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KR100445712B1 - 바이러스-매개된dna전이를증가시키기위한작제물및이를위한배양배지 - Google Patents

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KR100445712B1
KR100445712B1 KR1019960705364A KR19960705364A KR100445712B1 KR 100445712 B1 KR100445712 B1 KR 100445712B1 KR 1019960705364 A KR1019960705364 A KR 1019960705364A KR 19960705364 A KR19960705364 A KR 19960705364A KR 100445712 B1 KR100445712 B1 KR 100445712B1
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Inventor
데이비드 에이 윌리암즈
비크람 피 파텔
Original Assignee
어드밴스드 리서치 앤드 테크놀로지 인스티튜트
노오쓰웨스턴 유니버시티
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Publication date
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Abstract

레트로바이러스에 의해 조혈 세포 및 다른 세포의 형질도입 효율을 증가시키는 방법은 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에 세포를 감염시킴을 포함한다. 도면으로 알 수 있는 바와 같이, 피브로넥틴 및 피브로넥틴 단편은, 세포, 특히 수임 전구세포 및 원시 조혈 간세포를 포함하는 조혈세포내로의 레트로바이러스-매개된 유전자 전이를 현저히 증가시킨다. 또한, 본 발명은 증가된 유전자 전이를 이용한 신체 유전자 치료를 위한 개선된 방법, 세포내로의 레트로바이러스-매개된 DNA 전이를 증가시키는 조혈성 세포 집단 및 신규한 작제물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

바이러스-매개된 DNA 전이를 증가시키기 위한 작제물 및 이를 위한 배양 배지
최근의 유전자 전이 기술에서의 향상과 많은 사람 질병에 대한 분자 원리를 이해하는데 있어서의 진보는 심각한 유전적 질병에 대해 신체 유전자 치료용 프로토콜을 개발하게 하였다. 현재, 사람 유전자 치료가 기대되는 유력한 질병에는 효소 또는 기타 단백질이 결핍되거나 손실되는 질병, 효소 또는 단백질의 수준이 정확하게 조절될 필요가 없는 경우의 질병, 특히 구조적으로 조절되는 질병 및 사람 골수에서 발견되는 결핍질환이 포함된다.
예를 들면, 유전자 치료요법이 기대되는 한가지 질환은 중증 복합성 면역 결핍증(severe combined immunodeficiency disease; SCID)을 유발하는 아데노신 데아미나제(ADA) 결핍증이다. ADA 결핍증 환자는 골수 세포에서 효소가 약간 검출되거나 또는 거의 검출되지 않는다. 그러나, ADA 결핍증은 화합성 골수 이식에 의해 치유되어왔다. ADA 정상 세포는 ADA 결핍 세포에 비해 선택적인 잇점을 가지며, 통상적으로 환자 골수를 재존재하도록(repopulate)할 것이다.
골수 세포는 골수 세포 조직이 시험관내에서 용이하게 조작되고 재존재하는 세포를 포함하기 때문에 신체의 체세포 유전자 치료를 위한 우수한 표적이다. 다른 한편으로, 사람 제대 혈액은 대량의 원시 전구세포를 포함하는 것으로 이미 입증된 바 있다. 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 즉 장기간 재존재하는 세포내로의 성공적인 유전자 전이는 이들 세포의 후대 세포에서 드러나는 다양한 질환에 대한 일생의 치료를 유도할 수 있다.
재존재하는 줄기세포(stem cell) 내로의 유전자 전이 및 재존재하는 줄기세포 내에서의 장기간의 유전자 발현은 다수의 연구자에 의해 쥐 모델에서 성취되었다. 그러나, 보다 큰 동물, 예를 들어 개 및 영장류에서의 생체내 실험은 대부분 원시 조혈모세포의 낮은 감염 효율성으로 인해 제한적으로 성공하였다. 또한, 현재 유전자 전이 기술의 제한점은 성인 골수(ABM)에 존재하는 줄기세포의 적은 수, 이들 세포를 정제하기 위한 적합한 방법의 부재 및 세포 주기에 있어 이와 같은 원시 세포의 낮은 비율을 포함하는 몇몇 요인에 의해 사람 프로토콜에 적용하는 경우 더욱 복잡하게 된다.
골수 세포에 관한 쥐 및 거대한 동물 실험 모두에 있어서, 가장 성공적인 프로토콜은 레트로바이러스 생산 세포주와 표적 세포의 동시배양을 이용한다는 점에 주목해야 한다. 또한, 사람에 있어서 대부분의 FDA-승인된 유전자 전이 시험은 유전자 형질도입을 위한 재조합 레트로바이러스 벡터에 의한다. 재조합 레트로바이러스 벡터는 이들이 외인성 DNA를 세포 DNA내로 효율적으로 전이시켜 정확하고 안정하게 통합시키기 때문에 유전자 치료에 바람직하다. 이들 벡터는 유전자 전이를 위한 외인성 DNA를 포함하며, 또한 변형되어 바이러스 병원성이 제거된다. 이들 변형으로 인하여, 바이러스 생산은 일반적으로 레트로바이러스 패키징(packaging) 세포를 사용하여 수행된다. 그러나, 임상적 유전자 치료요법을 위해서는 세포-부재 형질도입이 생물-안정성 및 특성 조절의 관점에서 더욱 바람직하다. 불행히도, 줄기세포와 같은 조혈 세포내로의 효율적인 유전자 전이는 일반적으로 바이러스-생산세포와의 동시배양 없이는 불가능하였다.
최근에, 유전자 전이 효율은 감염시에 기질 세포(stromal cell)에 표적 세포를 노출시킴으로써 증가될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 기질 세포는 조혈미세환경의 주요한 성분이다. 조혈미세환경은 대식세포, 기질 세포, 내피 세포, 지방세포 및 각종의 한정된 부착 분자로 구성된 세포외 복합 매트릭스(complex extracellular matrix; ECM)의 조직화된 네트워크로 이루어져 있다. 라미닌, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸 및 피브로넥틴과 같은 ECM 분자는 조혈 세포 및 성장 인자 모두를 위한 부착 부위를 제공한다. 레트로바이러스 감염시 기질 세포의 당해 촉진 효과를 담당하는 기작은 불분명하지만, 이들 세포가 조혈미세환경의 세포와 직접 접촉하여 존재하는 경우 조혈세포의 증식 및 분화의 생리학적 조절이 이루어지는 것으로 알려져 있다.
장기간 재존재하는 조혈모세포 및 기타 세포내로의 효율적인 유전자 전이는 현재 조혈 및 기타 질환의 치료요법을 위한 유전자 전이 프로토콜의 광범위한 적용을 제한하는 문제점으로 남아있다. 종래 방법의 위험성 및 제한성 없이 포유동물세포내로 유전 물질을 효율적으로 전이시키는 방법에 대한 요구가 지속되어 왔다. 본 발명은 이와 같은 요구를 해소한다.
본 발명은 일반적으로 바이러스에 의한 세포의 형질도입(transduction) 효율을 증가시키는 방법, 및 더욱 특히 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 단편을 사용하여 세포내로 바이러스-매개된 유전자 전이를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 키모트립신 단편을 포함하는 피브로넥틴 분자의 개략도를 제공한다.
도 2는 하기 실시예 1에 기술된 바와 같은 TKNEO 벡터를 사용한, 피브로넥틴 단편의 존재하의 사람 수임 전구세포(committed human progenitor cells)의 감염 효율을 나타낸다.
도 3은 하기 실시예 1에 기술된 바와 같은 TKNEO 벡터를 사용한, 피브로넥틴 단편의 존재하의 여러가지 수임 사람 조혈 전구세포의 감염 효율을 비교한다.
도 4는 하기 실시예 7에 기술되는 바와 같이 (i) 동시배양 방법(레인 2 내지 4), (ii) 고정된 피브로넥틴 단편의 존재하의 상등물 감염(레인 5 내지 7) 및 BSA 상의 상등물 감염(레인 8 내지 10)에 의해 형질도입된 골수 세포를 이식시킨 마우스에서 hADA의 존재를 비교한다. hADA에 대한 대조물은 레인 1 및 레인 12에 나타나 있고 쥐 ADA에 대한 대조물은 레인 11에 나타나 있다.
도 5는 하기 실시예 8에 추가로 기술되는 바와 같이 피브로넥틴 단편에 대한 레트로바이러스의 결합을 입증한다.
도 6은 하기 실시예 8에 추가로 기술된 바와 같이 피브로넥틴 단편에 대한 레트로바이러스의 결합이 용량-의존성임을 입증한다.
도 7은 하기 실시예 9 내지 11에 사용된 여러가지 재조합 피브로넥틴 단편을 도시한 개략도를 나타낸다.
도 8은 하기 실시에 9에 기술된 바와 같이 몇몇 재조합 단편을 포함하는 여러가지 피브로넥틴 단편에 결합하는 레트로바이러스를 나타낸다.
도 9는 하기 실시예 9에 기술된 바와 같이 헤파린이 레트로바이러스의 피브로넥틴 단편에의 결합을 차단함을 증명한다.
도 10은 하기 실시예 10에 추가로 기술된 바와 같이 여러가지 피브로넥틴 단편의 존재하에 쥐 조혈세포의 레트로바이러스 감염 효율을 나타낸다.
도 11은 하기 실시예 11에 기술된 바와 같이, (i) 동시배양 방법, (ii) 여러가지 피브로넥틴 단편상의 상등물 감염 및 (iii) BSA상의 상등물 감염에 의해 형질도입된 골수 세포를 이식시킨 마우스에서 hADA의 존재를 비교한다.
본 발명 원리의 이해를 도모하기 위해, 이제 이의 특정한 양태에 대해 언급하고, 특정한 용어를 사용하여 특정한 양태를 기술할 것이다. 그럼에도 불구하고, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니며, 본원에 예시된 바와 같이 본 발명 원리의 이와 같은 변화, 추가의 변형 및 적용이 본 발명과 관련되는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 발생할 수 있는 것으로 이해될 수 있다.
상기 지적된 바와 같이, 본 발명은 레트로바이러스와 같은 바이러스에 의해 생존가능한 세포의 형질도입 빈도를 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용한 생존가능한 세포내로의 효율적인 유전자 전이 방법, 형질도입된 세포를 수득하는 방법 및 자가 이식 및 기타 세포 이식을 달성하는 방법 및 물질을 제공한다.
