CN111484942A - 一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法，属于生物工程领域。本发明是以酿酒酵母BY4741野生型菌株或敲除了LSC1基因的酿酒酵母BY4741菌株为宿主，分模块过量表达T.fusca己二酸逆降解途径中的β‑酮硫解酶基因、3‑羟酰基‑辅酶A脱氢酶基因、3‑羟基己二酰脱氢酶基因、5‑羧基‑2‑戊烯酰辅酶A还原酶基因、己二酰辅酶A，己二酸的产量可达到0.033‑0.113g/L。以其优秀的抗逆性、耐酸性、遗传稳定性、食品安全性，为酿酒酵母宿主工业化发酵生产己二酸准备了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法，属于生物工程领域。
背景技术
己二酸(Adipic acid，adipate)又称肥酸，是一种重要的有机二元酸，广泛应用于化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造等方面。
目前己二酸的主要生产方式是化学合成，但是该方法的产品收率并不高。此外，在己二酸的化学合成过程中主要以苯为原料，通过化学方法合成，原料和中间产物毒性很强，而且过程中产生大量的N2O等温室气体，环境污染严重且不可持续。
为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基础工作。目前报道的主要生物合成己二酸的方法有生物催化法和全生物合成方法。以葡萄糖为底物全生物合成己二酸具有工艺流程简单、总投入成本低、可循环利用等突出优点，因此备受研究人员青睐。目前报导主要的生物催化法主要是利用大肠杆菌作为宿主催化合成己二酸前体顺，顺-粘康酸，然后再利用金属催化剂催化合成己二酸。此外，大肠杆菌以葡萄糖为底物利用乙酰CoA和琥珀酰CoA作为底物全生物合成己二酸也达到了较高的产量。但大肠杆菌全生物合成己二酸存在着一些弊端，例如大肠杆菌属于原核生物、抗逆性较差、不耐酸、菌株遗传稳定性差，不易进行大规模工业发酵生产；另外大肠杆菌属于非食品安全菌株，其生物合成品不易运用于食品制造等领域。
基于以上问题，越来越多的研究者选择将酿酒酵母作为生物合成己二酸的宿主。酿酒酵母是一种最简单的真核生物，其遗传背景清晰、基因操作容易、遗传稳定性强、生命力旺盛、耐酸性和抗逆性强，并且，酿酒酵母可以生产多种类型的有机酸，并且存在着许多支持有机酸合成的内源代谢途径，并且，酿酒酵母是大规模工业发酵生产的最常用菌株之一。这使得酿酒酵母吸引了己二酸生物合成研究人员的极大的兴趣。其中，有研究人员利用酿酒酵母脂肪酸氧化法全生物合成己二酸，获得了较为理想的产量。目前，研究人员以酿酒酵母为宿主、以葡萄糖为底物从头合成己二酸有所报导，但产量较低，可能的原因是酿酒酵母宿主下以葡萄糖为底物从头合成己二酸并未找到合适的代谢途径。
自然界中存在着天然的己二酸合成或分解代谢途径，其中，褐色喜热裂孢菌的3-氧代己二酰辅酶A途径可以高效的利用己二酸，同时，当生长情况良好、碳源充足时，该途径也可以积累己二酸，因此，该途径又被称之为T.fu己二酸逆降解途径。途径中涉及到的六种酶分别是：β-酮硫解酶(Tfu_0875)，3-羟酰基-CoA脱氢酶(Tfu_2399)，3-羟基己二酰-CoA脱氢酶(Tfu_0068)，5-羧基-2-戊烯酰-CoA还原酶(Tfu_1648)和琥珀酰CoA合成酶(Tfu_2576、Tfu_2577)。然而，由于缺乏对该菌株进行基因工程改造的工具，提高己二酸的含量很困难。相比目前报导的己二酸生物合成途径，该Tfu己二酸逆降解途径的效率更高，可以以极高的得率通过葡萄糖等碳源底物生产己二酸。目前，在大肠杆菌中重构该途径，可以使己二酸的产量达到68g/L，为报导的最高值。然而，该菌株在实际生产过程中，存在如下缺陷：1、耐酸性差，菌株在pH低于5时会发生裂解；2、补料成本高：生产时须使用成本较高的葡萄糖等碳源进行发酵；3、发酵温度所需的能耗高：由于大肠杆菌所需的发酵温度为37℃，对能源的需求高。
从理论上来说，结合Tfu己二酸逆降解途径的优势，以及酿酒酵母宿主的优势，不仅可以获得较高的己二酸产量、产率，还可以克服大规模工业化生产遇到的种种问题，如菌株抗逆性、耐酸性、遗传稳定性等，是一种良好的策略。
发明内容
本发明首先提供了一种产己二酸的重组酿酒酵母，过量表达了来自褐色喜热裂孢菌β-酮硫解酶、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶、3-羟基己二酰脱氢酶、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶和己二酰辅酶A合成酶的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述过量表达是分模块过量表达；具体为：β-酮硫解酶和3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因采用同一个载体共表达；3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因采用同一个载体共表达；己二酰辅酶A合成酶基因采用一个载体表达。
在本发明的一种实施方式中，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母BY4741或敲除了LSC1基因的酿酒酵母BY4741为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述分模块过量表达是以pRS423为表达载体表达β-酮硫解酶基因和3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因；以pHAC181为表达载体表达3-羟基己二酰脱氢酶基因和5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因；以Y42为表达载体表达己二酰辅酶A合成酶基因。
