről két véletlenszerűen kiválasztott kiónt először friss SC-lemeztáptalajra oltottuk, majd erről 100 ml, 15% glükózt tartalmazó YEPD-tápfolyadékot tartalmazó tenyészetet oltottunk be. A kontrolltenyészetet C. polymorpha U-2-törzzsel oltottuk be. Miután a tenyészetet körkörös mozgást végző rázókészüléken (200 fordulat/perc) 30 °C-on 10 napig inkubáltuk, a tenyésztő tápfolyadékban HPLC-eljárással meghatároztuk a xilitoltartalmat. Az előbbi kísérlet eredményeit a 6. táblázat mutatja.

6. táblázat pCPU(AX)-plazmiddal transzformált C. polymorpha U-2-törzs xilitoltermelése

Törzs	Xilitol (mg/ml)
C. polymorpha U-2	0,0
C. polymorpha U-2:: pCPU(AX)-1	0,5
C. polymorpha U-2: :pCPU(AX)-2	0,0
C. polymorpha U-2: :pCPU(AX)-3	2,1

A különböző kiónok xilitoltermelésének szintje között jelentős variáció volt megfigyelhető. Ez lehet annak a következménye, hogy a pCPU(AX)-plazmid a C. polymorpha kromoszómájának különböző helyére épült be. A C. polymorpha U-2: :pCPU(AX)-2 valószínűleg egy revertáns és nem valódi transzformáns. A fenti kísérletek azonban világosan mutatják, hogy az arabitol-xilitol reakcióút beépíthető C. polymorpha törzsbe.

8. példa

Az oxidativ pentóz-foszfát-reakcióút enzimjeinek klónozása és azok nagy mennyiségben történő expreszsziója ozmofil élesztőben

Az oxidativ pentóz-foszfát-reakcióút első enzimjét, a D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt S. cerevisiae-ben a ZWFl-gén kódolja. Ennek a génnek a szekvenciája ismert [Nogae T. és Johnston M., Gene, 96, 161 (1990); Thomas D. és munkatársai, The EMBO J., 10, 547 (1991)]. A gént, beleértve a teljes kódolószakaszt - 600 bázispárt az 5’-végi nem kódoló régióból és 450 bázispárt az 3’-végi nem kódoló régióból - PCR-technikával az alábbi két oligonukleotid felhasználásával klónoztuk: CAGGCCGTCGACAAGGATCTCGTCTC (5’-oligonukIeotid) (3. azonosító számú szekvencia) és AATTAGT CGACCGTTAATTGGGGCCAC TGAGGC (3’-oligonukleotid) (4. azonosító számú szekvencia). Nogae T. és Johnston M. számozása szerint [Gene, 96, 161 (1990)] az 5’-oligonukleotid a 982-1007. pozícióban, a 3’-oligonukleotid a 3523-3555. pozícióban kapcsolódik a D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz-génhez. A GRF18 jelzésű S. cerevisiae törzsből a 3. példában ismertetettek szerint kromoszomális DNS-t izoláltunk. A PCR-paraméterek megegyeztek a

3. példában alkalmazottakkal. A ZWFl-gént tartalmazó amplifikált DNS-fragmenst Sall-enzimmel emésztettük, és ugyanazzal a restrikciós enzimmel emésztett pUC19plazmidba klónoztuk, így kaptuk a pUC(ZWF)-plaz17

HU 219 016 Β midot. A klónozott gén azonosságát restrikciós analízissel ellenőriztük.

A penóz-foszfát-reakcióút második enzimjét, a 6foszfoglukonsav-dehidrogenázt E. coli-ban a gnd-gén kódolja. Az előbbi gén szekvenciája ismert [Nasoff M. S. és munkatársai, Gene, 27, 253 (1984)]. Abból a célból, hogy a gnd-gént E. coli-ból klónozzuk, a HB101 jelzésű E. coli törzsből a Klebsiella terrigena-GUS izolálásánál alkalmazott módszerrel azonos módon (lásd az 1. példát) kromoszomális DNS-t izoláltunk. A gnd-gén amplifikálásánál felhasznált oligonukleotidokat, a [GCGAAGCTTAAAAATGTCCAAGCAACAGA TCGGCG (5. azonosító számú szekvencia) és a GCG AAGCTTAGATTAATCCAGCCATTCGGTATGG (6. azonosító számú szekvencia)] oligonukleotidokat úgy terveztük, hogy csak a kódolórégiót amplifikálják, és az iniciációs kodontól közvetlenül 5’-irányban (upstream), valamint a terminátorkodontól közvetlenül 3’ irányban (downstream) HindlII-hasítási helyeket iktassunk be. Nasoff M. S. és munkatársai számozása szerint [Gene, 27, 253 (1984)] az 5’-oligonukleotid az 56-78. pozícióban, a 3’-oligonukleotid az 1442-1468. pozícióban kapcsolódik a 6-foszfoglükonsav-dehidrogenázgénhez. Az amplifikált DNS-ffagmenst HindlII-enzimmel emésztettük, és HindlII-enzimmel emésztett, pUC19-vektorral ligáltuk. Tíz független, látszólag azonos pUC(gnd)plazmidot tartalmazó kiónt összegyűjtöttünk. Ezt azért csináltuk, hogy elkerüljük a PCR-amplifikáció során esetleg keletkező szekvenciahibákkal kapcsolatos problémákat. A gnd-gén kódolórégióját a 5. cerevisiae ADCI-promoterével és transzkripciósterminátor-szekvenciájával fúzionáltattuk oly módon, hogy a pUC(gnd)-plazmidgyűjteményből az 1,4 kb nagyságú HindlII-fragmenst a pAAH5-expressziós vektorba [Ammerer, Meth. Enzymol., 101, 192 (1983)] vittük át. Az így kapott pAAH(gnd) jelzésű plazmid több független kiónját lítium-kloridos eljárással [Ito és munkatársai, J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] a GRF 18 jelzésű 5. cerevisiae törzsbe transzformáltuk és a transzformánsokban meghatároztuk a 6-foszfo-D-glukonát-dehidrogenáz-aktivitást. A 6-foszfo-D-glukonát-dehidrogenáz-aktivitás a nem transzformált gazdasejthez képest mindegyik transzformánsban többszörösére emelkedett, ami azt jelenti, hogy a 6-foszfo-D-glukonát-dehidrogenáz hatékonyan expresszálható élesztőben. Az élesztőben a legmagasabb aktivitással rendelkező pAAH(gnd)klónt választottuk további konstrukciók előállítására. A ZWF1- és a gnd-gén klónozásának menetét, valamint a pAAH(gnd)-plazmid előállítását a 8., valamint a 8A. ábra mutatja.

