CN101663397B - 用于基因治疗的载体 - Google Patents

Abstract

公开了逆转录病毒载体，其包含转录单位，所述转录单位包含：转录调节序列；和编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因，其这样放置，从而使得转录单位的表达可以由调节序列调节。在逆转录病毒载体中，单位这样放置，从而使得来自单位的mRNA的转录方向与逆转录病毒载体的RNA基因组的转录方向相反。通过使用具有如上所述结构的载体，可以制备具有高基因转染效率的病毒上清液。逆转录病毒载体对于治疗或预防癌症或病毒感染有用。

Description

用于基因治疗的载体

技术领域

本发明涉及使用具有核糖核酸内切酶活性的多肽在治疗或预防疾病中有用的核酸构建体。 

背景技术

基因治疗已作为治疗方法开发用来治疗或预防由细胞中的“遗传信息中的错误”引起的疾病(包括遗传疾病和癌症)，这借助于添加正确的遗传信息以修饰细胞的功能，或通过引入在细胞中固有地不存在的新型“保护基因”来实现。 

目前，除上述方面外，详尽研究了编码显示出细胞毒性活性的产物的基因的利用，以用于选择性清除对于活生物有害的细胞(例如癌细胞和由病原微生物感染的细胞)的目的。例如，在靶细胞中表达疱疹病毒胸苷激酶基因随后给活生物施用无毒的前体药物(丙氧鸟苷)，导致前体药物的靶细胞特异性活化，从而导致由于药物的细胞毒性的靶细胞破坏。 

由原核毒素-抗毒素基因编码的毒素称为显示出细胞毒性活性的多肽。已知MazF——mazE-mazF系统的毒素(非专利文件1)和PemK——pemI-pemK系统的毒素(非专利文件2)，具有识别特定核苷酸序列的单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性，并且已提出使用这些毒素以治疗增生性疾病(专利文件1)。 

人免疫缺陷病毒(HIV)感染表达CD4分子的细胞，例如T细胞。这导致由HIV感染的人中CD4阳性T细胞(辅助T细胞)计数中的减少和细胞免疫中的降低，最终导致严重的免疫缺陷，这导致机会感染例如卡氏(Carinii)肺炎的出现。这个疾病阶段称为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。 

已开发了干扰HIV的生活史的抗病毒剂(例如逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂)和疫苗用于治疗HIV感染，并且几种抗病毒剂已投入实践使用。然而，它们不一定被视为特效药的完全集合，因为对这些试剂有抵抗力的突变体可能在由HIV感染的个体中出现，这具有高突变率。仍 未完成作为另一种方法的开发用于抑制HIV增殖的基因治疗试剂的尝试，所述方法使用核酸例如RNA诱饵和核酶，或蛋白质例如反式显性突变蛋白质和细胞内抗体作为活性成分。 

此外，已考虑了用于引起HIV感染细胞特异性的细胞死亡的方法(例如专利文件2，非专利文件3、4和5)。这些方法尝试使编码细胞毒性产物的基因连接在衍生自HIV的LTR启动子下游。然而，迄今，不存在这些方法的已知临床应用。 

专利文件3公开了单链RNA特异性核糖核酸内切酶作为如上所述的细胞毒性产物的使用。这种方法以依赖Tat蛋白质(与HIV感染结合表达的蛋白质)的方式诱导单链RNA特异性核糖核酸内切酶的表达，且因此导致在具有HIV基因组的细胞中单链RNA的降解。这导致抑制HIV在细胞中的复制和出芽。当Tat蛋白质的表达由HIV衍生的RNA降解终止，并且表达的Tat蛋白质从细胞中清除时，核糖核酸内切酶表达终止。在这个过程期间，核糖体和tRNA在细胞中保持完整，并且一旦核糖核酸内切酶表达终止，就恢复正常的蛋白质合成。因此，在这个时间点时仍未被破坏的细胞恢复增殖。同样，尽管这种方法具有不导致CD4阳性T细胞中的过量减少的优点，但当载体的构建不充分时，可能无法以足够的效率将核糖核酸内切酶基因引入细胞内。 

专利文件1：WO 2004/113498 

专利文件2：美国专利号5,554,528 

专利文件3：WO 2007/020873 

非专利文件1：Molecular Cell，12：913-920(2003) 

非专利文件2：J.Biol.Chem.，279：20678-20684(2004) 

非专利文件3：Hum.Gene Therapy，2：53-61(1991) 

非专利文件4：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：365-369(1994) 

非专利文件5：Hum.Gene Therapy，10：103-112(1999) 

发明内容

由本发明解决的问题 

考虑到前述现有技术，已进行了本发明。本发明的目的是提供使用核糖核酸内切酶用于治疗和/或预防疾病的更有效方法。 

用于解决问题的方法 

本发明人研究了用于表达具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的逆转录病毒载体的构建，其可以用于治疗和/或预防多种疾病，包括例如癌症和病毒感染。因此，本发明人已发现如果将用于转录编码多肽的基因的单位以相对于逆转录病毒载体的RNA基因组的转录方向的相反方向置于逆转录病毒载体中，那么可以获得可以达到特别高度有效的基因转移到细胞内的逆转录病毒载体，从而完成了本发明。 

更具体而言，本发明涉及： 

包含转录单位的逆转录病毒载体，所述转录单位包含转录调节序列和编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因，所述基因这样放置，从而使得它的表达可以由调节序列控制，其中所述单位这样放置，从而使得来自单位的mRNA的转录方向与逆转录病毒载体的RNA基因组的转录方向相反； 

根据[1]的逆转录病毒载体，其中转录调节序列是用于控制在癌细胞或病毒感染细胞中特异性表达的基因转录的序列； 

根据[1]的逆转录病毒载体，其中转录调节序列是这样的序列，从而使得转录由癌细胞或病毒起源的反式作用因子诱导； 

根据[3]的逆转录病毒载体，其中转录调节序列是这样的序列，从而使得转录由免疫缺陷病毒的反式作用因子诱导； 

根据[4]的逆转录病毒载体，其包含这样的转录调节序列，从而使得转录由Tat蛋白质和/或Rev蛋白质诱导； 

根据[4]的逆转录病毒载体，其中编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因置于免疫缺陷病毒的LTR的下游； 

根据[1]的逆转录病毒载体，其中转录调节序列是这样的序列，从而使得转录由人工供应到细胞内的反式作用因子诱导； 

根据[1]-[7]中任一项的逆转录病毒载体，其中具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽是MazF蛋白质； 

