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ES2228497T3 - Composicion adyuvante que comprende saponina y un oligonucleotido inmunoestimulante. - Google Patents

Composicion adyuvante que comprende saponina y un oligonucleotido inmunoestimulante.

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Publication number
ES2228497T3
ES2228497T3 ES00920647T ES00920647T ES2228497T3 ES 2228497 T3 ES2228497 T3 ES 2228497T3 ES 00920647 T ES00920647 T ES 00920647T ES 00920647 T ES00920647 T ES 00920647T ES 2228497 T3 ES2228497 T3 ES 2228497T3
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ES
Spain
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saponin
vaccine
cpg
oligonucleotide
antigen
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES00920647T
Other languages
English (en)
Inventor
Martin SmithKline Beecham Biologicals SA FRIEDE
Nathalie Garcon
Philippe Hermand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
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Priority claimed from US09/301,829 external-priority patent/US6558670B1/en
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Una composición adyuvante que comprende una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulante, en la que la saponina está en forma de un ISCOM, o un liposoma formulado con colesterol y lípido, o una emulsión de aceite en agua, o está asociada con una sal metálica o quitosano.

Description

Composición adyuvante que comprende saponina y un oligonucleótido inmunoestimulante.
La presente invención se refiere a composiciones adyuvantes novedosas para su uso en vacunas. En particular, las composiciones adyuvantes de la presente invención comprenden una combinación de saponina y un oligonucleótido inmunoestimulante, dicha combinación opcionalmente comprende además un vehículo. Se proporcionan también por la presente invención vacunas que comprenden las composiciones adyuvantes de la presente invención y al menos un antígeno. Se proporcionan además procedimientos de fabricación de las composiciones adyuvantes y de las vacunas de la presente invención y su uso como medicamentos. Adicionalmente, la presente invención proporciona procedimientos para tratar un individuo susceptible a, o que padezca, una enfermedad mediante la administración parenteral o a través de mucosas de las vacunas de la presente invención.
Se conocen en la técnica oligonucleótidos inmunoestimulantes que contienen dinucleótidos CpG no metilados ("CpG") por ser adyuvantes cuando se administran tanto por vía sistémica como a través de mucosas (documentos WO 96/02555, EP 468520, Davis et al., J. Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskie and Davis, J. Immunol, 1998, 161(9):4463-6). CpG es una abreviatura para los motivos de dinucleótidos citosina-guanosina presentes en el ADN. Históricamente, se observó que la fracción de ADN de BCG podía ejercer un efecto antitumoral. En estudios posteriores, se mostró que los oligonucleótidos sintéticos derivados de las secuencias génicas BCG eran capaces de inducir efectos inmunoestimulantes (tanto in vitro como in vivo). Los autores de estos estudios concluyeron que ciertas secuencias palindrómicas, que incluyen una secuencia motivo CG central, portan esta actividad. El papel central de la secuencia motivo CG en la inmunoestimulación era aclarado más tarde en una publicación de Krieg, Nature 374, pág. 546, 1995. El análisis detallado ha mostrado que la secuencia motivo CG tiene que estar en una cierto entorno de secuencia, y que tales secuencias son comunes en el ADN bacteriano, pero son raras en el ADN de vertebrados. La secuencia inmunoestimulante es con frecuencia: purina, purina, C, G, pirimidina, pirimidina, en la que la secuencia motivo dinucleótido CG no está metilada, pero se conocen otras secuencias CpG no metiladas que son inmunoestimulantes y pueden usarse en la presente invención. El documento WO98/18810 describe adyuvantes CpG que se pueden combinar con otros adyuvantes convencionales.
En ciertas combinaciones de los seis nucleótidos está presente una secuencia palindrómica. Varias de estas secuencias motivo, bien como una repetición de una secuencia motivo o bien como una combinación de diferentes secuencias motivo, pueden estar presente en el mismo oligonucleótido. La presencia de una o más de estas secuencias inmunoestimulantes que contienen oligonucleótidos puede activar diversas subseries inmunes, que incluyen los linfocitos citolíticos naturales (que producen interferón \gamma y tienen actividad citolítica) y macrófagos (Wooldrige et al. Vol 89 (Nº 8), 1977). Aunque otras secuencias que contienen CpG no metiladas no tienen esta secuencia consenso, ahora se demuestra que son inmunomoduladores.
Cuando se formula el CpG en vacunas, se administra generalmente en disolución libre junto con un antígeno libre (documento WO 96/02555; McCluskie and Davis, según anteriormente) o conjugado covalentemente con un antígeno (publicación PCT Nº WO 98/16247), o formulado con un vehículo tal como hidróxido de aluminio (antígeno de superficie del virus de la hepatitis) Davis et al., según anteriormente; Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EEUU, 1998, 95(26), 15553-15558).
Las saponinas se tratan en: Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol. 2 págs. 363-386). Las saponinas son esteroides o glicósidos triterpenos ampliamente distribuidos en el reino vegetal y en animales marinos. Las saponinas se distinguen por formar disoluciones coloidales en agua que forman espuma en agitación, y por precipitar el colesterol. Cuando las saponinas están cerca de membranas celulares crean estructuras con forma de poros en las membranas que causan el estallido de la membrana. La hemólisis de los eritrocitos es un ejemplo de este fenómeno, que es una propiedad de ciertas saponinas, pero no de todas.
Se conocen las saponinas como adyuvantes en vacunas para la administración sistémica. La actividad adyuvante y hemolítica de las saponinas individuales se ha estudiado extensivamente en la técnica (Lacaille-Dubois and Wagner, según anteriormente). Por ejemplo, la Quil A (derivada de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina), y las fracciones de la misma, se describen en el documento de los Estados Unidos 5.057.540 y en "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2); 1-55; y en el documento EP 0 362 279 B1.
Las estructuras particuladas, denominadas Complejos Inmunoestimulantes (ISCOM), que comprenden fracciones de Quil A son hemolíticas y se han usado en la fabricación de vacunas (Morein, B., documento EP 0 109 942 B1). Se ha descrito que estas estructuras tienen actividad adyuvante. (documento EP 0 109 942 B1; documento WO 96/11711).
Se han descrito las saponinas hemolíticas QS21 y QS17 (fracciones purificadas por HPLC de Quil A) como adyuvantes sistémicos potentes, y el procedimiento de su producción se describe en la patente de los Estados Unidos Nº 5.057.540 y en el documento EP 0 362 279 B1. También se describe en estas referencias el uso de QS7 (una fracción no hemolítica de Quil-A) que actúa como un adyuvante potente para las vacunas sistémicas. EL uso de QS21 se describe además en Kensil et al. (1991. J. Inmunology vol 146, 431-437). Las combinaciones de QS21 y polisorbato o ciclodextrina se conocen también (documento WO 99/10008). Los sistemas de adyuvantes particulados que comprenden fracciones de Quil A, tales como QS21 y QS7 se describen en el documento WO 96/33739 y en el documento WO 96/11711.
Otras saponinas que se han usado en los estudios de vacunación sistémica incluyen aquellas derivadas de otras especies vegetales tales como Gypsophila y Saponaria (Bomford et. al., Vaccine, 10(9):572-577, 1992).
Se conoce también que las saponinas han sido usadas en estudios de vacunas aplicadas a través de mucosas, que han conseguido con distinto éxito la inducción de respuestas inmunes. Se ha mostrado previamente que la saponina Quil-A no tiene efecto en la inducción de una respuesta inmune cuando se administra un antígeno por vía intranasal (Gizurarson et al. 1994. Vaccine Research, 3, 23-29). Mientras que otros autores han usado este adyuvante con éxito (Maharaj et al., Can. J. Microbiol, 1986, 32(5):414-420; Chavali and Campbell, Immunobiology, 174(3):347-59). Los ISCOM que comprenden saponina Quil A se han usado en formulaciones de vacunas intragástricas e intranasales y muestran una actividad adyuvante (McI Mowat et al., 1991, Immunology, 72, 317-322; McI Mowat and Donachie, Immunology Today, 12, 383-385). El documento WO 98/5415 describe una vacuna oral que comprende QS21, opcionalmente junto con CpG. No existe descripción de la combinación sinérgica de CpG y saponina en las formas reivindicadas en la presente memoria, en el documento WO98/56415.
También se ha descrito la QS21, la fracción no tóxica de Quil A, como un adyuvante oral o intranasal (Sumino et al., J. Virol., 1998, 72(6):4931-9; documento WO 98/56415).
WO00/09159 es una solicitud de patente en tramitación con la presente que constituye novedad sólo como técnica anterior según el artículo 54 (3) del Convenio Europeo de Patentes. Este documento describe la combinación de CpG junto con saponina. Sin embargo, el documento WO/09159 no hace mención a la forma de la saponina que se reivindica en la presente memoria.
Se ha descrito el uso de otras saponinas en estudios de vacunación intranasal. Por ejemplo, las saponinas Chenopodium quinoa se han usado tanto en vacunas intranasales como intragástricas (Estrada et al., Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 1998, 21(3):225-36).
La presente invención se refiere al hallazgo sorprendente de que las combinaciones de oligonucleótidos inmunoestimulantes (CpG) y saponinas son adyuvantes extremadamente potentes. Por lo tanto, se proporciona una composición adyuvante que comprende una combinación de saponina y un oligonucleótido inmunoestimulante. Preferiblemente, los adyuvantes de la presente invención pueden comprender además un vehículo. En una forma preferida de la presente invención la saponina y los oligonucleótidos en el adyuvante y las composiciones de vacunas actúan sinérgicamente en la inducción de los anticuerpos específicos para un antígeno y son potentes en la inducción de respuestas inmunes asociadas convencionalmente al sistema inmune de tipo Th1. Por lo tanto, las composiciones adyuvantes no son solo adecuadas para la inmunoprofilaxis de enfermedades, sino también, sorprendentemente, para la inmunoterapia de enfermedades tales como infecciones virales, bacterianas o parásitas persistentes, y también trastornos crónicos tales como el cáncer.