본 발명의 한가지 특징은 피브로넥틴(FN), 및 FN의 CS-1 세포-부착 도메인을 포함하는 피브로넥틴의 단편이, 피브로넥틴 수용체를 수반함으로써 피브로넥틴 또는 이의 단편과 결합하는 능력을 나타내는 조혈세포, 예를 들어 수임 전구세포(committed progenitor cells) 및 원시 조혈모세포 또는 장기간 배양-개시 세포(long-term culture-initiating cell; LTC-IC)와 같은 세포내로의 레트로바이러스-매개된 유전자 전이를 현저하게 증가시킨다는 발견에 있다. 유리하게는, 이와 같이 증가된 효율로 인해 바이러스-생산 세포와의 동시배양이 불필요하게 된다. 본 발명의 다른 특징은 헤파린-Ⅱ 결합 도메인내에 위치한 피브로넥틴의 바이러스-결합 도메인의 발견에 있다. 당해 바이러스-결합 도메인을 이용하여 예를 들어 바이러스를 표적 세포에 전달하기 위한 다양한 작제물을 포함하는 많은 분야에서 바이러스 입자를 집적시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 특정 양태에 따른 재조합 바이러스 벡터는 외인성 DNA 단편을 포함하고, 비-병원성, 즉 복제-결함성이다. 이들 벡터는 외인성 DNA를 동물세포와 같은 숙주 세포, 특히 포유동물 세포의 세포 DNA내로 효율적으로 전이시키고, 정확하고 안정하게 통합시킨다. 예를 들면, 본 발명에서는 당해 유전자의 암호화 서열로부터의 일련의 염기를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 적합한 프로모터의 조절하에 재조합 레트로바이러스 벡터내로 혼입시켜 유전자, 전형적으로는 외인성 프로모터를 작동시킬 수 있다. 이 점에 있어서, 외인성 DNA는 천연적으로 또는 인공적으로 제조된 DNA를 포함할 수 있고, 천연 발생되거나 화학적으로 합성되어일부분이 연결 또는 당업계에 공지된 기타 방법에 의해 결합되어 있는 이종 공급원으로부터 유도된 부분에서 기원할 수 있다. 상기 지적된 바와 같이, 도입된 뉴클레오타이드 서열은 프로모터의 조절하에 존재할 것이고, 따라서 일반적으로 프로모터의 하부에 존재할 것이다. 달리 말하면, 프로모터 서열은 일반적으로 암호화 서열의 상부(즉, 5' 말단)에 존재할 것이다. 이러한 맥락에서, 외인성 암호화 서열을 전사시키기 위한 프로모터 및 전사 개시 코돈과 협력하는 기타 조절 인자(예: 인핸서 서열)가 존재하거나 존재하지 않을 수 있다는 것은 공지되어 있다. "~의 조절하"라는 문구는 이와 같은 기타 인자의 존재가 도입된 유전자를 전사시키는데 요구되는 것으로 고려된다. 또한, 재조합 DNA는 바람직하게는 도입된 암호화 서열의 하부에 종결 서열을 포함할 것이다.
선별 가능한 마커 또는 기타 선별 가능한 잇점을 제공하는 외인성 DNA를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들면, 당해 벡터는 네오마이신과 같은 항생제를 포함하는 여러가지 선별제에 내성을 제공하는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 대표적인 벡터는 예를 들어 N2/ZipTKNEO 벡터(TKNEO)(역가: NIH 3T3 세포에 대해 1×105G418rcfu/ml), ZipPGK-hADA 벡터 및 ZipPGK-mADA 벡터를 포함하며, 이들 모두는 이미 문헌[참조: Moritz et al. (1993) J. Exp. Med. 178:529]에 보고되어 있다. TKNEO 벡터에서는 네오 포스포트란스퍼라제 서열이 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 프로모터를 통해 센스 오리엔테이션(5' 긴 말단 반복 서열-LTR에 대해)으로 발현된다. 당해 벡터는 형질도입된 세포의 확인을 쉽게하기 위해 네오마이신 내성을 제공하는 선별가능한 마커 유전자를 포함한다. ZipPGK-hADA 벡터에서는 사람 ADA("hADA") cDNA가 사람 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터를 통해 5'LTR에 대해 센스 오리엔테이션으로 발현된다. 이것은 하나의 발현 가능한 유전자 서열만을 포함하고, 선별가능한 우성 마커를 결실하고 있다. ZipPGK-mADA (PGK-mADA) 벡터는 사람 ADA cDNA가 쥐 ADA("mADA") DNA로 대체된 것을 제외하고는 ZipPGK-hADA 벡터와 동일하다. 이들 벡터 및 다른 바이러스성 벡터 및 이의 제조방법은 널리 공지되어 있으며, 본 발명에 있어서 이들의 시행 및 용도는 본 기술분야의 전문가에게 본원에 제공된 것으로 충분할 것이다.
본 발명에 사용되는 바이러스 벡터는, 사람 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ 결합 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ 결합 도메인의 아미노산 서열에 결합하는 능력을 나타낸다. 하기 문단에 언급된 바와 같이, 본 발명이 어느 이론에 국한되지는 않지만, 각각의 작용 도메인에 대한 바이러스 및 세포의 결합을 통해 바이러스 및 표적 세포의 동시-집적(co-localization)이 바이러스에 의한 세포의 형질도입의 증가를 촉진하는 것으로 생각된다. 이 점에 있어서, 헤파린-Ⅱ 결합 도메인의 아미노산 서열에 결합하여 본 발명에 효율적으로 사용되는 바이러스의 능력은 하기 실시예 8 및 9에 기술된 바와 같은 통상의 공정을 사용하여 용이하게 입증할 수 있다. 일반적으로 말하면, 이들 검정은 바이러스 입자가 헤파린-Ⅱ 결합 도메인을 포함하는 고정된 폴리펩타이드에 결합하여 고정된 폴리펩타이드 매트릭스로부터 세척됨에 저항하는 정도를 측정한다. 요약하면, 예를 들어 피브로넥틴 헤파린-Ⅱ 결합 도메인을 포함하는 고정된 폴리펩타이드를 포함하는 웰에서 바이러스 함유 상등물을 배양할 수 있다. 이어서, 이 웰을 생리적 염수 완충액으로 완전히 세척하고, 바이러스에 대한 표적 세포를 웰에서 배양하여 웰에 잔류하는 감염 활성 수준을 측정한다. 최초 바이러스 상등물과 비교한 감염 활성의 감소 또는 역가를 평가하고 유사한 대조군(예: BSA-피복된 웰을 사용)의 활성 감소와 비교한다. 대조군 웰과 비교하여 헤파린-Ⅱ 도메인 함유 웰에 잔류하는 현저하게 높은 역가는 당해 바이러스가 본 발명 양태에 사용하기에 적합함을 의미한다. 이 스크리닝 공정을 촉진시키기 위해, 바이러스 벡터는 상기 언급된 바와 같이 선별 가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 피브로넥틴의 단편은 천연 또는 합성 기원일 수 있으며, 예를 들어 이미 문헌[참조: Ruoslahti et al.(1981) J. Biol. Chem. 256: 7277; Patel and Lodish(1986) J. Cell. Biol. 102: 449; 및 Bernardi et al.(1987) J. Cell. Biol. 105: 489]에 기술된 바와 같이 천연 발생 물질로부터 실질적으로 순수하게 제조할 수 있다. 이 점에 있어서, 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편에 대한 본원에서의 언급은 피브로넥틴이 천연적으로 발생하고 본질적으로 기타 단백질이 없음을 의미하고자 한다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편은 예를 들어 문헌[참조: Taguchi 등에게 1993년 3월 30일 허여되어 Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan에게 양도된 미합중국 특허 제5,198,423호]에 일반적으로 기술된 바와 같이 재조합하여 제조할 수 있다. 특히, 하기 실시예에서 H-271, H-296, CH-271, CH-296및 C-CS1으로서 확인된 재조합 단편 및 이를 수득하는 방법은 상기 특허에 상세하게 기술되어 있다. 하기 실시예에 사용된 C274 단편은 미합중국 특허 제5,102,988호에 기술된 바와 같이 수득되었다. 이들 단편 또는 이들을 통상적으로 유도할 수 있는 단편은 일본 산업과학기술성 발효 연구부(Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology)에 FERM P-10721(H-296), FERM BP-2799(메티오닌에 의해 H-271에 결합된 C-277), FERM BP-2800(메티오닌에 의해 H-296에 결합된 C-277) 및 FERM BP-2264(H-271)로서 기탁된 이. 콜라이를 배양하여 수득할 수 있으며, 또한 미합중국 특허 제5,198,423호에 기술되어 있다. 또한, 본원에 이용가능한 피브로넥틴 단편 또는 이와 같은 단편을 위한 출발물질에 관한 유용한 정보는 상술한 재조합 단편에 대해 추가로 기술하고 있는 문헌[참조: Kimizuka et al., J. Biochem, 110, 284-291(1991)], 사람 피브로넥틴 유전자의 구조를 기술하고 있는 문헌[참조: EMBO J., 4, 1755-1759(1985)], 사람 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ 결합 도메인을 기술하고 있는 문헌[참조: Biochemistry, 25, 4936-4941(1986)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 약 30 또는 35kb 단편(30/35 FN) 및 이하 실시예에 기술된 바와 같은 여러가지 재조합 단편내에 포함된, CS-1 세포 부착 도메인 및 헤파린-Ⅱ 결합 도메인 모두를 포함하는 피브로넥틴 단편은 이제까지의 작업에 있어서 조혈세포내로의 유전자 전이 효율을 현저히 증가시키는 것으로 밝혀졌으며, 본 발명에 사용하기에 바람직하다. 따라서, 넓게 말하면 본 발명에 사용되는 피브로넥틴-관련된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 바이러스를 결합시키는 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ 결합 도메인의 아미노산 서열 뿐만 아니라, 피브로넥틴의CS-1 세포 부착 도메인의 세포-결합 활성을 제공하는 아미노산 서열을 제공할 수 있을 것으로 이해될 것이다. 당업자는 필요한 세포- 및 바이러스-결합 활성이 이들 작용성 피브로넥틴 도메인의 천연 아미노산 서열과 세포-결합 및 바이러스-결합 활성을 유사하게 나타내기에 충분하지만 천연 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열 모두에 의해 제공될 수 있을 것으로 인정할 것이다. 이들 유사한 아미노산 서열은 이들의 상응하는 천연 서열과 실질적인 서열 상동성을 나타낼 것이며, 아미노산이 결실, 치환 및/또는 변형되었음에도 불구하고 목적하는 세포-결합 또는 바이러스-결합 특성을 갖는 아미노산 서열을 제공하는 서열을 포함할 수 있다.
이 점에 있어서, 적합한 생물공학적 기술은 당해 작용성 도메인에 있어 아미노산의 결실, 치환, 부가 또는 기타 변형이 통상적으로 수행될 수 있는 정도까지 진보되었다. 이어서, 생성된 아미노산 서열은 목적하는 세포-결합 또는 바이러스-결합 활성에 대해 통상적으로 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ-결합 도메인의 돌연변이체 또는 변형된 형태의 바이러스-결합 활성은 상기에 일반적으로 언급되고 실시예 8 및 9에 더욱 구체적으로 기술된 바와 같이 바이러스 배양, 세척 및 바이러스 역가 검정을 사용하여 스크리닝함으로써 대조군과 비교된 감염성의 보유도를 측정할 수 있다. 본원에 제공된 기술에 따르면, 이들 결합 검정은 본 분야에 종사하는 전문가에게는 단지 통상적인 실험을 나타낼 것이다.