Abból a célból, hogy egy ozmofil élesztőgazdasejtben mind a glükóz-6 foszfát-dehidrogenáz-, mind a 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz-gént egy időben nagy mennyiségben expresszáljuk, előállítottuk a pSRT(ZG)-plazmidot. Ennek a plazmidnak az előállítási menetét a 9. ábra mutatja. Röviden, a pAAH(gnd)plazmidból a 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz-expressziós kazettát egy 3,1 kb nagyságú BamHI-DNS-fragmensként BamHI-enzimmel hasított pUC19-plazmidba vittük át. Az így kapott pUC(ADHgnd)-plazmidot SacI-, valamint Xbal-enzimmel hasítottuk, és agarózgél-elektroforézissel egy 3,1 kb nagyságú DNS-fragmenst tisztítottunk. Ezt a fragmenst egyszerre két másik DNSfragmenssel ligáltuk: a pUC(ZWF)-plazmidból nyert

2,5 kb nagyságú fragmenssel, melyet Sacl-enzimmel végzett emésztéssel és Pstl-enzimmel végzett részleges emésztéssel kaptunk, valamint a PstI-, és Xbal-enzimekkel emésztett pSRT(AX)-9-plazmid (3. példa) vektorfragmensével. Az így kapott pSRT(ZG)-plazmid szerkezetét restrikciós analízissel igazoltuk. Miután a pSRT(ZG)-plazmiddal az ATCC 13356 nyilvántartási számú Z. rouxii törzset (a 4. példában ismertetett módszerrel) transzformáltuk, a transzformált törzsben meghatároztuk a D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz-, valamint a 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz-aktivitást. Mindkét enzim körülbelül hússzor nagyobb aktivitást mutatott a transzformált törzsben, mint a nem transzformáit kontroliban (7. táblázat). Hasonló módszerekkel érhetjük el a két pentóz-foszfát-reakcióút oxidatív részéhez tartozó enzimet kódoló génnek más élesztőfajokban nagy mennyiségben történő expresszióját is. Mivel azonban a Saccharomyces-en és a ZygoSaccfiaromyces-en kívül a legtöbb élesztőfajban nem ismert olyan vektor, amely extrakromoszomális plazmádként képes fennmaradni, az ilyen gazdasejtek esetében a beépüléssel járó transzformáció az egyetlen alkalmazható eljárás. A találmány szerint előnyös típusú integrálódó vektorok azok, amelyek célzottan a riboszomális-DNS-lokuszba épülnek be, mivel az ilyen típusú vektorok nagyszámú beépülést lehetőséggel rendelkeznek, tehát magasabb expressziós szintet tesznek lehetővé [Lopes T. S. és munkatársai, Gene, 79,199 (1989)].

7. táblázat

D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz- és 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz-aktivitás a pSRT(ZG)-plazmiddal transzformált ATCC

13356 nyilvántartási számú Z. rouxii törzsben és a transzformálatlan kontrolitörzsben (pmol/perc χ mg protein)

Élesztőtörzs	D-glükóz-6-Ρ- dehidrogenáz	6-P-D-glükonát- dehidrogenáz
Z. rouxii (transzformálatlan)	0,33	0,45
Z. rouxii [pSRT(ZG)]	7,3	7,7

9. példa

Transzketolázmutánsok előállítása élesztőben A transzketolázmutánsokat élesztőben legkönnyebben a génfolytonosság helyspecifikus megszakításával állíthatjuk elő, bár szokásos kémiai mutagenezises eljárások is alkalmazhatók. A génmegszakításos eljárás alkalmazásához rendszerint abból az élesztőfajból klónozott homológ transzketolázgénre van szükségünk, melyben a mutációt létre kívánjuk hozni, bár néha igen közeli rokonságot mutató fajból származó heterológ gén is felhasználható. A S. cerevisiae-ből származó transzketolázgén szekvenciája ismert (Fletcher T. S. és Kwee I. L., EMBL DNS-szekvenciabank, azonosító

