JPH09510874A - ウイルス仲介ｄｎａ導入の増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 レトロウイルスによる造血細胞その他の細胞の形質導入効率を増大させる方法は、細胞をフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下で感染させることを含む。図面から分かるように、フィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは細胞、特にコミッティッド前駆細胞および未発達の造血幹細胞を含めた造血細胞へのレトロウイルス仲介による遺伝子導入を有意に増強させる。本発明は、増強された遺伝子導入を利用した体細胞遺伝子治療のための改良法、レトロウイルス仲介による細胞へのＤＮＡ導入を増強するための細胞集団および新規な構築体、ならびにそれらの使用をも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルス仲介ＤＮＡ導入の増強 発明の分野 本発明は一般にウイルスによる細胞の形質導入効率を高める方法、より詳細に はフィブロネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグメントを用いてウイ ルス仲介による細胞内への遺伝子導入を増強する方法に関するものである。 発明の背景 ヒトの疾病の多くについて分子基準での理解が進み、かつ遺伝子導入技術が向 上したことにより、最近では重篤な遺伝病に対して体細胞遺伝子療法のためのプ ロトコールの開発が試みられるようになった。現在、ヒトの遺伝子療法にとって 有望な候補である疾病には、酵素または他のタンパク質が欠損または欠如してい るものであって、酵素または他のタンパク質の水準を厳密に調節する必要のない 場合、特にそれらが構成的に調節されているもの、および患者の骨髄に見られる 欠損が含まれる。 たとえば遺伝子療法の候補である疾病の１つは、重篤な複合型免疫不全病（Ｓ ＣＩＤ）をもたらすアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症である。ＡＤＡ欠 損患者は骨髄中に検出しうる酵素をほとんど、または全く含まない。しかしＡＤ Ａ欠損症は適合骨髄移植によって治癒している。ＡＤＡ正常細胞はＡＤＡ欠損細 胞より選択的利点をもち、患者の骨髄を正常にリポピュレート（ｒｅｐｏｐｕｌ ａｔｅ）するであろう。 骨髄組織はインビトロで容易に取り扱うことができ、かつリポピュレートする 細胞を含むので、骨髄細胞は体細胞遺伝子療法の良好な標的である。あるいはヒ トの臍帯血が未発達の前駆細胞を多数含有することもこれまでに証明されている 。長期的にリポピュレートする細胞である造血幹細胞中への遺伝子導入に成功す れば、これらの細胞の子孫において顕性となる多様な疾病を生涯にわたって治癒 することができる。 リポピュレートする幹細胞中への遺伝子導入およびそこでの長期的な遺伝子発 現が、ネズミモデルにおいて多数の研究者により達成された。しかしより大型の 動物、たとえばイヌおよび霊長類におけるインビボ実験の成功は限定されている 。 これは未発達の造血幹細胞の感染効率が低いことが大きな原因である。現在の遺 伝子導入技術の制限は、ヒトのプロトコールに適用した場合、幾つかの要因によ ってさらに複雑になる。これらの要因には成人骨髄（ＡＢＭ）中に存在する幹細 胞数が少ないこと、これらの細胞を精製する適切な方法がないこと、および細胞 周期においてこのような未発達細胞の部分が少ないことが含まれる。 骨髄細胞に関するネズミおよび大型動物双方の実験において、成功例のプロト コールは大部分が標的細胞とレトロウイルス産生細胞系の同時培養を採用してい ることが指摘された。同様に、ＦＤＡが承認したヒトの遺伝子導入の試みは大部 分が遺伝子導入のために組換えレトロウイルスベクターに依存している。組換え レトロウイルスベクターは外因性ＤＮＡを細胞内ＤＮＡ中へ効果的に導入し、正 確かつ安定に組み込むので、遺伝子療法にとって望ましい。これらのベクターは 遺伝子導入のための外因性ＤＮＡを含有し、ウイルス病原性を排除するためにさ らに修飾される。これらの修飾がなされているため、ウイルスの産生は一般にレ トロウイルスパッケージング細胞を用いて行われる。しかし臨床遺伝子療法には 、生物学的安全性および品質管理の懸念から無細胞形質導入の方が望ましい。残 念ながら造血細胞、たとえば幹細胞への効果的な遺伝子導入はウイルス産生細胞 との同時培養なしには一般に不可能であった。 最近、感染に際して標的細胞を間質細胞に暴露することにより遺伝子導入効率 を高めうることが示された。間質細胞は造血ミクロエンバイロンメント（ＨＭ） の主成分である。ＨＭはマクロファージ、間質細胞、内皮細胞、脂肪細胞、およ び多様な特定の付着分子から構成される複雑な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の 統制された網状構造からなる。ＥＣＭ分子、たとえばラミニン、コラーゲン、ト ロンボスポンジン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよびフィブロネ クチンが、造血細胞と成長因子の双方に対する足場部位を提供する。間質細胞が レトロウイルス感染に及ぼすこの促進作用の基礎となるメカニズムは不明である が、造血細胞の増殖および分化の生理学的調節はこれらの細胞がＨＭの細胞と直 接に接触した際に起こることが最近知られた。 長期的にリポピュレートする造血幹細胞および他の細胞への効果的な遺伝子導 入には依然として問題が多く、このことが現在では遺伝子導入プロトコールを造 血および他の疾病の治癒的療法に広範に適用するのを妨げている。従来法がもつ 危険性および制限なしに遺伝物質を哺乳動物細胞に効果的に導入する方法が依然 として求められている。本発明はこれらの要求に応えるものである。 発明の概要 すなわち本発明の好ましい１態様は、レトロウイルスベクターによる造血細胞 の形質導入頻度を増大させる方法を提供する。この方法には、生存可能な造血細 胞に複製欠損性組換えレトロウイルスベクターを、レトロウイルスによる細胞形 質導入を増大させるのに有効な実質的に純粋なフィブロネクチンおよび／または フィブロネクチンフラグメントの存在下で感染させることが含まれる。フィブロ ネクチンおよび／またはフィブロネクチンフラグメントは天然物質に由来するも のであってもよく、または合成によるもの（たとえば組換え法により遺伝子工学 的に合成されたもの、または化学的合成法によるもの）、もしくは天然物質と合 成物質の組合わせに由来するものであってもよい。さらに本発明に用いられるフ ィブロネクチンポリペプチド（１または２以上）には、天然フィブロネクチンア ミノ酸配列に対する突然変異体であって、それにもかかわらず本発明による形質 導入の増大を達成するのに必要な付着性を備えたものが含まれることは理解され るであろう。 本発明の他の好ましい態様は、生存可能な造血細胞に外因性ＤＮＡを保有する 複製欠損性組換えレトロウイルスを、レトロウイルスによる細胞形質導入頻度の 増大に有効な量の固定化されたフィブロネクチン、固定化されたフィブロネクチ ンフラグメント、またはその固定化された混合物の存在下で感染させることを含 む、形質導入された造血細胞の調製方法を提供する。 本発明の他の好ましい態様は、改良された細胞移植法を提供する。本方法には 、ドナー動物から生存可能な造血細胞を採取し；これらの造血細胞に組換えレト ロウイルスベクターを感染させて、形質導入された生存可能な造血細胞を調製し 、その際感染は固定化された形の、かつ形質導入頻度を増大させるのに有効なフ ィブロネクチンおよび／またはそのフラグメントの存在下で行われ；そして形質 導入された生存可能な造血細胞を細胞移植体としてレシピエント動物に導入する 工程が含まれる。好ましい１態様においては、感染細胞を自己ドナー(ａｕｔｏ ｌ ｏｇｏｕｓ ｄｏｎｏｒ)に導入することができる。 本発明の他の好ましい態様は、細胞移植法に適した形質導入された臍帯血細胞 を得る方法を提供する。本方法には、臍帯血由来の造血細胞に複製欠損性組換え レトロウイルスベクターを、レトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入 頻度を増大させるのに有効な固定化された量のフィブロネクチンおよび／または そのフラグメントの存在下で感染させることが含まれる。本発明は、その方法で 得られた、臍帯血細胞由来の生存可能な形質導入細胞集団、およびそれらの形質 導入細胞集団を動物に細胞移植体として導入することをも包含する。 以上に述べた本発明の態様のより具体的な観点によれば、使用されるフィブロ ネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは、フィブロネクチンのヘパリン −ＩＩ結合性ドメインがもつレトロウイルス結合活性を与える第１アミノ酸配列 、およびフィブロネクチンのＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与える第２ アミノ酸配列を含むであろう。フィブロネクチンのこれら２結合ドメインを合わ せて使用することにより、レトロウイルスによる標的細胞の形質導入効率が著し く増大することが証明された。 本発明の他の好ましい態様は、レトロウイルスベクターによる予め定めた標的 細胞の形質導入頻度を増大させる構築体の製造方法を提供する。本方法には、標 的細胞に結合するリガンドを、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメイ ンがもつレトロウイルス結合活性を与えるアミノ酸配列を含むポリペプチドに共 有結合させる工程が含まれる。本発明は、これらの構築体をレトロウイルスベク ターによる予め定めた標的細胞の形質導入頻度を増大させるために使用する方法 、および形質導入細胞を用いる移植法をも包含する。 本発明の他の好ましい態様は、ウイルスを含有する培地を、一定量のウイルス の局在化に有効な固定化された量のフィブロネクチン、またはヘパリン−ＩＩ結 合性ドメインがもつウイルス結合活性を含むフィブロネクチンフラグメントの存 在下でインキュベートすることを含む、一定量のウイルスを局在化する方法を提 供する。 本発明のさらに他の好ましい態様は一般に、実質的に純粋な、および／または 固定化されたフィブロネクチンまたはそのフラグメントを含有する形質導入され た生存可能な造血細胞および他の細胞の培養物、ならびに細胞内へのレトロウイ ルス仲介によるＤＮＡ導入を実施するためのキットを提供する。 本発明の目的は、哺乳動物細胞の効果的なレトロウイルス感染方法を提供する ことである。 本発明の他の目的は、同時培養の必要がない、レトロウイルスベクターによる 遺伝子導入方法を提供することである。 本発明の他の目的は、自己および／または同種間細胞移植のための方法および 細胞培養物を提供することである。 本発明のこれらおよび他の目的、利点および特色は、以下の記載から当業者に 自明であろう。 図面の説明 図１は、キモトリプチックフラグメントを含むフィブロネクチン分子の模式図 である。 図２は、フィブロネクチンフラグメントの存在下でＴＫＮＥＯベクターを用い たコミッティッド（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）ヒト前駆細胞の感染効率を示す；後記 実施例１に詳細に記載する。 図３は、フィブロネクチンまたはそのフラグメントの存在下でＴＫＮＥＯベク ターを用いた種々のコミッティッドヒト造血前駆細胞の感染効率を示す；後記実 施例１に詳細に記載する。 図４は、下記の方法で形質導入された骨髄細胞を移植したマウスにおけるｈＡ ＤＡの存在を比較する：（１）同時培養法（２−４列）、（ｉｉ）固定化フィブ ロネクチンフラグメントの存在下での上清感染（５−７列）、およびＢＳＡ上で の上清感染（８−１０列）；後記実施例７に詳細に記載する。ｈＡＤＡに関する 対照を１および１２列に、ネズミＡＤＡに関する対照を１１列に示す。 図５は、フィブロネクチンフラグメントに対するレトロウイルスの結合を示す ；後記実施例８に詳細に記載する。 図６は、フィブロネクチンフラグメントに対するレトロウイルスの結合が用量 依存性であることを示す；後記実施例８に詳細に記載する。 図７は、後記実施例９−１１で用いた種々の組換えフィブロネクチンフラグメ ントを示す模式図である。 図８は、種々の組換えフィブロネクチンフラグメント（幾つかの組換えフラグ メントを含む）へのレトロウイルスの結合を示す；後記実施例９に記載する。 図９は、ヘパリンがフィブロネクチンフラグメントへのレトロウイルスの結合 を遮断することを示す；後記実施例９に記載する。 図１０は、種々の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下でのネズミ造 血細胞のレトロウイルス感染効率を示す；後記実施例１０に詳細に報告する。 図１１は、下記の方法で形質導入された骨髄細胞を移植したマウスにおけるｈ ＡＤＡの存在を比較する：（ｉ）同時培養法、（ｉｉ）種々のフィブロネクチン フラグメント上での上清感染、および（ｉｉｉ）ＢＳＡ上での上清感染；後記実 施例１１に記載する。 好ましい態様の説明 本発明の原理を理解しやすくするために本発明の特定の態様を参照し、具体的 な語を用いてそれを説明する。ただしこれは本発明の範囲の限定を意図するもの でないことは理解されるであろう。本明細書に示すような本発明の原理の変更、 さらに修正および適用は本発明に関連する技術分野の専門家が普通に行うものと 解される。 前記のように、本発明はウイルス、たとえばレトロウイルスによる生存可能な 細胞の形質導入頻度を増大させる方法を提供する。本発明は、組換えレトロウイ ルスベクターを用いた生存可能な細胞中への効果的な遺伝子導入法、形質導入細 胞を得る方法、ならびに自己および他の細胞移植を達成するための方法および材 料をも提供する。 本発明の１特色は、フィブロネクチン（ＦＮ）、およびＦＮのＣＳ−１細胞付 着ドメインを含むフィブロネクチンフラグメントが、フィブロネクチン受容体を 保有することによりフィブロネクチンまたはそのフラグメントへの結合能を示す 細胞、たとえば造血細胞、たとえばコミッティッド前駆細胞および未発達の造血 幹細胞または長期培養−開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）中へのレトロウイルス仲介に よる遺伝子導入を有意に増強するという知見である。有利には、この増大した効 率によりウイルス産生細胞との同時培養が不必要になる。本発明の他の特色は、 フィブロネクチンのウイルス結合性ドメインがヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン内 にあるという知見を利用する。