在本发明的一种实施方式中，所述β-酮硫解酶基因(Tfu_0875)的Accessionnumber为MN550906，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因(Tfu_2399)的Accession number为MN550907，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述3-羟基己二酰脱氢酶基因(Tfu_0068)的Accession number为MN550908，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因(Tfu_1648)的Accession number为MN550909，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述己二酰辅酶A合成酶(Tfu_2576，Tfu_2577)的Accession number分别为MN550910、MN550911，核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二个目的是提供一种构建所述重组酿酒酵母的方法，包括以下步骤：
(1)以质粒pRS423为骨架载体，连接基因Tfu_0875、Tfu_2399，得到重组质粒pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399；
(2)以质粒pHAC181为骨架载体，连接基因Tfu_0068、Tfu_1648，得到重组质粒pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648；
(3)以质粒Y42为骨架载体，连接基因Tfu_2576、Tfu_2577，得到重组质粒Y42-Tfu_2576-Tfu_2577；
(4)将pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399、pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648、Y42-Tfu_2576-Tfu_2577分别转入野生型BY4741或敲除了LSC1基因的酿酒酵母BY4741，得到重组酿酒酵母P123、P123ΔLSC1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)以酿酒酵母BY4741的gDNA为模板，用引物CN9847-1-AF/R、CN9847-1-BF/R、CN9847-1-DF/R、CN9847-1-EF/R、CN9847-1-GF/R分别扩增基因片段Tcyc1-1、Ttef1-1、Ptef1-1、Pgpd1-1、Ttdh2-1，与基因合成得到的SEQ ID NO.1/2所示的Tfu_0875、Tfu_2399片段按照质粒图谱顺序进行同源重组连接，各个片段全长连接至T载体，得到中间构建pUCmT-Tfu_0875-Tfu_2399；将中间构建体pUCmT-Tfu_0875-Tfu_2399与质粒pRS423使用XhoI与SacI双酶切，再用T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)以酿酒酵母BY4741的gDNA为模板，用引物CN9847-2-AF/R、CN9847-2-BF/R、CN9847-2-DF/R、CN9847-2-EF/R、CN9847-2-GF/R分别扩增基因片段Ttdh2-2、Tadh1-2、Padh1-2、Ppgk1-2、Tpgk1-2，与基因合成的核苷酸序列如SEQID NO.3/4所示的Tfu_0068、Tfu_1648片段按照质粒图谱顺序进行同源重组连接，各个片段全长连接至T载体，得到中间构建pUCmT-Tfu_0068-Tfu_1648；将中间构建体pUCmT-Tfu_0068-Tfu_1648与质粒pHAC181使用NdeI与EcoRI双酶切，再用T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)以获得的酿酒酵母BY4741的gDNA为模板，用引物CN9847-3-AF/R、CN9847-3-BF/R、CN9847-3-DF/R、CN9847-3-EF/R、CN9847-3-GF/R分别扩增基因片段Tpgk1-3、Ttpi1-3、Ptpi1-3、Ptdh3-3、Tfab1-3，与基因合成(苏州泓讯)得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.5/6所示的Tfu_2576、Tfu_2577片段进行同源重组连接，各个片段全长连接至T载体，得到中间构建体pUCmT-Tfu_2576-Tfu_2577；将中间构建体pUCmT-Tfu_2576-Tfu_2577与质粒Y42使用BamHI与EcoRI双酶切，再用T4 DNA连接酶连接得到重组质粒Y42-Tfu_2576-Tfu_2577。
本发明的第三个目的在于提供一种发酵生产己二酸的方法，所述方法应用重组酿酒酵母P123和P123ΔLSC1进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述方法将所述重组酿酒酵母于30℃培养至OD600为1.0-1.2时，以10％的接种量转接至YPD培养基，30℃发酵96h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为SD(-Ura-His-Leu)培养基。