Los oligonucleótidos preferidos para su uso en adyuvantes o vacunas de la presente invención, contienen preferiblemente dos o más secuencias motivo dinucleótido CpG separadas por al menos, tres, más preferiblemente al menos seis o más nucleótidos. Los oligonucleótidos de la presente invención son típicamente desoxinucleótidos. En una realización preferida el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferiblemente un enlace fosforotioato, aunque los enlaces fosfodiester y otros enlaces internucleótidos están dentro del alcance de la invención que incluye oligonucleótidos con enlaces internucleótidos mezclados. Los procedimientos para producir oligonucleótidos fosforotioato o fosforoditioato se describen en los documentos US 5.666.153, US5.278.302 y WO 95/26204.
Los ejemplos de oligonucleótidos preferidos tienen las siguientes secuencias. Las secuencias contienen preferiblemente enlaces internucleótidos fosforotioato modificados.
OLIGO 1 (SEC ID Nº 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
OLIGO 2 (SEC ID Nº 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3 (SEC ID Nº 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 (SEC ID Nº 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (SEC ID Nº 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
Los oligonucleótidos CpG alternativos pueden comprender las secuencias anteriores preferidas de forma que ellos tengan deleciones o adiciones de los mismos poco importantes.
Los oligonucleótidos CpG utilizados en la presente invención pueden sintetizarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica (véase por ejemplo el documento EP 468520). Convenientemente, tales oligonucleótidos pueden sintetizarse utilizando un sintetizador automatizado.
Los oligonucleótidos utilizados en la presente invención son característicamente desoxinucleótidos. En una realización preferida el enlace internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferiblemente un enlace fosforotioato, aunque los fosfodiésteres están dentro del alcance de la presente invención. Los oligonucleótidos que comprenden diferentes enlaces internucleotídicos también se contemplan, por ejemplo, fosfodiésteres y fosforotioato mezclados. Pueden usarse otros enlaces internucleótidos que estabilizan el oligonucleótido.
Las saponinas que pueden usarse en las combinaciones adyuvantes de la presente invención incluyen aquellas derivadas de la corteza del Quillaja Saponaria Molina, llamadas Quil A, y fracciones de la misma, descritas en el documento US 5.057.540 y en "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; y en el documento EP 0 362 279 B1. Las fracciones particularmente preferidas de Quil A son QS21, QS7 y QS17.
La \beta-escina es otra saponina hemolítica preferida para su uso en composiciones adyuvantes de la presente invención. Se describe la escina en el Merck Index (12ª edición: entrada 3737) como una mezcla de saponinas que se hallan en la semilla del árbol del castaño, Lat: Aesculus hippocastanum. Se describe su aislamiento mediante cromatografía y purificación (Fiedler, Arzneimittel-Forsch, 4, 213 (1953)), y mediante resinas de intercambio iónico (Erbring et al., US 3.328.190). Las fracciones de escina, \alpha y \beta, se han purificado y parecen ser biológicamente activas. (Yoshikawa M. et al (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug. 44(8): 1454-1464)). La \beta-escina también se conoce como aescina.
Otra saponina hemolítica preferida para su uso en la presente invención es la digitonina. La digitonina se describe en el Merck Index (12ª Edición, entrada 3204) como una saponina, derivada de la semilla de la Digitalis purpurea, y purificada según los procedimientos descritos en Gisvold et al., J. Am. Pharm. Assoc., 1934, 23, 664; y Ruhenstroth-Bauer, Physiol. Chem, 1955, 301, 621. Su uso se describe como un reactivo clínico para la determinación del colesterol.
Las combinaciones adyuvantes de la presente invención pueden además comprender un vehículo, de forma que la saponina, o el CpG, o ambos, puedan estar asociados con una entidad vehículo particulada para aumentar la capacidad adyuvante de la combinación. Las vacunas sistémicas particularmente preferidas, por ejemplo, comprenden una molécula de vehículo.
El CpG usado en las combinaciones adyuvantes de la presente invención pueden estar en disolución libre, o puede acomplejarse con vehículos particulados tales como sales minerales (por ejemplo, pero no limitado a ellas, sales de aluminio o de calcio), liposomas, ISCOM, emulsiones ("aceite en agua", "agua en aceite", "agua en aceite" en agua), polímeros (tales como, pero sin limitarse a ellos, poliláctico, poliglicólico, polifosfazina, poliaminoácido, alginato, quitosano) o micropartículas. Preferiblemente dichos vehículos son catiónicos. Las vacunas de la presente invención comprenden además un antígeno que puede asociarse con el complejo CpG-vehículo, o pueden no asociarse con el complejo CpG-vehículo. En este caso, el antígeno puede estar en suspensión libre o asociado a un vehículo separado.
Las saponinas que forman parte de la presente invención pueden separarse en forma de micelas, o pueden estar en forma de grandes estructuras ordenadas tales como ISCOM documento (EP 0 109 942 B1) o liposomas (documento WO 96/33739) cuando se formulan con colesterol y lípidos, o en forma de una emulsión de aceite en agua (documento WO 95/17210). Las saponinas pueden asociarse preferiblemente con una sal metálica, tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio (documento WO 98/15287). Como alternativa, la saponina puede asociarse a un vehículo particulado tal como quitosano. La saponina puede también estar en estado seco tal como un polvo. Las formulaciones finales en la forma en que se administran a la superficie de la mucosa del sujeto vacunado son preferiblemente de naturaleza hemolítica. La saponina puede o no puede estar asociada físicamente con el antígeno, bien a través de un enlace directo o bien mediante una interacción conjunta con la misma molécula vehículo particulada (documentos GB9822712,7; WO 98/16247). El CpG y la saponina en los adyuvantes o vacunas de la presente invención pueden estar ellos mismos separados o asociados. Por ejemplo, el CpG y la saponina puede estar en suspensión libre o puede asociarse a través de un vehículo, más preferiblemente un vehículo particulado tal como hidróxido de aluminio o a través de un liposoma catiónico o un ISCOM.
Una combinación adyuvante preferida según la presente invención se compone de uno o más oligonucleótidos CpG que contienen al menos 3, preferiblemente al menos 6 nucleótidos entre dos secuencias motivo CG adyacentes, junto con QS21 y un vehículo particulado seleccionado del grupo que comprende una emulsión de aceite en agua o DQ. Más preferiblemente, la combinación adyuvante comprende CpG 2006 (SEC ID Nº 4), o CpG 1758 (SEC ID Nº 2) o CpG 1826 (SEC ID Nº 1) mezclado con QS21, y un vehículo particulado seleccionado del grupo que comprende una emulsión de aceite en agua o DQ. Por lo tanto, las vacunas particularmente preferidas, por ejemplo, comprenden tales combinaciones adyuvantes y un antígeno. La vacuna preferida de la presente invención se usa para generar respuestas inmunes sistémicas después de su administración a un individuo a través de la vía sistémica.
Las combinaciones adyuvantes de la presente invención pueden usarse como adyuvantes tanto sistémicos como a través de mucosas. En una forma particular de la invención se proporciona una vacuna sistémica para administrarse a través de la vía sistémica o parenteral tal como la administración intramuscular, intradérmica, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Una vía preferida de administración es la vía transdérmica, por ejemplo mediante parches en la piel.
Las preparaciones de vacunas sistémicas de la presente invención pueden usarse para proteger o tratar un mamífero susceptible a, o que padece una enfermedad, por medio de la administración de dicha vacuna por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intravenosa o subcutánea. Los procedimientos de administración sistémica de las preparaciones de vacuna pueden incluir jeringuillas y agujas convencionales o dispositivos diseñados para la liberación "balística" de vacunas sólidas (documento WO 99/27961), o dispositivos de chorro de líquido a presión sin aguja (documentos US 4.596.556; US 5.993.412), o parches transdérmicos (documentos WO 97/48440; WO 98/28037). La presente invención puede también usarse para aumentar la inmunogenicidad de los antígenos aplicados a la piel (liberación transdérmica o transcutánea, documentos WO 98/20734; WO 98/28037). La presente invención proporciona por tanto un dispositivo de liberación para administración sistémica, cargado previamente con la vacuna o composiciones adyuvantes de la presente invención. De este modo, se proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un individuo, que comprende la administración de una vacuna que incluye un antígeno y un oligonucleótido inmunoestimulante, una saponina y un vehículo, al individuo, al que se administra la vacuna por vía parenteral o sistémica. Los procedimientos preferidos para inducir una respuesta inmune incluye la administración de una vacuna que comprende un oligonucleótido de SEC ID Nº: 1, 2, 3, 4 ó 5, con una saponina derivada de Quil A, tal como QS21, y un vehículo, tal como una emulsión de aceite en agua, un liposoma que contiene colesterol o alumbre.
Como alternativa, las preparaciones de vacunas de la presente invención pueden usarse para proteger o tratar un mamífero susceptible a, o que padece una enfermedad, por medio de la administración de dicha vacuna a través de una mucosa, tal como la administración por vía oral/alimentaria o nasal. Otras vías de administración a través de mucosas alternativas son la intravaginal y la intrarectal. La vía de administración a través de mucosas preferida es la vía nasal, denominada vacunación intranasal. Los procedimientos de vacunación intranasal son bien conocidos en la técnica, que incluyen la administración de una forma de gotículas, pulverización o polvo seco de la vacuna en la nasofaringe del individuo que va a ser inmunizado. Las formulaciones de vacunas nebulizadas o en aerosol también forman parte de esta invención. Las formulaciones entéricas tales como cápsulas gastrorresistentes y gránulos para administración oral, supositorios para administración rectal o vaginal también forman parte de esta invención.
