[go: up one dir, main page]

EA024877B1 - Связывающие множество мишеней белки, обладающие антагонистическими свойствами по отношению к cd86 - Google Patents

Связывающие множество мишеней белки, обладающие антагонистическими свойствами по отношению к cd86 Download PDF

Info

Publication number
EA024877B1
EA024877B1 EA201170443A EA201170443A EA024877B1 EA 024877 B1 EA024877 B1 EA 024877B1 EA 201170443 A EA201170443 A EA 201170443A EA 201170443 A EA201170443 A EA 201170443A EA 024877 B1 EA024877 B1 EA 024877B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
domain
binding
fusion protein
cells
amino acid
Prior art date
Application number
EA201170443A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201170443A1 (ru
Inventor
Питер Армстронг Томпсон
Питер Роберт Баум
Филип Тэн
Джон В. Блэнкеншип
Сатиш Кумар Натараджан
Original Assignee
Эмерджент Продакт Дивелопмент Сиэтл, Ллс
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эмерджент Продакт Дивелопмент Сиэтл, Ллс filed Critical Эмерджент Продакт Дивелопмент Сиэтл, Ллс
Publication of EA201170443A1 publication Critical patent/EA201170443A1/ru
Publication of EA024877B1 publication Critical patent/EA024877B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C07K16/248—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

Согласно настоящему изобретению предложен мультиспецифичный связывающий белок для модулирования ингибирования активности T-клеток или блокирования реакций, опосредуемых T-клетками, содержащий домен, связывающий CD86, соединенный с гетерологичным связывающим доменом посредством промежуточного домена, характеризующийся тем, что указанный гетерологичный связывающий домен представляет собой агонист IL-10. Мультиспецифичный гибридный белок также может содержать промежуточный домен, отделяющий другие участки. Также согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды, кодирующие мультиспецифичные гибридные белки, композиции, содержащие в составе гибридные белки, и способы применения мультиспецифичных гибридных белков и композиций.

Description

Настоящее изобретение в целом относится к области мультиспецифичных связывающих молекул и их применению для терапевтических целей и, в частности, к гибридному белку, содержащему связывающий домен, обладающий антагонистическими свойствами по отношению к ί'Ό86. и другой связывающий домен, обладающий специфичностью по отношению к гетерологичной мишени, например, такой как агонист Ш-10, а также к композициям и их применению для терапевтических целей.
Описание уровня техники
Иммунная система человека обычно защищает организм от вреда, наносимого чужеродными веществами и патогенами. Один из способов защиты организма иммунной системой заключается в образовании специализированных клеток, называемых Т-лимфоцитами или Τ-клетками. В ходе межклеточных взаимодействий между Τ-клетками и антиген-презентирующими клетками (АПК) возникают костимулирующие Τ-клеточные сигналы, которые, в свою очередь, стимулируют реакции Τ-клеток на антигены. Для полной активации Τ-клеток требуется связывание рецептора Τ-клеток (ΤΟΚ) с комплексом антигенМНС, присутствующим на поверхности антиген-презентирующих клеток, и связывание рецептора ΟΌ28 на поверхности Τ-клеток с его лигандами ΟΌ86 и/или ΟΌ80, присутствующими на поверхности антигенпрезентирующих клеток, в частности дендритных клеток.
ΟΌ80 (также обозначаемый как В7-1) первоначально был описан как активирующий антиген, ассоциированный с В-клетками человека, впоследствии было обнаружено, что он является рецептором родственных молекул Τ-клеток ΟΌ28 и антигена-4, связанного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (СТЬА-4). В ходе более поздних исследований был обнаружен другой рецептор СТБА-4, называемый ΟΌ86 (также обозначаемый как В7-0 или В7-2). Последовательности ΟΌ86 и ΟΌ80 обладают приблизительно 25% идентичности во внеклеточном участке. Хотя обычно считают, что ΟΌ80 и ΟΌ86 функционально равноценны в отношении способности вызывать и поддерживать пролиферацию ΟΌ4(+) Τ-клеток (Уакйеуко е! а1. (2002), ΌΝΑ Се11 ΒίοΙ. 21: 137-49), и данные, полученные с применением растворимого гибридного белка СТЬА-4 1д, блокирующего активность обеих молекул, показали их клиническую эффективность (Оеиоуеке е! а1. (2005), ΝΕΙΜ 353:114-1123), существуют доказательства того, что специфическое ингибирование СЭ86 может обладать преимуществами. Например, присутствие СЭ86 или СЭ80 обладает различным действием на В-клетки. В частности, было показано, что СЭ80 приводит к образованию негативного сигнала для пролиферации и секреции 1дС как в нормальных В-клетках, так и в В-клеточных лимфомах, тогда как СЭ86 повышает активность В-клеток (Биуак е! а1. (2002), I. Βίο1. СЬет. 277:7766-7775). Также существуют доказательства того, что СЭ80 обладает иммуноподавляющим действием на Τ-клетки (Ьапд е! а1. (2002), I. 1ттипо1. 168:3786-3792; Τау1ο^ е! а1. (2004), I. 1ттипо1. 172:34-39; РанА е! а1. (2004), ΡΝΑδ, 101:10398-10403), и он может опосредовать дальнейшее подавление иммунного ответа через сигналинг ΡΌ-Ы (СЭ274) на активированных АПК или Τ-клетках (ВиЬе е! а1. (2007), 1ттипЪу 27:111-122; Кеи (2008), Апп. Кеу. 1ттипо1. 26:677-704). Соответственно, ингибирование ΟΌ86 при отсутствии ингибирования ί'Ό80 может обладать преимуществами для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний, а также В-клеточных лимфом.
СТЬА-4 представляет собой трансмембранный гликопротеин 1 типа, относящийся к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируемый в основном в активированных Τ-клетках, а также в небольшой степени в регуляторных Τ-клетках ί'Ό4+ί'Ό25+ (Т-рег). СЭ86 и СЭ80 считают единственными эндогенными лигандами СТЬА-4. Было показано, что СТЬА-4 связывает СЭ86 и СЭ80 с большими аффинностью и авидностью по сравнению с СЭ28 (БиМеу е! а1. (1991), I. Е\р. Мей. 174:561-69; БшАеу е! а1. (1994), 1ттииЬу, 1:793-801) и имеет ключевое значение в качестве отрицательного регулятора активации Τ-клеток. В частности, связывание СТЬА-4 с СЭ80/СЭ86 приводит к подавлению реакций Τ-клеток и сохранению гомеостаза Τ-клеток и периферической толерантности. Считают, что это происходит как по причине антагонизма зависимой от ΟΌ28 костимуляции, так и прямого отрицательного сигналинга через
- 1 024877 цитоплазматический участок СТЬА-4. Для обзора строения и функций СТЬА-4 см. Тей е! а1. (2006), Аппи. Кеу. 1ттипо1. 24:65-97.
Как было упомянуто выше, для эффективного иммунного ответа требуется как контакт с рецептором Т-клеток, так и связывание СЭ28 с СЭ80 и/или СЭ86. Связывание с рецептором Т-клеток в отсутствие связывания СЭ28 приводит либо к апоптозу Т-клеток, либо к подавлению иммунитета, опосредованного указанными клетками. Также было показано, что сигналинг СЭ28 усиливает продукцию цитокинов Т-клетками. В частности, было показано, что стимуляция СЭ28 в 5-50 раз усиливает образование 1Ь-2, ФНО -α, лимфотоксина, ИФН-γ и ГМ КСФ в активированных Т-клетках. Более того, было показано, что индукция экспрессии гена лимфокина и/или цитокина СО28 осуществляется даже в присутствии иммунодепрессанта циклоспорина (Тйотркоп е! а1. (1989), Ргос. ЫаЙ. Асаб. ЗсБ ИЗА, 86:1333-1337). Также было показано, что СЭ28 способствует выживанию Т-клеток путем индуцирования повышенной регуляцией анти-апоптозного ВСЬ-ХЬ (А1едге е! а1. (2001), Ыа1иге Кеу. 1ттипо1. 1:220-228).
Были сконструированы растворимые формы СТЬА-4 путем слияния внеклеточного участка СТЬА-4, подобного вариабельному участку, с константными участками иммуноглобулина с получением гибридных белков СТБА-4-1д. Было показано, что посредством связывания с СО86 и СЭ80 растворимый СТБА-4-1д предотвращает зависимую от СЭ28 костимуляцию (БиМеу е! а1. (1991), 1. Ехр. Меб., 174:56169) и ингибирует костимуляцию Т-клеток, а также обладает положительным иммуноподавляющим действием в организме человека (Вгисе & Воусе (2007), Апп. Рйагтасо1йег. 41:1153-1162). Гибридный белок СТБА4-1д абатасепт в настоящее время применяют для лечения ревматоидного артрита в случаях неадекватной реакции на терапию, направленную против ФНО-α. Тем не менее, не все пациенты отвечают на введение СТБА-4-1д. и для продолжительного ответа требуется частое введение лекарственного средства, возможно, отчасти по причине того, что блокирование взаимодействия СЭ28 и СО86/СЭ80 является слабым стимулятором регуляторных Т-клеток и его недостаточно для блокирования ответов, обусловленных активированными эффекторными Т-клетками в состоянии заболевания.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 показывает связывание с СЭ80 различных белков, включая абатасепт, СТБА-4-1д(К2) (8ЕЦ ГО N0: 11), и мультиспецифичный эксцепторный (хсер!ог) гибридный белок, содержащий эктодомен СТЬА-4, соединенный с 1Б-10 (8ЕЦ ГО N0: 9).
На фиг. 2 показано, что СТБА-4-1д(Ш) (8ЕЦ ГО N0: 11) и мультиспецифичный эксцепторный гибридный белок, содержащий эктодомен СТЬА-4, соединенный с 1Б-10 (8ЕЦ ГО N0: 9), способны связываться с растворимым рецептором А 1Б-10 (йБ-КЖа).
На фиг. 3 и 4 показано, что мультиспецифичный эксцепторный гибридный белок, содержащий эктодомен СТЬА-4, соединенный с 1Б-10 (8ЕЦ ГО N0: 9), способен вызывать фосфорилирование 8ТАТ3 в МКПК.
На фиг. 5 показано, что эксцепторные молекулы, содержащие направленные против СО86 связывающие домены из моноклонального антитела 3Ό1 и гуманизированного моноклонального антитела РИМ, способны связываться с СЭ86 на поверхности клеток А1Б2-8.
На фиг. 6 показано, что эксцепторные молекулы, содержащие домен, связывающий СО86, и 1Б-10 способны одновременно связывать СО86 на поверхности клетки и йБ-КЖа.
На фиг. 7 показано, что различные варианты гуманизированных ББШ 8МБР, направленных против СЭ86, способны связывать СЭ86.
На фиг. 8 показано, что эксцепторные молекулы СТЕА-4::1Ь-10, содержащие различные линкеры, присоединяющие БЬ-10 к карбоксиконцу (ΒΌ2) эксцепторной молекулы, способны связывать 1Ь-10К1-1§. Δ -8ЕЦ ГО N0: 9; О - 8ББ) ГО N0: 171; · - 8БО ГО N0: 302; 4 - 8ЕЦ ГО N0: 173.
На фиг. 9 показано, что эксцепторные молекулы СТЕА-4::1Ь-10, содержащие более короткие линкеры, присоединяющие БЬ-10 к карбоксиконцу (ΒΌ2) эксцепторной молекулы, способны связывать 1Ь-10К1-1§. ώ - §Εζ) ГО N0: 171; О - 3Εζ) ГО N0: 175; · - ЗЕЦ ГО N0: 177; А - ЗЕЦ ГО N0: 179.
На фиг. 10 показано, что несколько эксцепторных белков связываются с СЭ80.
На фиг. 11 показано, что несколько эксцепторных белков связываются с СЭ86.
На фиг. 12 показано, что несколько эксцепторных белков связываются с йБ-КЖа.
На фиг. 13 показано, что несколько эксцепторных белков способны одновременно связываться с СЭ80 и с 51Ь-10Ка.
На фиг. 14 показано, что несколько эксцепторных белков обладают перекрестной реакционной способностью в отношении СЭ80 мыши.
На фиг. 15 показано, что несколько эксцепторных белков обладают перекрестной реакционной способностью в отношении СЭ86 мыши.
На фиг. 16 и 17 показано, что несколько эксцепторных белков блокируют ответ, опосредованный Т-клетками человека, при анализе с применением реакции СКЛ (МЬК).
На фиг. 18-20 показано, что несколько эксцепторных белков блокируют ответ, опосредованный Т-клетками мыши, при анализе с применением реакции СКЛ.
- 2 024877
На фиг. 21 и 22 показано, что несколько эксцепторных белков, содержащих вариант 1Ь-10 (как вариант 1Ь-10 с мутацией 187, так и моно-ГЬ-10) или вариант СТЬА-4, блокируют ответ, опосредованный Т -клетками человека, при анализе с применением реакции СКЛ.
На фиг. 23 показано, что несколько эксцепторных белков, содержащих вариант ГЬ-10 (как вариант ГЬ-10 с мутацией 187, так и моно-1Ь-10), обладают более слабым иммуностимулирующим действием, чем 1Ь-10 мыши при анализе пролиферации клеток МС/9.
На фиг. 24 показано, что несколько эксцепторных белков, содержащих вариант ГЬ-10 (как вариант ГЬ-10 с мутацией I 87, так и моно-1Ь-10), обладают более слабым иммуностимулирующим действием, чем 1Ь-10 человека при анализе пролиферации клеток МС/9.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение позволяет осуществлять направленное воздействие на антигенпрезентирующие клетки (АПК) с изменением их активности. Например, активность Т-клеток можно модулировать путем создания мультиспецифичных эксцепторных гибридных белков, содержащих первый связывающий домен, преимущественно связывающийся с СЭ86, и второй связывающий домен (гетерологичный связывающий домен). В отдельных вариантах реализации мультиспецифичный эксцепторный гибридный белок содержит первый и второй связывающие домены, первый и второй линкеры и промежуточный домен, причем один конец указанного промежуточного домена соединен посредством линкера с первым указанным связывающим доменом, представляющим собой домен, связывающий С'Н86. а другой конец соединен посредством линкера со вторым связывающим доменом, представляющим собой антагонист 1Ь-10.
В отдельных вариантах реализации домен, связывающий СЭ86, представляет собой эктодомен СТЬА-4, эктодомен С.Н28 или связывающий домен вариабельной области иммуноглобулина (например, 8сРу), обладающий специфичностью по отношению к СГО86 (например, полученный из моноклонального антитела 3Ό1 или ΡυΝ1). В некоторых вариантах реализации применяют участок, меньший, чем полноразмерный эктодомен. Например, можно применять домены в пределах эктодомена СТЬА-4, связывающие СГО86 и предотвращающие связывание СГО86 с С.Н28. В дополнительных вариантах реализации агонист 1Ь-10 представляет собой 1Ь-10 или его функциональный фрагмент.
Примеры строения указанных мультиспецифичных гибридных белков, обозначаемых в настоящем документе как эксцепторные молекулы, включают Ν-ΒΌ-ГО-ЕН-С, Ν-ΕΌ-ГО-ВН-С, Ν-ΒΌ1-ΙΌ-ΒΌ2<’ и Ν-ΕΌ-ГО-ЕН-С, где Ν- и -С обозначают амино- и карбоксиконец соответственно; ΒΌ представляет собой иммуноглобулин подобный связывающий домен или связывающий домен вариабельной области иммуноглобулина; ГО представляет собой промежуточный домен и ΕΌ представляет собой внеклеточный домен или экстодомен, например лиганд-связывающий домен рецептора, лиганд, лектиновую область С-типа, область семафорина или семафорин подобный домен или им подобные. В составе некоторых конструкций ГО может включать константную область иммуноглобулина или ее фрагмент, расположенную между указанными первым и вторым связывающими доменами. В других конструкциях, в составе которых каждый из ΒΌ и ΕΌ связан с ГО посредством одинаковых или различных линкеров (например, посредством линкера, включающего от одной до 50 аминокислот), например шарнирной области иммуноглобулина (состоящей, например, из верхней и коровой областей) или ее функционального варианта, или лектинового интердомена или его функционального варианта, или области стебля молекулы кластера дифференцировки (СО) или его функционального варианта.
Перед приведением более подробного описания настоящего изобретения для лучшего понимания его может быть полезным предоставление определений отдельных терминов, употребляемых в настоящем документе. Дополнительные определения приведены в ходе описания настоящего изобретения.
В настоящем описании подразумевается, что любой интервал концентрации, интервал процентных значений, интервал отношений или интервал чисел включает любое значение любого целого числа в пределах обозначенного интервала и, когда это целесообразно, его дробных частей (например, одна десятая и одна сотая целого числа), если не указано обратного. Также следует понимать, что любой интервал значений, указанный в настоящем описании, относящийся к любому физическому свойству, например к субъединицам полимера, размерам или толщине, включает любое число в пределах указанного интервала, если не указано обратного. При использовании в настоящем описании приблизительно или по существу состоящий из означают ±20% от указанного интервала, значения или структуры, если не указано обратного. Следует понимать, что единственное число, употребляемое в настоящем описании, может относиться к одному или более перечисляемых элементов. Предложение любого выбора (например, при использовании союза или) может подразумевать под собой одну, две или любое сочетание возможностей. Термины включает и содержит в тексте настоящего описания являются синонимами. Также следует понимать, что описания определенных соединений или групп соединений, полученных из различных сочетаний структур и заместителей, приведенные в настоящем документе, приведены в тексте в той же степени, как для отдельного соединения или группы соединений. Следовательно, выбор определенных структур или определенных заместителей входит в объем настоящего изобретения.
