ES2294781T3 - Transferencia de adn mediada por virus mejorada. - Google Patents
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Abstract
METODO PARA AUMENTAR LA EFICACIA DE LA TRANSDUCCION DE CELULAS HEMATOPOYETICAS Y OTRAS CELULAS MEDIANTE RETROVIRUS QUE INCLUYE LA INFECCION DE LAS CELULAS EN PRESENCIA DE FIBRONECTINA O DE FRAGMENTOS DE FIBRONECTINA. COMO SE PUEDE VER EN EL GRAFICO, LA FIBRONECTINA Y LOS FRAGMENTOS DE FIBRONECTINA MEJORAN SIGNIFICATIVAMENTE LA TRANSFERENCIA GENICA MEDIADA RETROVIRALMENTE A LAS CELULAS, ESPECIALMENTE LAS CELULAS HEMATOPOYETICAS QUE INCLUYEN PROGENITORES COMPROMETIDOS Y CELULAS MADRE HEMATOPOYETICAS PRIMITIVAS. LA INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA METODOS MEJORADOS PARA LA TERAPIA GENICA SOMATICA BASADA EN LA MEJORA DE LA TRANSFERENCIA GENICA, POBLACIONES CELULARES HEMATOPOYETICAS, Y NUEVAS CONSTRUCCIONES PARA MEJORAR LA TRANSFERENCIA DE DNA MEDIADA RETROVIRALMENTE DENTRO DE LAS CELULAS ASI COMO SU USO.
Description
Transferencia de ADN mediada por virus
mejorada.
La presente invención se refiere generalmente a
métodos para incrementar la eficiencia de la transducción de
células por virus, y más particularmente a métodos para incrementar
la transferencia genética en células mediada por virus utilizando
fibronectina o fragmentos de fibronectina.
El progreso para entender la base molecular de
varias enfermedades humanas así como la mejora en la tecnología de
la transferencia genética ha conducido a los intentos recientes de
desarrollar protocolos para la terapia genética somática para
enfermedades genéticas graves. Actualmente, los candidatos de
enfermedades prometedores para la terapia genética humana incluyen
aquellos en que un enzima u otra proteína está defectuoso o falta,
donde el nivel de enzima o de proteína no necesita estar regulado
exactamente, especialmente aquellos que se regulan
constitutivamente, y aquellos defectos que se encuentran en la
médula ósea del paciente.
Por ejemplo, un candidato de enfermedad para la
terapia genética es la deficiencia de la adenosina desaminasa (ADA)
que resulta en la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave
(SCID). Los patientes deficientes en ADA tienen poca enzima o no la
tienen detectable en las células de la médula ósea. Sin embargo, se
ha curado la deficiencia en ADA mediante el transplante de médula
ósea adecuado. Las células de normales en ADA poseen una ventaja
selectiva sobre las células deficientes en ADA y normalmente
repoblarán la médula ósea del paciente.
Las células de la médula ósea son un buen
objetivo para la terapia genética somática porque se manipula
fácilmente el tejido de médula espinal in vitro y contienen
células repobladoras. Alternativamente, también se ha demostrado
previamente que la sangre del cordón umbilical contiene un gran
número de células progenitoras primitivas. Una transferencia
genética exitosa en células madre hematopoyéticas, las células
repobladoras a largo plazo, puede conducir a curas a lo largo de
una vida para una variedad de enfermedades manifestadas en la
progenie de estas células.
Se ha conseguido la transferencia genética, y la
expresión genética a largo plazo, en células madre repobladoras en
modelos de murino mediante un número de investigadores. Sin embargo,
los experimentos in vivo en animales más grandes, tales como
perros y primates, se han encontrado con un éxito limitado, debido
ampliamente a la baja eficiencia de la infección de las células
madre hematopoyéticas. Se han complicado aún más las limitaciones
de la tecnología de transferencia genética actual cuando se aplican
a protocolos humanos mediante varios factores, incluyendo los
números pequeños de células madre presentes en la médula ósea adulta
(ABM), la falta de métodos adecuados para purificar estas células,
y la fracción baja de tales células primitivas en el ciclo
celular.
Tanto en los experimentos con animales grandes
como con murinos que implican células de médula ósea, se ha
comentado que los protocolos más exitosos utilizan el cocultivo de
las células objetivo con líneas celulares productoras retrovirales.
También, la mayoría de las pruebas de transferencia genética
aprobadas por la FDA en humanos se basan en vectores retrovirales
recombinantes para la transducción genética. Los vectores
retrovirales recombinantes son deseables para la terapia genética
porque transfieren eficientemente e integran de un modo preciso y
estable el ADN exógeno en el ADN celular. Estos vectores contienen
ADN exógeno para la transferencia genética y se modifican aún más
para eliminar la patogenicidad viral. Debido a estas modificaciones,
se lleva a cabo generalmente la producción viral usando células de
empaquetamiento de retrovirus. Sin embargo, para la terapia
genética clínica, la transducción libre de células es más deseable
debido a las preocupaciones sobre la bioseguridad y el control de
calidad. Desafortunadamente, en general no ha sido posible la
transferencia genética eficiente en células hematopoyéticas tales
como las células madre sin el cocultivo con células productoras de
virus.
Recientemente, se ha mostrado que se puede
incrementar la eficiencia de la transferencia genética exponiendo
las células objetivo a células del estroma durante la infección. Las
células del estroma son un componente mayoritario del microentorno
hematopoyético (HM). El HM consiste en una red organizada de
macrófagos, células del estroma, células endoteliales, adipocitos y
una matriz extracelular compleja (ECM) formada a partir de una
variedad de moléculas de adhesión definidas. Las moléculas ECM tales
como la laminina, el colágeno, la trombospondina, los
proteoglicanos, los glicosaminoglicanos y la fibronectina
proporcionan lugares de anclaje tanto para las células
hematopoyéticas como para los factores de crecimiento. El mecanismo
que determina este efecto promotor del estroma durante la infección
retroviral no está claro, pero se ha sabido durante algún tiempo
que la regulación fisiológica de la proliferación y de la
diferenciación de las células hematopoyéticas ocurre cuando estas
células están en contacto directo con las células del HM.
La transferencia genética eficiente en células
madre hematopoyéticas repobladoras a largo plazo y en otras células
sigue siendo problemática, inhibiendo la aplicación generalizada de
los protocolos de transferencia genética para la terapia curativa
de enfermedades hematopoyéticas y otras en la actualidad. Persiste
una necesidad de métodos para la transferencia eficiente de
material genético en células de mamíferos sin los peligros y
limitaciones de los métodos del pasado. La presente invención se
dirige hacia estas necesidades.
Brevemente, una representación preferida de esta
invención proporciona un método para incrementar la frecuencia de
la transducción de las células hematopoyéticas mediante un vector
retrovirus. El método incluye infectar células hematopoyéticas
viables con un vector retrovirus recombinante defectuoso en la
replicación en presencia de fibronectina y/o fragmentos de
fibronectina sustancialmente puros efectivos para incrementar la
frecuencia de la transducción celular por el retrovirus. Se puede
derivar la fibronectina y/o los fragmentos de fibronectina a partir
de materiales que se pueden encontrar naturalmente o se pueden
derivar sintéticamente (e.g. modificados mediante ingeniería
genética a través de técnicas de síntesis química o recombinante), o
a partir de una combinación de materiales que se pueden encontrar
naturalmente y sintéticos. Además, se entenderá que el polipéptido o
los polipéptidos de fibronectina que se utilizan en la invención
pueden incluir mutaciones en la secuencia de aminoácidos de la
fibronectina que se pueden encontrar naturalmente que proporcionan
sin embargo polipéptidos funcionales que poseen las propiedades de
adhesión necesarias para conseguir una transducción mejorada de
acuerdo con la invención.
Otra representación preferida de la invención
proporciona un método para producir células hematopoyéticas
transducidas que incluye la infección de células hematopoyéticas
viables con un retrovirus recombinante defectuoso en la replicación
que lleve ADN exógeno en presencia de fibronectina inmovilizada,
fragmentos de fibronectina inmovilizados, o una mezcla inmovilizada
de estos en cantidades efectivas para incrementar la frecuencia de
la transducción celular por el retrovirus.
Otra representación preferida de la invención
proporciona un método mejorado para el injerto celular. El método
incluye los pasos para obtener células hematopoyéticas viables a
partir de un donante animal; para infectar las células
hematopoyéticas con un vector retrovirus recombinante para producir
células hematopoyéticas viables transducidas, estando el agente
infectante en presencia de fibronectina y/o de un fragmento suyo de
forma inmovilizada y efectiva para incrementar la frecuencia de la
transducción, y para introducir las células hematopoyéticas viables
transducidas en un recipiente animal como un injerto celular. De un
modo preferido se pueden introducir las células infectadas en un
donante autólogo.
Otra representación preferida de la presente
invención proporciona un método para obtener células de sangre del
cordón umbilical transducidas adecuadas para un procedimiento de
injerto celular. El método incluye la infección de células
hematopoyéticas a partir de la sangre del cordón umbilical con un
vector retrovirus recombinante defectuoso en la replicación en
presencia de una cantidad inmovilizada efectiva de fibronectina y/o
de fragmentos de fibronectina para incrementar la frecuencia de la
transducción de las células hematopoyéticas mediante el vector
retrovirus. La invención también incluye poblaciones celulares
transducidas viables a partir de la sangre del cordón umbilical
obtenible mediante tal método, y los métodos de injerto celular que
incluyen introducir las poblaciones celulares transducidas en un
animal en forma de injerto celular.
De acuerdo con aspectos más específicos de las
representaciones de la invención que se han mencionado arriba, la
fibronectina o el fragmento de fibronectina que se utilicen
contendrán una primera secuencia de aminoácidos que proporcione la
actividad de enlace retroviral del dominio de unión de la
Heparina-II de la fibronectina, y una segunda
secuencia de aminoácidos que proporcione la actividad de enlace
celular del dominio CS-1 de la fibronectina. El uso
de estos dos dominios de enlace de la fibronectina juntamente ha
demostrado que incrementa significativamente la eficiencia de la
transducción de las células objetivo por el retrovirus.
Otra representación preferida de la invención
proporciona un método para producir un constructo para incrementar
la frecuencia de transducción de una célula objetivo predeterminada
mediante un vector retrovirus. El método incluye el paso de acoplar
covalentemente un ligando que se enlaza a dicha célula objetivo a un
polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que
proporciona la actividad de enlace retroviral del dominio de unión
de la Heparina-II de la fibronectina. La presente
invención también incluye métodos que implican la utilización de
estos constructos para incrementar la frecuencia de transducción de
las células objetivo predeterminadas mediante un vector retrovirus,
y para los procedimientos de injerto utilizando las células
transducidas.