HU 219 016 Β jel: SCTRANSK, nyilvántartási szám: M63302). A fenti szekvencia felhasználásával a S. cerevisiae transzketolázgénjét PCR-eljárással klónoztuk. A transzketolázgént tartalmazó DNS-fragmens amplifikálására az AGCTCTAGAAATGACTCAA TTCACTGAC ATTGATAAGCTAGCCG (7. azonosító számú szekvencia) és a GGAGAATTCAGCTTGTC ACCCTTA TAGAATG CAATGGTCTTTTG (8. azonosító számú szekvencia) oligonukleotidokat, valamint a S. cerevisiae (fent ismertetettek szerint izolált) kromoszomális DNS-ét használtuk. Fletcher T. S. és Kwee I. L. számozása szerint (EMBL DNS-szekvencia-gyűjtemény, azonosítójel: SCTRANSK, nyilvántartási szám: M63302) az 5’-oligonukleotid a 269-304. pozícióban, a 3’-oligonukleotid a 2271-2305. pozícióban kapcsolódik a transzketolázgénhez. A fragmenst Xbal- és EcoRIenzimmel emésztettük, és a fenti restrikciós enzimekkel hasított pUC19-plazmidba klónoztuk. Az így kapott pUC(TKT)-plazmid restrikciós analízise megerősítette a klónozott DNS-fragmens azonosságát. Ezt a plazmidot BglI- és Clal-enzimekkel hasítottuk, és a nagyobb DNS-fragmenst agarózelektroforézissel tisztítottuk. A fenti fragmenst a pUT332-plazmidból [Gatignol A. és munkatársai, Gene, 91, 35 (1990)] izolált két fragmenssel ligáltuk: az URA3-gént és belomycinrezisztencia-gén 3’-részét tartalmazó Clal-Pstl-ftagmenssel, valamint az élesztő TEF1 (lásd transzkripciós elongációs faktor) promoterét és a bleomycinrezisztencia-gén kódolószekvenciájának 5’ részét tartalmazó BamHIPstl-fragmenssel. Miután a fenti ligációs eleggyel E. coli-t transzformáltunk és a plazmidklónokat restrikciós analízissel vizsgáltuk, a pTKT(BLUIZA)-plazmidot izoláltuk. Ez a plazmid tartalmazza a S. cerevisiae transzketolázgénjét, amelybe a Clal-BglI-hasítási helyek közé eső 90 bázispár hosszúságú fragmenst a pUT332plazmid egy olyan fragmensével helyettesítettük, amely a 5. cerevisiae-ben szelekciót lehetővé tevő két markert tartalmaz, nevezetesen a TEFl-promoter és a CYC1transzkripciós terminátor szabályozása alatt álló URA3-gént, valamint a bleomycinrezisztencia-gént. A plazmidot lítium-kloridos eljárás alkalmazásával [Ito és munkatársai, J. Bacteriol., 753, 163 (1983)] a DBY746 jelzésű 5. cerevisiae törzsbe (ATCC 44773 nyilvántartási szám; MAT-α his3Al leu2-3, 112 ura3-52 trpl-289) transzformáltuk phleomycinrezisztencia megjelenésére (YEPD-tápfolyadékban 10 pg/ml phleomycin alkalmazásával). A transzformánsokban vizsgáltuk az uracil-prototrófiát és a D-xilulózon történő szaporodási képességet. Öt URA3-klónt, melyek közül három D-xilulózon csökkent mértékű növekedést mutatott, 100-100 ml tenyészetben szaporítottunk, ezekből üveggyöngyökkel történő rázással sejtextraktumot készítettünk, és a nyerskivonatokban meghatároztuk a transzketolázaktivitást. A vizsgálatot 3 mmol/1 magnézium-kloridot, 0,1 mmol/1 tiamin-pirofoszfátot, 0,25 mmol/1 NADH-t és 0,2 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó 0,1 mol/1 koncentrációjú glicilglicin pufferben (pH 7,6) végeztük. Közvetlenül a mérést megelőzően a fenti puffer 1 ml-éhez 3 pl olyan oldatot adtunk, mely 0,5 mol/1 D-xilulóz-5-foszfátot és

0,5 mol/1 ribóz-5-foszfátot tartalmazott, majd ehhez

7,5 egység trióz-foszfát-izomerázt és 1,5 egység a-glicerofoszfát-dehidrogenázt (mindkettő a Sigmától származott) adtunk. A reakciót a nyerskivonat megfelelő térfogatának hozzáadásával indítottuk meg, majd 340 nmen követtük az optikai denzitás csökkenését. Kontrollként a DBY746-törzs sejtkivonatát használtuk. A DBY746-törzs és a D-xilulózon gátlást nem mutatóan szaporodó transzformánsok nyers sejtkivonatában a transzketolázaktivitás könnyen mérhető volt; a mért érték: körülbelül 0,25 egység/mg protein. A D-xilulózon csökkent szaporodást mutató három transzformáns transzketolázaktivitása az általunk alkalmazott módszer mérési küszöbe alatt volt (legalább 20-szor kisebb volt, mint a vad típusú törzsé). A sejtkivonat előállítása során létrejövő esetleges enziminaktiváció kontrolljaként meghatároztuk a D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz- és a 6foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz-aktivitásokat is. A fenti két enzim aktivitása mind a hat törzsben igen hasonló volt. Megállapítottuk tehát, hogy a D-xilulózon csökkent növekedést mutató három klónmutációt hordoz a transzketolázgénben. A megszakított folytonosságú transzketolázgént tartalmazó törzsek növekedése a fenilalanin és tirozin aromás aminosavaktól mentes táptalajon is némileg csökkent volt, bár ez a hatás kisebb volt, mint a fenti mutációnak a D-xilulóz hasznosításra kifejtett hatása.

Más élesztőfajokból származó transzketolázgének könnyen klónozhatok a fent említett S. cerevisiae törzsek transzketolázgénjében található mutáció komplementációja alapján. Előnyösen úgy végezhetjük a klónozást, hogy egy megfelelő vektorban (például a jól ismert YEpl3-plazmidban) a nem Saccharomyces élesztőtörzsből génkönyvtárat készítünk, ezzel a génkönyvtárral mutáns transzketolázt tartalmazó 5. cerevisiae törzset (például a fent leírt génfolytonosság megszakítással nyert mutánsokat) transzformálunk, és olyan transzformánsokat szelektálunk, melyek D-xilulózon való növekedési képessége helyreállt. Az ilyen D-xilulóz-pozitív transzformánsokból a plazmid-DNS-t kimenthető és azzal ugyanaz a recipiens törzs transzformálható. Az előbbi transzformációból származó összes kiónnak jó növekedési képességet kell rendelkeznie D-xilulózon. A transzformánsokban meghatározható a transzketolázaktivitás és annak szignifikáns szinten való újbóli megjelenése a klónozott gén azonosságának bizonyítékául szolgálhat. További és végső bizonyítékot a klónozott DNS rövid szakaszainak szekvenálásával és a 5. cerevisiae transzketolázgén szekvenciájával homológ szekvenciadarabok kimutatásával szerezhetünk, vagy annak kimutatásával, hogy a klónozott DNS-fragmens hibridizál az autentikus S. cerevisiae transzketolázklónnal. Másképp a klónozási eljárás alapulhat DNS-hibridizáción mint elsődleges eljáráson, mely eljárás alkalmazásával egy nem Saccharomyces élesztőből előállított génkönyvtárból a transzketolázgént tartalmazó kiónokat kiszelektálhatjuk. A S. cerevisiae transzketolázgén egy fragmensét telep- vagy plakkhibridizációs kísérletben próbaként használhatjuk, a legerősebb hibridizációs jelet adó kiónokat részleges szekvenálással tovább vizsgálhatjuk.