Связывающий домен или связывающий фрагмент согласно настоящему изобретению может представлять собой, например, любой белок, полипептид, олигопептид или пептид, обладающий способ- 3 Μ4»ΊΊ ностью к специфическому распознаванию и связыванию биологической молекулы (например, СО86) или комплекса, состоящего из более одной одинаковых или различных молекул, или совокупности или агрегата, как устойчивого, так и не устойчивого (например, комплекс ί'.Ό86/ί'.Ό28). Указанные биологические молекулы включают белки, полипептиды, олигопептиды, пептиды, аминокислоты или их производные, липиды, жирные кислоты или их производные; углеводороды, сахараиды или их производные; нуклеотиды, нуклеозиды, пептиды нуклеиновых кислот, молекулы нуклеиновых кислот или их производные; гликозилированные белки, гликопептиды, гликолипиды, липопротеины, протеолипиды или их производные; другие биологические молекулы, которые могут присутствовать, например, в биологическом образце; или любое сочетание указанных молекул. Связывающий домен включает любой встречающийся в природе, синтезированный, или полусинтезированный, или полученный рекомбинантным путем партнер для связывания с биологической молекулой или другой интересующей мишени. Для определения связывающих доменов согласно настоящему изобретению известно множество различных способов обнаружения специфического связывания с определенной мишенью, включая Вестерн блоттинг, ИФА или анализ с помощью прибора Биакор.
Связывающие домены и гибридные белки, содержащие в своем составе указанные домены, согласно настоящему изобретению обладают способностью к связыванию мишени в заданной степени, включая специфическое или избирательное связывание, при незначительном связывании других компонентов, присутствующих в исследуемом образце, если они связывают молекулу - мишень с аффинностью или Ка (т.е. с равновесной константой ассоциации определенного связывающего взаимодействия, измеряемой в единицах, составляющих 1/М) составляющей, например, более чем или приблизительно равной
-Ц1
1012 или 1013 М-1. К высокоаффинным областям связывания относятся связывающие домены, Ка которых составляет по меньшей мере 107, по меньшей мере 108, по меньшей мере 109, по меньшей мере 1010, по меньшей мере 1011, по меньшей мере 1012, по меньшей мере 1013 М-1 или более. Также аффинность можно определить через равновесную константу диссоциации (Κι) определенных связывающих взаимодействий, измеряемую в единицах, составляющих М (например, от 10-5 до 10-13 М). Аффинность полипептидов и гибридных белков, содержащих связывающий домен согласно настоящему изобретению, можно с легкостью определить при помощи общепринятых методик (см., например, 8са1сйагй е! а1. (1949), Αηη. Ν.Υ. АсаД δοΐ. 51:660 и патент США № 5283173; 5468614 или аналогичные им).
Связывающие домены согласно настоящему изобретению можно получать согласно описанному в настоящем документе или при помощи различных способов, известных в данной области техники (см., например, патент США № 6291161; 6291158). Источники включают последовательности генов антител различных видов организмов (которые могут быть оформлены как антитела, фрагменты 8Ρν, 8сРу или РаЬ, как в библиотеке фагов), включая человека, верблюдовых (из верблюдов, дромадер или лам; Натег8-Са8!егтап е! а1. (1993) №Лиге. 363:446 и N§иуеη е! а1. (1998) 1. Мо1. ΒίοΙ, 275:413), акулу (Коих е! а1. (1998) Ргос. №!1. АсаД 8ст. (υδΑ) 95:11804), рыбу Кдиуеп е! а1. (2002), 1ттиподепе!ю8, 54:39), грызунов, птичьих, овечьих, последовательности, кодирующие случайные библиотеки пептидов или последовательности, кодирующие сконструированное разнообразие аминокислот в альтернативных каркасных структурах, не соответствующих антителам, например, в доменах фибриногена (см., например, \Уе18е1 е! а1. (1985), δ^ι^, 230:1388), в доменах Кунитца (см., например, патент США № 6423498), в доменах липокалина (см., например, ПЗ 2006/095164), в У-образных доменах (см., например, опубликованную заявку на патент США № 2007/0065431), в лектиновых доменах С-типа (2е1еп8ку апй Сгеайу (2005), ΡΕΒδ ί. 272:6179), тАЬ2 или РсаЬ™ (см., например, РСТ опубликованную заявку на патент США № ПЗ 2007/098934; ПЗ 2006/072620) и т.д. Также для разработки связывающих доменов согласно настоящему изобретению можно применять традиционные стратегии разработки гибридом с применением синтезированного одноцепочечного СО86 как иммуногена в подходящих системах (например, мыши, мышь НиМАЬ®, мышь ТС™, КМ-мышь®, ламы, цыплята, крысы, хомяки, кролики и т.д.).
Все общепринятые в данной области термины, относящиеся к методике работы с антителами, в настоящем описании несут смысл, придаваемый им в данной области, если в настоящем документе недвусмысленно не указано обратное. Например, термины Уь и УН относятся к вариабельной связывающей области, полученной из легкой и тяжелой цепей антитела соответственно. Вариабельные связывающие области состоят из дискретных, четко выраженных участков, известных как гипервариабельные участки (СОК) и каркасные участки (РК). Термины Сь и СН относятся к константной области иммуноглобулина т.е. к константной области, полученной из легкой или тяжелой цепи соответственно, с условием, что вторая область далее делится на домены константного участка СН1, СН2, СН3 и СН4, в зависимости от изотипа антитела (1§А, 1§О, 1дЕ, 1§С, 1дМ), из которого был получен указанный участок. Часть участков константной области образует Рс-фрагмент (кристаллизующийся фрагмент), содержащий домены, отвечающие за эффекторные функции иммуноглобулина, такие как АОСС (антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность), АОСР(антителозависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз), СЭС (комплементзависимая цитотоксичность) и фиксация комплемента, связывание с рецепторами Рс, более длительный период полувыведения щ νί\Ό по сравнению с полипептидами, не содержа105, 106, 107,
108, 109, 1010, 10
- 4 024877 щими Рс-фрагмент, связывание белка А и, возможно, трансплацентраный перенос (см. Сароп е! а1. (1989), Ыа1иге, 337:525). Далее, полипептид, содержащий Рс-фрагмент, подвержен димеризации и мультимеризации полипептида. Шарнирная область, также обозначенная в настоящем описании как линкер, представляет собой аминокислотную последовательность, расположенную между связывающей вариабельной областью и константной областью одной цепи антитела и соединяющую указанные области и, как известно в данной области, подобно шарниру, обеспечивающей подвижность антител и подобных антителам молекул.
Доменную структуру иммуноглобулинов можно подвергать конструированию, в ходе которого антигенсвязывающие домены и домены, отвечающие за эффекторные функции, можно переносить между разными классами и подклассами иммуноглобулинов. Структура и функции иммуноглобулинов рассмотрены, например, в Нат1о№ е! а1., Ебк., АпНЬоФек: А ЬаЬота1огу Мапиа1., СЬар!ег 14 (Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1огу, Со1б 8ртшд НагЬог, 1988). Обширное введение, а также подробную информацию обо всех аспектах методики работы с рекомбинантными антителами можно найти в пособии КесошЬшай АпНЬоФек (1оЬп \УПеу & 8опк, ΝΥ, 1999). Полное собрание подробных лабораторных протоколов конструирования антител можно найти в К. Койетшапп апб 8. БиЬе1, Ебк., ТЬе АпбЬобу Епдтееппд ЬаЬ Мапиа1 (8ртшдет Ует1ад, Не1бе1Ьегд/№\у Υо^к. 2000). Также протоколы, относящиеся к указанной теме, доступны в Сштей Рго1осо1к ш 1ттипо1оду, Аидик! 20091, опубликованных 1оЬп \Уйеу & 8опк, 1пс., Вок!оп, МА.
Термин биологический образец включает образец крови, образец, полученный с помощью биопсии, эксплантат ткани, культуру органа, биологическую жидкость, или любую другую ткань, или клетку, или любой другой препарат, полученный от субъекта или из биологического источника. Субъектом или биологическим источником могут являться, например, животные, относящиеся или не относящиеся к роду человек, первичная культура клеток или адаптированная в культуре линия клеток, включая генетически сконструированные линии клеток, которые могут содержать включенные в хромосомы или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, гибридные линии соматических клеток, иммортализованные или подверженные иммортализации линии клеток, линии дифференцированных или подверженных дифференциации клеток, трансформированные линии клеток и им подобные. В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения субъект или биологический образец может быть потенциально поражен заболеванием или иметь риск поражения заболеванием, нарушением или состоянием, включая заболевание, нарушение или состояние, связанное со злокачественной опухолью, или нарушение, связанное с В-клетками. В отдельных вариантах реализации субъект или биологический источник могут быть поражены заболеванием, связанным с повышенной пролиферацией, воспалительным заболеванием или аутоиммунным заболеванием, в других вариантах реализации настоящего изобретения может быть известно, что субъект или биологический источник может находиться вне риска поражения указанным заболеванием, нарушением или состоянием.
Домены, связывающие СБ86.
Как было упомянуто в настоящем описании, СБ86 представляет собой трансмембранный белок I типа и является представителем суперсемейства иммуноглобулинов. СБ86 экспрессируется антигенпрезентирующими клетками и является лигандом двух белков Т-клеток, СБ28 и СТЬА-4. Связывание СБ86 с СБ28 является костимулирующим сигналом для активации Т-клетки, тогда как связывание СБ86 с СТЬА-4 регулирует активацию Т-клетки в отрицательном направлении и снижает иммунный ответ. Альтернативный сплайсинг ведет к появлению двух вариантов транскриптов, кодирующих разные изоформы (№ доступа ОепЬапк ΝΡ_787058.3 и ΝΡ_008820.2).
Домен, связывающий СБ86 согласно настоящему изобретению, способен блокировать связывание СБ86 с СБ28 и, следовательно, отрицательно регулировать активацию Т-клеток. Предусматриваемые согласно настоящему изобретению СБ86 связывающие домены включают внеклеточный домен СТЬА-4 или его фрагмент, внеклеточный домен СБ28 или его фрагмент или связывающий домен, полученный на основе антитела, обладающий специфичностью по отношению к СБ86 (например, домен, полученный из моноклонального антитела ΡυΝ1 (см., например, 1. Ра!Ьо1. 1993 Маг; 169(3):309-15) или полученный из моноклонального антитела 3Ό1, направленного против СБ86. В некоторых вариантах реализации СБ86-связывающий домен представляет собой внеклеточный домен (эктодомен) СТЬА-4 человека (№ доступа ОепЬапк ΝΡ1Ό05205), например последовательность зрелого полипептида из 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 (сигнальный пептид: 1-37 аминокислоты). Аминокислотная последовательность эктодомена СТЬА-4 без сигнального пептида приведена в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 410. Заявители отмечают, что в ходе отдельных исследований было показано, что последовательность зрелого полипептида эктодомена СТЬА-4 начинается с метионина в положении 38 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1, в ходе других исследований было показано, что последовательность зрелого полипептида начинается с аланина в 37 положении. В дополнительных вариантах реализации связывающий домен СГО86 представляет собой эктодомен СТЬА-4, который подвергли мутации для повышения авидности к СБ86 по сравнению с диким типом или не подвергнутым мутации СТЬА-4, согласно описанному, например, в опубликованном патенте США № и8 2003/0035816. В отдельных вариантах реализации эктодомен СТЬА-4, подвергнутый мутации, содержит аланин или тирозин в положении аминокислоты 29 и/или глутаминовую кислоту, аспарагин, аспарагиновую кислоту, глутамин, изо- 5 024877 лейцин, лейцин или треонин в положении 104 §ЕЦ ГО N0: 410. Аминокислотная последовательность варианта эктодомена СТЬА-4 Α29Υ Ь104Е приведена в §ЕЦ ГО N0: 411. В отдельных вариантах реализации связывающий домен СГО86 представляет собой подобный вариабельной области домен СТЬА-4, например, с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3 или участок СОК подобного вариабельной области домена СТЬА-4, например, с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 4 (СЭК1). §ЕЦ ГО N0: 5, (СЭК2) или §ЕЦ ГО N0: 6 (СГОК3). Указанные участки СОК описаны, например, в патенте США № 7405288. В других вариантах реализации связывающий домен СГО86 представляет собой внеклеточный домен (эктодомен) СГО28 (№ доступа СеиЬаик ПР_006130.1), например, согласно приведенному в §ЕЦ ГО N0: 2. 1-18 аминокислоты в §ЕЦ ГО N0: 2 представляют собой сигнальный пептид. Аминокислотная последовательность эктодомена СГО28 без сигнального пептида приведена в §ЕЦ ГО N0: 412. В дополнительных вариантах реализации связывающий домен СГО86 содержит одноцепочечный иммуноглобулин подобный участок, например, 8сРу, обладающий специфичностью по отношению к СГО86. В отдельных вариантах реализации связывающий домен СГО86 содержит связывающие домены вариабельных связывающих областей легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела РиШ или 3Ό1. Последовательности тяжелой цепи, легкой цепи, линкера 8сРу и участков СОК в составе моноклональных антител, РЦП1 и 3Ό1, направленных против СЭ86, которые можно применять для создания эксцепторных молекул согласно настоящему изобретению, приведены в §ЕЦ N08: 305-313 и 318-326 соответственно.
В одном аспекте связывающий домен СГО86 или гибридный белок, содержащий указанный связывающий домен согласно настоящему изобретению, обладает специфичностью по отношению к СГО86 и его аффинность описывается константой диссоциации (КД значение которой составляет от приблизительно 10-3 до менее чем приблизительно 10-8 М. В отдельных предпочтительных вариантах реализации связывающий домен СГО86 или гибридный белок, содержащий указанный связывающий домен, связывает СГО86 с аффинностью, составляющей приблизительно 0.3 мкМ.
В качестве иллюстративного примера можно привести возможность определения связывающих доменов СГО86 согласно настоящему изобретению с применением фаговой библиотеки РаЬ фрагментов (см., например, Ное1 е1 а1. (2005), №йиге Вю1есЬпо1. 23:344) путем скрининга по признаку связывания с синтезированным или рекомбинантным СГО86 (с применением аминокислотной последовательности или ее фрагмента, приведенной по № доступа СепЬапк №_787058.3 или ПР_008820.2). В отдельных вариантах реализации молекула СЭ86, применяемая для создания домена, связывающего СЭ86, может дополнительно содержать промежуточный домен или домен димеризации согласно описанному в настоящем документе, например Рс-фрагмент иммуноглобулина или его участок.
В некоторых вариантах реализации домены, связывающие СГО86 согласно настоящему изобретению, включают домены УН и Уъ согласно описанному в настоящем документе (например, РИ№, 3Ό1, или их гуманизированных вариантов). Другие примеры участков УН и Уъ включают описанные в патенте США № 6827934. В отдельных вариантах реализации домены УН и Уъ происходят из организма человека. В дополнительных вариантах реализации предложены варианты доменов, связывающих СГО86 согласно настоящему изобретению, последовательности которых по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99.5% или по меньшей мере на 100% идентичны аминокислотной последовательности одного или более вариабельных участков в составе легкой цепи (Уъ) или одного или более вариабельных участков в составе тяжелой цепи (УН) или обоих вариантов согласно 8ЕЦ N08: 305 и 306, §ЕЦ N08: 318 и 319 или описанным в патенте США № 6827934 (включенном в настоящий документ посредством ссылки), где в составе каждого участка СОК содержится ноль, одна, две или три замены аминокислот (т.е. большинство замен расположены в области каркасного участка (участков)). Термины идентична или процент идентичности по отношению к последовательностям двух или более полипептидов или молекул нуклеиновых кислот относятся к двум или более одинаковым или имеющим определенный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов в составе определенного участка последовательностям или частичным последовательностям (например, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности), при сопоставлении и выравнивании на максимальное соответствие в окне сравнения или обозначенном участке, измеряемые при помощи способов, известных в данной области, например алгоритма сравнения последовательностей, ручного выравнивания или визуальной оценки. Например, предпочтительными алгоритмами, подходящими для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы ВЬА§Т и ВЬА§Т 2.0, описанные в АЙ8с1ш1 е1 а1. (1977), №.1с1ею Ааб8 Ке8. 25:3389 и А118с1ш1 е1 а1. (1990), 1. Мо1. Вю1. 215:403 соответственно.
В любом из указанных или других вариантов реализации, описанных в настоящем документе, касающихся применения участков Уъ и УН, домены Уъ и УН могут быть расположены в любой ориентации и могут быть разделены линкером, длина которого может оставлять до 30 аминокислот согласно описанному в настоящем документе или любой аминокислотной последовательностью, способной обеспечивать функцию спейсера, совместимую с взаимодействием двух связывающихся доменов. В отдельных вариантах реализации линкер, соединяющий домены Уъ и УН, содержит аминокислотную последовательность
- 6 024877 согласно приведенному в одном или более из следующих документов: ЗЕО ГО N08: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 и 383-398, например 46 линкер (ЗЕО ГО N0: 88), 130 линкер (ЗЕО ГО N0: 163), 131 линкер (ЗЕО ГО N0: 164), 115 линкер (ЗЕЦ ГО N0: 148) или линкер, приведенный в ЗЕЦ ГО N0: 244. Мультиспецифичные связывающие домены должны содержать по меньшей мере два специфичных связывающих участка, по аналогии с организацией антитела верблюдовых, или по меньшей мере четыре специфичных связывающих участка, по аналогии с организацией более традиционного антитела млекопитающих, содержащего парные цепи Уъ и УН.