Otra representación preferida de la invención
proporciona un método para localizar una cantidad de un virus, que
comprende incubar un medio que contiene el virus en presencia de una
cantidad inmovilizada efectiva de fibronectina o de fragmentos de
fibronectina que contienen la actividad enlazante viral del dominio
de unión de la Heparina-II de la fibronectina para
localizar una cantidad del virus.
Otras representaciones todavía preferidas de la
invención proporcionan generalmente cultivos celulares
hematopoyéticos viables transducidos y otros cultivos celulares que
contienen fibronectina o fragmentos suyos sustancialmente puros y/o
inmobilizados, así como kits para llevar a cabo la transferencia de
ADN en células mediada por retrovirus, tal como se describió más
ampliamente en los pasajes que siguen.
Es un objeto de esta invención proporcionar
métodos para la infección retroviral eficiente de células de
mamíferos.
Es otro objeto más de esta invención
proporcionar métodos para la transferencia genética con vectores
retrovirales que eviten la necesidad del cocultivo.
\newpage
Es otro objeto más de esta invención
proporcionar métodos mejorados y cultivos celulares para la
autoplastia celular y/o el injerto celular alogénico.
Estos y otros objetos, ventajas, y
características de la invención serán fácilmente aparentes para el
artesano con habilidad a partir de la siguiente descripción.
La Fig. 1 proporciona una representación
esquemática de una molécula de fibronectina, incluyendo fragmentos
quimotrípticos.
La Fig. 2 muestra la eficiencia de la infección
de las células progenitoras humanas comprometidas en presencia de
fragmentos de fibronectina usando el vector TKNEO, tal como se
describe más ampliamente en el Ejemplo 1,
infra.
infra.
La Fig. 3 compara la eficiencia de la infección
de varias células progenitoras hematopoyéticas humanas comprometidas
en presencia de fragmentos de fibronectina suyos usando el vector
TKNEO, tal como se describe más ampliamente en el Ejemplo 1,
infra
La Fig. 4 compara la presencia de hADA en
ratones a los que se han injertado células de médula ósea
transducidas mediante (i) el método de cocultivo (calles
2-4), (ii) infección sobrenadante en presencia de
fragmentos de fibronectina inmovilizados (calles
5-7), e infección sobrenadante sobre BSA (calles
8-10), tal como se describe más ampliamente en el
Ejemplo 7, infra. Se muestran los controles para el hADA en
las calles 1 y 12 y para el ADA de murino en la calle 11.
La Fig. 5 demuestra la unión retroviral a los
fragmentos de fibronectina, tal como se describe más ampliamente en
el Ejemplo 8, infra.
La Fig. 6 demuestra que la unión retroviral a
los fragmentos de fibronectina es dependiente de la dosis, tal como
se describe más ampliamente en el Ejemplo 8, infra.
La Fig. 7 demuestra un diagrama esquemático que
ilustra varios fragmentos de fibronectina recombinantes que se usan
en los Ejemplos 9-11, infra.
La Fig. 8 muestra la unión del retrovirus a
varios fragmentos de fibronectina, incluyendo a varios fragmentos
recombinantes, tal como se describe en el Ejemplo 9,
infra.
La Fig. 9 demuestra que la heparina bloquea la
unión del retrovirus a los fragmentos de fibronectina, tal como se
describe en el Ejemplo 9, infra.
La Fig. 10 muestra la eficiencia de la infección
del retrovirus de las células hematopoyéticas de murino en
presencia de varios fragmentos de fibronectina, tal como se informa
más ampliamente en el Ejemplo 10, infra.
La Fig. 11 compara la presencia de hADA en
ratones injertados con células de médula ósea transducidas mediante
(i) el método de cocultivo, (ii) la infección sobrenadante sobre
varios fragmentos de fibronectina, y (iii) la infección
sobrenadante sobre BSA, tal como se describe en el Ejemplo 11,
infra.
Con el propósito de favorecer un entendimiento
de los principios de la invención, ahora se hará referencia a
ciertas representaciones suyas y se usará un lenguaje específico
para describir lo mismo. Sin embargo se entenderá que no se
pretende de este modo ninguna limitación del alcance de la
invención, contemplando tales alteraciones, más modificaciones y
tales aplicaciones de los principios de la invención tal como se
ilustran aquí tal como se le ocurriría normalmente a uno con
habilidad en la técnica a la que se refiere la invención.
Tal como se indicó arriba, la presente invención
proporciona métodos para incrementar la frecuencia de la
transducción de células viables mediante virus tales como los
retrovirus. La invención también proporciona métodos para la
transferencia genética eficiente en células viables usando vectores
retrovirales recombinantes, métodos para obtener células
transducidas, y métodos y materiales para conseguir injertos
autólogos y otros injertos celulares.
Una característica de la presente invención es
el descubrimiento de que la fibronectina (FN), y los fragmentos de
fibronectina que contienen el dominio de adhesión celular
CS-1 de FN, mejoran significativamente la
transferencia genética mediada por un retrovirus en células tales
como las células hematopoyéticas, e.g. células madre
hematopoyéticas primitivas y progenitoras comprometidas o células
iniciadoras de cultivos a largo plazo (LTC-IC), que
llevan un receptor de fibronectina y que de este modo exhiben la
capacidad para unir la fibronectina o fragmentos suyos.
Ventajosamente, esta eficiencia incrementada hace que el cocultivo
con células productoras de virus sea innecesario. Otras
características de la invención se concentran en el descubrimiento
de un dominio de unión viral de fibronectina localizado dentro del
dominio de unión de la Heparina-II. Se puede usar
este dominio de unión viral para localizar las partículas de virus
en varias aplicaciones, incluyendo por ejemplo en un rango amplio
de constructos para liberar el virus sobre una célula objetivo.
Los vectores virales recombinantes de acuerdo
con ciertos aspectos preferidos de la presente invención contienen
ADN exógeno y no son patogénicos, i.e. defectuosos en la
replicación. Estos vectores transfieren eficientemente e integran
de modo preciso y estable ADN exógeno en el ADN celular de las
células huésped tales como las células animales, particularmente
las células de mamíferos. Por ejemplo, se puede incorporar en la
presente invención una secuencia de nucleótidos que incluya una
corrida de bases de la secuencia de codificación del gen de interés
en un vector retroviral recombinante bajo el control de un promotor
adecuado para conducir a los genes, típicamente un promotor
exógeno. En este sentido, el ADN exógeno puede contener ADN que se
haya producido ya sea natural o bien artificialmente, y puede estar
formado a partir de partes derivadas de fuentes heterólogas, cuyas
partes pueden ser moléculas que se pueden encontrar naturalmente o
bien estén sintetizadas químicamente, y donde se han unido aquellas
partes mediante ligadura u otros medios conocidos en la técnica. Tal
como se indica, la secuencia de nucleótidos introducida estará bajo
el control de un promotor y de este modo normalmente estará en
dirección 3' respecto el promotor. Si se establece alternativamente,
la secuencia de promotor normalmente estará en dirección 5'
(i.e. en el final 5') de la secuencia de codificación. En
esta parte, se conoce bien que pueden haber o no otros elementos
regulatorios (e.g. secuencias potenciadoras) que cooperan con
el promotor y un codón de inicio transcripcional para conseguir la
transcripción de la secuencia de codificación exógena. La frase
"bajo el control de" contempla la presencia de otros elementos
que son necesarios para conseguir la transcripción del gen
introducido. También, el ADN recombinante incluirá preferiblemente
una secuencia de terminación en dirección 3' a partir de la
secuencia de codificación.
Se pueden usar vectores retrovirales que
incluyen ADN exógeno que proporcionan un marcador seleccionable u
otra ventaja seleccionable. Por ejemplo, los vectores pueden
contener uno o más genes exógenos que proporcionen resistencia a
varios agentes de selección incluyendo antibióticos tales como la
neomicina. Los vectores representativos que se pueden usar en la
invención incluyen por ejemplo el vector N_{2}/ZipTKNEO (TKNEO)
(título: 1 x 10^{5} G418^{r} cfu/ml sobre células NIH 3T3), el
vector ZipPGK-hADA, y el vector
ZipPGK-mADA, todos tal como informó anteriormente
Moritz et al. (1993) J. Exp. Med. 1778:529. En
el vector TKNEO, se expresan las secuencias de neo fosfotransferasa
en la orientación del sentido (relativo a la repetición LTR terminal
larga 5') a través del promotor de la timidina quinasa del herpes
simplex. Este vector contiene un gen marcador seleccionable que
proporciona resistencia a la neomicina para facilitar la
identificación de las células transducidas. En el vector
ZipPGK-hADA, se expresa el cADN ADA ("hADA") en
la orientación de sentido relativa al LTR5' a través del promotor
de la fosfogliceratoquinasa humana (PGK). Contiene únicamente una
secuencia genética expresable y carece de un marcador seleccionable
dominante. El vector ZipPGK-mADA
(PGK-mADA) es idéntico al vector
ZipPGK-hADA excepto en que se ha sustituido el cADN
ADA con ADN ("mADA") ADA de murino. Estos y otros vectores
virales y técnicas para su producción son bien conocidos y el uso
en la presente invención estará incluido dentro de las habilidades
de aquellos con práctica en la técnica dado lo aquí expuesto.
Los vectores virales que se utilizan en la
invención exhiben la capacidad de enlazarse a una secuencia de
aminoácidos del dominio de unión de la Heparina-II
de la fibronectina, incluyendo la de la fibronectina humana. Tal
como se discute en los pasajes que siguen, aunque la presente
invención no está limitada por ninguna teoría, se cree que la
colocalización del virus y de la célula objetivo a través de la
unión del virus y de la célula a los dominios funcionales
respectivos facilita una mejora en la transducción de la célula por
el virus. En este sentido, se puede averiguar fácilmente la
capacidad de un virus para enlazarse a la secuencia de aminoácidos
del dominio de unión de la Heparina-II y de este
modo servir eficientemente en la invención usando procedimientos de
rutina tales como aquellos que se describen en los Ejemplos 8 y 9 de
abajo. Hablando en general, estos ensayos determinan el punto hasta
el que las partículas de virus están enlazadas a polipéptidos
inmovilizados que contienen el dominio de unión de la
Heparina-II, para resistir el lavado de la matriz de
polipéptido inmovilizada. Brevemente, por ejemplo, se puede incubar
un sobrenadante que contenga un virus en una cavidad que contenga
un polipéptido inmovilizado incluyendo el dominio de enlace de la
Heparina-II de la fibronectina. Entonces se lava
extensivamente la cavidad con tampón salino fisiológico, después de
lo que se incuban las células objetivo del virus en la cavidad para
determinar el nivel de actividad infecciosa que permanece en la
cavidad. Se estima la reducción de la actividad infecciosa, o el
título, relativa al sobrenadante viral inicial y se compara con la
de una réplica de control similar (e.g. usando una cavidad
recubierto con BSA). Un título restante en la cavidad que contiene
el dominio de la Heparina-II significativamente
mayor en comparación con el control significa que el virus sujeto
es adecuado para el uso en los aspectos de la invención. Para
facilitar este procedimiento de barrido, el vector viral puede
contener un gen marcador seleccionado, tal como se trata
arriba.
