KR101043871B1

KR101043871B1 - 동종 제대혈 혈청 또는 혈장을 사용하는 유전자 도입 방법

Info

Publication number: KR101043871B1
Application number: KR1020080080405A
Authority: KR
Inventors: 오일환
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2008-08-18
Filing date: 2008-08-18
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2028-08-18
Also published as: KR20100021793A

Abstract

본 발명은 동종의 제대혈 혈청 또는 혈장 및 레트로바이러스 벡터를 포함하는 레트로바이러스 벡터의 표적세포로의 유전자 도입효율을 증가하기 위한 조성물, 및 상기 조성물의 존재 하에 표적세포를 레트로바이러스 벡터로 감염시키는 것을 포함하는 레트로바이러스 벡터에 의해 유전자를 표적세포로 도입하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자 도입 방법에 의해 얻어진 유전자가 도입된 세포, 및 상기 유전자 도입된 세포를 개체에 이식하는 것을 포함하는 세포의 이식방법에 관한 것이다.

제대혈 혈청, 제대혈 혈장, 유전자 도입

Description

동종 제대혈 혈청 또는 혈장을 사용하는 유전자 도입 방법 {Gene transfer method with the use of allogenic umbilical cord blood serum or plasma}

본 발명은 레트로바이러스 벡터 및 동종의 제대혈 혈청 또는 혈장을 포함하는 레트로바이러스의 표적세포로의 유전자 도입효율을 증가하기 위한 조성물, 및 상기 조성물의 존재 하에 표적세포를 레트로바이러스 벡터로 감염시키는 것을 포함하는 레트로바이러스 벡터에 의해 유전자를 표적세포로 도입하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 유전자 도입 방법에 의해 얻어진 유전자가 도입된 세포 및 상기 유전자 도입 세포를 인간을 제외한 척추동물로 이식하는 것을 포함하는 세포의 이식방법에 관한 것이다.

조혈줄기세포 (Hematopoietic stem cell, HSC)는 평생에 걸쳐 혈액을 생산할 수 있는 극소수의 세포로서 자가재생산과 장기생착을 가능하게 하는 세포이다 (Dick et al ., 1985; Lemischka et al ., 1986; Eaves et al ., 1997). 실제로 다분화능력을 가진 조혈줄기세포는 선천성 조혈대사 질환이나 면역결핍 등의 유전자 치 료의 줄기세포유전자 치료의 줄기세포 응용이 기대된다 (Kohn, 1996; Sadelain et al ., 2005; Cohen-Haguenauer et al ., 2006), (Biffi and Naldini, 2005), (Candotti et al ., 1996; Onodera et al ., 1999; Cavazzana-Calvo et al ., 2000; Aiuti et al ., 2002; Gaspar et al ., 2004). 이런 임상적 치료를 위해 최근에는 원하는 유전자를 레트로바이러스로 조혈줄기세포에 도입시켜 이식하려는 유전자 치료연구가 이루어지고 있다.

레트로바이러스 벡터는 관심있는 외래 유전자를 세포 내로 효율적으로 도입하고 유전자를 그 염색체 DNA로 안정하게 도입시키므로, 특히 장기간 유전자 발현을 원하는 유전자 치료요법을 위해 바람직한 유전자 도입수단으로 사용되고 있다. 이 벡터는 유전자가 도입된 개체에 대해 악영향을 미치지 않도록 다양하게 변형시켜 사용된다. 예를 들어, 벡터의 복제능을 제거하여 유전자 도입에 사용하는 벡터가 무제한적인 감염(유전자 도입)을 반복하면서도 세포 내에서 복제하지 않도록 한다. 그러한 복제-결손 레트로바이러스 벡터는 스스로 복제할 수 없으며, 일반적으로 레트로바이러스 생산 세포(팩키징 세포)를 사용하여 벡터가 바이러스 입자 내에 캡시드로 둘러싸인(encapsidated) 레트로바이러스를 제조한다.

그러나, 수많은 그룹에 의한 연구에도 불구하고, 조혈줄기세포는 유전자가 쉽게 높은 효율로 도입되지 않는 세포 중의 하나이다. 지금까지, 마우스 또는 기타 동물로부터의 조혈줄기세포에 대해 유전자를 도입하기 위한 가장 효율적인 프로토콜은 조혈줄기세포를 레트로바이러스 생산 세포와 동시-배양(co-culture)하는 방법이었다. 그러나, 안전성에 대한 우려로 인해, 레트로바이러스 생산 세포가 오염될 위험성이 낮은 무세포(cell-free) 시스템에서 유전자를 도입하는 것이 인간을 위한 유전자 도입방법을 위해 요구되어 왔다. 불행하게도, 레트로바이러스 생산 세포와 동시-배양하지 않고 유전자를 조혈줄기세포로 효율적으로 도입하는 것은 쉽지가 않다.

특히, 많은 레트로바이러스를 이용한 유전자 치료를 위한 연구들이 바이러스생산세포의 배양 및 조혈줄기세포를 지지하는 역할로서 우태아 혈청을 사용해 왔으나 (Cavazzana-Calvo et al ., 2000; Dando et al ., 2001; Aiuti et al ., 2002; Hacein-Bey-Abina et al ., 2002), 이를 이용한 배지들은 광우병과 같은 감염이나, 알레르기 반응과 같은 안전성의 문제 등으로 인해 임상적 적용의 한계 요인이 되고 있다 (Selvaggi et al ., 1997; Tuschong et al ., 2002; Spees et al ., 2004). (Even et al ., 2006). 이런 이유로 유전자 전달 방법에 무혈청 배지나 우태아 혈청을 대체할 수 있는 배지에 대한 연구가 진행되고 있다 (Eckert et al ., 2000; Cohen-Haguenauer et al ., 2006). 그러나, 이러한 무혈청대체 배지에 의해서도 우태아 혈청을 포함한 배지와 동일한 유전자 전달효율을 나타내야 하며, 레트로바이러스를 이용한 전이시에도 같은 효율을 얻어야 하나 이에 대한 연구조사는 더 필요한 상황이다 (Merten, 2004; Coroadinha et al ., 2006).