用于治疗或预防疾病的方法，其包括将根据[1]-[8]中任一项的逆转录病毒载体引入细胞内； 

根据[9]的方法，其中疾病是癌症或病毒感染； 

根据[9]的方法，其中疾病是免疫缺陷病毒感染； 

疾病的治疗或预防试剂，其包括根据[1]-[8]中任一项的逆转录病毒载体作为有效组分； 

根据[12]的治疗或预防试剂，其用于治疗或预防癌症或病毒感染；和 

根据[13]的治疗或预防试剂，其用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染。 

发明效果 

根据本发明，提供了对于基因治疗高度有效的逆转录病毒载体，所述基因治疗利用单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性在细胞中的表达。逆转录病毒载体对于治疗和/或预防癌症和病毒感染特别是RNA病毒感染有用。 

附图说明

图1举例说明了pMT-HLTR-MazF-PL的构建。 

图2举例说明了pMTD3-U3TAR-MazF-PL的构建。 

图3举例说明了由HIV感染和未由HIV感染的细胞数目的直方图。 

具体实施方式

如本文所使用的，术语“单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性”指在单链核酸中的核糖核苷酸的3′侧水解磷酸二酯键的活性，所述单链核酸包含至少一个核糖核苷酸分子作为组成成分核苷酸。由这种活性水解的核酸形成具有羟基的3′末端和具有磷酸基的5′末端，具有磷酸基的3′末端和具有羟基的5′末端，或具有2′，3′-环磷酸和羟基的5′末端。不能切割双链体核酸例如双链RNAs或RNA-DNA杂交体的任何多肽都可以在本发明中使用，尽管本发明并不具体限于其。考虑到其为单链RNA的HIV基因组的有效降解，上述底物特异性适合于本发明。具有以核苷酸序列特异性方式切割RNA的活性的那些和能够以核糖体不依赖性方式降解mRNA的那些特别优选用于在本发明中使用。具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽(下文有时称为单链RNA特异性核糖核酸内切酶)的例子包括称为mRNA干扰酶(interferase)的酶，例如下文描述的MazF和PemK(WO 2004/113498)。 

具有以序列特异性和核糖体不依赖性方式降解单链RNA的活性的在本发明中使用的多肽可以是例如具有微生物起源的那些，尽管本发明 并不具体限于其。在此种情况下，编码上述多肽的基因可以从微生物基因组或质粒中分离。例如，在本发明中，可以使用编码核糖核酸内切酶MazF和PemK的基因，所述MazF和PemK是毒素-抗毒素系统的组成成分毒素，并且分别在Molecular Cell，12：913-920(2003)和J.Biol.Chem.，279：20678-20684(2004)中描述。MazF是切割单链RNA中的序列5′-A/CA-3′的酶，并且PemK是主要切割序列5′-U/A(C、A或U)-3的酶。还可能从已知数据库中选择编码对于MazF或PemK氨基酸序列高度同源的氨基酸序列的基因，以分离这个且在本发明中使用它。具有上述活性的多肽已在大量微生物中发现，包括蓝绿藻和古细菌(archae)(WO 2006/123537、WO 2007/010740、WO 2007/013264、WO 2007/013265等)。优选地，在本发明中使用编码MazF的基因。MazF的氨基酸序列在序列表中显示为SEQ ID NO.1。 

上述核糖核酸内切酶，毒素-抗毒素系统的组成成分毒素适合于在本发明中使用，因为它们不被任何胞质核糖核酸酶抑制剂例如人胎盘核糖核酸酶抑制剂抑制(WO 2004/113498)。如果核糖核酸内切酶持续表达，那么新蛋白质合成不在细胞中发生，从而导致细胞生长抑制随后为诱导的细胞死亡。此外，病毒组分蛋白质的合成在病毒感染的细胞中被阻断，并且病毒的复制或出芽不发生。因此，本发明的逆转录病毒载体允许从活生物中清除癌细胞或病毒感染细胞。具体地，在由RNA病毒感染的细胞中，病毒基因组自身由上述核糖核酸内切酶降解。 

本发明的逆转录病毒载体是包含转录单位的那种，所述转录单位包含转录调节序列和编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因，所述基因这样放置，从而使得它的表达可以由调节序列控制，并且特征在于所述单位这样放置，从而使得来自单位的mRNA的转录方向与逆转录病毒载体的RNA基因组的转录方向相反。 

如本文所使用的，术语“转录调节序列”指能够控制连接在其下游的基因转录的核酸序列。转录调节序列的例子包括以由特定反式作用因子的结合/解离介导的开/关方式控制转录的启动子，尽管本发明并不具体限于其。通过将核酸插入任何启动子和目的基因之间的位点内，位于衍生自P1噬菌体的loxP序列之间的核酸可以用作Cre重组酶可诱导的转录调节序列。 

在本发明中，可以使用控制在癌细胞或由致病微生物感染的细胞中 特异性表达的基因转录的任何序列(启动子)，以及控制由癌细胞或由致病微生物感染的细胞中特异性存在的反式作用因子诱导的转录的任何序列。此外，通过将反式作用因子人工供应到细胞内的组合，可以使用其转录由反式作用因子诱导的任何转录调节序列。如上所述的“其转录由反式作用因子诱导的转录调节序列”可以是这样的序列，其具有固有地能够与因子相互作用的区域，或可以是具有能够与因子相互作用的区域的序列和具有转录活性的另一种独立序列的人工组合。 

关于在癌细胞中特异性表达的基因的转录调节序列的例子包括肿瘤特异性启动子(源于AFP、CEA、PSA、中期因子(midkine)、端粒末端转移酶、MAGE、酪氨酸酶、IAI.3B等基因的启动子)。此外，在病毒感染细胞中特异性存在的反式作用因子的例子包括人免疫缺陷病毒起源的Tat蛋白质和Rev蛋白质。Tat和Rev蛋白质诱导分别在TAR(反式激活应答元件)序列和RRE(Rev反应元件)序列控制下的基因转录。 

在其中反式激活因子人工供应到细胞内的方面，优选使用正常在细胞中不显示转录诱导活性的转录调节序列。因为此种序列允许仅当供应反式激活因子时位于其下游的基因转录，所以在靶细胞中达到目的基因(即编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因)的选择性表达。反式激活因子供应到细胞内可以这样来达到：使用用于将因子直接引入细胞内的方法，或借助于合适的辅助试剂，或通过使用用于将编码因子的基因引入细胞内的任何众所周知的方法将因子引入细胞内。 