또한, 피브로넥틴의 변형되거나 돌연변이체 형태의 CS-1 세포 부착 도메인 또는 기타 세포-결합 폴리펩타이드와의 세포-결합은 통상의 방법을 사용하여 검정할 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 방법에는 문헌[참조: Nature 352: 438-441(1991)]에 기술된 방법이 포함된다. 요약하면, 세포-결합 폴리펩타이드를 플라스틱 디쉬상에 피복하고, 검정하고자 하는 세포 집단을 30분 내지 2시간 동안 배지에 도말한다. 배양기간 후, 단백질에 부착하지 않은 세포를 회수하고, 계수하여 생존력을 분석한다. 또한, 트립신 또는 세포 분리 완충액(예: Gibco)을 사용하여 폴리펩타이드에 부착한 세포를 회수하고, 계수하여 생존력을 시험한다. 몇몇 경우에, 예를 들어 조혈 콜로니 형성 세포의 경우, 세포를 추가로 12 내지 14일 동안 배양하여 세포의 콜로니 형성 특성을 확인한다. 이어서, 부착 세포의 백분율을 계산하고, 소 혈청 알부민(BSA)이 피복된 플라스틱 디쉬와 같은 표준 대조군 표본과 비교한다. 분석된 폴리펩타이드에 대한 표적 세포의 실질적인 결합은 폴리펩타이드/세포 조합이 본 발명에 적합하고, 폴리펩타이드가 피브로넥틴의 레트로바이러스 결합 단편에 결합하여 바이러스 벡터에 의한 표적 세포의 감염을 증가시키는 본 발명의 작제물을 제조할 수 있다는 표시이다.
본 발명의 보다 구체적인 양태에 따라, 레트로바이러스 벡터에 의한 형질도입을 증가시키는데 사용되는 바이러스-결합 폴리펩타이드는 (i) 사람 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ 결합 도메인의 Ala1690내지 Thr1960에 상응하는 서열번호 1의 제1 아미노산 서열 또는 레트로바이러스를 결합시키는 능력을 나타내기에 충분한 제1 아미노산에 유사한 아미노산 서열; (ii) 사람 피브로넥틴의 ⅢCS 결합 도메인(CS-1 세포 결합 도메인)의 한 부분에 상응하는 서열번호 2의 제2 아미노산 서열 또는 원시 전구세포와 같은 조혈세포 및/또는 장기간 재존재하는 (간)세포를 결합시키는 능력을나타내기에 충분한 제2 아미노산 서열에 유사한 아미노산 서열을 포함할 것이다.
서열번호 1
서열번호 2
이미 언급한 바와 같이, 생성된 아미노산 서열이 바이러스(헤파린-Ⅱ-결합 도메인의 경우에)를 결합시키는 능력 및 표적 세포(CS-1 도메인의 경우에)를 결합시키는 능력을 나타내는 천연 서열과 충분히 유사한 경우, 이들 천연 서열의 변형 및/또는 변이는 본 발명을 실행하는데 있어서 가능할 것으로 이해할 수 있다.
본 발명의 한가지 양태는 시험관내 세포 치료 요법 및 숙주내로 표적세포의 후속적인 이식과 관련되고 또한 형질도입된 표적 세포를 사용한 숙주의 "이식"으로 알려져 있는 체세포 유전자 치료 요법의 방법을 제공한다. 조혈세포 또는 기타 세포는 표준 프로토콜을 사용하여 사람 또는 기타 포유동물로부터 수집할 수 있다. 예를 들면, 조혈세포는 사람 공여체의 골수 또는 말초 혈액 또는 사람 태아 제대 혈액으로부터 수집할 수 있다 일단 수집한 후, 조혈세포를 표준 기술로 임의 처리하여 줄기세포 및/또는 원시 전구세포 중에서 농축시킬 수 있다. 이어서, 조혈 세포를 예를 들어 조직 배양 플레이트상에서 안정하게 배양할 수 있다. 당해 배양시에 임의로 부착-음성 저밀도 단핵세포를 레트로바이러스 감염 전에 예비 자극시킬 수 있다. 본 기술분야에 공지되고 본원에 기술된 예비 자극은 레트로바이러스에 노출시키기 전에 성장 자극 인자에 세포를 노출시키는 방법을 의미한다. 이와같은 예비 자극은 레트로바이러스에 의한 조혈세포의 형질도입을 향상시키는 것으로 입증되었다.
예비 자극에 이어서, 세포를 수거하고, 본원에 기술된 바와 같이 레트로바이러스에 의한 세포 형질도입의 빈도를 증가시키는 피브로넥틴 또는 이의 단편과 함께 배양할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 정제된 및/또는 불용성의, 예를 들어 고정된 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편과 함께 배양한다. 이어서, 세포를 재조합 바이러스, 예를 들어 세포내에서 효소 또는 기타 단백질의 결실 또는 비정상을 교정하는 유전자를 포함하는 레트로바이러스를 사용하여 바이러스에 의한 세포의 형질도입 빈도를 증가시키기에 효과적인 양의 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에 감염시킬 수 있다. 이어서, 생성되는 형질도입된 조혈세포는 통상적으로, 예를 들어 동물 세포 이식편 수용체, 바람직하게는 동종 이식물을 포함하는 자가이식 공여체내로 정맥내 도입할 수 있으며, 후자의 경우 제대 혈액 세포가 하기 언급되는 바와 같이 이식에 사용된다.
본 발명의 방법은 예를 들어 암 및 백혈병을 포함하는 골수 질환 및 단백질 결핍 또는 단백질 이상과 관련된 질환을 포함하는 여러가지 질환을 위한 유전자 표지 또는 유전자 치료 프로토콜 및 화학 치료 요법과 같은 다른 치료 프로토콜에 대한 내성을 개선시키기 위해 조혈세포를 변형시키는 치료 요법에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명이 사용될 수 있는 대표적인 질환에는 ADA 결핍증, 예를 들어 ADA-결핍성 SCID, 소아 급성 골수성 백혈병(AML), 신경아세포종 및 성인 AML 및 급성 림프성 백혈병(ALL)이 포함된다.
본 발명의 한가지 특히 바람직한 양태에 있어서, 세포 이식에 사용되는 세포를 사람 제대 혈액으로부터 수득한다. 따라서, 사람 제대 혈액을 수거하고, 예를 들어 부착-음성의 저밀도 단핵 세포 집단을 수득함으로써 생존 가능한 원시 조혈 전구세포 및/또는 줄기세포를 농축시킬 수 있다. 이어서, 당해 집단을 임의로 예비 자극시키고, 레트로바이러스 벡터 및 고정되고/되거나 정제된 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에 배양하여 벡터에 의한 세포의 형질도입 효율을 증가시킨다. 이 점에 있어서, 제대 혈액으로부터 수득한 원시 조혈세포 및/또는 줄기세포의 형질도입은, 피브로넥틴이 제대 혈액내에서 ECM의 일부를 구성하지 않고 제대혈액으로부터 수득한 원시 전구세포 및 줄기세포가 골수로부터 수득한 세포와 상이한특징을 가지더라도 피브로넥틴 또는 피브로넥틴의 존재하에 크게 증가되는 것으로 밝혀졌다. 특히, 제대 혈액 줄기세포는 CD34+, HLA-DR+로서 특징지워지는 반면에, 골수로부터의 줄기세포는 CD34+, HLA-DR-로서 특징지워진다. 제대 혈액의 원시전구세포가 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편의 존재하에 증가된 방식으로 효과적으로 형질도입된다는 본 출원인의 발견은 조혈세포의 고도로 줄기세포-농축된 공급원을 편리하게 사용할 수 있게 한다. 게다가, 원시 전구세포 및 줄기세포가 풍부한 제대 혈액의 동종 이식을 포함한, 다수의 환자에 대한 성공적인 이식은 제대 혈액이 조혈세포를 위한 공급원으로서 매우 바람직함을 증명한다[참조: Kohli-Kummer et al., Brit. Heaematol. 85: 419-422 (1993): Broxmeyer et al., Blood Cell 17: 313-329(1991); Gluckman et al., Br. J. Heaematol. 45: 557(1980); Heidelberg: Springer-Verlag pp. 60-68(1989); Wagner et al., Blood 79: 1874-1881(1992); and Wagner et al., Blood 82-86a(요약서)].
경우에 따라, 수거한 형질전환된 조혈세포 또는 다른 세포는 형질도입 효율 및 유전자 발현에 대해 시험할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 의해 제공된 레트로바이러스-매개된 유전자 전이의 현저한 향상은 피브로넥틴 또는 효과적인 피브로넥틴 단편의 존재하에 레트로바이러스에 의한 고도의 감염 및 유전자 전이 효율을 입증하는 몇몇 시험이 기술된 하기 특정 실시예에 의해 증명된다. 특히, PGK-hADA 레트로바이러스로 감염시킨 쥐 조혈세포는 전이된 ADA cDNA를 고도로 발현시켰다. 유사하게, 사람 전구세포 콜로니에 감염시킨 각각의 PGK-mADA 바이러스는 내인성 사람 ADA 단백질보다 10배나 더 높은 수준으로 쥐 ADA를 발현시켰다. 따라서, 전이 효율을 정확하게 분석하기 위하여, 전구세포 콜로니는 전이된 mDNA의 발현이 내인성 사람 ADA 수준과 같거나 이보다 더 높은 경우에만 형질도입된 것으로 간주되었다. TKNEO 벡터로부터의 neo의 높은 발현 수준은 네오포스포트란스퍼라제(네오 유전자 생성물) 활성에 대해 분석한 바와 같이 G418 약물 내성에 의해 검출되었다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 레트로바이러스 생산자 세포의 존재하에 동시배양할 필요없이 유리하게 수행된다. 따라서, 본 발명의 한가지 양태에 따르면, 레트로바이러스-매개된 유전자 전이는 표적 조혈세포 또는 기타 세포외의 세포의 실질적인 부재하에 수행될 수 있다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 포함하는 생산자 세포를 배양하여 상등물을 수거할 수 있다. 이어서, 레트로바이러스-함유 상등물을 사용하여 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 단편의 존재하에 조혈세포를 감염시킬 수 있으며, 이는 예를 들어 감염이 수행되는 기질 또는 감염용 배지와 접촉된 기질상에 피복된 고정된 형태로 수행된다. 이 점에 있어서, 높은 역가 헬퍼-부재 레트로바이러스를 생산하는 모든 생산자 세포가 본 발명에 사용하기에 적합한 것으로 생각된다. 여기에는 예를 들어 본 기술분야에 공지된 많은 기타 패키징 세포주 뿐만 아니라, Psi-2, C2, PA12, PA317 및 GP+envAM12와 같은 패키징 세포가 포함된다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ 결합 도메인내 아미노산에 결합하는 강력한 바이러스를 사용하여 다양한 세포 유형에 걸쳐 바이러스성 치료용 전달 시스템을 작제할 수 있다. 결국, 피브로넥틴의 레트로바이러스 결합도메인을 포함하는 폴리펩타이드를, 표적 세포에 대한 특이성을 당해 작제물에 제공하는 임의의 리간드와 공유 결합시킬 수 있다. 이러한 방법은 각각의 표적 세포에 대해 특이적인 레트로바이러스 세포주를 작제해야 하는 종래의 필요성을 해결할 것이다[참조: Kasahara, N., A. M. Dozy, and Y. W. Kan., Science, Vol. 266, pp. 1373-1376(1994) and Valsesia-Wittmann, S., A. Drynda, G. Deleage, M. Aumailley, J. M. Heard, O. Danos, G. Verdier, and F. L. Cosset, J. Virol., Vol. 68, pp 4609-4619(1994)]. 표적 작제물의 특이성은 예를 들어 1) 세포 부착 단백질, 2) 호르몬 또는 사이토킨, 3) 표적 세포에 대한 모노클로날 항체, 4) 표적 세포를 결합시키는 탄수화물[참조: G. Ashwell, et al., Annu. Rev. Biochem., Vol. 51, pp. 531-554(1982)], 5) 표적 세포에 대한 대사 산물 또는 6) 표적 세포를 결합시키는 작용성 폴리펩타이드를 포함하는 리간드를 사용하여 제공할 수 있다. 작제물의 유전자 전달 효율은 몇몇 헤파린-Ⅱ 바이러스 결합 도메인을 포함시켜 표적 세포로 전달되는 바이러스 단편의 양을 증가시킴으로써 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 미합중국 특허 제5,198,423호에 기술된 바와 같이 Pro1239내지 Ser1515에 상응하는 사람 피브로넥틴의 세포-결합 도메인은 BHK 및 B16-F10을 포함하는 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다[참조: Kimizuka et al., J. Biochem. Vol. 110, pp. 285-291(1991)]. 또한, 헤파린-Ⅱ 도메인 자체는 섬유아세포, 내피 세포 및 종양 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 폴리펩타이드 서열은 레트로바이러스에 의한 감염을 위해 예정된 표적 세포에 피브로넥틴의 레트로바이러스 도메인을 결합시킬 수 있다.