このウイルス結合性ドメインは、たとえばウイル スを標的細胞へ運搬するための広範な構築体を含めた多くの用途において、ウイ ルス粒子を局在化するために使用しうる。 本発明の特定の好ましい観点による組換えウイルスベクターは、外因性ＤＮＡ を含有し、非病原性、すなわち複製欠損性である。これらのベクターは外因性Ｄ ＮＡを宿主細胞、たとえば動物細胞、特に哺乳動物細胞の細胞ＤＮＡ中へ効果的 に導入し、正確かつ安定に組み込む。たとえば本発明においては目的とする遺伝 子のコード配列に由来する一連の塩基を含むヌクレオチド配列を、遺伝子を駆動 するための適切なプロモーター、一般に外因性プロモーターの制御下に、組換え レトロウイルスベクター中へ取り込ませることができる。これに関して外因性Ｄ ＮＡは天然または合成により産生されたＤＮＡを含むことができ、かつ異種供給 源に由来する部分であってもよく、それらの部分は天然分子または化学合成され た分子のいずれであってもよく、かつそれらの部分はライゲーションまたは当技 術分野で既知の他の手段で結合される。前記のように、導入されたヌクレオチド 配列はプロモーターの制御下にあり、したがって一般にプロモーターの下流にあ る。言い換えると、プロモーター配列は一般にコード配列の上流（すなわち５′ 末端）にある。その際、プロモーターと協同作用する他の調節要素（たとえばエ ンハンサー配列）、および外因性コード配列の転写を行う転写開始コドンが存在 してもよく、存在しなくてもよいことは周知である。“の制御下にある”という 字句は、導入された遺伝子の転写を行うためにこのような他の要素が必要である ことを表す。同様に組換えＤＮＡは好ましくは、導入されたコード配列の下流に 終止配列を含む。 選択マーカーまたは他の選択性利点を与える外因性ＤＮＡを含むレトロウイル スを使用しうる。たとえばベクターは、抗生物質、たとえばネオマイシンを含め た種々の選択試薬に対する耐性を与える１または２以上の外因性遺伝子を含むこ とができる。本発明に使用しうる代表的ベクターには、たとえば下記のものが含 まれる：Ｎ２／ＺｉｐＴＫＮＥＯベクター（ＴＫＮＥＯ）（力価：ＮＩＨ ３Ｔ ３細胞上で１×１０⁵ Ｇ４１８^r ｃｆｕ／ｍｌ）、ＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベ クター、およびＺｉｐＰＧＫ−ｍＡＤＡベクター、これらはすべてＭｏｒｉｔｚ ら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：５２９により報告されている。Ｔ ＫＮＥＯベクターにおいては、ｎｅｏホスホトランスフェラーゼ配列が単純ヘル ペスチミジンキナーゼプロモーターによりセンス配向で（５′側ロングターミナ ルリピート−ＬＴＲに対して）発現する。このベクターは、形質導入された細胞 の同定を容易にするためのネオマイシン耐性を与える選択マーカー遺伝子を含む 。ＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベクターにおいては、ヒトＡＤＡ（“ｈＡＤＡ”）が ヒトホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターにより５′ＬＴＲに対 してセンス配向で発現する。それは発現しうる遺伝子配列１個のみを含み、優性 選択マーカーを欠如する。ＺｉｐＰＧＫ−ｍＡＤＡ（ＰＧＫ−ｍＡＤＡ）ベクタ ーはヒトＡＤＡ ｃＤＮＡがネズミＡＤＡ（“ｍＡＤＡ”）ＤＮＡで置換された 点以外はＺｉｐＰＧＫ−ｈＡＤＡベクターと等しい。これらおよび他のウイルス ベクターならびにそれらの調製法は周知であり、それらの実施および本発明にお ける使用は本明細書の記載から当業者が容易になしうるものである。 本発明に用いられるウイルスベクターは、ヒトフィブロネクチンを含めたフィ ブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配列への結合能を示す 。本発明はいずれかの理論によって限定されるものではないが、後記の節に述べ るように、ウイルスおよび標的細胞がそれぞれの官能性ドメインに結合すること によりウイルスおよび細胞が同時局在（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）する ことによって、ウイルスによる細胞の形質導入が促進されると考えられる。これ に関してウイルスがヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配列に結合し、し たがって本発明において効果的に作用する効力は、ルーティン方法、たとえば後 記実施例８および９に記載された方法で容易に確認しうる。一般にこれらのアッ セイ法は、ヘパリン−ＩＩ結合性ドメインを含む固定化されたポリペプチドにウ イルス粒子が結合し、したがって固定化されたポリペプチドマトリックスからの 洗浄に耐える程度を測定するものである。以下に要約する：たとえばフィブロネ クチンヘパリン−ＩＩ結合性ドメインを含む固定化されたポリペプチドを収容し たウェル内でウイルスを含有する上清をインキュベートすることができる。次い でウェルを生理食塩緩衝液で徹底的に洗浄したのち、ウイルスに対する標的細胞 を ウェル内でインキュベートして、ウェル内に残存する感染活性の水準を測定する 。初期ウイルス上清と比較した感染活性、すなわち力価の低下を評価し、同様な 対照試験（たとえばＢＳＡコーティングしたウェルの使用）のものと比較する。 対照ウェルと比較してヘパリン−ＩＩ結合性ドメイン含有ウェル内に残存する力 価の方が有意に高いことは、被験ウイルスが本発明の観点に使用するのに適して いることを示す。このスクリーニング法を容易にするために、ウイルスベクター は前記のように選択マーカーを含んでもよい。 本発明に使用するフィブロネクチンのフラグメントは天然または合成のいずれ に由来するものであってもよく、天然材料からたとえば先にＲｕｏｓｌａｈｔｉ ら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７２７７；Ｐａｔｅｌおよび Ｌｏｄｉｓｈ（１９８６）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：４４９；ならびに Ｂｅｒｎａｒｄｉら（１９８７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：４８９が記 載したように、実質的に純粋に調製することができる。これに関して本明細書中 で、実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとい う場合、フィブロネクチンが天然にそれらと共に存在する他のタンパク質を本質 的に含有しないことを意味するものとする。本発明に使用する実質的に純粋なフ ィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは組換えにより、たとえば 米国特許第５，１９８，４２３号明細書（１９９３年３月３０日にタグチらに交 付され、京都の宝酒造株式会社に譲渡された）に一般的に記載された方法に従っ て製造することもできる。特に後記実施例においてＨ−２７１、Ｈ−２９６、Ｃ Ｈ−２７１、ＣＨ−２９６およびＣ−ＣＳ１と定める組換えフラグメントならび にそれらを得る方法が、この第５，１９８，４２３号明細書に詳述されている。 後記実施例で用いたＣ２７４フラグメントは米国特許第５，１０２，９８８号明 細書の記載に従って得られた。これらのフラグメントまたはそれらをルーティン に誘導しうるフラグメントは、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１０７２１（Ｈ−２９６）、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７９９（メチオニンにより Ｈ−２７１に結合したＣ−２７７）、ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００（メチオニンに よりＨ−２９６に結合したＣ−２７７）、およびＦＥＲＭ ＢＰ−２２６４（Ｈ −２７１）として寄託された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を同様に米国特許第５，１ ９ ８，４２３号明細書に記載された方法に従って培養することにより得られる。さ らに、本発明に使用しうるフィブロネクチンに関して、またはそれらのフラグメ ントの出発原料に関して有用な情報が下記に見られる：Ｋｉｍｉｚｕｋａら，Ｊ ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，２８４−２９１（１９９１）、これは前記の組換え フラグメントにつきさらに報告する；ＥＭＢＯ Ｊ．，４，１７５５−１７５９ （１９８５）、これはヒトフィブロネクチン遺伝子の構造につき報告する；Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５，４９３６−４９４１（１９８６）、これはヒトフ ィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインにつき報告する。ＣＳ−１細胞 付着ドメインおよびヘパリン−ＩＩ結合性ドメインの両方を含むフィブロネクチ ンフラグメント、たとえば約３０または３５ｋｄフラグメント（３０／３５ＦＮ ）および後記実施例に報告する種々の組換えフラグメントに含まれるものが造血 細胞中への遺伝子導入効率を著しく増大させることがこれまでの研究で認められ 、本発明に使用するのに好ましい。したがっておおまかに言うと、本発明に使用 されるフィブロネクチン関連ポリペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ−１細胞 付着ドメインがもつ細胞結合活性、およびウイルスを結合する、フィブロネクチ ンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメインのアミノ酸配列を提供する。必要な細胞結合 活性およびウイルス結合活性が両方とも、これらの官能性フィブロネクチンドメ インの天然アミノ酸配列により、ならびに天然配列とは異なるがなお細胞結合活 性およびウイルス結合活性を示すのに十分なほど類似するアミノ酸配列により提 供されることは、当業者には自明であろう。これらの類似アミノ酸配列はそれら に対応する天然アミノ酸配列に実質的に相同な配列を示し、アミノ酸が欠失、置 換および／または修飾されたにもかかわらず目的とする細胞結合性またはウイル ス結合性を備えたアミノ酸配列を提供するものを包含しうる。 これに関して、関連のバイオテクノロジー技術分野は対象となる官能ドメイン においてアミノ酸の欠失、置換、付加または他の修飾をルーティンに実施しうる 状態にまで進歩している。得られたアミノ酸配列を、次いで目的とする細胞結合 活性およびウイルス結合活性につきルーティンにスクリーニングすることができ る。たとえばフィブロネクチンの突然変異形または修飾形のヘパリン−ＩＩ結合 性ドメインは一般的に先に述べたように、かつ実施例８および９に詳述するよう に、ウイルスのインキュベーション、洗浄、および対照と比較した感染性の保持 を測定するためのウイルス力価アッセイによりスクリーニングすることができる 。本明細書に示す教示を考慮すると、これらの結合アッセイは当業者にはルーテ ィン実験にすぎないであろう。 フィブロネクチンの修飾形もしくは突然変異形のＣＳ−１細胞付着ドメインへ の、または他の細胞結合性ポリペプチドへの細胞の結合も、同様に常法によりア ッセイしうる。たとえばそれらの方法にはＮａｔｕｒｅ ３５２：４３８−４４ １（１９９１）に記載されたものが含まれる。以下に要約する：細胞結合性ポリ ペプチドをプラスチック皿にコートし、アッセイすべき細胞集団を培地に入れて ３０分ないし２時間載せておく。このインキュベーション期間後に、タンパク質 に付着していない細胞を回収し、計数し、生存性につきアッセイする。ポリペプ チドに付着した細胞をトリプシンまたは細胞解離用緩衝液（たとえばギブコ）を 用いて同様に回収し、計数し、生存性につきアッセイする。場合により、たとえ ば造血コロニー形成細胞については、細胞をさらに１２−１４日間培養して、細 胞のコロニー形成性を確認する。次いで付着細胞の％を計算し、標準対照、たと えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コートしたプラスチック皿と比較する。アッ セイされるポリペプチドに標的細胞が実質的に結合した場合、そのポリペプチド ／細胞の組合わせが本発明に適しており、そのポリペプチドをフィブロネクチン からのレトロウイルス結合性フラグメントに結合させて、ウイルスベクターによ る標的細胞の感染を増強するための本発明構築体を製造しうることを示す。 本発明のより具体的な観点によれば、レトロウイルスベクターによる形質導入 を増強するために用いるウイルス結合性ポリペプチドは下記を含む：（ｉ）次式 （配列番号：１）で表される、ヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ド メインのＡｌａ¹⁶⁹⁰−Ｔｈｒ¹⁹⁶⁰に相当する第１アミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列； および（ｉｉ）次式（配列番号：２）で表される、ヒトフィブロネクチンのＩＩ ＩＣＳ結合性ドメインの一部（ＣＳ−１細胞結合性ドメイン）に相当する第２ア ミノ酸配列： あるいは造血細胞、たとえば未発達の前駆細胞および／または長期リポピュレー ションする（幹）細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列。 前記のように、得られるアミノ酸配列がウイルスの結合能（ヘパリン−ＩＩ結 合性ドメインの場合）および標的細胞の結合能（ＣＳ−１細胞結合性ドメイン） を示すのに十分なほど類似している限り、本発明の実施に際してこれらの天然配 列の一定の修飾および／または突然変異を行うのが可能であることは理解される であろう。 本発明の１観点は、インビトロ細胞療法、次いで宿主への標的細胞の移植（ｔ ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を伴う、体細胞遺伝子治療法を提供する。これ は宿主への形質導入された標的細胞の“移植（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）”とし ても知られている。造血細胞または他の細胞はヒトその他の哺乳動物源から標準 プロトコールにより採集することができる。たとえば造血細胞はヒトドナーの骨 髄もしくは末梢血から、またはヒト胎児臍帯血から採集することができる。