ES2620770T3 - Proceso de fermentación que emplea células de levadura que tienen una ruta alterada desde dihidroxiacetona fosfato hasta glicerol - Google Patents

Abstract

Un proceso de fermentación en el que una célula de levadura pre-duplicación del genoma completo que tiene una ruta metabólica nativa desde dihidroxiacetona fosfato hasta glicerol-3-fosfato hasta glicerol, que está modificada genéticamente para delecionar o alterar al menos un gen nativo de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, se cultiva en condiciones de fermentación y en presencia de una fuente de carbono para producir un producto de fermentación deseado, en el que el rendimiento de glicerol es menor del 2% respecto del peso de la fuente de carbono que consume la célula, y por lo que se añade glicerol al medio de fermentación; en el que la fuente de carbono es un carbohidrato de hexosa, un oligómero de glucosa, un carbohidrato de pentosa, o un oligómero de xilosa; en el que la levadura preduplicación del genoma completo se selecciona de la especie Issatchenkia orientalis, Pichia galeiformis, Pichia sp. YB-4149 (denominación del NRRL), Candida ethanolica, P. deserticola, P. membranifaciens y P. fermentans.

Description

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nativas para la célula hospedadora, y orientadas en la construcción en la misma dirección entre sí. Las secuencias de repeticiones directas tienen de manera ventajosa una longitud de alrededor de 50-1500 pb. No es necesario que las secuencias de repeticiones directas codifiquen nada. Esta construcción permite que se dé un evento de recombinación homóloga. Este evento se da con una frecuencia muy baja, y da como resultado células que contienen una deleción del gen marcador de selección y una de las secuencias de repeticiones directas. Puede ser necesario cultivar los transformantes durante varias rondas en medios no selectivos para permitir que se dé la recombinación homóloga espontánea en algunas de las células. Las células en las que se ha delecionado espontáneamente el gen marcador de selección se pueden seleccionar o cribar basándose en su pérdida de la característica de selección conferida por el gen marcador de selección.

La construcción de deleción del gen objetivo puede contener además un casete de gen estructural, de nuevo localizado en posición posterior a la región flanqueante de 5' y en posición anterior a la región flanqueante de 3', pero preferiblemente sin estar dentro de ningún casete de marcador de selección que pueda haber presente. Tal construcción permite la deleción simultánea del gen objetivo y la inserción de un gen estructural. "Gen estructural" quiere decir cualquier gen que codifique una proteína, distinta del gen objetivo o de un gen marcador de selección como se describió anteriormente. Se puede usar una amplia diversidad de genes estructurales, pero los de interés particular para esta invención son un gen que confiere a la célula la capacidad de producir un ácido orgánico, o un gen que confiere a la célula la capacidad de consumir una fuente de carbono particular, tal como un carbohidrato de pentosa.

En los casos en los que se usa un marcador de selección, la transformación se puede llevar a cabo con un par de construcciones de deleción en vez de una única construcción de deleción. Un elemento del par contendrá la primera secuencia del locus del gen objetivo y una parte no funcional del casete de gen marcador. El otro elemento del par contendrá la segunda secuencia del locus del gen objetivo y otra parte no funcional del casete de gen marcador. Las dos partes del casete de gen marcador se seleccionan de manera que juntas forman un casete completo. Los extremos de cada una de las dos partes del casete de gen marcador comparten una secuencia común, es decir, una porción del casete está duplicada en los extremos de cada una de las dos partes. La célula se transforma con estos de manera simultánea para llevar a cabo la deleción o alteración deseada, con la formación de un casete de marcador o gen estructural completo y funcional. Una proporción de las células integrarán de manera homóloga ambas construcciones de deleción en el locus objetivo, y afrontarán un evento de recombinación homóloga adicional para reconstituir un casete de gen de selección funcional a partir de los dos fragmentos no funcionales. Los transformantes eficaces se pueden seleccionar basándose en la característica conferida por el marcador de selección.

Cuando la ruta metabólica nativa de la célula incluye la ruta de dihidroxiacetona fosfato a glicerol-3-fosfato a glicerol (por medio de las enzimas GDP y GPP), se puede delecionar o alterar cualquiera de el/los gen(es) GDP o gen(es) GPP. Se pueden delecionar los dos genes GDP y GPP. En tal caso, la deleción o alteración de ambos genes GDP y GPP se puede realizar de manera simultánea o de manera secuencial en cualquier orden. Si la célula contiene múltiples genes GDP o GPP, o múltiples alelos de tales genes, se prefiere delecionar todos los que sean funcionales en la célula. En los casos en los que la ruta metabólica nativa de la célula incluya la ruta de dihidroxiacetona fosfato hasta dihidroxiacetona hasta glicerol (por medio de una dihidroxiacetona fosfato fosfatasa y glicerol deshidrogenasa), se puede delecionar o alterar cualquiera de los genes de dihidroxiacetona fosfato fosfatasa o de glicerol deshidrogenasa. Se pueden delecionar o alterar los dos genes de dihidroxiacetona fosfato fosfatasa o glicerol deshidrogenasa, lo que se puede realizar de manera simultánea o secuencial, en cuyo caso se puede realizar en cualquier orden. Como antes, preferiblemente se delecionan todas las copias o alelos funcionales múltiples de tales genes.

En ciertos aspectos de la invención, la célula es capaz de producir un ácido orgánico deseado (o su sal). Esta capacidad se manifiesta por la capacidad de convertir al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 50%, al menos un 70%, al menos un 80% o al menos un 90% en peso de una fuente de carbono hasta el ácido orgánico deseado cuando se cultiva en al menos un conjunto de condiciones de fermentación. Como pocas células de levadura tienen la capacidad nativa de producir tales ácidos, la célula útil en la invención contendrá en la mayoría de los casos al menos un gen exógeno funcional que le permita producir el ácido.