Участки СОК можно определять различными способами, известными в данной области, включая КаЬа!, СЬо!Ыа, ЛЬМ и связанные способы определения. Определение КаЬа! основано на вариабельности последовательностей и применяется чаще всего для прогнозирования участков СОК (1оЬп8ОИ е! а1. (2000), ШсЮс Λοίά8 Ке8. 28:214). Определение СНобйа основано на расположении структурных петлевых фрагментов (СЬо!Ыа е! а1. (1986), 1. Мо1. ΒίοΙ. 196:901; СНобйа е! а1. (1989), №!ите, 342:877). Определение АЬМ представляет собой нечто среднее между определениями КаЬа! и СНобйа и является объединенным набором программ для моделирования строения антител, созданным 0хГогб Мо1еси1аг Отоир (Март е! а1 (1989), Ргос. №!1. Асаб. 8с1. (США), 86:9268; Кее8 е! а1., АВМТМ, компьютерная программа, предназначенная для моделирования вариабельных областей антител, 0хГогб, ИК; 0хГогб Мо1еси1аг, Ь!б.). Дополнительный вариант определения, известный как контактное определение, был представлен ранее (см. МасСа11ит е! а1. (1996), 1. Мо1. Вю1. 5:732) и основан на анализе строения доступных в кристаллической форме комплексов.
Участки СОК в составе тяжелой цепи принято обозначать как Н1, Н2 и Н3, последовательная нумерация которых осуществляется по порядку от Аконца к С-концу. Длина участка СОК-Н1 составляет приблизительно от 10 до 12 аминокислотных остатков, она начинается через четыре аминокислотных остатка после Су8 согласно способам определения СЬо!Ыа и АЬМ или на пять аминокислотных остатков позже согласно способу определения КаЬа!. За участком Н1 могут следовать Тгр, Тгр-Уа1, Тгр-11е или Тгр-А1а. Длина Н1 составляет приблизительно от 10 до 12 аминокислотных остатков согласно способу определения АЬМ, тогда как способ определения СНобйа исключает последние четыре аминокислотных остатка. Участок СОК-Н2 начинается через 15 аминокислотных остатков после окончания Н1 согласно способам определения КаЬа! и АЬМ, и обычно ему предшествует последовательность Ьеи-01и-Тгр-11е-01у (хотя известны и некоторые вариации), и обычно за ним следует последовательность Ьу5/Лгд-Ьеи/11е/Уа1/РНе/ТНг/Л1а-ТНг/Зег/11е/Л1а. Согласно способу определения КаЬа! длина участка Н2 составляет приблизительно от 16 до 19 аминокислотных остатков, тогда как способ определения АЬМ прогнозирует длину указанного участка как 9-12 аминокислотных остатков. Начало участка СОК-Н3 обычно расположено через 33 аминокислотных остатка после окончания Н2, обычно ему предшествует последовательность аминокислот Су8-А1а-Ат§, и за ним следует аминокислота О1у, длина указанного участка находится в интервале от 3 до приблизительно 25 аминокислотных остатков.
Участки СОК в составе легкой цепи принято обозначать как Ь1, Ь2 и Ь3, последовательная нумерация которых осуществляется по порядку от Аконца к С-концу. Участок СОК-Ь1 обычно начинается приблизительно с 24 аминокислотного остатка, обычно ему предшествует остаток Су8. За участком СОК-Ь1 обычно следует остаток Тгр, с которого начинается одна из следующих последовательностей: Тгр-Туг-О1п, Тгр-Ьеи-О1п, Тгр-РНе-О1п или Ттр-Туг-Ьеи. Длина СОК-1 составляет приблизительно от 10 до 17 аминокислотных остатков. Участок СОК-Ь2 начинается через 16 аминокислотных остатков после окончания участка Ь1 и обычно ему предшествуют остатки 11е-Туг, Уа1-Туг, 11е-Ьу8 или бе-РНе. Длина СОК-Ь2 составляет приблизительно семь аминокислотных остатков. Участок СОК-Ь3 обычно начинается через 33 аминокислотных остатка после окончания участка Ь2 и обычно ему предшествует остаток Су8, после указанного участка обычно следует последовательность РНе-О1у-ХХХ-О1у, и ее длина составляет от 7 до 11 аминокислотных остатков.
Таким образом, связывающий домен согласно настоящему изобретению может включать один участок СОК вариабельной области антитела, направленного против СО86, или указанный связывающий домен может включать множество участков СОК, которые могут быть идентичными или могут различаться. В отдельных вариантах реализации связывающие домены согласно настоящему изобретению включают домены УН и Уъ, обладающие специфичностью по отношению к СО86, содержащие каркасные участки и участки СОК1, СОК2 и СОК3, где (а) домен УН содержит аминокислотную последовательность СОК3 тяжелой цепи; или (Ь) домен Уъ содержит аминокислотную последовательность СОК3 легкой цепи; или (с) связывающий домен содержит аминокислотную последовательность УН из (а) и аминокислотную последовательность Уъ из (Ь); или связывающий домен содержит аминокислотную последовательность УН из (а) и аминокислотную последовательность Уъ из (Ь) и где УН и Уъ находятся в составе одной и той же референтной последовательности. В дополнительных вариантах реализации связывающие домены согласно настоящему изобретению включают домены УН и Уь, обладающие специфичностью по отношению к СО86, содержащие каркасные участки и участки СОК1, СОК2 и СОК3, где (а) домен УН содержит аминокислотную последовательность СОК1, СОК2 и СОК3 тяжелой цепи; или (Ь) домен Уъ содержит аминокислотную последовательность СОК1, СОК2 и СОК3 легкой цепи; или (с) связывающий домен содержит аминокислотную последовательность УН из (а) и аминокислотную последова- 7 024877 тельность Уъ из (Ь); или связывающий домен содержит аминокислотную последовательность Ун из (а) и аминокислотную последовательность V!, из (Ь) и где Ун и Уъ находятся в составе одной и той же референтной последовательности. В любом из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, включающих специфичные участки СПК связывающий домен может содержать (ί) домен Ун, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности домена Ун; или (и) домен Уъ, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотной последовательности домена Уъ; или (ίίί) домен Ун из (ί) и домен Уъ из (и); или домен Ун из (ί) и домен Уъ из (ίί), при этом Ун и Уъ находятся в составе одной и той же референтной последовательности, причем в составе каждого участка СОК содержится не больше трех замен аминокислот (т.е. многие замены расположены в каркасном участке (участках)).
Домен, связывающий СО86 в составе эксцепторных гибридных белков согласно настоящему изобретению, может представлять собой иммуноглобулин подобный домен, например каркасную область иммуноглобулина. Каркасные области иммуноглобулинов, предусматриваемые настоящим изобретением, включают, но не ограничиваются 8сРу, антитело, состоящее из одного домена или антитело, состоящее только из тяжелой цепи. В случае 8сРу настоящее изобретение предусматривает вариабельные области тяжелой и легкой цепей, соединенные с любым пептидным линкером, известным в данной области как совместимый с объединением доменов или участков в составе связывающей молекулы. Примерами линкеров являются линкеры на основе линкерного мотива О1у48ег, например (О1у48ег)п, где п=1-5. Если связывающий домен в составе гибридного белка согласно настоящему изобретению получен на основе иммуноглобулина отличного от человека животного или включает участки СОК иммуноглобулина, происходящие не от человека, связывающий домен можно гуманизировать в соответствии со способами, известными в данной области. В качестве альтернативы СО86-связывающий домен гибридных белков согласно настоящему изобретению, может представлять собой каркас, отличный от каркасной области иммуноглобулина. Другие каркасы, предусматриваемые настоящим изобретением, представляют собой участок (участки) СОК, обладающие специфичностью по отношению к СО86, находящиеся в функциональной конформации. Другие предусматриваемые каркасы включают, но не ограничиваются, следующими: молекула содержащая домен А, домен фибронектина III, антикалин, полученная методами генной инженерии связывающая молекула с анкириновым повтором, аднектин, домен Кунитца или белковое аффитело с доменом ΑΖ.
1Ь-10.
Согласно упомянутому выше в отдельных вариантах настоящего изобретения предложены полипептиды, содержащие домен или участок связывания, обладающий агонистическими свойствами по отношению к 1Ь-10 (т.е. способный усиливать сигналинг 1Ь-10). В некоторых вариантах реализации связывающий домен, обладающий агонистическими свойствами по отношению к 4Б-10, представляет собой 1Ь-10 или 1Ь-10 Рс или его биологически активный фрагмент. В других вариантах реализации связывающий домен, обладающий агонистическими свойствами по отношению к 1Ь-10, представляет собой одноцепочечный связывающий белок, например 8сРу, избирательно связывающийся с 1Ь-10К1 или рецептором 2 1Ь-10 (1Ь-10К2). В некоторых вариантах реализации связывающий домен, обладающий агонистическими свойствами по отношению к 4Б-10, представляет собой 1Ь-10, содержащий точечную мутацию в 87 положении 8ЕЦ ГО N0: 7, например от I до А или 8 (обозначенные в настоящем документе как Ι87Α или К78 соответственно). Известно, что вариант молекул ГЬ-Ю 187 обладает более слабыми иммуностимулирующими свойствами по сравнению с ЕЛ-10 дикого типа (ϋίη§ е! а1., ί. Ехр. Меб. 191:213, 2000). Также Ю-10 обычно образует гомодимер с аминоконцевым участком каждой молекулы мономера, связывающейся с С-концевым участком другого мономера). В одном варианте реализации также был исследован связывающий домен, обладающий агонистическими свойствами по отношению к ^-10, представляющий собой молекулу ^-10, содержащую короткий линкер (дддкдд 8ЕЦ ГО N0: 379), разделяющий две части молекулы (Ν- и С-фрагменты) таким образом, чтобы указанные части могли образовывать внутримолекулярный димер. Указанные молекулы обозначены в настоящем документе как молекулы моно-ТБ-10.
К-К) (№ доступа ОепЬапк ΝΡ 000563.1; 8ЕЦ ГО N0: 754) является представителем суперсемейства цитокинов, структура которых представляет собой альфа-спираль. Хотя этому и не существует эмпирических доказательств, было сделано предположение о том, что все представители указанного семейства содержат в составе альфа-спираль (РБскепксЬет, н. е! а1., (2002), Ттепйк Iттиηο1. 23:89). Ю-10 содержит четыре остатка цистеина, только один из которых является консервативным среди представителей семейства. Поскольку в строении Ю-10 была показана У-образная складчатость, принимающая участие в его димеризации, похоже, что дисульфидные связи не имеют решающего значения для поддержания его структуры. Значение идентичности аминокислотного состава ББ-10 с другими представителями семейства находится в интервале от 20% (4Б-19) до 28% (Ю-20) (Оитои1ет е! а1., (2002), Еиг. СуФкше №ΐ\ν. 13:5).
Впервые ББ-10 был описан как цитокин ТЬ2 мыши, который ингибировал образование цитокинов ИФН-α и ГМ-КСФ клетками ТЫ (Мооге е! а1., 2001, Аппи. Кеу. Iттиηо1. 19:683; Рюгепйпо е! а1., (1989), ί. Ехр. Меб. 170:2081). Длина !Б-10 человека составляет 178 аминокислот, она содержит сигнальную по- 8 024877 следовательность, состоящую из 18 аминокислот и зрелый сегмент, состоящий из 160 аминокислот. Его молекулярная масса составляет приблизительно 18 кДа (в мономерной форме). ГЬ-10 человека не содержит потенциально Ν-связанного сайта гликозилирования и не подвергается гликозилированию (Питои!ег е! а1., (2002), Еиг. Су!окше №!ν. 13:5; У1е1га е! а1., (1991), Ргос. Ыа1'1. Асай. 8ск И8А, 88:1172). 1Б-10 содержит четыре остатка цистеина, образующих две межцепочечные дисульфидные связи. Спирали от А до Ό в составе одного мономера ковалентно взаимодействуют со спиралями Е и Р в составе второго мономера с образованием не ковалентного У-образного гомодимера. Была построена карта функциональных доменов молекулы 1Б-10. На Ν-конце остатки #1-9, расположенные перед спиралью А, участвуют в пролиферации тучных клеток, тогда как аминокислотные остатки #152-160 на С-конце, расположенные перед спиралью Р, опосредуют секрецию и хемотаксис лимфоцитов.
Клетки, для которых была доказана способность к экспрессии 1Б-10, включают Т-клетки СЭ8+. клетки микроглии, моноциты СП14+ (но не СО 16+), клетки ТБ2 СЭ4+ (мыши), кератиноциты, звездчатые клетки печени, Т-клетки ТБ1 и ТБ2 СЭ4+ (человека), клетки меланомы, активированные макрофаги, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, В-клетки (С.П5+ и С.П19+) и эозинофилы. В случае Т-клеток первоначальное наблюдение об ингибировании 1Б-10 образования ИФН-γ в настоящее время рассматривается как непрямое действие, опосредованное А-клетками. Дополнительное влияние на Т-клетки, тем не менее, включает хемотаксис Т-клеток ΤΌ8+, индуцированный 1Ь-10, ингибирование хемотаксиса Т-клеток С.П4+ по отношению к 1Ь-8, подавление образования 1Ь-2 вследствие активации, ингибирование апоптоза Т-клеток посредством активации Вс1-2 и прерывание пролиферации Т-клеток вследствие слабой стимуляции антигеном при совместной стимуляции с СП28 (АкФк е! а1., (2001), 1ттипо1оду 103:131).
В случае В-клеток 1Б-10 выполняет несколько связанных, но обособленных функций. В совокупности с ФРО-β и СП40Ь, 1Б-10 индуцирует образование 1дА в не обученных (1др+) В-клетках. Считается, что ФРО-Р/СП40Ь стимулирует переключение класса, тогда как 1Б-10 вызывает дифференциацию и рост. При отсутствии ФРО-Р, 1Б-10 совместно действует с СП40Ь в стимулировании 1дО1 и 1дО3 (человека) и, следовательно, может являться прямым фактором переключения для подтипов 1дО. Примечательно, что 1Б-10 оказывает противоположное действие на выделение 1дЕ, вызываемое 1Ь-4. Если 1Б-10 присутствует во время переключения класса, вызываемого 1Ь-4, он меняет действие на противоположное; если он присутствует после коммутирования 1дЕ, он усиливает секрецию 1дЕ. Наконец, взаимодействие СП27/СП70 в присутствии 1Б-10 стимулирует образование плазматических клеток из В-клеток памяти (Адетаки е! а1. (1998), В1оой 91:173).
1Б-10 также оказывает влияние на тучные клетки и клетки - естественные киллеры. В случае тучных клеток 1Б-10 вызывает выделение гистамина при блокировании выделения ГМ-КСФ и ФНО-α. Указанное действие может иметь аутокринный механизм, поскольку известно, что в организме крысы 1Б-10 выделяют тучные клетки. В качестве доказательства его плейотропной природы можно привести тот факт, что 1Б-10 оказывает противоположное действие на клетки - естественные киллеры. Вместо того чтобы блокировать образование ФНО-α и ГМ-КСФ, фактически 1Б-10 стимулирует указанную функцию в случае клеток - естественных киллеров. Также он усиливает пролиферацию клеток - естественных киллеров, вызываемую 1Ь-2, и усиливает секрецию ИФН-γ в клетках - естественных киллерах, подвергнутых первичному воздействию 1Б-18. При совместном действии с 1Ь-12 и/или 1Ь-18, 1Б-10 усиливает цитотоксичность клеток - естественных киллеров (Са1 е! а1., 1999, Еиг. ί. 1ттипо1. 29:2658).
1Б-10 обладает ярко выраженным противовоспалительным действием на нейтрофилы. Он ингибирует выделение хемокинов М1Р (воспалительного белка макрофагов)-1а, ΜΙΡ-1β и 1Ь-8 и блокирует образование провоспалительных медиаторов 1Ь- 1β и ФНО-α. Также он снижает способность нейтрофилов к образованию супероксидов, вследствие чего препятствует клеточной цитотоксичности, опосредованной ПМН. Также 1Б-10 блокирует хемотаксис, вызываемый 1Ь-8 и 1МЬР, возможно, посредством рецептора 1 СХС (Уюю8о е! а1., (1998) Еиг. Су!окше №!ν. 9:247).
В случае дендритных клеток (ОС), 1Б-10 обычно проявляет иммуносупрессорное действие. Похоже, что он стимулирует дифференциацию макрофагов в СП14+ за счет дендритных клеток. Существуют представления, что 1Б-10 снижает способность дендритных клеток стимулировать Т-клетки, особенно тип клеток ТБ1. Что касается экспрессии КТС-ΙΙ, она может подавляться, может сохраняться без изменений или активироваться (§Багта е! а1., (1999) 1. 1ттипо1. 163:5020). По отношению к СЭ80 и СО86, 1Б-10 способен как к подавлению, так и к активации экспрессии указанных молекул. В7-2/СП86 выполняет ключевую функцию в активации Т-клеток. По отношению к указанной молекуле, 1Б-10 принимает участие как в активирующем, так и в подавляющем действии. Тем не менее, возможно, наиболее значительное модуляторное действие 1Б-10 оказывает на СЭ40 (похоже, что 1Б-10 снижает его экспрессию). На уровне доменов, 1Б-10 может блокировать иммуностимуляцию путем ингибирования миграции клеток Лангерганса в ответ на появления провоспалительных цитокинов. Как альтернативный вариант, 1Б-10 блокирует этап созревания дендритных клеток, стимулируемый процессом воспаления, в ходе которого обычно происходит подавление ССК1, ССК2 и ССК5, и активация ССК7. Указанное блокирование, с сохранением ССК.1, ССК2 и ССК5, ведет к невозможности миграции дендритных клеток к региональным
- 9 024877 лимфатическим узлам. Результатом становится иммобилизованная дендритная клетка, не стимулирующая Т-клетки, но связывающая (и освобождающая) провоспалительные цитокины без ответа на них (Ό-Атюо е! а1., (2000), №1. 1ттипо1. 1:387).