採集 したのち、造血細胞を幹細胞および／または未発達の前駆細胞に富むものにする ために、所望によりそれらを標準法で処理することができる。次いで造血細胞を 適宜、たとえば組織培養プレート上でインキュベートしうる。所望によりこの期 間に付着陰性の低密度単核細胞をレトロウイルス感染前に予備刺激することがで きる。当技術分野で知られており、本発明に用いられる予備刺激とは、細胞をレ トロウイルス暴露する前に増殖刺激因子に暴露させることを意味する。このよう な予備刺激はレトロウイルスによる造血細胞の形質導入を向上させることが証明 された。 予備刺激ののち、細胞を収穫し、本明細書に記載するようにレトロウイルスに よる細胞形質導入頻度を増大させるフィブロネクチンまたはそのフラグメントと 共にインキュベートすることができる。好ましくは精製した、および／または不 溶性の、たとえば固定化したフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメ ントと共に細胞をインキュベートする。次いで細胞に組換えウイルス、たとえば 細胞における酵素または他のタンパク質の欠損または異常を適正化するための遺 伝子を含むレトロウイルスに、ウイルスによる細胞の形質導入頻度を増大させる のに有効な量のフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下 で感染させる。得られた形質導入された造血細胞を、次いで細胞移植体レシピエ ント動物、好ましくは自己ドナーに常法により、たとえば静脈内へ導入すること ができる。これには同種異系移植体も包含され、これは特に後記のように移植体 として臍帯血細胞を用いる場合に利用される。 本発明方法は、がん、白血病などを含めた骨髄障害、タンパク質の欠損または 異常を伴う障害を含む、多様な障害の遺伝子マーキングまたは遺伝子治療プロト コールに、および他の治療プロトコール、たとえば化学療法に対する抵抗性を改 善するために造血細胞を改質する治療に利用しうる。本発明を利用しうる代表的 障害には、たとえばＡＤＡ欠乏症、たとえばＡＤＡ欠乏性ＳＣＩＤ、小児急性骨 髄性白血病（ＡＭＬ）、神経芽細胞腫、ならびに成人ＡＭＬおよび急性リンパ性 白血病（ＡＬＬ）が含まれる。 本発明の特に好ましい１態様においては、細胞移植に用いられる細胞をヒト臍 帯血から得る。たとえばヒト臍帯血を採集し、たとえば付着陰性かつ低密度の単 核細胞集団を得ることにより、生存可能な未発達の造血前駆細胞および／または 幹細胞を富化することができる。次いでこの集団を所望により予備刺激し、レト ロウイルスベクター、ならびにベクターによる細胞の形質導入効率を増大させる ために、固定化したおよび／または精製したフィブロネクチンまたはフィブロネ クチンフラグメントの存在下でインキュベートする。これに関して、フィブロネ クチンは臍帯血中のＥＣＭの一部を構成せず、また臍帯血由来の未発達の前駆細 胞および／または幹細胞は骨髄由来の細胞と異なることが解明されているが、臍 帯血由来の未発達の前駆細胞および／または幹細胞の形質導入はフィブロネクチ ンまたはフィブロネクチンフラグメントの存在下で大幅に増強されることが見出 された。特に臍帯血幹細胞はＣＤ３４⁺、ＨＬＡ−ＤＲ⁺であることが解明され、 これに対し骨髄由来の幹細胞はＣＤ３４⁺、ＨＬＡ−ＤＲ^-であることが解明され ている。臍帯血由来の未発達の前駆細胞はフィブロネクチンまたはフィブロネク チンフラグメントの存在下で増強された様式で効果的に形質導入されるという本 発明者らの知見により、簡便な、かつ高度に幹細胞富化した造血細胞源の利用が 可能となる。さらに、未発達の前駆細胞および／または幹細胞を富化した同種異 系移植体を用いた多数の患者の移植に成功したという証拠により、臍帯血は極め て好ましい造血細胞源となる。Ｋｏｈｌｉ−Ｋｕｍｍｅｒら，Ｂｒｉｔ．Ｈｅａ ｅｍａｔｏｌ．８５：４１９−４２２（１９３３）；Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら，Ｂ ｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ １７：３１３−３２９（１９９１）；Ｇｌｕｃｋｍａｎら ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｅｍａｔｏｌ．４５：５５７（１９８０）；Ｈｅｉｄｅｌｂ ｅｒｇ：スプリンガー−フェルラーク，ｐｐ．６０−６８（１９８９）；Ｗａｇ ｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ ７９：１８７４−１８８１（１９９２）；およびＷａｇ ｎｅｒら，Ｂｌｏｏｄ ８２−８６ａ（抄録）を参照されたい。 所望により、収穫した形質導入された造血細胞その他の細胞を形質導入効率お よび遺伝子発現につき試験することができる。たとえば本発明により得られるレ トロウイルス仲介遺伝子導入における著しい改良は、後記の具体的な実施例にお いて証明される。実施例にはフィブロネクチンまたは有効なフィブロネクチンフ ラグメントの存在下でのレトロウイルスによる高い感染および遺伝子導入効率を 証明する幾つかの試験を記載する。特にＰＧＫ−ｈＡＤＡレトロウイルスに感染 したネズミ造血細胞は高水準の導入ＡＤＡ ｃＤＮＡを発現した。同様に個々の ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス感染したヒト前駆細胞コロニーは、内因性ヒトＡＤＡ タンパク質より最高１０倍高いネズミＡＤＡタンパク質を発現した。したがって 導入効率を厳密に分析するために、前駆細胞コロニーは導入されたｍＡＤＡの発 現が内因性ヒトＡＤＡ水準以上である場合にのみ形質導入されたとみなされた。 ＴＫＮＥＯベクターからのｎｅｏの高水準の発現は、ネオホスホトランスフェラ ーゼ（ｎｅｏ遺伝子生成物）活性のアッセイと同様にＧ４１８薬物耐性により検 出された。 前記のように、本発明方法はレトロウイルス産生細胞の存在下で同時培養する 必要なしに有利に実施することができる。したがって本発明の１観点によれば、 レトロウイルス仲介遺伝子導入を、標的である造血細胞その他の細胞以外の細胞 が実質的に存在しない状態で実施することができる。たとえばレトロウイルスベ クタープラスミドを含む産生細胞を培養し、上清を採集することができる。次い でレトロウイルス含有上清を、フィブロネクチンおよび／またはフィブロネクチ ンフラグメントの存在下で造血細胞の感染に用いることができる。これらは好ま しくは固定化された形のものであり、たとえば支持体にコートし、この上で感染 を行うか、または他の方式で感染用培地と接触させる。これに関して、高力価の 無ヘルパーレトロウイルスを産生する任意の産生細胞が本発明に使用するのに適 していると考えられる。これらには、たとえばパッケージング細胞、たとえばＰ ｓｉ−２、Ｃ２、ＰＡ１２、ＰＡ３１７、およびＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２、ならび に当技術分野で知られている他の多数のパッケージング細胞系が含まれる。 本発明の他の観点によれば、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合性ドメイ ン内のアミノ酸への強いウイルス結合を利用して、広範な細胞タイプにわたるウ イルス療法に用いる運搬システムを構築しうる。このためには、フィブロネクチ ン由来のレトロウイルス結合性ドメインを含むポリペプチドを、この構築体に標 的細胞に対する特異性を与える任意のリガンドに共有結合させることができる。 この方法によれば、各標的細胞に特異的なレトロウイルス細胞系を予め構築する 必要性が回避されるであろう（Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．，Ａ．Ｍ．Ｄｏｚｙおよ びＹ．Ｗ．Ｋａｎ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２６６，ｐｐ．１３７３−１３ ７６（１９９４）、ならびにＶａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｓ．，Ａ． Ｄｒｙｎｄａ，Ｇ．Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｍ．Ａｕｍａｉｌｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．Ｈｅａ ｒｄ，Ｏ．Ｄａｎｏｓ，Ｇ．ＶｅｒｄｉｅｒおよびＦ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６８，ｐｐ．４６０９−４６１９（１９９４））。標的 構築体の特異性は、たとえば下記を含めたリガンドの使用により与えることがで きる：１）細胞付着性タンパク質、２）ホルモンまたはサイトカイン、３）標的 細胞に対するモノクローナル抗体、４）標的細胞に結合する炭水化物（Ｇ．Ａｓ ｈｗｅｌｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５１，ｐｐ．５ ３１−５５４（１９８２））、５）標的細胞に関する代謝産物、または６）標的 細胞に結合する官能性ポリペプチド。遺伝子運搬のための構築体の効率は、数種 類のヘパリン−ＩＩウイルス結合性ドメインを含有させ、したがって標的細胞に 運搬されるウイルス粒子の量を増加させることによって、改善することができる 。たとえば米国特許第５，１９８，４２３号明細書に記載されたフィブロネクチ ンのＰｒｏ¹²³⁹−Ｓｅｒ¹⁵¹⁵に相当するヒトフィブロネクチン細胞結合性ドメイ ンは、ＢＨＫおよびＢ１６−Ｆ１０細胞を含めた細胞に結合することが示された （Ｋｉｍｉｚｕｋａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０，２８４−２９１（１９９ １））。さらに、ヘパリン−ＩＩドメイン自体が線維芽細胞、内皮細胞、および 腫瘍細胞に結合することが示された。これらのポリペプチド配列をフィブロネク チン由来のレトロウイルス結合性ドメインに結合させて、レトロウイルスによる 感染のために予め定めた細胞をターゲティングすることができる。 造血系における用途の例には、それぞれ高特異性赤血球または顆粒球の前駆細 胞をターゲティングするための、フィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメ インに結合したエリトロポエチンまたはＧ−ＣＳＦの構築体が含まれる。本発明 による他の一般的用途は、レトロウイルス結合性ドメイン（１または２以上）を 、悪性細胞に特異的にまたは主として結合するリガンドと結合させることであろ う。たとえば標的細胞上の受容体に結合する物質、たとえば下記のものを用いて 、乳がん細胞のインビトロ増殖に、またインビボ増殖にすら影響を及ぼしうるこ とが示された：黄体形成ホルモン放出性誘導体、Ｅｍｏｎｓ，Ｇ．ら，Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ．９：１３６４−１３７９（１９９４）；エストロゲン、Ｔｏｌｃ ｈｅｒ，Ａ．Ｗ．，Ｏｎｃｏｌ．８：３９−４３（１９９４）；またはアンチエ ストロゲン、Ｈｏｗｅｌｌ，Ａ．ら，Ｌａｎｃｅｔ ３４５：２９−３０(１９ ９５)；プロゲストーゲンまたはアンチプロゲストーゲン、Ｋｌｉｊｎ．Ｆ．Ｇ ．ら，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．９ Ｓｕｐｐｌ．１：１８１−１８９（１９９４ ）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｋ．ら，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１：６７２−６ ８７（１９９４）；これらはフィブロネクチン由来のウイルス結合性ドメイン１ または２以上を含む本発明の構築体においてリガンドとして用いられるであろう 。他の例として、ヨウ化物を含む構築体を用いて甲状腺（がん）細胞を高度に特 異的にターゲティングすることができ、またＨＤＬもしくはその一部を含む構築 体により肝（がん）細胞を高度に特異的にターゲティングすることができる。最 後に、モノクローナル抗体およびフィブロネクチンのレトロウイルス結合性ドメ インの構築体は、抗体が得られるいかなる細胞および器官をもターゲティングす ることができるであろう。したがってフィブロネクチンのレトロウイルス結合性 ドメインがウイルスベクターを結合および局在化しうる能力を利用することによ り、広範な哺乳動物細胞タイプをターゲティングすることができる。 したがって本発明の他の好ましい態様は、標的細胞のウイルス形質導入を増強 するために使用しうる構築体を製造するものである。フィブロネクチンのヘパリ ン−ＩＩ結合性ドメインのウイルス結合性アミノ酸配列を、標的細胞が結合する リガンドに結合させる。前記のように、リガンドはたとえばフィブロネクチン由 来のもしくは他のタンパク質（細胞付着性タンパク質、たとえばラミニン、コラ ーゲン、ビトロネクチン、オステオポンチンまたはトロンボスポンジンを含む） 由来のポリペプチド、ホルモン、代謝産物、抗体（モノクローナル抗体を含む） 、または標的細胞に、好ましくは特異的に結合する能力を示す他の任意のリガン ドであってもよい。得られた構築体全体を、後記の実施例に具体的に例示するフ ィブロネクチンポリペプチドに用いたと同様な様式で固定化された形で用いるこ とができる。 構築体の安定性および特異性、ならびに生理的条件下でのレトロウイルス構築 体の相互作用など種々の要因を考慮して、これらの構築体および細胞ターゲティ ング法を前記のようにインビトロでの、またインビボでのレトロウイルスによる ターゲティングに用いることができる。運搬システムを改変して標的細胞への構 築体の運搬を局在化することにより、たとえば肝細胞をターゲティングするため に門脈にカテーテル挿入することにより、特異性を改良することもできる。 本発明方法を実施するために特に設計されたキットを用いると、レトロウイル ス仲介ＤＮＡ導入が極めて簡便に実施されると考えられる。したがって本発明の 他の観点は、レトロウイルスによる標的細胞の形質導入を増強する量の前記の実 質的に純粋なポリペプチドまたは構築体、およびレトロウイルス感染を実施しう る人工的支持体を含むキットを提供する。ポリペプチドまたは他の構築体は別個 に、または人工的支持体にコートして供給することができる。ヒト造血細胞に関 する感染プロトコールの場合、キットは細胞の予備刺激のための造血細胞成長因 子をも含むであろう。さらにキットは形質導入のための前記の組換えレトロウイ ルスベクターを含むことができる。