또한, 조혈 시스템에서의 예시적인 적용은 각각 고도로 특이적인 적혈구 또는 과립구 전구세포를 표적화시키기 위해 피브로넥틴의 레트로바이러스 결합 도메인에 결합된 에리트로포이에틴 또는 G-CSF의 작제물을 포함한다. 본 발명에 따른 또다른 통상적인 적용은 레트로바이러스 결합 도메인 또는 도메인들을 악성세포에 특이적 또는 우세하게 결합하는 리간드와 연결시킬 수 있다. 예를 들면, 유방암 세포의 시험관내 및 생체내 증식은 황체화 호르몬 방출 유도체[참조: Emons, G. et al., Hum. Reprod. 9: 1364-1379(1994)], 에스트로겐[참조: Tolcher, A. W., Oncol. 8: 39-43(1994)], 또는 항-에스트로겐[참조: Howell, A. et al., Lancet 345: 29-30(1995)], 프로게스토겐 또는 항-프로게스토겐[참조: Klijn. F. G. et al, Hum. Reprod. 9 Suppl. 1: 181-189(1994); Griffiths, K. et al, Semin. Oncol. 21: 672-687(1994)]과 같은 표적 세포상의 수용체에 결합하는 물질을 사용하여 영향을 줄 수 있으며, 이는 피브로넥틴의 하나 이상의 바이러스 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 작제물에 리간드로서 사용할 수 있다. 추가의 예로서, 갑상선(암) 세포는 조디드(Jodid)에 따른 작제물을 사용하여 고도로 특이적으로 표적화시킬 수 있으며, 간(암) 세포는 HDL 또는 이의 단편을 포함하는 작제물로 표적화시킬 수 있다. 마지막으로, 모노클로날 항체 및 피브로넥틴의 레트로바이러스-결합 도메인의 작제물은 항체가 이용가능한 임의의 세포 및 기관을 표적화시킬 수 있다. 따라서, 광범위한 포유동물의 세포 유형이 바이러스 벡터를 결합 및 집적시키기 위해 피브로넥틴의 레트로바이러스 결합 도메인의 능력을 이용함으로써 표적화시킬수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 바람직한 양태는 표적 세포의 바이러스 형질도입을 증가시키는데 사용될 수 있는 작제물의 제조방법을 포함한다. 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ-결합 도메인의 바이러스-결합 아미노산 서열을 표적 세포가 결합하는 리간드에 연결시킨다. 상기 기술된 바와 같이, 리간드는 예를 들어 피브로넥틴 또는 또 다른 단백질(세포 부착 단백질, 예를 들어 라미닌, 콜라겐, 비트로넥틴, 오스테오폰틴 또는 트롬보스폰딘을 포함)로부터의 폴리펩타이드, 호르몬, 대사산물, 항체(모노클로날 항체 포함) 또는 표적 세포에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 임의의 또 다른 리간드일 수 있다. 생성된 모든 작제물은 하기 실시예에 구체적으로 예시된 피브로넥틴 폴리펩타이드를 위해 사용된 것과 유사한 방식으로 고정된 형태로서 사용할 수 있다.
이와 같은 작제물 및 세포-표적화 방법은 상술한 바와 같이 시험관내에서 사용될 수 있으며, 또한 생리학적 조건하에서 작제물 및 레트로바이러스 작제물의 반응 안정성 및 특이성과 같은 여러가지 인자에 따라 레트로바이러스를 생체내에서 표적화시킬 수 있다. 또한, 특이성은 예를 들어 간세포를 표적화시키기 위해 문맥에 카테터를 꽂는 것과 같이 표적 세포에 작제물을 편재 전달시키는 전달 시스템을 변형시켜 향상시킬 수 있다.
매우 편리한 레트로바이러스-매개된 DNA 전이는 본 발명의 실제 방법에서 구체적으로 설계된 키트를 사용하여 수행할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 레트로바이러스에 의한 표적 세포의 형질도입을 증가시키는상기 논의된 상당량의 실질적으로 순수한 폴리펩타이드 또는 작제물을 레트로바이러스 감염을 수행할 수 있는 인공 기질과 함께 포함하는 키트를 제공한다. 폴리펩타이드 또는 다른 작제물은 별도로 제공되거나 인공 기질상에 피복시킬 수 있다. 사람 조혈세포를 위한 감염 프로토콜의 경우, 키트는 또한 세포 예비자극을 위한 조혈세포 성장 인자를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 형질도입을 위해 상기 기술된 바와 같은 재조합 레트로바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 당해 키트는 키트의 조작시 성분의 파괴를 예방하기에 충분하도록 여러가지 키트 성분을 서로 공간적으로 구분시킨 멸균 포장을 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트 성분을 공간적으로 구분되도록 다수의 구획 또는 부분을 포함하는 성형된 플라스틱 제품을 사용하는 것이 통상적이다.
본 발명에 대한 추가의 이해 및 평가를 촉진시키기 위해, 하기 특정 실시예가 제공된다. 이들 실시예는 예시적인 것이며, 사실상 비제한적인 것으로 이해될 것이다.
본 발명의 한가지 바람직한 양태는 레트로바이러스 벡터에 의한 조혈세포의 형질도입 빈도를 증가시키는 방법을 제공한다 당해 방법은 레트로바이러스에 의한 세포 형질도입의 빈도를 증가시키기에 효과적인, 실질적으로 순수한 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 단편의 존재하에 생존가능한 조혈세포를 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터로 감염시킴을 포함한다. 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 단편은 천연 발생 물질로부터 기원하거나 합성적으로 유도할 수 있으며(예를 들어, 재조합 또는 화학적 합성 기술에 따라 유전공학적으로 제조), 또한 천연-발생 및 합성 물질의 조합으로부터 기원할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용된 피브로넥틴 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 본 발명에 따라 형질도입을 향상시키는데 요구되는 부착 특성을 갖는 작용성 폴리펩타이드를 제공하는 천연-발생 피브로넥틴 아미노산 서열에 대한 돌연변이체를 포함하는 것은 물론이다.
본 발명의 또다른 바람직한 양태는 레트로바이러스에 의한 세포 형질도입 빈도를 증가시키기에 효과적인 양의 고정된 피브로넥틴, 고정된 피브로넥틴 단편 또는 이의 고정된 혼합물의 존재하에 조혈세포를 외인성 DNA를 수반하는 복제-결함 재조합 레트로바이러스로 감염시킴을 포함하여 형질도입된 조혈세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 세포 이식을 위한 개선된 방법을 제공한다. 당해 방법에는 동물 공여체로부터 생존가능한 조혈세포를 수득하는 단계, 조혈세포를 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 고정된 형태 및 형질도입의 빈도를 증가시키기에 효과적인 피브로넥틴 및/또는 이의 단편의 존재하에 감염시켜 형질도입된 생존가능한 조혈세포를 제조하는 단계 및 형질도입된 생존가능한 조혈세포를 동물 수용체내로 세포 이식에 의해 도입시키는 단계를 포함한다. 한가지 바람직한 양태에 있어서는 감염된 세포가 자가 공여체내로 도입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 세포 이식 방법에 적합한 형질도입된 제대 혈액 세포를 수득하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 레트로바이러스 벡터에 의해 조혈세포의 형질도입 빈도를 증가시키기 위한 유효량의 고정된 피브로넥틴 및/또는 피브로넥틴 단편의 존재하에서 제대 혈액으로부터의 조혈세포를 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터로 감염시킴을 포함한다. 또한, 본 발명은 이와 같은 방법에 의해 수득가능한 제대 혈액으로부터의 형질도입된 생존가능한 세포 집단(cellular population) 및 형질도입된 세포 집단을 동물내로 세포 이식편(cellular graft)으로서 도입시키는 세포 이식 방법을 포함한다.
본 발명의 상기 양태 중의 보다 특정한 양태에 따라, 사용되는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 단편은 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ-결합 도메인의 레트로바이러스-결합 활성을 제공하는 제1 아미노산 서열 및 피브로넥틴의 CS-1 도메인의 세포-결합 활성을 제공하는 제2 아미노산 서열을 포함할 것이다. 피브로넥틴의 이들 2개의 결합 도메인의 사용은 레트로바이러스에 의한 표적 세포의 형질도입 효율을 매우 현저히 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 레트로바이러스 벡터에 의한 예정된 표적 세포의 형질도입 빈도를 향상시키는 작제물의 제조 방법을 제공한다. 당해 방법은 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ-결합 도메인의 레트로바이러스-결합 활성을 제공하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 상기 표적 세포와 결합하는 리간드를 공유 결합시키는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 레트로바이러스 벡터에 의해 예정된 표적 세포의 형질도입 빈도를 증가시키기 위해 이들 작제물을 사용하는 방법 및 형질도입된 세포를 사용한 이식 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 상당한 양의 바이러스를 집적(localizing)시키기 위해 피브로넥틴의 헤파린-Ⅱ 결합 도메인의 바이러스-결합 활성을 포함하는 유효량의 고정된 피브로넥틴 또는 피브로넥틴의 단편의 존재하에 바이러스를 포함하는 배지를 항온처리함을 포함하여 상당한 양의 바이러스를 집적시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태는 일반적으로 다음에 추가로 기술되는 바와 같이 세포내로 레트로바이러스-매개된 DNA 전이를 유도하는 키트 뿐만 아니라, 실질적으로 순수하고/하거나 고정된 피브로넥틴 또는 이의 단편을 포함하는 형질도입된 생존가능한 조혈세포 및 기타 세포 배양물을 제공한다.