如上所述，本发明的逆转录病毒载体对于从活生物中清除癌细胞和/或病毒感染细胞有用。当单链RNA特异性核糖核酸内切酶在由RNA病毒感染的细胞中表达时，由病毒复制产生的病毒的基因组RNA由上述多肽切割，从而抑制病毒复制。因此，本发明的逆转录病毒载体特别用于治疗和/或预防RNA病毒感染，例如由逆转录病毒(例如人T嗜淋巴细胞病毒)、慢病毒(例如免疫缺陷病毒)、黄病毒(例如丙型肝炎病毒和日本脑炎病毒)、布尼亚病毒(例如汉坦病毒)、流感病毒和冠状病毒(例如SARS)引起的感染。 

作为本发明的一个方面，例示了包含转录单位的逆转录病毒载体，所述转录单位包含其为转录由免疫缺陷病毒起源的反式作用因子诱导 的此种序列的转录调节序列，和编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因，所述基因这样放置，从而使得表达可以由转录调节序列控制。此种逆转录病毒载体对于治疗和/或预防免疫缺陷病毒感染有用。 

在下文中，将详细描述这个方面。 

如本文所使用的，术语“免疫缺陷病毒”指通过感染和破坏免疫细胞来引起获得性免疫缺陷的病毒。免疫缺陷病毒的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。此外，通过使不同免疫缺陷病毒基因组相组合形成的嵌合体病毒也包括在本文描述的“免疫缺陷病毒”中。此种嵌合体病毒的例子包括猴/人免疫缺陷病毒(SHIV)。 

此外，如本文所使用的，免疫缺陷病毒感染指其中获得性免疫缺陷由上述免疫缺陷病毒引起的病理学状况。 

尽管转录由免疫缺陷病毒起源的反式作用因子利用其诱导的转录调节序列并无具体限制，但可以使用转录由免疫缺陷病毒起源的Tat蛋白质利用其诱导的转录调节序列。此种序列优选是转录由源于免疫缺陷病毒例如HIV的Tat蛋白质利用其诱导的转录序列。因为Tat蛋白质与RNA中存在的TAR(反式激活应答元件)序列结合，所述RNA的转录通过免疫缺陷病毒的LTR启动子的作用起始，以激活其下游序列的转录，所以在本发明中可以使用具有转录起始位点下游的TAR区域的核苷酸序列的转录调节序列。待使用的特别优选的转录调节序列是待治疗或预防的免疫缺陷病毒(例如HIV)的LTR，或适当修饰的LTR。修饰的例子包括在启动子中宿主细胞起源的转录因子结合位点的缺失，和Tat蛋白质特异性转录不需要的区域的缺失。前面一种修饰允许通过源于宿主细胞的转录因子的转录水平中的减少，这与由免疫缺陷病毒例如HIV的感染无关。转录调节序列中的此种修饰例如在非专利文件2中描述。此外，后面一种修饰的例子包括U5区域或LTR中的TAR序列下游的区域(R区域和U5区域的部分)的缺失。 

此外，已知免疫缺陷病毒基因组中存在的RRE(Rev反应元件)通过与Rev蛋白质相互作用增强蛋白质表达，所述Rev蛋白质是免疫缺陷病毒起源的反式作用因子(非专利文件3)。进一步已知尽管在不存在Rev蛋白质的情况下，在gag和pol基因内存在的称为INS的区域抑制 免疫缺陷病毒mRNA的转录，但这种抑制通过RRE和Rev蛋白质之间的相互作用而去除(J.Virol.，66：7176-7182(1992))。因此，这些转录调节序列整合入编码外来多肽的基因的3′末端区域内允许以Rev蛋白质依赖性或免疫缺陷病毒感染依赖性方式表达由核酸编码的多肽。 

与免疫缺陷病毒起源的反式作用因子相互作用的上述序列可以与反式作用序列固有地整合入其内的功能序列(例如启动子)组合使用，或与异源功能序列组合使用。例如通过使能够在所需细胞中起始mRNA转录且不源于免疫缺陷病毒的启动子与上述序列组合构建的序列包括在本发明中使用的“转录调节序列”中。 

上述核糖核酸内切酶不降解作为核糖体的组成成分的rRNA或折叠成高级结构的tRNA。因此，如果编码上述酶的基因置于转录由免疫缺陷病毒起源的反式作用因子利用其诱导的转录调节序列的控制下，那么在本发明的逆转录病毒载体引入其内的细胞中降解且消除RNA病毒的RNA，从而导致细胞中的内切核酸酶表达终止，这允许细胞恢复增殖潜力。其中病毒复制被抑制的细胞保留其增殖潜力，即使例如免疫缺陷病毒作为原病毒整合到细胞的染色体内。核糖核酸内切酶的使用是有利的，因为可以阻止免疫缺陷病毒的复制和免疫缺陷病的发作，而不减少活生物中的T细胞数目。 

其为毒素-抗毒素系统的组成成分毒素的核糖核酸内切酶通过识别长度约3-7个核苷酸的短核苷酸序列切割单链RNA。因此，如果核糖核酸内切酶在细胞中表达，那么大多数细胞mRNAs被降解，从而抑制细胞中的蛋白质合成和细胞生长。核糖核酸内切酶还切割免疫缺陷病毒基因组RNA，并且也阻止上述病毒(例如HIV)的复制和细胞外释放(出芽)。此外，由免疫缺陷病毒基因组编码的多肽的表达也被抑制，这阻止例如细胞外释放的Tat蛋白质诱导未受免疫缺陷病毒感染的细胞的凋亡。 

对于免疫缺陷病毒感染的治疗或预防，希望将如在本发明中使用的基因引入潜在由免疫缺陷病毒感染的细胞内，所述基因编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽，所述细胞例如人和灵长类动物中的细胞(或细胞群体)，包括CD4阳性细胞。因此，在本发明中，执行靶向CD4-阳性细胞(例如T细胞)、能够分化成CD4-阳性细胞的前体细胞(例如造血干细胞)或包含这些细胞的细胞群体的基因转移。从 进行基因全面转移到潜在由免疫缺陷病毒感染的细胞内的观点来看，优选靶向造血干细胞或包含在本发明中的这些细胞的细胞群体。上述细胞并无具体限制，只要它们包含CD4-阳性细胞或其前体细胞。其的例子包括由个体收集的血细胞(外周血细胞、脐带血细胞)和骨髓细胞，或CD4-阳性细胞、CD4阳性细胞的前体细胞、和通过已知方法由上述细胞分级分离的造血干细胞。 

如上所述，本发明用于产生用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染的细胞，且用于产生包含细胞的细胞组合物。此外，本发明提供了使用细胞用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染的方法。具体地，引入本发明的逆转录病毒载体的细胞施用于个体可以减少个体中免疫缺陷病毒感染细胞的比率，或对个体赋予针对免疫缺陷病毒感染的抗性。上述细胞和包含细胞的细胞组合物对于治疗或预防特别地HIV感染或AIDS有用。 