Las combinaciones adyuvantes de la presente invención, representan un tipo de adyuvantes para mucosas adecuados para la aplicación en humanos, a fin de reeemplazar la vacunación sistémica por la vacunación a través de mucosas. En una forma preferida de la presente invención las saponinas puras tales como Quil A, o derivados de la misma, que incluyen QS21; escina; digitonina; o saponinas de Gypsophila Chenopodium quinoa en combinación con los oligonucleótidos inmunoestimulantes pueden usarse como adyuvantes para la administración a través de mucosas de antígenos para conseguir una respuesta inmune sistémica.
Las combinaciones adyuvantes de la presente invención se usan en la formulación de vacunas, vacunas que pueden administrarse a través de la vía sistémica o a través de mucosas. Preferiblemente, cuando las vacunas se usan para la administración a través de mucosas la combinación adyuvante comprenden una saponina hemolítica.
Para la administración a través de mucosas, la composición de esta invención comprende preferiblemente una saponina hemolítica. La saponina hemolítica, o la preparación de saponina, dentro del significado de esta invención se determina con referencia al ensayo siguiente.
1. Se lava sangre reciente de cobayas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces en una centrífuga de mesa. Después de la resuspensión en una volumen igual al volumen original la sangre se diluye adicionalmente 10 veces en PBS.
2. Se añaden 50 \mul de esta suspensión sanguínea a 800 \mul de PBS que contiene diluciones a la mitad de agente tensioactivo o saponina.
3. Después de 8 horas la hemólisis se evalúa visualmente o por medida de la densidad óptica del sobrenadante. La presencia de un sobrenadante rojo, que absorbe la luz a 570 nm indica la presencia de hemólisis.
4. Los resultados se expresan como concentraciones de la primera dilución de saponina a la que no se halla hemólisis.
Para los fines de esta invención la preparación adyuvante de saponina es hemolítica si lisa los eritrocitos a una concentración de menos de un 0,1%. Como medio de referencia, las muestras substancialmente puras de Quil A, QS21, QS7, digitonina, y \beta-escina son todas saponinas hemolíticas como se definen en este ensayo. Dentro de la variabilidad experimental inherente de tales ensayos biológicos, las saponinas de la presente invención tienen preferiblemente una actividad hemolítica, de aproximadamente entre 0,5-0,00001%, más preferiblemente entre 0,05-0,00001% incluso más preferiblemente entre 0,005-0,00001%, y lo más preferiblemente entre 0,001-0,0004%. De forma ideal, dichas saponinas deben tener una actividad hemolítica similar (es decir dentro de la diferencia de la décima parte) a la de la QS21.
Las vacunas de la presente invención pueden también administrarse a través de la vía oral. En tales casos el excipiente farmacéuticamente aceptable puede también incluir tampones alcalinos, o cápsulas entéricas o microgránulos. Las vacunas de la presente invención pueden también administrarse a través de la vía vaginal. En tales casos, los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden también incluir emulsionantes, polímeros tales como CARBOPOL®, y otros estabilizantes conocidos de cremas vaginales y supositorios. Las vacunas de la presente invención pueden también administrarse por la vía rectal. En tales casos los excipientes pueden incluir ceras y polímeros conocidos en la técnica para fabricar supositorios rectales.
Las preparaciones de más de una saponina en las combinaciones de adyuvantes de la presente invención también forman parte de la presente invención. Por ejemplo las combinaciones de al menos dos de los siguientes grupos comprenden QS21, QS7, Quil A, \beta-escina, o digitonina. De forma adicional, las composiciones de la presente invención pueden comprender combinaciones de más de un oligonucleótido inmunoestimulante.
En una realización similar de la presente invención las combinaciones CpG/saponina para la administración sistémica y a través de mucosas pueden combinarse además con otros adyuvantes que incluyen monofosforil lípido A y su derivado no tóxico monofosforil lípido A 3-desoxi-acilado. Como alternativa las formulaciones de saponinas pueden combinarse con los vehículos de vacunas compuestos de quitosano u otros polímeros policatiónicos, partículas poliláctida y poliláctida-coglicólido, matrices de polímero basadas en poli-N-acetilglucosamina, partículas compuestas de polisacáridos o polisacáridos químicamente modificados, liposomas y partículas basadas en lípidos, partículas compuestas de monoésteres de glicerol monoester, etc. Las saponinas pueden también formularse en la presencia de colesterol para formar estructuras particuladas tales como liposomas o ISCOM. Además, las saponinas pueden formularse juntas con un éter o éster de polioxietileno, bién en una disolución o suspensión no particulada, o bien en una estructura particulada tal como un liposoma paucilamelar o un ISCOM. Las saponinas pueden también formularse con excipientes tales como el Carbopol® para incrementar la viscosidad, o pueden formularse en una forma de polvo seco con un excipiente en polvo tal como lactosa.
El monofosforil lípido A 3-desoxi-acilado, es un adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Inmunochem, Montana. Puede prepararse por los procedimientos tratados en el documento GB 2122204B. Una forma preferida de monofosforil lípido A 3-desoxi-acilado está en forma de una emulsión que tiene un tamaño de partícula pequeño, menor de 0,2 \mum de diámetro (documento EP 0 689 454 B1). Los adyuvantes particularmente preferidos son combinaciones de 3D-MPL y QS21 (documento EP 0 671 948 B1), emulsiones aceite en agua que comprenden 3D-MPL y QS21 (documento WO 95/17210, WO 98/56414), o 3D-MPL formulado con otros vehículos (documento EP 0 689 454 B1).
Preferiblemente, las formulaciones de vacunas de la presente invención contienen un antígeno o una composición antigénica capaz de inducir una respuesta inmune frente a un patógeno humano, dicha composición antígeno o antigénica se deriva de VIH-1 (tal como tat, nef, gp120 o gp160), virus del herpes humano, tal como gD o derivados del mismo o proteínas tempranas intermedias tales como ICP27 a partir de HSV1 ó HSV2, citomegalovirus ((esp. humana) (tal como gB o derivados del mismo), Rotavirus (que incluyen los virus atenuados vivos), el virus de Epstein Barr (tal como gp350 o derivados del mismo), virus de la varicela zoster (tal como gpI, II y IE63), o de un virus de la hepatitis tal como virus de la hepatitis B, (por ejemplo antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B o un derivado del mismo), el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis C y el virus de la hepatitis E, o a partir de otros patógenos virales, tales como paramixovirus: virus Respiratorio Sincitial (tal como proteínas F y G o derivados de las mismas), virus parainfluenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma humano (por ejemplo HPV6, 11, 16, 18), flavivirus (por ejemplo virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis producida por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o virus de la gripe (virus vivos completos o inactivados, virus de la gripe divididos, cultivados en células MDCK o en huevos, o virosomas completos de la gripe (como se describen en R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) o proteínas purificadas o recombinantes de los mismos, tales como HA, NP, NA o proteínas M, o combinaciones de las mismas), o derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, que incluyen N. gonorrhea y N. meningitidis (por ejemplo polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, proteínas que se unen a transferrina, proteínas que se unen a lactoferrina, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo proteínas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, que incluyen M catarrhalis, también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesinas e invasivas de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp, que incluyen B. pertussis (por ejemplo toxina pertactina, pertussis o derivados de las mismas, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbrinas), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., que incluyen M. tuberculosis (por ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B o -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, que incluyen L. pneumophila; Escherichia spp, que incluyen E. coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, toxinas lábiles al calor o derivados de las mismas, toxinas estables al calor o derivados de las mismas), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatógena (por ejemplo toxina similar a la toxina shiga o derivados de la misma); Vibrio spp, que incluyen V. cholera (por ejemplo toxina del cólera o derivados de la misma); Shigella spp, que incluyen S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, que incluyen Y. enterocolítica (por ejemplo una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, que incluyen C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp, que incluyen S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., que incluyen L. monocytogenes; Helicobacter spp, que incluyen H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, que incluye P. aeruginosa; Staphylococcus spp., que incluye S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., que incluye E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., que incluyen C. tetani (por ejemplo toxina tetánica y derivados de la misma), C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y derivados de la misma), C. difficile (por ejemplo toxinas de clostridium A o B y derivados de las mismas); Bacilus spp., que incluyen B. anthracis (por ejemplo toxina botulínica y derivados de la misma); Corynebacterium spp., que incluyen C. diphtheriae (por ejemplo toxina diftérica y derivados de la misma); Borrelia spp, que incluyen B. burgdoferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp, que incluyen E. equi y el agente de la ehrliquiosis granulocítica humana; Rickettsia spp, que incluyen R. rickettsii; Chlamydia spp., que incluyen C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas que se unen a vheparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas que se unen a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., que incluyen L. interrogans; Treponema spp., que incluyen T. pallidum (por ejemplo las proteínas de membrana externa sobresaliente), T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivados de parásitos tales como Plasmodium spp, que incluyen P. falciparum; Toxoplasma spp., que incluyen T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., que incluyen E. histolytica; Babesia spp., que incluyen B. microti; Trypanosoma spp., que incluyen T. cruzi; Giardia spp., que incluyen G. lamblia; Leshmania spp., que incluyen L. major; Pneumocystis spp., que incluyen P. carinii; Trichomonas spp., que incluyen T. vaginalis; Schistosoma spp, que incluyen S. mansoni, o derivados de levadura tales como Candida spp., que incluyen C. albicans; Cryptococcus spp., que incluyen C. neoformans.
Otros antígenos específicos preferidos para M. tuberculosis son por ejemplo Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1 (documento WO 99/51748). Las proteínas para M. tuberculosis también incluyen proteínas de fusión y variantes de las mismas en las que al menos dos, preferiblemente tres polipéptidos de M. tuberculosis se fusionan en una proteína mayor. Las fusiones preferidas incluyen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (documento WO 99/51748).
Los antígenos más preferidos para Chlamydia incluyen por ejemplo la Proteína de Alto Peso Molecular (HWMP) (documento WO 99/17741), ORF3, (documento EP 366 412), y las proteínas de membrana putativas (Pmps). Otros antígenos de Chlamydia de la formulación de vacuna pueden seleccionarse del grupo que se describe en el documento WO 99/28475.