본 발명의 목적은 포유동물 세포의 효율적인 레트로바이러스 감염 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동시배양할 필요가 없는 레트로바이러스 벡터를 사용한 유전자 전이 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자가 및/또는 동종 세포 이식을 위한 개선된 방법 및 세포 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적, 잇점 및 특징은 하기 설명에 의해 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
실시예 1
TKNEO를 사용한 골수 세포내로의 유전자 전이
1.1 바이러스-상등물의 제조
레트로바이러스성 플라스미드 TKNEO 벡터를 포함하는 GP+EnvAM 12 생산자 세포[참조: Markowitz et al. (1988) Virology 167: 400]를, 10% 송아지 태아 혈청(FCS, Hyclone, Logan, UT) 및 페니실린 100단위/ml 및 스트렙토마이신100μg/ml(P/S, 모두 Gibco)를 포함하는 이스코브 변형된 둘베코 배지(IMDM, Gibco, Gaithersburg, MD)에서 배양했다. 융합성 플레이트(confluent plate)에 20% FCS를 포함하는 IMDM 10ml를 밤새 가하여 바이러스 함유 상등물을 수집했다. 수집된 배지를 0.45 마이크론 여과기(Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)를 통해 여과하여 사용할 때까지 -80℃에 저장했다.
1.2 피브로넥틴 단편의 제조
4M 우레아로 FN을 용출시키기 전에 젤라틴-아가로즈 칼럼을 1M 우레아로 세척하는 것을 제외하고는, 문헌[참조: Ruoslahti et al., Methods Enzymol. 82: 803-831(1982)]에 이미 기술된 바와 같이 FN을 사람 혈장(Lifesource, Glenview, IL)으로부터 정제했다. 정제된 FN을 10mM 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판-설폰산(CAPS), 150mM NaCl, 2mM CaCl2pH 11.0에 대해 4℃에서 완전히 투석하고, 분취량으로 -80℃에 저장했다. FN의 키모트립신 세포 결합 도메인(CBS)(CS-1) 및 헤파린-Ⅱ 결합 단편을 이미 문헌[참조: Ruoslahti et al. (1982), 상기, Patel and Lodish, J. Cell. Biol, 102, pp. 449-456(1986), and Bernardi et al., J. Cell. Biol. 105. pp. 489-498(1987)]에 기술된 바와 같이 정제했다. 헤파린-아가로즈 칼럼으로부러의 1M NaCl 용출로 3개의 주요 헤파린-결합 단편(30kD, 35kD 및 42kD)을 수득했다. 이들 헤파린-결합 단편을 추가로 정제하기 위해, 1M NaCl 용출물을 10mM 트리스-HCl, pH 7.0에 대해 4℃에서 밤새 투석하고, 10mM 트리스-HCl pH 7.0으로 평형화시킨 음이온 교환 칼럼[2ml DEAE 세파로즈 고속 유동(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)/단백질의 ml]을 통해 통과시켰다. 30/35kD 단편을 비결합된 분획에서 수집한 반면에, 42kD 단편을 100mM NaCl로 칼럼으로부터 용출시켰다. FN 500mg으로부터 30/35kD 단편 약 26mg 및 42kD 단편 4mg을 수득했다. 30/35kD 단편이 아닌 42kD 단편이 웨스턴 블롯팅 기술에 의해 측정된 바와 같이 피브린-결합 도메인에 대한 항체에 의해 인식되었다. 또한, 42kD 단편은 피브린-세파로즈 친화성 칼럼에 결합한다
감염 프로토콜에 사용하기 위해, 상기 문헌[참조: Patel and Lodish (1986)]에 기술된 바와 같이 피브로넥틴 단편을 75pmol/cm2의 농도로 35 또는 100mm 페트리디쉬(Falcon, Lincoln Park, NJ)상에 고정시켰다. 대조군 플레이트는 유사한 방식으로 2%(FN-부재) 소 혈청 알부민(BSA, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)으로 피복시켰다.
1.3 레트로바이러스 감염 프로토콜
건강한 성인 공여자로부터의 골수 샘플을 인디아나 대학교 의과대학의 인스티튜셔널 리뷰 보드(Institutional Review Board of Indiana University School of Medicine)에 의해 증명된 프로토콜에 따라 멸균된, 보존제-부재 황산나트륨 헤파린을 포함하는 튜브에 수집했다. 저밀도 단핵 세포는 Ficoll-Hypaque(밀도 1.077g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ)상에서 25℃에서 45분 동안 원심분리하여 제조했다. 조직배양 플레이트상에서 4 내지 16시간 동안 37℃로 2% FCS를 포함하는 IMDM중 5% CO2에서 추가로 배양하여 저밀도 골수 세포로부터 플라스틱 부착 세포를제거했다.
부착-음성 저밀도 단핵 세포는 문헌[참조: Luskey et al. (1992) Blood 80: 396]에 이미 기술된 바와 같이, 레트로바이러스 감염전에 48시간 동안 37℃에서 20% FCS, 100U/ml rhIL-6, 100ng/ml rhSCF(모두 Amgen, Thousand Oaks, CA) 및 P/S를 포함하는 IMDM중의 5% CO2로 페트리 디쉬내에서 세포 밀도 1x106세포/ml로 예비자극시켰다. 예비 자극된 세포는 플라스틱에 느슨하게 부착된 세포를 제거하기 위해 격렬하게 피펫으로 옮겨 수거했다.
예비 자극된 세포(5x105세포/ml)를 BSA(대조군 플레이트) 또는 피브로넥틴 또는 이의 단편으로 피복시킨 플레이트(플라스틱 플레이트에 단백질을 용이하게 부착시키기 위해 UV 조사시킴)상에서 6시간 동안 배양하고, 이어서 성장 인자(상기한 바와 같음) 및 7.5㎍/ml 폴리브렌(Aldrich Chemical, Milwaukee, WI)의 존재하에 바이러스 상등물로 감염시켰다. 2시간 후 바이러스 상등물을 대체(성장 인자 및 5.0㎍/ml 폴리브렌을 포함)하고, 추가로 12 내지 24시간 동안 세포를 배양했다. 각각의 배지 교환시 부착하지 않은 세포를 다시 첨가했다.
감염 프로토콜에 이어서, 부착하지 않은 세포를 가만히 따르고, 제조업자의 지시에 따라 세포 분리 완충액(Cell Dissociation Buffer; CDB)(효소 부재/PBS계, Gibco)을 사용하여 배지로부터 부착 조혈세포를 수집했다. 부착 세포를 비-부착 분획에 가하고, 2회 세척하여 계수했다. 수거한 세포를 클론형성 메틸셀룰로오즈 전구세포 검정 또는 장기간 골수 배양에 플레이팅했다.
1.4 장기간 골수 배양
이미 기술된 방법을 약간 변형시켜 LTC-IC(사람 줄기세포) 검정을 수행했다[참조: Sutherland et al. Blood 74: 1563(1989)]. 요약하면, 0.5 내지 1x106개의 감염된 세포를 상기한 바와 같이 6웰 조직배양 플레이트(Costar, Cambridge, MA)중의 10% FCS, 10% 말 혈청(Sigma) 및 P/S를 포함하는 5ml IMDM, 1x10-5M 하이드로코르티손(Upjohn, Kalamazoo, MI) 및 320 모스몰 염화나트륨중 융합성의 예비조사된 동종이계의 사람 골수 섬유아세포(BMF)상의 장기간 골수 배양물(LTMC)에 시딩했다. LTMC를 33℃로 5% CO2에서 배양하고, 50%의 배지 및 부착하지 않은 세포를 제거하여 매주 영양공급했다. 5주 후, CDB를 사용하여 LTC-IC 배양물을 사멸시키고, BMF로부터 부착 조혈세포를 제거했다. 비-부착 조혈세포 및 부착 조혈세포 모두를 합하고, 메틸셀룰로오즈에 플레이팅하여 LTC-IC로부터 기원한 콜로니를 수득했다.
1.5 클론형성 메틸셀룰로오즈 검정
메틸셀룰로오즈 검정은 문헌[참조: Toksoz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 89, p 7350(1992)]에 이미 기술된 바와 같이 약간 변형시켜 수행했다. 요약하면, 25% FCS, 10% 사람 혈장, 10-5M 베타-머캅토에탄올(Sigma) 및 P/S를 포함하는 2.4% IMDM 메틸셀룰로오즈(Fluka, Ronkonkoma, NY) 1ml중의 5단위/ml 에리트로포이에틴(Epo, Amgen), 100ng/ml rhSCF, 10ng/ml rhIL-3(Genzyme, Cambridge, MA)으로 2 내지 5x104개의 감염된 성인 골수 세포를 플레이팅했다. 배양물을 37℃로5% CO2/95% 대기에서 배양하고, 13일째에 역상 현미경으로 관찰하여 콜로니(>50 세포)를 CFU-GM(과립구 및 대식세포 포함), CFU-Mix(골수계 성분 및 적혈구계 성분을 포함) 또는 BFU-E(적혈구계 성분만을 포함)로서 계수했다.
1.6 레트로바이러스 감염의 분석
TKNEO 바이러스를 사용한 감염 효율은 13일째에 1.5mg/ml(무수 분말, Gibco) G418에 대한 메틸셀룰로오즈 콜로니 내성의 백분율을 측정하여 분석했다. 가성 감염(mock infection)은 골수 세포를 어떠한 재조합 바이러스도 생성하지 않는 GP+EnvAM 12 패키징 세포주상에서 배양함으로써 각각의 실험에서 수행했다. 1.5mg/ml G418을 사용한 상기 가성 감염된 세포의 배양은 일정하게 <1%의 기본 콜로니를 나타냈다.
1.7 수임 전구세포 내로의 유전자 전이 효율
형질도입 효율은 30/35 FN-또는 BSA-피복된 디쉬상에 플레이팅한 골수 세포를 감염시켜 비교했다. 선별없이 감염시킨 후 수득된 다수의 콜로니에서 상기 조건사이에 어떠한 차이점도 관찰되지 않았다. 도 2는 감염후 G418r콜로니의 백분율을 나타낸다. 보다 높은 G418r콜로니의 백분율이 계열-제한된(BFU-E 및 CFU-GM)전구세포 뿐만 아니라 다수계열(CFU-Mix) 전구세포로부터 기원한 것을 포함하는 모든 형태의 전구세포로부터 30/35FN상에서 관찰되었다. 모든 수임 전구세포내로의 감염은 ESA에 비해 30/35FN상에서 9배 증가했다.