1Ь-10 обладает несколькими зарегистрированными действиями на моноциты. Например, 1Ь-10 снижает экспрессию КТС-ΙΙ на поверхности клеток, а также ингибирует образование 1Ь-12 вследствие стимуляции. Хотя он способствует преобразованию моноцита в макрофаг при совместном действии с М-КСФ, фенотип макрофага неясен (т.е. СЭ16+/цитотоксический либо СГО16-). 1Ь-10 также снижает выделение ГМ-КСФ и образование 1Ь-8, при этом способствуя выделению ГО-ГОа (Секкег е! а1., (1997), Ргос. №н1. Асаб. δα. υδΑ, 94:14620). В настоящее время известно, что гиалуронектин, компонент соединительной ткани, секретируется моноцитами в ответ на ГО-10. Указанный факт может иметь некоторое значение для миграции клеток, в частности, при образовании метастазов клетками опухоли, поскольку известно, что гиалуронектин препятствует миграции клеток через внеклеточное пространство (Секкег е! а1., (1997), Ргос. Ыа!'1. Асаб. δα. υδΑ, 94:14620).
Было показано, что гибридные белки, содержащие 1Б-10 с Рс фрагментами мыши или макаки (обозначенными в настоящем описании как 1Б-10 Рс), ингибируют активность макрофагов и увеличивают продолжительность жизни ксенотрансплантата панкреатического островка (Репд е! а1. (1999), Ттапкр1ап!а!юп 68:1775; Ак1еби е! а1. (2007), Су!ок1пе 40:183), а также снижают септический шок в модели мыши (УНепд е! а1. (1995), 1. 1ттипо1. 154:5590).
Рецептор 1 ГО-10 (1Б-10К1) человека представляет собой трансмембранный гликопротеин I типа, пронизывающий мембрану один раз, длина которого составляет 90-110 кДа, экспрессируемый ограниченным количеством типов клеток (Ьш е! а1., 1994, 1. 1ттипо1. 152:1821), слабая экспрессия которого наблюдается в поджелудочной железе, скелетной мускулатуре, мозге, сердце и почках, средние уровни экспрессии наблюдаются в плаценте, легких и печени. Моноциты, В-клетки, большие гранулярные лимфоциты и Т-клетки демонстрируют высокий уровень экспрессии 1Б-10К1 (Ьш е! а1., 1994, 1. 1ттипо1. 152:1821). Экспрессируемый белок содержит 578 аминокислот, включает сигнальный пептид, содержащий 21 аминокислот, внеклеточный участок, содержащий 215 аминокислот, трансмембранный сегмент, содержащий 25 аминокислот, и цитоплазматический домен, содержащий 317 аминокислот. В пределах внеклеточного участка находятся два мотива ФН III и сайт посадки δТΑТ3, а также участок связывания с 1АК1 в пределах цитоплазматического домена (Ко!епко е! а1., 2000, Опсодепе, 19:2557; Ко!епко е! а1., 1997, ЕМВО 1. 16: 5894). Рецептор 1 Ю-10 связывает Ю-10 человека с Ка, составляющей 200 пМ.
В некоторых вариантах реализации связывающие домены согласно настоящему изобретению содержат домены Уь и Ун, обладающие специфичностью по отношению к рецептору 1 ГЬ-Ю или рецептору 2 Ю-Ю, согласно описанному в настоящем документе. В отдельных вариантах реализации домены Уъ и Ун представляют собой домены молекул из организма человека. Домены Уъ и Ун могут быть ориентированы в любом направлении и могут быть разделены аминокислотным линкером, содержащим до приблизительно 30 аминокислот, согласно описанному в настоящем документе, или любой другой последовательностью аминокислот, способной выполнять функцию спейсера, сочетающуюся с взаимодействием двух частей связывающихся доменов. В отдельных вариантах реализации линкер, соединяющий домены Уъ и Ун, содержит аминокислотную последовательность согласно приведенному в δΕΟ ГО N0: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 и 383-398, например, линкер, приведенный в δΕΟ ГО N0: 244, 46 линкер (δΕΟ ГО N0: 88), 130 линкер (δΕΟ ГО N0: 163) или 131 линкер (δΕΟ ГО N0: 164). Мультиспецифичные связывающие домены могут содержать по меньшей мере два специфические связывающих фрагмента, по аналогии со строением антитела верблюдовых, или по меньшей мере четыре специфических связывающих фрагмента, по аналогии со строением более часто применяемого антитела млекопитающих, состоящего из парных цепей Уъ и Ун.
В дополнительных вариантах реализации связывающие домены согласно настоящему изобретению, обладающие специфичностью по отношению к ГО-ЮРТ или Ю-10ГО2, могут содержать в своем составе один или более гипервариабельный участок (СЭР) или множественные копии одного или более из указанных СЭР, которые были получены, произведены от или разработаны на основе ксРу или РаЬфрагмента, направленного против ГО-10Р1 или Ю-10Р2, или вариабельных областей в составе их легкой или тяжелой цепи. Следовательно, связывающий домен согласно настоящему изобретению может содержать один участок СЭР из состава вариабельной области молекулы, направленной против ГО-10Р1 или ГО-10Р2, или может содержать множественные участки СЭР, которые могут быть идентичными или различаться.
Мультиспецифичные гибридные белки.
Согласно настоящему изобретению предложены мультиспецифичные гибридные белки, содержащие домен, связывающийся с СГО86 (домен, связывающий СГО86 ), и домен, связывающийся с молекулой, отличной от СГО86 (гетерологичный связывающий домен). В отдельных вариантах реализации гетерологичный связывающий домен представляет собой агонист ГО-10. В отдельных вариантах реализации гетерологичный связывающий домен представляет собой агонист ^-10, например [0-10, ГО-10-Рс или одноцепочечный участок связывания, специфическим образом связывающийся с ГО-10Р1 или ГО-10Р2.
- 10 024877
Согласно настоящему изобретению предусмотрены гибридные белки, в составе которых домен, связывающий ΟΌ86, может находиться на Ν-конце, а гетерологичный связывающий домен - на С-конце. В отдельных вариантах реализации эксцепторная молекула соответствует приведенному в §ЕЦ ГО N0: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 187, 189, 191, 193, 219, 221, 223, 237, 262, 302, 330, 336, 338, 340 или 400. Также предусмотрены гибридные белки, в составе которых гетерологичный связывающий домен может находится на Ν-конце, а домен, связывающий СГО86. - на С-конце. В отдельных вариантах реализации эксцепторная молекула соответствует приведенным в §ЕЦ ГО N0: 183, 185, 199, 201, 203, 205, 207, 211, 213, 254, 258, 266, 276, 350, 352 или 354. Согласно приведенному в настоящем документе связывающие домены согласно настоящему изобретению могут быть соединены с любым концом промежуточного домена (например, константного участка иммуноглобулина или его фрагмента). Далее, каждый из двух или более связывающих доменов может быть соединен с промежуточным доменом посредством линкера согласно описанному в настоящем документе.
Термин промежуточный домен, употребляемый в настоящем описании, относится к аминокислотной последовательности, свободно функционирующей в качестве каркаса для одного или более связывающих доменов таким образом, чтобы указанный гибридный белок находился преимущественно (например, 50% или более от популяции гибридных белков) или главным образом (например, 90% или более от популяции гибридных белков) в форме одноцепочечного полипептида в композиции. Например, отдельные промежуточные домены могут выполнять структурную функцию (например, разделение в пространстве, гибкость, ригидность) или биологическую функцию (например, увеличение периода полувыведения из плазмы, например, из плазмы крови человека). Примеры промежуточных доменов, которые могут увеличивать период полувыведения из плазмы гибридных белков согласно настоящему изобретению, включают альбумин, трансферрин, каркасную область, связывающую белок плазмы и им подобные домены или их фрагменты. В отдельных предпочтительных вариантах реализации промежуточный домен, содержащийся в мультиспецифичном гибридном белке согласно настоящему изобретению, представляет собой домен димеризации. Указанное определение относится к аминокислотной последовательности, обладающей способностью к стимуляции объединения по меньшей мере двух одноцепочечных полипептидов или белков посредством не ковалентных или ковалентных взаимодействий, например водородных связей, электростатических взаимодействий, сил Ван-дер-Ваальса, солевых мостиков, дисульфидных связей, гидрофобных взаимодействий и т.д., или любого сочетании указанных взаимодействий. Примеры доменов димеризации включают константные области тяжелой цепи иммуноглобулина или их фрагменты. Следует понимать, что домен димеризации будет преимущественно стимулировать образование димеров, но будет сохранять способность образования мультимерных комплексов более высокого порядка (например, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров, септамеров, октамеров и т.д.).
Термин фрагмент константной области употребляется в настоящем описании в отношении последовательности пептида, полипептида или белка, соответствующей или полученной из фрагмента или полноразмерной одной или более области константного участка, но не всех участков константной области исходного антитела. В предпочтительном варианте реализации фрагмент константной области представляет собой СН2СН3 1д0, предпочтительно СН2СН3 1дО1. В некоторых вариантах реализации участки константной области гибридного белка согласно настоящему изобретению не обладают или обладают минимальными эффекторными функциями в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АПСС), антитело-зависимом клеточно-опосредованном фагоцитозе (АЭСР) или активации комплемента и комплемент - зависимой цитотоксичности (СЭС), при этом сохраняя способность связывать некоторые рецепторы Рс (например, связывание РсКп) и сохраняя относительно длительный период полувыведения ίη νίνο. В отдельных вариантах реализации связывающий домен согласно настоящему изобретению соединен с константной областью ί§01 человека или ее фрагментом, при этом одна или боле аминокислот в составе константной области или ί§01 или ее фрагмента подвергнуты мутации: лейцин в 234 положении (Ь234), лейцин в 235 положении (Ь235), глицин в 237 положении (0237), глутамат в 318 положении (Е318), лизин в 320 положении (К320), лизин в 322 положении (К322) или любое их сочетание (нумерация согласно ЕЙ). Например, любую из указанных аминокислот или более чем одну аминокислоту можно заменить на аланин. В дальнейшем варианте реализации каждая из аминокислот Ь234, Ь235, 0237, Е318, К320 и К322 (нумерация согласно ЕЙ) в составе Рс-фрагмента 1д01 заменена на аланин (т.е. Ь234Л, Ь235Л, 0237А, Е318А, К320А и К322А соответственно), и, возможно, также внесена мутация Ν297Λ (т.е., по существу, снятие гликозилирования участка СН2).
Методы внесения мутаций в Рс-фрагмент и вне его, способные изменять взаимодействия Рс с рецепторами Рс (СО 16, ΟΌ32, ΟΌ64, СЭ89, РсеК1, РсКп) или с компонентом комплемента С1ц (см., например, патент США № 5624821; Ргс51а (2002), Сигг. РЪагша. Вю1сс1то1. 3:237), известны в данной области. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения включают композиции, содержащие иммуноглобулин или гибридные белки, содержащие константную область ί§0 человека или ее фрагмент, где сохраняется связывание с РсКп и белком А и где Рс-фрагмент более не взаимодействует или взаимодействует в минимальной степени с другими рецепторами Рс или С1с|. Например, связывающий домен согласно настоящему изобретению может быть соединен с константной областью 1д01 или ее фрагмен- 11 024877 том, в которой аспарагин в 297 положении (N297 в соответствии с нумерацией ЕЙ) был подвергнут мутации замены на другую аминокислоту со снижением степени или исключением гликозилирования по этому сайту и, следовательно, отменой эффективного связывания Ее с рецептором Рсу и С1с|. Другим примером мутации является Р3318, выключающая связывание С1ц, но не влияющая на связывание Рс.
В дальнейших вариантах реализации Рс-фрагмент иммуноглобулина может иметь измененный характер гликозилирования по сравнению с референтной последовательностью иммуноглобулина. Например, можно применять множество генетических методик для замены одного или более конкретного аминокислотного остатка из остатков, образующих сайт гликозилирования (см. Со е! а1. (1993), Мо1. 1ттипо1. 30:1361; 1асциетоп е! а1. (2006), 1. ТЬготЬ. Наеток!. 4:1047; §сЬи8!ег е! а1. (2005), Сапсег Кек. 65:7934; ХУагпоск е! а1. (2005), Вю!есЬпо1. Вюепд. 92:831), например N297 в составе участка СН2 (нумерация согласно ЕЙ). В качестве альтернативного варианта, для того чтобы добиться измененного характера гликозилирования, можно создавать клетки-хозяева, в которых получают гибридный белок. Например, один способ, известный в данной области, позволяет добиваться изменения гликозилирования в форме разделенных пополам, нефукозилированных вариантов, повышающих ЛЭСС. Варианты, получаемые в результате экспрессии в клетке-хозяине, содержат фермент, модифицирующий олигосахариды. В качестве альтернативного варианта, предусмотрено применение методики Ро!еШдеп!® ВюХУа/Куо\уа Накко для снижения содержания фукозы в составе гликозилированных молекул согласно настоящему изобретению. В одном способе, известном в данной области, предусмотрены клетки СНО в качестве клеток-хозяев для получения рекомбинантного белка, в котором модифицируют характер гликозилирования Рс-фрагмента иммуноглобулина через образование ГДФ-фукозы.
В качестве альтернативного варианта, для изменения характера гликозилирования гибридных белков согласно настоящему изобретению применяют химические методики. Например, многие ингибиторы глюкозидазы и/или маннозидазы оказывают одно или более желательное действие по увеличению активности ЛЭСС. усилению связывания рецептора Рс и изменению характера гликозилирования. В отдельном варианте реализации клетки, экспрессирующие мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению (включающий домен, обладающую антагонистичными свойствами по отношению к СО86, соединенный с агонистом 1Ь-10, выращивают в среде культивирования, содержащей в составе модифицирующее вещество углеводородной природы в концентрации, повышающей ЛЭСС молекул иммуногликопротеина, образуемых указанными клетками-хозяевами, где указанное модифицирующее вещество углеводородной природы содержится в концентрации меньшей 800 мкМ. В предпочтительном варианте реализации клетки, экспрессирующие указанные мультиспецифичные гибридные белки, выращивают в среде культивирования, содержащей кастаноспермин или кифуненсин, более предпочтительно кастаноспермин в концентрации 100-800 мкМ, например 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 или 800 мкМ. Способы изменения характера гликозилирования при применении модифицирующего вещества углеводородной природы, например кастаноспермина, описаны в опубликованной заявке на патент США № 2009/0041756 или публикации РСТ № УО 2008/052030.
В другом варианте реализации Рс-фрагмент иммуноглобулина может содержать модификации аминокислот, влияющие на связывание рецепторов Рс эффекторных клеток. Указанные модификации можно создавать при применении любой методики, известной в данной области, например, подхода, описанного в РгеЧа е! а1. (2001), ВюсЬет. §ос. Тгапк. 50:487. Согласно другому подходу для конструирования фрагментов константных областей, соответствующих Рс-фрагментам, для улучшения эффекторной функции клеточного цитолиза, доступна методика Хепсог ХтАЬ™ (см. Ьа/аг е! а1. (2006), Ргос. №·ιΐ1. ЛсаФ §щ (И8А), 103:4005). При применении указанного подхода, например, возможно создание фрагментов константных областей с повышенной специфичностью и связыванием с рецептором Рсу, и, следовательно, с улучшенной эффекторной функцией клеточного цитолиза.
Также существуют варианты реализации, в которых константная область или ее фрагмент, возможно, способны увеличивать период полувыведения из сыворотки или усиливать плацентарный перенос по сравнению с соответствующим гибридным белком, не содержащим промежуточный домен. В отдельных вариантах реализации увеличенный период полувыведения гибридного белка согласно настоящему изобретению в организме человека составляет по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 18, по меньшей мере 20, по меньшей мере 24, по меньшей мере 30, по меньшей мере 36, по меньшей мере 40, по меньшей мере 48 ч, по меньшей мере несколько дней, по меньшей мере неделю, по меньшей мере две недели, по меньшей мере несколько недель, по меньшей мере месяц, по меньшей мере два месяца, по меньшей мере несколько месяцев или более.
Фрагмент константной области может включать часть или все из приведенных ниже доменов: домен СН2 и домен СН3 (1дА, 1§ϋ, 1дО, 1дЕ или 1дМ), или домен СН3 и домен СН4 (1дЕ или 1дМ). Следовательно, термин фрагмент константной области, согласно определенному в настоящем документе, может относиться к полипептиду, соответствующему фрагменту константного участка иммуноглобулина. Фрагмент константной области может включать домен СН2 и домен СН3, полученные из одинаковых или различных иммуноглобулинов, серотипов антител или аллельных вариантов. В некоторых вариантах
- 12 024877 реализации домен Снз является усеченным и содержит С-концевую последовательность, приведенную в заявке на патент США № 12/041590 (представляющей собой ОР РСТ/ИЗ2007/071052) как ЗЕО ГО ΝΟδ: 366-371. В отдельных вариантах реализации фрагмент константной области полипептида согласно настоящему изобретению включает домен Сн2 и домен Снз, которые, возможно, могут содержать аминоконцевой линкер, карбоксиконцевой линкер или линкеры на обоих концах молекулы.