在由引入本发明的逆转录病毒载体的CD4-阳性细胞或引入本发明的逆转录病毒载体的CD4-阳性细胞的前体细胞(例如造血干细胞)分化的CD4-阳性细胞中，在细胞中由免疫缺陷病毒感染和源于免疫缺陷病毒的反式作用因子的后续形成后，诱导置于转录调节序列下游的编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因的表达。因此，所产生的多肽降解细胞中的mRNAs，从而抑制蛋白质生物合成。在这个过程期间，还对通过复制过程形成的RNA基因组实施降解。因此，由于由免疫缺陷病毒基因组编码的多肽的翻译和免疫缺陷病毒基因组的复制都被抑制，所以新传染性免疫缺陷病毒颗粒的产生和其他细胞的感染将得到阻止。此外，如果引入本发明的逆转录病毒载体的细胞通过与其中细胞外产生免疫缺陷病毒的免疫缺陷病毒感染的细胞混合进行培养，那么引入本发明的逆转录病毒载体的细胞数目将增加，而载体未引入其内的细胞数目将减少。因此，免疫缺陷病毒产生细胞的比率将减少。 

本发明进一步提供了用于治疗和/或预防免疫缺陷病毒感染的方法，其包括使用上述药物。本发明的治疗方法可以单独或与多药疗法(HAART)组合进行，所述多药疗法包括3-4种不同抗病毒药物(例如逆转录抑制剂和蛋白酶抑制剂)的组合使用。 

本发明的逆转录病毒载体包含这样的核酸，其中编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因与上述转录调节序列连接，所 述基因这样放置，从而使得表达可以由调节序列控制，即单链RNA特异性核糖核酸内切酶转录单位。在本发明中，转录单位这样放置，从而使得来自单位的mRNA的转录方向与逆转录病毒载体的RNA基因组的转录方向相反。 

逆转录病毒是单链RNA病毒，其中基因组5′-LTR、包装信号、gag、pol和env基因、以及3′-LTR以5′到3′的顺序作为主要元件发现。在这些元件中，5′-LTR、包装信号和3′-LTR对于逆转录病毒载体是必需的。在用于将外源基因引入细胞内的逆转录病毒载体中，通常，基因例如gag、pol和env被缺失并且代替地插入所需基因。一般而言，目的基因以与病毒基因组的转录方向相同的方向插入逆转录病毒载体内，并且目的基因由5′-LTR启动子或插入目的基因上游的内部启动子转录。然而，当单链RNA特异性核糖核酸内切酶基因以与逆转录病毒基因组的转录方向相同的方向插入时，核糖核酸内切酶基因由逆转录病毒mRNA表达，并且因为核糖核酸内切酶破坏病毒基因组RNA(mRNA)，所以不能预期逆转录病毒载体的高滴度生产。 

在本发明中，单链RNA特异性核糖核酸内切酶转录单位置于与逆转录病毒载体中的RNA基因组的转录方向相反的方向。即，由转录单位的转录调节序列起始的转录方向与由逆转录病毒载体的5′-LTR起始的转录方向相反。因此，这意味着逆转录病毒mRNA等价于核糖核酸内切酶基因的反义链，并且核糖核酸内切酶将决不由这种mRNA表达。此外，即使核糖核酸内切酶mRNA的弱转录可能由于转录调节序列的性质而发生，核糖核酸内切酶的表达也将被抑制，因为逆转录病毒mRNA充当反义RNA。 

在本发明中使用的逆转录病毒载体并无具体限制。从阻止不受限制的感染或基因转移的观点来看，复制缺陷型逆转录病毒载体优选用于本发明。该载体缺乏在受感染细胞中自主复制的能力且因此是不致病的。该载体可以进入宿主细胞例如脊椎动物细胞特别是哺乳动物细胞内，以使插入载体内的外来基因稳定整合到细胞的染色体DNA内。已知的复制缺陷型逆转录病毒载体的例子包括逆转录病毒载体，例如MFG和α-SGC载体(WO 92/07943)、pBabe(Nucleic Acids Research，18：3587-3596(1990))、pLXIN(Takara Bio Inc.)或pDON-AI(Takara BioInc.))、慢病毒载体及其修饰。慢病毒载体的例子包括但不具体限于， 人免疫缺陷病毒(HIV)衍生的载体(具有野生型LTR的HIV载体(例如美国专利号5,665,577)和具有经修饰的LTR的HIV载体(例如pLenti6/V5，Invitrogen Corporation))、和猴免疫缺陷病毒(SIV)起源的载体(例如Human Gene Therapy，11：1863-1874(2000))。 

本发明的逆转录病毒载体可以这样构建：通过从上述逆转录病毒载体中选择合适的载体，并且将单链RNA特异性核糖核酸内切酶转录单位装载到载体上。所构建的逆转录病毒载体的制备方法并无具体限制，并且它可以通过培养引入所构建的逆转录病毒载体的逆转录病毒生产细胞且收集培养上清液来获得。逆转录病毒生产细胞可以是以稳定方式将逆转录病毒颗粒产生到上清液内的细胞，或可以是通过用逆转录病毒载体质粒转染瞬时产生逆转录病毒颗粒的细胞。 

对于逆转录病毒生产细胞的制备，可以使用任何已知包装细胞系，例如PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86或GP+envAm-12(美国专利号5,278,056)、或Psi-Crip(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：6460-6464(1988))。同样，可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒生产细胞。 

本发明可以使用借助于假型包装制备的逆转录病毒。此种逆转录病毒具有与来自其基因组由其起源的病毒不同的起源的包膜。可以使用的假型逆转录病毒的例子包括具有源于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、水疱性口炎病毒(VSV)或猫内源病毒的包膜，或可以充当包膜的蛋白质的那种。此外，可以使用在其表面上具有糖基化蛋白质的逆转录病毒载体。使用其中导入了编码涉及糖基化的酶的基因的逆转录病毒生产细胞制备此种载体。 

除单链RNA特异性核糖核酸内切酶转录单位外，本发明的逆转录病毒载体可以包含与单位的转录调节序列协同作用的元件，例如操纵基因、增强子和终止子序列。此外，不依赖于单位，本发明的逆转录病毒载体可以具有允许选择转基因细胞的合适标记基因(例如抗药基因、编码可以充当报道分子的蛋白质的基因)、受体基因等。此外，本发明的逆转录病毒载体可以与自杀基因一起装载，以用于用转基因细胞的治疗已完成时或在其中发生任何副作用的情况下消除体内转基因细胞的目的。这些基因不一定需要这样放置，从而使得它们以与RNA基因组的转录方向相反的方向转录。 