Las células de interés particular producen lactato, lo cual quiere decir ácido láctico o una sal del mismo. En tal caso, la célula útil en la invención contiene al menos un gen de lactato deshidrogenasa (LDH) funcional exógeno integrado en su genoma. Un gen LDH es uno que codifica una enzima lactato deshidrogenasa funcional. Una enzima LDH funcional es una que cataliza la reducción de piruvato a lactato. Los genes LDH son específicos de la producción de L-LDH o D-LDH, lo que permite respectivamente a la célula producir el enantiómero de ácido L-o D-láctico (o sus sales). Es posible que la célula modificada útil en la invención contenga ambos genes de L-y D-LDH, y así sea capaz de producir ambos enantiómeros de ácido láctico. Sin embargo, se prefiere que solamente haya presentes genes de L-o D-LDH, de forma que la célula produzca un producto de ácido láctico más puro ópticamente.

Los genes LDH adecuados incluyen los obtenidos de fuentes bacterianas, fúngicas, de levaduras o de mamíferos. Los ejemplos de genes L-LDH específicos son los obtenidos de L. helveticus, L. casei, B. megaterium, P. acidilactici y fuentes bovinas. Los ejemplos de genes D-LDH específicos son los obtenidos de L. helveticus, L. johnsonii, L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. plantarum, y L. pentosus. Son adecuados los genes funcionales que son idénticos o al

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del locus de cada gen o alelo en la construcción para delecionar o alterar ambos genes o alelos de PDC. La construcción usada para alterar el/los gen(es) PDC puede incluir uno o más casetes de marcador funcional o gen estructural insertados en posición posterior a la porción flanqueante de 5' del gen PDC nativo y en posición anterior a las porciones flanqueantes de 3' del gen PDC nativo. Esta aproximación permite la deleción del gen PDC y la inserción del casete de gen funcional en una única etapa de transformación.

Otra modificación adicional de interés particular es una (o más) que confiere individualmente o colectivamente a la célula la capacidad de fermentar carbohidratos de pentosa hasta productos de fermentación deseables. Entre este último tipo de modificaciones están (1) la inserción de un gen de xilosa isomerasa funcional, (2) una deleción o alteración de un gen nativo que produce una enzima que cataliza la conversión de xilosa en xilitol, (3) una deleción o alteración de un gen de xilitol deshidrogenasa funcional y/o (4) las modificaciones que provocan que la célula sobreexprese una xiluloquinasa funcional. Los métodos para introducir esas modificaciones en las células de levadura se describen, por ejemplo, en el documento WO 04/099381. Los métodos adecuados para insertar un gen de xilosa isomerasa funcional, delecionar o alterar un gen nativo que produce una enzima que cataliza la conversión de xilosa en xilitol, delecionar o alterar un gen de xilitol deshidrogenasa funcional modificando la célula para sobreexpresar una xiluloquinasa funcional se describen, por ejemplo, en el documento WO 04/099381.

Otra modificación adicional de interés particular en las células que producen lactato útiles en la invención incluye una deleción o alteración de al menos un gen de L-o D-lactato:ferricitocromo c oxidorreductasa.

En general, la célula usada en la invención se caracteriza por una capacidad reducida de sintetizar glicerol. Un método útil para determinar la capacidad de una célula de sintetizar glicerol es cultivar la célula en las condiciones microaerobias estándar descritas anteriormente. Se usa un medio de fermentación acuoso definido, que contiene al inicio del cultivo 5 g/L de sulfato de amonio, 3 g/L de fosfato monopotásico, 0,5 g/L de sulfato magnésico, oligoelementos, vitaminas y 150 g/L de glucosa. El pH se ajusta a 3,5 al inicio del cultivo. Se permite que el pH oscile libremente durante el cultivo, pero se tampona el medio si es necesario para impedir que el pH caiga por debajo de 3,0 o se eleve por encima de 7,0 durante el cultivo. El medio de fermentación se inocula con suficientes células de levadura que son el objeto de la determinación para producir una DO600 de 1,0. La temperatura de cultivo es 30 °C. El cultivo se continúa hasta que la concentración de glucosa se reduce hasta 5 g/L, pero no continúa durante más de 120 horas. Durante el cultivo, se seleccionan las condiciones de ventilación y agitación para producir una tasa de consumo de oxígeno de 5,0 ± 1,0 mmol/L/hr. En estas condiciones estándar, las células usadas en la invención no producen en general más de 2,0 g/L de glicerol. Más en general, no producen más de 0,6 g/L de glicerol en estas condiciones, y en la mayoría de casos no producen más de 0,2 g/L de glicerol en estas condiciones. Las células preferidas también producen, en estas condiciones microaerobias estándar, al menos 10 g/L de al menos un producto de fermentación deseable, tal como etanol o un ácido orgánico tal como lactato. Las células producen más preferiblemente al menos 40 y especialmente al menos 50 g/L del producto de fermentación deseado en estas condiciones.

La célula se puede cultivar en las condiciones microaerobias estándar descritas anteriormente o en cualquier otro conjunto útil de condiciones de fermentación, para producir uno o más productos de fermentación deseables. El etanol es un ejemplo de un producto de fermentación que producen de manera natural muchas especies de levaduras. Como se discutió anteriormente, las células se pueden modificar para permitir que produzcan otros productos de fermentación deseables, que incluyen ácidos orgánicos tales como lactato o ácido 3-hidroxi propiónico. Las células se pueden modificar para producir también otros productos de fermentación, que incluyen otros ácidos u otros productos que no son ácidos.

En el proceso de fermentación de la invención, se cultiva la célula en un medio de fermentación que incluye una fuente de carbono que es fermentable por la célula transformada. La fuente de carbono puede ser un carbohidrato de hexosa tal como glucosa, o un oligómero u otro polímero de glucosa tal como glicano, maltosa, maltotriosa o isomaltotriosa. La fuente de carbono puede ser otro carbohidrato de hexosa, del cual son ejemplos panosa, fructosa, fructosa y sus oligómeros y polímeros respectivos. Si la célula tiene de manera nativa o se modifica para conferir la capacidad de fermentar carbohidratos de pentosa, la fuente de carbono puede incluir un carbohidrato de pentosa tal como xilosa, o un oligómero o polímero de xilosa tal como xilano. Tales carbohidratos de pentosa son de manera adecuada hidrolizados de una biomasa que contiene hemicelulosa. En el caso de carbohidratos oligoméricos, puede ser necesario añadir enzimas al caldo de fermentación para digerirlos hasta el carbohidrato monomérico correspondiente para la fermentación con la célula.

