DE60036929T2

DE60036929T2 - Gentherapeutika

Info

Publication number: DE60036929T2
Application number: DE60036929T
Authority: DE
Inventors: Ikunoshin Uji-shi KATO; Kiyozo Koka-gun ASADA; Mitsuhiro Kusatsu-shi UENO; Kimikazu Takatsuki-shi HASHINO; Hirofumi Kusatsu-shi YOSHIOKA; Keiji Otsu-shi TANAKA
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-03-23
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2020-03-15
Also published as: WO2000056368A1; KR100674140B1; CN1345248A; DE60036929D1; EP1163912A1; ATE376840T1; EP1163912B1; US20060166924A1; CN1225285C; KR20010102547A; TWI272107B; AU2944100A; EP1163912A4

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Missile-Gentherapie, die für eine Behandlung von Erkrankungen verwendbar sind, die für ihre Behandlung einer Gentherapie bedürfen, und zum selektiven Transfer eines Gens in Zielzellen in vivo.
Hintergrund
Bisher wurden weltweit etwa 3000 Gentherapien durchgeführt. Das größte technische Problem hinsichtlich der Gentherapie war, dass die Wirksamkeit eines Transfers eines therapeutischen Gens in Zielzellen, insbesondere in hämatopoetische Stammzellen, sehr gering ist. In jüngerer Zeit wurde die Wirksamkeit des Gentransfers bemerkenswert durch die Verwendung eines rekombinanten Proteins eines Fibronectinfragments, CH-296 (Takara Shuzo; RetroNectin), verbessert und dadurch gewinnt die Gentherapie an Praktikabilität (Nature Medicine, 2: 876–882 (1996)). Das rekombinante RetroNectin-Molekül kann sowohl an ein Retrovirus mit einem inkorporierten therapeutischen Gen als auch an eine Zielzelle binden, um ihnen zu ermöglichen, in Nachbarschaft zueinander zu treten, wodurch die Wirksamkeit eines Gentransfers stark erhöht wird. Es wurde angenommen, dass es am schwierigsten ist, ein Gen in humane hämatopoetische Stammzellen zu transferieren. Jedoch wurde ein Transfer eines therapeutischen Gens mit einer Wirksamkeit von etwa 90% unter Verwendung von RetroNectin sogar für humane hämatopoetische Stammzellen erreicht. RetroNectin ist ein einzelnes Polypeptid, worin ein Peptid, das spezifisch an eine hämatopoetische Stammzelle bindet, mit einem Peptid verbunden ist, das spezifisch an einen Retrovirusvektor mit einem inkorporierten therapeutischen Gen bindet. Die Erfinder haben gezeigt, dass die zwei Anteile in RetroNectin die gleiche Aktivität wie in dem ursprünglichen RetroNectin-Molekül aufweisen, selbst wenn sie voneinander getrennt sind und als ein Cocktail gemischt sind, wo bei dieses Verfahren als Cocktail-Gentransferverfahren bezeichnet wurde (vgl. WO 97/18318 ).
Das Verfahren zum Transfer eines Gens in hämatopoetische Stammzellen unter Verwendung von RetroNectin ist ein epochales Verfahren, dadurch, dass es die Wirksamkeit eines Gentransfers in hämatopoetische Stammzellen erhöht. Dieses Verfahren umfasst die Durchführung eines Gentransfers in hämatopoetische Stammzellen in vitro und ein Rückführen der hämatopoetischen Stammzellen mit dem transferierten Gen in den lebenden Körper. Das Verfahren, das derartige Schritte umfasst, könnte als zu kompliziert angesehen werden, als dass es für eine Gentherapie in manchen Fällen angewendet wird.
Es besteht ein Bedarf für eine Bereitstellung eines Zielzellen-spezifischen Gentransferverfahrens, das die Diversität von Zielzellen bedienen kann, die für eine Gentherapie verwendet werden sollen.
Es wurde versucht, nicht-virale Vektoren (z. B. ein Vektor, bei dem Polylysin oder dergleichen als Träger zum Zurückhalten einer Nukleinsäure verwendet wird) mit einer Zielgerichtetheit gegen Zielzellen dadurch zu versehen, dass ein Ligand mit einer für die Zellen spezifischen Affinität hinzugefügt wird. Jedoch kann ein durch dieses Verfahren transferiertes Gen in Zellen nicht stabil aufrechterhalten werden. Virusvektoren, die ein Fusionsprotein einer viralen Hülle mit einem Liganden mit Affinität für eine Zielzelle exprimieren, sind bekannt. Jedoch wurde die beabsichtigte Zielsteuerung in vielen Fällen nicht erreicht, da die infektiöse Funktion der Hülle oder die Bindefunktion des Liganden oder beides aufgrund der Expression als Fusion beschädigt waren. Des Weiteren war es nötig, Verpackungszellen für jeden Typ einer Zielzelle in komplizierter Weise herzustellen, um die fusionierte Hülle zu exprimieren. Des Weiteren war viel Zeit für Experimente erforderlich, um eine Verpackungszelllinie zu etablieren, die eine Virusvektor-Suspension mit hohem Titer bereitstellen kann, um zu bestätigen, dass kein Replikations-kompetentes Retrovirus (RCR) auftritt und dergleichen. Namba et al. (Human Gene Therapy 9: 5–11, 1998) beschreiben die Bystander Effekt BE-vermittelte Therapie von experimentellem Gehirntumor durch genetisch veränderte Tumorzellen.
Wie vorstehend erörtert, bestand ein Bedarf für eine Lösung verschiedener Probleme, die nach wie vor mit den gegenwärtigen Techniken assoziiert waren, um wirksam ein interessierendes Gen spezifisch in Zielzellen zu transferieren.
Erfindungsgemäße Gegenstände
Der erfindungsgemäße Hauptgegenstand ist die Bereitstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, die für eine Gentherapie verwendbar ist, die einen Transfer eines Gens in vivo umfasst, und die Bereitstellung eines einfach durchzuführenden Gentherapieverfahrens, das einen Transfer eines Gens spezifisch in Zielzellen in vivo unter Verwendung der therapeutischen Zusammensetzung umfasst.
Zusammenfassung der Erfindung
Der erste erfindungsgemäße Aspekt betrifft eine Zusammensetzung zur Gentherapie, die zur Behandlung einer der Gentherapie zugänglichen Krankheit verwendet wird und die als Wirkstoffe eine wirksame Menge eines Retrovirus, das ein für Gentherapie verwendbares Gen enthält, sowie eine wirksame Menge einer Zelle als Träger enthält, die eine Affinität für das Retrovirus und eine Affinität, die für eine Zielzelle, für die ein Transfer des Gens benötigt wird, spezifisch ist, aufweist, wobei die Affinität für das Retrovirus von einer funktionellen Substanz abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Anti-Virus-Antikörpern, Heparin II-bindender Domäne von Fibronectin, Fibroblastenwachstumsfaktor, Kollagen und Polylysin, und durch Binden der funktionellen Substanz an die Zelle als Träger oder durch Expression der funktionellen Substanz an der Oberfläche der Zelle als Träger verliehen wird.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen ersten Aspekts wird die Affinität für die Zielzelle dadurch verliehen, dass die Zelle als Träger dazu veranlasst wird, eine funktionelle Substanz, die die Affinität für die Zielzelle aufweist, auf der Zelle als Träger zu exprimieren, wobei die funktionelle Substanz ein Ligand für einen auf der Zielzelle exprimierten Rezeptor oder ein Antikörper gegen ein Oberflächen-Antigen auf der Zielzelle ist.