其为毒素-抗毒素系统的组成成分毒素的核糖核酸内切酶例如MazF或PemK的活性在相应的抗毒素(例如MazE或PemI)的共存下被抑制。因此，当毒性核糖核酸内切酶基因在本发明中使用时，通过使用组合的抗毒素基因可以阻止未受HIV感染的细胞中由核糖核酸内切酶活性引起的细胞毒性的表达。作为上述方面的例子，为了通过使用抗毒素活性抑制毒素活性，考虑通过使抗毒素基因连接在例如组成型启动子(例如衍生自持家基因例如甘油醛3-磷酸脱氢酶或β-肌动蛋白基因的启动子，或病毒衍生的启动子)下游，而留下痕量抗毒素，以在未受HIV感染的细胞中表达。一旦此种细胞由HIV感染，就通过如上所述的反式作用因子的作用刺激毒素的表达，并且仅当所表达的毒素量超过所表达的抗毒素量时显示出细胞毒性。因此，可以改善对于HIV感染细胞的细胞毒性的选择性。 

在本发明的一个方面，使用先体外后体内基因转移，通过其本发明的逆转录病毒载体先体外后体内引入从生物个体中收集的细胞内。当使用逆转录病毒载体时，这样达到基因转移：通过使从生物样品中收集的上述靶细胞与本发明的逆转录病毒载体，例如与病毒生产细胞的培养上清液，或与由此种培养上清液纯化的逆转录病毒载体混合，并且随后在合适的条件下温育所产生的混合物。因此，可以制备具有整合到其染色体内的单链RNA特异性核糖核酸内切酶转录单位的细胞。本发明的另一个方面是通过其本发明的逆转录病毒载体直接施用于个体的体内基因转移方法。 

如果逆转录病毒载体用于先体外后体内基因转移，那么在具有逆转录病毒结合活性的功能物质的存在下，逆转录病毒载体可以以高效率感染靶细胞。 

使用具有逆转录病毒结合活性的功能物质的基因转移方法公开于例如WO 95/26200、WO 97/18318和Nature Medicine，2：876-882(1996)中。此种方法分成使用在单个分子中具有逆转录病毒结合位点和靶细胞结合位点的功能物质的方法，以及使用具有逆转录病毒结合位点的功能物质和具有靶细胞结合位点的功能物质的混合物的方法。2种方法都可以在本发明中使用。 

上述功能物质并无具体限制，只要它具有逆转录病毒结合活性和/或靶细胞结合活性。具有逆转录病毒结合活性的功能物质的例子包括纤 连蛋白肝素结合结构域(肝素-II结构域)、成纤维细胞生长因子、V型胶原片段、多肽的衍生物或变体、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖。此外，能够与所需靶细胞结合的任何物质都可以用作具有靶细胞结合活性的功能物质。具有靶细胞结合活性的功能物质的例子包括具有细胞结合活性的多肽(例如细胞骨架蛋白质)、识别细胞或细胞表面上的生物分子的抗体、生长因子、细胞因子和糖链，尽管本发明并不具体限制于其。 

作为本发明的一个优选方面，存在其中在功能物质的存在下执行基因转移到靶细胞内的方法，所述功能物质包括纤连蛋白衍生的肝素结合结构域。例如，功能物质优选是具有细胞粘附结构域和肝素结合结构域两者的纤连蛋白片段。作为细胞粘附结构域，VLA-5和/或VLA-4结合区域多肽是特别优选的。如上所述的纤连蛋白片段可以由从活生物中纯化的纤连蛋白制备，通过特定方法例如蛋白酶消化，或通过使用重组DNA技术。例如以RetroNectin(注册商标)的名称从Takara Bio Inc.商购可得的重组纤连蛋白片段优选用于本发明。 

如上所述，本发明的逆转录病毒载体和引入逆转录病毒载体的细胞可以用于治疗和/或预防癌症和病毒感染。即，本发明提供了用于治疗和/或预防上述疾病的试剂，所述疾病例如RNA病毒感染(例如免疫缺陷病毒感染(AIDS)和丙型肝炎)。此种试剂并无具体限制，只要它包含逆转录病毒载体或细胞作为活性成分。此种试剂还可以采取任何形式，并且除单独作为活性成分外，它可以为包含与药学上可接受的载体组合的活性成分的制剂，和使用载体用于先体外后体内基因转移到细胞内的试剂盒的形式。 

如下文实施例中所述，在核糖核酸内切酶编码基因通过本发明的逆转录病毒载体引入其内的细胞群体中，与不含具有基因的细胞的细胞群体中的那种比较，HIV复制减少至约1/5，即使受感染细胞群体中仅约50％的细胞保留基因。因此，通过本发明产生的治疗和/或预防作用不受充当活性剂的基因的引入效率限制。尽管本发明并不限于任何具体理论，但通过使用逆转录病毒载体用于治疗HIV的本发明的基因治疗具有此种意外地有利特征如链反应机制，其中治疗基因或由其表达的蛋白质无需由载体介导从转化细胞传递给未转化的细胞。 

实施例 

在下文中，本发明将参考实施例更详细地进行举例说明，但不应解释为限制于其。 

实施例1 

MazF表达质粒的构建 

(1)MazF表达逆转录病毒载体质粒pMT-HLTR-MazF-PL的构建 

通过用限制酶SalI和XbaI双重消化取出插入质粒pQBI-LTRgagGFP(Quantum Biotechnologies Inc.)内的编码gag、sgGFP和RRE的区域，并且将具有在序列表中由SEQ ID NO：2显示的核苷酸序列且编码MazF蛋白质的化学合成DNA插入质粒内SalI和XbaI位点之间。因此构建的质粒指定为pQBI-LTRMazFcvl。通过PCR扩增从HIV-LTR延伸到MazF编码区的区域，其中使用pQBI-LTRMazFcv1作为模板以及由SEQ IDNOs：3和4显示的2种引物。因此获得的扩增片段用限制酶NotI和Eco52I进行消化。这种DNA片段指定且命名为HIV-LTR-MazF盒。 

通过PCR扩增包含单纯疱疹病毒1型多腺苷酸化信号位点的DNA片段，其中使用质粒pZsGreen1-N1(Takara Bio Inc.)作为模板以及由SEQ ID NOs：5和6显示的2种引物。因此获得的扩增片段用限制酶MluI和NotI进行消化。这种DNA片段命名为pA片段。 