Линкер представляет собой пептид, соединяющий или связывающий другие пептиды или полипептиды, например линкер, содержащий в составе от приблизительно 2 до приблизительно 150 аминокислот. В составе гибридных белков согласно настоящему изобретению, линкер может соединять промежуточный домен (например, фрагмент константной области, полученный из иммуноглобулина) со связывающим доменом, или линкер может соединять два вариабельных участка связывающего домена или два участка в пределах одноцепочечного полипептида, образованного из гетеродимерной молекулы, например, ЕВ13 (ЗЕО ГО ΝΟ: 25) и субъединица р35 Ш-12 (ЗЕО ГО ΝΟ: 26) из состава Ш-35. Например, линкер может представлять собой аминокислотную последовательность, полученную, из, произведенную от или разработанную на основе последовательности шарнирной области антитела, последовательности, соединяющей связывающий домен с рецептором или последовательности, соединяющей связывающий домен с трансмембранным участком поверхности клетки или мембранным якорем. В некоторых вариантах реализации линкер может содержать в своем составе по меньшей мере один остаток цистеина, способный участвовать в образовании по меньшей одной дисульфидной связи при нормальных условиях или при других стандартных условиях реакций пептидов (например, в условиях очистки пептидов, в условиях хранения пептидов). В отдельных вариантах реализации линкер, соответствующий или аналогичный пептиду шарнирной области иммуноглобулина, сохраняет остаток цистеина, соответствующий остатку цистеина, расположенного в направлении аминотерминального конца указанной шарнирной области. В дальнейших вариантах реализации предусмотрен линкер из состава шарнирной области 1§О1 или 1дО2А, содержащий в составе один или два остатка цистеина, соответствующих остаткам цистеина в составе шарнирной области. В отдельных вариантах реализации между промежуточными доменами образованы одна или более внутренние дисульфидные связи. В других вариантах реализации гибридные белки согласно настоящему изобретению могут содержать промежуточный домен, непосредственно соединенный со связывающим доменом (т.е., в отсутствие линкера или шарнирной области). В некоторых вариантах реализации промежуточный домен представляет собой домен димеризации, например Рс-фрагмент СН2СН3 из состава 1§О1.
Промежуточный домен или домен димеризации в составе гибридных белков согласно настоящему изобретению может быть связан с одним или более концевым связывающим доменом посредством пептидного линкера. В дополнение к обеспечению функции пространственного разделения, линкер может сообщать гибкость или ригидность, способствующие правильной ориентации одного или более связывающих доменов гибридного белка, как в пределах молекулы гибридного белка, так и между гибридными белками или гибридным(и) белком (белками) и мишенью (мишенями). Далее, линкер может поддерживать экспрессию полноразмерного гибридного белка и стабильность очищенного белка как ίη νίίτο, так и ίη νίνο после введения субъекту, нуждающемуся в этом, например, человеку, и предпочтительно является не иммуногенным или слабо иммуногенным в организме указанных субъектов. В отдельных вариантах реализации линкер, соединяющий промежуточный домен или домен димеризации в составе мультиспецифичных гибридных белков согласно настоящему изобретению, может включать часть шарнирной области иммуноглобулина или указанную область целиком.
Также связывающий домен может включать области Ун и Уь, и указанные области вариабельного участка могут быть связаны посредством линкера. Примеры линкеров, соединяющих связывающий домен вариабельного участка, включают линкеры, принадлежащие к семейству (01упЗет), например (О1у3ЗеТ)п(О1у4ЗеТ)ь (О1у3Зет)1(О1у4Зет)п, (О1у3Зет)п(О1у4Зет)п или (О1у4Зет)п, где η представляет собой число от 1 до 5 (см., например, 22, 29, 46, 89, 90, 116, 130 и 131 линкеры, соответствующие ЗЕО ГО ΝΟδ: 64, 71, 88, 131, 132, 149, 163 и 164 соответственно). В предпочтительных вариантах реализации указанные линкеры на основе мотива (01упЗет) применяют для присоединения вариабельных областей и не применяют для присоединения связывающие домены (например, δсРν) к промежуточному домену (например, Сн2Сн3 1дО).
Примеры линкеров, подходящих для применения для соединения промежуточного домена (например, фрагмента константной области, полученного на основе молекулы иммуноглобулина) со связывающим доменом или соединения двух вариабельных участков связывающего домена, приведены в ЗЕО ГО ΝΟδ: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 и 383-398.
Линкеры, предусматриваемые настоящим изобретением, включают, например, пептиды, полученные из любого участка внутри области молекулы представителя суперсемейства иммуноглобулинов (например, шарнирной области антитела) или стебель в составе лектинов С-типа, семейства белков мембраны II типа. Длина указанных линкеров находится в интервале от приблизительно 2 до приблизительно 150 аминокислот, или от приблизительно 2 до приблизительно 40 аминокислот, или от приблизительно 8 до приблизительно 20 аминокислот, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 60 аминокислот, более предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 30 аминокислот и наибо- 13 024877 лее предпочтительно от приблизительно 15 до приблизительно 25 аминокислот. Например, длина 1 линкера составляет две аминокислоты, а длина 116 линкеров - 36 аминокислот (1-133 линкеры приведены в ЗЕР ГО N08: 43-166 соответственно; дополнительные примеры линкеров приведены в ЗЕР ГО N08: 244, 307, 320, 355-379 и 383-398).
Помимо общих требований к длине, линкер, подходящий для применения в составе гибридных белков согласно настоящему изобретению, включает шарнирную область антитела, выбранную из следующих: шарнирная область 1дС. шарнирная область 1дА, шарнирная область Ι§ϋ, шарнирная область 1дЕ или варианты указанных областей. В отдельных вариантах реализации линкер может представлять собой шарнирную область антитела (верхняя и коровая область), выбранного из следующих: 1дС1 человека, 1дС2 человека, 1дС3 человека, 1дС4 человека или фрагменты или варианты указанных областей. Определение линкера, представляющего собой шарнирную область иммуноглобулина, употребляемое в настоящем описании, относится к аминокислотам, расположенным между С-концом СН1 и Ν-концом СН2 (для 1§С, 1дА и Ι§Ό) или Ν-концом СН3 (для 1дЕ и 1дМ). Определение шарнирная область иммуноглобулина дикого типа, употребляемое в настоящем описании, относится к аминокислотной последовательности, встречающейся в природе, расположенной между участками СН1 и СН2 (для 1§С, 1дА и Ι§ϋ), и связывающей их, или расположенной между участками СН2 и СН3 (для 1дЕ и 1дМ) и связывающей их, в составе тяжелой цепи антитела. В предпочтительных вариантах реализации последовательности шарнирных областей иммуноглобулина дикого типа происходят из организма человека.
По данным кристаллографических исследований, шарнирную область 1дС структурно и функционально можно подразделить на три участка: верхняя шарнирная область, коровая или центральная шарнирная область и нижняя шарнирная область (ЗПп с1 а1., 1штипо1одюа1 Кеу1е№8, 130:87 (1992)). Примеры верхних шарнирных областей включают ЕРКЗСЭКТНТ (ЗЕр ГО N0: 383), находящуюся в составе 1§С1, ЕККССУЕ (ЗЕр ГО N0: 384) находящуюся в составе 1§С2, ЕЬКТРЬСПТТ НТ (ЗЕр ГО N0: 385) или ЕРКЗСЭТРРР (ЗЕР ГО N0: 386) находящуюся в составе 1§С3, и ЕЗКУСРР (ЗЕр ГО N0: 387), находящуюся в составе 1§С4. Примеры центральных шарнирных областей включают СРРСР (ЗЕр ГО N0: 398), находящуюся в составе 1дС1 и 1§С2, СРКСР (ЗЕр ГО N0: 388) находящуюся в составе 1§С3, и СРЗСР (ЗЕр ГО N0: 389), находящуюся в составе 1§С4. Тогда как антитела 1§С1, 1§С2 и 1§С4, похоже, содержат одинаковые верхние и центральные шарнирные области, 1дС3 содержит четыре последовательно расположенные области: одну область ЕЬКТРЬСПТТ НТСРКСР (ЗЕр ГО N0: 390) и три области ЕРКЗСПТРРРСРКСР (ЗЕр ГО N0: 391).
Похоже, что в составе антител 1дА и Ι§Ό отсутствует 1дС-подобная коровая область, а Ιβϋ содержит две последовательно расположенные верхние шарнирные области (см. ЗЕр ГО N08: 392 и 393). Примеры верхних шарнирных областей дикого типа, встречающихся в составе антител 1дА1 и 1дА2, приведены в (ЗЕр ГО N08: 394 и 395, соответственно.
Антитела 1дЕ и 1дМ, напротив, вместо типичной шарнирной области содержат домен СН2, обладающий свойствами, сходными со свойствами шарнирной области. Примеры доменов СН2 дикого типа, подобных верхним шарнирным областям 1дЕ и 1дМ, приведены в ЗЕр ГО N0: 396 (УСЗКЛРТРРТ УкП.рЗЗЗПО С.С.НРРРТГОГ ЬСЬУЗСУТРС Т1МТ\\ТЕ1)0 р\АГО\ПЕЗТА ЗТТрЕСЕЬАЗ ТРЗЕЬТЬЗРК Н\\ТЗ1ЖТ¥ТС рУТУрСНТРЕ ПЗТККСА) и ЗЕр ГО N0: 397 (У1АЕЬРРКУЗ УЕУРРКЛСРР ОХРНКЗКМС РАТСРЗРКР1 РУЗАТКРОКР УОЗОУТТОРУ РАЕАКЕЗСРТ ТУКУТЗТЬТ1 К ЕЗ1 )\\'1 .СОЗМ РТСКУЛНКСЬ ТРРРХАЗЗМС УР) соответственно.
Определения видоизмененная шарнирная область иммуноглобулина или видоизмененная шарнирная область иммуноглобулина дикого типа относится к (а) шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, содержащей до 30% изменений в аминокислотном составе (например, до 25, 20, 15, 10 или 5% замен или делеций аминокислот), (Ь) фрагменту шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, длина которого составляет по меньшей мере 10 аминокислот (например, по меньшей мере 12, 13, 14 или 15 аминокислот), и содержащий до 30% изменений в аминокислотном составе (например, до 25, 20, 15, 10 или 5% замен или делеций аминокислот) или (с) фрагменту шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, включающий центральную шарнирную область (длина указанного фрагмента может составлять 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 или по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот). В отдельных вариантах реализации один или более остатков цистеина в составе шарнирной области иммуноглобулина дикого типа могут быть заменены на один или более остатков другой аминокислоты (например, один или более остатков серина). Видоизмененная шарнирная область иммуноглобулина в качестве альтернативного или дополнительного варианта может включать остаток пролина шарнирной области иммуноглобулина дикого типа, замененный на другой аминокислотный остаток (например, на остаток серина).
Альтернативные последовательности шарнирной области и линкера можно создавать из фрагментов рецепторов поверхности клетки, связывающих 1дУ-подобные или 1дС-подобные домены. Также в качестве соединительных областей или линкерных пептидов можно применять участки, расположенные между 1дУ-подобными доменами, в случае когда рецептор поверхности клетки содержит множественные последовательно расположенные 1дУ-подобные домены, и между 1дС-подобными доменами, когда рецептор поверхности клетки содержит множественные последовательно расположенные 1дС-подобные
- 14 Μ4»ΊΊ домены. В отдельных вариантах реализации длина последовательностей шарнирной области и линкерного участка составляет от 5 до 60 аминокислот, и они могут быть изначально гибкими, но также могут обладать более ригидными свойствами, и могут обладать первичной структурой α-спирали с минимальной β-складчатой структурой. В предпочтительном варианте последовательности стабильны в плазме и сыворотке и устойчивы к протеолитическому расщеплению. В некоторых вариантах реализации последовательности могут включать естественный или внесенный мотив, например СРРС (ЗЕЦ ГО N0: 422), сообщающий способность к образованию дисульфидной связи или множественных дисульфидных связей для стабилизации С-терминального конца молекулы. В других вариантах реализации последовательности могут включать один или более сайтов гликозилирования. Примеры последовательности шарнирной области и линкерного участка включают участки, расположенные между 1дУ-подобными и 1дСподобными доменами или между между 1дУ-подобными доменами или 1дС-подобными доменами в составе СО2, СО4, СО22, СО33, СО48, СО58, СО66, СО80, СО86, СО96, СО150, СО166 и СО244. Альтернативные способы создания шарнирных областей включают создание из областей рецепторов II типа, содержащих дисульфидные мостики, не относящихся к суперсемейству иммуноглобулинов, например СО69, СО72, и СО161.
В отдельных вариантах реализации линкер согласно настоящему изобретению включает линкер йсогрюи. Линкеры ксогрюи включают пептиды, полученные из междоменных участков представителей суперсемейства иммуноглобулинов, например шарнироподобные пептиды, полученные из шарнирных участков иммуноглобулинов, например из шарнирных участков 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА и 1дЕ. В отдельных вариантах реализации в составе шарнироподобного линкера ксогрюи остается по меньшей мере один остаток цистеина, способный к образованию внутрицепочечной дисульфидной связи при нормальных условиях. Линкеры ксогрюи, полученные из 1дС1, могут содержать 1 остаток цистеина или 2 остатка цистеина, и в их составе могут оставаться остаток цистеина, соответствующий цистеину шарнирной области на Ν-конце в составе 1дС1 дикого типа. Не шарнироподобные пептиды также предусматриваются в качестве линкеров ксогрюи при условии, что указанные пептиды обеспечивают достаточное расстояние и гибкость для создания одноцепочечного полипептида, способного образовать два связывающих фрагмента, каждый из которых расположен в направлении конца белка (Ν и С) относительно более центрально расположенного фрагмента константного участка. Примеры не шарнироподобных линкеров ксогрюи включают пептиды в составе участка стебля из лектиновых областей стебля С-типа белков мембраны 1Ь типа, например области стебля молекул СГО69. СГО72. СГО94. ΝΚΟ2Α и ΝΚΟ2Ό. В некоторых вариантах реализации линкер ксогрюи включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕЦ ГО Ν0§: 355-359 и 365.
В некоторых вариантах реализации линкер содержит один остаток цистеина для образования внутрицепочечной дисульфидной связи. В других вариантах реализации линкер содержит два остатка цистеина для образования внутрицепочечных дисульфидных связей между цепями. В дальнейших вариантах реализации линкер получают из междоменного участка иммуноглобулина (например, из шарнирной области иммуноглобулина) или из области стебля II типа лектина С-типа (полученного из белка мембраны II типа; см., например, примеры последовательностей областей стебля лектина, приведенные в опубликованной заявке РСТ № ΑΌ 2007/146968, например 81Т) ГО Ν0δ: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287, 289, 297, 305, 307, 309-311, 313-331, 346, 373-377, 380 или 381 из указанной публикации, указанные последовательности включены в настоящий документ посредством ссылки).
В одном аспекте настоящего изобретения примеры мультиспецифичных гибридных белков, содержащих в составе домен, связывающий СЭ86, согласно описанному в настоящем документе, также будут включать по меньшей мере один дополнительный домен или участок связывания, обладающий специфичностью по отношению к мишени, отличной от СГО86 (гетерологичный связывающий домен). Например, гибридный белок согласно настоящему изобретению может содержать домен, связывающий СЭ86, соединенный посредством промежуточного домена с агонистом ГО-10. В отдельных вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению содержит первый и второй связывающие домены, первый и второй линкер и промежуточный домен, где один конец указанного промежуточного домена соединен посредством первого линкера с первым связывающим доменом, представляющим собой домен, связывающий СГО86 (например, эктодомен СТЬА4, эктодомен СО28, молекулу, направленную против СЭ86), а другой конец соединен посредством второго линкера с другим связывающим доменом, который представляет собой, например, агонист ГО-10.
В отдельных вариантах реализации первый линкер и второй линкер в составе мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению независимо выбраны, например, из 1-133 линкеров, приведенных в ЗЕЦ ГО Ν0δ: 43-166, и линкеров, приведенных в ЗЕЦ ГО Ν0δ: 244, 307, 320, 355-379 и 383-398. Например, в качестве первого и второго линкеров можно применять любой из 47, 58, 126-131 линкеров (ЗЕЦ ГО Ν0δ: 89, 100, и 159-164, соответственно) или линкеры, приведенные в ЗЕЦ ГО Ν0: 244 или 355-379, или любое их сочетание. В дальнейших примерах один линкер представляет собой 47 лин- 15 024877 кер (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 89) или 132 линкер (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 165), а другой линкер представляет собой линкер, приведенный в δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 355, или 127 линкер (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 160), или один линкер представляет собой 58 линкер (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 100) или 133 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 166), а другой линкер представляет собой 126 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 159), или один линкер представляет собой 58 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 100) или 133 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 166), а другой линкер представляет собой 127 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 160), или один линкер представляет собой 58 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 100) или 133 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 166), а другой линкер представляет собой 128 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 161), или один линкер представляет собой 58 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 100) или 133 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 166), а другой линкер представляет собой 129 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 162). В дальнейших примерах, связывающие домены согласно настоящему изобретению, включающие домены Ун и Уь, например, домены, обладающие специфичностью по отношению к ΕΌ86, могут содержать в составе дополнительный (третий) линкер, расположенный между участками Ун и Уь, например, линкер, приведенный в δΕΟ ГО ΝΟ: 244, δΕΟ ГО ΝΟ: 89, 46 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 88), 130 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 163) или 131 линкер (δΕΟ ГО ΝΟ: 164). В любом из указанных вариантов реализации линкеры могут быть фланкированы одной-пятью дополнительными аминокислотами в пределах последовательности (например, 131 линкер содержит аланин в пределах коровой последовательности (04δ)), на любом из концов (например, 130 линкер содержит серин на Ν-конце коровой последовательности (04δ)) или по обоим концам (например, 120 линкер содержит две аминокислоты (аспарагин-тирозин) на одном конце, и три аминокислоты (глицин-аспарагин-серин) на другом конце коровой последовательности (04δ)), что может являться просто результатом создания указанной рекомбинантной молекулы (например, применение определенного фермента рестрикции для соединения молекул нуклеиновых кислот может привести к вставке от одной до нескольких аминокислот), или для целей настоящего изобретения может быть предусмотрен любой фрагмент любой определенной коровой последовательности линкера.