Los fragmentos de fibronectina para el uso en la
invención pueden ser de origen natural o sintético, y se pueden
preparar con una pureza sustancial a partir de materiales formados
naturalmente, por ejemplo tal como describió previamente Ruoslahti
et al. J. Biol. Chem. 1981, 256, 7277; Patel y
Lodish J. Cell. Biol. 1986, 102, 449; y
Bernardi et al. J. Cell. Biol. 1987, 105, 489.
En este sentido, la referencia de aquí a una fibronectina
sustancialmente pura o a fragmentos de fibronectina pretende
significar que están libres esencialmente de otras proteínas con
las que la fibronectina se forma naturalmente. También se puede
producir de modo recombinante fibronectina sustancialmente pura o
fragmentos de fibronectina para el uso en la invención, por
ejemplo, tal como se describe generalmente en la Patente U.S. Núm.
5.198.423 que se publicó el 30 de marzo de 1993 por Taguchi et
al. y que se asignó a Takara Shuzo Col., Ltd., Kioto, Japón. En
particular, se describen con detalle en esta patente '423 los
fragmentos identificados en los Ejemplos de abajo como
H-271, H-296,
CH-271, CH-296 y
C-CS1, y los métodos para obtenerlos. Se obtuvo el
fragmento C274 que se utiliza en los Ejemplos de abajo tal como se
describe en la Patente U.S. Núm. 5.102.988. Estos fragmentos o los
fragmentos a partir de los que se pueden derivar rutinariamente
están disponibles mediante el cultivo de E. coli depositada
en el Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial
Science and Technology, Japón, como FERM
P-10721 (H-296), FERM
BP-2799 (C-277 enlazado a
H-271 a través de la metionina), FERM
BP-2800 (C-277 enlazado a
H-296 a través de la metionina), y FERM
BP-2264 (H-271), tal como se
describe también en la Patente U.S. Núm. 5.198.423. Además, se
puede encontrar información útil respecto a los fragmentos de
fibronectina utilizables aquí o a los materiales de partida para
tales fragmentos en Kimizuka et al. J. Biochem. 1991,
110, 284-291, que informa aún más respecto a
los fragmentos recombinantes que se indicaron arriba; en EMBO
J. 1985, 4, 1755-1759, que informa
sobre la estructura del gen de la fibronectina humana; y en
Biochemistry 1986, 25,
4936-4941, que informa sobre el dominio de unión de
la Heparina-II de la fibronectina humana. Se ha
encontrado que los fragmentos de fibronectina que contienen tanto el
dominio de adhesión celular de CS-1 como el dominio
de unión de la Heparina-II, tal como se incluye por
ejemplo en un fragmento de 30 ó 35 kd aproximadamente (30/35 FN) y
en varios fragmentos recombinantes tal como se informa en los
Ejemplos de abajo, mejoran significativamente la eficiencia de la
transferencia genética en las células hematopoyéticas en los
trabajos realizados hasta el momento, y se prefieren para el uso en
la invención. De este modo se entenderá que, hablando ampliamente,
el polipéptido o polipéptidos relacionados con la fibronectina que
se utilizan en la invención proporcionarán una secuencia de
aminoácidos que proporcione la actividad de unión celular del
dominio del adhesión celular de CS-1 de la
fibronectina así como una secuencia de aminoácidos del dominio de
unión de la Heparina-II de la fibronectina que se
enlaza al virus. El artesano con habilidad reconocerá que se pueden
proporcionar las actividades de enlace a células o a virus
necesarias tanto mediante las secuencias de aminoácidos nativas de
estos dominios de fibronectina funcionales como mediante las
secuencias de aminoácidos que difieren de las secuencias nativas
aunque son suficientemente similares como para exhibir las
actividades de enlace a células o a virus. Estas secuencias de
aminoácidos similares exhibirán una homología de secuencia
sustancial respecto a sus correspondientes secuencias nativas, y
pueden incluir aquellas en que se han borrado aminoácidos, se han
sustituido y/o se han modificado a la vez que proporcionan, sin
embargo, una secuencia de aminoácidos con la característica de
enlace a células o a virus deseada.
En este sentido, las técnicas biotecnológicas
pertinentes han avanzado hasta un estado en el que se puede
realizar rutinariamente la eliminación, la sustitución, la adición u
otra modificación de aminoácidos en los dominios funcionales
sujeto. Entonces se pueden cribar rutinariamente las secuencias de
aminoácidos para la actividad de enlace a células o a virus
deseada. Por ejemplo, se puede realizar una criba de la actividad
enlazante a virus de las formas mutantes o modificadas del dominio
de unión de la Heparina-II de la fibronectina tal
como se trata generalmente arriba y más específicamente abajo en los
Ejemplos 8 y 9, usando la incubación de virus, el lavado, y los
ensayos de título viral para determinar la retención de la
infecciosidad comparada con un control. Dadas las enseñanzas que se
proporcionan aquí, estos ensayos de unión no representarán nada más
que experimentación de rutina para aquellos que trabajan en este
campo.
Se puede ensayar de la misma manera el enlace a
células de formas mutantes o modificadas del dominio de adhesión
celular de CS-1 de la fibronectina, o a otros
polipéptidos que enlacen células, usando procedimientos
convencionales. Por ejemplo, tales procedimientos incluyen aquellos
que se describen en Nature 1991, 352,
438-441. Brevemente, se recubre el polipéptido que
enlaza las células sobre placas de plástico y se sumerge en el medio
la población celular que se va a ensayar desde 30 minutos hasta 2
horas. Después de este período de incubación, se recuperan las
células que no son adherentes a la proteína, se cuentan y se ensayan
para la viabilidad. También se recuperan las células adherentes al
polipéptido usando tripsina o un tampón de disociación celular
(e.g. Gibco), se cuentan y se ensaya la viabilidad. En
algunos casos, por ejemplo para la colonia hematopoyética que forma
las células, se cultivan las células además durante
12-14 días adicionales para determinar las
características de formación de la colonia de las células. Entonces
se calcula el porcentaje de células adherentes y se compara
respecto al estándar con un control estándar tal como las placas de
plástico recubiertas con albúmina sérica bovina (BSA). El enlace
sustancial de las células objetivo con el polipéptido ensayado
proporciona una indicación de que la combinación célula/polipéptido
es adecuada para la invención, y se puede acoplar el polipéptido al
fragmento de enlace retroviral de la fibronectina para producir un
constructo de la invención para incrementar la infección de las
células objetivo por el vector viral.
De conformidad con aspectos más específicos de
la invención, el polipéptido enlazante del virus que se utiliza
para incrementar la transducción mediante los vectores retrovirales
comprenderá (i) una primera secuencia de aminoácidos que
corresponde a Ala^{1690} - Thr^{1969} del dominio de unión de la
Heparina-II de la fibronectina humana, que viene
representado mediante la fórmula (Sec. I.D. #1):
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln
Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu
Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys
Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met
Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr
Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp
Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala
Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Sys Pro Asp Val Arg Ser Tyr
Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala
Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu
Leu Val Ser Trp Gln Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr
Glu Sys Pro Gly Sev Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly
Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile
Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg
Lys Lys Thr;
o una secuencia de aminoácidos suficientemente
similar a esta como para exhibir la habilidad de enlazar el
retrovirus;
y (ii) una segunda secuencia de aminoácidos que
corresponde a una porción del dominio de unión de IIICS de la
fibronectina humana (el dominio de enlace de celular de
CS-1); que viene representada mediante la fórmula
(Sec. I.D. #2):
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro
Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr;
o una secuencia de aminoácidos suficientemente
similar a esta como para exhibir la habilidad de enlazar células
hematopoyéticas tales como el progenitor primitivo y/o las células
(madre) repobladoras a largo plazo.
Tal como se mencionó previamente, se entenderá
que ciertas modificaciones y/o mutaciones de estas secuencias
nativas son posibles dentro de la práctica de la presente invención,
mientras que la secuencia de aminoácidos resultante sea
suficientemente similar a la secuencia nativa como para exhibir la
habilidad de enlazar el virus (en el caso del dominio de unión de
la Heparina-II) y la habilidad de enlazar las
células objetivo (en el caso del dominio de
CS-1).
CS-1).
Un aspecto de la invención proporciona un método
de terapia génica somática que implica terapia celular in
vitro y el consiguiente transplante de células objetivo en un
huésped, también conocido como "injerto" del huésped con las
células objetivo transducidas. Se pueden recoger las células
hematopoyéticas u otras células a partir de una fuente animal
humana o de otro mamífero usando protocolos estándar. Por ejemplo,
se pueden recoger las células hematopoyéticas de la médula ósea o
de la sangre periférica de un donante humano o a partir de la
sangre del cordón umbilical fetal humano. Una vez que se han
recogido, se pueden tratar opcionalmente las células
hematopoyéticas mediante técnicas estándar para enriquecerlas en
células madre y/o en células progenitoras primitivas. Entonces se
pueden incubar adecuadamente las células hematopoyéticas, por
ejemplo sobre placas de cultivo de tejidos. Opcionalmente durante
este período, se pueden preestimular las células mononucleares de
baja densidad no adherentes antes de la infección retroviral. La
preestimulación tal como se conoce en la técnica y tal como se usa
aquí se refiere al proceso de exponer las células a factores
estimuladores del crecimiento antes de la exposición a los
retrovirus. Se demostrado que tal preestimulación mejora la
transducción de las células hematopoyéticas mediante los
retrovirus.
Tras la preestimulación, se pueden cosechar e
incubar las células con fibronectina o fragmentos suyos tal como se
describe aquí, que mejoran la frecuencia de la transducción celular
mediante los retrovirus. Preferiblemente, se incuban las células
con, e.g. fibronectina o fragmentos de fibronectina
inmovilizados, purificados y/o insolubles. Entonces se pueden
infectar las células con el virus recombinante, por ejemplo un
retrovirus que contenga un gen para corregir un enzima u otra
deficiencia o anormalidad de proteínas en las células, en presencia
de una cantidad de fibronectina o de fragmentos de fibronectina
efectiva para incrementar la frecuencia de transducción de las
células mediante el virus. Entonces se pueden introducir
convencionalmente las células hematopoyéticas transducidas
resultantes, e.g. intravenosamente, en una cavidad de injerto
celular animal, preferiblemente un donante autólogo pero también
incluye los transplantes alogénicos, especialmente el último, en el
que se usan las células de la sangre del cordón umbilical para el
injerto tal como se trata abajo.