一般にキットは、キットの取り扱い中に成分 が漏出するのを防止するのに十分な程度に互いに間隔をおいてこれらの各種キッ ト成分を保管する無菌のパッケージングを含むであろう。たとえばキット成分を 互いに間隔をおいた関係に保持するための多数のコンパートメントまたは領域を 備えたプラスチック成形品を用いるのが一般的である。 本発明をさらに理解および認識しやすくするために、以下の具体例を提示する 。これらの例は説明のためのものであって限定する性質のものでないことは理解 さ れるであろう。 実施例１ ＴＫＮＥＯを用いた骨髄細胞への遺伝子導入 １．１．ウイルス上清の調製 レトロウイルスプラスミドＴＫＮＥＯベクターを含むＧＰ＋ＥｎｖＡＭ １２ 産生細胞（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら（１９８８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６７：４０ ０）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）ハイクローン、ユタ州ローガン）なら びに１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン （Ｐ／Ｓ、両方ともギブコ）を含有するイスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）の改変ダルベ ッコ培地（ＩＭＤＭ、ギブコ、マリーランド州ガイザースバーグ）中で培養した 。２０％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭを１０ｍｌ添加して平板を一夜で集密化する ことにより、ウイルスを含有する上清を採集した。収穫した培地を０．４５ミク ロンのフィルター（ゲルマン・サイエンシズ、ミシガン州アンアーバー）で濾過 し、使用時まで−８０℃に保存した。 １．２．フィブロネクチンフラグメントの調製 Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８２：８０３−８ ３１(１９８２)の記載に従ってヒト血漿(ライフソース、イリノイ州グランビュ ー)からＦＮを精製した。ただし４Ｍ尿素によるＦＮの溶離前にゼラチン−アガ ロースカラムを１Ｍ尿素で洗浄した。精製ＦＮを４℃で１０ｍＭ ３−（シクロ ヘキシルアミノ）−１−プロパン−スルホン酸（ＣＡＰＳ）、１５０ｍＭ Ｎａ Ｃｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、ｐＨ１１．０に対して徹底的に透析し、少量ずつに 分けて−８０℃に保存した。ＦＮのキモトリプチック細胞結合性ドメイン（ＣＢ Ｄ）（ＣＳ−１）およびヘパリン−ＩＩ結合性フラグメントを先の記載に従って 精製した（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら（１９８２），前掲、ＰａｔｅｌおよびＬｏｄ ｉｓｈ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２，ｐｐ．４４９−４５６（１９８６） 、並びにＢｅｒｎａｒｄｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５，ｐｐ．４８９ −４９８（１９８７））。ヘパリン−アガロースカラムからの１Ｍ ＮａＣｌ溶 出液中に３つの主要なヘパリン結合性フラグメント（３０ｋＤ、３５ｋＤおよび ４２ｋＤ）が得られた。これらのヘパリン結合性フラグメントをさらに精製する ために、１Ｍ ＮａＣｌ溶出液を４℃で１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０ ）に 対して一夜透析し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したアニオ ン交換カラム（２ｍｌ ＤＥＡＥセファロース高速用（ファルマシア・ファイン ・ケミカルズ、スウェーデン国ウプサラ）／ｍｇタンパク質）に導通した。３０ ／３５ｋＤフラグメントは結合しない画分中に採集され、一方４２ｋＤフラグメ ントはカラムから１００ｍＭ ＮａＣｌで溶離された。５００ｍｇのＦＮからほ ぼ２６ｍｇの３０／３５ｋＤフラグメントおよび４ｍｇの４２ｋＤフラグメント を得た。ウェスタンブロッティング法で測定すると、４２ｋＤフラグメントはフ ィブリン結合性ドメインに対する抗体により認識されたが、３０／３５ｋＤフラ グメントは認識されなかった。４２ｋＤフラグメントはフィブリン−セファロー スアフィニティーカラムにも結合する。 感染プロトコールに用いるために、フィブロネクチンフラグメントをＰａｔｅ ｌおよびＬｏｄｉｓｈ（１９８６）、前掲、の記載に従って３５または１００ｍ ｍのペトリ皿（ファルコン、ニュージャージー州リンカーン・パーク）上に７５ ｐｍｏｌ／ｃｍ²の濃度で固定化した。対照の皿に２％（無ＦＮ）ウシ血清アル ブミン（ＢＳＡ）ベーリンガー・マンハイム、ドイツ国マンハイム）で同様にコ ートした。 １．３．レトロウイルス感染プロトコール 健康な成人ドナーから骨髄試料を、インディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉ ｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより立証されたプロトコールに従って、 無菌の、防腐剤を含有しない硫酸ナトリウムヘパリンを入れた試験管中へ採集し た。フィコール−ハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（密度１．０７ ７ｇ／ｍｌ、ファルマシア、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）上において ２５℃で４５分間遠心分離することにより、低密度単核細胞を調製した。さらに ３７℃で２％ＦＣＳを含有するＩＭＤＭ中、５％ＣＯ₂において４−１６時間、 組織培養皿上でインキュベートすることにより、プラスチック付着細胞を低密度 骨髄細胞から除去した。 付着陰性の低密度単核細胞をレトロウイルス感染前に、先にＬｕｓｋｅｙら（ １９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０：３９６が記載したものに従って３７℃で４８時間 、２０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＳ ＣＦ（両方ともアムゲン、カリフォルニア州サウザンド・オークス）、およびＰ ／Ｓを含有するＩＭＤＭ中、５％ＣＯ₂において細胞密度１×１０⁶個／ｍｌでペ トリ皿内において予備刺激した。激しくピペッティングしてプラスチックにゆる く付着した細胞を除去することにより、予備刺激した細胞を収穫した。 予備刺激した細胞（５×１０⁵細胞／ｍｌ）を、ＢＳＡ（対照のプレート）ま たはフィブロネクチンもしくはそのフラグメント（タンパク質をより良くプラス チックプレートに付着させるためにＵＶ照射した）でコートしたプレート上で６ 時間インキュベートし、次いで成長因子（前記）および７．５μｇ／ｍｌのポリ ブレン（アルドリッヒ・ケミカル、ワイオミング州ミルウォーキー）の存在下に ウイルス上清を感染させた。ウイルス上清を２時間後に交換し（成長因子および ５．０μｇ／ｍｌのポリブレンを含有）、細胞をさらに１２−２４時間インキュ ベートした。培地交換の度に付着していない細胞を再添加した。 感染プロトコールに従って、付着していない細胞をデカントし、付着した造血 細胞を培養物から細胞解離用緩衝液（ＣＤＢ）（無酵素／ＰＢＳ系、ギブコ）に より採集した。付着細胞を非付着画分に添加し、２回洗浄し、計数した。収穫し た細胞をクローン原性メチルセルロース前駆細胞アッセイまたは長期骨髄培養に おいて平板培養した。 １．４．長期骨髄培養 ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細胞）アッセイを先に記載された方法に従い、わずかに 改変して実施した。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄら，Ｂｌｏｏｄ ７４：１５６３（１ ９８９）。以下に要約する。０．５−１×１０⁶個の感染細胞を、６ウェル組織 培養プレート（コスター、マサチュセッツ州ケンブリッジ）中で、１０％ＦＣＳ 、１０％ウマ血清（シグマ）およびＰ／Ｓ、１×１０^-5Ｍヒドロコルチゾン（ア ップジョン、ミシガン州カラマズー）ならびに３２０ｍｏｓｍｏｌ塩化ナトリウ ムを含有するＩＭＤＭ５ｍｌ中の、集密的な前照射した（前記に従う）同種ヒト 骨髄線維芽細胞（ＢＭＦ）上での長期骨髄培養（ＬＴＭＣ）に接種した。ＬＴＭ Ｃを３３℃において５％ＣＯ₂中でインキュベートし、５０％の培地および付着 していない細胞を分離することにより週１回供給した。５週間後に、付着した造 血細胞をＣＤＢによりＢＭＦから分離することによって、ＬＴＣ−ＩＣ培養物を 殺 した。付着していない造血細胞および付着した造血細胞の両方を合わせてメチル セルロース中で平板培養し、ＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニーを得た。 １．５．クローン原性メチルセルロースアッセイ メチルセルロースアッセイを先にＴｏｋｓｏｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，ｐ７３５０（１９９２）が記載したも のに従い、わずかに改変して実施した。以下に要約する：２−５×１０⁴個の感 染した成人骨髄細胞を、５Ｕ／ｍｌのエリトロポエチン（Ｅｐｏ、アムゲン）、 １００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ−３(ゲンザイム、 マサチュセッツ州ケンブリッジ)と共に、２５％ＦＣＳ、１０％ヒト血漿、１０^{- 5} Ｍベーターメルカプトエタノール（シグマ）およびＰ／Ｓを含有する２．４％ ＩＭＤＭメチルセルロース（フルカ、ニューヨーク州ロンコンコーマ）１ｍｌ中 で平板培養した。培養物を３７℃で５％ＣＯ₂／９５％空気中においてインキュ ベートし、１３日目に倒立顕微鏡で観察することによりコロニー（＞５０細胞） をＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球およびマクロファージを含有）、ＣＦＵ−Ｍｉｘ（骨髄 様および赤血球様要素を含有）、またはＢＦＵ−Ｅ（赤血球様要素のみを含有） として計数した。 １．６．レトロウイルス感染の分析 １３日目に１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（乾燥粉末、ギブコ）に対して耐性で あるメチルセルロースコロニーの％を測定することにより、ＴＫＮＥＯウイルス による感染効率を分析した。各実験において、骨髄をＧＰ＋ＥｎｖＡＭ １２パ ッケージング系上で組換えウイルスを形成させずにインキュベートすることによ り、模擬感染を行った。これらの模擬感染細胞を１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８と 共に培養したものは、常に＜１％のバックグラウンドコロニーを示した。 １．７．コミッティッド前駆細胞への遺伝子導入効率 骨髄細胞を３０／３５ ＦＮコートまたはＢＳＡコートした皿で平板培養した 状態で感染させることにより、形質導入効率を比較した。これらの条件下では選 択なしに感染させたのちに得られたコロニー数には差がなかった。図２は感染後 のＧ４１８^rコロニーの％を示す。系列限定（ｌｉｎａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔ ｅｄ）前駆細胞（ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭ）および多系列（ｍｕｌｔｉｌ ｉｎａｇｅ）前駆細胞（ＣＦＵ−Ｍｉｘ）に由来するものを含めてすべてのタイ プの前駆細胞に由来する３０／３５ ＦＮ上に、高率のＧ４１８^rコロニーが認 められた。ＢＳＡと対比して３０／３５ ＦＮ上ではすべてのコミッティッド前 駆細胞への感染が９倍増大した。 １．８．長期培養開始細胞への遺伝子導入効率 ＴＫＮＥＯベクターを用いてＬＴＣ−ＩＣへの遺伝子導入を評価した。ＬＴＣ −ＩＣ由来のコロニーへの遺伝子導入は３０／３５ ＦＮ上での感染後に検出さ れたにすぎない（１６％Ｇ４１８′コロニー対０％Ｇ４１８^rコロニー、３０／ ３５ ＦＮ対ＢＳＡ）。 １．９．造血細胞の感染効率に対する３０／３５ ＦＮ作用の特異性 ３０／３５ ＦＮ上で見られた遺伝子導入効率増大の特異性を判定するために 、ＴＫＮＥＯによる感染を下記のものでコートした皿上で実施した：ＢＳＡ、３ ０／３５ ＦＮ、無傷のフィブロネクチン、ＲＧＤＳテトラペプチド配列を含む 中心−細胞結合性ドメイン（ＣＢＤ）を含む１１５ｋｄのＦＮフラグメント、ヘ パリン−ＩＩ結合性ドメインを特色とし、ただしＣＳ−１配列を欠如する４２ｋ ｄ Ｃ−末端ＦＮフラグメント（４２ＦＮ）（図１）。ＢＳＡ上での感染では、 ３±１％のＧ４１８^r ＢＦＵ−Ｅ、１±１％のＧ４１８^r ＣＦＵ−ＧＭ、およ び０±０％のＧ４１８^r ＣＦＵ−Ｍｉｘが得られた。ＣＢＤ上ではＧ４１８^rコ ロニーの割合には有意の増大が認めらず、一方４２ＦＮ上ではわずかに高いＢＦ Ｕ−Ｅ（６．０±１％）の感染が見られた（図３）。しかし無傷のＦＮはすべて のコミッティッド前駆細胞への遺伝子導入の増大を促進した。無傷のＦＮ上での 感染後のＧ４１８^rコロニーの割合は、下記を含めてすべての系列において３０ ／３５ ＦＮ上でのものより低かった：ＢＦＵ−Ｅ（１６±２対２４±４％）、 ＣＦＵ−ＧＭ（５±２対２０±４％）、およびＣＦＵ−Ｍｉｘ(６±１対９±１ ％);それぞれ無傷のＦＮ対３０／３５ ＦＮ。 実施例２ ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いた骨髄細胞への遺伝子導入 ２．１．一般法 ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス上清を、実施例１においてＴＫＮＥＯにつき記載し たと同様に調製した。フィブロネクチンのキモトリプチックフラグメント（図１ ）を先に実施例１に記載したと同様に調製し、実施例１のレトロウイルス感染プ ロトコールに従った。ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細胞）アッセイおよびメチルセルロ ースアッセイを実施例１に従って実施した。 ２．２．レトロウイルス感染の分析 ＰＧＫ−ｍＡＤＡベクターによる感染効率を、ＡＤＡアイソザイム電気泳動に よるタンパク質分析により測定した。