In einer weiteren Ausführungsform des ersten erfindungsgemäßen Aspekts ist die Zelle als Träger ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus vaskulären Endothelzellen, Entzündungszellen, hämatopoetischen Stammzellen, Endothelzellen des Gehirns und Knochenmarkszellen.
Der zweite erfindungsgemäße Aspekt betrifft die Verwendung einer wirksamen Menge einer Zelle als Träger, die eine Affinität für ein Retrovirus, das ein für Gentherapie verwendbares Gen enthält, und eine Affinität, die für eine Zielzelle, für die ein Transfer des Gens benötigt wird, spezifisch ist, aufweist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für Gentherapie zur Behandlung einer der Gentherapie zugänglichen Krankheit, wobei die Affinität für das Retrovirus von einer funktionellen Substanz abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Anti-Virus-Antikörpern, Heparin II-bindender Domäne von Fibronectin, Fibroblastenwachstumsfaktor, Kollagen und Polylysin, und durch Binden der funktionellen Substanz an die Zelle als Träger oder durch Expression der funktionellen Substanz an der Oberfläche der Zelle als Träger verliehen wird.
In einer Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Aspekts wird die Affinität für die Zielzelle dadurch verliehen, dass die Zelle als Träger dazu veranlasst wird, eine funktionelle Substanz, die die Affinität für die Zielzelle aufweist, auf der Zelle als Träger zu exprimieren, wobei die funktionelle Substanz ein Ligand für einen auf der Zielzelle exprimierten Rezeptor oder ein Antikörper gegen ein Oberflächen-Antigen auf der Zielzelle ist.
In einer weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Aspekts enthält die Zusammensetzung eine wirksame Menge des Retrovirus, das ein für Gentherapie verwendbares Gen enthält.
In einer noch weiteren Ausführungsform des zweiten erfindungsgemäßen Aspekts ist die Zelle als Träger ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus vaskulären Endothelzellen, Entzündungszellen, hämatopoetischen Stammzellen, Endothelzellen des Gehirns und Knochenmarkszellen.
In einer weiteren Ausführungsform des ersten oder zweiten erfindungsgemäßen Aspekts ist die Zielzelle eine Zelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hämatopoetischen Stammzellen, Blutzellen, Leukozyten, Lymphozyten, T-Zellen, Tumorinfiltrierenden Lymphozyten, B-Zellen und Krebszellen.
In einer noch weiteren Ausführungsform des ersten oder zweiten erfindungsgemäßen Aspekts kodiert das für Gentherapie verwendbare Gen ein therapeutisches Protein, das bei Expression des Gens in der Zielzelle in einer Menge exprimiert wird, die für die Behandlung ausreichend ist.
In einer weiteren Ausführungsform des ersten oder zweiten erfindungsgemäßen Aspekts ist das therapeutische Protein ein Enzym oder ein Cytokin.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirksamkeit eines Gentransfers unter Verwendung von HL-60-Zellen als Träger.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Retrovirusvektor, der in der Missile-Gentherapie unter Verwendung der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung verwendet wird, ist nicht spezifisch begrenzt. Bekannte Retrovirusvektoren, die gewöhnlich für einen Gentransfer verwendet werden, werden eingesetzt. Ein rekombinanter Retrovirusvektor wird vorzugsweise erfindungsgemäß verwendet. Insbesondere ist ein Replikations-defizienter rekombinanter Retrovirusvektor bevorzugt. Die Fähigkeit zur Replikation eines solchen Vektors wird beseitigt, so dass er nicht autonom in infizierten Zellen replizieren kann, und daher ist der Vektor nicht pathogen. Der Vektor kann in eine Wirtszelle wie eine Vertebratenzelle (insbesondere eine Sängerzelle) eindringen und stabil ein Fremdgen, das für eine Gentherapie verwendbar ist und in den Vektor inseriert ist, in die chromosomale DNA integrieren.
Erfindungsgemäß kann das Gen, das in Zielzellen in vivo transferiert werden soll, in einer in einen rekombinanten Retrovirusvektor inserierten Form verwendet werden, so dass es unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors wie eines in dem Virusvektor vorliegenden Promotors oder eines Fremdpromotors exprimiert wird. Des Weiteren kann ein weiteres regulatorisches Element (wie eine Enhancersequenz oder eine Terminatorsequenz), das mit einem Promotor und/oder einer Transkriptionsinitiationsstelle kooperiert, in dem Vektor vorliegen, um eine wirksame Transkription des Gens zu erreichen. Des Weiteren können ein Promotor, eine Transkriptionsinitiationsstelle und ein weiteres damit kooperierendes regulatorisches Element, die eine Expression in einer stellenspezifischen Weise (in einem Organ, um einen Tumor usw.) steuern, in den Vektor eingebaut werden, um weiter die Spezifität einer Genexpression an der Zielstelle zu erhöhen. Das zu transferierende Gen kann ein natürlich auftretendes Gen oder ein künstlich hergestelltes Gen sein. Alternativ kann das Gen ein Gen sein, bei dem DNA-Moleküle unterschiedlichen Ur sprungs durch Ligation oder andere bekannte Möglichkeiten miteinander verbunden sind.
Ein jegliches Gen, dessen Transfer in Zielzellen in vivo erwünscht ist, kann als das Gen, das in den Virusvektor inseriert werden soll, ausgewählt werden. Beispielsweise kann ein Gen, das für ein Enzym oder ein mit der zu behandelnden Erkrankung assoziiertes Protein, einen intrazellulären Antikörper (vgl. beispielsweise WO 94/02610 ), einen Wachstumsfaktor, eine Antisense-Nukleinsäure, ein Ribozym, einen falschen Primer (vgl. beispielsweise WO 90/13641 ) oder dergleichen kodiert, als das Gen verwendet werden.
Beispiele für funktionelle Substanzen mit Affinitäten für Viren umfassen in nicht begrenzender Weise Anti-Virus-Antikörper, Heparin II-bindende Domäne von Fibronectin, Fibroblastenwachstumsfaktor, Typ V-Kollagen und Polylysin. Auch sind Substanzen offenbart, die zu diesen funktionellen Substanzen funktionell äquivalent sind wie eine funktionelle Substanz mit einer Heparin-bindenden Domäne. Diese können von solchen funktionellen Substanzen abgeleitet sein. In diesem Zusammenhang bedeutet "von einer funktionellen Substanz abgeleitet", dass eine funktionelle Stelle einer funktionellen Substanz mit einer Affinität für ein Virus in dem Molekül der zu verwendenden funktionellen Substanz eingeschlossen ist. Eine Affinität ist ein Konzept, das eine Fähigkeit, an ein Virus zu binden, und eine Fähigkeit, sich an eine Zelle anzuheften, einschließt. Die Affinität für ein Virus der erfindungsgemäß verwendeten funktionellen Substanz macht es möglich, dass ein Virus eine spezifische Zelle oder ein Organ oder ein Gewebe mit der Zelle ansteuert und dass eine Gentherapie durchgeführt werden kann, die einen Transfer eines Gens in vivo in eine spezifische Zelle umfasst.