Las vacunas bacterianas preferidas comprenden antígenos derivados de Streptococcus spp., que incluyen S. pneumoniae (por ejemplo polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas que se unen a colina) y el antígeno de proteína neumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), y los derivados mutantes destoxificados de los mismos (documentos WO 90/06951; WO 99/03884). Otras vacunas bacterianas preferidas comprenden antígenos derivados de Haemophilus spp., que incluyen H. influenzae tipo B (por ejemplo PRP y conjugados de los mismos), H. influenzae no tipificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos derivados de fimbrina (documento US 5.843.464) o variantes de copias múltiples o proteínas de fusión de los mismos.
Los derivados de los antígenos de superficie de la Hepatitis B son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, aquellos antígenos PreS1, PreS2 expuestos y descritos en las solicitudes de patentes europeas EP-A-414 374; EP-A-0304 578 y EP 198-474. En un aspecto preferido la formulación de vacuna de la invención comprende el antígeno VIH-1, gp120, especialmente cuando se expresa en células CHO. En una realización adicional, la formulación de vacuna de la invención comprende gD2t como se define en la presente anteriormente.
En una realización preferida de la presente invención las vacunas que contienen el adyuvante reivindicado comprenden el antígeno derivado del virus del papilloma humano (HPV) considerado como el responsable de verrugas genitales (HPV 6 o HPV 11 y otros), y los virus HPV responsables del cáncer cervical (HPV16, HPV18 y otros).
Las formas particularmente preferidas de vacuna profiláctica o terapéutica contra las verrugas genitales comprenden partículas L1 o capsómeros, y proteínas de fusión que comprenden uno o más antígenos seleccionados de HPV 6 y HPV 11 proteínas E6, E7, L1, y L2.
Las formas más preferidas de proteínas de fusión son L2E7 como se describe en el documento WO 96/26277, y proteína D (1/3)-E7 descritas en el documento GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).
Una composición de vacuna preferida profiláctica o terapéutica contra la infección ó el cancer de cuello uterino por HPV, puede comprender antígenos HPV 16 ó 18. Por ejemplo, antígenos monómeros L1 ó L2, o antígenos L1 ó L2 presentados juntos como una partícula viroide (VLP) o la proteína L1 sola presentada sola en una estructura de VLP o capsómero. Se conocen por sí mismos tales antígenos, partículas similares a virus y capsómeros. Véanse por ejemplo los documentos WO 94/00152, WO94/20137, WO94/05792 y WO93/02184.
Las proteínas tempranas adicionales pueden incluirse solas o como proteínas de fusión tales como E7, E2 o preferiblemente E5, por ejemplo; las realizaciones particularmente preferidas a este respecto incluyen un VLP que comprende proteínas de fusión L1E7 (documento WO 96/11272).
Los antígenos particularmente preferidos HPV 16 comprenden las proteínas tempranas E6 o E7 en fusión con una proteína D transportadora para formar fusiones Proteína D-E6 o E7 a partir de HPV 16, o combinaciones de los mismos; o combinaciones de E6 o E7 con L2 (documento WO 96/26277).
Como alternativa, las proteínas tempranas HPV 16 ó 18, E6 y E7, pueden presentarse en una molécula única, preferiblemente como una proteína de fusión D-E6/E7. Tales vacunas pueden contener opcionalmente bien una proteína E6 ó E7, o bien antes, a partir de HPV 18, preferiblemente en forma de una proteína de fusión D-E6 o Proteína D-E7 o una proteína de fusión D E6/E7.
La vacuna de la presente invención puede comprender adicionalmente antígenos de otras cepas de HPV, preferiblemente de cepas HPV 31 ó 33.
Las vacunas de la presente invención además comprenden antígenos derivados de parásitos que causan la malaria. Por ejemplo, los antígenos preferidos de Plasmodia falciparum incluyen RTS,S y TRAP. El RTS es una proteína híbrida que comprende substancialmente todas las porciones C-terminales de la proteína circumsporozoito (CS) de P. falciparum unida a través de cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno de superficie de la Hepatitis B al antígeno de superficie (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se describe en la solicitud de patente internacional Nº PCT/EP92/02591, publicada con el número WO 93/10152 que reivindica la prioridad de la solicitud de patente del Reino Unido Nº 9124390.7. Cuando se expresa en levadura, la RTS se produce como una partícula de lipoproteína, y cuando se coexpresa con el antígeno S de HBV se produce una partícula mezcla conocida como RTS,S. Los antígenos TRAP se describen en la solicitud de patente internacional Nº PCT/GB89/00895, publicada con el número WO 90/01496. Una realización preferida de la presente invención es una vacuna contra la malaria en la que la preparación antigénica comprende una combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. Otros antígenos de plasmodia que son buenos candidatos para ser componentes de una vacuna contra la malaria multiestado son P. falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos de Plasmodium spp.
Las formulaciones también pueden contener un antígeno antitumoral y pueden ser útiles para el tratamiento inmunoterapéutico del cáncer. Por ejemplo, la formulación adyuvante encuentra utilidad con antígenos de rechazo de tumores tales como aquellos para cánceres de próstata, de mama, colorrectales, de pulmón, pancreáticos, renales o melanomas. Como ejemplos de antígenos se incluyen MAGE 1 y MAGE 3 u otros antígenos MAGE (para el tratamiento del melanoma), PRAME, BAGE, o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions in Inmunology 8, págs 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical and Laboratory Research (presentado en 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute, 89, pág 293. Aunque estos antígenos se expresan en una amplia gama de tipos tumorales, tales como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de la vejiga. Otros antígenos específicos de tumores son adecuados para su uso con los adyuvantes de la presente invención e incluyen, pero no se restringen a ellos, gangliósidos de tumores específicos, antígenos específicos de próstata (PSA), o Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, mamaglobina, MUC-1, antígeno carcinoembriónico (CEA). De este modo, en un aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna que comprende una composición adyuvante según la invención y un antígeno de rechazo de tumores.
Un aspecto particularmente preferido de la presente invención es que las vacunas comprenden un antígeno tumoral: tales vacunas son sorprendentemente potentes en la terapia del cáncer tales como cánceres de próstata, de mama, colorrectales, de pulmón, pancreáticos, renales, de ovarios o melanomas. De este modo, las formulaciones pueden contener un antígeno asociado a tumores, así como antígenos asociados a mecanismos que sustentan tumores (por ejemplo angiogénesis, invasión tumoral). Adicionalmente, los antígenos particularmente relevantes para las vacunas en la terapia del cáncer también comprenden antígenos de membrana específicos de próstata (PSMA), antígeno de célula madre de próstata (PSCA), tirosinasa, survivin, NY-ESO1, prostasa, PS108 (documento WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. De forma adicional dicho antígeno puede ser una hormona autopéptido tal como la hormona de liberación de la hormona gonadotropina de longitud completa (GnRH, documento WO 95/20600), un péptido de longitud corta de 10 aminoácidos, útiles en el tratamiento de muchos cánceres o en la inmunodepresión.
Se ha previsto que las composiciones de la presente invención se usen para formular vacunas que contienen antígenos derivados de Borrelia sp.. Por ejemplo, los antígenos pueden incluir ácidos nucleicos, antígenos derivados de patógenos o preparaciones antigénicas, péptidos o proteínas producidas de forma recombinante, y proteínas de fusión quiméricas. En particular el antígeno es OspA. El OspA puede ser una proteína total madura en una forma lipidada en virtud de la célula hospedadora (E. Coli) denominada (Lipo-OspA) o un derivado no lipidado. Tales derivados no lipidados incluyen la proteína de fusión NS1-OspA no lipidada que tiene los primeros 81 aminoácidos N-terminales de las proteínas no estructurales (NS1) del virus de la gripe, y la proteína completa OspA, y otra, MSP-OspA es una forma no lipidada de OspA que lleva 3 aminoácidos N-terminales adicionales.
Las vacunas de la presente invención pueden usarse para la profilaxis o la terapia de la alergia. Tales vacunas pueden comprender antígenos específicos de alérgenos (por ejemplo Der p1) y antígenos no específicos de alérgenos (por ejemplo, péptidos derivados de la IgE humana, que incluyen pero no se limitan al decapéptido de Stanworth (documento EP 0 477 231 B1)).
Las vacunas de la presente invención pueden usarse también para la profilaxis o la terapia de trastornos crónicos diferentes de la alergia, del cáncer o de enfermedades infecciosas. Tales trastornos crónicos son enfermedades tales como aterosclerosis y Alzheimer.
Los antígenos relevantes para la profilaxis y la terapia de los pacientes susceptibles a, o que sufren la enfermedad neurodegenerativa de Alzheimer son, en particular, el fragmento de los aminoácidos 39-43 del extremo N (A\beta) de la proteína precursora amiloide y fragmentos más pequeños. Este antígeno se describe en la solicitud de patente internacional Nº WO 99/27944- (Athena Neurosciences).
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos adversos significativos en vacunas típicas. Tal cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplee y de cómo se presente. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 1-1000 \mug de proteína, preferiblemente 1-500 \mug, preferiblemente 1-100 \mug, lo más preferiblemente 1 a 50 \mug. Una cantidad óptima para una vacuna particular puede determinarse por estudios estándar que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos vacunados. Después de una vacunación inicial, los sujetos deben recibir una o varias inmunizaciones de recuerdo adecuadamente espaciadas. Tales formulaciones de vacuna pueden aplicarse a una superficie mucosa de un mamífero bien en una pauta de una vacunación inicial o de vacunación de recuerdo; o como alternativa, pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo a través de vías transdérmicas, subcutáneas o intramusculares.
La cantidad de CpG o oligonucleótidos inmunoestimulantes en los adyuvantes o vacunas de la presente invención es generalmente pequeña, pero dependiendo de la formulación de vacuna puede estar en el intervalo de 1-1000 \mug por dosis, preferiblemente 1-500 \mug por dosis y más preferiblemente entre 1 a 100 \mug por dosis.