本发明还要求保护所述产己二酸的重组酿酒酵母在制备含己二酸的产品方面的应用。
本发明的有益效果在于：将高效的己二酸生物合成途径——Tfu己二酸逆降解途径成功的导入酿酒酵母重组菌，并且实现了己二酸在酿酒酵母宿主中的从头合成。相比化学法合成己二酸，全生物法合成己二酸，首先产品的回收更加方便简单，而且极大程度地降低了对环境的污染程度；相比其他己二酸合成宿主，酿酒酵母以其优良的抗逆性、耐酸性、遗传稳定性，为工业化发酵生产己二酸准备了基础；同时，酿酒酵母作为食品安全(GRAS)菌株，可以实现生物合成己二酸在食品领域的直接运用。
本发明构建的重组酿酒酵母能够以葡萄糖为唯一碳源生产己二酸，在摇瓶水平上，，通过Tfu己二酸逆降解途径的引入及发酵条件的控制，P123△LSC1菌种发酵产量达到33mg/L，实现了己二酸在酿酒酵母宿主合成从无到有的跨越。并通过发酵优化，使己二酸在酿酒酵母宿主P123中产量提高至0.113g/L。同时，己二酸发酵过程当中宿主可以耐受4以下的pH值、遗传稳定性良好，这为以酿酒酵母为宿主工业化发酵生产食品安全的己二酸奠定了基础。
附图说明
图1为Tfu己二酸逆降解途径示意图；
图2为BY4741敲除LSC1基因的菌落pcr验证图谱。1、2、5、6、7：敲除LSC1成功的菌株；3、4：未敲除成功的菌株；8：空白对照；M：5000bp Marker；
图3为pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399质粒图谱；
图4为pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648质粒图谱；
图5为Y42-Tfu_2576-Tfu_2577质粒图谱；
图6为重组质粒pcr验证图谱。1：pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399；2：pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648；3：Y42-Tfu_2576-Tfu_2577；M：5000bp Marker；
图7为重组酿酒酵母P123菌落pcr验证图谱。M：5000bp Marker；1：基因片段Tfu_0875；2：基因片段Tfu_2399；3：基因片段Tfu_0068；4：基因片段Tfu_1648；5：基因片段Tfu_2576；6：基因片段Tfu_2577；
图8为在YPD培养基中BY4741野生型、BY4741ΔLSC1、P123和P123ΔLSC1己二酸产量图谱。
具体实施方式
表1下述实施例涉及的引物序列表
β-酮硫解酶基因(Tfu_0875)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因(Tfu_2399)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；3-羟基己二酰脱氢酶基因(Tfu_0068)的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因(Tfu_1648)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；己二酰辅酶A合成酶基因(Tfu_2576、Tfu_2577)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
实施例1：BY4741中succinate--CoA ligase(GDP-forming)subunit alpha(LSC1)基因的敲除
重组酿酒酵母LSC1基因敲除框的获得：以ΔLSC1-pUG6-F和ΔLSC1-pUG6-R为引物，以pUG6载体为模板，通过PCR反应扩增出大小为1700bp的DNA片段，该片段在首尾分别与BY4741基因组上LSC1基因ORF框上游和下游的50bp为同源序列。将PCR产物纯化后留取备用。
重组酿酒酵母基因敲除框的转化：将平板活化的酿酒酵母BY4741单菌落接种于装有10mL YPD液体培养基的100mL锥形瓶中，然后在转速为250r·min-1，温度为30℃的摇床过夜培养作为新鲜的种子液，按1％转接至装有50mL YPD培养基的250mL锥形瓶中，相同条件下培养5-8h，至OD600至0.8-1.0左右停止培养。(2)用50mL离心管收集菌液，6000r·min-1，4℃低温离心10min，收集菌体。(3)倒掉上清液，用预冷的25mL无菌水清洗菌体，低温离心后弃掉上清收集菌体。重复操作3次。(4)弃上清收集菌体，加入1mL的无菌细胞悬浮液(5％甘油，10％二甲基亚枫，v/v)重悬菌体，按100μL分装作为转化用感受态，保存于-80℃冰箱用于后续实验。(5)感受态细胞于30℃孵育2min，8000r·min-1离心2min，去上清液，配制转化体系，包括以下成分：260μL 50％PEG 4000，36μL 1M醋酸锂，2μg待转化DNA片段，10μLssDNA用无菌水补至360μL，重悬1min。(6)于42℃热激30min，6000rpm离心5min，去上清用无菌水将菌体重悬，6000rpm离心5min，弃上清，菌体直接涂布YPD(G418抗性)平板。
BY4741ΔLSC1菌株的获得：将上述平板生长的新鲜单菌落挑取至20μL无菌水中混匀，取1μL作为PCR反应模板，使用敲除验证引物进行PCR反应，反应体系按照表2配制。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取条带大小为3190bp的单菌落，即为正确的敲除株(对照为2572bp)，命名为BY4741ΔLSC1。