Ein Antikörper, der eine für einen Retrovirusvektor spezifische Affinität aufweist, ist für einen spezifischen und wirksamen Transfer eines Gens in spezifische Zellen besonders geeignet. Der Antikörper, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist nicht auf einen spezifischen Antikörper begrenzt. Ein Antikörper, der ein Antigen auf der Oberfläche eines Retrovirusvektors für einen Gentransfer erkennt, kann in geeigneter Weise für eine Verwendung ausgewählt werden. Ein solcher Antikörper kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Alternativ können viele gegenwärtig käuflich verfügbare Antikörper auch verwendet werden. Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein, sofern er die gewünschten Eigenschaften wie eine Fähigkeit, an ein zu verwendendes Virus zu bin den, aufweist. Des Weiteren kann ein Antikörper oder ein Derivat eines Antikörpers verwendet werden, der/das unter Verwendung bekannter Techniken modifiziert wurde, wie ein humanisierter Antikörper, ein Fab-Fragment oder ein einzelkettiger Antikörper.
Auch offenbart sind Beispiele für funktionelle Substanzen mit Affinitäten für Zielzellen, die in nicht begrenzender Weise Proteine mit einer Affinität für die Zelle, Hormone, Cytokine, Antikörper gegen Zelloberflächen-Antigene, Polysaccharide, Glycoproteine, Glycolipide, von Glycoproteinen oder Glycolipiden abgeleitete Zuckerketten, Metaboliten der Zielzellen und Zellen umfassen. Sie können von solchen funktionellen Substanzen abgeleitete Zell-bindende Stellen sein. In diesem Zusammenhang bedeutet "von einer funktionellen Substanz abgeleitet", dass eine funktionelle Stelle einer funktionellen Substanz mit einer Affinität für eine Zielzelle in dem zu verwendenden Molekül der funktionellen Substanz eingeschlossen ist. Eine Affinität für eine Zielzelle ist ein Konzept, das eine Fähigkeit, an eine Zielzelle zu binden, und eine Fähigkeit, sich an eine Zelle anzuheften, einschließt. Die Affinität für eine Zielzelle einer funktionellen Substanz ermöglicht, dass eine spezifische Zelle oder ein Organ oder ein Gewebe mit der Zelle von einem Virus angesteuert werden und dass eine Gentherapie durchgeführt wird, die einen Transfer eines Gens in vivo in eine spezifische Zelle umfasst.
Ein Antikörper, der spezifisch an eine Zielzelle bindet, ist besonders für einen wirksamen Transfer eines Gens in spezifische Zielzellen geeignet. Der gegen die Zielzelle gerichtete Antikörper, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist nicht auf einen spezifischen Antikörper begrenzt. Ein Antikörper gegen ein Antigen, das auf Zielzellen exprimiert wird, in die ein Gen transferiert werden soll, kann geeigneterweise für eine Verwendung ausgewählt werden. Ein solcher Antikörper kann in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Alternativ können viele gegenwärtig käuflich verfügbare Antikörper auch verwendet werden. Der Antikörper kann entweder ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper sein, sofern er erwünschte Eigenschaften wie Spezifität für die Zielzelle aufweist. Weiterhin kann auch ein Antikörper oder ein Derivat eines Antikörpers, der/das in an sich bekannter Weise modifiziert wurde, wie ein humanisierter Antikörper, ein Fab-Fragment oder ein einzelkettiger Antikörper, verwendet werden.
Eine Expression von jeweiligen Leukozyten-Antigenen (als CD-Antigene bekannt) auf verschiedene Zellen wurde detailliert untersucht. Somit kann ein Gen in Zielzel len mit hoher Spezifität dadurch transferiert werden, dass ein Antikörper ausgewählt wird, der ein CD-Antigen, das auf den interessierenden Zielzellen exprimiert wird, erkennt, und dieser im erfindungsgemäßen Verfahren eines Gentransfers eingesetzt wird. Beispielsweise kann ein Gentransfer gegen T-Helferzellen dadurch gerichtet sein, dass ein Anti-CD4-Antikörper verwendet wird oder der Gentransfer kann gegen hämatopoetische Stammzellen dadurch gerichtet sein, dass ein Anti-CD34-Antikörper verwendet wird.
Ferner ist ein Protein mit einer Aktivität, sich an eine Zelle anzuheften, wie Fibronectin, Laminin, Kollagen oder Vitronectin als eine funktionelle Substanz mit einer Affinität für eine Zielzelle offenbart. Die funktionelle Substanz kann ein Fragment davon sein, sofern sie eine Aktivität einer Bindung an eine Zielzelle aufweist.
Ein Glycoprotein, Laminin, ist für einen wirksamen Transfer eines Gens in verschiedene Zielzellen wie Blutzellen offenbart. Die Zuckerkette von Laminin spielt bei einem Gentransfer unter Verwendung von Laminin eine wichtige Rolle. Daher ist eine von Laminin in an sich bekannter Weise freigesetzte Zuckerkette als eine funktionelle Substanz offenbart. Ferner ist ein Glycoprotein mit einer N-gekoppelten Zuckerkette mit einem hohen Gehalt an Mannose wie Laminin oder eine davon freigesetzte oder chemisch synthetisierte Zuckerkette offenbart. Weiterhin ist eine Substanz wie ein Protein offenbart, die an die vorstehend beschriebene Zuckerkette gebunden ist. Beispielsweise ist eine funktionelle Substanz offenbart, die eine Affinität für ein Retrovirus aufweist und an die Zuckerkette gebunden ist.
Die vorstehend beschriebene funktionelle Substanz kann von natürlich auftretenden Materialien erhalten werden, künstlich hergestellt werden (beispielsweise unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken oder chemischer Synthesetechniken) oder durch Vereinigen einer natürlich auftretenden Substanz und einer künstlich hergestellten Substanz hergestellt werden.
Die Heparin II-bindende Domäne von Fibronectin, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann in einer im Wesentlichen reinen Form aus natürlich auftretenden Materialien gemäß Verfahren hergestellt werden, wie sie beispielsweise in J. Biol. Chem., 256: 7277 (1981), J. Cell. Biol., 102: 449 (1986) oder J. Cell. Biol., 105: 489 (1987) beschrieben sind. Die Heparin II-bindende Domäne von Fibronectin kann unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken wie in der US-PS 5,198,423 beschrieben hergestellt werden. Insbesondere sind ein Fibronectinfrag ment mit einer Heparin II-Domäne, die eine Retrovirus-Bindestelle ist, wie rekombinante Polypeptide, einschließlich CH-296 (RetroNectin), H-271, H-296 und CH-271, sowie ein Verfahren zu deren Gewinnung detailliert in dem Patent beschrieben. Diese Fragmente können durch Kultivierung von Escherichia coli-Stämmen erhalten werden, die unter den Zugangsnummern FERM P-10721 (H-296) (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 12. Mai 1989), FERM BP-2799 (CH-271) (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 12. Mai 1989), FERM BP-2800 (CH-296) (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 12. Mai 1989) und FERM BP-2264 (H-271) (Datum der ursprünglichen Hinterlegung: 30. Januar 1989) bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan hinterlegt sind, wie in der Veröffentlichung beschrieben. Des Weiteren können Fragmente, die typischerweise von diesen Fragmenten abgeleitet werden können, durch ein Modifizieren der Plasmide dieser Escherichia coli-Stämme unter Verwendung bekannter rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden.