El medio contendrá en general nutrientes según los necesite la célula particular, lo que incluye una fuente de nitrógeno (tal como aminoácidos, proteínas, fuentes de nitrógeno inorgánicas tales como amoniaco o sales de amonio, y similares), y diversas vitaminas, minerales y similares. Se puede usar un medio denominado "complejo" o un medio denominado "definido".

Otras condiciones de fermentación, tales como la temperatura, la densidad celular, la selección de sustrato(s), la selección de nutrientes, y similares no se consideran críticas para la invención, y se seleccionan en general para proporcionar un proceso económico. Las temperaturas durante la fase de crecimiento y la fase de producción pueden oscilar desde una temperatura superior a la temperatura de congelación del medio hasta alrededor de 50 °C, aunque esto depende hasta cierto punto de la capacidad de la cepa de tolerar las temperaturas elevadas. Una

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temperatura preferida, en particular durante la fase de producción, es de alrededor de 30-45 °C.

Durante la fase de producción, la concentración de células en el medio de fermentación está en general en el intervalo de 0,1 a 20, preferiblemente de 0,1 a 5, aún más preferiblemente de 1 a 3 g de células secas/litro de medio de fermentación. La fermentación se puede llevar a cabo de manera aerobia, microaerobia, o anaerobia. Si se desea, se puede usar la tasa de consumo de oxígeno como control del proceso, como se describió en el documento WO 03/102200. Las células usadas en la invención pueden comportarse especialmente bien cuando se cultivan en condiciones microaerobias, caracterizadas por una tasa de consumo de oxígeno de 4 a 12, especialmente de 5 a 10, mmol/L/hr.

En los casos preferidos en los que la célula produce un ácido orgánico tal como lactato, el medio se puede tamponar durante la fase de producción de la fermentación de forma que el pH se mantiene en un intervalo de alrededor de 3,5 a alrededor de 9,0, o de alrededor de 4,5 a alrededor de 7,0. Los agentes tamponadores adecuados son materiales básicos que neutralizan el ácido a medida que se forma, e incluyen, por ejemplo, hidróxido cálcico, carbonato cálcico, hidróxido sódico, hidróxido potásico, carbonato potásico, carbonato sódico, carbonato amónico, amoniaco, hidróxido amónico y similares. En general, los agentes tamponadores que se han usado en los procesos de fermentación convencionales también son adecuados en la presente memoria.

En una fermentación tamponada, los productos de fermentación ácidos se neutralizan hasta la sal correspondiente a medida que se forman. La recuperación del ácido, por lo tanto, implica regenerar el ácido libre. Esto se realiza en general eliminando las células y acidificando el caldo de fermentación con un ácido fuerte tal como ácido sulfúrico. Se forma un producto secundario salino (yeso en el caso en el que una sal cálcica sea el agente neutralizante y ácido sulfúrico sea el agente acidulante), que se separa del caldo. El ácido se recupera después del caldo por medio de técnicas tales como extracción líquido-líquido, destilación, absorción, etc., tal como se describen en T.B. Vickroy, Vol. 3, capítulo 38 de Comprehensive Biotechnology, (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta, et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16:221-231; patentes de EE.UU. Nºs 4.275.234, 4.771.001, 5.132.456, 5.420.304, 5.510.526, 5.641.406, y 5.831.122, y el documento WO 93/00440.

De manera alternativa, se puede permitir que el pH del medio de fermentación caiga durante el cultivo desde un pH de partida que está por encima del pKa del producto ácido, en general 5,5 o más, hasta o por debajo del pKa del producto de fermentación ácido, tal como en el intervalo de alrededor de 1,5 a alrededor de 3,5, en el intervalo de alrededor de 1,5 a alrededor de 3,0, o en el intervalo de alrededor de 1,5 a alrededor de 2,5.

También es posible llevar a cabo la fermentación para producir un producto ácido ajustando el pH del caldo de fermentación a o por debajo del pKa del producto ácido antes o al inicio del proceso de fermentación. El pH se puede mantener a continuación a o por debajo del pKa del producto ácido a lo largo del cultivo, o se puede dejar incrementar por encima del pKa del ácido a medida que se desarrolla la fermentación. En este último caso, el pH se mantiene preferiblemente dentro del intervalo de alrededor de 1,5 a alrededor de 3,5, en el intervalo de alrededor de 1,5 a alrededor de 3,2, o en el intervalo de alrededor de 2,0 a alrededor de 3,0.

La célula usada en la invención tiene una capacidad muy reducida de producir glicerol en muchas condiciones de fermentación. La capacidad reducida de la célula de producir glicerol se manifiesta por rendimientos de glicerol bajos. Las células metabolizan en general menos del 2% en peso de la fuente de carbono que se consume hasta glicerol. En la mayoría de casos, el rendimiento de glicerol es menor del 1% o incluso menor del 0,1%, respecto del peso de la fuente de carbono que se consume en el cultivo. Preferiblemente, la célula metaboliza al menos un 40%, tal como al menos un 50, 60, 70, 80 o 85%, de la fuente de carbono que se consume hasta el producto de fermentación deseado.

Se ha descubierto que las células útiles en la invención exhiben una buena capacidad de crecer en condiciones de fermentación. Esto es sorprendente, debido a los diversos usos en la célula del glicerol y al papel que se cree que desempeña el glicerol en el equilibrio de NADH/NAD+ en las células de levadura de tipo natural. Dentro del alcance de la invención está añadir glicerol al medio de fermentación para compensar la capacidad disminuida de la célula de producir glicerol por sí misma.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención, pero no pretenden limitar el alcance de la misma. El Ejemplo 7 es según la invención. Todas las partes y porcentajes están en peso, a menos que se indique de otra manera.

Ejemplo 1A: Mutagénesis de la cepa CD607 de K. marxianus y selección de la cepa mutante (CD853) que tiene resistencia a ácido glicólico.

La cepa CD607 de K. marxianus se describe en el Ejemplo 3D del documento WO 03/102152. Esta cepa tiene una deleción de su gen de piruvato descarboxilasa y una inserción de un gen de lactato deshidrogenasa exógeno en ese locus. Las células de la cepa CD607 se someten a mutagénesis por medio de exposición a luz ultravioleta.