通过PCR扩增包含小鼠PGK启动子的片段，其中使用pQBI-pgk(Quantum Biotechnologies Inc.)作为模板和由SEQ ID NOs：7和8显示的引物。因此获得的扩增片段用限制酶MluI进行消化，随后为平端化和用BamHI的进一步消化。这种DNA片段命名为pPGK片段。 

通过PCR扩增人低亲和力神经生长因子受体的细胞外结构域，其中使用逆转录病毒生产细胞SFCMM-3(Human Gene Therapy，9：2243-2251(1998))的基因组作为模板以及由SEQ ID NOs：9和10显示的引物。因此获得的扩增片段用限制酶EcoRI和XhoI进行消化。这种DNA片段命名为LNGFR片段。 

将上述基因片段依次插入pMT载体(Gene Therapy，11：94-99(2004))内MluI和BamHI位点之间，以获得图1中显示的重组逆转录病毒载体质粒pMT-HLTR-MazF-PL。这种载体的特征在于HIV-LTR-MazF盒以与逆转录病毒载体基因组的转录方向相反的方向插入。 

(2)MazF表达逆转录病毒载体质粒pMTD3-U3TAR-MazF-PL的构 建 

为了与pMT-HLTR-MazF-PL比较的目的，构建自灭活载体pMTD3-U3TAR-MazF-PL，其中HIV-LTR-MazF盒以与逆转录病毒载体基因组的转录方向相同的方向插入，从而使得在基因转移后，抑制逆转录病毒基因组的转录(图2)。为了制备这种载体，使用其中从载体pMT的3′LTR U3区域的核苷酸43延伸到核苷酸309的部分缺失的质粒载体pMTD3。如上在(1)中所述制备的DNA片段如图2中显示插入这种载体的MluI和BamHI位点之间。 

此外，如下构建表达MazE——即MazF的抗毒素的载体。最初，载体pIRESneo3(Takara Bio Inc.)的CMV启动子由CAG启动子替换，以制备载体pCAIN。随后，编码具有由SEQ ID NO：11显示的氨基酸序列的MazE蛋白质的基因(具有由SEQ ID NO：12显示的核苷酸序列)插入pCAIN的EcoRI和NotI位点之间。因此构建的载体命名为pCAIN-MazE。 

实施例2 

逆转录病毒生产细胞的确立和逆转录病毒载体的制备 

使用pMT-HLTR-MazF-PL和逆转录病毒包装试剂盒Eco(RetrovirusPackaging Kit Eco)(Takara Bio Inc.)执行瞬时病毒生产，以获得亲嗜性病毒MT-HLTR-MazF-PL。允许这种亲嗜性病毒在8μg/mL聚凝胺(Sigma-Aldrich Japan K.K.)的存在下感染GaLV逆转录病毒包装PG13细胞(ATCC CRL-10686)，以获得细胞用于基因转移。细胞通过有限稀释在96孔板中铺平板，并且取出增殖克隆的培养上清液，以使用实时PCR测定病毒滴度，如实施例3中所述。选择其中观察到高滴度病毒生产的克隆1，以确立逆转录病毒生产细胞系PG13/MT-HLTR-MazF-PL。 

PG13/MT-HLTR-MazF-PL在补加有10％胎牛血清(InvitrogenCorporation)的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM；Sigma-AldrichJapan K.K.)中进行培养。当培养达到半汇合时，将培养基替换为补加有5mM丁酸钠的包含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基(0.1mL/cm²)。培养24小时后，使上清液通过0.45μm滤器(MilliporeCorporation)过滤，以获得重组逆转录病毒GaLV/MT-HLTR-MazF-PL的溶液。这种病毒溶液以小等分试样进行分配且于-80℃贮存于冷冻机 中。这些等分试样在下文描述的基因转移研究中使用。 

pMTD3-U3TAR-MazF-PL和pCAIN-MazE以20：1的比率混合。使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen Corporation)用这种混合物转染PG13细胞，并且在补加有500μg/mL新霉素(G418)的包含10％胎牛血清的DMED培养基中进行选择。使用CD271LNGFR MicroBead Kit(MiltenyiBiotec K.K.)对因此获得的G418抗性细胞群体实施分离程序，以获得LNGFR阳性细胞。LNGFR阳性细胞通过有限稀释在96孔板中铺平板，并且取出增殖克隆的培养上清液，以使用实时PCR测定病毒滴度，如实施例3中所述。因此，确立产生高滴度病毒载体的细胞系PG13/MTD3-U3TAR-MazF-PL。PG13/MTD3-U3TAR-MazF-PL在补加有10％胎牛血清的DMEM培养基中进行培养。当培养达到半汇合时，将培养基替换为补加有5mM丁酸钠的包含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基(0.1mL/cm²)。培养24小时后，使上清液通过0.45μm滤器(Millipore Corporation)过滤，以获得重组逆转录病毒GaLV/MTD3-U3TAR-MazF-PL的溶液。这种病毒溶液以小等分试样进行分配且于-80℃贮存于冷冻机中。这些等分试样在下文描述的基因转移研究中使用。 

实施例3 

病毒滴度的测定 

使用1μl病毒溶液作为模板且使用Retro-X qRT-PCR Titration Kit(Takara Bio Inc.)执行实时PCR反应，从而由校准曲线计算病毒溶液中的RNA拷贝数。实施例2中获得的病毒溶液的滴度对于GaLV/MT-HLTR-MazF-PL是9.78×10⁹拷贝/mL，并且对于GaLV/MTD3-U3TAR-MazF-PL是1.16×10⁹拷贝/mL。通过以相反方向装载HLTR-MazF表达盒，可能获得具有比自灭活逆转录病毒载体更高滴度的重组病毒。 

实施例4 

CH-296包被板的制备 

向无表面处理的24孔板(Falcon)的每个孔中加入20μg/ml浓度的500μl纤连蛋白片段，CH-296(产品名称：RetroNectin；Takara Bio Inc.)。 允许板在4℃下静置过夜，然后用PBS进行洗涤。这个板在下文描述的实验中用作CH-296包被板。 

实施例5 

基因转移效率的测定 

通过执行基因转移实验来测定基因转移效率，其中根据下文描述的程序，用实施例2中制备的重组逆转录病毒溶液转染由人急性成淋巴细胞性白血病细胞系CCRF-CEM(ATCC CCL-119)和食蟹猴的外周血制备的CD4-阳性T细胞。 