Unter den vorstehend beschriebenen Fibronectinfragmenten weisen CH-296 und CH-271 Liganden für VLA-5 auf und CH-296 und H-296 weisen Liganden für VLA-4 auf. Somit sind sie für eine Ansteuerung von Zellen verwendbar, die VLA-5 oder VLA-4 exprimieren. Beispielsweise ist eine funktionelle Substanz mit einem Liganden für VLA-4 für einen Transfer eines Gens in hämatopoetische Stammzellen verwendbar.
Eine Zelle ist offenbart, die eine Affinität für eine Zielzelle aufweist. Bestimmte Zellen weisen Affinitäten auf, die für Organe, Gewebe oder Zellen spezifisch sind. Somit ist die Zelle als Träger für eine Infektion einer Zielzelle mit einem Virusvektor in vivo verwendbar. Eine Ansteuerung einer Zielzelle durch ein Gen unter Verwendung einer Zelle als Träger ist nachstehend beispielhaft beschrieben.
1. Gentransfer unter Verwendung vaskulärer Endothelzellen als Träger
Eine vaskuläre Endothelzelle weist die Eigenschaft auf, dass sie sich spezifisch an einer Stelle anhäuft, an der sich ein Blutgefäß neu bildet. Eine Steuerung eines Gens unter Verwendung einer vaskulären Endothelzelle als Träger kann unter Verwendung dieser Eigenschaft erfolgen.
Krebszellen induzieren eine Vaskularisation um sich herum, um zu wachsen, Nährstoffe aufzunehmen und Abfallstoffe über die gebildeten Blutgefäße auszuscheiden. Krebs kann durch einen Transport eines Virusvektors an eine Vaskularisationsstelle um die Krebszellen unter Ausnutzung der vorstehend beschriebenen Eigenschaft der vaskulären Endothelzelle behandelt werden. Beispielsweise kann ein Suizidgen wie HSV-TK als therapeutisches Gen transferiert werden, um direkt Krebsgewebe anzugreifen. Alternativ kann ein Gen, das eine Vaskularisation hemmt, transferiert werden, um die Aufnahme von Nährstoffen durch Krebszellen zu hemmen und eine Regression des Krebses einzuleiten. Für eine derartige Krebstherapie festgestellte Nebenwirkungen sind geringer als sie für eine herkömmliche Chemotherapie oder Radiotherapie festgestellt wurden. Die physische Last eines Patienten aufgrund einer Operation wird dramatisch durch Verwendung einer einfachen Behandlung verringert, die ein Impfen mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung für eine Gentherapie umfasst.
Es ist bevorzugt, die Entwicklung eines kollateralen Kreislaufsystems zu beschleunigen, um den ischämischen Zustand zu überwinden, der nach einer Blutgefäß-Bypassoperation bei einem Gehirninfarkt oder Myokardinfarkt festgestellt wird. In diesem Fall wird der ischämische Zustand durch Transfer eines Gens, das an der Beschleunigung von Vaskularisation beteiligt ist, an eine Vaskularisationsstelle um die Operationsstelle unter Verwendung einer Gefäßendothelzelle als Träger gelindert.
2. Gentransfer in entzündetes Gewebe unter Verwendung einer Entzündungszelle als Träger
In dem Fall einer allergischen Entzündung wie Bronchialasthma heften sich Entzündungszellen aus dem Blutgefäßlumen an die Blutgefäßwand an, wandern durch Gefäßendothelzellen und bewegen sich sodann in das Stroma, um eine Entzündung der Schleimhaut des Respirationstrakts zu verursachen. Eine Therapie kann unter Zuhilfenahme dieser Eigenschaft einer Entzündungszelle, an einer Entzündungsstelle akkumuliert zu werden, durchgeführt werden. Entzündungszellen, die als Träger verwendet werden können, umfassen Eosinophile, Mastzellen und Lymphozyten. Beispielsweise wird bei einer Adhäsion von Entzündungszellen an die Blutgefäßwand, was der erste Schritt einer Akkumulation ist, die Adhäsion von Entzündungszellen gehemmt und die Akkumulation findet sodann nicht statt, falls ein Gen, das an einer Hemmung der Adhäsion beteiligt ist, in Gefäßendothelzellen transferiert wird.
3. Gentransfer in die Knochenmark-Mikroumgebung unter Verwendung von hämatopoetischen Stammzellen als Träger
Eine hämatopoetische Stammzelle weist die Eigenschaft auf, dass sie die Knochenmark-Mikroumgebung ansteuert. Eine Zielsteuerung eines Gens kann unter Ausnutzung dieser Eigenschaft erfolgen. Wenn hämatopoetische Stammzellen die Knochenmark-Mikroumgebung zusammen mit einem Virusvektor ansteuern, kann ein nützliches Gen in die Knochenmark-Mikroumgebung transferiert werden, einschließlich benachbart zu anderen hämatopoetischen Stammzellen und Zellen, die die Knochenmark-Mikroumgebung ausmachen, wie Stromazellen.
4. Gentransfer in einen Gehirntumor unter Verwendung von Gehirn-Endothelzellen als Träger
Eine Zielsteuerung an eine Stelle eines Gehirntumors kann durch Binden eines Virusvektors an von dem Gehirn abgeleitete Endothelzellen erfolgen. Insbesondere weist ein Retrovirusvektor die Eigenschaft auf, dass er sich teilende Zellen mit hoher Wirksamkeit infiziert. Somit kann er ein heilendes Gen spezifisch in einen Gehirntumor transportieren ohne dass nicht-teilende normale Zellen, die den Tumor umgeben, infiziert werden.
5. Gentransfer unter Verwendung einer Zelle, die zur Regeneration von Gewebe fähig ist, als Träger
Kürzlich wurde die Regeneration von Blutgefäßen unter Verwendung von Knochenmarkszellen beschrieben und es erfolgte eine Behandlung von Myokardinfarkt unter Verwendung dieser Feststellung. Der Blutfluss in einem Herzmuskel im Infarktzustand wird durch Injektion von Knochenmarkszellen in den Herzmuskel verbessert. Wenn Knochenmarkszellen ermöglicht wird, einen Virusvektor mit einem nützlichen Gen (wie einem die Vaskularisation beschleunigendem Gen) unter Ausnutzung dieser Eigenschaft zu transportieren, wird die Fähigkeit der Knochenmarkszellen, Blutgefäße zu regenerieren, dramatisch aufgrund einer synergistischen Wirkung mit dem transferierten Gen gesteigert. Des Weiteren sind Knochenmarkszellen fähig, in Knochen, Knorpel, Sehne, Fettzellen, Skelettmuskel und Stromazellen zu dif ferenzieren und dieses zu regenerieren wie dies bei mesenchymalen Stammzellen der Fall ist. Daher können Knochenmarkszellen für eine Beschleunigung einer Regeneration von Geweben oder Zellen, für eine Stellen-spezifische Behandlung und dergleichen durch eine Verwendung der Knochenmarkszellen für einen Transport eines therapeutischen Gens, das für diesen Zweck geeignet ist, verwendet werden.