HU 219 016 Β

Bármely módszert alkalmazzuk a transzketolázgénnek a választott élesztőfajból történő klónozására, az említett élesztőben található transzketolázgén mutációjának létrehozására az elkövetkezőkben ugyanazokat a lépéseket alkalmazzuk. A klónozott DNS-fragmenst részleges restrikciós térkép készítésével és előnyösen a transzketolázgén kódolórégiójának lokalizálásával jellemezzük. Ezután a transzketolázgént tartalmazó DNSfragmensbe, az említett fragmens bármelyik végétől legalább néhány száz bázispár távolságra, a kiválasztott élesztőben szelekciót lehetővé tevő markert tartalmazó DNS-darabot inszertálunk. Sok élesztőfaj esetében például domináns szelekciós markerként egy élesztőből származó erős promoter szabályozása alatt álló, bakteriális eredetű phleomycingént tartalmazó kazetta, például a pUT332-plazmidból származó fent ismertetett kazetta használható. Lényeges, hogy a szelekciós markért hordozó DNS-fragmenst oly módon inszertáljuk, hogy az inszertált DNS-sel a transzketolázgén kódolórégióját megszakítsuk vagy előnyösen az inszertált DNS-fragmenssel a kódolórégió (egy részét) helyettesítsük. Az ilyen DNS-konstrukciókat ezután a fentiekben ismertetettek szerint a 5. cerevisiae-ben található transzketolázmutáció létrehozásánál alkalmazott módszerhez hasonló módon a kiválasztott élesztőben a transzketolázgén kromoszomális példányának megszakítására használhatjuk. Bármely alkalmas transzformációs eljárást alkalmazhatunk, a találmány szerinti előnyös módszerek a protoplaszttranszformáció és az elektroporáció. A megszakított transzketolázgént tartalmazó kiónokat a S. cerevisiae esetében ismertetett módszerhez hasonló módon szelektálhatjuk. Alternatív módszerként vagy más módszerek kiegészítéseként a transzketolázgén kromoszomális régiójának szerkezetét Southem-hibridizációval vizsgálhatjuk.

10. példa

A D-ribulokináz-gén klónozása

A D-ribulokináz-gén klónozásának előnyös módja hasonló az 1. példában, a D-arabitol-dehidrogenáz klónozásánál leírthoz. Ismert, hogy a D-ribulokináz-gén több baktériumban, így E. coli-ban vagy Klebsiella aerogenes-ben a ribitol hasznosításért felelős operonrésze [Loviny T. és munkatársai, Biochem. J., 230, 579 (1985)]. Szintén ismeretes, hogy az E. co/z'-B-törzsekben ez az operon nem található meg, és ezért nem képesek ribitolt szénforrásként felhasználni. Tehát egy E. coli-Btörzset (mint például a szokásosan használt E. coli HB101- és JM103-törzset, valamint a Stratagene cégtől származó, nagy hatásfokkal transzformálható SCS1törzset vagy az XLl-Blue-törzset) egy ribitol felhasználásra képes baktériumból származó valamely alkalmas vektorban, előnyösen pUC191-vektorban előállított génkönyvtárral transzformálhatunk. A D-ribulokináz-gént előnyösen egy nem kórokozó baktériumfajból, például Klebsiella terrigena fajból izoláljuk. Kiszelektáljuk azokat az E. coli transzformánsokat, amelyek képesek egyedüli szénforrásként ribitolt tartalmazó minimáltáptalajon szaporodni. Az ilyen ribitolpozitív kiónokból plazmidDNS-t izolálunk, és azzal újból egy E. co/z'-B-törzset transzformálunk. Az ilyen ismételt transzformációból származó összes transzformánsnak képesnek kell lennie egyedüli szénfonásként ribitolt tartalmazó táptalajon történő szaporodásra. Ezután elkészíthetjük a klónozott inszert restrikciós térképét. Ennek a térképnek az alapján az eredeti kiónból különböző deléciós származékokat állíthatunk elő, és azokban a fent említett funkcionális teszttel vizsgálhatjuk a ribitoloperonmegtartottságát. Több egymást követő delécióval a ribitoloperont tartalmazó DNS-fragmens méretét 3,5-4 kb nagyságúra (a K. aerogenes-ben található operonnak megfelelő méretre) minimalizálhatjuk. Végül elvégezhetjük a D-ribulokináz-gén (részleges) nukleotidszekvenciájának meghatározását, és ennek alapján vagy a természetben előforduló alkalmas restrikciós hasítási helyek, vagy ismert PCRtechnikák segítségével létrehozott ilyen hasítási helyek felhasználásával kivághatjuk a gén kódolószekvenciáját. A D-ribulokináz-gént expresszálhatjuk más gazdasejtekben, előnyösen élesztőkben, mely eljárásnál az alábbi szokásos lépéseket alkalmazzuk: a D-ribulokináz gén kódolórégióját egy megfelelő promoterszekvenciával, valamint transzkripciós terminátorszekvenciával kapcsoljuk össze, az expressziós kazettát a választott gazdasejt transzformációjára alkalmas vektorba visszük át, transzformánsokat nyerünk, végül igazoljuk a D-ribulokináz expressziójának hatékonyságát.