Las células de una placa nueva YP (extracto de levadura más peptona) + 20 g/L de glucosa se resuspenden en 2 mL de levadura-peptona + 50 g/L de glucosa hasta una DO600 aproximada de 6. Se pipetean diez alícuotas de 125 µl de esta suspensión celular en diez pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos de 300 µl. La placa de

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G418 completo con cierta duplicación en los extremos de los fragmentos.

La cepa CD853 se cultiva durante la noche en YP + 60 g/L de glucosa + MES 0,2 M + 1% de etanol, pH 6,5, y se somete a electroporación de manera simultánea con el fragmento de 2,6 kpb del plásmido pBH158 y el fragmento de 2,0 kpb de pBH159. Los transformantes se seleccionan en placas de YP + 20 g/L de glucosa + 300 µg/mL de G418 a 30 °C después de 2 días de cultivo. Se recogen 15 transformantes, se vuelven a sembrar en placas de YP + 20 g/L de glucosa + G418 y se cultivan durante la noche. Solamente las células que se han cotransformado con ambos fragmentos y en las que ambos fragmentos se han integrado de manera homóloga en el locus de KmGPD1F serán resistentes a G418.

La deleción del gen KmGPD1F se verifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 18 y SEQ. ID. Nº 19. Siete transformantes exhiben una única banda de 3,4 kpb mediante PCR, lo que indica que el gen KmGPD1F está delecionado en esos transformantes. Uno de estos transformantes se denomina cepa CD1606.

Ejemplo 2A: Construcción de los vectores de deleción del gen GPP pBH160 (Fig. 3) y pBH161 (Fig. 4)

El plásmido pVR29 se digiere con MluI y KpnI, y el fragmento de 5,1 kpb que contiene el casete del gen G418 así obtenido se purifica en gel y se desfosforila. Una región de 0,9 kpb de ADN inmediatamente en posición anterior del gen de GPP nativo (gen KmHOR2) se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 20 y SEQ. ID. Nº 21, mediante el uso del ADN genómico de K. marxianus como molde. El producto de PCR se purifica en gel, se digiere con MluI y KpnI, y se liga en el fragmento de 5,1 kpb del plásmido pVR29 para producir un plásmido denominado pBH160 (Fig. 3). El plásmido pBH160 contiene, por orden de transcripción, el flanco en posición anterior de 0,9 kpb del gen KmHOR2 y el casete de expresión de G418.

El plásmido pVR29 se digiere con NgoMIV y SpeI, y un fragmento de 4,7 kpb que contiene el casete de expresión de G418 se purifica en gel y se desfosforila. Una región de 0,8 kpb de ADN inmediatamente en posición posterior del gen KmHOR2 se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 22 y SEQ. ID. Nº 23, mediante el uso del ADN genómico de K. marxianus como molde. El producto de PCR se purifica en gel, se digiere con NgoMIV y SpeI, y se liga en el fragmento de 4,7 kpb de pVR29 para producir un plásmido denominado pBH161 (Fig. 4). El plásmido pBH161 contiene, por orden de transcripción, el casete de expresión de G418 y el flanco en posición posterior de 0,8 kpb del gen KmHOR2.

Ejemplo 2B: Transformación de la cepa CD853 (Ej. 1A) con los plásmidos pBH160 y pBH161 (Ej. 2A, Figs. 3 y 4) para producir un transformante (cepa CD1608) que tiene un gen LDH exógeno, una deleción de un gen PDC nativo, un gen CYB2 nativo alterado y un gen GPP nativo delecionado.

El plásmido pBH160 se digiere con MluI y HindIII. Estas enzimas de restricción cortan el plásmido para producir un fragmento de 2,3 kpb que contiene el flanco en posición anterior de 0,9 kpb del gen de GPP de K. marxianus (KmHOR2) y parte del casete de expresión de G418. Este fragmento se aísla de un gel de agarosa. El plásmido pBH161 se digiere con XhoI y NgoMIV. Estas enzimas de restricción cortan el plásmido para producir un fragmento de 2,0 kpb que contiene el flanco en posición anterior de 0,8 kpb del gen KmHOR2 y parte del casete de expresión de G418. Este fragmento se aísla de un gel de agarosa. Los dos fragmentos aislados contienen juntos el casete de expresión de G418 completo con cierta duplicación en los extremos de los fragmentos.

La cepa CD853 se cultiva durante la noche en YP + 60 g/L de glucosa + MES 0,2 M + 1% de etanol, pH 6,5, y después se somete a electroporación con el fragmento de 2,3 kpb del plásmido pBH160 y el fragmento de 2,0 kpb del plásmido pBH161. Los transformantes se seleccionan en placas de YP + 20 g/L de glucosa + 300 µg/mL de G418 a 30 °C después de 2 días de cultivo. Se vuelven a sembrar 15 transformantes en placas de YP + 20 g/L de glucosa + 300 µg/mL de G418 y se cultivan durante la noche. Todos los transformantes crecen en este medio. Solamente las células que se han cotransformado con ambos fragmentos y en las que ambos fragmentos se han integrado de manera homóloga en el locus de KmHOR2 serán resistentes a G418.

La deleción del gen KmHOR2 se verifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 20 y SEQ. ID. Nº 21. Tres transformantes producen una única banda de 3,8 kpb, lo que es indicativo de la deleción del gen KmHOR2. Uno de estos transformantes se denomina cepa CD1608.

Ejemplo 3: Cultivo discontinuo microaerobio de las cepas CD853 (Ej. 1A), CD1606 (Ej. 1C) y CD1608 (Ej. 2B).

Las cepas CD853, CD1606 y CD1608 se cultivan por separado en condiciones microaerobias. Se llevan a cabo fermentaciones por duplicado en los casos de las cepas CD1606 y CD1608. En cada caso, se usa un reactor de cultivo discontinuo de una etapa. El medio de fermentación es un medio definido que incluye sulfato de amonio, fosfato monopotásico y sulfato magnésico, oligoelementos, vitaminas, agente antiespumante, y alrededor de 90 g/L de glucosa. El pH del medio se ajusta a alrededor de 3,0 mediante la adición de hidróxido potásico. El medio se ajusta a 30 °C y se inocula con 1 mL de células. Las células se cultivan a 30 °C con agitación y en condiciones de ventilación que conducen a una tasa de consumo de oxígeno de 5-6 mmol/L/hr. La tasa de consumo de oxígeno se determina según los métodos descritos en el documento WO 03/102.200.