Se pueden usar los métodos de la invención en
protocolos de marcaje genético o de terapia genética para una
variedad de desórdenes que incluye los desórdenes de médula ósea,
que incluye por ejemplo cánceres, leucemias, desórdenes que
implican deficiencias o anormalidades en las proteínas, y terapias
para modificar las células hematopoyéticas para mejorar la
resistencia a otros protocolos terapéuticos tales como la
quimioterapia. Los desórdenes representativos en los que se puede
usar la invención de este modo incluyen la deficiencia de ADA,
e.g. SCID deficiente de ADA, la leucemia mielógena aguda
pediátrica (AML), el neuroblastoma, el AML de adultos y la leucemia
linfocítica aguda (ALL).
En una representación particularmente preferida
de la invención, se obtienen las células que se utilizan para un
injerto celular a partir de la sangre de cordón umbilical humano. De
este modo, se puede recoger la sangre del cordón umbilical humano y
se puede enriquecer en células madre y/o células progenitoras
hematopoyéticas primitivas viables, obteniendo por ejemplo una
población celular mononuclear, de baja densidad, no adherente.
Entonces se preestimula opcionalmente esta población, y se incuba en
presencia de un vector retroviral y/o de fibronectina purificada o
fragmentos de fibronectina, para incrementar la eficiencia de la
transducción de las células mediante el vector. En este sentido se
ha encontrado que se incrementa enormemente la transducción de las
células madre y/o las células hematopoyéticas primitivas a partir de
la sangre del cordón umbilical en presencia de fibronectina o de
fragmentos de fibronectina, incluso cuando la fibronectina no forma
parte del ECM en la sangre del cordón e incluso aunque se han
caracterizado las células madre y las células progenitoras
primitivas de la sangre del cordón como diferentes respecto a
aquellas de la médula ósea. En particular, se ha caracterizado la
célula madre de la sangre del cordón como CD34*,
HLA-DR^{+}, mientras que se ha caracterizado la
célula madre de la médula ósea como CD34*,
HLA-DR^{-}. El descubrimiento de los Solicitantes
de que se transducen efectivamente las células progenitoras
primitivas de la sangre del cordón umbilical de una manera mejorada
en presencia de fibronectina o de fragmentos de fibronectina hace
posible el uso de una fuente conveniente y altamente enriquecida en
células madre. Además, la evidencia de injerto exitoso en numerosos
pacientes con transplantes alogeneicos de sangre de cordón
enriquecida para las células madre y las células progenitoras
primitivas, hace que la sangre de cordón sea una fuente altamente
preferida para las células hematopoyéticas. Ver,
Kohli-Kummer et al. Brit. Heaematol.
1993, 85, 419-422; Broxmeyer et al.
Blood Cell 1991, 17, 313-329 ;
Gluckman et al. Br. J. Heaematol. 1980, 45, 557
; Heidelberg: Springer-Verlag págs.
60-68 (1989); Wagner et al. Blood
1992, 79, 1874-1881; y Wagner et
al. Blood 82-86a (Abstract).
Si se desea, se pueden ensayar células
hematopoyéticas transducidas cosechadas u otras células para la
eficiencia de la transducción y de la expresión genética. Por
ejemplo, se demuestran las mejoras significativas en la
transferencia genética mediada por retrovirus proporcionada por la
invención en los Ejemplos específicos de abajo, que describen
varias pruebas demostrando una infección y una eficiencia de la
transferencia genética elevadas por retrovirus en presencia de
fibronectina o de fragmentos de fibronectina efectivos. En
particular, las células hematopoyéticas de murino infectadas con el
retrovirus PGK-hADA expresaron niveles elevados del
cADN de ADA transferido. Similarmente, las colonias individuales
progenitoras humanas infectadas por el virus
PGK-mADA expresaron niveles de ADA de murino hasta
10 veces mayores que la proteína de ADA humana endógena. En
consecuencia, para analizar rigurosamente la eficiencia de la
transferencia, se consideró que las colonias progenitoras estaban
transducidas solamente si la expresión del mADA transferido era
igual o mayor que los niveles de ADA humanos endógenos. Se
detectaron niveles elevados de expresión de neo a partir del vector
TKNEO mediante la resistencia a la droga G418, como un ensayo de la
actividad de la neofosfotransferasa (el producto genético neo).
Tal como se indicó arriba, se llevan a cabo los
métodos de la presente invención ventajosamente sin necesidad de
cocultivo en presencia de células productoras retrovirales. De este
modo, de acuerdo con un aspecto de la invención, se puede realizar
la transferencia genética mediada por retrovirus en ausencia
sustancial de células diferentes a las células hematopoyéticas
objetivo u otras células. Por ejemplo, se pueden cultivar las
células productoras que contienen el plásmido vector retroviral y se
puede recoger el sobrenadante. Entonces se puede utilizar el
sobrenadante que contiene el retrovirus para infectar las células
hematopoyéticas en presencia de fibronectina y/o de fragmentos de
fibronectina, que están preferiblemente en forma inmovilizada,
e.g. recubiertos sobre un sustrato en el que se lleva a cabo
la infección o de otro modo en contacto con el medio para la
infección. En este sentido, se contempla como adecuada para el uso
de esta invención cualquier célula productora que produzca
retrovirus con título elevada y sin necesidad de un auxiliar. Estos
incluyen, por ejemplo, las células de empaquetamiento tales como
Psi-2, C2, PA12, PA317, y GP+envAM12, así como
varias otras líneas celulares de empaquetamiento que se conocen en
la técnica.
De acuerdo con otras características de la
invención, se puede usar el fuerte enlace del virus con los
aminoácidos dentro del dominio de unión de la
Heparina-II de la fibronectina para construir
sistemas de liberación para terapia viral a lo largo de un rango
amplio de tipos de células. Con este fin, se puede acoplar
covalentemente un polipéptido que incluya el dominio de unión del
retrovirus de la fibronectina a cualquier ligando que proporcione
esta especificidad de constructo para las células objetivo. Esta
aproximación eludirá la necesidad previa de construir líneas
celulares de retrovirus específicas para cada célula objetivo
(Kasahara, N.; A. M. Dozy; Y. W. Kan. Science 1994,
266, págs. 1373-1376 y
Valsesia-Wittmann, S.; Drynda, A.; Deleage, G.;
Aumailley, M.; Heard, J. M.; Danos, O.; Verdier, G.; y Cosset, F.
L. J. Virol. 1994, 68,
4609-4619. Se puede proporcionar la especificidad
del constructo objetivo utilizando ligandos que incluyan por ejemplo
1) proteína adhesiva a las células, 2) hormonas o citoquinas, 3)
anticuerpos monoclonales para las células objetivo, 4)
carbohidratos que enlazan las células objetivo (Ashwell, G. et
al. Annu. Rev. Biochem. 1982, 51,
531-554, 5) metabolitos para las células objetivo,
o 6) polipéptidos funcionales que enlazan las células objetivo. Se
puede mejorar la eficiencia del constructo para la liberación
genética incluyendo varios dominios de unión del virus de la
Heparina-II e incrementando en consecuencia la
cantidad de partículas virales que se liberan a las células
objetivo. Por ejemplo, se ha mostrado que el dominio de enlace
celular de la fibronectina humana que corresponde a
Pro^{1239}-Ser^{1515}, tal como se describe en
la Patente U.S. Núm. 5.198.423, enlaza células incluyendo las
células BHK y B16-F10 (Kimizuka et al. J.
Biochem. 1991, 110, 285-291.
Además, se ha mostrado que el propio dominio de la
Heparina-II enlaza fibroblastos, células
endoteliales, y células tumorales. Se pueden acoplar estas
secuencias de polipéptidos al dominio de unión del retrovirus de la
fibronectina para dirigirse células predeterminadas para la
infección mediante el retrovirus.
Las aplicaciones ejemplares en el sistema
hematopoyético también incluyen un constructo de eritropoyetina o
G-CSF acoplado al dominio de unión del retrovirus de
la fibronectina para dirigirse hacia células precursoras eritroides
o granulocíticas altamente específicas, respectivamente. Otra
aplicación común de acuerdo con la presente invención será combinar
el dominio o dominios de unión del retrovirus con un ligando que se
enlace específica o predominantemente a las células malignas. Por
ejemplo, se ha mostrado que se puede influenciar el crecimiento
in vitro e incluso in vivo de las células del
carcinoma de pecho usando sustancias que se enlacen a los
receptores de las células objetivo tales como los derivados
liberadores de la hormona luteinizante, Emons, G. et al. Hum.
Reprod. 1994, 9, 1364-1379, los
estrógenos, Tolcher, A. W. Oncol. 1994, 8,
39-43, o los antiestrógenos, Howell, A. et al.
Lancet 1995, 345, 29-30, los
progestógenos o los antiprogestógenos, Klijn, F. G. et al. Hum.
Reprod. 1994, 9, Supl. 1,
181-189; Griffiths, K. et al. Semin. Oncol.
1994, 21, 672-687, que servirán como
ligandos en constructos de la invención que contengan uno o más
dominios de unión del virus de la fibronectina. Como ejemplos
adicionales, se pueden establecer como objetivo muy específicamente
las células del tiroides (cáncer) usando constructos con Jodid, y
se pueden establecer como objetivo las células del hígado (cáncer)
mediante constructos que contienen HDL o partes suyas. Finalmente,
los constructos de los anticuerpos monoclonales y el dominio de
unión del retrovirus de la fibronectina permitirán establecer como
objetivo cualquier célula y órgano frente al que un anticuerpo está
disponible. De este modo se puede establecer como objetivo un rango
amplio de tipos de células de mamíferos capitalizando la habilidad
del dominio de unión del retrovirus de la fibronectina para enlazar
y localizar vectores virales.
De acuerdo con esto, otra representación
preferida de la invención implica la preparación de un constructo
que se pueda usar para mejorar la transducción viral de una célula
objetivo. La secuencia de aminoácidos del dominio de unión de la
Heparina-II de la fibronectina que enlaza virus está
acoplada a un ligando al que se enlaza la célula objetivo. Tal como
se trató arriba, el ligando puede ser, por ejemplo, un polipéptido
de la fibronectina o de otra proteína (incluyendo una proteína
adhesiva de células, por ejemplo, la laminina, el colágeno, la
vitronectina, la osteopontina o la trombospondina), una hormona, un
metabolito, un anticuerpo (incluyendo los anticuerpos
monoclonales), o cualquier otro ligando que exhiba la capacidad de
enlazarse, preferiblemente con especificidad, a la célula objetivo.
Se puede usar el contructo global resultante en forma inmovilizada
de una manera similar a la que se usa para los polipéptidos de
fibronectina que se ejemplifican específicamente en los Ejemplos de
abajo.