Es werden funktionelle Substanzen beschrieben, die eine Substanz umfassen, die aus einer funktionellen Substanz mit einer Affinität für ein Virus und einer funktionellen Substanz mit einer Affinität für eine Zielzelle besteht. Beispiele für die funktionellen Substanzen sind eine funktionelle Substanz, die aus einem gegen eine Zielzelle gerichteten Antikörper mit einer für eine Zielzelle spezifischen Affinität und einem gegen ein Virus gerichteten Antikörper mit einer für ein Retrovirus spezifischen Affinität besteht, eine funktionelle Substanz, die aus einer Zuckerkette mit einer für eine Zielzelle spezifischen Affinität und einem gegen ein Virus gerichteten Antikörper mit einer für ein Retrovirus spezifischen Affinität besteht, und eine funktionelle Substanz, die aus einer Zelle mit einer für eine Zielzelle spezifischen Affinität und einem Polypeptid mit einer für ein Retrovirus spezifischen Affinität besteht. Es wird ein Gen beschrieben, das in spezifische Zellen in einem lebenden Körper, in dem verschiedene Zelltypen koexistieren, unter Verwendung einer solchen funktionellen Substanz transferiert wird. Insbesondere sollen Zuckerketten die Erscheinungsbilder von Zellen sein, da sie verschiedene Eigenschaften von Zellen bestimmen und Zellen über verschiedene Zuckerketten sich erkennen und miteinander Wechselwirken. Somit wird eine Zielsteuerung eines Gentransfers unter Verwendung dieser Spezifität von Zuckerketten beschrieben, was die genaueste Missile-Gentherapie in vivo ermöglicht, falls sie zusammen mit einem Antikörper, der eine spezifische Bindefähigkeit aufweist, verwendet wird.
Beispiele für die erfindungsgemäße Zusammensetzung für eine Gentherapie unter Verwendung einer Zelle als Träger sind eine Zusammensetzung, in der eine funktionelle Substanz mit einer Affinität für einen Retrovirusvektor an eine Zelle mit einer für eine Zielzelle spezifischen Affinität gebunden ist. Verfahren, die für ein Binden funktioneller Substanzen an Zellen verwendet werden, umfassen ein Verfahren, bei dem eine funktionelle Substanz chemisch an eine Zelle gebunden wird, und ein Verfahren, bei dem eine funktionelle Substanz verwendet wird, die sowohl eine Affinität für einen Virusvektor, als auch eine Affinität, die für eine Zelle spezifisch ist, die als Träger verwendet werden soll, aufweist.
Ferner kann eine Zelle als Träger verwendet werden, die eine für einen Retrovirusvektor spezifische Affinität und eine für eine Zielzelle spezifische Affinität aufweist. Native Zellen werden beschrieben, die inhärent beide der vorstehend beschriebenen Eigenschaften aufweisen. Alternativ wird eine Zelle beschrieben, auf die eine oder beide der zwei Affinitäten künstlich übertragen wurden. Eine für eine Zielzelle spezifische Affinität kann dadurch übertragen werden, dass die Zelle veranlasst wird, eine funktionelle Substanz mit einer für die Zielzellen spezifischen Affinität (z. B. ein Ligand für einen auf der Zielzelle exprimierten Rezeptor oder ein Antikörper gegen ein Oberflächenantigen auf der Zielzelle) auf der Oberfläche der Zelle zu exprimieren. Des Weiteren kann eine Affinität für einen Retrovirusvektor in ähnlicher Weise dadurch übertragen werden, dass eine funktionelle Substanz mit einer für den Retrovirusvektor spezifischen Affinität auf der Oberfläche der Trägerzelle exprimiert wird.
Trägerzellen, die ausgehend von dem Patienten, dem die erfindungsgemäße Zusammensetzung für eine Gentherapie verabreicht werden soll, hergestellt werden, werden nicht durch eine Immunität oder dergleichen beseitigt. Somit sind sie besonders für therapeutische Zwecke bevorzugt. Falls die Herstellung von Trägerzellen aus einem Patienten unmöglich ist, können Zellen verwendet werden, die von einem anderen Individuum oder einer anderen Tierspezies abgeleitet sind. In diesem Fall vermehren sich die Zellen nicht und verschwinden, sobald sich Zellen nach einer bestimmten Zeitspanne nach der Verabreichung in den lebenden Körper zu teilen beginnen, falls die Zellen mit Strahlung oder einem Arzneimittel behandelt wurden. Solche Zellen sind für den Zweck eines Transports eines Virusvektors ausreichend funktionell.
Des Weiteren kann die Wirksamkeit des Gentransfers weiter dadurch erhöht werden, dass die Wechselwirkung (z. B. Signaltransduktion) zwischen der Trägerzelle und der Zielzelle ausgenutzt wird, um einen Zustand zu erzeugen, bei dem die Zielzelle gegenüber einer Infektion mit dem Retrovirusvektor empfänglich wird, beispielsweise um den Zellzyklus zu beschleunigen.
Eine Zusammensetzung für eine Gentherapie, die für eine Behandlung einer Erkrankung verwendet wird, die gegenüber einer Gentherapie empfänglich ist, kann dadurch hergestellt werden, dass als wirksamer Bestandteil eine wirksame Menge einer Zelle als Träger verwendet wird, die eine Affinität für ein Retrovirus, das ein für eine Gentherapie nützliches Gen enthält, und eine Affinität, die für eine Zielzelle spezifisch ist, für die ein Transfer des Gens erforderlich ist, aufweist. Des Weiteren kann eine Zusammensetzung für eine Gentherapie für eine Behandlung einer Erkrankung, die einer Gentherapie zugänglich ist, dadurch hergestellt werden, dass als wirksame Bestandteile eine wirksame Menge einer funktionellen Substanz mit einer Affinität für ein Virus, das ein für eine Gentherapie nützliches Gen enthält, und eine wirksame Menge einer weiteren funktionellen Substanz mit einer Affinität, die für eine Zielzelle spezifisch ist, für die ein Transfer des Gens erforderlich ist, verwendet werden.
Die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung kann dadurch hergestellt werden, dass eine wirksame Menge der vorstehend beschriebenen funktionellen Substanz als wirksamer Bestandteil verwendet wird, und sie mit einem bekannten pharmazeutischen Träger formuliert wird. Die Zusammensetzung kann als injizierbare Zubereitung oder als Tropfinfusion verabreicht werden.