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El gen de higromicina (y su terminador) se colocan en el plásmido pMI321 entre dos copias del promotor de IoPGK1, que sirven como secuencias de repeticiones directas.

Ejemplo 4D: Construcción de un plásmido (pMI355, Fig. 8) que tiene el casete del gen de higromicina de E. coli, el casete del gen LDH de L. helveticus, y la región flanqueante de 5' de IoPDC1A.

Se construye una biblioteca genómica de la cepa de tipo natural de I. orientalis de la ATCC PTA-6658 en el vector cósmido SuperCos1 (Stratagene) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Las secuencias similares a PDC se amplifican mediante PCR a partir del ADN genómico de la cepa con cebadores denominados SEQ. ID. Nº 55 y SEQ. ID. Nº 56. Se amplifica un fragmento de 700 pb de un gen PDC. La biblioteca genómica se criba mediante el uso de técnicas de hibridación con fragmentos de PCR marcados como sonda como se describió en el documento WO 03/049525, y los clones de cósmidos que contienen el gen PDC se aíslan y secuencian. La región de 5' de PDC1A de I. orientalis desde 1000 pb hasta 167 pb en posición anterior al inicio del marco de lectura abierto se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 57 y SEQ. ID. Nº 58 y el ADN del cósmido de PDC1A de I. orientalis como molde. El fragmento se corta con SalI y SacI. Un fragmento de 836 pb se aísla en gel y se liga con un fragmento de 6992 pb obtenido digiriendo el plásmido pMI321 (Fig. 7, Ejemplo 4C) con SalI y SacI. El plásmido resultante se denomina pMI355 (Fig. 8).

Ejemplo 4E: Construcción de plásmidos (pMI356 y pMI357 (Fig. 9)) que contienen la región flanqueante de 5' de IoPDC1A, el casete del gen de higromicina de E. coli, el casete del gen LDH de L. helveticus, y una región flanqueante de 3' de IoPDC1A.

La región de 3' de PDC1A de I. orientalis correspondiente a las secuencias desde 524 pb en posición anterior hasta 217 pb en posición posterior del codón de parada de la traducción de PDC se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 59 y SEQ. ID. Nº 60 y el ADN del cósmido de PDC1A de I. orientalis (Ejemplo 4D) como molde. El fragmento se corta con ApaI y SmaI. Se aísla en gel un fragmento de 630 pb y se liga a un fragmento de 7809 pb obtenido digiriendo el plásmido pMI355 (Fig. 8, Ej. 4D) con ApaI y SmaI. El plásmido resultante se denomina pMI357 (Fig. 9). Contiene los casetes de higromicina y LDH del plásmido pMI355 entre el flanco de 5' y una porción del flanco de 3' del gen IoPDC1A.

El plásmido pMI356 se construye de la misma manera, excepto porque se usa una sección diferente de la región de 3' de PDC1A de I. orientalis.

Ejemplo 4F: Construcción del plásmido pMI433 (Fig. 10) que contiene la región flanqueante de 5' de IoPDC1A, un casete del gen ScMEL5, el casete del gen LDH de L. helveticus y la región flanqueante de 3' de IoPDC1A.

El promotor de PGK1 de I. orientalis se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 61 y SEQ. ID. Nº 62 y el ADN genómico de I. orientalis como molde. El fragmento se rellena al usar la enzima Klenow y dNTP 0,1 mM, y después se corta con SphI. Se aísla en gel un fragmento de 669 pb. Un plásmido denominado pMI233 (descrito en la Fig. 23C del documento WO 03/049525) se corta con XhoI. El fragmento se rellena con la enzima Klenow y se corta con SphI. Se ligan los fragmentos de 4534 pb y de 669 pb, y el plásmido resultante se denomina pMI319. El plásmido pMI319 contiene el gen MEL5 de S. cerevisiae (ScMEL5) y la región promotora de IoPGK1.

El plásmido pMI319 se corta con ApaI, los extremos se hacen romos con polimerasa de T4, y se corta con NotI. Se aísla en gel un fragmento de 2317 pb. Se liga a un fragmento de 6498 pb obtenido digiriendo el plásmido pMI357 (Ejemplo 4E) con SalI, haciendo los extremos romos con la enzima Klenow y después cortando con NotI. El plásmido resultante contiene el gen ScMEL5 (con su terminador nativo) en lugar del gen de higromicina del plásmido pMI357. El plásmido resultante se denomina pMI433 (Fig. 10).

Ejemplo 4G: Construcción de los plásmidos pMI449 (Fig. 11) y pMI454 (Fig. 12) que contienen la región flanqueante de 5' de CYB2 de I. orientalis, el casete del gen ScMEL5 entre secuencias de repeticiones directas de K. thermotolerans y la región flanqueante de 3' de CYB2 de I. orientalis.

El plásmido pMM28 (Fig. 5, Ej. 4B) se digiere con BamHI, se rellena con la enzima Klenow, y se digiere con SalI. El fragmento de 4077 pb así obtenido se liga a un fragmento NotI (rellenado con la enzima Klenow)-SalI de 2317 pb de pMI433 (Fig. 10, Ej. 4F). El plásmido resultante se denomina pMI445.

La región flanqueante de 3' del gen de L-lactato:ferricitocromo c oxidorreductasa de I. orientalis (IoCYB2A) (que corresponde a las secuencias de 90 a 676 pb en posición posterior del inicio del marco de lectura abierto) se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 63 y SEQ. ID. Nº 64, mediante el uso de un clon de cósmido de CYB2-2 como molde. El producto de la PCR se digiere con SacI y SmaI, y el fragmento de 607 pb se liga al fragmento SacI -SmaI de 6386 pb del plásmido pMI445. El plásmido resultante se denomina pMI448.