한편, 동종의 재대혈에서 유래된 혈청과 혈장은 의료폐기물로 취급되어 구하기 쉽고, 이종 간의 항체나 미생물에 의한 감염의 위험이 없어 안전한 혈청으로 주목 받고 있다.또한 제대혈 혈청의 함유성분은 제대혈 유래 세포의 미분화 상태의 유지역할에 기여한다고 보고되었다 (Broxmeyer et al ., 1994; Bogunia-Kubik et al ., 2002; Bogunia-Kubik et al ., 2003)

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 조혈줄기세포의 재구성 능력을 측정하기 위하여 NOD/SCID 마우스를 이용한 실험에서, 제대혈 유래 혈청과 혈장이 조혈줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 능력 및 레트로바이러스 입자 안정성을 유지하여 유전자 전달 효율을 높일 수 있는 가능성에 대해 조사하였다. 그 결과, CD34 양성세포를 제대혈청이나 혈장을 사용하여 유전자 전이하였을 때 무혈청배지나 우혈청에 비해 더 높은 비율로 유전자 전이된 골수재구성이 일어남을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 동종의 제대혈 혈청 또는 혈장의 존재 하에 표적세포를 레트로바이러스로 감염시키는 것을 포함하는, 레트로바이러스에 의해 유전자를 표적세포로 도입하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 도입 방법에 의해 얻어진 유전자가 도입된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 유전자 도입 방법에 의해 얻어진 유전자가 도입된 세포를 개체에 이식하는 것을 포함하는, 세포의 이식방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 동종의 제대혈 혈청 또는 혈장 및 레트로바이러스 벡터를 포함하는, 레트로바이러스 벡터의 표적세포로의 유전자 도입효율을 증가하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 동종의 제대혈 혈청 또는 혈장의 존재 하에 표적세포를 레트로바이러스로 감염시키는 것을 포함하는, 레트로바이러스에 의해 유전자를 표적세포로 도입하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 동종의 제대혈 혈청 또는 혈장 및 레트로바이러스 벡터를 포함하는, 레트로바이러스 벡터의 표적세포로의 유전자 도입효율을 증가하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 "제대혈 혈청 (umbilical cord blood serum, CBS)" 또는 "제대혈장 (cord blood plasma, CBP)"은 태아의 탯줄에서 분리한 혈청 또는 혈장을 말한다. 본 발명의 제대혈 혈청 또는 혈장은 바람직하게는 태아의 출산 또는 사산 시 버려진 탯줄에서 얻을 수 있다. 제대혈은 탯줄 정맥으로부터 혈액 백(blood bag)에 연결된 주사바늘을 삽입시켜 수집할 수 있다. 이 혈액 수집은 실온에서 시행되며, 한 탯줄당 최대 100 cc까지 얻을 수 있다. 이 모든 과정은 오염이 없는 크린룸에서 시행될 수 있다.

본 발명의 제대혈 혈청 또는 혈장의 기원으로는, 사람, 소, 염소, 돼지, 말 등의 탯줄이 있는 동물이면 어떠한 기원도 가능할 것이며, 바람직하게는 사람, 소에서 기인한 것이며, 보다 바람직하게는 사람에서 기인한 것이다. 또한 본 발명의 제대혈 혈청 또는 혈장은 동종의 것을 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에서 사용하는 배양 배지에는 그것이 동종의 제대혈 혈청 또는 혈장을 함유하는한 제한이 없다. 그러한 배지의 기본 성분은 아미노산, 당, 유기산과 같은 에너지원, 비타민, pH 조절용 완충성분, 무기염 등을 포함한다. 배지는 페놀레드와 같은 pH 지시약을 함유할 수 있다. 예를 들어, Gibco-BRL로부터 구입할 수 있는, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), IMDM (Iscoves Modified Dulbecco's Medium) 등과 같은 공지의 배지를 기본 배지로 사용할 수 있다.

또한, 유전자 도입을 위한 표적세포의 타입 및 기타 목적에 따라 다양한 성 분을 이들 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 표적세포는 G0 기에 있을 때에는 레트로바이러스로 감염되지 않기 때문에 세포들을 전 처치 (prestimulation)하여 세포주기로 유도하는 것이 바람직하다. 이 목적을 위하여, 세포를 레트로바이러스로 감염시키기 전에 표적세포를 적당한 표적세포 사이토카인 또는 성장인자의 존재하에서 배양한다. 예를 들어, 인터루킨(IL-3, IL-6 등), 콜로니 자극인자(G-CSF, GM-CSF 등), 간세포 인자(stem cell factor, SCF), hFlt3 (human flt-3 ligand) 에리트로포이에틴, 다양한 세포성장 인자 등과 같은 표적세포 성장인자를 유전자 도입용 골수세포 또는 조혈줄기세포를 전 처치 (prestimulation)하는데 사용할 수 있다. 인간으로부터 유래된 이들 수많은 사이토카인은 상업적으로 입수가능하다. 이들 사이토카인을 사용하여, 관심 있는 활성을 갖는 것을 선별하며, 임의로 또다른 것과 결합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 유전자를 도입하는 방법에는 재조합 레트로바이러스 벡터를 통상적으로 사용한다. 특히, 바람직하게는 복제-결손 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용한다. 그러한 벡터는 복제 능력이 제거되었기 때문에 감염된 세포 내에서 자가 복제할 수 없고 비병원성이다. 벡터가 팩키징되는 레트로바이러스는 척추동물 세포 특히, 포유동물 세포와 같은 숙주세포로 침투할 수 있으며 벡터 내에 삽입된 외래 유전자를 염색체 DNA로 안정하게 도입시킨다.