Se pueden utilizar tales constructos y tales
aproximaciones de focalización en células in vitro tal como
se discutió arriba, y también en la focalización in vivo de
retrovirus, teniendo en cuenta varios factores tales como la
estabilidad y la especificidad del constructo y la interacción del
constructo del retrovirus bajo condiciones fisiológicas. También se
puede mejorar la especificidad modificando el sistema de liberación
para localizar la liberación del constructo hacia las células
objetivo, cateterizando por ejemplo la vena porta para dirigirse
hacia células del hígado.
Se contempla que se lleve a cabo una
transferencia de ADN mediada por retrovirus altamente conveniente
utilizando equipos diseñados especialmente para practicar los
métodos de la invención. De acuerdo con esto, otro aspecto de la
invención proporciona equipos que incluyen una cantidad
sustancialmente pura del polipéptido o del constructo que se trató
arriba que mejora la transducción de las células objetivo por los
retrovirus, junto con un sustrato artificial sobre el que se puede
llevar a cabo la infección retroviral. Se puede proporcionar el
polipéptido u otro constructo separadamente o recubierto sobre el
sustrato artificial. En el caso de los protocolos de la infección
para las células hematopoyéticas humanas los equipos también
incluirán factores de crecimiento de las células hematopoyéticas
para la preestimulación celular. Además, los equipos pueden incluir
los vectores del retrovirus recombinante tal como se discutió
arriba para la transducción. Generalmente hablando, los equipos
incluirán un empaquetamiento estéril que asegure los diversos
componentes del equipo en una relación espaciada de uno respecto al
otro suficiente para prevenir la ruptura de los componentes durante
la manipulación del equipo. Por ejemplo, es una práctica común
utilizar artículos de plástico moldeados que posean compartimentos
o áreas múltiples para mantener los componentes del equipo en una
relación espaciada.
Para favorecer un mayor entendimiento y
apreciación de la invención, se proporcionan los siguientes Ejemplos
específicos. Se entenderá que estos ejemplos son ilustrativos y que
no son limitantes por naturaleza.
Se cultivaron las células productoras de
GP+EnvAM 12 (ver Markowitz et al. Virology
1988, 167, 400) que contenían el vector del TKNEO
retroviral plásmido en el Medio Dulbecco Modificado por Iscove
(IMDM, Gibco, Gaithersburg, MD) que contiene suero fetal bovino al
10% (FCS, Hyclone, Logan, UT) y 100 unidades/ml de penicilina y 100
microgramos/ml de estreptomicina (P/S, ambos de Gibco). Se recogió
el sobrenadante que contenía el virus añadiendo 10 ml de IMDM que
contiene un FCS al 20% sobre platos confluentes durante una noche.
Se filtró el medio cosechado a través de filtros de 0,45 micras
(Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) y se almacenaron a 80ºC hasta que
se usaron.
Se purificó el FN a partir de plasma humano
(Lifesource, Glenview, IL) tal como se describió previamente en
Ruoslahti et al. Methods Enzymol. 1982, 82,
803-831, excepto en que se lavó la columna de
gelatina-agarosa con urea 1 M antes de la elución
del FN con urea 4 M. Se dializó extensivamente el FN purificado a
4ºC frente a ácido
3-(ciclohexilamino)-1-propansulfónico
10 mM (CAPS), NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM pH 11,0 y se
almacenó en alícuotas a -80ºC. Se purificó el dominio de unión
celular quimotríptico (CBD) (CS-1) y los fragmentos
de unión de la Heparina-II del FN tal como se
describió previamente (Ruoslathi et al. 1982,
supra, Patel y Lodish J. Cell. Biol. 1986,
102, págs. 449-456, y Bernardi et al. J.
Cell. Biol. 1987, págs. 489-498. Se
obtuvieron tres fragmentos enlazantes de heparina mayores (30 kD,
35 kD, y 42 kD) en el eluyente NaCl 1 M a partir de la columna de
agarosa-heparina. Para purificar más estos
fragmentos enlazantes de heparina, se dializó durante una noche el
eluyente de NaCl 1 M a 4ºC frente a Tris-HCl 10 mM,
pH 7,0 y se hizo pasar a través de una columna de intercambio
aniónico (2 ml de sefarosa DEAE de flujo rápido (Pharmacia Fine
Chemicals, Uppsala, Suecia)/mg de proteína) que se habían
equilibrado con Tris-HCl 10 mM pH 7,0. Se
recogieron los fragmentos de 30/35 kD en la fracción no enlazada
mientras que se eluyó el fragmento de 42 kD a partir de la columna
con NaCl 100 mM. A partir de 500 mg de FN, se obtuvieron
aproximadamente 26 mg de los fragmentos de 30/35 kD y 4 mg del
fragmento de 42 kD. Se reconoció el fragmento de 42 kD, pero no los
fragmentos de 30/35 kD, mediante un anticuerpo frente al dominio
enlazante de la fibrina, tal como se determinó mediante la técnica
de Western Blot. Además, el fragmento de 42 kD se enlaza a una
columna de afinidad de fibrina-sefarosa.
Para el uso en el protocolo de infección, se
inmovilizaron los fragmentos de fibronectina sobre placas de petri
de entre 35 y 100 mm (Falcon, Lincoln Park, NJ) a un título de 75
pmol/cm^{2} tal como describieron Patel y Lodish (1986),
supra. Se recubrieron las placas de control de manera análoga
con albúmina sérica bovina al 2% (libre de FN) (BSAm, Boehringer
Mannheim, Mannheim, Alemania).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se recogieron muestras de médula ósea de
donantes adultos saludables en tubos que contenían heparina sulfato
sódico libre de preservativos y estéril de acuerdo con otros
protocolos aprobados por el Institutional Review Board of
Indiana University School of Medicine. Se prepararon células
mononucleares de baja densidad mediante centrifugación en
Ficoll-Hypaque (densidad 1,077 g/ml, Pharmacia,
Piscataway, NJ) durante 45 minutos a 25ºC. Se eliminaron las
células adherentes plásticas de las células de médula ósea de baja
densidad mediante una incubación adicional sobre placas de cultivo
de tejidos durante 4-16 horas a 37ºC en CO_{2} al
5% en IMDM con FCS al 2%.
Se preestimularon las células mononucleares de
baja densidad no adherentes antes de la infección retroviral tal
como describió previamente Luskey et al. Blood 1992,
80, 396, durante 48 horas a 37ºC y CO_{2} al 5% en en IMDM
con FCS al 20%, rhIL-6 de 100 U/ml, rhSCF de 100
ng/ml (ambos de Amgen, Thousand Oaks, CA), y P/S a una densidad
celular de 1 x 10^{6} células/ml en placas de petri. Se cosecharon
las células preestimuladas mediante pipeteo vigoroso para eliminar
las células que eran ligeramente adherentes al plástico.
Se incubaron las células (5 x 10^{5}
células/ml) durante 6 horas en placas recubiertas con BSA (placas de
control) o fibronectina o fragmentos suyos (sometidos a radiación
UV para adherir mejor las proteínas a la placa de plástico) y
entonces se infectaron con el sobrenadante del virus en presencia de
factores de crecimiento (como arriba) y 7,5 microgramos/ml de
polibreno (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI). Se sustituyó el
sobrenadante del virus (incluyendo los factores de crecimiento y el
polibreno de 5,0 microgramos/ml) después de 2 horas y se incubaron
las células desde 12 hasta 24 horas adicionales. Se reañadieron las
células no adherentes con cada cambio de medio.
Siguiendo el protocolo de infección, se
decantaron las células no adherentes y se recogieron las células
hematopoyéticas adherentes de los cultivos usando un Tampón de
Disociación Celular (CDB) (libre de enzima/basado en PBS, Gibco) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadieron las
células adherentes sobre la fracción no adherente, se lavaron dos
veces y se contaron. Se colocaron en una placa las células
cosechadas en ensayos con progenitores de metilcelulosa
clonogénicos o bien en cultivos de médula ósea a largo plazo.
Se realizaron ensayos LTC-IC
(célula madre humana) de acuerdo con los métodos que se han descrito
previamente con ligeras modificaciones. Sutherland et al.
Blood 1989, 74, 1563. Brevemente, se sembraron
0,5-1x10^{6} células infectadas en cultivos de
médula ósea a largo plazo (LTMC) sobre fibroblastos de médula ósea
humana (BMF) alogénicos preirradiados (como arriba) concluyentes en
5 ml de IMDM que contenía FCS al 10%, suero de caballo al 10%
(Sigma) y P/S, hidrocortisona 1x10^{-5} M (Upjohn, Kalamazoo, MI),
y cloruro de sodio 320 mosmol en 6 placas de cultivo de tejidos de
6 pozos (Costar, Cambridge, MA). Se incubaron los LTMC a 33ºC en
CO_{2} al 5% y se alimentaron semanalmente por eliminación del 50%
del medio y de las células no adherentes. Después de cinco semanas,
se sacrificaron los cultivos de LTC-IC usando CDB
para eliminar las células hematopoyéticas adherentes del BMF. Se
combinaron las células hematopoyéticas adherentes y las no
adherentes y se colocaron en una placa en metilcelulosa para
obtener colonias derivadas de LTC-IC.
Se realizaron los ensayos con metilcelulosa tal
como describió previamente Toksoz et al. Proc. Natl. Acad.
Sci., USA 1992, 89, 7350, con modificaciones
menores. Brevemente, se colocaron en una placa
2-5x10^{4} células de médula ósea adulta
infectadas con 5 unidades/ml de eritropoyetina (Epo, Amgen), rhSCF
100 ng/ml, rhIL-3 10 ng/ml (Genzyme, Cambridge, MA)
en 1 ml de metilcelulosa IMDM al 2,4% (Fluka, Ronkonkoma, NY) que
contenía FCS al 25%, plasma humano al 10%, betamercaptoetanol
10^{-5} M (Sigma), y P/S. Se incubaron los cultivos a 37ºC en 5%
CO_{2} /95% aire y se contaron las colonias (>50 células)
mirando en un microscopio invertido durante el día 13 como
CFU-GM (que contiene granulocitos y macrófagos),
CFU-Mix (que contiene elementos mieloides y
eritroides), o BFU-E (que contiene únicamente
elementos eritroides).
Se analizó la eficiencia de la infección con el
virus TKNEO determinando el porcentaje de las colonias de
metilcelulosa resistentes a G418 1,5 mg/ml (polvo seco, Gibco)
durante el día 13. Se realizaron simulacros de infección en cada
experimento incubando médula ósea sobre la línea de empaquetamiento
GP+EnvAM 12 haciendo un virus no recombinante. El cultivo de estas
células de simulacro infectadas con G418 de 1,5 mg/ml demostró
consistentemente <1% de colonias de fondo.