表2菌落PCR反应体系
凝胶电泳的准备：称取0.3g琼脂糖溶于25mL 1×TAE缓冲液中，加热30-60s使其完全溶化，加入5μL EB，摇匀后倒入已插好梳子的水平胶框中，避免产生气泡，放置待其凝固。轻轻地拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，倒入电泳缓冲液使其没过胶块，根据上样量加入适量的10×Loading Buffer，垂直点入上样孔中，插好电极后，100V运行30min后结束，取出胶块放入凝胶成像仪中进行拍照。
实施例2：重组质粒的构建及重组酿酒酵母的获得
Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648、Tfu_2576、Tfu_2577的序列已于在NCBI中公布。
以获得的酿酒酵母BY4741的gDNA为模板，利用带有同源臂的引物(表1)进行PCR扩增，得到基因片段Tcyc1-1、Ttef1-1、Ptef1-1、Pgpd1-1、Ttdh2-1片段，其中，采用引物CN9847-1-AF/R扩增Tcyc1-1；采用引物CN9847-1-BF/R扩增Ttef1-1；采用引物CN9847-1-DF/R扩增Ptef1-1；采用引物CN9847-1-EF/R扩增Pgpd1-1；采用引物CN9847-1-GF/R扩增Ttdh2-1；将扩增后的Tcyc1-1、Ttef1-1、Ptef1-1、Pgpd1-1、Ttdh2-1与合成的序列如SEQ IDNO.1、2所示的Tfu_0875、Tfu_2399片段进行同源重组连接，各个片段按照图3的顺序全长连接至T载体，得到中间构建pUCmT-Tfu_0875-Tfu_2399。将中间构建体pUCmT-Tfu_0875-Tfu_2399与质粒pRS423使用XhoI与SacI双酶切，再用T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399。
以获得的酿酒酵母BY4741的gDNA为模板，利用带有同源臂的引物(表1)进行PCR扩增，得到基因片段Ttdh2-2、Tadh1-2、Padh1-2、Ppgk1-2、Tpgk1-2，其中，采用引物CN9847-2-AF/R扩增Ttdh2-2；采用引物CN9847-2-BF/R扩增Tadh1-2；采用引物CN9847-2-DF/R扩增Padh1-2；采用引物CN9847-2-EF/R扩增Ppgk1-2；采用引物CN9847-2-GF/R扩增Tpgk1-2；将扩增后的Ttdh2-2、Tadh1-2、Padh1-2、Ppgk1-2、Tpgk1-2与基因合成的SEQ ID NO.3、4所示Tfu_0068、Tfu_1648片段进行同源重组连接，各个片段按照图4的顺序全长连接至T载体，得到中间构建体pUCmT-Tfu_0068-Tfu_1648。将中间构建体pUCmT-Tfu_0068-Tfu_1648与质粒pHAC181使用NdeI与EcoRI双酶切，再用T4 DNA连接酶连接得到重组质粒pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648
以获得的酿酒酵母BY4741的gDNA为模板，利用带有同源臂的引物(表1)进行PCR扩增，得到基因片段Tpgk1-3、Ttpi1-3、Ptpi1-3、Ptdh3-3、Tfab1-3，其中，采用引物CN9847-3-AF/R扩增Tpgk1-3；采用引物CN9847-3-BF/R扩增Ttpi1-3；采用引物CN9847-3-DF/R扩增Ptpi1-3；采用引物CN9847-3-EF/R扩增Ptdh3-3；采用引物CN9847-3-GF/R扩增Tfab1-3；将扩增后的Tpgk1-3、Ttpi1-3、Ptpi1-3、Ptdh3-3、Tfab1-3与基因合成的序列如SEQ ID NO.5、6所示的Tfu_2576、Tfu_2577片段进行同源重组连接，各个片段按照图5的顺序全长连接至T载体，得到中间构建体pUCmT-Tfu_2576-Tfu_2577。将中间构建体pUCmT-Tfu_2576-Tfu_2577与质粒Y42使用BamHI与EcoRI双酶切，再用T4 DNA连接酶连接得到重组质粒Y42-Tfu_2576-Tfu_2577。
将pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399、pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648、Y42-Tfu_2576-Tfu_2577分别转入野生型酿酒酵母BY4741和敲除了LSC1基因的酿酒酵母BY4741，得到重组酿酒酵母P123和P123ΔLSC1。
实施例3：重组酿酒酵母摇瓶发酵
YPD培养基：酵母浸出物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，固体YPD培养基中加入2.0％琼脂，pH为5.4～5.6，121℃，高压蒸汽灭菌30min；
SD培养基：葡萄糖20g，YNB培养基(不含(NH4)2SO4 1.7g),(NH4)2SO4 5g，加1000mL去离子水pH＝5.5，115℃，高压蒸汽灭菌15min。接种前，根据选择性标记加入适量灭过菌的氨基酸、嘧啶、琼脂粉。
LB培养基(按g/L计)：10胰蛋白胨+5酵母粉+10NaCl。
发酵条件：以SD(-Ura-His-Leu)培养基为发酵培养基，将重组酿酒酵母于30℃培养至OD600为1.0-1.2时，无菌水洗涤2次，以10％的接种量转接至YPD培养基发酵96h，装液量为50mL/250mL，转速250rpm，温度30℃。