또한, 레트로바이러스의 일종인 렌티바이러스 벡터를 이용한 경우에도 마찬가지의 높은 유전자 도입 효율을 얻을 수 있다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 핵공(nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체(바이러스 쉘(shell))의 친핵성으로 인해 분열 세포 뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다. 일반적인 레트로바이러스는 세포가 분열할 때 세포의 핵막을 파괴하며 핵으로 진입하기 때문에, 분열하는 세포에만 감염이 가능지만, 렌티바이러스는 렌티 바이러스의 캡시드가 핵공을 통해 세포의 핵으로 진입하기 때문에 분열하지 않는 세포에도 감염이 가능하므로 증식하지 않는 다수의 인간세포를 감염시킬 수 있는 장점을 가진다. 이러한 특징으로 최근에는 렌티바이러스 벡터를 인체 내 유전자 이상에 의해 발생하는 유전병이나 암을 치료하기 위해 생체 내로 유전자를 도입하기 위한 전달체로서 이용하기 위한 연구가 진행되고 있다. 보고에 따르면, 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)으로부터 유래되는 렌티바이러스 벡터는 시험관내 및 생체내 비유사분열 세포 내로의 트랜스 유전자의 유효한 전달, 통합 및 장기간 발현을 매개할 수 있다고 한다(Naldini et al., 1996a; Naldini et al., 1996b; Blomer et al., 1997).

본 발명에서, 세포로 도입하는 외래 유전자를 적절한 프로모터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터에 존재하는 LTR 프로모터 또는 외래 프로모터의 제어 하에 레트로바이러스 벡터로 삽입함으로써 사용할 수 있다. 또한, 외래 유전자의 전사를 수행하기 위하여, 프로모터 및 전사 개시 위치와 서로 작용하는 인핸서(enhancer) 서열과 같은 다른 조절요소가 벡터 내에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 도입된 유전자는 유전자 하부에 위치하는 종결서열을 추가로 수반한다.

도입하는 외래 유전자는 자연적으로 발생하는 유전자이거나 인공적으로 제조 된 유전자일 수 있다. 또한, 외래 유전자는 서로 다른 기원의 DNA 분자가 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 서로 연결(ligation)된 것일 수 있다. 세포로 도입하기를 원하는 모든 유전자를 레트로바이러스 벡터에 삽입하는 외래 유전자로 선택할 수 있다. 예를 들어, 치료하고자 하는 질병과 관련된 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자, 안티센스 핵산 또는 리보자임, 세포내 항체, 성장인자 등을 외래 유전자로 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 레트로바이러스 벡터는 유전자가 도입된 세포를 선별할 수 있도록 적당한 마커 유전자를 가질 수 있다. 예를 들어, 세포에 항생제에 대한 내성을 부여하는 약제 내성 유전자, 또는 효소 활성을 검출함으로써 유전자가 도입된 세포를 분별할 수 있게 하는 리포터 유전자를 마커 유전자로 사용할 수 있다.

사용가능한 백터는 예를 들어, MFG 벡터(ATCC No. 68754), α-SGC(ATCC No. 68755) 등과 같은 공지의 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 이들 벡터를 PG13(ATCC CRL-10686), PG13/LNc8(ATCC CRL-10685), PA317(ATCC CRL-9078), GP+E-86(ATCC CRL 9642) 및 GP+envAm-12(ATCC CRL9641), Psi-Crip(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 6460-6464 (1988)) 등과 같은 공지의 팩키징 세포주를 사용하여 벡터를 팩키징한 바이러스 입자로 제조할 수 있다.

본 발명의 방법에 의한 유전자 도입을 위한 표적으로 사용하는 세포에는 제한이 없다. 예를 들어, 줄기세포, 조혈세포, 비부착성 저밀도 단핵세포, 부착성 세포, 골수세포, 조혈줄기세포, 말초 혈액 간세포, 탯줄 혈액 세포, 태아 조혈 줄기 세포, 배발생 간세포, 배세포, 원시 배아세포, 난모세포, 난원세포, 난자, 정모세포, 정자, CD34+ 세포, c-kit+ 세포, 다능성 조혈 전구세포, 단능성 조혈 전구세포, 적혈구계 전구세포, 림프 모세포, 성숙 혈액 세포, 림프구, B 세포, T 세포, 피브로블라스트, 뉴로블라스트, 뉴로사이트, 표피세포, 혈관 표피세포, 헤파토사이트, 미오블라스트, 골격근 세포, 평활근 세포, 암 세포, 마이엘로마 세포, 루케미아 세포 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 방법을 바람직하게는 혈액 및 골수로부터 얻을 수 있는 조혈계 세포에 대해 사용하는데, 이들 세포가 비교적 얻기 쉽고 그들을 배양하고 유지하는 기술이 확립되어 있기 때문이다.

바람직하게, 도입된 유전자의 장기 발현을 원하는 경우, 조혈줄기세포, CD34+ 세포, c-kit+ 세포, 다능성 조혈 전구세포 등과 같은 혈액 전구세포가 표적세포로 적당하다.

바이러스-생산 세포의 배양 상등액과 같은, 레트로바이러스를 함유하는 샘플을 본 발명의 유전자 도입 방법에 사용한다. 상등액을 제조하는 방법은 특정적인 것으로 제한되지 않는다. 예들 들면, 바이러스-생산 세포 배양 중에 소듐 부티

레이트를 가하면 상등액 중에 생산된 바이러스 입자의 양을 증가시킨다는 것이 공지되어 있다 (Human Gene Therapy, 6:1195-1202, 1995). 이렇게 제조된 고-역가 바이러스 상등액은 본 발명의 유전자 도입 방법을 사용하여 아무 문제없이 사용될 수 있다.

본 발명에서 우리는 조혈줄기세포에 대한 유전자 전달과정에서 안전성과 효율성 면에서 동종제대혈 혈청이나 혈장을 이용함으로써 우혈청 (fetal bovine serum, FBS) 에 비해 더 나은 결과를 얻을 수 있는지 조사하였다.