11. példa

A D-ribulóz-5-foszfát-3-epimeráz-gén klónozása és nagy mennyiségben történő expresszálása

A homogén D-ribulóz-5-foszfát-3-epimeráz-enzimnek sütőélesztőből (ipari Saccharomyces cerevisiae élesztőből) történő izolálására szolgáló eljárás ismeretes [Williamson W. T. és munkatársai, Meth. Enzymol., 9, 605 (1966)]. Az enzimet izolálhatjuk és általánosan ismert eljárásokkal annak N-terminális, valamint részleges belső aminosavszekvenciáját meghatározhatjuk. Az így kapott részleges aminosavszekvencia alapján a reverz transzlációként ismert módszerrel előállíthatjuk a későbbiekben a polimeráz-láncreakció megindítására felhasználható oligonukleotidszekvenciákat. A PCR-eljárással előállított DNS-fragmenseket hibridizációs próbaként felhasználva egy élesztőgénkönyvtárban kiválaszthatjuk a D-ribulóz-5-foszfát-3epimeráz-gén teljes hosszúságú kópiáját tartalmazó kiónokat. A D-ribulóz-5-foszfát-3-epimeráz-gént egyéb élesztőgazdasejtben előnyös módon úgy expresszálhatjuk nagy mennyiségben, hogy azt egy olyan vektorba klónozzuk, amely a kívánt gazdasejtben nagy kópiaszámmal rendelkezik (Z. rouxii esetén például pSRT303D-vektorba). A gén nagy mennyiségben történő expresszálásának ettől eltérő és sokkal hatékonyabb módja szerint a transzlációs startkodon körül legalább részlegesen meghatározzuk a D-ribulóz-5foszfát-3-epimeráz-gén nukleotidszekvenciáját, ennek az információnak a felhasználásával izoláljuk a Dribulóz-5-foszfát-3-epimeráz-gén kódolószekvenciáját, majd ezt a választott gazdasejtben ismeretesen hatékonyan működő promoterszekvenciával kapcsoljuk össze.

HU 219 016 Β

12. példa

A D-xilulokináz-gén klónozása és D-xilulokináz-mutánsok előállítása

A D-xilulokináz (EC 2.7.1.17) gén különböző élesztőfajokból történő előállítására szolgáló eljárások ismeretesek [Ho N. W. Y. és munkatársai, Enzyme Microbiol. Technoi., 11,417 (1989); Stevis P. E. és munkatársai, Applied Enviromental Microbiol., 53,2975 (1987)]. Leírtak S. cerevisiae-ben a génfolytonosság megszakításával létrehozott D-xilulokináz-mutációkat is [Stevis P. E. és munkatársai, Appl. Biochem. Biotechnoi., 20, 327 (1989)]. Hasonló eljárások alkalmazásával más élesztőfajokban is előállíthatunk D-xilulokináz-mutánsokat. S. cerevisiae-én kívül egyéb élesztőfajok esetében a D-xilulokináz-gén folytonosságának megszakítására felhasznált genetikai markerek előnyösen domináns antibiotikumrezisztencia-markerek (lásd a 9. példát). Más eljárás szerint alkalmazhatunk mutánsok előállítására szolgáló klasszikus módszereket, melyek alapulhatnak kémiai mutagenezisen (például etil-metán-szulfonáttal vagy akriflavinnal történő kezelésen) vagy fizikai mutagenezisen (például ultraibolya sugarakkal vagy röntgenbesugárzással történő kezelésen). A mutánsok feldúsulását oly módon érhetjük el, hogy a mutagenizált sejteket egyedüli szénforrásként D-xilulózt tartalmazó táptalajon és olyan antibiotikum jelenlétében (például nisztatin jelenlétében) tenyésztjük, amely csak a szaporodó sejteket öli el. A mutánsok szelektálására a D-xilulokinázmutánsoknak azt a tulajdonságát használhatjuk fel, hogy szaporodásukhoz nem képesek egyedüli szénforrásként D-xilulózt hasznosítani.

13. példa

Xilitolt D-arabitolon keresztül, javított hatásfokkal előállító törzsek

A 4. példában leírtunk egy szerkezetileg hasonlóságot nem mutató szénforrásokból, mint például D-glükózból xilitol előállítására képes élesztőtörzs előállítására szolgáló olyan eljárást, amelyben kulcsfontosságú köztitermékként D-arabitol szerepel. Hogy ezeknek a „D-arabitol-reakcióutat” felhasználó törzseknek a fermentációja során a xilitol keletkezésének hatásfokát javítsuk, a D-arabitol előállításának hatásfokát kell javítanunk. A D-arabitol-termelő élesztőkben a D-glükózból D-arabitol keletkezéséhez vezető reakcióutat leírták [Ingram J. M. és munkatársai, J. Bacteriol., 89, 1186 (1965)]. A D-arabitol defoszforiláláson és NADPH-al kapcsolt ribulóz-reduktáz által katalizált redukción keresztül D-ribulóz-5-foszfátból keletkezik. A D-ribulóz5-foszfát keletkezése D-glükóz-6-foszfátból két egymást követő irreverzíbilis dehidrogénezéssel járó lépés eredménye, melyet a D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz- és a 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz-enzimek katalizálnak, és amely a pentóz-foszfát-reakcióút (vagy hexóz-monofoszfát-sönt) oxidatív ágaként ismert univerzálisan végbemenő reakcióút. A pentóz-foszfát-reakcióút nem oxidatív ágában a D-ribulóz-5-foszfát reverzibilis módon ribóz-5-foszfáttá és D-xiluIóz-5-foszfáttá izomerizálódik. A ribóz-5-foszfátot és a D-xilulóz-5foszfátot transzketoláz alakítja tovább. Tehát ha egy Darabitol-termelő mikrooganizmus-törzsben transzketolázmutációt hozunk létre, a D-ribulóz-5-foszfátból D-arabitollá alakuló frakció aránya növekedni fog. A transzketolázmutánsok előállítására szolgáló eljárást a 9. példában ismertetjük. A D-arabitol-termelés hatásfoka tovább növelhető, ha a fentiekben ismertetettek szerint a D-ribulóz-5-foszfát bioszintézisarányát a pentóz-foszfát-reakcióút oxidatív ágához tartozó enzimeket kódoló két gén nagy mennyiségben történő expreszszálásával maximalizáljuk (lásd a 8. példát). Az ily módon D-arabitol-termelés hatásfoka szempontjából optimalizált törzseket xilitol-dehidrogenáz- és D-arabitol-dehidrogenáz-géneket hordozó rekombináns DNS-konstrukciókkal (lásd a 3. és 4. példát) továbbtranszformálhatjuk, ily módon olyan törzseket kapunk, melyekben a xilitoltermelés hatásfoka jobb.