Se comparó la eficiencia de la transducción
infectando células de médula ósea mientras se colocaban en placas
30/35 recubiertas con FN o BSA. No se observó ninguna diferencia en
el número de colonias obtenido después de la infección sin
selección entre estas condiciones. La Fig. 2 demuestra el porcentaje
de colonias G418^{r} después de la infección. Se notó un mayor
porcentaje de colonias G418^{r} en FN 30/35 a partir de todos los
tipos de progenitores, incluyendo aquellos derivados de las células
progenitoras con restricción de línea (BFU-E y
CFU-GM) así como con multilínea. Se incrementó la
infección en todos los progenitores comprometidos en un orden de 9
sobre 30/35 FN frente a BSA.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la transferencia genética en
LTC-IC usando el vector TKNEO. Tan sólo se detectó
la transferencia genética en colonias derivadas de
LTC-IC después de la infección sobre FN 30/35
(colonia 16% G418' vs 0% G418^{r}, FN 30/35 vs
BSA).
Para determinar la especificidad de la
eficiencia en la transferencia genética mejorada que se había visto
en FN 30/35, se realizó la infección con TKNEO sobre placas
recubiertas con BSA, FN 30/35, fibronectina intacta, un fragmento
de FN de 115 kd que contiene el dominio de enlace celular central
(CBD) que contiene la secuencia de tetrapéptido RGDS, y un
fragmento de FN C-terminal de 42 kd (42FN)
caracterizado mediante el dominio de enlace de la
Heparina-II pero que carece de la secuencia
CS-1 (Fig. 1). La infección sobre BSA proporcionó
BFU-E G418^{r} 3 \pm 1%, CFU-GM
G418^{r} 1 \pm 1%, y CFU-MIX G418^{r} 0 \pm
0%. No se notó sobre el CBD ningún incremento significativo en la
proporción de las colonias de G418^{r}, mientras que se observó
una infección ligeramente mayor de BFU-E (6,0 \pm
-1%) en FN 42 (Fig. 3). Sin embargo, FN intacta favoreció una
transferencia genética mejorada en todos los progenitores
comprometidos. El porcentaje de colonias de G418^{r} después de
la infección sobre la FN intacta era menor que sobre la FN 30/35 en
todas las líneas, incluyendo BFU-E (16 \pm -2%
vs 24 \pm 4%), CFU-GM (5 \pm 2% vs
20 \pm 4%), y CFU-MIX (6 \pm 1% vs 9
\pm 1%; FN intacta vs FN 30/35, respectivamente).
Se preparó el sobrenadante del virus
PGK-mADA tal como se describió para el TKNEO en el
Ejemplo 1. Se prepararon fragmentos quimotrípticos de fibronectina
(Fig. 1) tal como se describió previamente en el Ejemplo 1 y se
siguió el protocolo de infección retroviral del Ejemplo 1. Se
realizaron ensayos de LTC-IC (células madre
humanas) y de Metilcelulosa de acuerdo con el Ejemplo 1.
Se determinó la eficiencia de la infección con
el vector PGK-mADA mediante análisis de proteínas
usando la electroforesis del isoenzima de ADA. Se realizó el
análisis de las colonias progenitoras individuales tal como
describió previamente Moritz (1993) y Lim et al. Proc. Natl.
Acad. Sci., USA 1989, 86, 8892. Para analizar
rigurosamente la eficiencia de la transferencia, tan sólo se
consideraron como transducidas las colonias que expresan el mADA al
mismo nivel o superior que el ADA humano endógeno. Para el análisis
de las colonias que estaban puestas en común, se combinaron las
colonias que se extrajeron del cultivo de metilcelulosa en
microtubos de 1,5 ml (Rainin, Woburn, MA), se lavaron con medio
templado y salino tamponado con fosfato (PBS), se centrifugaron y
se almacenaron a -20ºC. Para el análisis de ADA, se lisaron las
células en 5 microlitros de tampón de lisis mediante ciclos de
congelado-descongelado repetidos y se realizó la
electroforesis isoenzimática tal como se describió previamente.
Se comparó la eficiencia de transducción
infectando células de médula ósea mientras se colocaban sobre placas
recubiertas con FN 30/35 o BSA. No se observó diferencia entre
estas condiciones en el número de colonias obtenidas después de la
infección sin selección. Tal como se muestra en la Tabla 1, se
incrementó sustancialmente la eficiencia de la infección en todos
los progenitores comprometidos sobre FN 30/35 vs BSA. Tal
como se esperaba con el vector de título elevado (\sim1x10^{7}
virones/ml), la eficiencia de transducción de los progenitores
comprometidos era extremadamente elevada. En referencia a la Tabla
1, la infección de médula ósea sobre FN 30/35 con
PGK-mADA proporcionó casi un 100% de transducción de
los progenitores comprometidos en dos experimentos separados.
En cuatro experimentos independientes realizados
con PGK-mADA una proporción significativa de
colonias de progenitor derivadas de LTMC antiguo de 5 semanas
(i.e. colonias derivadas de LTC-IC) expresó
el gen ADA de murino transferido. La expresión estaba en el rango
desde 2/12 (17%) hasta 6/6 (100%) de colonias analizadas (Tabla 2).
La expresión del gen mADA introducido excedió o como mínimo igualó
la cantidad de actividad de ADA humano endógeno en todas las
colonias que se consideraban positivas. La eficiencia de la
infección del PGK-mADA era mayor que para el TKNEO.
Tal como se muestra en la Tabla 2, la infección de la médula ósea
sobre FN 30/35 con PGK-mADA proporcionó
prácticamente un 100% de transducción de los progenitores
comprometidos en dos experimentos separados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se incrementó la eficiencia de la transferencia
genética en LTC-IC en FN 30/35. Debido al tamaño
relativamente pequeño de estas colonias secundarias derivadas de
LTC-IC, se limitó la habilidad para realizar el
análisis de proteínas sobre colonias únicas. Después de la
infección con PGK-mADA sobre BSA, las colonias
derivadas de LTC-IC de la fibronectina intacta y de
FN 42 0/6, 0/4 y 0/3, respectivamente, demostraron la expresión de
ADA de murino, mientras que las colonias derivadas de
LTC-IC 3/5 infectadas sobre FN 30/35 expresaron
mADA. Además, cuando se pusieron en común múltiples colonias
derivadas de LTC-IC antes del análisis en dos
experimentos adicionales, se detectó la expresión de mADA sólo
después de la infección sobre FN 30/35 y en menor grado sobre FN
intacto, pero no sobre FN42 o BSA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara el sobrenadante del virus
PGK-hADA tal como se describió para el TKNEO en el
Ejemplo 1. Se preparan los fragmentos quimotrípticos de la
fibronectina (Fig. 1) tal como se describió previamente en el
Ejemplo 1 y se siguió el protocolo de infección retroviral del
Ejemplo 1. Se realizaron ensayos de metilcelulosa y de
LTC-IC tal como se describió en el Ejemplo 1.
Para el análisis de las colonias que se habían
puesto en común, se combinan colonias escogidas del cultivo de
metilcelulosa en microtubos de 1,5 ml (Rainin, Woburn, MA), se lavan
con medio templado y PBS, se centrifugan y se almacenan a -20ºC.
Para el análisis de ADA, se lisan las células en 5 microlitros de
tampón de lisis mediante ciclos repetidos de
congelación-descongelación y se realiza la
electroforesis isoenzimática tal como se describió
previamente.
previamente.
Se prepara el sobrenadante del virus TKNEO y los
fragmentos quimotrípticos de fibronectina (Fig. 1) tal como se
describió previamente en el Ejemplo 1. Se siguió el protocolo de
infección retroviral del Ejemplo 1 excepto en que se recogió la
sangre del cordón umbilical a partir de niños normales recién
nacidos a tiempo completo, en tubos que contenían heparina de
acuerdo con los protocolos aprobados por el Institutional Review
Board of Indiana University School of Medicine, y se usó en vez
de las células de médula ósea. Se realizaron ensayos de
LTC-IC (célula madre humana) y de metilcelulosa de
acuerdo con el Ejemplo 1.
Se incrementó la infección sobre FN 30/35 más de
cuatro veces en comparación con el BSA en tres experimentos por
separado (Tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara el sobrenadante del virus
PGK-mADA y los fragmentos quimotrípticos de
fibronectina (Fig. 1) tal como se describió previamente en el
Ejemplo 1. Se siguió el protocolo de infección retroviral del
Ejemplo 1 excepto en que se recogió la sangre del cordón umbilical
a partir de niños normales recién nacidos a tiempo completo, en
tubos que contenían heparina de acuerdo con los protocolos aprobados
por el Institutional Review Board of Indiana University School
of Medicine. Se realizaron ensayos de LTC-IC y
de metilcelulosa de acuerdo con el Ejemplo 1.
Usando el vector PGK-mADA de
mayor título, el análisis de las colonias derivadas del
LTC-IC demostró una expresión del cADN mADA
introducido de alto nivel sólo a partir de cultivos establecidos a
partir de sangre del cordón infectada usando el sobrenadante sobre
FN30/35. Se detectó una expresión pequeña de mADA en las colonias
derivadas de LTC-IC infectadas en las placas de
control de BSA.
Los resultados que se muestran en los Ejemplos 4
y 5 demuestran que también se puede conseguir la eficiencia de la
infección mejorada usando FN30/35 cuando se usan células madre y
células progenitoras de la sangre del cordón.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara el sobrenadante del virus
PGK-mADA y los fragmentos quimotrípticos de
fibronectina (Fig. 1) tal como se describió para el TKNEO en el
Ejemplo 1. Se sigue el protocolo de infección retroviral del Ejemplo
1 excepto en que se recoge la sangre del cordón a partir de niños
normales recién nacidos a tiempo completo, en tubos que contienen
heparina de acuerdo con protocolos aprobados por el Institutional
Review Board of Indiana University School of Medicine, y se
usan en vez de las células de médula ósea. Se realizan ensayos de
LTC-IC y de metilcelulosa de acuerdo con el Ejemplo
1.
\newpage
Ejemplos
7-11
Para los Ejemplos 7-11, se
utilizaron dos líneas celulares de empaquetamiento productoras de
retrovirus: la línea celular GP + E86 ecotrópica (Markowitz, D.;
Goff, S.; Bank, A. J. Virol. 1988, 62,
1120-1124) y la GP + envAM12 anfotrópica
(Markowitz, D.; Goff, S.; Bank, A. Virology 1988,
167, 400-406), respectivamente. Se enumeran
en la Tabla 1 las vectores retrovirales y los clones productores que
se usan en los estudios que se describen aquí.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron todas las líneas celulares en el
medio Eagle modificado por Dulbecco (DME, Gibco, Grand Island, NY)
que contenía suero fetal bovino al 10% (FCS, Hyclone, Logan, UT) y
penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 \mug/ml (P/S,
ambos de Gibco) excepto las células de EAL2a que se hicieron crecer
en DME-F12 (Gibco) con FCS al 10% más P/S. Se
recogió el virus que contenía el sobrenadante añadiendo 10 ml de
medio esencial mínimo alfa (\alphaMEM, Gibco) para las células de
murino o el Medio Dulbecco de Iscove (IMDM, Gibco) para las células
humanas, conteniendo cada uno FCS al 10% más P/S hacia placas de 10
cm confluyentes durante una noche. Se filtró el medio cosechado a
través de filtros de 0,45 micras (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) y
se almacenó a -80ºC hasta que se usó.