В дальнейших вариантах реализации промежуточный домен в составе мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению состоит из константной области иммуноглобулина или ее фрагмента, где указанный промежуточный домен расположен между доменом, связывающим ΕΌ86, и связывающим доменом, представляющим собой агонист ΙΌ-10. В отдельных вариантах реализации промежуточный домен в составе мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению содержит домен, связывающий СГО86 на Ν-конце и связывающий домен, представляющую собой агонист ΙΌ-10 - на карбоксиконце. В других вариантах реализации промежуточный домен в составе мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению содержит связывающий домен, представляющий собой агонист ΙΌ-10 на Ν-конце, и домен, связывающий СГО86 на карбоксиконце.
В дальнейших вариантах реализации фрагмент константного участка иммуноглобулина содержит в своем составе домены СН2 и СН3 из состава иммуноглобулина 01 (Ι§Ο1). В сходных вариантах реализации одна из следующих аминокислот в составе участков СН2 и СН3 Ιβ01 подвергнута мутации (т.е. в указанном положении содержится другая аминокислота): лейцин в 234 положении (Ь234), лейцин в 235 положении (Ь235), глицин в 237 положении (0237), глутамат в 318 положении (Е318), лизин в 320 положении (К320), лизин в 322 положении (К322), также возможно любое сочетание указанных мутаций (нумерация в соответствии со способом КаЪаЦ Например, любую из указанных аминокислот можно заменить на аланин. В другом варианте реализации в соответствии с нумерацией КаЪа1 каждый из аминокислотных остатков Ь234, Ь235 и 0237 в составе участка СН2 подвергнут мутации замены на аланин (т.е. Ь234А, Ь235А и 0237А соответственно) и каждый из аминокислотных остатков Е318, К320 и К322 в составе участка СН2 Ιβ01 подвергнут мутации замены на аланин (т.е. Ε318А, К320А и К322А соответственно).
В отдельных вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению может включать иммунофармацевтическое средство на основе модульного белка малого размера (δΜΙΡ™). В этом отношении термин δΜΙΡ™ относится к классу высокомодульных веществ, обладающих улучшенными лекарственными свойствами по сравнению с моноклональными и рекомбинантными антителами. δΜΙΡ содержат одну полипептидную цепь, включающую участок, обладающий специфичностью по отношению к мишени, на основе, например, вариабельного участка антитела, в сочетании с вариабельным ЕС-фрагментом, благодаря которому возможен специфический рекрутинг целевых эффекторных клеток (например, макрофагов и клеток - естественных киллеров (ΝΙ<)) и/или вовлечение процесса уничтожения, опосредованного комплементом. В зависимости от выбора мишени и шарнирных областей, δΜΙΡ способны проводить сигнал или блокировать передачу сигнала посредством рецепторов поверхности клетки. Сконструированные гибридные белки, обозначенные в настоящем документе как иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера или продукты δΜΙΡ™ , соответствуют описанию, приведенному в патентной публикации США № 2003/133939, 2003/0118592 и 2005/0136049, а также в международных патентных публикациях νΟ 02/056910, νΟ 2005/037989 и νΟ 2005/017148.
- 16 024877
В некоторых вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок может содержать молекулу ΡΙΜδ, аналогичную описанным в патентной публикации США № 2009/0148447 и международной патентной публикации \УО 2009/023386.
В отдельных вариантах реализации можно сконструировать мультиспецифичные гибридные белки согласно настоящему изобретению, передний и задний концы молекул которых обладают различной аффинностью, для направления на определенные типы клеток. Например, применение связывающего домена, обладающего специфичностью по отношению к СГО86 (например, 3Ό1, ΡυΝ1 или их гуманизированные варианты), обладающего более высокой аффинностью по отношению к СГО86, чем аффинность сконструированного агониста 1Ь-10 (например, с внесенной мутацией 187А или Ι87δ, или конструкция моно1Ь-10) по отношению к 1Ь-10К1 человека, и сочетание подобных молекул в составе эксцепторной молекулы согласно настоящему изобретению может благоприятствовать ее нацеливанию на определенный тип клеток, например на антигенпрезентирующие клетки (АПК). В этом направлении возможно создание гибридных белков, которые могут обладать более высокой или более низкой аффинностью по отношению к СЭ86 или более высокой или более низкой аффинностью по отношению к любому из гетерологичных белков направленного действия, описанных в настоящем документе, в зависимости от целевого типа клеток, выбранных в качестве мишени. В предпочтительных вариантах реализации связывающий домен, обладающий антагонистическими свойствами по отношению к СГО86, предпочтительно нацеливает мультиспецифичную эксцепторную молекулу направленного действия на АПК за счет более высокой аффинности по отношению к СГО86, чем аффинность указанного гетерологичного связывающего домена по отношению к его партнеру по связыванию. В некоторых вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению содержит домен, связывающий СГО86, включающий внеклеточный домен СТЬА4 или его фрагмент, внеклеточный домен СЭ28 его фрагмент или связывающий домен, полученный из антитела, обладающего специфичностью по отношению к СГО86. В отдельных вариантах реализации связывающий домен, полученный из антитела, обладающего специфичностью по отношению к СГО86, получают из моноклонального антитела ΡυΝ1 (см., например, I. Ра!Ьо1. 1993 Маг; 169(3):309-15) или получают из моноклонального антитела 3Ό1, направленного против СЭ86. В отдельных вариантах реализации домен, связывающий ί'Ό86, представляет собой 8СГРА4, например, с последовательностью зрелого полипептида 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1. В отдельных вариантах реализации домен, связывающий СГО86, представляет собой 5СΤ^Λ4. например, с последовательностью 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 или участок, подобный вариабельному участку, СТЬА4, например, приведенный в §ЕЦ ГО ΝΟ: 3, или его фрагмент. В других вариантах реализации домен, связывающий СО86, представляет собой 5СГО28, например, с последовательностью зрелого полипептида 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2 (сигнальный пептид: 1-18 аминокислоты). Также существуют варианты реализации, согласно которым домен, связывающий СГО86, содержит вариабельные области легкой и тяжелой цепей ΡυΝ1 (например, 8ЕЦ ГО ΝΟ5: 305 и 306) или 3Ό1 (например, 8ЕЦ ГО ΝΟκ: 318 и 319), предпочтительно, в форме 8сРу. В дальнейших вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению содержит домен связывания СГО86 и гетерологичный связывающий домен, представляющий собой агонист ГО-10 (см., например, аминокислотные последовательности гетерологичных доменов, приведенные в §ЕЦ ГО ΝΟκ: 7, 14, 15, 18-22, 25, 26, 29, 32, 33, 36, 39 и 40).
Примеры строения указанных мультиспецифичных гибридных белков, обозначенных в настоящем описании как эксцепторные молекулы, включают ЛВО1-ГО-ВО2-С, Н-ВЭ2-ГО- ВЭ1-С, где N и С обозначают аминоконец и карбоксиконец молекулы соответственно; ВЭ1 представляет собой домен, связывающий СО86, например иммуноглобулинподобный вариабельный участок или вариабельный участок иммуноглобулина или эктодомен; X представляет собой промежуточный домен, а ВЭ2 представляет собой связывающий домен, являющийся агонистом ГО-10. В составе некоторых конструкций X может представлять собой константный участок иммуноглобулина или его фрагмент, расположенный между первым и вторым связывающими доменами. В некоторых вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению содержит промежуточный домен (X), имеющий следующее строение, в направлении от Ν-конца к С-концу: -Ы-Х-Р2-, где каждый из Ь1 и Ь2 независимо представляет собой линкер, содержащий в составе от двух приблизительно до 150 аминокислот; и X представляет собой константную область иммуноглобулина или ее фрагмент. В дальнейших вариантах реализации мультиспецифичный гибридный белок содержит в составе промежуточный домен, представляющий собой альбумин, трансферрин или другой белок, связывающий белок сыворотки, где гибридный белок остается главным образом или по существу в форме одноцепочечного полипептида в композиции. Аминокислотные последовательности примеров эксцепторных гибридных белков приведены в δΙΛ) ГО ΝΟκ: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 237, 239, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 266, 276, 302, 330, 334, 336, 338, 340, 350, 352 и 354; кодируемые полинуклеотидными последовательностями, приведенными в δΙΛ) ГО ΝΟκ: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37, 41, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 236, 238, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 265, 275, 301, 329, 333, 335, 337, 339, 349, 351 и 353 соответственно.
- 17 024877
Также существуют варианты реализации, согласно которым мультиспецифичные гибридные белки согласно настоящему изобретению имеют следующее строение: ^ВП1-Х-Ь2-ВП2-С, где ΒΌ1 представляет собой домен, связывающий СЭ86, например связывающий домен, по меньшей мере на 90% идентичный эктодомену СТЬА4; -Х-представляет собой -Ь1-СН2СН3-, где Ь1 представляет собой первую шарнирную область 1дО1, возможно, подвергнутую мутации замены первого или второго остатка цистеина, и где -СН2СН3- представляет собой участок СН2СН3 Рс-фрагмента 1дО1; Ь2 представляет собой линкер, выбранный из 8ЕЦ ГО N08: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 и 383-398; и ΒΌ2 представляет собой связывающий домен, являющийся агонистом ГО-10, согласно описанному в настоящем документе.
В отдельных вариантах реализации мультиспецифичный эксцепторный гибридный белок содержит в составе (а) домен, связывающий СГО86, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или по меньшей мере на 100% идентична последовательности зрелого полипептида 8ЕЦ ГО N0: 1 или 8ЕЦ ГО N0: 2, и (Ь) связывающий домен, представляющий собой агонист ГО-10, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или по меньшей мере на 100% идентична последовательности зрелого полипептида гетерологичных связывающих белков, упомянутых выше, приведенной в 8ЕЦ ГО N08: 7, 14, 15, 18-22, 25, 26, 29, 32, 33, 36, 39 и 40, где в направлении от аминоконца к карбоксиконцу или от С-концу к Оконцу (ί) домен, связывающий СГО86 варианта (а) или связывающий домен варианта (Ь) соединен с первым линкером, (ίί) первый линкер соединен с константным участком СН2 и СН3 тяжелой цепи иммуноглобулина, приведенным в любой из 8ЕЦ ГО N08: 409 и 415-417, (ίίί) полипептид константного участка СН2СН3 соединен со вторым линкером, и (ίν) второй линкер соединен с доменом, связывающим СГО86 из (а) или связывающим доменом из (Ь). В отдельных вариантах реализации первый линкер представляет собой 47 линкер (8ЕЦ ГО N0: 89), 132 линкер (8ЕЦ ГО N0: 165) или 133 линкер (8ЕЦ ГО N0: 166), второй линкер представляет собой любой из 126-129 линкеров (8ЕЦ ГО N08: 159-162), и дополнительный (третий) линкер, расположенный между доменами, связывающими СГО86, в составе УН и Уь, представляет собой 130 линкер (8ЕЦ ГО N0: 163) или 131 линкер (8ЕЦ ГО N0: 164).
Примеры аминокислотных последовательностей эксцепторных гибридных белков приведены в 8ЕЦ ГО N08: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 237, 239, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 266, 276, 302, 330, 334, 336, 338, 340, 350, 352 и 354; кодируемые полинуклеотидными последовательностями, приведенными в 8ЕЦ ГО N08: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37, 41, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 236, 238, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 265, 275, 301, 329, 333, 335, 337, 339, 349, 351 и 353 соответственно.
Получение мультиспецифичных гибридных белков.
Для производства любого из полипептидов или гибридных белков, содержащих связывающий домен, описанных в настоящем документе, с достаточным выходом, применяют лидерный пептид для усиления экспрессии вырабатываемых полипептидов и гибридных белков. Предполагается, что применение любого из стандартных лидерных пептидов (сигнальной последовательности) позволит направлять новообразованные полипептиды или гибридные белки по секреторному пути и добиваться отщепления лидерного пептида от зрелого полипептида или гибридного белка в области соединения лидерного пептида и полипептида или гибридного белка, или рядом с ней. Определенный лидерный пептид следует выбирать на основе факторов, известных в данной области, например применение последовательностей, кодируемых полинуклеотидами, позволяющими легкое введение или вырезание сайтов расщепления эндонуклеазой в начале или в конце кодирующей последовательности для лидерного пептида, для облегчения разработки молекулы лидерного пептида, с условием, что указанные последовательности определяют аминокислоты, не производящие нежелательного влияния на любой целевой процессинг лидерного полипептида новообразованного белка или не производящие нежелательного влияния на любую целевую функцию молекулы полипептида или гибридного белка, если лидерный пептид не отщепляется в ходе созревания полипептидов или гибридных белков. Примеры лидерных пептидов согласно настоящему изобретению включают естественные лидерные последовательности (т.е., последовательности, экспрессируемые с нативным белком) или применение гетерологичных лидерных последовательностей, например, Н3Х-МОР0У01Р8РРЫ8А8У1М8КС(Х)п -С02Н, где X представляет собой любую аминокислоту, а значение п составляет от нуля до трех (8ЕЦ ГО N08: 167, 419, 420 и 421), или
Н3Х-МРАРАОРРРРРРР^РРОТТС-С02Н (8ЕЦ ГО N0: 168).
Согласно упомянутому в настоящем документе предложены варианты и производные связывающих доменов, например эктодоменов, вариабельных областей тяжелой и легкой цепей и участков 0ΌΚ, описанных в настоящем документе. В одном примере предложены варианты, полученные при помощи вставок, где один или более аминокислотных остатков дополняют последовательность специфичного связывающего агента. Вставки могут быть расположены на любом из концов или на обоих концах белка, или могут быть помещены в состав внутренних областей аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Варианты продуктов согласно настоящему изобретению также включают зрелые продукты специфических связывающих агентов, т.е. продукты специфических связывающих агентов, из состава которых удалена лидерная или сигнальная последовательность, и итоговый белок
- 18 Μ4»ΊΊ содержит дополнительные остатки на аминотерминальном конце. Дополнительные остатки на аминотерминальном конце могут быть получены из другого белка или могут включать один или более остатков, не определяемых как полученные из определенного белка. Предусмотрены полипептиды с дополнительным метионином в -1 положении, а также полипептиды согласно настоящему изобретению с дополнительными остатками метионина и лизина в -2 и -1 положениях. Варианты, содержащие в составе дополнительные остатки Ме!, Ме!-Ьу8 или Ьу8 (или один или более из основных остатков в целом), особенно удобны для повышенного образования рекомбинантного белка в бактериальных клетках-хозяевах.
Термин аминокислоты, употребляемый в настоящем описании, относится к природной (встречающейся в природе) аминокислоте, природной аминокислоте, содержащей заместители, неприродной аминокислоте, неприродной аминокислоте, содержащей заместители, или к любому их сочетанию. В настоящем описании приведены как стандартные однобуквенные обозначения природных аминокислот, так и трехбуквенные обозначения. Природные полярные аминокислоты включают аспарагин (А8р или Ν) и глутамин (О1п или О); к основным аминокислотам относится аргинин (Агд или К), лизин (Ьу8 или К), гистидин (Н18 или Н) и их производные; и кислые аминокислоты, например, аспарагиновая кислота (А8р или Ό) и глутаминовая кислота (О1и или Е) и их производные. Природные гидрофобные аминокислоты включают триптофан (Тгр или V), фенилаланин (РЬе или Р), изолейцин (11е или I), лейцин (Ьеи или Ь), метионин (Ме! или М), валин (Уа1 или У) и их производные; а также другие неполярные аминокислоты, например, глицин (О1у или О), аланин (А1а или А), пролин (Рго или Р) и их производные. Природные аминокислоты с промежуточными значениями полярности включают серин ^ег или δ), треонин (ТЬг или Т), тирозин (Туг или Υ), цистеин (Су8 или С) и их производные. Если не указано обратного, любая аминокислота, описанная в настоящем документе, может находиться как в Ό-, так и в Ь-конфигурации.
Варианты, полученные путем замены, включают гибридные белки, из состава аминокислотных последовательностей которых один или более аминокислотных остатков удалены и замещены на другие остатки. В некоторых вариантах реализации характер замен является консервативным; тем не менее, объем настоящего изобретения также охватывает замены, являющимися не консервативными. Аминокислоты можно классифицировать на основе их физических свойств и их участия во вторичной и третичной структуре белка. В данной области консервативной заменой считают замену одной аминокислоты на другую аминокислоту, обладающую сходными свойствами. Примеры консервативных замен приведены в табл. 1 (см. ПЗ 97/09433, стр. 10, опубликовано 13 марта 1997 г.).
Таблица 1
Консервативные замены I
Боковая цепь Свойства Аминокислоты
Алифатическая Не полярная 0, А, Ρ, I, Ь, V
Полярная, заряженная 5, Τ, Μ, Ν, (2
Полярная, не заряженная ϋ, Е, К, Р
Ароматическая Н, Р, XV, Υ
Другое Ν, 0, О.Е
Другим вариантом классификации консервативных замен аминокислот является вариант, предложенный ЬеЬтпдег (ВюсЬет18!гу, δесοηά ЕйЬюп; Vο^ιЬ РиЬЬ8Ьег8, 1пс. ΝΥ:ΝΥ (1975), р. 71-77), приведенный в табл. 2.