La región flanqueante de 5' de IoCYB2A (que corresponde a las secuencias de 913 a 487 pb en posición anterior del inicio del marco de lectura abierto predicho) se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados

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como SEQ. ID. Nº 65 y SEQ. ID. Nº 66, de nuevo mediante el uso del clon de cósmido de CYB2-2 como molde. El producto de PCR se digiere con SphI, y el fragmento de 454 pb se liga al fragmento SphI de 6993 pb obtenido digiriendo parcialmente pMI448. El plásmido resultante se denomina pMI449 (Fig. 11).

La región flanqueante de 5' de IoCYB2A (que corresponde a las secuencias de 466 a 7 pb en posición anterior del marco de lectura abierto predicho) se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 67 y SEQ. ID. Nº 68, una vez más mediante el uso del clon de cósmido de CYB2-2 como molde. El producto de PCR se digiere con SphI, y el fragmento de 493 pb se liga al fragmento SphI de 6993 pb obtenido digiriendo parcialmente el plásmido pMI448. El plásmido resultante se denomina pMI453.

La región flanqueante de 3' de IoCYB2A (que corresponde a las secuencias desde 402 pb en posición anterior hasta 77 pb en posición posterior del codón de parada predicho) se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 69 y SEQ. ID. Nº 70, mediante el uso del cósmido de CYB2-2 como molde. El producto de la PCR se digiere con ApaI y SmaI, y el fragmento de 506 pb se liga al fragmento ApaI -SmaI de 6886 pb del plásmido pMI453. El plásmido resultante se denomina pMI454 (Fig. 12).

Ejemplo 4H: Construcción de un plásmido (pBH165, Fig. 13) que contiene un fragmento en posición anteriordel gen IoGPD1, una primera sección de repeticiones directas de K. thermotolerans, un casete del gen MEL5, una segunda sección de repeticiones directas de K. thermotolerans, y un fragmento en posición posterior del gen IoGPD1.

El plásmido pMI449 se digiere con NdeI y SbfI para escindir la homología flanqueante de CYB2A de 5'. Un fragmento de 6,8 kpb se purifica en gel y se desfosforila. Un fragmento de 302 pb del gen IoGPD1 del Ejemplo 4A (que corresponde a los pares de bases 1-302 desde el codón de inicio del gen) se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 71 y SEQ. ID. Nº 72. El producto de PCR se purifica en gel, se digiere con NdeI y SbfI, y se liga al fragmento de 6,8 kpb del plásmido pMI449 para producir el plásmido pBH164. El plásmido pBH164 se digiere después con XmaI y EcoRI para escindir la homología flanqueante de CYB2A de 3'. Un fragmento de 6,5 kpb se purifica en gel y se desfosforila. Un fragmento de 346 pb del gen IoGPD1 del Ejemplo 4A (que corresponde a los pares de bases 322-668 desde el codón de inicio) se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 73 y SEQ. ID. Nº 74. El producto de PCR se purifica en gel, se digiere con XmaI y EcoRI, y se liga al fragmento de 6,5 kpb obtenido de pBH164 para producir pBH165 (Fig. 13).

El plásmido pBH165 contiene, por orden de transcripción, el fragmento de 302 pb del gen IoGPD1, una primera sección de repeticiones directas de K. thermotolerans, un casete del gen MEL5, una segunda sección de repeticiones directas de K. thermotolerans, y el fragmento de 346 pb del gen IoGPD1. Se diseña para la inserción en el locus del gen IoGPD1 nativo (con la alteración del gen), seguido de una eliminación por formación de bucle del casete del gen MEL5.

Ejemplo 4I: Generación de un mutante de I. orientalis (CD1184) con los genes IoPDC1A y IoPDC1B delecionados y el gen LhLDH integrado en una etapa transformando la cepa de I. orientalis de tipo natural con el plásmido pMI356 (Ej. 4F).

La cepa de I. orientalis de tipo natural de la ATCC PTA-6658 se transforma con el plásmido pMI356 mediante el uso de métodos estándar. Se cultivan las cepas transformadas que crecen en placas de higromicina. Se selecciona un transformante que no produce etanol para un análisis de Southern, que confirma la deleción de ambos alelos de IoPDC1A y la inserción de al menos una copia del gen LhLDH. Esta cepa se denomina CD1184.

Ejemplo 4J: Generación de la cepa mutante de I. orientalis (CD1496) transformando sucesivamente la cepa CD1184 (Ej. 4I) con los plásmidos pMI449 (Ej. 4G, Fig. 11) y pMI454 (Ej. 4G, Fig. 12), seguido de mutagénesis.

La cepa CD1184 se transforma con el plásmido pMI449 mediante el uso del método de acetato de litio y los transformantes (colonias azules) se seleccionan basándose en la actividad de melibiasa en placas de YPD X-α-gal. La sustitución del gen IoCYB2A de la cepa CD1184 se confirma mediante PCR de las colonias y un análisis de Southern en algunos de los transformantes. El marcador MEL5 se elimina por formación de un bucle de uno de esos transformantes a través de un evento de recombinación homóloga por medio de las secuencias de repeticiones de

K. thermotolerans, tal como se confirma mediante análisis de Southern. El segundo alelo de CYB2A se deleciona después en este transformante mediante el uso del plásmido pMI454. Los transformantes se analizan mediante PCR de las colonias con respecto a la ausencia de un producto de PCR específico de CYB2A de 1000 pb. El marcador MEL5 del plásmido pMI454 se elimina por formación de un bucle de un transformante que tiene una deleción del segundo alelo de CYB2A por medio de recombinación como antes. Este transformante se denomina cepa CD1436. La cepa CD1436 tiene una deleción de ambos genes PDC1 (con la sustitución por un casete del gen L-LDH funcional), y una deleción de cada uno de sus dos genes IoCYB2 nativos.

La cepa CD1436 se somete a mutagénesis con EMS mediante el uso de las condiciones expuestas en el Ejemplo 1A, excepto porque las condiciones de exposición son 8 µL durante 1 hora. Las células mutagenizadas se dejan recuperar durante 6 horas en 200 µL de medios de YP + 20 g/L de glucosa, y después se colocan en placas con PDA + 35 g/L de ácido láctico y se incuban durante una semana a 30 °C. Una cepa que produce más lactato y menos glicerol que la cepa CD1436 se denomina cepa CD1496.