Ejemplo
7
Para los estudios con células de murino, se
cosechó médula ósea a partir de fémures y tibias de ratones C3H/HeJ
de entre 6 y 8 semanas de edad durante 2 días después de la
administración de 150 mg/kg de 5-fluorouracilo
(SoloPack Laboratories, Franklin Park, IL) (Lim, B.; Apperley, J.
F.; Orkin, S. H.; Williams, D. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1989, 86, 8892-8896). Se
preestimularon las células a un título de 5x10^{5} células/ml en
IMDM/FCS al 20% más P/S con el factor de célula madre recombinante
de rata de 100 ng/ml (nSCF; Amgen, Thousands Oaks, CA) e
interleucina-6 humana recombinante de 100
unidades/ml (rhIL6; Pepro Tech Inc., Rock Hill, NJ) durante 48
horas (Luskey, B.D.; Rosenblatt, M.; Zsebo, Z.; Williams, D.A.
Blood 1992, 80, 396-402.
Seguidamente, se comparó la eficiencia de la transferencia genética
con el vector PGK-hADA producida por las células
productoras de EPHA-5 usando tres protocolos de
infección diferentes: 1) infección sobrenadante; 2) infección
sobrenadante sobre FN 30/35; 3) cocultivo sobre células productoras
de EPHA-5. En consecuencia, se recubrieron los
platos de bacterias de 100 mm con FN 30/35 2,5 \mug/cm^{2}
(equivalente a 75 pmol/cm^{2}) disuelto en 5 ml de salino
tamponado con fosfato (PBS: Gibco) durante 1 hora a temperatura
ambiente bajo luz UV con la tapa del plato abierta y durante otra
hora con la tapa del plato cerrada. Después de bloquearlos con
albúmina sérica bovina al 2% (BSA, Fracción V; Boehringer Mannheim,
Indianapolis, IN) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se
lavaron una vez los platos con la Solución de Sal equilibrada de
Hank (HBSS) sumplementada con Hepes 1 M al 2,5% (v/v) (ambos de
Gibco). Para la infección de sobrenadante, se recubrieron los platos
con BSA únicamente. Se incubaron 5x10^{6} células donadoras
preestimuladas con 10 ml de sobrenadante de virus obtenido a partir
de células EPHA-5 tal como se describió arriba
suplementado con rhIL-6 100 U/ml, hrSCF 100 ng/ml y
polibreno 7,5 \mug/ml. Se recogieron las células no adherentes y
se reañadieron junto con el sobrenadante de virus fresco. Para el
cocultivo, se incubaron células EPHA-5 en 4 ml de
medio con mitomicina C 10 \mug/ml durante 2 horas a 37ºC, se
lavaron, se tripsinizaron y se sembraron sobre platos de cultivo de
tejidos de 100 mm a un título de 3x10^{6} células en 10 ml de
\alphaMEM/FCS al 20% más P/S. Al día siguiente, se añadieron
durante 48 horas 5x10^{6} células de médula ósea preestimuladas
con rhIL-6 100 U/ml, nSCF 100 ng/ml y polibreno 4
\mug/ml. Siguiendo el protocolo de infección, se decantaron las
células no adherentes y se recogieron las células hematopoyéticas
adherentes a partir de los cultivos usando el Tampón de Disociación
Celular (CDB) (libre de enzima/basado en PBS, Gibco) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante. Se añadieron las células
adherentes sobre la fracción no adherente, se lavaron dos veces, y
se suspendieron en 1 ml de HBSS/Hepes aproximadamente. Se
inyectaron las células totales que se obtuvieron a partir de
5x10^{6} células preestimuladas en las venas de la cola de tres
ratones cavidad que se habían sometido a la irradiación de cuerpo
total letal (con 700 más 400 de cGy, fuentes de Cs^{137}) (Luskey,
B.D.; Rosenblatt, M.; Zsebo, K.; Williams, D.A. Blood
1992, 80, 396-402). Se analizó la
transducción de las células madre hematopoyéticas mediante el
examen de los ratones reconstituidos para la expresión del cADN de
ADA humano introducido. Se realizó este análisis del isoenzima ADA
en ratones transplantados examinando las células de la sangre
periférica para la presencia de la proteína hADA mediante el
análisis in situ de los enzimas en acetato de celulosa (Lim,
B.; Williams, D. A.; Orkin, S. H. Mol. Cell. Biol.
1987, 7, 3459-3465). Se realizó el
examen comenzando 4 meses después del transplante y se repitió
mensualmente.
Generalmente se acepta que la reconstitución de
médula ósea a largo plazo de ratones con células madre
hematopoyéticas genéticamente manipuladas es adecuada para
determinar la eficiencia de la transducción de las células madre
después de un período de 4 meses después del transplante. El
análisis de las cavidades de la médula ósea transducida después de
7 meses mediante el análisis de isoenzimas reveló que: 1) la
expresión del cADN de ADA humano estaba presente usando el
cocultivo o la infección sobrenadante sobre FN 30/35 pero estaba
ausente en el grupo transplantado después de la infección
sobrenadante sin FN 30/35 y que; 2) los niveles de expresión eran
comparables para el cocultivo y los grupos FN 30/35. Tal como se
muestra en la Figura 4, calles 2-4, tres ratones
transplantados con médula ósea transducida mediante cocultivo sobre
células EPHA-5 demostró ADA humano fácilmente
detectable. Se detectaron niveles similares de ADA humano en tres
ratones transplantados con células hematopoyéticas transducidas
mediante infección sobrenadante de FN 20/35 (Figura 4, calles
5-7). En contraste, no se detectó ADA humano en
tres ratones transplantados con células hematopoyéticas transducidas
mediante infección sobrenadante sobre BSA (Figura 4, calles
8-10). Se muestran los controles para la
localización del ADA humano en las calles 1 y 12 y el ADA de murino
en la calle 11 de la Figura 4. La banda de murino en las calles
2-10 revela que se cargaron cantidades iguales de
proteína. Estos datos demuestran que la transducción de las células
madre hematopoyéticas reconstituyentes a largo plazo mediante
infección sobrenadante sobre FN 30/35 es equivalente al cocultivo y
muy superior a la infección sobrenadante sin FN 30/35.
Ejemplo
8
Para probar si la transducción incrementada es
el resultado de la colocalización de virus y células
hematopoyéticas, se analizó si las partículas recombinantes
retrovirales demostraban enlace a FN 30/35. Por ello, se
preincubaron placas recubiertas con FN 30/35 con sobrenadante que
contenía el virus TKNeo durante 30 minutos y se lavaron después
extensivamente. Se determinó el título viral del sobrenadante usando
células NIH/3T3 de acuerdo con procedimientos estándar (Markowitz,
D.; Goff, S.; Bank, A. J. Virol. 1988, 62,
1120-1124. Brevemente, se colocaron las células 3T3
a un título de 1000 células/pozo en una placa de cultivo de tejidos
de 6 pozos y se dejaron crecer durante una noche. Se añadieron
diluciones en serie del sobrenadante del virus sobre cada pozo con
polibreno 7,5 \mug/ml y se incubaron durante 2,5 horas a 37ºC
después de lo que se añadieron 2 ml de medio. Después de 24 horas,
se sustituyó el medio con medio que contenía G418 (0,75 mg/ml, polvo
seco, Gibco) y se incubaron las placas durante
10-12 días. Se tiñeron las colonias resistentes a
G418 (G418^{r}) después de 10-12 días y se
marcaron. Se usó el número de colonias/pozo multiplicado por la
dilución del sobrenadante del virus como las partículas infecciosas
(cfu)/ml de sobrenadante. Se evaluó/"tituló" la cantidad de
partículas retrovirales que permanecían en las placas de 35 mm
recubiertas con FN 30/35 o con BSA después de la preincubación con
el sobrenadante del virus y del lavado intensivo añadiendo 1000
células NIH/3T3 por placa bacteriológica de 35 mm más polibreno.
Veinticuatro horas después, se alimentaron los cultivos con un medio
que contenía 0,75 mg/ml de G418 (polvo seco) y se incubaron aún más
las células durante 10-12 días. Siguiendo esta
incubación, se cuantificó la presencia de virus adherente
enumerando las colonias de NIH/3T3 resistentes a G418.
Para evaluar si la unión del virus a FN 30/35 se
produce de modo dependiente de la dosis, se repitieron los
experimentos de arriba con concentraciones crecientes de FN 30/35
recubriendo los platos. Por lo tanto, se recubrieron los platos
bacteriológicos de 35 mm con FN 30/35 de 1, 4, 10 y 20
\mug/cm^{2} tal como se describió arriba. Se incubó una
dilución 1:50 de un stock de virus de TKNeo que se había titulado
previamente en 1x10^{4} partículas infecciosas/ml sobre placas
recubiertas con F30/35 durante 30 minutos. Después de un lavado
intensivo, se añadieron 2000 células NIH/3T3 en cada pozo. Se llevó
a cabo la selección del mismo modo que arriba y se contaron las
colonias de NIH/3T3 resistentes a G418 después de 10 días de
selección.
La Figura 5 indica los resultados de uno de los
tres experimentos representativos. Usando el sobrenadante TKNeo, se
redujeron las concentraciones retrovirales que se habían medido
mediante las colonias G418^{r} en las células NIH/3T3 en más de 3
unidades logarítmicas (desde 4x10^{3} hasta 0) sobre placas
recubiertas con BSA, mientras que la reducción de el título era
sólo de una unidad logarítmica sobre placas recubiertas con FN
30/35. Estos datos demuestran que se enlaza el retrovirus
cuantitativamente a FN 30/35 pero que no se enlaza a placas
recubiertas con BSA (platos de control). La Figura 6 muestra que se
detectaron números crecientes de colonias resistentes a G418 cuando
se incubó el sobrenadante que contenía el virus sobre placas
recubiertas con concentraciones crecientes de FN 30/35. Por ello, la
unión del virus a FN 30/35 ocurre de un modo dependiente de la
dosis.
Ejemplo
9
Kimizuka et al. han informado previamente
de la expresión de las secuencias de ADN de FN clonadas en E.
coli (Kimizuka, F.; Taguchi, Y.; Ohdate, Y.; Kawase, Y.;
Shimojo, T.; Hashino, D.; Kato, I; Sekiguchi, K.; Titani, K. J.