個々の前駆細胞コロニーの分析を、先にＭ ｏｒｉｔｚ（１９９３）およびＬｉｍら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，ｐ８８９２が記載したと同様に実施し た。導入効率を厳密に分析するために、内因性ヒトＡＤＡと同じか、またはより 高い水準のｍＡＤＡを発現するコロニーのみを形質導入されたとみなした。プー ルしたコロニーの分析のために、メチルセルロース培養物から取り出したコロニ ーを１．５ｍｌミクロ試験管（レイニン、マサチュセッツ州ウーバン）内で一緒 にし、温培地およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、遠心分離し、−２０ ℃に保存した。ＡＤＡ分析のために、細胞を５μｌの細胞溶解用緩衝液中で反復 凍結融解サイクルにより溶解し、先の記載に従ってアイソザイム電気泳動を実施 した。 ２．３．コミッティッド前駆細胞への遺伝子導入効率 骨髄細胞を３０／３５ ＦＮコートまたはＢＳＡコートした皿上で平板培養し た状態で感染させることにより、形質導入効率を比較した。これらの条件間に、 選択なしの感染後に得たコロニー数の差は見られなかった。表１に示すように、 すべてのコミッティッド前駆細胞への感染効率がＢＳＡに対比して３０／３５ ＦＮ上で実質的に増大した。高力価（約１×１０⁷ウイルス粒子／ｍｌ）ベクタ ーを用いる場合に予想されたように、コミッティッド前駆細胞の形質導入効率は 著しく高かった。表１を参照すると、３０／３５ ＦＮ上での骨髄のＰＧＫ−ｍ ＡＤＡ感染により、別個の２実験でコミッティッド前駆細胞のほぼ１００％の形 質導入が得られた。 ２．４．長期培養開始細胞への遺伝子導入効率 ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いて行った４つの独立した実験で、有意の割合の５週齢 ＬＴＭＣ由来の前駆細胞コロニー（すなわちＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニー）が、 導入されたネズミＡＤＡ遺伝子を発現した。発現は分析したコロニーのうち２／ １２（１７％）−６／６（１００％）に及んだ（表２）。導入されたｍＡＤＡ遺 伝子の発現は、陽性であるとみなされたすべてのコロニーにおいて内因性ヒトＡ ＤＡ活性を上回るか、または少なくともそれと同等であった。ＰＧＫ−ｍＡＤＡ に関する感染効率はＴＫＮＥＯに関するよりも高かった。表２に示すように、２ つの別個の実験において３０／３５ ＦＮ上での骨髄のＰＧＫ−ｍＡＤＡ感染に より、コミッティッド前駆細胞のほぼ１００％の形質導入が得られた。 ２．５．造血細胞の感染効率に対する３０／３５ ＦＮ作用の特異性 ＬＴＣ−ＩＣ中への遺伝子導入効率が３０／３５ ＦＮ上で増大した。これら の二次ＬＴＣ−ＩＣ由来コロニーの大きさが比較的小さいため、単一コロニーに つきタンパク質分析を行う可能性には限界があった。ＢＳＡ、無傷のフィブロネ クチン、および４２ ＦＮ上でのＰＧＫ−ｍＡＤＡ感染後にネズミＡＤＡの発現 を示したのは、それぞれ０／６、０／４および０／３のＬＴＣ−ＩＣ由来コロニ ーであったが、３０／３５ ＦＮ上で感染させたＬＴＣ−ＩＣ由来コロニー３／ ５がｍＡＤＡを発現した。さらに、多数のＬＴＣ−ＩＣ由来コロニーをプールし たのち２つの追加実験で分析した場合、ｍＡＤＡ発現は３０／３５ ＦＮ上、お よびこれより低いが無傷のＦＮ上での感染後にのみ検出され、４２ ＦＮまたは ＢＳＡ上では検出されなかった。 実施例３ ＰＧＫ−ｈＡＤＡを用いた骨髄細胞への遺伝子導入 ３．１．一般法 ＰＧＫ−ｈＡＤＡウイルス上清を実施例１においてＴＫＮＥＯにつき記載した と同様に調製する。フィブロネクチンのキモトリプチックフラグメント（図１） を先に実施例１に記載したと同様に調製し、実施例１のレトロウイルス感染プロ トコールに従う。ＬＴＣ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施 例１に従って実施する。 ３．２．レトロウイルス感染の分析 プールしたコロニーの分析のために、メチルセルロース培養物から取り出した コロニーを１．５ｍｌミクロ試験管（レイニン、マサチュセッツ州ウーバン）内 で一緒にして、温培地およびＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、−２０℃に保存する 。ＡＤＡ分析のために、細胞を５μｌの細胞溶解用緩衝液中での反復凍結融解サ イクルにより溶解し、前記に従ってアイソザイム電気泳動を実施する。 実施例４ ＴＫＮＥＯを用いた臍帯血細胞への遺伝子導入 ４．１．一般法 ＴＫＮＥＯウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプチックフラグメ ント（図１）を先に実施例１に記載したと同様に調製した。実施例１のレトロウ イルス感染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生児からの臍帯血をインデ ィアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄにより 立証されたプロトコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ採集し、骨髄細胞 の代わりに使用した。ＬＴＣ−ＩＣ（ヒト幹細胞）アッセイおよびメチルセルロ ースアッセイを実施例１に従って実施した。 ４．２．コミッティッド前駆細胞への遺伝子導入効率 ３つの別個の実験において、３０／３５ ＦＮ上での感染はＢＳＡと比較して ４倍以上増大した（表３）。 実施例５ ＰＧＫ−ｍＡＤＡを用いた臍帯血細胞への遺伝子導入 ５．１．一般法 ＰＧＫ−ｍＡＤＡウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプチックフ ラグメント（図１）を、先に実施例１に記載したと同様に調製した。実施例１の レトロウイルス感染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生児からの臍帯血 をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒ ｄにより立証されたプロトコールに従ってヘパリンを入れた試験管中へ採集した 。ＬＴＣ−ＩＣアッセイおよびメチルセルロースアッセイを実施例１に従って実 施した。 ５．２．長期培養開始細胞への遺伝子導入効率 高力価ＰＧＫ−ｍＡＤＡベクターを用いた場合、ＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニー の分析により、上清をＦＮ３０／３５上で用いて感染させた臍帯血から株化され た培養物からのみ、導入ｍＡＤＡ ｃＤＮＡの高水準の発現が証明された。ＢＳ Ａ対照プレートで感染させたＬＴＣ−ＩＣ由来のコロニーにはほとんどｍＡＤＡ の発現が検出されなかった。 実施例４および５に示した結果は、臍帯血前駆細胞および幹細胞を用いた場合 にもＦＮ３０／３５を用いることによって改良された感染効率を達成しうること を証明する。 実施例６ ＰＧＫ−ｈＡＤＡを用いた臍帯血細胞への遺伝子導入 ＰＧＫ−ｈＡＤＡウイルス上清およびフィブロネクチンのキモトリプチックフ ラグメント（図１）を、実施例１にＴＫＮＥＯにつき記載したと同様に調製する 。実施例１のレトロウイルス感染プロトコールに従い、ただし正常な満期新生児 からの臍帯血をインディアナ医科大学Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅ ｗ Ｂｏａｒｄにより立証されたプロトコールに従ってヘパリンを入れた試験管 中へ採集し、骨髄細胞の代わりに使用する。ＬＴＣ−ＩＣアッセイおよびメチル セルロースアッセイを実施例１に従って実施する。 実施例７−１１ 実施例７−１１のレトロウイルスベクターおよび産生細胞系 実施例７−１１には２種類のレトロウイルス産生パッケージング細胞系を用い た：それぞれエコトロピックＧＰ＋Ｅ８６細胞系（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．， Ｓ．ＧｏｆｆおよびＡ．Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６２，ｐｐ１１ ２０−１１２４（１９８８））およびアンフォトロピックＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２ 細胞系（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．ＧｏｆｆおよびＡ．Ｂａｎｋ，Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１６７，ｐｐ４００−４０６（１９８８））。ここに記載 した実験で用いたレトロウイルスベクターおよび産生クローンを表４に挙げる。 細胞系はすべて１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ、ハイクローン、ユタ州ローガ ン）および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマ イシン（Ｐ／Ｓ、両方ともギブコ）を含有する改変ダルベッコ培地（ＤＭＥ）ギ ブコ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で培養された。ただしＥＡＬ２ａ 細胞は１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＤＭＥ−Ｆ１２（ギブコ）中で増殖 させた。ネズミ細胞については、それぞれ１０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓを含有する アルファ最小必須培地（αＭＥＭ、ギブコ）またはヒト細胞についてはイスコブ のダルベッコ培地（ＩＤＭＥ、ギブコ）１０ｍｌを添加して、１０ｃｍのプレー トを一夜集密化させることにより、ウイルスを含有する上清を採集した。収穫し た培地を０．４５ミクロンのフィルター（ゲルマン・サイエンシズ、ミシガン州 アンアーバー）で濾過し、使用時まで−８０℃に保存した。 実施例７ 一次ネズミ造血細胞の形質導入 ７．１．実験 ネズミ細胞を用いる実験のために、６−８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの大腿 骨および脛骨から、１５０ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシル（ソロパック・ラ ボラトリーズ、イリノイ州フランクリン・パーク）投与の２日後に骨髄を収穫し た（Ｌｉｍ，Ｂ．，Ｊ．Ｆ．Ａｐｐｅｒｌｅｙ，Ｓ．Ｈ．ＯｒｋｉｎおよびＤ． Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，Ｖ ｏｌ．８６，ｐｐ８８９２−８８９６（１９８９））。細胞を５×１０⁵細胞／ ｍｌの濃度においてＩＭＤＭ／２０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓ中で、１００ｎｇ／ｍ ｌのラット組換え幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ；アムゲン、カリフォルニア州サウザ ンズ・オークス）および１００Ｕ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−６（ｒ ｈＩＬ−６；ペプロ・テク・インコーポレーテッド、ニュージャジー州ロックヒ ル）により４８時間予備刺激した（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｂ．Ｄ．，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂ ｌａｔｔ，Ｋ.ＺｓｅｂｏおよびＤ.Ａ.Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ ．８０，ｐｐ３９６−４０２（１９９２））。次いでＥＰＨＡ−５産生細胞が産 生したＰＧＫ−ｈＡＤＡベクターによる遺伝子導入効率を３つの異なる感染プロ トコールにより比較した：１）上清感染；２）ＦＮ３０／３５上での上清感染； ３）ＥＰＨＡ−５産生細胞上での同時培養。したがって１００ｍｍの細菌皿に、 ５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ギブコ）に溶解した２．５μｇ／ｃｍ²の ＦＮ３０／３５（７５ｐｍｏｌ／ｃｍ²に相当）で室温においてＵＶ光線下に、 皿の蓋を開けた状態で１時間、そして皿の蓋を閉じた状態でさらに１時間コート した。 ２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、フラクションＶ；ベーリンガー・マンハイム 、インディアナ州インディアナポリス）により室温で３０分間ブロッキングした のち、２．５％（ｖ／ｖ）の１Ｍ Ｈｅｐｅｓを補充したハンクスの平衡塩類溶 液（ＨＢＳＳ）（両方ともギブコ）で皿を１回洗浄した。上清感染のためには皿 をＢＳＡのみでコートした。５×１０⁶個の予備刺激したドナー細胞を、前記に 従ってＥＰＨＡ−５細胞から得たウイルス上清１０ｍｌに１００Ｕ／ｍｌのｒｈ ＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのｈｒＳＣＦおよび７．５μｇ／ｍｌのポリブレン を補充したものと共にインキュベートした。付着していない細胞を採集し、新鮮 なウイルス上清を再添加した。同時培養のためには、培地４ｍｌ中のＥＰＨＡ− ５細胞を１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣと共に３７℃で２時間インキュベー トし、洗浄し、トリプシン処理し、１００ｍｍの組織培養皿に１０ｍｌのαＭＥ Ｍ／２０％ＦＣＳプラスＰ／Ｓ中３×１０⁶個の細胞濃度で接種した。翌日、１ ００Ｕ／ｍｌのｒｈＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌのｈｒＳＣＦおよび４μｇ／ｍ ｌのポリブレンで予備刺激した５×１０⁶個の骨髄細胞を４８時間添加した。感 染プロトコール後に付着していない細胞をデカントし、付着した造血細胞を培養 物から細胞解離用緩衝液（ＣＤＢ）（無酵素／ＰＢＳ系、ギブコ）により、製造 業者の指示に従って採集した。付着細胞を非付着画分に添加し、２回洗浄し、約 １ｍｌのＨＢＳＳ／Ｈｅｐｅｓに懸濁した。５×１０⁶個の予備刺激した細胞か ら得た全細胞を、致死量の全身照射（７００プラス４００ｃＧｙによる、¹³⁷Ｃ ｓ−源）した３匹のレシピエントマウスの尾静脈に注射した（Ｌｕｓｋｅｙ，Ｂ ．Ｄ．，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，Ｋ．