CD34 양성세포가 제대혈청 (umbilical cord blood serum, CBS)이나 제대혈장 (cord blood plasma, CBP) 에 배양하였을 때 우혈청이나 무혈청 배지 (serum free media, SFM) 에서 배양한 것에 비해 생착량이 증가하였고(도 1C), NOD/SCID 생쥐에서 관찰된 양성 생착의 비율이 더 높았다. 제대혈청이나 혈장은 VSV-G 나 영장류 백혈병 바이러스 (Gibbon Ape Leukemia virus) 의 표면단백질로 코팅된 레트로바이러스에 대한 안정성도 더 높였다 (도 2). 이에 따라 CD34 양성세포를 제대혈청이나 혈장을 사용하여 유전자 전이하였을 때 SFM 이나 FBS 에 비해 더 높은 비율의 유전자 전이된 골수재구성을 관찰할 수 있었다 (도 3). 이러한 증가는 수여자 마우스의 골수에서 조혈전구세포들이 보다 높은 비율로 유전자 전이되는 것과 관련이 있었다 (도 4). 중요한 것은 결합매개성 유전자 증폭 (ligation-mediated PCR (LM-PCR)로 검색하였을 때 다양한 클론들이 유전자 전이되고 있는 것을 발견하였다 (도 5). 따라서 본 발명은 동종 제대혈에서 유래된 혈청이나 혈장이 임상적으로 사용할 수 있는 안전하고도 보다 효과적인 유전자 전이의 방법이 될 수 있을 뿐 아니라, 주변에서 쉽게 구할 수 있어 앞으로 임상적 목적의 조혈줄기세포에 대한 유전자 조작에 널리 사용될 수 있음을 알 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 도입 방법에 의해 얻어진, 유전 자가 도입된 세포에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 도입 방법에 의해 얻어진 유전자가 도입된 세포를 척추동물로 이식하는 것을 포함하는, 세포의 이식방법에 관한 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 유전자가 도입되는 세포를 개체에 이식함으로써, 외래 유전자가 생체 내에서 발현되는 유전자 치료요법이 가능해진다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 유전자가 도입된 세포는 이종 동물로부터의 혈청으로부터 유래된 단백질이나 불순물을 함유하지 않고 이종간의 항체나 미생물에 의한 감염의 위험이 없기 때문에, 개체로의 이식에 적당하다. 예를 들어, 표적세포로서 조혈줄기세포를 사용하는 유전자 치료요법을 하기 과정에 의해 수행할 수 있다.

먼저, 골수 조직, 말초 혈액, 탯줄 혈액 등과 같은 조혈줄기세포를 함유하는 재료를 공여체로부터 모은다. 그러한 재료를 유전자 도입과정에 직접 사용할 수 있으나, 통상 조혈줄기세포를 함유하는 단핵성 세포 분획을 밀도 구배 원심분리 등에 의해 제조하거나, 추가로 조혈줄기세포를 CD34 및/또는 c-kit와 같은 세포 표면 마커 분자를 사용하여 정제한다. 조혈줄기세포를 함유하는 재료를, 필요한 경우, 적당한 세포 성장인자로 전 처치 (prestimulation)한 후, 관심 있는 유전자를 본 발명의 방법에 의해 삽입한 재조합 레트로바이러스 벡터로 감염시킨다. 그렇게 하여 얻은 유전자가 도입된 세포를 예를 들어, 정맥투여에 의해 수용체로 이식할 수 있다. 수용체는 바람직하게는 공여체 자신이지만, 동종(allogenic) 이식을 수행할 수도 있다. 예를 들어, 탯줄 혈액을 재료로 사용하는 경우, 동종 이식을 수행한다.

본 발명의 방법은 예를 들어 암 및 백혈병을 포함하는 골수 질환 및 단백질 결핍 또는 단백질 이상과 관련된 질환을 포함하는 여러가지 질환을 위한 유전자 치료요법에 사용될 수 있다. 본 발명이 사용될 수 있는 대표적인 질환에는 예를 들면, 유전자 치료요법이 기대되는 질환은 중증 복합성 면역 결핍증(severe combined immunodeficien cy disease; SCID)을 유발하는 ADA(Adenosine Deaminase Deficiency) 결핍증, 예를 들어 ADA-결핍성 SCID, 소아 급성 골수성 백혈병(AML), 신경아세포종 및 성인 AML 및 급성 림프성 백혈병(ALL)이 포함된다. 또한, 예를 들어, 암이나 백혈병의 치료에 사용되는 화학요법제로 인한 조혈세포의 손상을 완화하기 위하여 약제 내성 유전자를 조혈줄기세포로 도입할 수 있다.

본 발명은 동종 제대혈에서 유래된 혈청이나 혈장이 보다 효과적인 조혈계 세포에 대한 유전자 전이효과를 가질 뿐 아니라 보다 효율적인 골수 재구성 능력을 가질 수 있다는 것을 보여주는 것이며, 동종 제대혈은 임상적으로 사용할 수 있는 안전하고도 주변에서 쉽게 구할 수 있는 재료이므로 앞으로 임상적 목적의 조혈줄기세포에 대한 유전자 조작 및 유전자 치료에 에 널리 사용될 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1. 제대혈과 세포의 준비

제대혈은 서울 가톨릭대학병원(강남성모병원)에서 생명윤리 및 안전에 관한 법률이 규정하는 바의 규칙에 의거하여 정상의 산모로부터 얻었다. 제대혈에 포함되어 있는 양성세포는 Ficoll-Hypaque(비중 1.077)에 원심분리하여 단핵구층을 확보한 후 Dynal CD34 전구세포 수집방법(Dynal Biotech, Oslo, Norway)을 사용하여 분리하였다. 3개의 다른 배치의 우태아 혈청은 Stem Cell Technology (Vancouver, ca), Gibco BRL (Grand island, NY), Caisson Laboratories (North Logan, UT)사에서 구입하였다.

제대혈 혈장은 피콜(Ficoll) 분리법에 의해 얻었고, 제대혈 혈청은 항응고제가 제거된 수집봉투에 제대혈을 수집해 원심분리를 거쳐 얻었으며 이때 회수된 제대혈 혈청과 혈장은 실험에 사용하기 전까지 -70℃ 냉동고에서 냉동보관 하였다. 293T 세포와 Rat-1 세포는 1mM 글루타민산 나트륨(sodium glutamate)과 1% 항생물질(Penistrept, GibcoBRL), 10% FBS가 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였다. PG13세포는 Dr. D. Miller (Fred Hutchinson Cancer Research Centre, Seattle, WA)로부터 받아 각각의 다른 조건으로 배양하기 전까지 10% FBS 가 함유된 DMEM에서 동일하게 배양하였다.

실시예 2. 체외배양과 집락군세포 ( CFC , colony forming cell ) 분석

본 발명에서 우선, 체외배양 동안에 조혈줄기세포의 미분화상태를 유지하는 효과를 CBS와 CBP가 함유된 배지의 능력을 SFM와 FBS가 함유된 배지와 비교하여 조사하였다.