La cantidad de saponina para su uso en los adyuvantes de la presente invención pueden estar en el intervalo de 1-1000 \mug por dosis, preferiblemente 1-500 \mug por dosis, más preferiblemente entre 1 a 250 \mug por dosis y más preferiblemente entre 1 a 100 \mug por dosis. La proporción de CpG: saponina (p/p), estará, por lo tanto, en el intervalo de 1:1000 a 1000:1, y estarán típicamente en el intervalo de 1:100 a 100:1, y preferiblemente en el intervalo de 1:10 a 1:1 ó de 1:1 a 10:1, y más preferiblemente 1:1, 4:1 ó 10:1.
Las formulaciones de la presente invención pueden usarse tanto para fines profilácticos como terapéuticos. De este modo, se proporciona el uso de una combinación de una saponina y una molécula CpG en la fabricación de una vacuna para la profilaxis y el tratamiento de infecciones virales, bacterianas y parasitarias, alergia, cáncer y otros trastornos no crónicos. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar un mamífero susceptible a, o que padezca una enfermedad infecciosa o cáncer o alergia, o una enfermedad autoinmune. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una vacuna o una combinación adyuvante, que comprende una saponina y CpG, como se describe en la presente para su uso como un medicamento. La preparación de vacunas se describe generalmente en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, EEUU, 1978.
Se ha previsto que las composiciones de la presente invención pueden usarse para formular vacunas que contienen antígenos derivados de una amplia variedad de fuentes. Por ejemplo, los antígenos pueden incluir ácidos nucleicos humanos, bacterianos o virales, antígenos o preparaciones antigénicas derivados de patógenos, antígenos o preparaciones antigénicas derivados de tumores, antígenos derivados de hospedadores, que incluyen péptidos derivados de la IgE, tal como el decapéptido que libera histamina de la IgE (conocido como el decapéptido de Stanworth), proteínas o péptidos producidos recombinantemente y proteínas de fusión quiméricas.
Se proporciona por la presente invención una composición de vacuna sistémica que comprende un antígeno, una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulante. De este modo, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un individuo susceptible a o que padece una enfermedad, mediante la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente memoria a través de la vía sistémica de dicho individuo. También se proporciona un procedimiento para evitar que a un individuo contraiga una enfermedad seleccionada del grupo que comprende enfermedades infecciosas bacterianas y virales, enfermedades parasitarias, cánceres de próstata, de mama, colorrectales, de pulmón, pancreáticos, renales, de ovarios o melanomas; trastornos crónicos no cancerígenos, alergia, Alzheimer, aterosclerosis, que comprende la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente memoria a través de la vía sistémica de dicho individuo.
Como alternativa, se proporciona por la presente invención una composición de vacuna administrada a través de mucosa que comprende un antígeno y una saponina hemolítica. De este modo, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un individuo susceptible a o que padece una enfermedad mediante la administración de una composición como se describe sustancialmente en la presente a una superficie mucosa de dicho individuo.
Además, se describe un procedimiento para inducir una respuesta inmune específica de antígeno sistémica en un mamífero que comprende la administración a una superficie mucosa de dicho mamífero una composición que comprende un antígeno y una saponina hemolítica. Además, también se proporciona un procedimiento de fabricación de una vacuna o adyuvante, que comprende tomar una saponina y tomar una molécula de CpG y mezclarlas con un antígeno.
Los ejemplos de excipientes adecuados farmacéuticamente aceptables para su uso en las combinaciones de la presente invención incluyen agua, solución salina tamponada con fosfato, disoluciones tampón isotónicas.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Valores de IgG específica para OspA 14 días después de la dosis de recuerdo nasal.
Figura 2: Valores de LA2 específico para OspA 14 días después de la dosis de recuerdo nasal.
Figura 3: Valores de IgG específica para las cepas del virus de la gripe séricas 14 días después de la dosis de recuerdo nasal.
Figura 4: Valores de Inhibición de Hemaglutinación (HAI) sérica específica para la cepa del virus de la gripe sérica 14 días después de la dosis de recuerdo nasal.
Figura 5: Valores de LA2 específico para OspA en ratones.
Figura 6: Actividad de linfoproliferación específica para gp-120 de las células del bazo de ratones inmunizados. La actividad específica de antígeno se expresa como SI para las diferentes concentraciones de antígeno para los 4 grupos experimentales.
Figura 7: Actividad de los LTC (linfocitos y citotóxicos) específicos para HBsAg de las células del bazo de ratones inmunizados. La actividad de la célula efectora se evaluó mediante el examen de la liberación de ^{51}Cr de las células P815 (círculos blancos) o de las células P815 s-transfectadas (círculos negros).
Figura 8: Respuestas del anticuerpo específico para HBsAg en ratones inmunizados. Los valores del anticuerpo específico (expresados como EU/ml) y los perfiles del isotipo se evaluaron usando ensayos ELISA. Los valores de los sueros combinados se muestran en la tabla, y las distribuciones del isotipo también se representan en un gráfico.
Figura 9: Actividad de linfoproliferación específica para HBSAg y gp120 de las células del bazo de ratones inmunizados. La actividad específica de antígeno se expresa como SI para las diferentes concentraciones de antígeno para los 4 grupos experimentales.
Figura 10: Actividad de los LTC específica para HBsAg y gp120 de las células del bazo de ratones inmunizados. La actividad de la célula efectora se evaluó mediante el examen de la liberación de ^{51}Cr de las células P815 control (símbolos blancos) o de las células P815 que presentan epítopo LTC de HbsAg o de gp120 (símbolos negros).
Figura 11: Respuestas de anticuerpo específico para gp120 y específico para HbsAg en ratones inmunizados. Los valores del anticuerpo específico (expresados en \mug/ml) (Figura 11A) y los perfiles del isotipo se evaluaron usando ensayos ELISA. Los valores de los sueros combiandos se muestran en la tabla, y las distribuciones del isotipo también se representan en un gráfico. La Figura 11B muestra el patrón de isotipo de los anticuerpos específicos para gp120.
Figura 12: Evolución del crecimiento tumoral promedio por grupos de 10 animales a lo largo del tiempo.
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, pero no se limita a ellos.
Ejemplo 1 El uso de QS21 y de CpG para la dosis de recuerdo intranasal de los anticuerpos sistémicos para Lipo-OspA
En este ejemplo se investiga si las saponinas líticas tales como QS21 y los inmunoestimulantes tales como CpG eran capaces de intensificar de un modo sinérgico las respuestas inmunológicas sistémicas a una vacunación en dosis de recuerdo intranasal en ratones. Ratones hembra Balb/c (5 animales por grupo), con una edad de 8 semanas, se inmunizaron intramuscularmente con lipo-OspA (1 \mug) formulado sobre alumbre (50 \mug). Después de 3 meses, se administraron a los ratones dosis de recuerdo intranasalmente (bajo anestesia) con 10 \mul de disolución (5 \mul por fosa nasal, administradas como gotitas mediante una pipeta) que contenían 5 \mug de lipo-OspA en A: PBS; en B: 20 \mug de CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); en C: 5 \mug de QS21 (obtenido de Cambridge Biotech, EE. UU.); en D: 20 \mug de CpG 1001 + 5 \mug de QS21; o como E: mediante inyección intramuscular de 1 \mug de lipo-OspA adsorbido sobre alumbre (50 \mug). Las Figuras 1 y 2 muestran los valores de IgG y los valores de LA2 específicos para OspA 14 días después de la dosis de recuerdo nasal.
Procedimientos ELISA para la medición de IgG sérica específica para OspA en ratones
Se recubren inmunoplacas de Maxisorp Nunc durante la noche a 4ºC con 50 \mul/pocillo de 1 \mug/ml de OspA diluido en PBS (en las filas B a H de la placa), o con 50 \mul de 5 \mug/ml de Ig caprina anti-ratón purificada (Boerhinger), en PBS (hilera A). Los sitios libres de las placas se bloquean (1 hora, 37ºC) usando tampón de saturación: PBS que contiene BSA al 1%, monolaurato de polioxietilensorbitano (TWEEN 20) al 0,1%, y Suero Bovino Normal (NBS) al 4%. Después, se incuban diluciones seriadas a la mitad de la mezcla del isotipo de la IgG, diluida en tampón de saturación (50 \mul por pocillo) y se añaden como una curva estándar (mezcla de anticuerpos monoclonales de ratón IgG1, IgG2a e IgG2b de Sigma, comenzando a 200 ng/ml y que se colocan en la hilera A), y las muestras séricas (comenzando a una dilución 1/100 y que se colocan en las hileras B a H) durante 1 h 30 min a 37ºC. Después se lavan las placas (x3) con tampón de lavado (PBS, monolaurato de polioxietilensorbitano (TWEEN 20) al 0,1%). Luego, se incuba IgG caprina de ratón biotinilada (Amersham) diluida a 1/5000 en tampón de saturación (50 \mul/pocillo) durante 1 h 30 min, a 37ºC. Después de 3 lavados, y de la posterior adición del conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano (Amersham), se lavan las placas 5 veces y se incuban durante 20 min a temperatura ambiente con 50 \mul/pocillo de tampón de revelado (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) y H_{2}O_{2} al 0,03% en tampón citrato 50 mM, pH 4,5). El revelado se interrumpe mediante la adición de 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 2N. Las densidades ópticas se leen a 492 nm y 630 nm usando el inmunolector Biorad 3550. Los valores de anticuerpo se calculan por el procedimiento matemático de 4 parámetros usando el software SoftMaxPro.
Ensayo de inhibición para la medición de los valores de anticuerpo sérico similar a LA2 para lipo-OspA
Los valores de anticuerpos en los vacunados se estudiaron con respecto a su especificidad similar a la de LA2. LA2 es un anticuerpo monoclonal murino que reconoce un epítopo OspA conformacional en la superficie de la bacteria y se ha demostrado que es capaz de matar burgdorferi B in vitro, así como proteger a los ratones frente a un infección con espiroqueta crecida en el laboratorio (Schaible UE et al. 1990. Proc Natl Acad Sci EE. UU. 87:3768-3772). Además, se ha demostrado que LA-2 mAb se correlaciona con los anticuerpos bactericidas, y estudios sobre sueros humanos también han demostrado una buena correlación entre los valores de IgG anti-OspA y los valores de LA-2 totales (según la medición obtenida mediante ELISA).