Biochem. 1991, 110, 284-291). Los
péptidos quiméricos y clonados incluyen una o una combinación de
varias secuencias importantes en la fibronectina que se conoce que
participan en la adhesión celular (incluyendo RGDS,
CS-1 y el lugar de unión de la heparina), ver Figura
7. Para analizar si se puede enlazar el retrovirus a estos
fragmentos de FN recombinantes, se repitieron los ensayos de
formación de las colonias celulares de 3T3 sobre placas recubiertas
con los fragmentos recombinantes C-274,
H-271, H-296,
CH-271, CH-296, y
C-CS1 así como FN 30/35 como control positivo,
usando dos diluciones diferentes (1:10 y 1:100) del stock de TKNeo
de retrovirus congelado con 1x10^{4} partículas infecciosas/ml. Se
usaron fragmentos de FN a un título de 120-130
pmol/cm^{2} (equivalente a 4 \mug/cm^{2} para
C-274, H-271, H-296,
C-CS1, FN 30/35 y 8 \mug/cm^{2} para
CH-271 y CH-296). Brevemente, se
recubrieron las placas, se añadió el virus, se lavaron
extensivamente las placas, se añadieron las células NIH/3T3 durante
24 horas y entonces se hicieron crecer en un medio de selección
durante 10 días, se tiñeron posteriormente las colonias y se
contaron.
contaron.
La Figura 8 demuestra que el número de colonias
resistentes a G418 (y en consecuencia de adhesión al virus) se
incrementó en los fragmentos H-271,
H-296, CH-271 y
CH-296. Además, muestra que la cantidad de virus
enlazado era escasamente comparable entre estos fragmentos
recombinantes y FN 30/35, aunque en este trabajo el fragmento
CH-271 exhibió el mayor nivel de enlace a virus.
Común a los 5 fragmentos de FN eran las repeticiones
12-14 de tipo III que contienen el lugar de unión
de la heparina de elevada afinidad (Ruoshlati, E. Ann. Rev.
Biochem. 1988, 57, 375-413 y
Kimizuka, F.; Taguchi, Y.; Ohdate, Y.; Kawase, Y.; Shimojo, T.;
Hashino, K; Kato, I.; Sekiguchi, K.; Titani, K. J. Biochem.
1991, 110, 284-291 situado
probablemente en la repetición 13 (Kimizuka, F.; Taguchi, Y.;
Ohdate, Y.; Kawase, Y.; Shimojo, T.; Hashino, K.; Kato, I.;
Sekiguchi, K.; Titani, K. J. Biochem. 1991,
110, 284-291. Esto sugiere que el enlace al
virus ocurre a través de este lugar de adhesión conocido. Esto se
evidenció mediante platos preincubados recubiertos con 4
\mug/cm^{2} de CH-271 con concentraciones
crecientes (10-1000 \mug/ml) de sulfato de
heparina, una molécula altamente cargada que se conoce que exhibe
un enlace celular al lugar de enlace de la heparina. Tal como se ve
en la Figura 9, se disminuye el número de colonias resistentes a
G418 siguiendo la preincubación de CH-271 con
concentraciones crecientes de sulfato de heparina. Estos datos
sugieren que el enlace del virus a FN está mediado a través del
lugar de enlace a la heparina de afinidad elevada que está situado
inmediatamente adyacente al lugar CS-1 en los
dominios carboxilo-terminales de FN.
Ejemplo
10
Para analizar si la transducción incrementada de
células hematopoyéticas que se describió previamente sobre FN 30/35
también se podía ver con fragmentos de FN recombinantes, se evaluó
la eficiencia de la transducción de las infecciones sobrenadantes
in vitro usando ensayos de células que formen potencialmente
colonias altamente proliferativas (HPP-CFC).
Utilizando vectores EAL2a, se comparó la influencia de varios
fragmentos de FN recombinantes frente a la infección sobrenadante
de FN 30/35 sobre el BSA sobre la transducción de células
hematopoyéticas usando el crecimiento de las colonias resistentes a
G418 como un indicador de la transferencia genética. Además, se
comparó la habilidad de las partículas del virus que ya eran
adherentes sobre los fragmentos de FN (frente al virus
sobrenadante) para transducir las células hematopoyéticas. Se
incubaron entre 0,5 y 1x10^{6} células de médula ósea
preestimuladas sobre placas de petri recubiertas con FN de 35 mm en
1-2 ml de virus EAL2a que contenía el sobrenadante
con factores de crecimiento y polibreno 5 \mug/ml tal como se
trató arriba. Para evaluar la transducción de las células
hematopoyéticas por el virus enlazado a los fragmentos de FN, se
lavaron las placas recubiertas con FN de 35 mm incubadas con el
sobrenadante que contenía el virus tres veces con 2 ml de PBS cada
una. Posteriormente, se añadieron entre 0,5 y 1x10^{6} células de
médula ósea preestimuladas en 2 ml de medio suplementado con
factores de crecimiento y polibreno. 22 horas después, se
cosecharon las células y se colocaron sobre ensayos
CFC-HPP con y sin G418 1,5 mg/ml tal como se
describió (Bradley, T.R.; Metcalf, D. Aust. J. Exp. Biol. Med.
Sci 1966, 44, 287-293. Se
incubaron los cultivos durante 14 días en CO_{2} al 7% a 33ºC y
se calculó la eficiencia de la transferencia genética como el
porcentaje de colonias resistentes a G418.
La transducción de las células hematopoyéticas
primitivas a través de la infección con el sobrenadante (Figura 10)
era significativamente mayor que la infección sobrenadante sobre el
BSA para todos los fragmentos que incluían el lugar de enlace de la
heparina (HBS) y como mínimo un lugar de adhesión celular activo más
(barras sólidas). La eficacia de la transducción de los fragmentos
recombinantes CH-271, H-296,
CH-296 y C-CS1 era similar al
efecto de FN 30/35, incluyendo los tres fragmentos tanto el lugar
CS-1 como el lugar de unión de la heparina. Estos
datos demuestran que se puede replicar la transducción incrementada
de las células hematopoyéticas primitivas que se han mostrado
previamente en FN 30/35 sobre fragmentos de FN recombinantes. Esto
demuestra además que el virus enlazado directamente a la
fibronectina es capaz de la transducción genética de las células
hematopoyéticas. Finalmente confirma la utilidad de la presencia
tanto del lugar CS-1 como del lugar de unión de la
heparina para la transducción de las células (madre) precursoras
hematopoyéticas primitivas.
Ejemplo
11
Se repitieron los estudios in vitro de
arriba (a partir del Ejemplo 10) para las células progenitoras
hematopoyéticas primitivas comparando la infección sobrenadante
sobre el BSA vs FN 30/35 frente a los fragmentos de FN
recombinante frente al cocultivo usando el transplante de médula
ósea para analizar los efectos sobre la reconstitución de las
células madre hematopoyéticas. Brevemente, se inyectaron en los
ratones irradiados letalmente células donadoras que se transdujeron
con los vectores EPHA-5 que contenían cADN de ADA
humano. Después de un mes, se analizó la eficacia de la
transferencia genética a partir de la sangre periférica en ensayos
de isoenzimas de ADA.
La Figura 11 muestra claramente que el fragmento
de fibronectina H-296 que contiene tanto el lugar de
unión de la heparina como el CS-1 proporciona
resultados similares para FN 30/35 y el cocultivo. Los fragmentos
que no contienen ambos lugares son menos efectivos en la
transducción de una célula hematopoyética transplantable. Estos
datos demuestran que la colocalización de las células
madre/hematopoyéticas primitivas y del retrovirus enlazado a los
fragmentos de FN recombinantes que contienen tanto el lugar de
enlace del CS-1 como de la heparina transduce
efectivamente las células hematopoyéticas transplantables.
Mientras que se ha ilustrado y descrito con
detalle la invención en la descripción anterior, se considerará lo
mismo como ilustrativo y no restrictivo en carácter, entendiendo que
sólo se ha descrito la representación preferida y que se desea
proteger todos los cambios y modificaciones que se incluyan dentro
del alcance de las reivindicaciones.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: (1) Indiana University Foundation
\hskip3.9cm(2) Northwestern University
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- INVENTORES: Williams, David, A.
\hskip3.9cmPatel, Vikram, P.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Transferencia de ADN mediada por virus mejorada
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: P.B. Atkinson
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FIRMA: Marks & Clerk
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CALLE: Sussex House, 83-85 Mosley Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CIUDAD: Manchester
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: UK
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: M3 3JY
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 95914912.1
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 27 de marzo de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Atkinson, Peter B.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE SUMARIO/REFERENCIA: D002337PEP
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: +44 161 236 2275
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: +44 161 236 5846
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NÚM 1:
\hskip0.4cmCARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 271 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NÚM. 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NÚM 1:
\hskip0.4cmCARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TOPOLOGÍA:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC NÚM. 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (9)
1. Un método ex vivo para incrementar la
frecuencia de la transducción de células hematopoyéticas viables
mediante un vector retrovirus recombinante defectuoso en la
replicación, que comprende infectar células hematopoyéticas viables
con un vector retrovirus recombinante defectuoso en la replicación
en presencia del fragmento de fibronectina CH-296
recombinante sustancialmente puro, para incrementar la frecuencia de
la transducción de las células hematopoyéticas mediante el vector
retrovirus.
2. El método de la reivindicación 1 donde las
células hematopoyéticas tienen una deficiencia o anormalidad de
proteínas y el vector retrovirus recombinante incluye un gen exógeno
que codifica la proteína.
3. El método de la reivindicación 2 donde el gen
exógeno es un gen que codifica la adenosina desaminasa.
4. El método de la reivindicación 3 donde el gen
exógeno es un gen que codifica la adenosina desaminasa humana.
5. El método de la reivindicación 1 donde las
células hematopoyéticas comprenden las células madre humanas.
6. El método de la reivindicación 5 donde se
caracterizan las células hematopoyéticas por ser células
mononucleares no adherentes, de baja densidad.
7. Un equipo para el uso para llevar a cabo la
transferencia de ADN mediada por retrovirus en células
hematopoyéticas humanas, que comprende:
- (a)
- el fragmento de fibronectina CH-296 recombinante sustancialmente puro.
- (b)
- un sustrato artificial sobre el que incubar un vector retroviral en contacto con células hematopoyéticas; y
- (c)
- factores de crecimiento de células hematopoyéticas para preestimular las células hematopoyéticas.
8. El equipo de la reivindicación 7 donde se
inmoviliza dicho fragmento de fibronectina CH-296
recombinante sobre dicho sustrato artificial.
9. El equipo de la reivindicación 8 que también
incluye:
- (e)
- un vector retroviral recombinante para transducir las células hematopoyéticas humanas.
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|---|---|---|---|
| US08/218,355 US5686278A (en) | 1994-03-25 | 1994-03-25 | Methods for enhanced retrovirus-mediated gene transfer |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95914912T Expired - Lifetime ES2294781T3 (es) | 1994-03-25 | 1995-03-27 | Transferencia de adn mediada por virus mejorada. |
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