14. példa

Xilitolt alternatív reakcióutak alkalmazásával előállító törzsek

A 4. és 13. példa szerinti eljárások a legnyilvánvalóbb eljárások D-glükózból és egyéb szénforrásokból xilitol előállítására képes mikroorganizmus-törzsek előállítására. Ezek az eljárások a természetben található különböző szénforrásokból D-arabitol keletkezéséhez vezető reakcióutat hasznosítják, és a D-arabitolnak xilitollá történő átalakítása céljából ezt a reakcióutat terjesztik ki egy vagy több reakcióval. Ez a reakcióút azonban nem az egyetlen lehetséges reakcióút. Előállíthatok olyan reakcióutak is, melyek anyagcsere-végtermékként xilitol keletkezéséhez vezetnek, és amelyben D-arabitol nem szerepel köztitermékként. Tehát ugyanabból a prekurzorból, nevezetesen D-ribulóz-5-foszfátból xilitol keletkezéséhez vezető reakcióút az előbbitől eltérő reakciók láncán keresztül is megvalósítható. A D-ribulóz-5-foszfátot a D-ribulóz-5-foszfát-3-epimeráz hatékonyan alakítja D-xilulóz-5-foszfáttá (lásd 11. példa), és ha a D-xilulóz-5-foszfát további átalakulását a transzketolázgén mutációjával megakadályozzuk, a felhalmozódó D-xilulóz5-foszfátot ugyanaz a nem specifikus foszfatáz defoszforilálja, mint a D-ribulóz-5-foszfátot [Ingram J. M. és munkatársai, J. Bacteriol., 89, 1186 (1965)], majd a xilitol-dehidrogenáz xilitollá redukálja (lásd a 3. példát). Ennek az reakcióútnak a megvalósításához szükség lehet a D-xilulokináz-gén inaktiválására (12. példa), hogy a haszontalan D-xiluIóz-5-foszfát-»D-xilulóz—>D-xilulóz-5foszfát hurok által okozott energiaveszteséget minimalizáljuk. Egy további genetikai módosítással, a D-ribulokináz (EC 2.7.1.47) génjének bejuttatásával és annak (nagy mennyiségben való) expresszálásával az ilyen törzsekben az egyidejű D-arabitol-termelést minimalizálhatjuk azáltal, hogy így a nem specifikus foszfatáz által termelt D-ribulóznak mintegy „csapdát állítunk”. A D-ribulóz így visszaalakul D-ribulóz-5-foszfáttá, majd továbbalakul D-xilulóz-5-foszfáttá.

15. példa

A rekombináns Z. rouxii törzs stabilitásának vizsgálata és xilitol előállítása fermentoros tenyésztési feltételek mellett

HU 219 016 Β

A xilitoltermelés stabilitását elnyújtott tenyésztés során mind szelektív feltételek mellett (szelektív tápfolyadék alkalmazásával: 50 mg/1 G418-at és 30% glükózt tartalmazó YEPD-tápfolyadékban), mind nem szelektív feltételek mellett (az előbbivel megegyező összetételű, de G418-at nem tartalmazó tápfolyadékban) vizsgáltuk. Egyetlen újonnan kapott Z. rouxii (nyilvántartási szám: ATCC 13356) transzformánst [pSRT(AX)-9] 200 ml térfogatú, G418-at tartalmazó YEPD-tápfolyadékban tenyésztettünk. A sejteket 50%-os glicerinoldatba vittük át, és 1 ml térfogatú mintákban -70 °C-on lefagyasztottuk. Négy lefagyasztott Z. rouxii [pSRT(AX)-9] mintát használtunk két szelektív és két nem szelektív, egyenként 50 ml térfogatú tenyészet beoltására. Miután (50-60 óra 30 °C-on, 200 fordulat/perc értéken) a tenyészetek elérték a stacionertenyésztési fázist, mintát vettünk, hogy HPLCvizsgálattal a pentitoltartalmat meghatározhassuk, majd 1 ml tenyészettel másik 50 ml térfogatú, az előbbivel megegyező összetételű (szelektív vagy nem szelektív) tápfolyadékot oltottunk be. A tenyésztés-hígítás ciklust még négyszer ismételtük. A fenti kísérletnél alkalmazott feltételek körülbelül megfelelnek a rekombináns törzsnek egy standard lefagyasztott inokulumból kiinduló, nagy mennyiségben végrehajtott fermentációja során létrejövő feltételeknek. A fenti kísérlet eredményeit a 8. táblázatban foglaltuk össze. A rekombináns törzs stabilitása előreláthatóan szelektív tápfolyadékban nagyobb. A xilitoltermelés csökkenése azonban, még nem szelektív tápfolyadékban is csak körülbelül 20 generációt követően volt kimutatható. Szelektív feltételek mellett a xilitoltermelés körülbelül 30 generáción keresztül stabilnak bizonyult.

A transzformált Z. rouxii törzs lefagyasztott törzstenyészetének egy mintájával egy 2 literes fermentorban 1 1 térfogatú (literenként), az alábbi összetételű tápfolyadékot oltottunk be: 0,1 g NaCl, 6,8 g kálium-foszfát, 0,5 g ammónium-szulfát, 20 g élesztőkivonat, 400 g glükóz és 50 mg/ml G418, (pH 6,0). Az alábbi tenyésztési feltételeket alkalmaztuk: levegőztetés: 0,5 térfogat/perc; rázatás: 400 fordulat/perc; hőmérséklet: 30 °C.