CD34 양성세포의 체외배양은 기존에 보고되어 있는 20% BIT^TM (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)가 함유된 SFM(serum-free substitution media)와 FBS, 동종의 제대혈 혈청과 혈장이 각각 10%씩 함유된 배양조건으로 나누어 배양하였다. 배양액에는 hFlt3 (human flt-3 ligand) 와 hSCF(human stem cell factor) 는 100 ng/mL씩 첨가하고 human IL-3 와 IL-6, G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor) 는 각각 20 ng/mL씩 첨가하였다. 사이토카인들은 R&D System 에서 구매하였다.

상기와 같이 분리된 CD34양성세포를 5x10⁴/mL의 밀도로 SFM와 FBS, CBS, CBP성분에 5가지 성장인자를 첨가한 배지로 5일 동안 배양한 후에 CD34 양성세포 보존율 확인한 결과, SFM는 38%, FBS 42%, CBS 46% 와 CBP 57%로 CD34 양성세포의 비율이 유사하게 나타났다 (p>0.05) (도 1A).

또한, 각 조건에서 체외배양한 후에 각 조건에서 체외배양한 세포는 NOD/SCID 마우스에 이식하거나 반고형(semi-solid) 배지(Methocult^TM, Stemcell Technology)에 14일간 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하면서 성장을 관찰하고 각 계열별로 분화되는 양상과 세포숫자를 측정하였다. 체외배양하지 않은 CD34 양성세포와 각 조건에서 체외배양을 거친 CD34 양성세포의 초기세포수 100개를 동일하게 반고형 배지에 배양하였다.

그 결과, 각 조건에서 체외배양한 후에 반고형(semi-solid) 배양을 통해 집락군을 만드는 능력을 가진 전구세포의 증식능은 체외배양을 거치지 않은 집락군 형성 능력에 비해 CBP군 에서 2.5 배의 약간 낮은 증가율을 제외하고는 SFM군 3.9배, FBS군 4.8배 CBS군 4.3배의 증가로 유사한 정도로 증가하였다 (p>0.05) (도 1B)

실시예 3. 유전자 전이된 세포의 이종이식과 유식세포 분석을 통한 생착율 분석

조혈줄기세포의 생체 내에서 재구성되는 능력을 확인하기 위하여 각 배지조건에서 5일간 배양된 CD34 양성세포 개수 1X10⁵ 를 반치명적으로 방사선 조사를 한 NOD/SCID 마우스들에 이식하여 생착률을 조사하였다.

구체적으로, 면역 결핍된 NOD/SCID 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)에서 구입하여 양압차단 사육실에서 HEPA 필터가 처리된 개별 환기 케이지을 사용하여 무균상태로 사육하였다. 체외배양한 세포와 바이러스로 전이시킨 세포를 반치사용량(300 cGy)으로 방사선 조사한 마우스에 이식하였고 시프로플록사신(100　mg/L ,ciprofloxacin, BayerAG, Leverkusen, Germany)을 3 주간 식용수에 첨가하여 복용시켰다. 이식 8주째 마우스로부터 골수세포를 수확하고 hCD45-PE와 hCD71-PE를 이용하여 인간 세포 생착율과 hCD19/20, hCD13/15, hCD41a, h- glycophorin A (all from BD Pharmingen) 항체를 이용하여 분화계열을 유식세포분석기를 통하여 분석하였다. 항체는 비특이성 결합을 막기 위해 2.4G2 (an anti-mouseF_c receptor antibody) 와 5% 인간혈청을 사용하였다. 인간세포의 생착율 조사는 isotype 항체염색에서 99.99%가 음성으로 나타나는 기준을 적용하여 PI(propidium iodide) 음성세포 중에서 항체반응을 측정하였다.

면역결핍마우스에서 인간세포의 생착율은 0.1%이상을 양성 생착율로 분석하였다 (Kim et al ., 2004). 마우스에 재구성된 전구세포의 분석을 위해, 유식세포분리기(Vantage^TM, BD)를 이용하여 마우스 골수에서 생착된 인간세포를 분리하여(CD45/71) 반고형 배지에 배양한 14일 후 형성된 집락군을 분석하였다. 집락군에서 형성된 수와 GFP 발현율 및 그들의 클론 추적을 조사하였다. 또한, 생착된 인간세포중 임파계(CD19/20)계열과 골수계열(CD13/15)을 분석하였다

그 결과, CBS군과 CBP군에서의 세포들의 생착율은 FBS군의 세포생착율에 비교하여 높게 나타났으며 SFM군과 유사한 정도를 보였다.(SFM;40%, FBS;25%, CBS;46% , CBP; 38%). 또한 이식된 마우스들의 양성 생착률의 빈도는 SFM군(7/8)과 FBS(7/8)군에서의 세포보다 CBS군(8/8)과 CBP군(4/4) 에서의 세포에서 더 높았다(도 1C). 생착된 세포들에서 림프계/골수계의 분화 비율은 각각의 배지조건들에 대해서 동등하게 관찰되었다. (도 1D) 따라서, CBS군과 CBP군의 배지배양조건은 적어도 SFM군과 FBS군에 비해서 SRC (SCID-repopulating cells) (Larochelle et al ., 1996)로 표현되는 조혈줄기세포 의 유지에 유사한 효과를 갖는다는 것을 보여 준다.

이 결과로 볼 때 동종의 제대혈에서 유래된 혈청과 혈장은 조혈줄기세포의 체외배양에 있어 우태아 혈청을 대체하는 효과적인 배지로 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4. 바이러스를 이용한 유전자 전이의 안정성 분석

제대혈 유래 혈청과 혈장이 레트로바이러스를 이용한 유전자 전이에 있어서 유사한 효과를 갖는지 알아보기 위한 연구로서, 우선 각 배지조건에서의 레트로바이러스의 안정성 유지에 대해 조사하기로 하였다. 따라서 GALV 로 슈도타이핑(pseudotyping)된 레트로바이러스와 VSV-G 로 슈도타이핑(pseudotyping)된 레트로바이러스 입자의 안정화에 대한 효과를 비교하기 위하여 레트로바이러스 생산 세포인 PG13세포에 각 배지조건에서 배양하여 얻은 바이러스상등액의 감염율을 적정하였다 (도 2A 개요도).