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de carbono para la cepa CD1184 son 2,1%, 9,3% y 15,9%, respectivamente. El rendimiento de biomasa es del 3,2%.

Estos resultados muestran que, en estas condiciones de fermentación, la deleción de los genes IoGPD1 nativos impide que la célula produzca cantidades medibles de glicerol. Como antes, la deleción de este gen (y la carencia resultante de producción de glicerol) tiene poco o ningún efecto sobre el crecimiento celular.

Ejemplo 6: Cultivo discontinuo microaerobio de las cepas CD1184 (Ej. 4I) y CD1688 (Ej. 4L) a una OUR de 9,9

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Las cepas CD1688 y CD1184 se cultivan por separado de la manera general descrita en el Ejemplo 5, excepto porque se seleccionan las condiciones de ventilación para alcanzar una tasa de consumo de oxígeno de 9,9-10,0 mmol/L/hr, y no se alimenta glucosa en el sistema durante el cultivo. Se añaden cortezas de levadura al cultivo de la cepa CD1688.

En estas condiciones, la cepa CD1184 produce lactato a una velocidad de 1,87 g/L-hr hasta que el título de lactato es aproximadamente 70 g/L. El rendimiento de lactato en ese punto es de alrededor del 73%. La producción para esta cepa se detiene después de 67,5 horas, en cuyo momento la concentración de glucosa en el caldo de fermentación se ha reducido desde 60 g/L hasta 2,1 g/L. La velocidad global de producción de lactato es 1,43 g/L-hr, y el rendimiento total de lactato es del 70%. Los rendimientos de piruvato, glicerol y dióxido de carbono para la cepa CD1184 son 2,1%, 5,7% y 21,5%, respectivamente. El rendimiento de biomasa es del 4,4%.

La cepa CD1688 produce lactato a una velocidad de 1,68 g/L-hr hasta que el título de lactato es aproximadamente 70 g/L. El rendimiento de lactato en ese punto es de alrededor del 80%. La producción para esta cepa se detiene después de 78 horas, en cuyo momento la concentración de glucosa en el caldo de fermentación se ha reducido desde 53,5 g/L hasta 4,8 g/L. La velocidad global de producción de lactato es 1,26 g/L-hr, y el rendimiento total de lactato es del 77%. Los rendimientos de piruvato, glicerol y dióxido de carbono para la cepa CD1688 son 1,2%, 0% y 23,2%, respectivamente. El rendimiento de biomasa es del 5,95%. Como antes, estos resultados muestran que, en estas condiciones de fermentación, la deleción de los genes IoGPD1 nativos impide que la célula produzca cantidades medibles de glicerol y que la deleción de este gen (y la carencia resultante de producción de glicerol) no tiene efecto sobre el crecimiento de la célula. Además, la deleción de IoGPD1 mejora el rendimiento global de lactato.

Ejemplo 7: Cultivos discontinuos microaerobios de la cepa CD1690 (Ej. 4L) a una OUR de 5-6.

La cepa CD1690 se cultiva de la manera general descrita en el Ejemplo 5, excepto porque las condiciones de ventilación se seleccionan para alcanzar una tasa de consumo de oxígeno de 5,75 mmol/L/hr, y el medio de fermentación es YP + 70 g/L de glucosa.

En estas condiciones, la cepa CD1690 produce lactato a una velocidad de 0,66 g/L-hr hasta que el título de lactato es aproximadamente 70 g/L. El rendimiento de lactato en ese punto es de alrededor del 78%. La producción para esta cepa se detiene después de 121 horas, en cuyo momento la concentración de glucosa en el caldo de fermentación se ha reducido a 23,8 g/L (de los 127,9 g/L proporcionados al cultivo). La velocidad global de producción de lactato es 0,61 g/L-hr, y el rendimiento total de lactato es del 77%. Los rendimientos de piruvato, glicerol y dióxido de carbono son 0%, 0% y 31,1%, respectivamente. El rendimiento de biomasa es del 2,4%. De nuevo, estos resultados muestran que, en estas condiciones de fermentación, la deleción de ambos alelos de IoGPD1 nativos impide que la célula produzca cantidades medibles de glicerol, y tiene poco o ningún efecto sobre el cultivo celular.

La cepa CD1690 se cultiva dos veces más de la manera general descrita en el Ejemplo 5 (mediante el uso del medio definido descrito ahí), excepto porque la OUR es 5,2 mmol/L/hr y se añade glicerol al caldo de fermentación. En el primer cultivo se añaden 0,1 g/L de glicerol, y se añaden 1,0 g/L de glicerol en el segundo cultivo.

Cuando se añaden 0,1 g/L de glicerol, la cepa CD 1690 produce lactato a una velocidad de 0,74 g/L-hr hasta que el título de lactato es aproximadamente 70 g/L. El rendimiento de lactato en ese punto es de alrededor del 78%. La producción para esta cepa se detiene después de 121 horas, en cuyo momento la concentración de glucosa en el caldo de fermentación se ha reducido a 10,2 g/L (de los 117,8 g/L proporcionados al cultivo). La velocidad global de producción de lactato es 0,68 g/L-hr, y el rendimiento total de lactato es del 76%. Los rendimientos de piruvato, glicerol y dióxido de carbono son 0,2%, 0% y 25,3%, respectivamente. El rendimiento de biomasa es del 4,1%.

Se obtienen resultados muy similares cuando se añaden 1,0 g/L de glicerol.

Estos resultados muestran inesperadamente que la adición de glicerol al medio de fermentación tiene poco o ningún efecto sobre la capacidad de estos transformantes de crecer y producir lactato, a pesar de la alteración de la capacidad nativa de las células de producir glicerol.

Ejemplo 8A: Construcción de un plásmido (pTMC61 (Fig. 14)) que contiene la región flanqueante de 5' de IoGPD1, el casete del gen de higromicina de E. coli entre repeticiones directas, y la región flanqueante de 3'de IoGPD1.