ＺｓｅｂｏおよびＤ．Ａ．Ｗｉｌｌｉ ａｍｓ，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８０，ｐｐ３９６−４０２（１９９２））。再構 成マウスを、導入したヒトＡＤＡ ｃＤＮＡの発現につき検査することにより、 造血幹細胞の形質導入を分析した。このＡＤＡアイソザイム分析は、移植したマ ウスにおいて末梢血細胞を酢酸セルロースｉｎ ｓｉｔｕ酵素分析によりｈＡＤ Ａタンパク質の存在につき検査することによって実施された（Ｌｉｍ，Ｂ．，Ｄ ．Ａ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＳ．Ｈ．Ｏｒｋｉｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ ｌ.,Ｖｏｌ．７，ｐｐ３４５９−３４６５（１９８７））。検査は移植後４カ月 目から実施し、月毎に反復した。 ７．２．結果 遺伝子操作した造血幹細胞によるマウスの長期骨髄再構成は、一般に移植の４ カ月後に幹細胞形質導入効率を判定するのが適切であると受け取られている。７ カ月後にレシピエントの形質導入骨髄をアイソザイム分析により分析して、下記 のことが明らかになった：１）ヒトＡＤＡ ｃＤＮＡ発現は同時培養またはＦＮ ３０／３５上での上清感染を採用した場合に存在したが、ＦＮ３０／３５なしの 上清感染後に移植した群には存在しなかった；および２）発現の水準は同時培養 群とＦＮ３０／３５群で同等であった。図４、２−４列に示すように、ＥＰＨＡ −５細胞上での同時培養により形質導入された骨髄を移植した３匹のマウスは容 易に検出しうるヒトＡＤＡを立証した。同様な水準のヒトＡＤＡが、ＦＮ３０／ ３５上でのの上清感染により形質導入された造血細胞を移植した３匹のマウスに 検出された（図４、５−７列）。これに対し、ＢＳＡ上での上清感染により形質 導入された３匹のマウスにはヒトＡＤＡが検出されなかった(図４、８−１０列) 。ヒトＡＤＡの位置に関する対照を図４の１および１２列に、ネズミＡＤＡに関 する対照を１１列に示す。２−１０列のネズミバンドは等量のタンパク質が装填 されたことを明らかにする。これらのデータはＦＮ３０／３５上での上清感染に よる長期再構成性の造血幹細胞の形質導入が同時培養と同等であり、かつＦＮ３ ０／３５なしの上清感染よりはるかに優れていることを立証する。 実施例８ ＦＮ３０／３５へのレトロウイルスベクター結合による 形質導入改良のメカニズム ８．１．実験 形質導入の増大がウイルスと造血細胞の同時局在の結果であるか否かを調べる ために、組換えレトロウイルス粒子がＦＮ３０／３５への結合を示すか否かを分 析した。したがってＦＮ３０／３５コートしたプレートを、ＴＫＮＥＯウイルス を含有する上清と共に３０分間プレインキュベートしたのち、徹底的に洗浄した 。上清のウイルス力価を標準法により、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を用いて測定した（ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．，Ｓ．ＧｏｆｆおよびＡ．Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｌｏｌ ．，Ｖｏｌ．６２，ｐｐ１１２０−１１２４（１９８８））。以下に要約する： ３Ｔ ３細胞を１０００個／ウェルの濃度で６ウェル組織培養プレートに接種し、一夜 増殖させた。各ウェルにウイルス上清の系列希釈液を７．５μｇ／ｍｌのポリブ レンと共に添加し、３７℃で２．５時間インキュベートしたのち、２ｍｌの培地 を添加した。２４時間後に培地をＧ４１８（０．７５ｍｇ／ｍｌ、乾燥粉末、ギ ブコ）含有培地と交換し、プレートを１０−１２日間インキュベートした。Ｇ４ １８耐性コロニー（Ｇ４１８^r）を１０−１２日後に染色し、計数した。コロニ ー／ウェル×ウイルス上清希釈度の数値を、感染性粒子数（ｃｆｕ）／上清ｍｌ として用いた。ＦＮ３０／３５コートまたはＢＳＡコートした３５ｍｍのプレー トをウイルス上清と共にプレインキュベートし、徹底的に洗浄したのち、３５ｍ ｍの細菌用皿当たり１０００個のＮＩＨ／３Ｔ３およびポリブレンを添加するこ とにより、プレート上に残留するレトロウイルス粒子の量を評価“力価測定”し た。２４時間後に培養物に０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（乾燥粉末）を含有す る培地を供給し、細胞をさらに１０−１２日間インキュベートした。このインキ ュベーションののち、Ｇ４１８耐性ＮＩＨ／３Ｔ３コロニーを計数することによ り付着ウイルスの存在を定量した。 ＦＮ３０／３５へのウイルスの結合が用量依存性様式で起こるか否かを評価す るために、皿をコートするＦＮ３０／３５の濃度を漸増させて上記実験を反復し た。したがって３５ｍｍの細菌用皿を上記に従って１、４、１０および２０μｇ ／ｃｍ²のＦＮ３０／３５でコートした。予め感染性粒子１×１０⁴個／ｍｌと力 価測定されたＴＫＮＥＯウイルス原液の１：５０希釈液を、ＦＮ３０／３５コー トしたプレート上で３０分間インキュベートした。徹底的に洗浄したのち、各ウ ェルに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を添加した。上記に従って選択を行い、 １０日間の選択後にＧ４１８耐性ＮＩＨ／３Ｔ３コロニーを計数した。 ８．２．結果 図５に代表的な３実験中の１つの結果を提示する。ＴＫＮＥＯ上清を用いた場 合、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞中のＧ４１８^rコロニーにより測定したレトロウイルス 力価が、ＢＳＡコートしたプレート上では３ ｌｏｇ以上低下した（４×１０³ から０）が、力価低下は３０／３５ ＦＮコートしたプレート上では１ ｌｏｇ にすぎなかった。これらのデータは、レトロウイルスがＦＮ３０／３５には定量 的 に結合するが、ＢＳＡコートした皿（対照の皿）のは結合しないことを証明する 。図６は、ウイルス含有上清をより高い濃度のＦＮ３０／３５でコートすると、 より多数のＧ４１８耐性コロニーが検出されたことを示す。したがってＦＮ３０ ／３５へのウイルスの結合は用量依存性の様式で起こる。 実施例９ 組換えフィブロネクチンフラグメントへのウイルスの結合 ９．１．実験 Ｋｉｍｉｚｕｋａらは先に大腸菌におけるクローン化ＦＮ ＤＮＡ配列の発現 につき報告した（Ｋｉｍｉｚｕｋａ，Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａ ｔｅ，Ｙ．Ｋａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｄ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｉ．Ｋａ ｔｏ，Ｋ．ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ，Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ２８４−２９１（１９９１））。クローン化およびキメ ラペプチドは細胞の付着に関与することが知られている、フィブロネクチン中の 幾つかの重要な配列の１つまたは組合わせを含む（ＲＧＤＳ、ＣＳ−１およびヘ パリン結合部位を含む）。図７を参照されたい。レトロウイルスがこれらの組換 えＦＮフラグメントに結合しうるか否かを分析するために、陽性対照としての組 換えフラグメントＣ−２７４、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ２ ９６、Ｃ−ＣＳ１およびＦＮ３０／３５でコートしたプレート上で、感染性粒子 １×１０⁴／ｍｌの凍結レトロウイルスＴＫＮＥＯ原液の２種類の異なる希釈液 （１：１０および１：１００）を用いて３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイを反復 した。ＦＮフラグメントは１２０−１３０ｐｍｏｌ／ｃｍ²の濃度で用いられた （Ｃ−２７４、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、Ｃ−ＣＳ１、ＦＮ３０／３５について は４μｇ／ｃｍ²、ＣＨ−２７１、ＣＨ２９６については８μｇ／ｃｍ²に相当） 。要約すると、プレートをコートし、ウイルスを添加し、プレートを徹底的に洗 浄し、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を２４時間添加し、次いで選択培地中で１０日間選択 したのちコロニーを染色し、計数した。 ９．２．結果 図８は、フラグメントＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１およびＣＨ２９ ６においてＧ４１８耐性コロニー数（したがってウイルスの付着）が増加したこ とを証明する。さらにこれは、結合したウイルスの量がこれらの組換えフラグメ ントとＦＮ３０／３５との間でほぼ同等であったことを示す。ただしこの実験で はＣＨ−２７１フラグメントが最高水準のウイルス結合を示した。これら５種類 のＦＮフラグメントすべてに共通して、高親和性のヘパリン結合部位を含むタイ プＩＩＩ反復配列１２−１４がある（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．，Ａｎｎ．Ｒｅ ｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５７，ｐｐ３７５−４１３（１９８８）、およ びＫｉｍｉｚｕｋａ，Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄａｔｅ，Ｙ．Ｋａ ｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｉ．Ｋａｔｏ，Ｋ．Ｓｅ ｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１１ ０，ｐｐ２８４−２９１（１９９１））。この部位は恐らく反復配列１３内に位 置すると思われる（Ｋｉｍｉｚｕｋａ，Ｆ．，Ｙ．Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｏｈｄ ａｔｅ，Ｙ．Ｋａｗａｓｅ，Ｔ．Ｓｈｉｍｏｊｏ，Ｋ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｉ．Ｋ ａｔｏ，Ｋ．ＳｅｋｉｇｕｃｈｉおよびＫ．Ｔｉｔａｎｉ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ .,Ｖｏｌ．１１０，ｐｐ２８４−２９１（１９９１））。これは、ウイルス結合 がこの既知の付着部位により起こっていることを示唆する。これは、４μｇ／ｃ ｍ²のＣＨ−２７１でコートした皿を、漸増する濃度（１０−１０００μｇ／ｍ ｌ）のヘパリン硫酸、すなわちヘパリン結合部位への細胞の結合を阻害すること が知られている高度に帯電した分子と共にプレインキュベートすることにより証 明された。図９に示すように、ヘパリン硫酸の濃度が増大するのに伴ってＣＨ− ２７１のプレインキュベーションによりＧ４１８耐性コロニー数が減少する。こ れらのデータは、ＦＮへのウイルスの結合がＦＮのカルボキシル末端のＣＳ−１ 部位のすぐ隣に位置する高親和性ヘパリン結合部位により仲介されることを示唆 する。 実施例１０ 組換えフィブロネクチンフラグメント上での造血細胞の形質導入 １０．１．実験 ＦＮ３０／３５につき先に記載した造血細胞の形質導入の増大が組換えＦＮフ ラグメントを用いた場合にも見られるか否かを分析するために、高増殖性の潜在 的コロニー形成性細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）アッセイ法を用いて、インビトロでの 上清感染の形質導入効率を評価した。ＥＡＬ２ａベクターを使用し、遺伝子導入 を指示するものとしてＧ４１８耐性コロニーの増殖を利用する造血細胞形質導入 に種々の組換えＦＮフラグメントが及ぼす影響を、ＦＮ３０／３５またはＢＳＡ 上での上清感染と比較した。さらに、既にＦＮフラグメントに付着したウイルス 粒子（上清ウイルスと対比）が造血細胞に形質導入する能力を比較した。０．５ −１×１０⁶個の予備刺激した骨髄細胞を３５ｍｍのＦＮコートしたペトリ皿上 で、成長因子および５μｇ／ｍｌのポリブレンを含有するＥＡＬ２ａウイルス含 有上清１−２ｍｌ中において、前記に従ってインキュベートした。ＦＮフラグメ ントに結合したウイルスによる造血細胞の形質導入を評価するためには、ウイル ス含有上清と共にインキュベートした３５ｍｍのＦＮコート皿をそれぞれ２ｍｌ のＰＢＳで３回洗浄した。次いで０．５−１×１０⁶個の予備刺激した骨髄細胞 を、成長因子およびポリブレンを補充した培地２ｍｌ中において添加した。２２ 時間後に細胞を収穫し、１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する、および含有し ないＨＰＰ−ＣＦＣアッセイに接種した（Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔ．Ｒ．およびＤ． Ｍｅｔｃａｌｆ，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ ．４４，ｐｐ２８７−２９３（１９６６）の記載に従う）。培養物を７％ＣＯ₂ 中で３３℃において１４日間インキュベートし、Ｇ４１８耐性コロニーの％とし て遺伝子導入効率を計算した。 １０．２．結果 上清感染による未発達の造血細胞の形質導入（図１０参照）は、ヘパリン結合 部位（ＨＢＳ）および少なくともさらに１つの有効な細胞付着部位を含むすべて のフラグメントにつき、ＢＳＡ上での上清感染より有意に高かった（中実の棒） 。組換えフラグメントＣＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６およびＣ−ＣＳ １の形質導入効率は、ＦＮ３０／３５、ヘパリン結合部位およびＣＳ−１部位の 両方を含む３フラグメントすべての作用と類似していた。他のすべての場合、形 質導入は著しく低下した。これらのデータは、先にＦＮ３０／３５につき示した 未発達の造血細胞の形質導入増大を組換えＦＮフラグメントについて再現しうる ことを証明する。それはさらに、フィブロネクチンに直接に結合したウイルスが 造血細胞の遺伝子形質導入を行いうることを証明する。最後にそれは、ＣＳ−１ と ヘパリン結合部位の両方が存在することが未発達の造血前駆（幹）細胞の形質導 入に有用であることを確認する。 実施例１１ 組換えフィブロネクチンフラグメント上でのネズミドナー細胞の形質導入 を利用したマウスの長期骨髄再構成 １１．１．