1.8 장기간 배양-개시 세포내로의 유전자 전이 효율
TKNEO 벡터를 사용하여 LTC-IC내로의 유전자 전이를 평가했다 LTC-IC 기원한 콜로니내로의 유전자 전이는 30/35 FN상에서 감염시킨 후에만 검출되었다(16% G418r대 0% G418r콜로니, 30/35 FN 대 BSA).
1.9 조혈세포의 감염 효율에 미치는 30/35 FN 효과의 특이성
30/35 FN에 대해 나타난 증가된 유전자 전이 효율의 특이성을 측정하기 위해, BSA, 30/35 FN, 완전한 피브로넥틴, RGDS 테트라펩타이드 서열을 포함하는 중심 세포-결합 도메인(CBD)을 포함하는 115 kd FN 단편 및 헤파린-Ⅱ 결합 도메인에 의해 특징지워지지만 CS-1 서열은 결실하고 있는 42kd C-말단 FN 단편(42FN)(도 1)으로 피복시킨 플레이트상에서 TKNEO를 사용한 감염을 수행했다. BSA상의 감염은 3±1% G418rBFU-E, 1±1% G418rCFU-GM 및 0±0% G418rCFU-MIX를 나타냈다. G418r콜로니 비율의 현저한 증가가 CBD 상에서는 전혀 나타나지 않은 반면, BFU-E의 약간 높은 감염율(6.0±-1%)이 42FN상에서 관찰되었다(도 3). 그러나, 완전한 FN은 모든 수임 전구세포내로의 유전자 전이 증가를 촉진시켰다. 완전한 FN상에서 감염시킨 후의 G418r콜로니의 백분율은 각각 BFU-E(16±-2 대 24±4%), CFU-GM(5±2 대 20±4%) 및 CFU-Mix(각각 6±1 대 9±1; 순수한 FN 대 30/35 FN)을 포함하는 모든 계열에 있어서 30/35 FN 상에서 감염시킨 후의 G418r콜로니의 백분율에 비해 작았다.
실시예 2
PGK-mADA를 사용한 골수 세포내로의 유전자 전이
2.1 일반적인 공정
실시예 1에서 TKNEO에 대해 기술한 바와 같이 PGK-mADA 바이러스 상등물을 제조했다. 실시예 1에 이미 기술된 바와 같이 피브로넥틴의 키모트립신 단편(도 1)을 제조하고, 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜을 수행했다. LTC-IC(사람 줄기세포) 검정 및 메틸셀룰로오즈 검정을 실시예 1에 따라 수행했다.
2.2 레트로바이러스 감염의 분석
PGK-mADA 벡터를 사용한 감염 효율은 ADA 동위효소 전기영동법을 사용하여 단백질 분석에 의해 측정했다. 개개 전구세포 콜로니의 분석은 문헌[참조: Moritz(1993) 및 Lim et. al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 86, p 8892]에 이미 기술된 바와 같이 수행했다. 전이 효율을 엄격하게 분석하기 위해, 내인성 사람 ADA와 동일하거나 이보다 더 높은 수준으로 mADA를 발현하는 콜로니만을 형질도입된 것으로 간주했다. 수집된 콜로니를 분석하기 위해, 메틸셀룰로오즈 배양물중에서 선택된 콜로니를 1.5ml 마이크로튜브(Rainin, Woburn, MA)내에서 합하고, 따뜻한 배지 및 인산염 완충된 염수(PBS)로 세척한 다음, 원심분리하여 -20℃에 저장했다. ADA 분석을 위해, 반복된 동결-해동 주기에 의해 용해 완충액 5㎕로 세포를 용해시키고, 동위효소 전기영동법을 이미 기술된 바와 같이 수행했다.
2.3 수임 전구세포 내로의 유전자 전이 효율
형질도입 효율은 30/35 FN-피복된 디쉬 또는 BSA-피복된 디쉬상에 플레이팅된 골수세포를 감염시킴에 의해 비교했다. 선별하지 않고 감염시킨 후 수득한 다수의 콜로니에서 어떠한 차이도 이들 조건간에 관찰되지 않았다. 표 1에 도시된 바와 같이, 모든 수임 전구세포 내로의 감염 효율은 BSA 보다 30/35 FN상에서 실질적으로 증가되었다. 역가가 높은(-1x107virions/ml) 벡터의 사용시 예상되는 바와 같이, 수임 전구세포의 형질도입 효율은 극히 높았다. 표 1과 관련하여, PGK-mADA를 사용한 30/35 FN 상의 골수 감염은 2개의 별도의 실험에서 수임 전구세포에 대해 거의 100%의 형질도입을 나타냈다.
[표 1]
PGK-mADA 벡터를 사용한 피브로넥틴 30/35 단편상에서의 수임 사람 전구세포의 감염 효율
* mADA 발현 콜로니의 수/분석된 전체 콜로니
2.4 장기간 배양-개시 세포내로의 유전자 전이 효율
PGK-mADA로 수행한 4개의 독립된 실험에서, 5주된 LTMC로부터 기원한 전구세포 콜로니(즉, LTC-IC 기원한 콜로니)의 현저한 비율이 전이된 쥐 ADA 유전자를 발현했다. 발현은 분석된 콜로니의 2/12(17%) 내지 6/6(100%)의 범위이었다(표 2). 모든 콜로니에서 내인성 사람 ADA 활성의 양을 초과하거나 적어도 이와 동등하게 도입된 mADA 유전자가 발현된 경우 양성인 것으로 간주하였다. PGK-mADA에 대한 감염 효율은 TKNEO의 경우에서 보다 높았다. 표 2에 나타낸 바와 같이, PGK-mADA를 사용한 30/35 FN 상의 골수 감염은 2개의 별개의 실험에서 수임 전구세포의 거의 100% 형질도입을 나타냈다.
[표 2]
PGK-mADA 벡터를 사용한 사람 장기간 배양 개시 세포(LTC-IC)의 감염 효율
* mADA 양성 콜로니의 수/분석된 전체 콜로니; N/A: 분석 불가
2.5 조혈세포의 감염 효율에 미치는 30/35 FN 효과의 특이성
LTC-IC내로의 유전자 전이 효율은 30/35 FN상에서 증가했다. 이들 제2 LTC-IC 기원한 콜로니의 비교적 작은 크기로 인해, 단일 콜로니에 대한 단백질 분석의 수행은 제한되었다. BSA, 완전한(intact) 피브로넥틴 및 42 FN상에서 PGK-mADA로 감염시킨 후에는 0/6, 0/4 및 0/3 LTC-IC-기원한 콜로니가 각각 쥐 ADA의 발현을 나타냈지만, 30/35 FN상에서 감염시킨 후에는 3/5 LTC-IC-기원한 콜로니가 mADA를 발현시켰다. 또한, 또 다른 2개의 실험에서 다수의 LTC-IC-기원한 콜로니를 분석전에 합한 경우, mADA의 발현은 30/35 FN상에서 감염시킨 후에만 검출되었고, 완전한 FN상에서 감염시킨 후에는 발현 정도가 적었으며, 42 FN 또는 BSA상에서는 검출되지 않았다.
실시예 3
PGK-hADA를 사용한 골수 세포내로의 유전자 전이
3.1 일반적인 공정
PGK-hADA 바이러스 상등물은 실시예 1에서 TKNEO에 대해 기술한 바와 같이 제조한다. 피브로넥틴의 키모트립신 단편(도 1)은 실시예 1에 이미 기술된 바와 같이 제조하고, 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따랐다. LTC-IC 및 메틸셀룰로오즈 검정은 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행했다.
3.2 레트로바이러스 감염의 분석
수집된 콜로니를 분석하기 위해, 메틸셀룰로오즈 배양으로부터 수득한 콜로니를 1.5μl 마이크로튜브(Rainin, Woburn, MA)에서 합하고, 따뜻한 배지 및 PBS로 세척한 다음, 원심분리하여 -20℃에서 저장했다. ADA 분석을 위해, 반복된 동결-해동 주기에 의해 세포를 용해 완충액 5μl에 용해시키고, 상기한 바와 같이 동위 효소 전기영동을 수행했다.
실시예 4
TKNEO를 사용한 제대 혈액 세포내로의 유전자 전이
4.1 일반적인 공정
TKNEO 바이러스 상등물 및 피브로넥틴의 키모트립신 단편(도 1)을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 정상의 만기 출산된 신생아의 제대 혈액을 인디아나 대학교 의과대학의 인스티튜셔널 리뷰 보드에 의해 입증된 프로토콜에 따라 헤파린을 포함하는 튜브내에 수집하여 골수 세포 대신에 사용하는 것외에는 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따랐다. LTC-IC(사람 줄기세포) 및 메틸셀룰로오즈 검정은 실시예 1에 따라 수행했다.
4.2 수임 전구세포 내로의 유전자 전이 효율
FN30/35상에서의 감염은 3개의 별개 실험에서 BSA와 비교하여 4배 이상 증가되었다(표 3).
[표 3]
30/35 FN 단편 및 TKNEO 벡터를 사용한 제대 혈액 전구세포의 감염 효율
실시예 5
PGK-mADA를 사용한 제대 혈액 세포내로의 유전자 전이
5.1 일반 공정
PGK-mADA 바이러스 상등물 및 피브로넥틴의 키모트립신 단편(도 1)을 실시예 1에 이미 기술된 바와 같이 제조했다. 정상의 만기 출산한 신생아로부터의 제대 혈액을 인디아나 대학교 의과대학의 인스티튜셔널 리뷰 보드에 의해 입증된 프로토콜에 따라 헤파린을 함유하는 튜브에 수집하는 것을 제외하고는 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따랐다. LTC-IC 및 메틸셀룰로오즈 분석은 실시예 1에 따라 수행했다.
5.2 장기간 배양 개시 세포내로의 유전자 전이 효율
높은 역가의 PGK-mADA 벡터를 사용한 LTC-IC-기원한 콜로니의 분석은 FN30/35상에서 상등물을 사용하여 감염시킨 제대 혈액으로부터 확립된 배양물에서만 도입된 mADA cDNA의 높은 발현 수준을 나타냈다. BSA 대조군 플레이트에서 감염된 LTC-IC-기원한 콜로니에서는 mADA 발현이 거의 검출되지 않았다.
실시예 4 및 5에 나타낸 결과는 FN30/35을 사용한 향상된 감염 효율이 제대 혈액 전구세포 및 줄기세포를 사용하는 경우에도 달성될 수 있음을 증명한다.
실시예 6
PGK-hADA를 사용한 제대 혈액 세포내로의 유전자 전이
PGK-hADA 바이러스 상등물 및 피브로넥틴의 키모트립신 단편(도 1)을 실시예 1의 TKNEO에 대해 기술한 바와 같이 제조했다. 정상의 만기 출산한 신생아의 제대 혈액을 인디아나 대학교 의과대학의 인스티튜셔널 리뷰 보드에 의해 입증된 프로토콜에 따라 헤파린을 포함하는 튜브에 수집하여 골수 세포 대신에 사용하는 것외에는 실시예 1의 레트로바이러스 감염 프로토콜에 따랐다. LTC-IC 및 메틸셀룰로오즈 검정은 실시예 1에 따라 수행했다.