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El casete del gen de higromicina se amplifica mediante PCR con el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 83 y SEQ. ID. Nº 84, con el plásmido pMI356 (Ej. 4E, véase la Fig. 9) como molde. Las condiciones de la PCR son 95 °C durante 5 minutos (una vez), 30 ciclos de 95 °C (30 segundos), 56 °C (30 segundos) y 72 °C (2 minutos), seguido de un ciclo de 72 °C durante 10 minutos. El producto de PCR resultante se digiere con SpeI y SalI, y se liga en el plásmido pBH165 (Ej. 4H, Fig. 13), que se ha digerido de forma similar, para producir el plásmido pTMC61 (Fig. 14).

Ejemplo 8B: Transformación de la cepa de I. orientalis de tipo natural seleccionada con el plásmido pBH165(Ej. 4H, Fig. 13), seguido de eliminación por formación de bucle del marcador de selección para producir la cepa transformante CD2624, que tiene un único alelo de GPD1 delecionado.

La cepa de I. orientalis de tipo natural de la ATCC PTA-6658 se cultiva durante muchas generaciones en un cultivo continuo en un medio que contiene una concentración baja de glucosa y una concentración elevada de ácido láctico. Se aísla una célula que crece bien en estas condiciones y se denomina cepa CD1822. La cepa CD1822 produce etanol y glicerol cuando se cultiva en un medio que contiene glucosa como fuente de carbono. La cepa CD1822 se cultiva y se transforma con el plásmido pBH165 de la misma manera que se describió en el Ejemplo 4K. Los transformantes se seleccionan en placas de base nitrogenada para levaduras (YNB) + 2% de melibiosa cubiertas con x-α-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-galactopiranósido), como se describió en el Ejemplo 4K, y se recoge una colonia azul y se vuelve a sembrar en placas de YP + 20 g/L de glucosa. Se aísla el ADN genómico del transformante, y se analiza con respecto a la integración de la construcción de deleción mediante dos grupos de reacciones de PCR. El primero de estos usó los cebadores denominados SEQ. ID. Nº 85 y SEQ. ID. Nº 86, y el segundo de estos se llevó a cabo con los cebadores denominados SEQ. ID. Nº 87 y SEQ. ID. Nº 88. Estos produjeron productos de PCR de 2,0 kpb y 1,4 kpb, respectivamente, lo que indica que se ha alterado uno de los alelos de GPD1. Se lleva a cabo una tercera reacción de PCR, mediante el uso de los cebadores denominados SEQ. ID. Nº 85 y SEQ. ID. Nº 88; esto produce un producto de 0,8 kpb, lo que indica que todavía hay un alelo de GPD1 inalterado en el transformante. El transformante se denomina cepa CD2624.

Ejemplo 8C: Transformación de la cepa CD2624 (Ej. 8B) con el plásmido pTMC61 (Ej. 8A, Fig. 14) para producir cepas transformantes CD2627, que tienen ambos alelos de IoGPD1 delecionados.

Se lleva a cabo una PCR mediante el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 89 y SEQ. ID. Nº 90, con el plásmido pTMC61 como molde. Se obtiene un fragmento de 4,1 kpb, y se usa para transformar la cepa CD2624. Los transformantes se seleccionan con YPD + 300 µg/ml de higromicina. Se aísla el ADN genómico de 100 de los transformantes, y se usa como molde en tres grupos de reacciones de PCR. El primero usa los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 91 y SEQ. ID. Nº 88, y produce un producto de 1,5 kpb en 30 de los transformantes. Se lleva a cabo una segunda reacción de PCR con ADN genómico de esos 30 transformantes mediante el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 85 y SEQ. ID. Nº 92. Diez cepas exhibieron el producto esperado de 2,5 kpb. El ADN genómico de esas diez cepas se analiza después mediante el uso de los cebadores identificados como SEQ. ID. Nº 85 y SEQ. ID. Nº 88. Dos cepas que no producen un fragmento de 0,8 kpb tienen ambos alelos de GPD1 alterados. Estas se ensayan con respecto al cultivo en placas de YNB + 2,0% de melibiosa. Una cepa es capaz de crecer, y se denomina cepa CD2627.

Ejemplo 8D: Cultivo microaerobio de la cepa CD1822, cepa CD2624 (Ejemplo 8B) y cepa CD2627 (Ejemplo 8C).

Las cepas CD1822, CD2624 y CD2627 se cultivan en fermentaciones microaerobias en matraz de agitación por duplicado. Las cepas se cultivan durante la noche en 25 mL de un medio definido que contiene ~100 g/mL de glucosa, a 30 °C y agitación a 250 rpm en matraces con deflectores de 250 mL. El medio definido es como se describió en Peter M. Bruinenberg, Johannes P. Van Dijken y W. Alexander Schefferes, 1983, An Enzymatic Analysis of NADPH Production and Consumption in Candida utilis, J. General Microbiology vol. 129, págs. 965-971, excepto por la presencia de glucosa adicional tal como se indica, y un incremento de ácido nicotínico hasta 5 mg/L.

Los cultivos resultantes se usan para inocular 50 mL del medio definido que contiene 100 g/L de glucosa en matraces con deflectores de 250 mL hasta una DO600 de 0,2. Estos matraces se incuban después a 100 rpm durante 22 horas a 30 °C. En el medio se analiza después el contenido de glucosa, glicerol y etanol mediante HPLC. También se determina el rendimiento de biomasa.

La cepa CD1822 consume toda la glucosa durante el cultivo de 22 horas, y produce 6,0 g/kg de glicerol, 34,54 g/kg de etanol y biomasa hasta una DO600 de 14,8.

La cepa CD2624, que tiene una alteración de un alelo de GPD1, consume toda la glucosa, produce 5,88 g/kg de glicerol y 35,25 g/kg de etanol. Se produce biomasa hasta una DO600 de 14,5.

La cepa CD2627, que tiene una alteración de ambos alelos de GPD1, consume toda la glucosa excepto 12,39 g/kg durante 22 horas. La producción de glicerol es de 0,34 g/kg. La producción de etanol es de 23,06 g/kg, y se produce biomasa hasta una DO600 de 11,5. Estos resultados indican que la alteración de los alelos de GPD1 en I. orientalis da como resultado una pequeña reducción de las velocidades de consumo de glucosa, y una pequeña reducción de la producción de etanol y la producción de biomasa en estas condiciones. Sin embargo, la cepa CD2627 crece bien

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