구체적으로, 레트로바이러스 입자를 생산하기 위하여 보고된 바와 같이 VSV-G 나 GALV (Gibbon Ape Leukemia virus)를 외피(envelope)로 하는 유전자에 의해 슈도타이핑(pseudotyping)시켰다 (Oh et al ., 2004). 간략히 기술하면, GALV 슈도타이핑(pseudotyping)된 레트로바이러스 입자 안정성효율을 알아보기 위하여, 바이러스 생산세포주를 표준화하기 위하여 GFP가 양성인 PG13 세포를 96-웰 플레이트 에 한 개의 세포씩 나누어 받아 그 중 한 클론으로부터 유래된 PG13 바이러스 생산 세포주(PG13-MIG No.7)를 확립하고, 이 PG13 세포 8x10⁶개를 100 mm dish에 10% FBS가 함유된 DMEM에 12시간 배양한 후 세척을 거쳐 각각의 배양조건의 배지로 바꾸어 48시간 배양하였다. 이후, 각 조건에서 얻은 바이러스 상등액을 회수하고 여과 후(0.45 ㎛ low-protein binding filter (Millipore, Bedford, MA, USA)) 얻은 바이러스 부유액을 Rat-1 세포에 감염시키고, CD34 양성세포에 황산프로타민(5 ㎍/ml)을 첨가하여 감염시켜 바이러스의 역가를 측정하였다. 또한, CBS와 CBP에서 VSV-G 슈도타이핑(pseudotyping)된 레트로바이러스 입자 안정성 효율을 알아보기 위하여 293T 세포에 레트로바이러스 벡터에 녹색 형광 단백질 (GFP) 이 삽입된 MIG 벡터는(MSCV-IRES-GFP), gag-pol 및 VSV-G 을 이입시켜 그 바이러스 상등액을 초고속원심분리를 통해 농축시킨 바이러스 입자를 24시간 동안 각 배지조건에서 배양하였다.

그 결과, MIG가 삽입된 PG13 세포주(MIG-PG13 #7)에서 파생된 단일 클론의 같은 수들이 각각 배지에서 48시간 동안 배양되었을 때, 레트로바이러스 입자의 감염율은 SFM 군에서 현저하게 감소하였고, 반면에 FBS군, CBS군 CBP군에서는 레트로바이러스 입자감염율은 높은 수치로 나타났다 (도 2B). 마찬가지로, VSV-G 슈도타이핑(pseudotyping)된 레트로바이러스 입자 농축액을 각의 배지에서 배양하였을 때도, 감염성을 띄는 바이러스 입자의 보존율이 FBS, CBS, CBP군에서는 유사하게 나타났으나 SFM군에서는 레트로바이러스 입자의 감염능력이 지속되지 못함을 보여주었다. (도 2C). 따라서 이 같은 결과들로부터, 레트로바이러스 입자의 안정성 효 율이 CBP군과 CBS군이 SFM군보다는 매우 높게 유지됨을 알 수 있었다.

실시예 5. 각 배지조건에서 CD34 양성세포로의 유전자 전이효율 분석

위의 결과들에 의해 CBS와 CBP가 조혈줄기세포의 미분화성을 유지하는 능력뿐 아니라 레트로바이러스입자의 안정화에 기여하는 것을 확인하였기 때문에, 그 다음 단계에서는 이들을 이용하여 실제 조혈줄기세포에 대한 유전자 전이를 시행할 경우 보다 높은 유전자 전달효과를 거둘수 있는지를 조사해 보기로 하였다.

실시예 4의 방법으로 생산된 바이러스들을 이용하여 CD34 양성 세포에 유전자 전이시켰으며, 이를 위해 미리 각각의 혈청 및 대체성분이 함유된 배지에서 5가지 사이토카인을 첨가시켜 2일 전부터 전 처치 (prestimulation) 시켰다. 48시간 후, 피브로넥틴(fibronection) 코팅과 각 조건에서 배양했던 바이러스 상등액으로 코팅을 거친 배양기에 전처치된 CD34 양성세포를 수확하여 각 바이러스 상등액으로 재부유시킨 후 5가지 사이토카인과 황산프로타민(5 ㎍/ml)을 첨가하여 24시간 감염시켰다.

그 결과, 유식세포 분석기를 통해 마지막 감염시킨지 24시간 후 유전자 전이의 효율성을 GFP 양성도를 통하여 관찰하였을 때, 7명의 독립된 기증자로부터의 CBS (62±1%) 를 사용한 군이나 8명의 독립된 기증자로부터 유래된 CBP(68±2%)를 함유된 배지를 사용한 세포군에서 GFP 양성세포들의 비율이 SFM(23±5%) 를 사용한 실험군 또는 3개 제조사의 FBS(42±4%) 실험군보다 높게 나타났다 (도 3A, B). 마찬가지로, CD34양성세포들 가운데 GFP양성세포들의 비율을 비교하였을 때도, CBS 또는 CBP 실험군에서 제대혈 기증자의 유래와 상관없이 SFM(24±2%)와 FBS(38±3%) 실험군에서의 수치에 비교해서 CBS(58±2%) 와 CBP(61±2% ) 실험군에서 더 높은 유전자 전달효율을 나타났다 (P<0.05) (도 3C). 각각 배지 조건하에서의 전구세포단계에 대한 유전자 전이율도 비슷하여, GFP 양성 집락군형성 능력이 SFM(25±5%)군에 비해 CBS(48±7%) 군과 CBP(53±8%)군에서 높게 나타났다 (도 3D).

다음으로 레트로 바이러스에서와 비슷한 결과가 렌티바이러스를 사용하였을 때에도 관찰되는지 확인하기 위하여 CD34 양성세포에 대해 각 조건에서의 렌티바이러스 감염을 시도하였다. 렌티바이러스 입자에 대한 연구를 위하여 GFP가 삽입된 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터를 Dr. C. Eaves(Terry Fox, Vancouver, ca)로부터 공급받았으며, 293T세포에 렌티바이러스 핵단백질인 H29와 VSV-G를 외피( envelope)로 하는 유전자를 유전자 이입(transfection)시켜 제조하였다. 렌티바이러스 역시 초고속원심분리를 이용하여 농축시키고 HeLa 세포를 이용하여 역가 (titer) 를 측정하였다.