以BY4741野生型、敲除LSC1基因的菌株BY4741ΔLSC1为对照菌株，在相同条件下培养，己二酸产量为0，BY4741ΔLSC1己二酸最高产量为0，P123己二酸最高产量为0.113g/L，P123ΔLSC1己二酸最高产量为0.033g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法
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ggaggcgcga ttgccatagg gcatccctta ggggcatcag gtgcaaggat tgttgggact 1080
ctagcgcacg aactacacag gaggggcgga gggtggggac tagcggcaat atgtattggc 1140
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<210> 2
<211> 1197
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
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<213> Saccharomyces cerevisiae
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Claims (10)
1.一种产己二酸的重组酿酒酵母，其特征在于，分模块表达编码β-酮硫解酶、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶、3-羟基己二酰脱氢酶、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶和己二酰辅酶A合成酶的基因；所述分模块表达具体为：β-酮硫解酶和3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因采用同一个载体共表达；3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因采用同一个载体共表达；己二酰辅酶A合成酶基因采用同一个载体共表达。
2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述分模块过量表达是以pRS423为表达载体表达β-酮硫解酶基因和3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因；以pHAC181为表达载体表达3-羟基己二酰脱氢酶基因和5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因；以Y42为表达载体表达己二酰辅酶A合成酶基因。
3.根据权利要求1或2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，以酿酒酵母BY4741或敲除了LSC1基因的酿酒酵母BY4741为宿主。
4.一种构建权利要求1～3任一所述重组酿酒酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以质粒pRS423为骨架载体，连接β-酮硫解酶基因Tfu_0875、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因Tfu_2399，得到重组质粒pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399；
(2)以质粒pHAC181为骨架载体，连接基因3-羟基己二酰脱氢酶基因Tfu_0068、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因Tfu_1648，得到重组质粒pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648；
(3)以质粒Y42为骨架载体，连接己二酰辅酶A合成酶基因Tfu_2576、Tfu_2577，得到重组质粒Y42-Tfu_2576-Tfu_2577；
(4)将步骤(1)～(3)构建的pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399、pHAC181-Tfu_0068-Tfu_1648和Y42-Tfu_2576-Tfu_2577转入酿酒酵母细胞中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741或敲除了LSC1基因的酿酒酵母BY4741。
6.一种发酵生产己二酸的方法，其特征在于，将权利要求1～3任一所述的重组酿酒酵母接种至发酵培养基中，于28～32℃发酵至少48h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述重组酿酒酵母于28～30℃培养至OD600为1.0～1.2时，以按体积计8～12％的接种量转接至发酵培养基，与28～30℃发酵48～96h。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基以葡萄糖为碳源。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征碍于，所述发酵培养基为SD(-Ura-His-Leu)培养基。
10.权利要求1～3任一所述的重组酿酒酵母在化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造领域制备己二酸或其衍生产品方面的应用。
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