Eine Dosis der therapeutischen Zusammensetzung wird in geeigneter Weise bestimmt und variiert abhängig von der spezifischen Dosisform, dem spezifischen Verabreichungsweg und dem spezifischen Zweck, sowie dem Alter, Gewicht und Zustand eines zu behandelnden Patienten. Im Allgemeinen beträgt eine Tagesdosis für eine erwachsene Person 10 μg bis 200 mg/kg hinsichtlich der Menge des in der Formulierung enthaltenen wirksamen Bestandteils. Natürlich kann die Dosis abhängig von verschiedenen Faktoren variieren. Daher kann in manchen Fällen eine geringere Dosis als die vorstehende ausreichend sein, jedoch kann in anderen Fällen eine Dosis, die höher ist als die vorstehende, erforderlich sein.
Erfindungsgemäß wird ein gentherapeutisches Verfahren bereitgestellt, das eine Verabreichung einer wirksamen Menge der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung als wirksamen Bestandteil umfasst.
In dem erfindungsgemäßen gentherapeutischen Verfahren kann die Zelle als Träger mit einer Affinität für ein Retrovirus in Bindung an eine wirksame Menge eines Retrovirus mit einem für eine Gentherapie nützlichen Gen verabreicht werden. Alternativ kann eine Zelle als Träger mit einer Affinität für ein Retrovirus verabreicht werden, so dass sie an das Retrovirus aufgrund ihrer Affinität in vivo bindet. In beiden Fällen wird die Verabreichungsart derart bestimmt, dass ein Gen wirksam in Zielzellen in vivo transferiert wird.
Obwohl die Erfindung nicht darauf beschränkt werden soll, ist es bevorzugt, ein Verfahren für eine Verabreichung auszuwählen, das dafür geeignet ist, dass die erfindungsgemäße Zusammensetzung für eine Gentherapie Zielzellen erreicht.
Beispiele für Zellen, die erfindungsgemäß als ein Ziel für einen Gentransfer verwendet werden sollen, umfassen in nicht begrenzender Weise Stammzellen, hämatopoetische Zellen, nicht-adhäsive mononukleäre Zellen mit geringer Dichte, adhäsive Zellen, Knochenmarkszellen, hämatopoetische Stammzellen, periphere Blutstammzellen, Nabelschnurblutzellen, fötale hämatopoetische Stammzellen, nicht-menschliche embryonale Stammzellen, nicht-menschliche embryonale Zellen, primitive Keimzellen, Oozyten, Oogonien, Eizellen, Spermatozyten, Spermien, CD34+-Zellen, C-Kit+-Zellen, pluripotente hämatopoetische Vorläuferzellen, unipotente hämatopoetische Vorläuferzellen, erythroidale Vorläuferzellen, lymphoidale Mutterzellen, reife Blutzellen, Blutzellen, Leukozyten, Lymphozyten, B-Zellen, T-Zellen, Tumor-infiltrierende Lymphozyten, Fibroblasten, Neuroblasten, Neurozyten, Endothelzellen, Gefäßendothelzellen, Häpatozyten, Myoblasten, Skelettmuskelzellen, Zellen der glatten Muskulatur, Krebszellen, Myelomzellen und Leukämiezellen.
Manche Gentherapien unter Verwendung hämatopoetischer Stammzellen als Zielzellen dienen einer Ergänzung eines defizienten oder abnormalen Gens in einem Patienten. Beispiele davon umfassen die Gentherapie bezüglich Adenosindeaminase(ADA)-Defizienz (vgl. US-PS 5399346 ) und Gaucher-Syndrom. Des Weiteren kann ein Arzneimittelresistenzgen in hämatopoetische Stammzellen transferiert werden, um die Schädigung von hämatopoetischen Zellen aufgrund Chemotherapeutika, die für die Behandlung von beispielsweise Krebs oder Leukämie verwendet werden, zu lindern.
Des Weiteren wurde ein therapeutisches Verfahren, bei dem ein Suizidgen wie Thymidinkinasegen in Krebszellen transferiert wird und sodann ein Arzneimittel verabreicht wird, um die Zellen abzutöten, als Gentherapie für Krebs untersucht (Science, 256: 1550–1552 (1992)). Des Weiteren werden Versuche unternommen AIDS unter Verwendung von Gentherapie zu behandeln. In diesem Fall findet das nachstehende Verfahren Berücksichtigung. Bei dem Verfahren wird ein Gen, das für ein Nukleinsäuremolekül (z. B. eine Antisense-Nukleinsäure oder ein Ribozym) kodiert, das mit der Replikation oder der Genexpression des menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) interferiert, in T-Zellen transferiert, die mit dem kausativen Agenz von AIDS, HIV, infizierbar sind [vgl. z. B. J. Virol., 69: 4045–4052 (1995)]. Der erfin dungsgemäße Zielzell-spezifische Gentransfer kann die Wirksamkeit von Gentherapien wie vorstehend beschrieben erhöhen.
Wie vorstehend detailliert beschrieben kann eine Erkrankung, die für ihre Behandlung eine Gentherapie erfordert, durch einen spezifischen Transfer eines Gens in Zielzellen in vivo unter Verwendung der erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzung und des erfindungsgemäßen therapeutischen Verfahrens behandelt werden. Keine akute Toxizität wird festgestellt, wenn die erfindungsgemäße therapeutische Zusammensetzung bei einer physiologisch wirksamen Konzentration in einen lebenden Körper verabreicht wird.
Beispiele
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung detaillierter, sind jedoch nicht beschrankend für den Schutzumfang zu verstehen.
Beispiel 1

(1) Der Vektor PGK-hADA (Nature Medicine, 2: 876–882 (1996)), ein PGK-Vektor mit einem humanen ADA-Gen (hADA), hergestellt durch EPHA-5-Produzentenzellen (Nature Medicine, 2: 876–882 (1996)), und eine injizierbare Zubereitung von RetroNectin wie nachstehend in Beispiel 2 beschrieben wurden in die Schwanzvene einer C3H/HeJ-Maus (8 Wochen alt, von Japan SLC bezogen) injiziert. Eine Transduktion hämatopoetischer Stammzellen wurde wie in Nature Medicine, 2: 876–882 (1996) beschrieben durch Untersuchung der Expression der transduzierten humanen ADA-cDNA in der Maus mit einem transferierten Gen untersucht. Insbesondere wurde das Vorhandensein von humanem ADA-Protein in peripheren Blutzellen aus der Maus durch ADA-Isozymanalyse bestätigt, bei der Celluloseacetat-Elektrophorese für einen Nachweis verwendet wird. Die Untersuchung erfolgte am Anfang der vier Monate nach der Transplantation und wurde jeden Monat wiederholt.
(2) Analyse von transduziertem Knochenmark aus der transplantierten Maus unter Verwendung der Isozymanalyse nach neun Monaten bestätigte die Expression von humaner ADA-cDNA für eine Maus, der RetroNectin und der Vektor PGK-hADA verabreicht worden war. Humanes ADA wurde nicht in einer Kontrollmaus selektiert.