실시예 7 내지 실시예 11
실시예 7 내지 11을 위한 레트로바이러스 벡터 및 생산자 세포주
실시예 7 내지 11을 위해, 2개의 레트로바이러스-생산 패키징 세포주가 사용되었다: 각각, 에코트로픽(ecotropic) GP+E86[참조: Markowitz, D., S. Goff, and A. Bank, J. Virol., Vol. 62, pp 1120-1124(1988)] 및 앰포트로퍽(amphotropic)GP+ env AM12 세포주[참조: Markowitz, D.,S. Goff, and A. Bank, Virology, Vol. 167, pp 400-406(1988)]. 본원에 기술된 연구에 사용된 레트로바이러스 벡터 및 생산자 클론은 표 1에 수록되어 있다.
[표 4]
모든 세포주는 10% 송아지 태아 혈청 + P/S를 포함한 DME-F12 (Gibco)에서 증식시킨 EAL2a 세포를 제외하고는 10% 송아지 태아 혈청(FCS, Hyclone, Logan, UT) 및 100 단위/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신(P/S, 모두 Gibco)을 포함한 둘베코 변형된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagles medium: DME, Gibco, Grand Island, NV)에서 배양했다. 바이러스 함유 상등물은 각각 10% FCS + P/S를 함유하는, 쥐 세포의 경우 알파-최소 필수 배지(αMEM, Gibco) 또는 사람 세포의 경우 이스코브 둘베코 배지(IMDM, Gibco) 10ml를 융합성의 10cm 플레이트에 밤새 가하여 수집했다. 수거된 배지를 0.45 마이크론 여과기(Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)를 통해 여과하여 사용할 때까지 -80℃에 보관했다.
실시예 7
쥐 1차 조혈세포의 형질도입
7.1. 실험
쥐 세포를 사용한 연구의 경우, 150mg/kg 5-플루오로우라실(SoloPack Laboratories, Franklin Park, IL)을 투여한 후 2일 경과하여 6 내지 8주된 C3H/HeJ 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 골수를 수거했다[참조: Lim, B., J. F. Apperley, S. H. Orkin, and D. A. Williams, Proc. Natl. Acad Sci USA, Vol. 86, pp 8892-8896(1989)]. 100ng/ml 래트 재조합 줄기세포 인자(rrSCF; Amgen, Thousands Oaks, CA) 및 100단위/ml 재조합 사람 인터류킨-6(rhIL-6; Pepro Tech Inc., Rock Hill, NJ)을 사용하여 IMDM/20% FCS + P/S중에서 5 x 105세포/ml의 농도로 48시간 동안 세포를 예비자극했다[참조: Luskey, B. D., M. Rosenblatt, K. Zsebo, and D. A. Williams, Blood, Vol. 80, pp 396-402(1992)]. 이어서, EPHA-5 생산자 세포에 의해 생산된 PGK-hADA 벡터를 사용한 유전자 전이 효율은 3개의 상이한 감염 프로토콜: 1) 상등물 감염; 2) FN 30/35상의 상등물 감염; 3) EPHA-5 생산자 세포상에서의 동시배양을 사용하여 비교했다. 따라서, 100mm 세균 디쉬는 인산염 완충된 염수(PBS; Gibco) 5ml중에 용해시킨 2.5μg/cm2FN 30/35(75pmol/cm2에 상당)로 실온에서 1시간 동안 UV 광선하에 디쉬 뚜껑을 개방하고 또 다른 1시간 동안 디쉬 뚜껑을 밀폐시켜 피복시켰다. 2% 소 혈청 알부민(BSA, 분획 V; Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여 30분 동안 실온에서 차단시킨 후, 2.5%(v/v) 1M 헤페즈(모두 Gibco)가 보충된 한크 평형화된 염 용액(Hank's Balanced Salt Solution: HBSS)으로 디쉬를 1회 세척했다. 상등물 감염의 경우, 디쉬를 BSA만으로 피복시켰다. 5x106예비 자극된 공여체 세포는 100U/ml rhIL-6, 100ng/ml hrSCF 및 7.5㎍/ml 폴리브렌이 보충된 상기한 바와 같은 EPHA-5 세포로부터 수득한 바이러스 상등물 10ml와 함께 배양했다. 비-부착 세포를 수집하고, 신선한 바이러스 상등물을 다시 가했다. 동시배양을 위해, 4ml 배지중의 EPHA-5 세포를 10μg/ml 미토마이신 C와 함께 2시간 동안 37℃에서 배양하고, 세척한 후 트립신으로 처리한 다음, 10ml αMEM/20% FCS + P/S중에서 3x106의 세포 농도로 100mm 조직 배양 디쉬상에 시딩했다. 다음 날, 100U/ml rhIL-6, 100ng/ml rrSCF 및 4㎍/ml 폴리브렌을 사용하여 예비 자극시킨 5x106골수 세포를 48시간 동안 가했다. 감염 프로토콜에 따라, 비-부착 세포를 기울여 따르고, 부착 조혈세포는 제조업자의 지시에 따라 세포 분리 완충액(CDB)(효소 부재/PBS계, Gibco)을 사용하여 배양물로부터 수집했다. 부착 세포를 비-부착 분획에 가하고, 2회 세척하여 약 1ml의 HBSS/헤페스중에 현탁시켰다. 예비 자극시킨 5x106세포로부터 수득한 전체 세포를 신체 전체에 치사 조사(700+ 400cGy,137Cs-공급원)시킨 3마리의 마우스 수용체의 꼬리 정맥내로 주사했다[참조: Luskey, B. D., M. Rosenblatt, K. Zsebo, and D. A. Williams, Blood, Vol. 80, pp 396-402(1992)]. 조혈모세포의 형질도입은 도입된 사람 ADA cDNA의 발현에 대해 재구성된 마우스를 실험하여 분석했다. 이 ADA 동위 효소 분석은 셀룰로오즈 아세테이트 원위치 효소 분석에 의해 hADA 단백질의 존재에 대해 말초 혈액 세포를 검사함으로써 이식된 마우스내에서 수행했다[참조: Lim, B., D. A.Williams, and S. H. Orkin, Mol. Cell. Biol., Vol. 7, pp 3459-3465(1987)]. 검사는 이식후 4개월 경과하여 개시하고, 매월 반복했다.
7.2. 결과
유전공학적으로 조작한 조혈모세포를 사용한 마우스의 장기간 골수 재구성은 일반적으로 이식후 4개월 경과한 후 모세포 형질도입 효율을 측정하기에 적합한 것으로 인정된다. 7개월 후 수용체의 형질도입된 골수에 대한 동위효소 분석은 1) 동시배양 또는 FN 30/35상의 상등물 감염을 사용하면 사람 ADA cDNA 발현이 나타났지만, FN 30/35 없이 상등물을 감염시킨 후에는 이식된 그룹에서 ADA cDNA발현이 일어나지 않았으며, 2) 발현 수준은 동시배양 및 FN 30/35 그룹에 대해 비슷하게 나타났다. 도 4의 레인 2 내지 4에 나타난 바와 같이, EPHA-5 세포상에서의 동시 배양에 의해 형질도입된 골수를 사용하여 이식시킨 마우스 3마리는 용이하게 검출가능한 사람 ADA를 생산하는 것으로 입증되었다. 유사한 수준의 사람 ADA는 FN 30/35의 상등물 감염에 의해 형질도입된 조혈세포를 사용하여 이식시킨 마우스 3마리에서 검출되었다(도 4, 레인 5 내지 7). 대조적으로, BSA상의 상등물 감염에 의해 형질도입된 조혈세포를 사용하여 이식시킨 마우스 3마리에서는 어떠한 사람 ADA도 검출되지 않았다(도 4, 레인 8 내지 10). 사람 ADA에 대한 위치 대조군은 도 4의 레인 1 및 12에 나타나 있고, 도 4의 레인 11에는 쥐 ADA에 대한 위치 대조군이 나타나 있다 레인 2 내지 10에서의 쥐 밴드는 동일량의 단백질이 로딩되었음을 나타낸다. 이들 데이터는 FN 30/35상의 상등물 감염에 의한 장기간 재구성되는 조혈모세포의 형질도입이 동시배양과 동등하고 FN 30/35을 사용하지 않은 상등물 감염에 비해 훨씬 우수함을 증명한다.
실시예 8
FN 30/35에 결합하는 레트로바이러스 벡터에 의한 향상된 형질도입의 기작
8.1. 실험
형질도입의 증가가 바이러스 및 조혈세포의 동시-집적에 의한 것인지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 재조합 레트로바이러스 입자가 FN 30/35에 결합하는지를 분석하였다. 따라서, TKNeo 바이러스를 포함하는 상등물과 함께 FN 30/35-피복된 플레이트를 30분 동안 예비 배양하고, 이어서 완전히 세척했다. 상등물의 바이러스 역가는 표준 공정[참조: Markowitz, D., S. Goff, and A. Bank, J. Virol., Vol 62, pp 1120-1124(1988)]에 따라 NIH/3T3 세포를 사용하여 측정했다. 요약하면, 3T3 세포를 6-웰 조직배양 플레이트에 1000 세포/웰의 농도로 플레이팅하여 밤새 증식시켰다. 바이러스 상등물의 일련의 회석액을 7.5㎍/ml 폴리브렌과 함께 각각의 웰에 가하고, 2.5시간 동안 37℃에서 배양한 후, 배지 2ml를 가했다. 24시간 후, 배지를 G418(0.75mg/ml, 무수 분말, Gibco)을 함유하는 배지로 대체하고, 상기 플레이트를 10 내지 12일 동안 배양했다. 10 내지 12일 후 G418-내성 콜로니(G418r)를 염색하고 계수했다. 바이러스 상등물의 희석에 의해 증가된 콜로니의 수/웰을 상등물의 감염 입자(cfu)/ml로서 사용했다. 본 발명자들은 바이러스 상등물로 예비배양하고 35mm 세균성 디쉬 세포 당 1000 NIH/3T3 + 폴리브렌을 가하여 강력하게 세척한 후에 FN 30/35-피복되거나 BSA-피복된 35mm 플레이트 상에 잔류하는 레트로바이러스 입자의 양을 평가/적정했다. 24시간 경과하여, 배양물에 0.75mg/ml G418(무수 분말)을 포함하는 배지를 공급하고, 세포를 10 내지 12일 동안 추가로 배양했다. 당해 배양에 이어서, G418-내성 NIH/3T3 콜로니를 계수하여 부착 바이러스의 존재를 정량화했다.