Se recubren inmunoplacas Maxisorp Nunc durante la noche a 4ºC con 50 \mul/pocillo de 0,5 \mug/ml de lipo OspA diluido en PBS. Los sitios libres se bloquearon con tampón de saturación durante 1 hora a 37ºC con (100 \mul/pocillo de tampón de saturación: PBS/BSA al 1%/Tween 20 al 0,1%/NBS al 4%). Diluciones seriadas a la mitad del anticuerpo monoclonal (mAb) LA2 comenzando a 4 \mug/ml se diluyeron en tampón de saturación (50 \mul por pocillo) formando una curva estándar. También se añadieron diluciones de muestras séricas de los vacunados (comenzando a una dilución 1/10) y las placas se incubaron durante 2 h a 37ºC. Después de la incubación se lavaron las placas 3 veces con PBS/TWEEN 20 (0,1%). Se añadió el conjugado LA2 mAb-peroxidasa (1/10.000) diluido en tampón de saturación a cada pocillo (50 \mul/pocillo) y se incubaron durante 1 hr a 37ºC. Después de 5 lavados, se incubaron las placas durante 20 minutos a temperatura ambiente (en la oscuridad) con 50 \mul/pocillo de tampón de revelado (OPDA 0,4 mg/ml y H_{2}O_{2} al 0,03% en tampón citrato 50 mM, pH 4,5). La reacción y la formación de color se interrumpieron con H_{2}SO_{4} 2N. Las densidades ópticas se leen a 492 nm y 630 nm usando el inmunolector Biorad 3550. Los valores de anticuerpo similar a LA2 se calculan por el procedimiento matemático de 4 parámetros usando el software SoftMaxPro. Los valores de anticuerpo similar a LA2 se determinaron por comparación con la curva patrón.
Resultados
CpG así como QS21 mejoran significativamente la vacunación de recuerdo intranasal de los anticuerpos sistémicos para Lipo-OspA. Además, cuando ambos adyuvantes se combinan, se demuestra claramente un efecto sinérgico de estas respuestas, especialmente por lo que se refiere a los anticuerpos LA2. Las respuestas humorales obtenidas en presencia de QS21 y CpG son significativamente mayores que aquellas inducidas por la vacunación de recuerdo parenteral. Si se consideran juntos, estos resultados muestran claramente el potencial de las formulaciones intranasales que combinan una saponina lítica y un inmunoestimulante.
Ejemplo 2 Combinación sinérgica de QS21 y CpG para intensificar la vacunación de recuerdo intranasal de los anticuerpos sistémicos para el virus de la gripe
En este ejemplo se investiga si las saponinas hemolíticas tales como QS21 (véase el ejemplo) y los inmunoestimulantes tales como CpG eran capaces de intensificar de un modo sinérgico la vacunación de recuerdo intranasal de anticuerpos sistémicos en ratones inoculados intranasalmente con el virus de la gripe completo e inactivado.
Ratones hembra Balb/c (10 animales por grupo), con una edad de 8 semanas, se inocularon intranasalmente con el virus de la gripe completo, trivalente e inactivado con \beta-propiolactona (A/Beijing/262/95; A/Johannesburgo/33/94; B/Panamá/45/90; 5 \mug HA/cepa) para simular la infección natural que se produce en los humanos. Después de 28 días, se administraron a los ratones dosis de recuerdo intranasalmente (bajo anestesia) con 20 \mul de disolución (10 \mul por fosa nasal, administrada como gotitas mediante una pipeta) que contenían 1,5 \mug de HA/cepa del virus de la gripe completo, trivalente e inactivado con \beta-propiolactona (las mismas cepas que en la primera inmunización) en A: PBS; en B: 50 \mug de CpG (TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT, Krieg 2006); en C: 45 \mug de QS21 (obtenido de Cambridge Biotech, EE. UU.); D: 50 \mug de CpG + 4,5 \mug de QS21; o como E: mediante la inyección intramuscular de 1,5 \mug de HA/cepa del virus de la gripe dividido y trivalente (las mismas cepas que en la primera inmunización). El fabricante SSD GmBH (Dresden, Alemania) proporcionó los antígenos del virus de la gripe.
Las Figuras 3 y 4 muestran los valores de IgG específica para la cepa del virus de la gripe sérica y los valores de Inhibición de la hemaglutinación (HAI) 14 días después de la dosis de recuerdo nasal.
Procedimientos ELISA para la medición de los valores de IgG anti-virus de la gripe en ratones
Se recubren inmunoplacas Maxisorp Nunc durante la noche a 4ºC con 50 \mul/pocillo de 1 \mug/ml de antígeno del virus de la gripe completo diluido en PBS (en las filas B a H de la placa), o con 50 \mul de 5 \mug/ml de Ig caprina anti-ratón purificada (Boerhinger), en PBS (hilera A). Los sitios libres de las placas se bloquean (1 hora, 37ºC) usando tampón de saturación: PBS que contiene BSA al 1%, monolaurato de polioxietilensorbitano (TWEEN 20) al 0,1%, y Suero Bovino Normal (NBS) al 4%. Después, se incuban diluciones seriadas a la mitad de la mezcla del isotipo de la IgG, diluida en tampón de saturación (50 \mul por pocillo) y se añaden como una curva estándar (mezcla de anticuerpos monoclonales de ratón IgG1, IgG2a e IgG2b de Sigma, comenzando a 200 ng/ml y que se colocan en la hilera A), y las muestras séricas (comenzando a una dilución 1/100 y que se colocan en las hileras B a H) durante 1 h 30 min a 37ºC. Después se lavan las placas (x3) con tampón de lavado (PBS, monolaurato de polioxietilensorbitano (TWEEN 20) al 0,1%). Luego, se incuba IgG caprina de ratón biotinilada (Amersham) diluida a 1/5000 en tampón de saturación (50 \mul/pocillo) durante 90 minutos, a 37ºC. Después de 3 lavados, y de la posterior adición del conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano (Amersham), se lavan las placas 5 veces y se incuban durante 20 min a temperatura ambiente con 50 \mul/pocillo de tampón de revelado (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) y H_{2}O_{2} al 0,03% en tampón citrato 50 mM, pH 4,5). El revelado se interrumpe mediante la adición de 50 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 2N. Las densidades ópticas se leen a 492 nm y 630 nm usando el inmunolector Biorad 3550. Los valores de anticuerpo se calculan por el procedimiento del parámetro matemático 4 usando el software SoftMaxPro. El fabricante SSD GmHB (Dresden, Alemania) proporciona el virus de la gripe completo usado para el recubrimiento (cepa A/Beijing/262/95), inactivado con \beta-propiolactona (BPL).
Actividad de Inhibición de Hemaglutinación (HAI) de los anticuerpos séricos específicos del virus de la gripe en ratones
Los sueros (25 \mul) se tratan primero durante 20 minutos a temperatura ambiente (t.a.) con 100 \mul de tampón borato 0,5M (pH 9) y 125 \mul de caolín obtenido en Dade Behring. Después de la centrifugación (30 minutos, 3000 rpm o 860 g), se recogen 100 \mul de sobrenadante (correspondiente a una dilución 1/10 del suero) y se incuban durante 1 hora a 4ºC con eritrocitos de pollo al 0,5%. Se recoge el sobrenadante después de la centrifugación durante 10 minutos a 3200 rpm (970 g). Ambas operaciones se realizan para eliminar los factores de hemaglutinación naturales contenidos en los sueros. Luego, se diluyen 25 \mul de los sueros tratados en 25 \mul de PBS (diluciones seriadas a la mitad comenzando a 1/20) en placas Greiner de 96 pocillos. Se añade el virus completo inactivado por BPL (25 \mul/pocillo) a una concentración de 4 Unidades de hemaglutinación (es decir, a una dilución que es 4 veces inferior que la última que provoca una aglutinación de eritrocitos) durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. Después, se añaden los eritrocitos de pollo (25 \mul/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se mantienen las placas a 4ºC durante la noche antes de leerse. El valor de HAI corresponde a la última dilución sérica que inhibe la hemaglutinación inducida por el virus.
Resultados
CpG así como QS21 no mejoran la vacunación de recuerdo intranasal de los anticuerpos IgG o HAI para las cepas del virus de la gripe. Sin embargo, cuando ambos adyuvantes se combinan, se demuestra claramente un efecto sinérgico de estas respuestas. Las respuestas HAI obtenidas en presencia de QS21 y CpG son incluso similares a aquellas inducidas por la vacunación de recuerdo parenteral. Estos resultados confirman el potencial de las formulaciones intranasales que combinan una saponina hemolítica y un inmunoestimulante. También demuestran que varias secuencias CpG pueden ser eficaces en este contexto (Krieg 2006 en el presente ejemplo y Krieg 1826 en los ejemplos 3 y 5).
Ejemplo 3 Combinación sinérgica de \beta-escina y CpG para intensificar la vacunación de recuerdo intranasal de los anticuerpos sistémicos para Lipo-OspA
En el presente ejemplo se evalúa la posibilidad de que pueda obtenerse una sinergia similar a la observada entre QS21 y CpG con otras saponinas hemolíticas (véase el ejemplo) tales como \beta-escina. También se prueba la saponina no hemolítica, el ácido glicirrícico.