Beispiel 2
RetroNectin (CH-296, Takara Shuzo) wurde in Injektionswasser bei einer Konzentration von 2 mg/ml gelöst. Die Lösung wurde mit Kochsalzlösung äquilibriert, um injizierbare Zubereitungen herzustellen.
Beispiel 3: Gentransfer unter Verwendung von HL-60-Zellen als Träger
Das Polypeptid CH-271 wurde wie folgt hergestellt. Zusammengefasst wurde Escherichia coli HB101/pCH101 (FERM BP-2799) gemäß dem in der US-PS 5,198,423 beschriebenen Verfahren kultiviert. CH-271 wurde aus der Kultur erhalten.
HL-60 humane Leukämiezellen (bezogen von Dainippon Pharmaceutical) wurden in D-MEM-Medium (Bio Whittaker) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, Bio Whittaker) bei einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert. RetroNectin^TM (Takara Shuzo) oder CH-271 wurde zu 1 ml der Zellsuspension bei einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugefügt. Eine Kontrollgruppe, bei der keine derartige Substanz zugegeben wurde, wurde bereitgestellt.
100 μl einer Lösung mit 6,23 × 10⁶ cfu/ml eines ekotropen Retrovirusvektors mit einem Gen für verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) (pLEIN (Clontech), hergestellt unter Verwendung von GP+E-86-Zellen (ATCC CRL-9642)), wurde zu den Zellen gegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C 30 Minuten in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. Nach einer Inkubation wurden die Zellen zweimal durch Zentrifugation in D-MEM-Medium mit 10% FCS gewaschen, um den Virusvektor zu entfernen, der nicht an die Zellen adsorbierte. Nach dem Waschen durch Zentrifugation wurden die Zellen in 1 ml D-MEM-Medium mit 10% FCS suspendiert.
2 × 10⁶ der so erhaltenen HL-60-Zellen wurden zu einer 6 Well-Zellkulturschale (Falcon) gegeben, in der 2 × 10⁵ NIH/3T3-Zellen (ATCC CRL-1658) kultiviert worden waren. Die Zellen wurden bei 37°C zwei Tage in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. Nach einer Inkubation wurden an die Schale adhärierende NIH/3T3-Zellen gewonnen. EGFP-exprimierende Zellen wurden durch Flusscytometrie unter Verwendung von FACSVantage (Becton Dickinson) bei einer Exzitationswellenlänge von 488 nm und einer Emissionswellenlänge von 515–545 nm untersucht. Die Wirksamkeit des Gentransfers (das Verhältnis von EGFP-exprimierenden Zellen zu Gesamtzellen) wurde sodann berechnet. Die experimentellen Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie in 1 gezeigt, wurde eine signifikante Expression des EGFP-Gens, das von dem GP+E-86/EGFP-Retrovirusvektor abgeleitet ist, nur bei der Gruppe festgestellt, bei der RetroNectin (CH-296) zu den HL-60-Zellen gegeben worden war, was anzeigt, dass ein Gentransfer stattfand. Insbesondere wurde gezeigt, dass der Retrovirusvektor an HL-60-Zellen mittels RetroNectin adsorbiert werden konnte, sich NIH/3T3-Zellen als Zielzellen zusammen mit HL-60-Zellen annähern konnte und sodann die Zielzellen infizieren konnte. Der an die Zellen mittels RetroNectin adsorbierte Virusvektor wurde nicht nach Zentrifugation oder Waschen abgelöst und verlor bei einer Adsorption nicht seine Infektiösität. Wie vorstehend beschrieben, konnte eine Trägerzelle, die zur Adsorption eines Virus fähig war, einfach lediglich dadurch hergestellt werden, dass RetroNectin zu einer Zellsuspension gegeben wurde.
RetroNectin weist einen Liganden (CS-1) für VLA-4, das auf HL-60-Zellen exprimiert wird, zusätzlich zu einem Liganden für VLA-5 auf. Auf der anderen Seite weist CH-271 einen Liganden für VLA-5 auf, dessen Expressionsniveau auf HL-60 gering ist. Es wird vermutet, dass dieser Unterschied den Unterschied hinsichtlich der Wirksamkeit des Gentransfers widerspiegelt. Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, eine Affinität für ein Virus spezifisch auf die interessierenden Trägerzellen sogar in einem Zustand, in dem mehrere Zelltypen gemeinsam vorliegen, dadurch zu übertragen, dass in geeigneter Weise eine funktionelle Substanz mit einer Affinität für das Virus, das in Kombination mit den Zellen verwendet werden soll, (z. B. ein Fibronectinfragment) ausgewählt wird.
Beispiel 4
Gentransfer unter Verwendung von Gefäßendothelzellen als Träger
RetroNectin wurde bei einer Endkonzentration von 100 μg/ml zu 200 μl D-MEM-Medium (Bio Whittaker, supplementiert mit 10% FBS) mit 5 × 10⁵ Gefäßendothelzellen (HUVECs, bezogen von Bio Whittaker) gegeben. Eine Kontrollgruppe, zu der RetroNectin nicht gegeben wurde, wurde bereitgestellt.
200 μl einer Lösung mit GP+E-86/EGFP-Retrovirus bei einer Konzentration von 7,75 × 10⁶ cfu/ml wurden zu den Zellen gegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C 30 Minuten in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert. Nach Inkubation wurden die Zellen zweimal durch Zentrifugation in D-MEM-Medium mit 10% FCS gewaschen, um den Virusvektor zu entfernen, der nicht an die Zellen adsorbierte. Nach dem Waschen durch Zentrifugation wurden die Zellen in 100 μl D-MEM-Medium mit 10% FCS suspendiert. 5 × 10⁵ HUVEC-Zellen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt worden waren, wurden mit 1 × 10⁵ L1210-Zellen (bezogen von Dainippon Pharmaceutical) in 500 μl RPMI 1640-Medium (Bio Whittaker, supplementiert mit 10% FBS) gemischt und in eine 24 Well-Schale (Falcon) überführt. Die Zellen wurden bei 37°C 4 Tage in einem 5% CO₂-Inkubator inkubiert.
Bei einer Untersuchung der Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop nach einer Kultivierung wurde ein Cluster von HUVECs, das von L1210-Zellen umgeben war, festgestellt, was zeigt, dass HUVECs eine Affinität für L1210-Zellen aufwiesen. Des Weiteren wurde eine Fluoreszenz ausgehend von EGFP für L1210-Zellen, die HUVECs umgaben, festgestellt, was zeigt, dass ein Gentransfer in diesen Zellen stattfand. Bei den Zellen, die dem vorstehend beschriebenen Verfahren ohne Zugabe von RetroNectin unterzogen worden waren, wurde festgestellt, dass HUVECs von L1210-Zellen umgeben waren, jedoch wurde keine Fluoreszenz festgestellt.
Durch das vorstehend Beschriebene wurde gezeigt, dass Zielzellen durch ein Gen angesteuert werden können, wenn HUVEC und eine funktionelle Substanz wie RetroNectin in Kombination verwendet werden.