FN 30/35에 대한 바이러스의 결합이 용량-의존적 방식으로 발생하는지를 평가하기 위해, 디쉬를 피복시키는 FN 30/35의 농도를 증가시키면서 상기 실험을 반복했다. 따라서, 35mm 세균성 디쉬를 상술된 바와 같이 1, 4, 10 및 20㎍/cm2FN 30/35로 피복시켰다. 1x104감염 입자/ml로 미리 적정한 TKNeo 바이러스 스톡의 1:50 희석물을 30분 동안 FN 30/35-피복된 플레이트상에서 배양했다. 완전히 세척한 다음, 각각의 웰에 2000 NIH/3T3 세포를 가했다. 선별은 상기한 바와 같이 수행하고, 선별후 10일 경과하여 G418-내성 NIH/3T3 콜로니를 계수했다.
8,2. 결과
도 5는 3개의 대표적인 실험 가운데 하나의 결과를 나타낸다. TKNeo 상등물을 사용한 경우, NIH/3T3 세포중의 G418r콜로니에 의해 측정된 레트로바이러스 역가는 BSA-피복된 플레이트와 비교하여 3 로그 이상(4x103내지 0) 감소한 반면에, 30/35 FN으로 피복시킨 플레이트의 경우 역가 감소는 단지 1 로그이었다. 이들 데이터는 레트로바이러스가 FN 30/35에 정량적으로 결합하지만, BSA로 피복시킨 디쉬(대조군 디쉬)에는 결합하지 않음을 증명한다. 도 6은 바이러스-함유 상등물을FN 30/35의 농도를 증가시켜 피복시킨 플레이트상에서 배양하는 경우에 G418-내성 콜로니의 수가 증가됨을 나타낸다. 따라서, FN 30/35에 대한 바이러스의 결합은 용량-의존적 방식으로 발생한다.
실시예 9
재조합 피브로넥틴 단편에 대한 바이러스 결합
9.1 실험
키미주카(Kimizuka) 등은 이. 콜라이에서 클로닝된 FN DNA 서열의 발현을 이미 보고한 바 있다[참조: Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, D. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, and K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, pp 284-291(1991)]. 클로닝된 키메라 펩타이드는 세포 부착에 관여하는 것으로 알려진 피브로넥틴중의 몇몇 중요한 서열(RGDS, CS-1 및 헤파린 결합 부위를 포함)의 조합 또는 어느 하나를 포함한다[참조: 도 7]. 레트로바이러스가 이들 재조합 FN 단편에 결합할 수 있는지를 분석하기 위해, 재조합 단편 C-274, H-271, H-296, CH-271, CH-296 및 C-CS1으로 피복시킨 플레이트 및 양성 대조군으로서 FN 30/35로 피복시킨 플레이트상에서 1x104감염 입자/ml인 동결 레트로바이러스 TKNeo 스톡의 2개의 다른 희석물(1:10 및 1:100)을 사용하여 3T3 세포 콜로니 형성 검정을 반복했다. FN 단편은 120 내지 130 pmol/cm2의 농도로 사용되었다[C-274, H-271, H-296, C-CS1, FN 30/35의 경우 4㎍/cm2에 상응하고, CH-271 및 CH-296의 경우8㎍/cm2에 상응한다]. 요약하면, 플레이트를 피복시키고, 바이러스를 가하고 플레이트를 완전히 세척하고, NIH/3T3 세포를 24시간 동안 가한 다음, 선별 배지에서 10일 동안 증식시키고, 이어서 콜로니를 염색하여 계수했다.
9.2. 결과
도 8은 G418-내성 콜로니(및 따라서 바이러스 부착)의 수가 단편 H-271, H-296, CH-271 및 CH-296에서 증가되었음을 입증한다. 게다가, 당해 작업에 있어서 CH-271 단편이 최고 수준의 바이러스 결합을 나타냈긴 하지만, 결합된 바이러스의 양은 이들 재조합 단편과 FN 30/35 사이에 대략 유사함을 나타낸다. 이들 모든 5개 FN 단편에서의 공통점은 반복 서열 13[참조: Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, K. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, and K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, pp 284-291(1991)]에 위치한 고 친화성 헤파린-결합 부위[참조: Ruoslahti, E., Ann., Rev. Biochem., Vol. 57, pp 375-413(1988) and Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, K. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, and K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, pp 284-291(1991)]를 포함하는 제Ⅲ형 반복서열 12 내지 14이다. 이것은 바이러스 결합이 당해 공지된 부착 부위에 의해 발생함을 시사한다. 이것은 헤파린-결합 부위에 대한 세포 결합을 억제하는 것으로 알려진 크게 하전된 분자인 헤파린 설페이트의 농도(10 내지 1000㎍/ml)를 증가시키면서 4㎍/cm2CH-271로 피복시킨 디쉬를 예비배양함으로써 입증되었다. 도 9에 도시된 바와 같이, G418-내성 콜로니의 수는 헤파린설페이트의 농도를 증가시키면서 CH-271을 예비배양함에 따라 감소된다. 상기 데이터는 FH에 대한 바이러스 결합이 FN의 카복실-말단 도메인의 CS-1 부위에 매우 가까이 위치한 고 친화성 헤파린-결합 부위를 통해 매개됨을 시사한다.
실시예 10
재조합 피브로넥틴 단편상에서의 조혈세포의 형질도입
10.1. 실험
또한, FN 30/35상에서의 상술된 조혈세포의 형질도입 증가가 재조합 FN 단편으로도 관찰될 수 있는지를 분석하기 위해, 본 발명자들은 고 증식성 잠재 콜로니 형성 세포(HPP-CFC) 검정을 사용하여 시험관내에서 상등물 감염의 형질도입 효율을 평가하였다. EAL2a 벡터를 사용함으로써, 본 발명자들은 유전자 전이의 지표로서 G418-내성 콜로니의 성장을 이용하여 BSA상의 여러가지 재조합 FN 단편 대 FN 30/35 상등물 감염이 조혈세포의 형질도입에 미치는 영향을 비교했다. 게다가, 본 발명자들은 FN 단편에 이미 부착시킨 바이러스 입자(상등물 바이러스와 대비하여)의 조혈세포를 형질도입시키는 능력을 비교했다. 예비자극된 0.5 내지 1x106의 골수 세포를 상기 기술된 바와 같이 성장 인자 및 5㎍/ml 폴리브렌과 함께 상등물을 함유하는 EAL2a 바이러스 1 내지 2ml중 35mm FN-피복된 페트리 디쉬상에서 배양했다. FN 단편에 결합된 바이러스에 의한 조혈세포의 형질도입을 평가하기 위해, 바이러스 함유 상등물과 함께 배양시킨 35mm FN-피복된 디쉬를 각각 2ml PBS를 사용하여 3회 세척했다. 이어서, 성장 인자 및 폴리브렌이 보충된 배지 2ml에 0.5 내지 1x106의 예비자극시킨 골수 세포를 가했다. 22시간 후, 세포를 수집하여 HPP-CFC검정에서 문헌[참조: Bradley, T. R. and D. Metcalf, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., Vol. 44, pp 287-293(1996)]에 기술된 바와 같이 1.5mg/ml G418의 존재 또는 부재하에 플레이팅했다. 배양물을 14일 동안 7% CO2중에서 33℃로 배양하고, 유전자 전이 효율을 G418 내성 콜로니의 백분율로서 계산했다.
10.2. 결과
상등물 감염에 의한 원시 조혈세포의 형질도입(도 10)은 헤파린 결합 부위(HBS) 및 하나 이상의 활성 세포 부착 부위를 포함하는 모든 단편의 경우 BSA상의 상등물 감염보다 현저히 높았다(흑색 막대). 재조합 단편 CH-271, H-296, CH-296 및 C-CS1의 형질감염 효율은 FN 30/35의 효과와 유사했는데, 이들 모든 3개의 단편은 헤파린-결합 부위 및 CS-1 부위 둘다를 포함한다. 다른 모든 경우에, 형질도입은 현저하게 감소되었다. 이들 데이터는 FN 30/35에서 이미 밝혀진 원시 조혈세포의 형질도입 증가가 재조합 FN 단편의 경우에서도 반복될 수 있음을 입증한다. 또한, 피브로넥틴에 직접 결합한 바이러스가 조혈세포를 유전적으로 형질도입시킬 수 있음을 입증한다. 결국, 이것은 원시 조혈 전구(간)세포의 형질도입을 위한 CS-1 부위 및 헤파린 결합 부위 모두의 존재 효능을 확인시킨다.
실시예 11
재조합 피브로넥틴 단편상의 쥐 공여체 세포의 형질도입을 이용한 마우스의 장기간 골수 재구성
11.1. 실험
본 발명자들은 원시 조혈 전구세포에 대한 상기 시험관내 연구(실시예 10으로부터)를 반복하여 골수 이식을 이용하여 BSA 대 FN 30/35 대 재조합 FN 단편 대 동시배양에 대한 상등물 감염을 비교하고 재구성된 조혈모세포에 대한 효과를 분석했다. 요약하면, 치명적으로 조사된 마우스에게 사람 ADA cDNA를 포함하는 EPHA-5 벡터로 형질도입시킨 공여체 세포를 주입했다. 1개월 경과한 후, ADA 동위효소 검정으로 말초 혈액으로부터 유전자 전이 효율을 분석했다.
11.2. 결과
도 11은 헤파린 결합 부위 및 CS-1 모두를 포함하는 피브로넥틴 단편 H-296이 FN 30/35 및 동시배양물과 유사한 결과를 나타냄을 보여준다. 이들 부위 모두를 포함하지 않는 단편은 이식 가능한 조혈세포를 형질도입시키는데 있어서 덜 효과적이다. 이들 데이터는 CS-1 및 헤파린 결합 부위 모두를 포함하는 재조합 FN 단편에 결합한 원시 조혈/줄기세포 및 레트로바이러스의 동시-집적이 이식 가능한 조혈세포를 효과적으로 형질도입시킴을 증명한다.
본 발명을 상기 설명에서 예시하고 상세히 기술하였을지라도, 이것은 예시적인 것이지 특성상 제한적인 것이 아니며, 바람직한 양태만을 기술한 것이고 본 발명의 범주내에 포함되는 모든 변화 및 변형이 보호되어야 하는 것으로 이해된다.
본원에서 인용된 모든 간행물은 이들이 개별적으로 참조로서 혼입되고 충분히 기술되었을지라도 그들 전체로서 본원에 참조로서 도입된다.

Claims (3)

  1. 고정된 피브로넥틴, 피브로넥틴의 CS-1 세포-부착 도메인 및 헤파린-Ⅱ 결합 도메인을 함유하는 고정된 피브로넥틴 단편 또는 이들의 고정된 혼합물, 및 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터를 포함하는, 복제-결함 재조합 레트로바이러스 벡터에 의한 생존가능한 조혈세포의 형질도입 빈도를 증가시키기 위한 배양 배지.
  2. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드에 공유 결합된, 표적 세포에 대해 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는, 예정된 표적 세포내로의 레트로바이러스-매개된 유전자 전이를 증가시키기 위한 작제물.
    서열번호 1
  3. 제2항에 있어서, 리간드가, 세포 부착 단백질, 호르몬, 사이토킨, 모노클로날 항체, 탄수화물, 대사 산물 또는 피브로넥틴 이외의 단백질로부터의 폴리펩타이드인 작제물.
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AMND Amendment
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