Таблица 2
Консервативные замены II
Боковая цепь Свойства Ами нокислоты
Не полярная (гидрофобная) Алифатические А, Ь, I, V, Р
Ароматические Р, XV
С еросодержащие м
Переходные о
Не заряженная, полярная Г идрокснльные 5, Τ, Υ
Амидные Ν, <2
С ероводородные С
Переходные О
Положительно заряженная (Основная) К, к.н
Отрицательно заряженная (Кислотная) ϋ,Ε
Варианты или производные также могут содержать дополнительные аминокислотные остатки, включающиеся за счет применения специфических систем экспрессии. Например, применение коммерчески доступных векторов, экспрессирующих целевой полипептид в форме фрагмента гибридного продукта глутатиона-трансферазы (ΟδΤ) позволяет получать целевой полипептид с дополнительным остатком глицина в -1 положении после отщепления компонента ΟδΤ от целевого полипептида. Также предусмотрены варианты, образующиеся в результате экспрессии в системах других векторов, включая системы, в которых в состав аминокислотной последовательности включаются гистидиновые метки, обычно на С- и/или Ν-конце последовательности.
- 19 024877
Также предусмотрены варианты, получаемые в результате делеций, где один или более аминокислотных остатков удалены из состава связывающего домена согласно настоящему изобретению. Делецию можно осуществлять по одному или по обоим концам гибридного белка или путем удаления одного или более остатков внутри аминокислотной последовательности.
В отдельных иллюстративных вариантах реализации гибридные белки согласно настоящему изобретению подвергаются гликозилированию, характер гликозилирования зависит от различных факторов, включая клетку-хозяина, в которой экспрессируется белок (в случае получения в рекомбинантных клетках-хозяевах) и условий культивирования.
Также согласно настоящему изобретению предложены производные гибридных белков. Производные включают специфичные полипептидные связывающие домены, содержащие модификации, отличные от вставок, делеций или замен аминокислот. В отдельных вариантах реализации характер модификаций является ковалентным и включает, например, образование химических связей с полимерами, липидами и другими органическими и неорганическими молекулами. Производные согласно настоящему изобретению можно создавать для увеличения периода полувыведения полипептида специфичного связывающего домена или можно разрабатывать для улучшения направленной способности полипептидов воздействовать на целевые клетки, ткани или органы.
Далее, в объем настоящего изобретения входят гибридные белки, подвергнутые ковалентной модификации или образующие производные путем присоединения одного или более водорастворимого полимера, например, полиоксиэтиленгликоля или полипропиленгликоля, согласно описанному в патентах США № 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 и 4179337. Другие полезные полимеры, известные в данной области, включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу и другие полимеры на основе углеводородов, поли-^-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимер полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол) и поливиниловый спирт, а также смесь указанных полимеров. Особо предпочтительные варианты реализации включают белки, являющиеся производными полиэтиленгликоля (ПЭГ). Водорастворимые полимеры могут быть присоединены в определенных положениях, например, к аминотерминальному концу белков и полипептидов согласно настоящему изобретению или случайным образом присоединены к одной или более боковых цепей полипептида. Применение ПЭГ для улучшения терапевтических свойств описано в патенте США № 6133426.
В отдельном варианте реализации настоящего изобретения предложен гибридный белок, содержащий иммуноглобулин или Рс-фрагмент иммуноглобулина. Указанный гибридный белок может характеризоваться длительным периодом полувыведения, например, несколько часов, день или более, или даже неделя и более, в частности, если Рс-фрагмент способен взаимодействовать с РсКп, рецептором Рс новорожденных. Сайт связывания с РсКп в составе Рс-фрагмента также является сайтом связывания белков А и О бактерий. Сильное связывание между указанными белками можно использовать как средство очистки антител или гибридных белков согласно настоящему изобретению, при применении аффинной хроматографии с белком А или белком О в ходе очистки белка.
Методики очистки белка хорошо известны специалистам в данной области. Указанные методики включают на одном из уровней, предварительное разделение на полипептидную и не - полипептидную фракции. Часто требуется дальнейшая очистка, включающая применение методик хроматографии и электрофореза для достижения частичной или полной очистки (или очистки до состояния гомогенности). К аналитическим методам, особенно подходящим для создания чистого гибридного белка, относятся ионно-обменная хроматография, эксклюзионная хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективными методами очистки полипептидов являются жидкостная хроматография и ВЭЖХ.
Отдельные аспекты настоящего изобретения касаются очистки и в отдельных вариантах реализации существенной очистки гибридного белка. Термин очищенный гибридный белок, употребляемый в настоящем документе, относится к композиции, отделяемой от других компонентов, где гибридный белок очищают до любого состояния, сопоставимого с состоянием белка, получаемого в естественных условиях. Следовательно, термин очищенный гибридный белок также относится к гибридному белку, свободному от окружающей среды, в которой он встречается в природе.
В общем случае очищенный будет относиться к композиции, содержащей в составе гибридный белок, подвергнутой разделению на фракции с удалением других различных компонентов, по существу, сохраняющей свою выраженную биологическую активность. В случаях, когда употребляется термин по существу очищенный, указанное определение относится к композиции, в составе которой гибридный белок составляет основной элемент, например составляет приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99% или более белка по массе в композиции.
Специалистам в данной области техники известны различные методы количественной оценки степени очистки, в свете настоящего изобретения. Указанные методы включают, например, определение специфичной связывающей активности активной фракции или измерение количества гибридного белка во фракции при помощи анализа методом ЗЭЗ/РАОЕ. Предпочтительным методом измерения чистоты
- 20 024877 белковой фракции является вычисление связывающей активности фракции, сравнение ее со связывающей активностью исходного экстракта и, таким образом, вычисление степени очистки, измеряемое в настоящем описании в -кратный количественный показатель очистки. Фактические единицы, применяемые для представления величины связывающей активности, разумеется, будут зависеть от определенной методики анализа, выбранной для контроля очистки и определения, проявляет ли экспрессируемый гибридный белок измеряемую связывающую активность.
Специалистам в данной области хорошо известны различные методики, подходящие для применения в очистке белков. Указанные методики включают, например, преципитацию с сульфатом аммония, ПЭГ, антителами и т.д. или путем тепловой денатурации с последующим центрифугированием; этапы хроматографии, например ионный обмен, гель-фильтрация, обращенная фаза, гидроксилапатит и аффинная хроматография; изоэлектрическое фокусирование; гель-электрофорез и сочетание перечисленных, а также других методик. В соответствии с общими представлениями в данной области техники считается, что порядок проведения этапов очистки можно изменять или можно исключать отдельные этапы, тем не менее, с получением в результате применения указанного метода по существу очищенного белка.
Не существует общих требований, говорящих о том, что гибридный белок всегда должен применяться в его наиболее очищенном состоянии. Действительно, предусматривается, что в отдельных вариантах реализации будут применяться менее по существу очищенные белки. Частичную очистку можно осуществить путем применения сочетания меньшего количества этапов очистки или путем применения других видов той же общей схемы очистки. Например, известно, что использование катионнообменной колоночной хроматографии, проводимой с применением аппарата для ВЭЖХ, в общем случае приведет к большей степени очистки, чем указанная методика с применением системы хроматографии низкого давления. Методы, представляющие более низкую степень относительной очистки, могут иметь преимущества в общем выделении белкового продукта или в сохранении связывающей активности экспрессируемого белка.
Известно, что перемещение полипептида может изменяться, иногда в значительной степени, при различных условиях проведения 8Б8/РАОЕ (Сара1б1 е! а1. (1977), ВюсЬет. ВюрЬук. Кек. Сотт. 76:425). Следовательно, стоит понимать, что при различных условиях проведения электрофореза кажущаяся молекулярная масса продуктов экспрессии очищенного и частично очищенного гибридного белка может различаться.
Полинуклеотиды, векторы экспрессии и клетки-хозяева.
Согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды (выделенные или очищенные или чистые полинуклеотиды), кодирующие мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению, векторы (включая векторы клонирования и векторы экспрессии), содержащие указанные полинуклеотиды, и клетки (например, клетки-хозяева), трансформированные или трансфицированные при помощи полинуклеотида или вектора согласно настоящему изобретению.
В отдельных вариантах реализации предусмотрен полинуклеотид (ДНК или РНК), кодирующий связывающий домен согласно настоящему изобретению, или мультиспецифичный гибридный белок, содержащий один или более указанных доменов. Кластеры экспрессии, кодирующие конструкции мультиспецифичных гибридных белков, приведены в примерах, прилагающихся к настоящему описанию.
Настоящее изобретение также относится к векторам, содержащим полинуклеотид согласно настоящему изобретению, в частности к рекомбинантным экспрессионным конструкциям. В одном варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий мультиспецифичный гибридный белок, включающий домен, связывающий СБ86 и агонист 1Ь10, согласно настоящему изобретению, вместе с другими полинуклеотидными последовательностями, вызывающими или усиливающими транскрипцию, трансляцию и процессинг указанных последовательностей, кодирующих мультиспецифичные гибридные белки.
Соответствующие векторы экспрессии и клонирования, предназначенные для применения в прокариотических и эукариотических клетках-хозяевах, описаны, например, в 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1., 8есопб Ебйюп, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ, (1989). Примеры векторов клонирования/экспрессии включают векторы клонирования, челночные векторы и векторы экспрессии, которые можно создавать на основе плазмид, фагмид, фазмид, космид, вирусов, искусственных хромосом или любого средства переноса нуклеиновой кислоты, известного в данной области и подходящего для амплификации, переноса и/или экспрессии полинуклеотида, заключенного в нем.
Термин вектор, употребляемый в настоящем описании, означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную к переносу другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Примеры векторов включают плазмиды, искусственно созданные хромосомы дрожжей и геномы вирусов. Отдельные векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, тогда как другие векторы можно включать в геном клетки-хозяина, вследствие чего они будут реплицироваться с геномом хозяина. Также отдельные векторы обозначены в настоящем документе как рекомбинантные векторы экспрессии (или просто векторы экспрессии), содержащие последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанные с последовательностью, контролирующей экспрессию и, следовательно, способные направлять экспрессию указанных последовательностей.
- 21 024877
В отдельных вариантах реализации экспрессионные конструкты получают из векторов на основе плазмид. Иллюстративные конструкции включают модифицированный вектор рЫА§§ (С1оп!ес1г Ра1о А1!о, СА), содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген устойчивости к ампициллину, сигнал полиаденилирования и сайт-промотор Т7; рИЕР38 и рЫЕР38 (СМС 1С08 Вюкщек, 1пс.), содержащие промотор СНЕР1; и рИ18 (Ьоп/а), содержащий промотор СМУ. Хорошо известны и другие подходящие векторы экспрессии млекопитающих (см., например, АикиЪе1 е! а1., 1995; ЗатЪгоок е! а1., выше; также см., например, каталоги ЬцЦгодеп, §ап И1едо, СА; Ыоуадеп, Майкоп, XVI; РЬагтааа, Ркса!а\уау, Νί). Возможно создание удобных конструкций, включающих последовательность, кодирующую дигидрофолат редуктазу (ДГФР), при подходящем регулирующем воздействии, для повышения уровней образования гибридных белков, которые являются результатом амплификации гена вследствие применения соответствующего селектирующего агента (например, метотрексата).
В общих чертах, рекомбинантные векторы экспрессии должны включать точки начала репликации и селектируемые маркеры, обеспечивающие трансформацию клетки-хозяина, и промотор, полученный из гена с высоким уровнем экспрессии, для направления транскрипции структурной последовательности в 5'-3' направлении согласно описанному выше. Вектор, функционально связанный с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, запускает клонирование экспрессионной конструкции. Примеры конструкций, предназначенных для экспрессии/клонирования, содержат по меньшей мере один элемент контроля экспрессии, например промотор, функционально связанный с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению. В составе векторов и конструкций, предназначенных для экспрессии/клонирования, согласно настоящему изобретению также предусмотрены такие дополнительные элементы контроля экспрессии, как энхансеры, фактор-специфичные сайты связывания, терминаторы и сайты связывания рибосом. Гетерологичную структурную последовательность полинуклеотидов согласно настоящему изобретению с последовательностями инициации и терминации трансляции присоединяют в соответствующей фазе. Следовательно, например, нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, кодирующие гибридные белки, можно включать в состав любого из различных сконструированных векторов экспрессии как рекомбинантную экспрессионную конструкцию для экспрессии указанного белка в клетке-хозяине.
Соответствующую последовательность (соответствующие последовательности) ДНК можно включить в состав вектора, например, посредством различных методик. В общих чертах, последовательность ДНК вносят в соответствующий сайт (соответствующие сайты) для расщепления эндонуклеазой, посредством методик, известных в данной области. Предусмотрены общепринятые методики клонирования, выделения ДНК, амплификации и очистки, для ферментативных реакций с участием лигазы, расщепления эндонуклеазами и т.д. Некоторые общепринятые методики описаны, например, в АикиЪе1 е! а1. (Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЪ1. Аккос. 1пс. & 1оЬп ΧνίΚν & §опк, 1пс., Вок!оп, МА, 1993); ЗатЪгоок е! а1. (Мо1еси1аг С1ошпд, §есопб Еб., Со1б 8ргшд НагЪог ЬаЪогаЮгу, Ркитаезу, ΝΥ, 1989); Машабк е! а1. (Мо1еси1аг С1ошпд, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЪогакгу, Ркптаезу, ΝΥ, 1982); О1оуег (Еб.) (ИЫА С1оп1пд Уо1. ί апб ίί, 1КЬ Ргекк, ОхГогб, ИК, 1985); Натек апб Нщщпк (Ебк.) (ШсПс Ааб Ну-Ъ^/аПоп, ШЬ Ргекк, ОхГогб, ИК, 1985); также возможно использование каких-либо других источников.
Последовательность ДНК в составе вектора экспрессии функционально связывают по меньшей мере с одной последовательностью, регулирующей экспрессию (например, конститутивный промотор или регулируемый промотор) для направления синтеза мРНК. Иллюстративные примеры указанных последовательностей, регулирующих экспрессию, включают промоторы эукариотических клеток или вирусы эукариотических клеток согласно описанному выше. Промоторные области можно отобрать из любого целевого гена при помощи векторов САТ (хлорамфеникол-ацетилтрансферазы) или других векторов, несущих маркеры селекции. Эукариотические промоторы включают предранний белок ЦМВ, тимидин киназу Н8У, ранний и поздний §У40, длинные концевые повторы (ЬТК) ретровируса и металлотионеин-ί мыши. Выбор соответствующего вектора и промотора находится в пределах компетенции обычного специалиста в данной области, а создание отдельных особо предпочтительных рекомбинантных экспрессионных конструкций, включающих по меньшей мере один промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок или полипептид согласно настоящему изобретению, описано в настоящем документе.
Также предусмотрены варианты полинуклеотидов согласно настоящему изобретению. Варианты полинуклеотидов по меньшей мере на 90%, а предпочтительно на 95, 99 или 99.9% идентичны полинуклеотидам заданной последовательности согласно описанному в настоящем документе, или вступают в реакцию гибридизации с указанными полинуклеотидами заданной последовательности в жестких условиях реакции гибридизации с 0.015 М хлоридом натрия, 0.0015 М цитратом натрия приблизительно при 65-68°С или с 0.015 М хлоридом натрия, 0.0015 М цитратом натрия и 50% формамидом приблизительно при 42°С. Варианты полинуклеотидов сохраняют способность кодировать связывающий домен или гибридный белок, содержащий в составе указанный домен, обладающий функциональной активностью согласно описанному в настоящем документе.
Термин жесткие употребляется в отношении условий, обычно рассматриваемых в данной области как жесткие. Строгость условий гибридизации обычно определяется температурой, ионной силой и кон- 22 024877 центрацией денатурирующих агентов, например формамида. Примерами жестких условий гибридизации и отмывки являются 0.015 М хлорид натрия, 0.0015 М цитрат натрия при приблизительно 65-68°С или 0.015 М хлорид натрия, 0.0015 М цитрат натрия и 50% формамид при приблизительно 42°С (см. 8атЬгоок е! а1, Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1., 2'1 Ей., Со1й §ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1й 8ргш§ НагЬог, Ν.Υ., 1989).
Также можно применять более жесткие условия (например, более высокая температура, большая ионная сила, более концентрированный формамид или другой денатурирующий агент); однако будет затронута степень гибридизации. В случаях, когда речь идет и гибридизации дезоксиолигонуклеотидов, дополнительные жесткие условия гибридизации включают отмывку в 6х стандартном цитратно-солевом буфере (88С), 0.05% пирофосфат натрия при 37°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 14 оснований), 48°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 17 оснований), 55°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 20 оснований) и 60°С (для олигонуклеотидов, состоящих из 23 оснований).