Beispiel 5: Ansteuerung von Gefäßendothelzellen
Unter Verwendung des Adenovirus-Expressionsvektor-Kits (Takara Shuzo) wurde der Adenovirusvektor AxCAiLacZ, der ein Kontrollplasmid mit einem lacZ-Gen aus dem Kit, pAxCAiLacZ, enthält, hergestellt. HUVECs, die in einer 10 cm-Schale (Falcon) nahezu zur Konfluenz kultiviert worden waren, wurden mit dem Adenovirusvektor AxCAiLacZ bei einem m. o. i.-Wert von 10 infiziert und die Kultivierung wurde fortgesetzt. Die drei Tage nach der Infektion gewonnenen Zellen wurden als LacZ-HUVECs bezeichnet.
1 × 10⁶ Zellen einer Maus-Fibrosarkom-Zelllinie, Meth-A (abgegeben durch das Institute of Physical and Chemical Research (RIKEN), RCB 0464), wurden subkutan in eine SCID-Maus (von Clea Japan bezogen) transplantiert. 2 × 10⁶ LacZ-HUVECs wurden über die Schwanzvene 5 Tage nach der Transplantation geimpft. Tumor, Peritoneum (zusammen mit der Abdomenwand), für das eine Vaskularisation an zu dem Tumor benachbarten Stellen festgestellt worden war, und verschiedene Organe (Leber, Milz, Herz, Niere und Lunge) wurden der Maus sieben Tage nach der Beimpfung entfernt. Alles wurde unter Verwendung von X-gal (Takara Shuzo) gefärbt, um die Lage von LacZ-HUVECs zu untersuchen. Des Weiteren wurde ein Teil der LacZ-HUVECs einer Kultivierung in einer Schale zur gleichen Zeit wie die Beimpfung der Maus unterzogen und mit X-gal gefärbt, sobald der Tumor, das Peritoneum und die Organe gefärbt wurden, um zu bestätigen, dass LacZ-HUVECs das LacZ-Gen aufwiesen.
In der Schale kultivierte LacZ-HUVECs wurden mit X-gal blau angefärbt, was bestätigt, dass sie das lacZ-Gen trugen. Teile des entfernten Tumors und Peritoneums wurden durch X-gal blau angefärbt. Insbesondere wurde eine linienförmige Blaufärbung entlang der Stellen einer Vaskularisation in dem Peritoneum festgestellt, was bestätigt, dass sich LacZ-HUVECs an den Stellen einer Vaskularisation befanden. Des Weiteren wurde eine Blaufärbung auch für einen Teil des Tumors festgestellt. Somit wurde gezeigt, dass die verabreichten HUVECs selektiv an den Stellen einer Vaskularisation angehäuft wurden.
Wie vorstehend beschrieben wurde gezeigt, dass HUVECs als Träger für einen Transfer eines Gens an eine Stelle einer Tumorigenese und eine Stelle einer Vaskularisation verwendet werden können.
Industrielle Anwendbarkeit
Erfindungsgemäß wird eine Therapie bereitgestellt, die eine Zielsteuerung eines Gentransfers in Zielzellen in vivo ermöglicht, wobei ein Gen spezifisch in interessierende Zielzellen transferiert wird. Die Therapie ist demzufolge für eine Behandlung von Erkrankungen verwendbar, die einer Gentherapie zugänglich sind. Des Weiteren wird eine Zusammensetzung für die Therapie bereitgestellt. Weiterhin wird erfindungsgemäß ein gentherapeutisches Verfahren, das eine Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzung umfasst, und ein gentherapeutisches Verfahren, das einen Transfer eines Gens in Zielzellen in vivo umfasst, bereitgestellt.

Claims

Zusammensetzung zur Gentherapie, die zur Behandlung einer der Gentherapie zugänglichen Krankheit verwendet wird und die als Wirkstoffe eine wirksame Menge eines Retrovirus, das ein für Gentherapie verwendbares Gen enthält, sowie eine wirksame Menge einer Zelle als Träger enthält, die eine Affinität für das Retrovirus und eine Affinität, die für eine Zielzelle, für die ein Transfer des Gens benötigt wird, spezifisch ist, aufweist, wobei die Affinität für das Retrovirus von einer funktionellen Substanz abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Anti-Virus-Antikörpern, Heparin II-bindender Domäne von Fibronectin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Kollagen und Polylysin, und durch Binden der funktionellen Substanz an die Zelle als Träger oder durch Expression der funktionellen Substanz an der Oberfläche der Zelle als Träger verliehen wird.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die Affinität für die Zielzelle dadurch verliehen wird, dass die Zelle als Träger dazu veranlasst wird, eine funktionelle Substanz, die die Affinität für die Zielzelle aufweist, auf der Zelle als Träger zu exprimieren, wobei die funktionelle Substanz ein Ligand für einen auf der Zielzelle exprimierten Rezeptor oder ein Antikörper gegen ein Oberflächen-Antigen auf der Zielzelle ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle als Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus vaskulären Endothelzellen, Entzündungszellen, hämatopoetischen Stammzellen, Endothelzellen des Gehirns und Knochenmarkzellen.
Verwendung einer wirksamen Menge einer Zelle als Träger, die eine Affinität für ein Retrovirus, das ein für Gentherapie verwendbares Gen enthält, und eine Affinität, die für eine Zielzelle, für die ein Transfer des Gens benötigt wird, spezifisch ist, aufweist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für Gentherapie zur Behandlung einer der Gentherapie zugängliche Krankheit, wobei die Affinität für das Retrovirus von einer funktionellen Substanz abgeleitet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Anti-Virus-Antikörpern, Heparin II-bindender Domäne von Fibronectin, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Kollagen und Polylysin, und durch Binden der funktionellen Substanz an die Zelle als Träger oder durch Expression der funktionellen Substanz an der Oberfläche der Zelle als Träger verliehen wird.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die Affinität für die Zielzelle dadurch verliehen wird, dass die Zelle als Träger dazu veranlasst wird, eine funktionelle Substanz, die die Affinität für die Zielzelle aufweist, auf der Zelle als Träger zu exprimieren, wobei die funktionelle Substanz ein Ligand für einen auf der Zielzelle exprimierten Rezeptor oder ein Antikörper gegen ein Oberflächen-Antigen auf der Zielzelle ist.
Verwendung gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge des Retrovirus enthält, das ein für Gentherapie verwendbares Gen enthält.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Zelle als Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus vaskulären Endothelzellen, Entzündungszellen, hämatopoetischen Stammzellen, Endothelzellen des Gehirns und Knochenmarkszellen.
Zusammensetzung oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zielzelle eine Zelle ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus hämatopoetischen Stammzellen, Blutzellen, Leukozyten, Lymphozyten, T-Zellen, Tumor-infiltrierenden Lymphozyten, B-Zellen und Krebszellen.
Zusammensetzung oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 bis 8, wobei das für Gentherapie verwendbare Gen ein therapeutisches Protein kodiert, das bei Expression des Gens in der Zielzelle in einer Menge exprimiert wird, die für die Behandlung ausreichend ist.
Zusammensetzung oder Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei das therapeutische Protein ein Enzym oder ein Cytokin ist.
Zusammensetzung oder Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 bis 10, wobei das Retrovirus ein Retrovirus-Vektor ist.