Ratones hembra Balb/c (6 animales por grupo), con una edad de 8 semanas, se inocularon intramuscularmente con lipo-OspA (1 \mug) formulado sobre alumbre (50 \mug). Después de 3 meses, se administraron a los ratones vacunas de recuerdo intranasalmente (bajo anestesia) con 10 \mul de disolución (5 \mul por fosa nasal, administrada como gotitas mediante una pipeta) que contenían 5 \mug de lipo-OspA en A: PBS; en B: 50 de \mug CpG 1001 (TCC ATG AGC TTC CTG ACG TT, Krieg 1826); en C: 5 \mug de \beta-escina (comprada en Sigma); en D: 50 \mug de CpG 1001 + 5 \mug de \beta-escina; en E: 5 \mug de ácido glicirrícico (comprado en Sigma); en F: 50 \mug de CpG 1101 + 5 \mug de ácido glicirrícico, o como G: mediante inyección intramuscular de 1 \mug de lipo-OspA adsorbido en alumbre (50 \mug). La Figura 5 muestra los valores de LA2 específico de OspA 14 días después de la vacunación de recuerdo nasal.
Procedimientos
Los procedimientos son los mismos que se detallaron en el Ejemplo 1.
Resultados
\beta-escina y CpG actúan sinérgicamente para intensificar la vacunación de recuerdo intranasal de los anticuerpos LA2 sistémicos. Esta combinación obtiene respuestas de anticuerpos más elevadas que la vacunación de recuerdo parenteral. Por otra parte, tal sinergia no se obtiene mediante la combinación de CpG con el ácido glicirrícico.
Estos resultados y los anteriores de esta patente considerados conjuntamente demuestran la capacidad de CpG y de las diferentes saponinas hemolíticas para adyuvar las respuestas inmunes de una manera sinérgica.
Ejemplo 4 Estudios de inmunogenicidad usando RTS,S de P. falciparum y gp120 de VIH-1 formulados con CpG y/o DQS21 1. Resumen del experimento
Se llevaron a cabo dos estudios de inmunogenicidad en ratones para evaluar los efectos potenciales aditivos o sinérgicos de los oligonucleótidos CpG (CPG) y QS21. Se inmunizaron grupos de ratones con RTS,S y gp120 formulado con CpG y QS21 solos o en combinación. También se ensayaron estas combinaciones de adyuvantes en presencia del vehículo Al(OH)_{3}, o una emulsión de aceite en agua (a/a).
Se examinó la inmunogenicidad de las formulaciones después de dos inmunizaciones parenterales. Se analizaron los sueros para determinar la presencia de anticuerpos específicos de antígeno, y para determinar la distribución de isotipos de anticuerpos. Las células del bazo se usaron para evaluar las respuestas inmunes mediadas por células. Estas células se ensayaron para determinar la presencia de linfocitos T citotóxicos (LTC) y de células linfoproliferativas (linfoproliferación).
TABLA 1 Grupos de ratones en el experimento 1
1
TABLA 2 Grupos de ratones en el experimento 2
2
2. Formulación 2.1. Experimento 1 Procedimiento de formulación
Las formulaciones se prepararon tres días antes de cada inyección. Cuando fue necesario se adsorbieron RTS,S (10 \mug) y gp 120 (10 \mug) sobre 100 \mug de Al(OH)_{3}. Cuando fue necesario, se añadió MPL (5 \mug) y se incubó durante 30 min antes de la adición del tampón como una mezcla de PBS concentrada 10 veces a pH 7,4 y H_{2}O, con excepción del grupo sin DQ para el que el tampón fue PO_{4}, NaCl 10/150 a pH 6,8. Después de 30 min, si se necesitaba, se añadió a la formulación QS21 (5 \mug) mezclado con liposomas en una proporción en peso de QS21/colesterol de 1/5 (denominado en lo sucesivo DQ). Treinta minutos más tarde, para las formulaciones con el oligonucleótido, se añadieron 10 \mug de CpG 30 minutos antes de la adición de 50 \mug/ml de tiomersal como conservante.
Al(OH)_{3} + RTSS + gp120 - _{1 \ h} - MPL- _{30 \ min} - premezcla - _{30 \ min} - DQ - _{30 \ min} - Cpg - _{30 \ min} - Tiomersal
Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con agitación.
2.2. Experimento 2 Procedimiento de formulación
Las formulaciones se realizaron simultáneamente para ambas inyecciones. El volumen de la inyección para un ratón es de 100 \mul. Se añadieron 50 \mug/ml de tiomersal como conservante.
Grupo 1: RTS,S (10 \mug) y gp120 (10 \mug) se diluyen con H_{2}O y PBS a pH 6,8 para que sean isotónicas. Después de 5 min, se adsorbe la formulación sobre CpG 1856 (100 \mug).
Grupo 2: RTS,S (10 \mug) y gp120 (10 \mug) se diluyen con H_{2}O y PBS a pH 7,4 para que sean isotónicas. Después de 30 min, RTS,S y gp120 se adsorben sobre DQ (5 \mug). Después de 30 min de adsorción, la formulación se adsorbe sobre CpG 1856 (100 \mug).
Grupo 3: RTS,S (10 \mug) y gp120 (10 \mug) se diluyen con H_{2}O y PBS a pH 6,8 para que sean isotónicas. Después de 5 min, la formulación se adsorbe sobre una emulsión a/a. Después de 5 min de adsorción, la formulación se adsorbe sobre QS21 (5 \mug) antes de la adición de CpG (100 \mug).
3. Procedimientos inmunológicos
Nueve ratones (Balb/C x C57B1/6) F1 por grupo recibieron en las patas traseras 2 x 50 \mul de vacuna dos veces en un intervalo de dos semanas. Dos semanas después se obtuvieron los sueros para evaluar las respuestas de anticuerpos y se recogieron las células del bazo para determinar las respuestas inmunes mediadas por células.
Para el análisis de linfoproliferación, las células se sembraron por cuadruplicado en placas de microtitulación de 96 pocillos con fondo redondo a una concentración de 2x10^{6} por ml. Las células se cultivaron durante 72 a 96 horas en RPMI-1640 suplementado con antibióticos, glutamina y suero de ratón normal al 1% (v/v) en presencia de diferentes concentraciones del antígeno RTS,S o gp120. Se cultivaron células control sin antígeno. Después, las células se pulsaron durante la noche con 1 \muCi/pocillo de [^{3}H]-timidina, se recogieron y se determinó la radiactividad incorporada en un contador beta. Los resultados se expresan como cuentas por minuto (cpm) promedio.
Para el análisis de los LTC se cultivaron células durante 7 días en placas de 6 pocillos en presencia de 10 \mul por ml del péptido sintético pCMI003 (IPQSLDSWWTSL) correspondiente a un epítopo LTC de HBsAg (Schirmbeck et al, 1995) o del péptido pCMI007 (GIHGPGRAFYAARK) que representa un epítopo LTC de gp120 (Casement et al., 1995). Al final del periodo del cultivo se evaluaron las células efectoras por duplicado para denominar la actividad citolítica específica para HBsAg en ensayos estándar de liberación de ^{51}Cr usando células P815 control y S-transfectadas. La citotoxicidad específica para gp120 se determinó mediante la utilización de las células blanco P815 que o bien se dejaron sin tratar o se pulsaron durante 1 h con el péptido pCMI007. Se determinó la liberación mínima y la liberación máxima con las células blanco sin las células efectoras y mediante la adición de Triton X-100 al 3% (v/v), respectivamente. Los resultados se expresan como el % de liberación de ^{51}Cr (cpm del cultivo experimental - cpm de la liberación espontánea / cpm de la liberación máxima - cpm de la liberación espontánea).
Se realizó la valoración y la determinación de isotipos de los sueros combinados en un formato de análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas o enzimoinmunoanálisis (ELISA) usando placas cubiertas con HbsAg. Los sueros se diluyeron en PBS/BSA comenzado a 1:4000. Se usaron anticuerpos secundarios biotinilados específicos para Ig o los isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b seguidos por un conjugado de peroxidasa de rábano-estreptavidina para la detección de anticuerpos unidos. Los valores del ELISA se calcularon a partir de una referencia mediante SoftmaxPro y se expresaron en unidades ELISA (EU/ml). Los valores de anticuerpo específico para gp120 se determinaron en un ELISA estándar usando placas cubiertas con la proteína gp120. Los sueros se diluyeron en PBS/Tween 20/BSA comenzado a 1:100. Se usaron los anticuerpos secundarios biotinilados específicos para Ig o los isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b seguidos por un conjugado peroxidasa de rábano-estreptavidina para la detección de los anticuerpos unidos. Los valores se calcularon en relación con una Ig de ratón estándar y se expresaron como \mug/ml.
4. Resultados
Experimento 1
El análisis de las respuestas de linfoproliferación no mostró diferencias significativas en la reactividad de RTS,S entre los grupos. Por contraste, los grupos 1 y 3 que contienen tanto CpG como DQS21, mostraron mejores respuestas de linfoproliferación específica para gp120 que los grupos que contienen CpG o DQS21 solos (Figura 6).
En este experimento, sólo se midieron los LTC específicos para HBsAg. No hubo grandes diferencias en la inducción de los LTC entre los grupos 1 y 3 que habían recibido CpG y DQS21 en combinación y los grupos 2 y 4 inmunizados con sólo uno de los dos componentes adyuvantes, mientras que la presencia de Al(OH)_{3} disminuyó la actividad de los LTC observada por la combinación de CpG y DQS21 en el grupo 1 (Figura 7). Sin embargo, se observaba la tendencia de que CpG y DQS21 era mejor que DQS21 solo, y la combinación inducía más LTC en presencia de Al(OH)_{3} que el CpG solo (Figura 7).
La respuesta inmune humoral de ratones se examinó sólo en presencia de anticuerpos específicos para HBsAg. Los valores fueron similares en todos los grupos excepto en el grupo 3, que mostró aproximadamente un incremento de tres veces, demostrando que, en presencia de Al(OH)_{3}, la combinación de DQS21 y CpG es más inmunogénica que CpG solo (Figura 8). La distribución del isotipo fue similar para los grupos 3 y 4 que contenían Al(OH)_{3}, mientras que en ausencia de Al(OH)_{3} la combinación de CpG y DQS21 inducía un patrón más fuerte del isotipo similar a T_{H1} que DQS21 solo (Figura 8).