A 10. ábra a fenti fermentáció során a glükózfelhasználás és a xilitolfelhalmozódás mértékének időbeli lefolyását ábrázolja. Ugyancsak ábrázoltuk az oldottoxigén-koncentrációt, amely az élesztőtenyészet respiratorikus aktivitását tükrözi. Egy nyilvánvalóan kétfázisú szaporodási görbét észleltünk: az első fázisban, körülbelül negyven óra elteltével a glükóz- és xilitolkoncentráció egy platót ért el (eddig a pontig a rendelkezésre álló glükóznak kevesebb mint a fele használódott fel), a második fázist körülbelül 200 órás tenyésztést követően észleltük, amikor a glükózfelhasználás, valamint a xilitoltermelés újból folytatódott. A végső xilitolkoncentráció 15 g/1 volt, csaknem kétszer több, mint a palackos fermentációval kapott koncentráció. A hosszú „lag-periódussal” rendelkező kétfázisú görbe ana utal, hogy egy spontán mutáns szelektálódott, (amely a szülői törzsnél valószínűleg nagyobb alkoholtoleranciával bírt). Ennek a feltevésnek az ellenőrzésére a fermentáció végpontján a tenyészetből egyetlen kiónt izoláltunk. Ezt az izolátumot a fent leírtakkal azonos feltételekkel mellett fermentorban tenyésztettük. Ennek a kísérletnek az eredményei (11, ábra) megerősítették azt a feltevést, hogy valóban egy olyan mutánst izoláltunk, amely körülbelül 60 óra alatt 400 g/1 glükóz teljes asszimilációjára képes. A fenti kísérlet alapján az is megállapítható, hogy a xilitoltermelő Z. rouxii törzs, amikor a tenyésztőfolyadékban az összes glükóz felhasználódott, xilitol asszimilációjára is képes.

8. táblázat

A xilitoltermelés stabilitása az ATCC 13356 nyilvántartási számú Z. rouxii [pSRT(AX)-9]-törzsben sorozatos tenyésztések során (g/1, összpentitol-termelődésre normalizált érték)

	Tenyésztési feltételek
A hígítást	A tenyészet	Szelektív	Nem
sorozat száma	sorszáma		szelektív
1.	1.	8,3	8,6
2.	8,9	8,6
2.	1.	8,9	8,9
2.	8,5	8,4
3.	1.	8,5	8,3
2.	8,6	8,2
4.	1.	8,7	8,0
2.	8,6	6,9
	1.	8,6	7,6
	2.	8,1	5,6
6.	1.	7,0	7,0
2.	6,9	2,4

Az idézett szakirodalmi hivatkozásokat teljes egészükben a kitanítás részeként kell tekinteni.

Miután a találmány szerinti megoldást teljes egészében ismertettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány tárgyköre kiterjed egyenértékű koncentrációértékek, egyéb paraméterek és hasonlók széles skálájára, anélkül hogy a találmány szellemétől, tárgykörétől vagy annak bármely megvalósítási módjától eltérnénk.

A SZEKVENCIÁK FELSOROLÁSA AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZ: 28 bázispár

TÍPUS: nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú

TOPOLÓGIA: mindkettő

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 1. AZONOSÍTÓ

SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CGAATTCTAG ACCACCCTAA GTCGTCCC 28

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZ: 29bázispár TÍPUS: nukleinsav

HU 219 016 Β

HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú TOPOLÓGIA: mindkettő

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA

TTCAAGAATT CAAGAAACTC ACGTGATGC 29

A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZ: 26 bázispát TÍPUS: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú TOPOLÓGIA: mindkettő

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAGGCCGTCG ACAAGGATCT CGTCTC 26

A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZ: 33 bázispár TÍPUS: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú

TOPOLÓGIA: mindkettő

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AATTAGTCGA CCGTTAATTG

AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZÚSÁG: 35 bázispár

TÍPUS: nukleinsav 20

GCGAAGCTTA AAAATGTCCA 35

A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 25 A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZ: 34bázispár TÍPUS: nukleinsav

GCGAAGCTTA GATTAATCCA

A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZ: 44 bázispár 35

TÍPUS: nukleinsav

GGGCCACTGA GGC

HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú TOPOLÓGIA: mindkettő

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGCAACAGAT CGGCG

HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú TOPOLÓGIA: mindkettő

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GCCATTCGGT ATGG

HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú TOPOLÓGIA: mindkettő

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGCTCTAGAA ATGACTCAAT TCACTGACAT TGATAAGCTA GCCG

A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZ: 44 bázispár TÍPUS: nukleinsav

HÁNY SZALU: kettős szálú TOPOLÓGIA: mindkettő

A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 8. AZONOSÍTÓ 45 SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGAGAATTCA GCTTGTCACC TTTG

CTTATAGAAT GCAATGGTCT

Claims (34)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás xilitol előállítására rekombináns gazdasejtben, azzal jellemezve, hogy (a) egy mikrobiális gazdasejtben új metabolikus reakcióutat hozunk létre úgy, hogy a gazdasejtbe Dxilulózt eredményező D-arabitol-dehidrogenáz (EC 1.1.1.11), D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.49), 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenáz (EC

   1.1.1.44), D-ribulóz-5-foszfát-3-epimeráz (EC 5.1.3.1), D-ribulokináz (EC 2.7.1.47) és/vagy xilitol-dehidrogenáz (EC 1.1.1.9) aktivitású proteint kódoló gént jutta55 tünk, és/vagy a gazdasejtben a transzketoláz és/vagy Dxilulokináz (EC 2.7.1.17) aktivitásért felelős natív gént inaktiváljuk;

   (b) az (a) lépés szerinti rekombináns gazdasejtet Dxilóztól, D-xilulóztól, D-xilóz és D-xilulóz elegyétől