렌티바이러스를 사용하여 CD34 양성세포에 유전자 전이하는 경우는, 신선하게 분리한 CD34 양성세포를 각 조건의 배지에 농축된 렌티바이러스 입자와 함께 24 시간동안 배양한 뒤 반고형 배양액에서 배양하였다.

그 결과, CD34 양성세포에 50 MOI (multiplicity of infection) 으로 감염시켰을 경우 24시간 유전자 전달 후, GFP 양성의 집락군의 형성능력이 SFM 에서보다 CBS 또는 CBP에서 더 높게 나타났다. 반면 낮은 농도의 렌티바이러스 (20 MOI) 를 사용한 경우는 각 군마다 유의적인 차이를 보이지 않았다 (도 3E). 이와 같은 결과들로 볼 때 SFM또는 FBS보다 CBS와 CBP에서 조혈줄기세포와 전구세포단계의 세포들에의 유전자 전달의 효율이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 생체내 재구성된 CD34 양성세포에서의 유전자 전이효율 분석

이 결과들을 바탕으로, 다음으로 이식된 마우스 골수에서 재구성에 영향을 미치는 더 미분화 단계의 조혈줄기세포와 SRC (scid repopulating cells)세포에서도 더 효율적인 유전자 전달이 될 수있는지 조사하였다. 이 목적을 위하여 반치사 용량의 방사선 조사를 한 NOD/SCID 마우스에 각 배지 조건하에서 유전자 전이된 CD34 양성세포를 이식하였고, 생착된 골수세포에서의 유전자 전달 효율을 비교하였다.

구체적으로, 상기와 같이 전처리를 거친 CD34 양성세포를 수확하여 각 바이러스 상등액으로 재부유시킨 후 5가지 사이토카인과 황산프로타민(5 ㎍/ml)을 첨가하여 24시간 감염시켰다. 세 번의 감염이 끝나고 세척한 후 NOD/SCID 마우스에 이식하였고, 표면 표현형분석을 수행하였다. GFP 양성 세포의 분석은 감염이 끝나고 바이러스가 없는 각 조건의 배지에서 24시간 더 배양한 후 분석하였다.

그 결과, 도 4A와 B에서 보이는 것과 같이 SFM(2%)을 첨가한 조건하에서 유전자 이식을 수행했을 때, 이식한 마우스에 생착된 인간 세포이면서 GFP양성세포의 비율이 FBS(12%), CBS(16%), CBP(26%)가 함유된 조건에 비해 매우 낮게 나타났다. 따라서, 이 결과는 생체 내 골수재구성되는 세포에 대한 효율적인 유전자 전달을 위해서는 무혈청배지 보다 혈청 성분이 첨가한 배지에서 더 높은 유전자 전달이 가능함을 보여준다.

특히, 혈청을 첨가한 배지중에서 생체내 재구성되는 세포내의 유전자 전달 효율이 FBS(12.0±1%)를 사용한 배지에 비해 제대혈에서 유래된 CBS(16.1±3%) 와 CBP(25.8±3%) 를 사용했을 때 훨씬 높게 확인되었다.(3expts, n=6 p< 0.05). 그러나 이과정에서, CBS 또는 CBP 배지에서 유전자 전달된 세포가운데 골수계열, 림프계열, 혈소판 세포계열, 적혈구 계열 등의 계통 분리에 대해 분석했을 때 차이가 없었다. 즉, CD19/20 (림프계), CD13/15, CD33 (골수계), CD41a (혈소판계) 및 Gly A (적혈구계) 에서의 GFP 양성도는 거의 유사하였다 (도 4C). 이 결과들은 CBS와 CBP로 이식된 골수안에 재구성되는 세포내 유전자 전달이 높은 이유로서, CBS와 CBP가 다중분화능 골수세포에 대한 효율적 유전자 적중이 이루어지고 있음을 보여주고 있다.

이 가능성을 보다 자세히 분석하기 위하여 다음으로 조혈줄기세포를 이식한 각각의 NOD/SCID 마우스로부터 다시 분리된 전구세포에서의 유전자 전달효율능을 조사하였다. 도 5A에서 보는 것과 같이, 마우스의 두 개의 대퇴골과 경골의 골수에 생착된 인간세포만을 분리하여 반고형 배지에 배양하여 형성된 집락군을 대상으로 비교하였고, 그 결과 마우스 골수내에서 유래된 GFP양성 집락군의 수는 SFM(17.7±9.7), FBS(80.9±19.8) 군에서 보다 CBS(149±21) 또는 CBP(161±33)군에서 훨씬 높게 관찰되었다. 이들 결과로부터, 재구성된 골수세포 내에서 발견되는 높은 유전 자 전달 효율은 보다 높은 전구세포에서의 유전자 전달효과로 연결될 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. LM - PCR 을 통한 재구성된 세포의 클론 추적

다음으로 보다 높은 유전자 전이 효율을 클론 차원에서 분석하기 위하여 마우스 골수에서부터 얻어진 각각의 조혈전구세포에 대한 클론추적 (clonal tracking) 방법으로 비교하였다. 생착된 세포 중에서 전이된 클론형성(clonality)을 조사하기 위해, 각 개별 수여자 마우스에 생착된 골수세포에서 유래된 전구세포 단계의 집락군을 수확하고 이 집락군으로부터 결합매개성 유전자 증폭을 통해 클론형성(clonality)을 추적하기 위하여 genomic DNA를 추출하였다. (Mueller and Wold, 1989; Pfeifer et al ., 1989)

다음으로, genomic DNA는 Cla1 제한효소를 이용하여 분리하고 linker-1 (5'-AGA AGC TTG AAT TCG AGC AGT CAG-3')과 linker-2 (5'-CTG CTC GAA TTC AAG CTT CT-3')를 T4 리가아제로 결합시켰다. 이렇게 결합매개시킨 지노믹 DNA는 linker-2 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응법을 두 번 수행을 하여 DNA단편을 증폭하였다. 중합효소연쇄반응 후 얻은 단편은 EcoR1/Not1의 제한효소로 pEGFP-NI (Clontech, Paloalto, CA)을 분리하여 추출한 GFP 탐침을 이용하여 서던 블랏(Southern blotting)법을 통해 클론형성(clonality)을 분석하였다.