CCRF-CEM细胞在补加有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中进行培养。在转染当天，通过离心收集细胞，并且以1x 10⁵细胞/mL的密度悬浮于补加有10％胎牛血清的新鲜RPMI-1640培养基中。向实施例4中制备的CH-296包被板的每个孔中，加入用补加有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(Miltenyi Biotec K.K.)稀释的实施例2中制备的重组逆转录病毒溶液的1mL 4、8和16倍稀释物，并且板随后在32℃和2000x g下离心2小时，以促进逆转录病毒载体与RetroNectin的粘附。随后取出上清液，并且用包含1.5％人血清清蛋白的0.5mL PBS洗涤孔。随后，向每个孔中加入1mL上述细胞悬浮液，并且在37℃下在5％二氧化碳气氛中温育3天。培养3天后，收集细胞，使用抗CD271(LNGFR)-PE抗体(Miltenyi Biotec K.K.)就LNGFR阳性细胞进行染色，并且通过流式细胞仪FACS Vantage(Becton Dickinson and Company)进行分析，以测定基因转移效率。 

此外，使用猴CD4+T细胞分离试剂盒(Monkey CD4+T CellIsolation Kit)(Miltenyi Biotec K.K.)由食蟹猴的外周血制备CD4-阳性T细胞，并且在补加有10％胎牛血清、2mM谷氨酸、200U/mL rhIL-2和5μg/ml伴刀豆球蛋白A的AIM-V培养基(Invitrogen Corporation)中进行培养。3天后，通过离心收集细胞，并且以2x 10⁵细胞/mL的密度悬浮于补加有10％胎牛血清、2mM谷氨酸和200U/mL rhIL-2的新鲜AIM-V培养基(Invitrogen Corporation)中。使用在实施例4中制备的2块CH-296-包被板。向板中加入1mL/孔在实施例2中制备的重组逆转录病毒溶液，所述板随后在32℃和2000x g下离心2小时，以促进逆转录病毒载体与RetroNectin的粘附。随后取出上清液，并且用包含1.5％人 血清清蛋白的0.5mL PBS洗涤孔。随后，无需取出包含1.5％人血清清蛋白的PBS，将一块板贮存于4℃。向另一块板的每个孔中加入1mL上述细胞悬浮液，并且在37℃下在5％二氧化碳气氛中进行温育。24小时后，收集细胞，并且将细胞悬浮液加入贮存于4℃的病毒粘附板中。培养另外3天后，收集细胞，并且使用抗CD271(LNGFR)-PE抗体(Miltenyi Biotec K.K.)就LNGFR阳性细胞进行染色，并且通过流式细胞仪FACS Vantage(Becton Dickinson and Company)进行分析，以测定基因转移效率。 

因此测定的基因转移效率显示于表1中。如该表中所示，通过以相反方向装载HLTR-MazF表达盒，与自灭活逆转录病毒载体相比较，基因转移效率得到显著改善。 

表1 

实施例6 

对人CD34-阳性祖细胞的基因转移 

通过执行基因转移实验来测定基因转移效率，其中根据下文描述的程序，用实施例2中制备的重组逆转录病毒溶液转染人骨髓CD34-阳性祖细胞(骨髓CD34+细胞；Cambrex Corporation)。 

人CD34-阳性祖细胞的刺激培养在包含4％胎牛血清的X-VIVO10培养基(Cambrex Corporation)中执行，所述培养基补加有20ng/mL重组人IL-3(PEPROTECH INC.)、100ng/mL重组人干细胞因子(PEPROTECH INC.)、100ng/mL重组人血小板生成素(PEPROTECHINC.)、和100ng/mL重组人Flt3-配体(PEPROTECH INC.)。在37℃下在5％二氧化碳气氛中培养2天后，计数细胞，然后以1x10⁵细胞/mL的密度悬浮于如上所述的新鲜培养基中。向实施例4中制备的CH-296包被板的每个孔中，加入实施例2中制备的重组逆转录病毒GaLV/MT-HLTR-MazF-PL的1mL未稀释溶液，并且板随后在32℃和2000x g下离心2小时，以促进逆转录病毒载体与RetroNectin的粘附。随后取出上清液，并且用包含1.5％人血清清蛋白的0.5mL PBS洗涤孔。随后，向每个孔中加入1mL上述细胞悬浮液，并且在37℃下在5％二氧化碳气氛中进行温育。培养3天后，收集细胞，使用抗CD271(LNGFR)-PE抗体(Miltenyi Biotec K.K.)就LNGFR阳性细胞进行染色，并且通过流式细胞仪FACS Vantage(Becton Dickinson and Company)进行分析，以测定基因转移效率。关于人CD34-阳性祖细胞的基因转移效率是85.7％，并且达到具有高效率的基因转移。

实施例8 

CH-296包被板的制备 

使用与实施例4中所述的那种相同的程序制备由CH-296包被的24孔板。此外，向无表面处理的12孔板(Falcon)中加入1mL/孔的20μg/mlCH-295，并且允许板在4℃下静置过夜，随后用PBS洗涤2次。这些板在下文描述的实验中用作CH-296包被板。 

实施例9 

人PBMCs的培养 

通过单采血液成分术得自5个人供体的外周血且以冷冻状态贮存的5份单核的细胞(PBMCs)样品(分别指定为TK5、TK14、TK19、TK23和TK29)进行解冻，并且悬浮于RPMI 1640培养基(Sigma-Aldrich JapanK.K.)中。每份悬浮液在500xg下离心10分钟，取出上清液，并且获得细胞沉淀。将沉淀悬浮于10mL培养基GT-T502(Takara Bio Inc.)中以计数细胞，所述培养基包含1％自体血浆、0.2％人血清清蛋白(BaxterInternational Inc.)、600IU/mL rhIL-2(CHIRON CORPORATION)、和2.5μg/mL Fungizone(Bristol-Myers K.K.)，然后用相同培养基调整至5x10⁶细胞/mL的细胞密度。通过将5mL每份悬浮液转移至25cm²瓶(Corning Incorporated)起始培养，随后以30ng/mL浓度添加抗-CD3 抗体OKT-3(Janssen Pharmaceutica N.V.)。在培养第3天时，计数细胞并且以1-2x10⁶/mL的细胞密度悬浮于新鲜培养基中，以制备细胞悬浮液。 

实施例10 

基因转移至人PBMCs 

向实施例8中制备的CH-296包被的24孔和12孔板的每个孔中，分别加入1mL和2mL实施例2中制备的重组逆转录病毒GaLV/MT-HLTR-MazF-PL溶液。板随后在32℃和2000xg下离心2小时，以促进逆转录病毒载体与RetroNectin的粘附。12孔板的每个孔用包含1.5％人血清清蛋白的1mL PBS洗涤2次，并且使其充满包含1.5％人血清清蛋白的1mL PBS。板贮存于4℃用于在下一天执行基因转移。 