   60 és D-xilózt vagy D-xilulózt tartalmazó polimerektől

   HU 219 016 Β vagy oligomerektől mint fő szénforrásoktól mentes tápközegben - az említett reakcióút felhasználásával xilitolszintézisre alkalmas feltételek mellett tenyésztjük; és (c) a (b) lépés szerint előállított xilitolt kinyerjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az új metabolikus reakciómat D-arabitol-dehidrogenáz (ECl.1.1.11) aktivitású proteint kódoló gén bejuttatásával hozzuk létre.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat egy arabitolt termelő mikrobiális gazdasejt D-arabitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.11) kódoló DNS-sel végzett transzformálása útján hozzuk létre.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat a 3. igénypont szerint transzformált mikrobiális gazdasejt xilitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.9) kódoló DNS-sel végzett továbbtranszformálásával hozzuk létre.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat gazdasejtként arabitolt termelő élesztősejt vagy arabitolt termelő gombasejt transzformálásával hozzuk létre.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat gazdasejtként D-xilulokinázt (EC 2.7.1.17) nem expresszáló sejt transzformálásával hozzuk létre.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat gazdasejtként transzketolázt (EC 2.2.1.1) nem expresszáló sejt transzformálásával hozzuk létre.
8. 8. A 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat a gazdasejt xilitoldehidrogenázt kódoló DNS-sel, D-glükóz-6-foszfátdehidrogenázt (EC 1.1.1.49) kódoló DNS-sel, 6-foszfoD-glükonát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.44) kódoló DNSsel és/vagy D-ribulóz-5-foszfát-3-epimerázt (EC

   5.1.3.1) kódoló DNS-sel végrehajtott további transzformálásával hozzuk létre.
9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat gazdasejtként Z. rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa vagy Torulaspora hansenii élesztőben, vagy Dendryphiella salina vagy Schizophyllum commune gombában hozzuk létre.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat gazdasejtként Z. rouxii élesztősejtben hozzuk létre.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat a gazdasejt D-glükóz-6foszfát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.49), 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.44), D-ribulóz-5-foszfát3-epimerázt (EC 5.1.3.1), D-ribulokinázt (EC 2.7.1.47) és/vagy xilitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.9) kódoló konstrukcióval történő transzformálásával hozzuk létre.
12. 12. A 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat transzketolázt (EC

    2.2.1.1) nem expresszáló gazdasejtben hozzuk létre.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat a gazdasejt további,

    D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.49), 6foszfo-D-glükonát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.44), Dribulóz-5-foszfát-3-epimerázt (EC 5.1.3.1), D-ribulokinázt (EC 2.7.1.47) és/vagy xilitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.9) kódoló konstrukcióval történő transzformálásával hozzuk létre.
14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat D-xilulokinázt (EC 2.7.1.17) nem expresszáló gazdasejtben hozzuk létre.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat a gazdasejt további, D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.49), 6foszfo-D-glükonát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.44), Dribulóz-5-foszfát-3-epimerázt (EC 5.1.3.1), D-ribulokinázt (EC 2.7.1.47) és/vagy xilitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.9) kódoló konstrukcióval történő transzformálásával hozzuk létre.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat sem transzketolázt (EC 2.2.1.1), sem D-xilulokinázt (EC 2.7.1.17) nem expresszáló gazdasejtben hozzuk létre.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat a gazdasejt D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.49), 6-foszfoD-glükonát-dehidrogenázt (EC 1.1.1.44), D-ribulóz-5foszfát-3-epimerázt (EC 5.1.3.1), D-ribulokinázt (EC 2.7.1.47) és/vagy xilitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.9) kódoló konstrukcióval történő további transzformálásával hozzuk létre.
18. 18. A 11-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat gazdasejtként Z. rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa vagy Torulaspora hansenii élesztőben, vagy Dendryphiella salina vagy Schizophyllum commune gombában hozzuk létre.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a metabolikus reakciómat gazdasejtként Z. rouxii élesztősejtben hozzuk létre.
20. 20. Rekombináns mikrobiális gazdasejt, azzal jellemezve, hogy egyetlen fermentáció során képes Dxilóztól, D-xilulóztól, D-xilóz és D-xilulóz elegyétől, valamint fő összetevőként D-xilózt vagy D-xilulózt tartalmazó polimerektől és oligomerektől eltérő szénforrásból kiindulva - a nem rekombináns mikrobiális gazdasejtnél nagyobb mértékben - xilitolt szintetizálni.
21. 21. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a nem rekombináns gazdasejthez képest a végtermékként arabitol szintéziséhez vezető natív metabolikus reakcióút meg van hosszabbítva vagy módosítva van benne, aminek következtében fokozott mértékű xilitolszintézisre képes.
22. 22. A 21. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a reakcióút D-arabitol-dehidrogenázt (EC 1.1.1.11) kódoló DNS-sel végzett transzformáció útján van benne meghosszabbítva vagy módosítva.
23. 23. A 22. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy a reakcióút xilitol-dehidrogenázt (EC 1 1.1.9) kódoló DNS-sel végzett transzformáció útján van benne meghosszabbítva vagy módosítva.

    HU 219 016 Β
24. 24. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy nem képes D-xilulokinázt (EC 2.7.1.17) expresszálni.
25. 25. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy nem képes transzketolázt (EC

    2.2.1.1) expresszálni.
26. 26. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy nem képes D-xilulokinázt (EC 2.7.1.17) vagy transzketolázt (EC 2.2.1.1) expreszszálni.
27. 27. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy xilitol-dehidrogenázt kódoló génnel van transzformálva.
28. 28. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy D-glükóz-6-foszfát-dehidrogenázt kódoló génnel (EC 1.1.1.49) van transzformálva.
29. 29. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzaljellemezve, hogy 6-foszfo-D-glükonát-dehidrogenázt kódoló génnel (EC 1.1.1.44) van transzformálva.
30. 30. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy D-ribulóz-5-foszfát-3-epimerázt kódoló génnel (EC 5.1.3.1) van transzformálva.
31. 31. A 20. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy xilitol-dehidrogenázt kódoló konstrukcióval van transzformálva.
32. 32. A 20-31. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy arabitolt termelő élesztőből vagy arabitolt termelő gombából - mint nem rekombináns mikrobiális gazdasejtből származik.
33. 33. A 32. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy nem rekombináns mikrobiális gazdasejtként ZygoSaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, Torulopsis candida, Pichia farinosa vagy Torulaspora hansenii élesztőből, vagy Dendryphiella salina vagy Schizophyllum commune gombából származik.
34. 34. A 33. igénypont szerinti rekombináns gazdasejt, azzal jellemezve, hogy Z. rouxii élesztősejtből származik.