그 결과, CBS군과 CBP군에서 다양한 클론의 패턴과 클론군 (oligoclonality) 를 관찰하였으며, 이는 유전자 전이시 CBS, CBP 조건 하에서 레트로바이러스에 의 한 다양한 조혈줄기세포 클론의 효율적인 유전자 전이가 가능함을 나타낸다.

결론적으로, 이러한 결과들은 조혈줄기세포에서의 의 유전자 도입을 위한 CBS 또는 CBP의 사용은 생체내 골수재구성능력이 있는 조혈줄기세포에 대한 유전자 전달효율을 높임과 동시에 이들로부터 유래되는 유전자 전이 세포가 보다 높은 비율로 골수를 재구성 하게 함으로써, 기존의 FBS나 SFM 배지를 사용하는 경우에 비해 보다 안전하면서도 보다 높은 유전자 치료의 효과를 거둘수 있음을 확인하였다.

통계처리

본 발명의 결과수치는 각 다른 실험의 평균값±표준오차로 나타냈다.

도 1은 체외배양동안 조혈줄기세포의 기능 보존에 대체 혈청의 효과 비교한 것으로, (A)는 체외배양 동안 CD34양성세포의 유지효과를 나타내고, (B)는 집락군의 형성 능력을 나타내고, (C)는 골수재구성능세포의 유지효과를 나타낸 것이다. 생착율 0.1%를 기준으로 양성생착과 음성생착으로 분리되고 점선으로 표시하였다. 수평선는 각 개별의 수여마우스간의 생착율 평균값의 수치를 나타낸다. (D)는 상기 (C) 에서 생착된 인간세포중 임파계(CD19/20)계열과 골수계열(CD13/15)을 분석한 것이다 (p>0.05).

도 2. CBS와 CBP에서의 레트로바이러스 입자 안정성 효과를 나타낸 것으로, (A)는 각 배양조건에서 레트로바이러스 입자의 안정성과 생체 내 재구성되는 세포에의 유전자 전이효율을 조사하기위한 실험 개요도이고, (B)는 GALV 슈도타이핑(pseudotyping) 된 레트로바이러스 입자 안정성효율을 각 배지조건에서 비교한 것이고, (C)는 CBS와 CBP에서 VSV-G 슈도타이핑(pseudotyping) 된 레트로바이러스 입자 안정성효율을 나타낸 것이다.

도 3은 각 배지조건에서 조혈줄기세포로의 유전자 전이효율과 개인간 혈청 차이를 나타낸 것으로, (A)는 SFM에서 미리 전처리를 거친 CD34 양성세포에 PG13 세포에 각 배지조건에서 배양하여 얻은 바이러스 상등액을 여과한 뒤 재부유시켜 감염시켰다. (B) 및 (C)는 유식세포분석기를 통해 마지막 감염후 24시간 동안 각 배지조건에서 배양한 후 CD34 양성세포와 GFP 양성비율을 나타낸다. 제시된 그림은 배양후 증식된 총 세포에의 GFP양성효율(B)과 CD34 양성세포에서의 GFP양성효율 을 나타낸다. (D)는 GFP양성세포의 비율은 FBS는 3개의 제조사로부터 얻은 다른 제품군, CBS는 7인의 공여자, CBP는 8인의 다른 공여자로부터 분리하여 사용하였다. 수평선은 각 군에서 배치에 따른 GFP 양성세포 비율의 평균값을 나타낸다. * :p<0.05

도 4는 SFM, FBS, CBS, CBP에서 생체내 재구성된 조혈줄기세포에서의 유전자 전달 효과를 비교한 것으로, (A)는 유식세포분석기를 통하여 마우스 골수세포 중에 생착된 인간세포(CD45/71) 와 유전자 전달(GFP)효율을 확인한 것이고 (3 expts, n=6 to 12), (B) 는 이때 생착된 인간세포 중에서 GFP 양성세포율을 나타낸 것이고, (C)는 수여마우스의 골수에 생착된 GFP 양성인 인간세포에서의 분화 계열분석한 것이다.

도 5는 재구성되는 전구세포로의 전이된 유전자 클론 추적을 나타낸 것으로, (A)는각 군에서 개별의 수여마우스에서 얻은 총 GFP 양성세포수를 나타낸 것이고, (B) 재구성되는 골수의 집락군 형성세포에서 클론 추적을 나타낸 것으로 유전자 전달된 세포에 의해 재구성세포의 다양한 클론은 각기 다른 밴드를 가진 클론별 차이를 보인다. M은 마커(Marker)의 약자이며, 레인의 숫자는 각각 다른 수여마우스를 나타낸다.

Claims

동종의 (allogenic) 제대혈 혈청의 존재 하에 표적세포를 레트로바이러스 벡터로 감염시키는 것을 포함하는, 레트로바이러스 벡터에 의해 유전자를 표적세포로 도입하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표적세포가 조혈계 세포인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 표적세포가 CD34 (hemopoietic progenitor cell antigen) 양성세포인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 치료하고자 하는 질병과 관련된 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자, 세포 내 항체 또는 성장인자를 암호화하는 유전자인 외래 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스 벡터인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 복제-결손 재조합 레트로바이러스인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 방법.
제 1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진, 유전자가 도입된 세포.
제 7항에 따른 방법에 의해 얻어진 유전자가 도입된 세포를 인간을 제외한 척추동물로 이식하는 것을 포함하는, 세포의 이식방법.
동종의 (allogenic) 제대혈 혈청 및 레트로바이러스 벡터를 포함하는, 레트로바이러스 벡터의 표적세포로의 유전자 도입효율을 증가하기 위한 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 표적세포가 조혈계 세포인 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 표적세포가 CD34 (hemopoietic progenitor cell antigen) 양성세포인 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 치료하고자 하는 질병과 관련된 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자, 세포 내 항체 또는 성장인자를 암호화하는 유전자인 외래 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스 벡터인 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 복제-결손 재조합 레트로바이러스인 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인 조성물.