24孔板的每个孔用包含1.5％人血清清蛋白的0.5mL PBS进行洗涤，并且向每个孔中加入1mL实施例9中制备的细胞悬浮液。板随后在32℃和1000xg下离心10分钟，以促进与在其上附着逆转录病毒载体的板的细胞粘附。在37℃下在5％二氧化碳气氛中后续培养4小时后，培养物用培养基稀释至5x10⁵/mL的细胞密度，并且进一步培养。 

在第一次基因转移的下一天，从贮存的12孔板中取出上清液，病毒与所述板粘附并且使所述板充满包含1.5％人血清清蛋白的PBS。向板的孔中转移每个供体的转染细胞的总体积。板在32℃和1000xg下离心10分钟，以促进与在其上附着逆转录病毒载体的板的细胞粘附。在37℃下在5％二氧化碳气氛中后续培养4小时后，培养物用培养基稀释至3x10⁵/mL的细胞密度，并且进一步培养。 

作为对照，对逆转录病毒载体未与之附着的CH-296包被板执行相同程序，以制备未转染的细胞。 

从第二次基因转移培养另外3天后，收集细胞，使用抗CD271-PE抗体就LNGFR阳性细胞进行染色，并且通过流式细胞仪Epics XL(Beckman Coulter Inc.)进行分析，以测定基因转移效率。关于每个供体起源的PBMC的基因转移效率显示于表3中。 

表3 

关于每个供体起源的PBMCs的MazF基因转移效率 

实施例11 

关于MazF转染的PBMCs的HIV感染实验-1 

实施例10中制备的源于5个供体的MazF转染细胞和未转染的细胞分别用培养基稀释至5×10⁵/mL的细胞密度。使稀释物的10mL等分试样温育过夜。在下一天，将细胞悬浮液分成2个等分试样，将所述等分试样转移到不同离心管内。向一个管中以0.01的MOI加入HIV IIIB株。另一个管用无HIV培养基进行模拟接种。管在37℃下温育2小时以允许HIV IIIB进入细胞，所述细胞随后用GT-T503培养基洗涤3次，并且随后悬浮于3.5mL培养基中。将1毫升这种细胞悬浮液加入24孔板的每个孔中，并且与1mL培养基温育用于培养。使用3个孔/样品执行这种培养。感染后3天，取样1mL培养上清液，并且向每个孔中加入1mL培养基，并且继续培养。感染后6天，取样1mL上清液。通过ELISA通过定量取样的上清液中存在的HIV p24抗原测定HIV的量。对感染后6天的细胞实施MTT测定，以测定活细胞数目。 

活细胞的测定结果显示于图3(a)-(e)中，并且在第3和6天时的p24抗原的定量结果显示于表4中。在图3中，纵轴代表每个测试组中的活细胞与对照组(未受MazF转染的，未受HIV感染的)中的活细胞的相对比率(％)。该图的横轴代表测试组。轴下的数字代表供体编号，并且用(-)指示的组对应于未受MazF转染的组，并且用(+)指示的组对应于MazF转染组；M指Moc感染(未受HIV感染)；并且H指HIV感染。在任何供体PBMCs中MazF转染和未转染的，或HIV感染和未感染的组之间在活细胞计数中不存在显著变化，显示其表达由HIV感染诱导的MazF不诱导细胞死亡。如表4中所示，尽管关于每个 供体细胞的MazF基因转移效率是约50％，但HIV复制在MazF转染细胞中抑制至未转染细胞的约1/5。 

表4 

在感染后第3和6天时的HIV的定量结果 

实施例12 

关于MazF转染的PBMCs的HIV感染实验-2 

根据与实施例10中的那种相同的程序由TK19起源的PBMCs制备MazF转染和未转染的细胞。因此制备的转染细胞的基因转移效率是61.1％。向这些细胞的每一种中，加入HIV IIIB和HIV HE株，并且根据与实施例11中所述那种相同的方法以0.01的MOI进行感染。作为对照，通过添加无HIV培养基制备Moc感染。在感染后3和6天通过经由ELISA定量上清液中存在的HIV p24抗原测定上清液中存在的HIV量。在第3和6天时的p24抗原的定量结果显示于表5中。 

如表5中所示，尽管MazF转染细胞中的MazF基因转移效率是61.1％，但与未转染的细胞比较，HIV IIIB和HIV HE株的HIV复制分别抑制至约1/20和1/4。 

表5 

工业适用性 

本发明提供了对于治疗和/或预防癌症和病毒感染有用的逆转录病毒载体。因为引入上述核酸构建体的细胞能够抑制RNA病毒的复制，所以它对于治疗和/或预防由此种病毒引起的疾病例如HIV感染特别有效。 

序列表自由正文 

SEQ ID NO：2；编码MazF的合成DNA。 

SEQ ID NO：3；扩增HIV-LTR-MazF盒的引物。 

SEQ ID NO：4；扩增HIV-LTR-MazF盒的引物。 

SEQ ID NO：5；扩增pA片段的引物。 

SEQ ID NO：6；扩增pA片段的引物。 

SEQ ID NO：7；扩增pPGK片段的引物。 

SEQ ID NO：8；扩增pPGK片段的引物。 

SEQ ID NO：9；扩增LNGFR片段的引物。 

SEQ ID NO：10；扩增LNGFR片段的引物。 

Claims (6)

1.一种包含转录单位的逆转录病毒载体，所述转录单位包含转录调节序列和编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因，所述基因这样放置，从而使得它的表达可以由所述调节序列控制，其中所述单位这样放置，从而使得来自所述单位的mRNA的转录方向与所述逆转录病毒载体的RNA基因组的转录方向相反，

其中所述转录调节序列是这样的转录调节序列，从而使得转录由Tat蛋白质诱导。

2.根据权利要求1的逆转录病毒载体，其中编码具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的多肽的基因置于免疫缺陷病毒的LTR的下游。

3.根据权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述转录调节序列是这样的序列，从而使得转录由人工供应到细胞内的反式作用因子诱导。

4.根据权利要求1-3中任一项的逆转录病毒载体，其中具有单链RNA特异性核糖核酸内切酶活性的所述多肽是MazF蛋白质。

5.根据权利要求1-4中任一项的逆转录病毒载体在制备用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染的治疗或预防试剂中的用途。

6.一种免疫缺陷病毒感染的治疗或预防试剂，其包括根据权利要求1-4中任一项的逆转录病毒载体作为有效组分。