実験 未発達の造血前駆細胞についての前記のインビトロ実験（実施例１０から）を 、ＢＳＡまたはＦＮ３０／３５または組換えＦＮフラグメント上での上清感染と 同時培養とを対比しながら、骨髄移植を用いて反復し、造血幹細胞の再構成に対 する影響を分析した。以下に要約する：致死量照射したマウスに、ヒトＡＤＡ ｃＤＮＡを含むＥＰＨＡ−５ベクターを形質導入したドナー細胞を注射した。１ カ月後に末梢血からＡＤＡアイソザイム分析により遺伝子導入効率を分析した。 １１．２．結果 図１１は、ヘパリン結合部位とＣＳ−１の両方を含むフィブロネクチンフラグ メントＨ−２９６がＦＮ３０／３５および同時培養と類似の結果を与えることを 明瞭に示す。これらの部位を両方を含むものでないフラグメントは移植可能な造 血細胞の形質導入における有効性がより低い。これらのデータは、未発達の造血 ／幹細胞と、ＣＳ−１およびヘパリン結合部位の両方を含む組換えＦＮフラグメ ントに結合したレトロウイルスとの同時局在によって、移植可能な造血細胞が効 果的に形質導入されることを証明する。 以上の記載において本発明を詳細に説明および記述したが、これは説明のため のものであって限定する性質のものではないと考えるべきであり、好ましい態様 を記載したものであって、本発明の精神に包含される変更および修正はすべて保 護されることを望むと解すべきである。 本明細書に引用した刊行物はすべて、それらが個々に引用されて完全に提示さ れたと同様に、それらの全体が参考として本明細書に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/27 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ 38/46 ＡＤＵ 7433−4Ｃ Ｃ０７Ｊ 1/00 47/48 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/78 48/00 ＡＥＤ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＤＵ Ｃ０７Ｊ 1/00 9051−4Ｃ 37/04 ＡＢＹ Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ 37/43 // Ｃ０７Ｋ 14/78 9051−4Ｃ 37/36 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ウィリアムズ，デヴィッド・エイ アメリカ合衆国インディアナ州46278，イ ンディアナポリス，ノース・ムーア・ロー ド 8751 (72)発明者 パテル，ヴィクラム・ピー アメリカ合衆国メリーランド州20876，ジ ャーマンタウン，セプター・リッジ・テラ ス 11117

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複製欠損性組換えレトロウイルスベクターによる生存可能な造血細胞の形 質導入頻度を増大させる方法であって、生存可能な造血細胞に複製欠損性組換え レトロウイルスベクターを、レトロウイルスによる細胞形質導入を増大させるの に有効な実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフ ラグメントまたはその混合物の存在下で感染させ、これによりレトロウイルスベ クターによる造血細胞の形質導入頻度を増大させることを含む方法。 ２．造血細胞がタンパク質の欠損または異常を有し、かつ組換えレトロウイル スベクターが該タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む、請求項１に記載の 方法。 ３．外因性遺伝子がアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子である、請求 項２に記載の方法。 ４．外因性遺伝子がヒトアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子である、 請求項３に記載の方法。 ５．ＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与えるアミノ酸配列、およびヘパ リン−ＩＩドメインがもつレトロウイルス結合活性を与えるアミノ酸配列を含む フィブロネクチンフラグメントの存在下で、細胞にレトロウイルスベクターを感 染させる、請求項１に記載の方法。 ６．造血細胞がヒト幹細胞を含む、請求項１に記載の方法。 ７．造血細胞が付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有する、請求項６に 記載の方法。 ８．形質導入された造血細胞を調製する方法であって、 培養されている生存可能な造血細胞に複製欠損性組換えレトロウイルスを、固 定化されたフィブロネクチン、固定化されたフィブロネクチンフラグメント、ま たはその固定化された混合物の存在下で感染させて、形質導入された造血細胞を 得る ことを含む方法。 ９．形質導入された造血細胞を収穫することを含む、請求項８に記載の方法。 １０．造血細胞がタンパク質の欠損または異常を有し、かつ組換えレトロウイ ルスベクターが該タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む、請求項８に記載 の方法。 １１．造血細胞が酵素の欠損または異常を有し、かつ外因性遺伝子が該酵素を コードする遺伝子である、請求項８に記載の方法。 １２．造血細胞が酵素の欠損または異常を有するヒト造血細胞であり、かつ外 因性遺伝子が該酵素をコードするヒト遺伝子である、請求項１１に記載の方法。 １３．造血細胞がアデノシンデアミナーゼ欠損を有し、かつ外因性遺伝子がア デノシンデアミナーゼをコードする、請求項１１に記載の方法。 １４．ヒト造血細胞がアデノシンデアミナーゼ欠損を有し、かつ外因性遺伝子 がアデノシンデアミナーゼをコードする、請求項１２に記載の方法。 １５．ＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与えるアミノ酸配列、およびヘ パリン−ＩＩドメインがもつレトロウイルス結合活性を与えるアミノ酸配列を含 むフィブロネクチンフラグメントの存在下で、細胞にレトロウイルスを感染させ る、請求項１２に記載の方法。 １６．造血細胞がヒト幹細胞を含む、請求項１５に記載の方法。 １７．造血細胞が付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有する、請求項１ ６に記載の方法。 １８．改良された細胞移植方法であって、 ドナー動物から生存可能な造血細胞を採取し； 生存可能な造血細胞に外因性ＤＮＡを含む複製欠損性組換えレトロウイルスベ クターを感染させて、形質導入された造血細胞を調製し、その際、レトロウイル スベクターによる細胞形質導入効率を増大させるのに有効な固定化された量のフ ィブロネクチンおよび／またはそのフラグメントの存在下で感染を行い；そして 形質導入された生存可能な造血細胞をレシピエント動物に細胞移植体として装 入する 工程を含む方法。 １９．細胞移植がレシピエント動物における骨髄血障害の治療のためのもので ある、請求項１８に記載の方法。 ２０．細胞移植がレシピエント動物におけるタンパク質の欠損または異常の治 療のためのものである、請求項１８に記載の方法。 ２１．ドナー動物およびレシピエント動物がヒトである、請求項１９に記載の 方法。 ２２．レシピエント動物が自己ドナーである、請求項２１に記載の方法。 ２３．固定化されたフィブロネクチン、固定化されたフィブロネクチンフラグ メント、またはその固定化された混合物を含有する培地中における、生存可能な 造血細胞を含む、レトロウイルス仲介による遺伝子導入を行うのに適した細胞集 団。 ２４．固定化されたフィブロネクチン、固定化されたフィブロネクチンフラグ メント、またはその固定化された混合物を含有する、生存可能な造血細胞を維持 しうる培地。 ２５．固定化されたフィブロネクチン、固定化されたフィブロネクチンフラグ メント、またはその固定化された混合物の存在下でレトロウイルス仲介による遺 伝子導入により形質導入された、生存可能な造血細胞を含む細胞集団。 ２６．生存可能な造血細胞におけるレトロウイルス仲介による遺伝子導入を改 良する方法であって、レトロウイルス仲介による遺伝子導入を固定化されたフィ ブロネクチン、固定化されたフィブロネクチンフラグメント、またはその固定化 された混合物の存在下で行うことを含む方法。 ２７．造血細胞が哺乳動物幹細胞を含む、請求項２６に記載の方法。 ２８．複製欠損性組換えレトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入頻 度を増大させる方法であって、造血幹細胞を富化した生存可能な造血細胞の集団 に複製欠損性組換えレトロウイルスベクターを、レトロウイルスによる細胞形質 導入を増大させるのに有効な固定化された量の、フィブロネクチンのＣＳ−１ド メインがもつ細胞結合活性を与えるアミノ酸配列、およびヘパリン−ＩＩドメイ ンがもつレトロウイルス結合活性を与えるアミノ酸配列を含むポリペプチドの存 在下で感染させて、レトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入頻度を増 大させることを含む方法。 ２９．造血細胞がタンパク質の欠損または異常を有し、かつ組換えレトロウイ ルスベクターが該タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む、請求項２８に記 載の方法。 ３０．外因性遺伝子がアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子である、請 求項２９に記載の方法。 ３１．外因性遺伝子がヒトアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子である 、請求項３０に記載の方法。 ３２．造血細胞が付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有する、請求項２ ９に記載の方法。 ３３．下記の両方を含むポリペプチドの存在下で感染を行う、請求項２８に記 載の方法： （ｉ）次式で表される第１アミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列； および（ｉｉ）次式で表される第２アミノ酸配列： または未発達の造血細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸 配列。 ３４．レトロウイルス産生細胞の不在下での、かつ固定化された量の、（ｉ） フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメインがもつレトロウイルス結合活性を与 える第１アミノ酸配列および（ｉｉ）フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインがも つ細胞結合活性を与える第２アミノ酸配列を含むポリペプチドの存在下でのレト ロウイルス仲介による遺伝子導入により形質導入された生存可能な造血細胞を含 み、その際、固定化された量のポリペプチドがレトロウイルスベクターによる造 血細胞の形質導入頻度を増大させるのに有効である、細胞集団。 ３５．造血幹細胞を富化した、請求項３４に記載の細胞集団。 ３６．生存可能な造血細胞が、ヒト造血幹細胞を富化したヒト造血細胞である 、請求項３５に記載の細胞集団。 ３７．付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有するヒト造血細胞の実質的 に均一な集団である、請求項３６に記載の細胞集団。 ３８．細胞におけるタンパク質の欠損または異常を適正化するための外因性遺 伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入された、請求項３６に 記載の細胞集団。 ３９．細胞におけるアデノシンデアミナーゼ欠損を適正化するためのヒトアデ ノシンデアミナーゼ遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入 された、請求項３８に記載の細胞集団。 ４０．細胞移植方法であって、 レトロウイルス産生細胞の不在下での、かつ固定化された量の、（ｉ）フィブ ロネクチンのヘパリン−ＩＩドメインがもつレトロウイルス結合活性を与える第 １アミノ酸配列および（ｉｉ）フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインがもつ細胞 結合活性を与える第２アミノ酸配列を含むポリペプチドの存在下でのレトロウイ ルス仲介による遺伝子導入により形質導入された生存可能な造血細胞を細胞移植 体として動物に装入することを含み、その際、固定化された量のポリペプチドが レトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入頻度を増大させるのに有効で ある方法。 ４１．生存可能な造血細胞が造血幹細胞を富化されたものである、請求項４０ に記載の細胞移植方法。 ４２．生存可能な造血細胞が、ヒト造血幹細胞を富化したヒト造血細胞である 、請求項４１に記載の細胞移植方法。 ４３．造血細胞が、付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有するヒト造血 細胞の実質的に均一な集団である、請求項４２に記載の細胞移植方法。 ４４．造血細胞が、細胞におけるタンパク質の欠損または異常を適正化するた めの外因性遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入されたも のである、請求項４２に記載の細胞移植方法。 ４５．造血細胞が、細胞におけるアデノシンデアミナーゼ欠損を適正化するた めのヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターに より形質導入されたものである、請求項４４に記載の細胞移植方法。 ４６．細胞移植方法に適した形質導入された臍帯血細胞を得る方法であって、 臍帯血由来の生存可能な造血細胞に複製欠損性組換えレトロウイルスベクター を、有効な固定化された量の、（ｉ）フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメイ ンがもつレトロウイルス結合活性を与える第１アミノ酸配列および（ｉｉ）フィ ブロネクチンのＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与える第２アミノ酸配列 を含むポリペプチドの存在下で感染させることを含み、その際、固定化された量 のポリペプチドが組換えレトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入頻度 を増大させるのに有効である方法。 ４７．造血細胞が、造血幹細胞を富化した臍帯血由来のヒト造血細胞である、 請求項４６に記載の方法。 ４８．造血細胞が、付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有する臍帯血由 来のヒト造血細胞の実質的に均一な集団である、請求項４７に記載の方法。 ４９．造血細胞がタンパク質の欠損または異常を有し、かつ組換えレトロウイ ルスベクターが該タンパク質をコードするヒト遺伝子を含む、請求項４７に記載 の方法。 ５０．外因性遺伝子がアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子である、請 求項４９に記載の方法。 ５１．固定化された量の、（ｉ）フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメイン がもつレトロウイルス結合活性を与える第１アミノ酸配列および（ｉｉ）フィブ ロネクチンのＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与える第２アミノ酸配列を 含むポリペプチドの存在下でのレトロウイルス仲介による遺伝子導入により形質 導入された生存可能な臍帯血由来の造血細胞を含み、その際、固定化された量の ポリペプチドがレトロウイルスベクターによる臍帯血由来の造血細胞の形質導入 頻度を増大させるのに有効である、細胞集団。 ５２．造血幹細胞がヒト臍帯血由来のヒト造血細胞である、請求項５１に記載 の細胞集団。 ５３．臍帯血由来のヒト造血幹細胞を富化した、請求項５２に記載の細胞集団 。 ５４．付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有するヒト造血細胞の実質的 に均一な集団である、請求項５３に記載の細胞集団。 ５５．細胞におけるタンパク質の欠損または異常を適正化するための外因性遺 伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入された、請求項５３に 記載の細胞集団。 ５６．細胞におけるアデノシンデアミナーゼ欠損を適正化するためのヒトアデ ノシンデアミナーゼ遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入 された、請求項５５に記載の細胞集団。 ５７．細胞移植方法であって、 固定化された量の、（ｉ）フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメインがもつ レトロウイルス結合活性を与える第１アミノ酸配列および（ｉｉ）フィブロネク チンのＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与える第２アミノ酸配列を含むポ リペプチドの存在下でのレトロウイルス仲介による遺伝子導入により形質導入さ れた生存可能な臍帯血由来の造血細胞を細胞移植体として動物に装入することを 含み、その際、固定化された量のポリペプチドがレトロウイルスベクターによる 臍帯幹細胞の形質導入頻度を増大させるのに有効である方法。 ５８．動物がヒトであり、かつ造血細胞がヒト造血幹細胞を富化したヒト造血 細胞である、請求項５７に記載の細胞移植方法。 ５９．造血細胞が、付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有するヒト造血 細胞の実質的に均一な集団である、請求項５８に記載の細胞移植方法。 ６０．造血細胞が、細胞におけるタンパク質の欠損または異常を適正化するた めの外因性遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入されたも のである、請求項５８に記載の細胞移植方法。 ６１．造血細胞が、細胞におけるアデノシンデアミナーゼ欠損を適正化するた めのヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターに より形質導入されたものである、請求項６０に記載の細胞移植方法。 ６２．複製欠損性組換えレトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入頻 度を増大させる方法であって、造血細胞に複製欠損性組換えレトロウイルスベク ターを、有効な固定化された量の、下記を含む組換えポリペプチドの存在下で感 染させる方法： 次式で表される第１アミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列； および次式で表される第２アミノ酸配列： または未発達の造血細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸 配列。 ６３．造血細胞がタンパク質の欠損または異常を有し、かつ組換えレトロウイ ルスベクターがタンパク質をコードする外因性遺伝子を含む、請求項６２に記載 の方法。 ６４．外因性遺伝子がアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子である、請 求項６３に記載の方法。 ６５．外因性遺伝子がヒトアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子である 、請求項６４に記載の方法。 ６６．造血細胞がヒト幹細胞を含み、かつ外因性遺伝子がヒト遺伝子である、 請求項６３に記載の方法。 ６７．造血細胞が、付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有する、請求項 ６６に記載の方法。 ６８．レトロウイルス産生細胞の不在下での、かつ造血細胞の形質導入頻度を 増大させる有効な固定化された量の組換えポリペプチドの存在下でのレトロウイ ルス仲介による遺伝子導入により形質導入された生存可能な造血細胞を含み、そ の際、組換えポリペプチドが下記を含むものである細胞集団： 次式で表される第１アミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列； および次式で表される第２アミノ酸配列： または未発達の造血細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸 配列。 ６９．造血幹細胞を富化した、請求項６８に記載の細胞集団。 ７０．生存可能な造血細胞が、ヒト造血幹細胞を富化したヒト造血細胞である 、請求項６９に記載の細胞集団。 ７１．付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有するヒト造血細胞の実質的 に均一な集団である、請求項７０に記載の細胞集団。 ７２．細胞におけるタンパク質の欠損または異常を適正化するための外因性遺 伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入された、請求項７０に 記載の細胞集団。 ７３．細胞におけるアデノシンデアミナーゼ欠損を適正化するためのヒトアデ ノシンデアミナーゼ遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入 された、請求項７２に記載の細胞集団。 ７４．細胞移植方法であって、 レトロウイルス産生細胞の不在下での、かつ造血細胞の形質導入頻度を増大さ せる有効な固定化された量の組換えポリペプチドの存在下でのレトロウイルス仲 介による遺伝子導入により形質導入された生存可能な造血細胞を細胞移植体とし て動物に装入することを含み、その際、組換えポリペプチドが下記を含むもので ある方法： 次式で表される第１アミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列； および次式で表される第２アミノ酸配列： または未発達の造血細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸 配列。 ７５．生存可能な造血細胞が造血幹細胞を富化されたものである、請求項７４ に記載の細胞移植方法。 ７６．生存可能な造血細胞がヒト造血幹細胞を富化したヒト造血細胞である、 請求項７５に記載の細胞移植方法。 ７７．造血細胞が、付着陰性の低密度単核細胞としての性質を有するヒト造血 細胞の実質的に均一な集団である、請求項７６に記載の細胞移植方法。 ７８．造血細胞が、細胞におけるタンパク質の欠損または異常を適正化するた めの外因性遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入されたも のである、請求項７６に記載の細胞移植方法。 ７９．造血細胞が、細胞におけるアデノシンデアミナーゼ欠損を適正化するた めのヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子を含む組換えレトロウイルスベクターに より形質導入されたものである、請求項７８に記載の細胞移植方法。 ８０．レトロウイルスを局在化させる方法であって、 レトロウイルスを含有する培地を、有効な固定化された量の、フィブロネクチ ンのヘパリン−ＩＩドメインがもつレトロウイルス結合活性を与えるアミノ酸配 列を含むポリペプチドと接触させた状態でインキュベートする ことを含む方法。 ８１．ポリペプチドが下記を含む、請求項８０に記載の方法： 次式で表されるアミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列。 ８２．予め定められた標的細胞へのレトロウイルス仲介によるＤＮＡ導入を増 強するのに有用な構築体を形成する方法であって、 標的細胞に特異的に結合するリガンドを選択し；そして 該リガンドを、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメインがもつレトロウイ ルス結合活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに共有結合させる ことを含む方法。 ８３．リガンドが細胞付着性のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、モノク ローナル抗体、炭水化物、代謝産物、またはフィブロネクチン以外のタンパク質 に由来するポリペプチドである、請求項８２に記載の方法。 ８４．標的細胞が悪性細胞であり、かつリガンドがホルモンである、請求項８ ３に記載の方法。 ８５．標的細胞が乳がん細胞であり、かつリガンドが黄体形成ホルモン放出ホ ルモン、エストロゲン、プロゲストーゲンまたはアンチプロゲストーゲンである 、請求項８４に記載の方法。 ８６．レトロウイルスによる生存可能な標的細胞集団の形質導入頻度を増大さ せる方法であって、有効な固定化された量の、レトロウイルスを結合するポリペ プチドに共有結合した細胞に特異的に結合するリガンドを有する構築体の存在下 で、細胞にレトロウイルスを感染させることを含み、該ポリペプチドがフィブロ ネクチンのヘパリン−ＩＩドメインがもつレトロウイルス結合活性を示すアミノ 酸配列を含むものである方法。 ８７．リガンドが細胞付着性のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、モノク ローナル抗体、炭水化物、代謝産物、またはフィブロネクチン以外のタンパク質 に由来するポリペプチドである、請求項８６に記載の方法。 ８８．ポリペプチドが下記を有する組換えポリペプチドである、請求項８６に 記載の方法： 次式で表されるアミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列。 ８９．予め定められた標的細胞へのレトロウイルス仲介による遺伝子導入を増 強するための構築体であって、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメインがも つレトロウイルス結合活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに共有結合し た標的細胞に特異的に結合するリガンドを含む構築体。 ９０．ポリペプチドが下記を有する組換えポリペプチドである、請求項８６に 記載の構築体： 次式で表されるアミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列。 ９１．リガンドが細胞付着性のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、モノク ローナル抗体、炭水化物、代謝産物、またはフィブロネクチン以外のタンパク質 に由来するポリペプチドである、請求項９０に記載の構築体。 ９２．ヒト造血細胞へのレトロウイルス仲介によるＤＮＡ導入を行う際に使用 する、下記を含むキット： （ａ）（ｉ）ヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩドメインがもつレトロウ イルス結合活性を与える第１アミノ酸配列および（ｉｉ）ヒトフィブロネクチン のＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を与える第２アミノ酸配列を含む、実質 的に純粋なポリペプチド； （ｂ）その上でレトロウイルスベクターをヒト造血細胞と接触した状態でイン キュベートするための人工支持体；ならびに （ｃ）造血細胞を予備刺激するための造血細胞成長因子。 ９３．実質的に純粋なポリペプチドが人工支持体上に固定化された、請求項９ ０に記載のキット。 ９４．下記をも含む、請求項９０に記載のキット： （ｄ）ヒト造血細胞に形質導入するための組換えレトロウイルスベクター。 ９５．実質的に純粋なポリペプチド（ａ）が下記を有する組換えポリペプチド を含む、請求項９０に記載のキット： 次式で表されるアミノ酸配列： またはレトロウイルスの結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸配 列。 ９６．実質的に純粋なポリペプチドが人工支持体上に固定化された、請求項９ ５に記載のキット。 ９７．下記をも含む、請求項９６に記載のキット： （ｄ）ヒト造血細胞に形質導入するための組換えレトロウイルスベクター。 ９８．生存可能な未発達の造血細胞集団の調製方法であって、生存可能な未発 達の造血細胞を含有する細胞集団を、有効な固定化された量の、フィブロネクチ ンのＣＳ−１ドメインがもつ細胞結合活性を示すポリペプチドと接触させて、未 発達の造血細胞を固定化された量の該ポリペプチドに結合させることを含む方法 。 ９９．ポリペプチドが下記を有する、請求項９８に記載の方法： 次式で表されるアミノ酸配列： または未発達の造血細胞の結合能を示すのに十分なほどこれと類似するアミノ酸 配列。