Experimento 2
Las respuestas de linfoproliferación específicas para RTS,S y gp120 fueron muy similares en este experimento. Los datos indican que la adición de DQS21 (tanto solo como con una emulsión a/a) intensifica las respuestas de linfoproliferación de ambos antígenos (Figura 9).
Las respuestas de los LTC se evaluaron mediante el uso de tanto un péptido con epítopo LTC tanto de HBsAg como de gp120. En ambos casos, los LTC podían detectarse después de la inmunización del grupo 1 con CpG solo (Figura 10). Sin embargo, la adición de DQS21 dio lugar a un incremento considerable de los LTC para ambos antígenos (Figura 10). La presencia de una emulsión a/a o bien neutralizó el efecto positivo de DQS21 (gp120) o bien incrementó el antecedente del ensayo in vitro (HBsAg).
Las respuestas de anticuerpos para HBsAg y gp120 se incrementaron mediante la adición de DQS21 al adyuvante CpG (Figura 11A). Se observó un incremento adicional cuando se incluyó una emulsión a/a en la formulación (Figura 11A). La adición de DQS21 a CpG tamizó los perfiles del isotipo gp120 hacia un sesgo de T_{H1} más pronunciado (Figura 11B), mientras que el impacto sobre los perfiles del isotipo HBsAg fue menos pronunciado en este experimento.
5. Conclusiones
La inmunización con RTS,S y gp120 formulados con la combinación de CpG y DQS21 da lugar a fuertes respuestas inmunes específicas de antígeno. La combinación de los componentes adyuvantes CpG y DQS21
- intensifica las respuestas de linfoproliferación
- incrementa la actividad de los LTC
- aumenta los valores de anticuerpos y los patrones del isotipo T_{H1}
en comparación con los componentes solos.
Ejemplo 5 Potencial terapéutico de las formulaciones CpG y/o DQS21 en el modelo tumoral TC1 1. Diseño experimental
Cuatro grupos de 10 ratones C57bl/6 recibieron 10^{6} células TC1 (200 \mul) (células tumorales que expresan E7) subcutáneamente en el costado el día 0.
Después se vacunó a los ratones dos veces el día 14 y el día 21 después de la inducción del tumor, con 5 \mug de PD1/3E7 HPV16 formulado inyectado intramuscularmente en las patas (IFP). El crecimiento tumoral se midió individualmente dos veces por semana.
Grupos de ratones:
1. Sin vacuna
2. PD1/3E7 + CPG (10 \mug ODN 2006)
3. PD1/3E7 + DQS21 (0,5 \mug)
4. PD1/3 E7 + CPG + DQS21
El crecimiento tumoral se controló mediante la medición de los tumores individuales, dos veces por semana.
2. Formulaciones
Las formulaciones se realizaron los días de las inyecciones. El volumen de inyección para un ratón fue de 100 \mul. Cuando fue necesario, se diluyó PD1/3E7 (5 \mug) con H_{2}O y PBS a pH 7,4 para que fuera isotónico. Después de 5 min, si era necesario, se añadió a la formulación QS21 (0,5 \mug) mezclado con liposomas en una proporción en peso QS21/colesterol de 1/5 (denominado en lo sucesivo DQ). Treinta minutos más tarde, para la formulación con el oligoinmunocleótido, se añadieron 10 \mug de CpG (ODN 2006) 30 min antes de la adición de 1 \mug/ml de tiomersal como conservante.
H_{2}O + PBS pH 7,4 + PD1/3E7 - _{5 \ min} + DQ -_{30 \ min} + CpG - _{30 \ min} - Tiomersal
3. Resultados
La evolución del crecimiento tumoral promedio por grupos de 10 animales a lo largo del tiempo se muestra en la Figura 12. El 100% de los animales que recibieron una inducción de tumor de 10^{6} células TC1 desarrollaron progresivamente crecimiento tumoral.
El 70-80% de los animales no vacunados o de los animales vacunados con la proteína E7 en DQS21 murieron hacia el día 35.
Dos vacunaciones con la proteína E7 formulada en DQS21 casi no tuvieron efecto en el crecimiento tumoral. Por el contrario, 2 vacunaciones, IFP (día 14, día 21) con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 HPV16 en el adyuvante CPG indujeron la regresión de estos tumores pre-establecidos y protegieron a los ratones de la muerte: el 70-80% de los ratones todavía estaban vivos el día 35. La combinación de los 2 inmunoestimulantes CPG y DQS21 mostró un ligero efecto beneficioso frente al CpG usado solo.
<110> Friede, Martin
\hskip1cm
Garcon, Nathalie 
\hskip1cm
Hermand, Philippe 
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Formulación Adyuvante
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<130> B45181
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<160> 5
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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
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<210> 1
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> Humano
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
tccatgacgt tcctgacgtt 
\hfill
20 
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<210> 2
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<211> 18
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<212> DNA
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<213> Humano
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<400> 2
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tctcccagcg tgcgccat 
\hfill
18 
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<210> 3
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Humano
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<400> 3
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accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 
\hfill
30 
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<210> 4
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<211> 24
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<212> DNA
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<213> Humano
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<400> 4
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tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 
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24 
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<213> Humano
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<400> 5
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tccatgacgt tcctgatgct 
\hfill
20

Claims (22)

1. Una composición adyuvante que comprende una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulante, en la que la saponina está en forma de un ISCOM, o un liposoma formulado con colesterol y lípido, o una emulsión de aceite en agua, o está asociada con una sal metálica o quitosano.
2. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido inmunoestimulante comprende una secuencia Purina, Purina, C, G, pirimidina, pirimidina.
3. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que dicho oligonucleótido inmunoestimulante se selecciona del grupo que comprende: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (SEC ID Nº 1); TCT CCC AGC GTG CGC CAT (SEC ID Nº 2); ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG (SEC ID Nº 3); TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (SEC ID Nº 4); TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (SEC ID Nº 5).
4. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido inmunoestimulante contiene al menos dos repeticiones CG no metilados estando separadas por al menos 3 nucleótidos.
5. Una composición adyuvante según la reivindicación 4, en la que el oligonucleótido inmunoestimulante contiene al menos dos repeticiones CG no metiladas estando separadas por 6 nucleótidos.
6. Una composición adyuvante como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la saponina deriva de QuilA.
7. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 6, en la que el derivado de quilA es QS21.
8. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 1, que comprende una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulante que contiene un dioligonucleótido CpG sin metilar, estando la saponina en la forma de liposoma.
9. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 1, que comprende una saponina y un oligonucleótido inmunoestimulante que contiene un dioligonucleótido CpG sin metilar, estando la saponina en la forma de emulsión de aceite en agua.
10. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 1, que comprende una sal metálica particulada.
11. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 10, en la que la sal metálica particulada es hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.
12. Una composición de vacuna que comprende una composición adyuvante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además un antígeno.
13. Una composición adyuvante como la reivindicada en la reivindicación 12, en la que dicho antígeno procede de un organismo seleccionado del grupo que comprende: virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la varicela zoster, virus herpes simple de tipo 1, virus herpes simple de tipo 2, citomegalovirus humano, virus del dengue, virus de la hepatitis A, B, C o E, virus respiratorio sincitial, virus del papiloma humano, virus de la gripe, Hib, virus de la meningitis, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Bordetella, Streptococcus, Mycoplasma, Mycobacteria, Haemophilus, Plasmodium o Toxoplasma, decapéptido de Stanworth; o antígenos asociados a tumores (TAA), MAGE, BAGE, GAGE, MUC-1, Her-2 neu, CEA, PSA, KSA o PRAME; o una hormona autopéptido, GnRH.
14. Una composición de vacuna según la reivindicación 12, en el que dicho antígeno se deriva del grupo que comprende (a) antígenos asociados a tumores PSMA, PSCA, tirosinasa, survivina, NY-ESO1, prostasa, PS108, RAGE, LAGE, HAGE; (b) o el fragmento de aminoácidos N terminal 39-43 (A\beta) de la proteína precursora amiloide; (c) o antígenos asociados a la aterosclerosis.
15. Una composición de vacuna como la reivindicada en las reivindicaciones 12 a 14 en la que la vacuna se administra sistémicamente.
16. Una composición para vacunas como la reivindicada en las reivindicaciones 12 a 14 en la que la vacuna se administra a través de mucosas.
17. Una composición para vacunas como la reivindicada en la reivindicación 16 en la que la saponina de la composición adyuvante es hemolítica.
18. Una vacuna como la reivindicada en las reivindicaciones 12 a 14 para su uso como medicamento.
19. El uso de una combinación de una saponina y una molécula de CpG según las reivindicaciones 12 a 18 en la fabricación de una vacuna para la profilaxis y el tratamiento de infecciones virales, bacterianas, parasitarias, alergia, cáncer u otros trastornos crónicos.
20. Un procedimiento para preparar una composición de vacuna como la reivindicada en las reivindicaciones 12 a 18 que comprende la mezcla de una saponina, un oligonucleótido inmunoestimulante y un antígeno, en el que la saponina está en forma de ISCOM, o un liposoma formulado con colesterol y lípido, o una emulsión de aceite en agua, o está asociada con una sal metálica o quitosano.
21. Un procedimiento para fabricar una vacuna como el reivindicado en la reivindicación 20, que comprende la mezcla de lo siguiente: (a) una saponina, (b) un oligonucleótido inmunoestimulante y (c) un antígeno, en la que la saponina está en forma de liposoma y en la que el oligonucleótido contiene dinucleótidos CpG sin metilar.
22. Un procedimiento para fabricar una vacuna como el reivindicado en la reivindicación 20, que comprende la mezcla de lo siguiente: (a) una saponina, (b) un oligonucleótido inmunoestimulante y (c) un antígeno, en la que la saponina está en forma de emulsión de aceite en agua y en la que el oligonucleótido contiene dinucleótidos CpG sin metilar.
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