Согласно дальнейшему аспекту настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная при помощи или в другом варианте содержащая любой из полинуклеотидов или любую векторную/экспрессионную конструкцию согласно настоящему изобретению. Полинуклеотиды или векторные/экспрессионные конструкции вводят в любую соответствующую клетку при применении любого способа, известного в данной области, включая трансформацию, трансфекцию и трансдукцию. Клетки-хозяева включают клетки, применяемые в данной области, подвергающиеся терапии ех угуо, включая, например, генную терапию ех νί\Ό. Клетки-хозяева эукариот, предусматриваемые данным аспектом настоящего изобретения при условии содержания полинуклеотида, вектора или белка согласно настоящему изобретению, включают, в дополнение к собственным клеткам субъекта (например, собственным клеткам пациента - человека), клетки УЕКО, клетки НеЬа, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) (включая измененные клетки СНО, способные видоизменять характер гликозилирования экспрессируемых поливалентных связывающих молекул, см., например, опубликованную заявку на патент США № 2003/0115614), клетки СО8 (например, СО8-7), У138, ВНК, НерО2, 3Т3, ΚΙΝ, МОСК, А549, РС12, К562, клетки НЕК293, клетки НерО2 се11к, N клетки, клетки 3Т3, клетки §ройор!ега £гид1регйа (например, клетки 8Г9), клетки ЗассЬаготусек сетеу1к1ае или любые другие клетки эукариот, известные в данной области как удобные для экспрессии и, возможно, выделения, белка или полипептида согласно настоящему изобретению. Также предусмотрены клетки прокариот, включая ЕксЬепсЫа соП, ВасШик киЫШк, 8а1топе11а (урЬипипит, стрептомицеты или любые другие клетки прокариот, известные в данной области как удобные для экспрессии и, возможно, выделения, белка или полипептида согласно настоящему изобретению. В ходе выделения белка или пептида согласно настоящему изобретению из клеток прокариот, в частности, предусмотрена возможность применения методик экстракции белка из телец включений, известных в данной области. Выбор соответствующей клетки находится в пределах компетенции специалиста в данной области на основе сведений, изложенных в настоящем документе. Предусмотрены клетки-хозяева, гликозилирующие гибридные белки согласно настоящему изобретению.
Термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин) относится к клетке, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что подобные термины употребляются с намерением обозначения не только отдельной целевой клетки, но также в отношении потомства указанной клетки. По причине того, что из-за мутаций или влияния окружающей среды в последующих поколениях могут появляться отдельные изменения, подобное поколение на практике может не являться идентичным родительской клетке, но, тем не менее, входит в понятие клетка-хозяин, употребляемое в настоящем документе.
Рекомбинантные клетки-хозяева можно культивировать в обычно применяемой питательной среде, измененной соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации определенных генов. Условия культивирования определенных клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, например температура, рН и т.д., будут известны специалистам в данной области. Также для экспрессии рекомбинантного белка можно применять различные системы культур клеток млекопитающих. Примеры систем культур клеток млекопитающих включают линии СОЗ-7 фибробластов почки обезьяны, описанные С1и/тап (1981), Се11, 23:175, и другие клетки, способные к экспрессии совместимого вектора, например, линии клеток С127, 3Т3, СНО, НеЬа и ВНК. Векторы экспрессии млекопитающих будут включать точку начала репликации, соответствующий промотор и, возможно, энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сайт полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'-фланкирующие последовательности, не подвергающиеся транскрипции, например, согласно описанному в настоящем документе, имеющие отношение к созданию поливалентных связывающих экспрессионных конструкций. Для получения целевых генетических элементов, не подвергающихся транскрипции, можно применять последовательности ДНК, полученные в результате сплайсинга ЗУ40, и сайты полиаденилирования. Введение конструкции в клетку-хозяина можно осуществлять различными способами, хорошо знакомыми специалистам в данной области, включая кальций-фосфатную трансфекцию, ОЕАЕ-опосредованную декстраном трансфекцию или электропорацию (Оа\лк е! а1. (1986), Вакю МеШойк О Мо1еси1аг Вю1о§у).
- 23 024877
В одном варианте реализации клетку-хозяин трансдуцируют рекомбинантной вирусной конструкцией, направляющей экспрессию белка или полипептида согласно настоящему изобретению. Трансдуцированная клетка-хозяин образует частицы вируса, содержащие белок или полипептид, полученный из фрагментов мембраны клетки-хозяина, включенных вирусными частицами в ходе активной репликации вируса в клетке.
Композиции и способы применения.
Для лечения млекопитающих, относящихся или не относящихся к роду человек, находящихся в болезненном состоянии, связанным с нарушением регуляции ί'Ό86, БЬ-10, НЬА-С, БЬ-35, ΡΌ-1, ВТЬА, ЬБСНТ, СБТКЬ или СЭ40, пациенту вводят мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению в количестве, являющимся эффективным для облегчения симптомов болезненного состояния в результате проведения курса, включающего одно или более введений. Поскольку белки согласно настоящему изобретению являются полипептидами, их можно суспендировать или растворять в фармацевтически приемлемом растворителе, возможно, включающем стабилизатор или другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые можно применять при внутривенном введении путем инъекции или инфузии, согласно более подробному описанию, приведенному ниже.
Фармацевтически эффективной дозой является доза, требуемая для предотвращения, подавления развития или лечения (облегчение симптома в определенной степени, предпочтительно всех симптомов) болезненного состояния. Фармацевтически эффективная доза зависит от формы заболевания, применяемой композиции, режима введения, типа пациента, подвергаемого лечению, физических характеристик конкретного пациента, рассматриваемых в связи с лечением, от одновременно принимаемых лекарств и других факторов, известных специалисту в области медицины. Например, можно вводить количество действующего вещества, находящееся в промежутке от 0.1 до 100 мг/кг массы тела (которое можно вводить однократно или в виде нескольких доз, вводимых каждый час, ежедневно, ежемесячно или в любой комбинации указанных режимов, составляющих соответствующий интервал), в зависимости от активности полипептидного связывающего домена или мультиспецифичного гибридного белка согласно настоящему изобретению.
В отдельных аспектах настоящего изобретения предложены композиции гибридных белков. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению обычно включают один или более тип связывающих доменов или гибридного белка в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или растворителем. Указанные носители не должны быть токсичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. Фармацевтически приемлемые носители, применяемые в терапии, хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в КетБпд!оп'8 РЬагтасеи!Бса1 ЗсБепсек, Маск РиЫБкЫпд Со. (А.К. Сеппаго (Еб.), 1985). Например, можно применять стерильный солевой и фосфатный солевой буфер при физиологическом значении рН. В состав фармацевтических композиций можно включать консерванты, стабилизаторы, красители и им подобные. Например, в качестве консервантов можно добавлять бензоат натрия, сорбиновую кислоту или сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Бб. а! 1449. Также можно применять антиоксиданты и суспендирующие агенты. Бб. Соединения согласно настоящему изобретению можно применять как в форме свободного основания, так и в форме соли, обе формы предусматриваются объемом настоящего изобретения.
Фармацевтические композиции также могут содержать растворители, например, буферы, антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту, низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды, белки, аминокислоты, углеводороды (например, глюкозу, сахарозу или декстрины), хелатообразующие вещества (например, ЭДТА), глутатион или другие стабилизаторы или вспомогательные вещества. Примерами соответствующих растворителей являются нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор в смеси с неспецифическим альбумином сыворотки. Предпочтительно, продукт оформляют в лекарственную форму в виде лиофилизата, с соответствующими растворами вспомогательных веществ в качестве растворителей.
Композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения болезненных состояний у млекопитающих, относящихся или не относящихся к роду человек, развивающихся в результате или связанных с нарушением регуляции СЭ86, БЬ-10. Согласно приведенному выше описанию было показано, что блокирование связывания СЭ86 с СЭ28, например, путем введения 1д к СТЬА4, обладает эффективностью при лечении аутоиммунных заболеваний, например, ревматоидного артрита. Известно, что БЬ-10 обладает иммуносупрессивными свойствами (СоттБпк е! а1. (2008), Б. А11егду С1Бп. Бттипо1. 121:1108-11; МБпд е! а1., (2008), БттитБу 28:468-476), и в ходе введения БЬ-10 пациентам, пораженным псориазом, наблюдали положительное воздействие (АкабиПаЬ е! а1. (1999), АгсЬ. Эегта!о1. 135:187-92) апб БпБ1атта!огу Ъо\\е1 бБкеаке (ЗсЬгеБЪег е! а1. (2000), Са8Бгоеп!его1оду, 119:1461-72). Следовательно, мультиспецифичные гибридные белки согласно настоящему изобретению полезны для лечения различных аутоиммунных и/или воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, юношеский ревматоидный артрит, астма, системная красная волчанка (СКК), воспалительные заболевания кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит), реакция трансплантат-против-хозяина, псориаз, множественный склероз, дерматомиозит, полимиозит, злокачественная анемия, первичный билиарный цирроз, острый рассеянный энцефаломиелит (АЭЕМ), болезнь Аддисона, анкилозирующий спондилит, анти- 24 024877 фосфолипидный синдром (ΑΡδ), аутоиммунный гепатит, диабетический миелит 1 типа, синдром Гудпасчера, болезнь Грейвса, болезнь Гийена-Барре (ΟΒδ), болезнь Хашимото, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, эритематоз, обыкновенная пузырчатка, синдром Шегрена, темпоральный артериит (также известный как гигантоклеточный артериит), аутоиммунная гемолитическая анемия, буллезный пемфигоид, васкулит, глютеновая энтеропатия, эндометриоз, гнойный гидраденит, интерстициальный цистит, кольцевидная склеродермия, склеродерма, нарколепсия, нейромиотония, витилиго и аутоиммунное заболевание внутреннего уха. Также мультиспецифичные гибридные белки согласно настоящему изобретению полезны для подавления неблагоприятных аллогенных иммунных реакций в ответ на трансплантацию органа (включая трансплантаты паренхиматозных органов или аллотрансплантаты), трансплантаты клеток и им подобные.
Определение фармацевтически приемлемая соль относится к соли полипептида, содержащего связывающий домен, или гибридного белка согласно настоящему изобретению, являющейся фармацевтически приемлемой и обладающей целевой фармакологической активностью исходного соединения. Указанные соли включают следующие: (1) соли, образованные путем добавления кислоты, в реакции с неорганической кислотой, например, с хлороводородной кислотой, бромоводородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой, фосфорной кислотой и так далее; или в реакции с органической кислотой, например, с уксусной кислотой, пропионовой кислотой, гексановой кислотой, циклопентапропионовой кислотой, гликолевой кислотой, пировиноградной кислотой, молочной кислотой, малоновой кислотой, янтарной кислотой, яблочной кислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, бензойной кислотой, 3-(4-гидроксибензоил)бензойной кислотой, коричной кислотой, миндальной кислотой, метансульфоновой кислотой, этансульфоновой кислотой, 1,2-этан-дисульфоновой кислотой, 2-гидроксиэтансульфоновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой, 4-хлорбензолсульфоновой кислотой, 2-нафталинсульфоновой кислотой, 4-толуолсульфоновой кислотой, камфорсульфоновой кислотой, 4-метилбицикло[2,2,2]окто-2-ен-1-карбоновой кислотой, глюкогептоновой кислотой, 3-фенилпропионовой кислотой, триметилуксусной кислотой, трет-бутилуксусной кислотой, лаурилсерной кислотой, глюконовой кислотой, глутаминовой кислотой, гидроксинафтойной кислотой, салициловой кислотой, стеариновой кислотой, муконовой кислотой и т.д.; или (2) соли, образованные в ходе реакции замещения кислого протона в составе исходного соединения на ион металла, например ион щелочного металла, щелочно-земельного металла или ион алюминия; или в результате образования координационной связи с органическим основанием, например с этаноламином, диэтаноламином, триэтаноламином, ^метилглюкамином или им подобными.
В отдельных иллюстративных вариантах реализации полипептид или гибридный белок согласно настоящему изобретению вводят внутривенно, например, в форме болюсной инъекции или инфузии. Пути введения, в дополнение к внутривенному введению, включают оральный путь, местный, парентеральный (например, сублингвально или буккально), сублинвальный, ректальный, вагинальный, интраназальный и периспинальный. Термин парентеральный, употребляемый в настоящем описании, включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрастенальные, внутрикавернозные, интратекальные, интрамеатальные, интрауретральные методики инъекций или инфузий. Фармацевтическую композицию создают таким образом, чтобы обеспечить действующим веществам, заключенным в ней, биологическую доступность при введении композиции пациенту. Композиции, предназначенные для введения пациенту, будут оформлены в одну или более стандартных лекарственных форм, где, например, таблетка может представлять собой лекарственную форму для однократного введения, а емкость для одного или более соединений согласно настоящему изобретению в форме аэрозоля может содержать множество единиц дозировки.
В составе композиций, предназначенных для орального введения, может присутствовать вспомогательное вещество и/или связывающее вещество, например сахароза, каолин, глицерин, декстраны крахмала, циклодекстрины, альгинат натрия, этилцеллюлоза и карбоксиметилцеллюлоза. Как вариант, могут присутствовать подслащивающие агенты, консерванты, красители/красящие вещества, усилители вкуса или любое их сочетание. Также возможно применение покрывающей оболочки.
В состав композиции, предназначенной для введения в форме инъекции, можно включить один или более из следующих агентов: поверхностно-активное вещество, консервант, увлажняющий агент, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буфер, стабилизатор, изотонический агент, а также любое их сочетание.
Для лекарственных форм на основе нуклеиновых кислот или для лекарственных форм, содержащих продукты экспрессии согласно настоящему изобретению, предусмотрена доза, находящаяся в промежутке от приблизительно 0.01 мкг/кг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, например, путем внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения или любым путем, известным в данной области, подходящим при данных условиях. Предпочтительная доза составляет, например, от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 20 мг/кг, особо предпочтительная доза составляет от приблизительно 5 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Специалистам в данной области будет очевидно, что количество и частота введений будут зависеть от реакции реципиента.
- 25 024877
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут находиться в любой форме, позволяющей осуществлять введение композиции в организм пациента, например, в твердой, жидкой форме или в состоянии газа (аэрозоль). Композицию можно предоставлять в форме жидкости, например в форме эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии, для введения любым из путей, описанных в настоящем документе.
Жидкая фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, как в форме раствора, так и в форме суспензии или в другой подобной форме может включать один или более из следующих компонентов: стерильные растворители, например вода для инъекций, солевой раствор (например, физиологический солевой раствор), раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, жирные масла, например синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить растворяющей или суспендирующей средой, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; противобактериальные агенты, например бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, например аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; буферы, например ацетатные, цитратные или фосфатные буферы; хелатирующие агенты, например этилендиаминтетрауксусная кислота; и агенты, регулирующие тонус мышц, например натрий, хлорид или декстроза. Лекарственную форму, предназначенную для парентерального введения, можно поместить в ампулы, шприцы для одноразового применения или ампулы многоразового применения, произведенные из стекла или пластика. Предпочтительной добавкой является физиологический солевой раствор. Фармацевтическая композиция, предназначенная для инъекций, предпочтительно является стерильной.
Также может быть желаемо включение других компонентов в состав лекарственной формы, например средства доставки, включая соли алюминия, эмульсии типа вода-в-масле, биодеградируемые масляные среды, эмульсии типа масло-в-воде, биодеградируемые микрокапсулы и липосомы. Примеры адъювантов, применяемых с указанными средами, включают Х-ацетилмурамил-Е-аланин-О-изоглутамин (МОР), липополисахариды (ЛПС), глюкан, 1Ь-12, ГМ-КСФ, интерферон-γ и 1Ь-15.
Хотя в составе фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению можно применять любой подходящий носитель, известный обыкновенному специалисту в данной области, вид носителя будет изменяться в зависимости от режима введения и в зависимости от того, требуется ли замедленное высвобождение. В композициях, предназначенных для парентерального введения, носитель может представлять собой воду, солевой раствор, спирт, спирт, воск, буфер или любое их сочетание. В композициях, предназначенных для орального введения, можно применять любой из указанных выше носителей или твердый носитель, например маннитол, лактозу, крахмал, стеарат магния, натрия сахарин, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния или любое их сочетание.
Также предусмотрено введение композиций, содержащих в составе мультиспецифичный гибридный белок согласно настоящему изобретению, в сочетании со вторым агентом. Второй агент может представлять собой агент, принятый в данной области в качестве стандартного лекарственного средства для лечения определенного болезненного состояния, например, воспалительного, аутоиммунного или ракового заболевания. Примеры предусматриваемых дополнительных агентов включают цитокины, факторы роста, стероиды, ЖАЮк, ОМАКОк, хемотерапевтические агенты, радиотерапевтические агенты или другие действующие и вспомогательные агенты.
Настоящее изобретение предусматривает единицу дозирования, содержащую фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению. Указанные единицы дозирования включают, например, ампулу или шприц одно- или многоразового применения, включая двухкамерную ампулу или шприц, где в одной камере содержится фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению в лиофилизированной форме, а в другой - растворитель. Единица дозирования многоразового применения также может представлять собой, например, контейнер или трубку, связывающуюся с устройством внутривенного введения.
Также согласно настоящему изобретению предусмотрен набор, содержащий фармацевтическую композицию в емкости, предназначенной для одно- или многоразового применения, например в ампуле, и набор инструкций по введению композиции пациентам, пораженным заболеванием согласно описанному в настоящем документе.
Все патенты США, публикации патентных заявок США, заявки на патент США, иностранные патенты, заявки на иностранные патенты, не патентные публикации, таблицы, последовательности, интернет - страницы и так далее, относящиеся к настоящему изобретению, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Следующие примеры приведены в иллюстративных целях и не ограничивают собой объем настоящего изобретения.
- 26 024877
Примеры
Последовательности эксцепторных молекул.
Аминокислотные последовательности примеров мультиспецифичных гибридных белков, содержащих эктодомен СТЬА4, приведены в 8ЕЦ ГО Ν08: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37 и 41 и 8ЕЦ ГО Ν0δ: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38 и 42 соответственно. Активность указанных примеров мультиспецифичных гибридных белков исследовали в соответствии с описанием, приведенным ниже, в примерах 1-6. Аббревиатуры, использованные в приведенных ниже примерах, включают следующие термины: ФСБ-Т: ФСБ, рН 7.2-7.4 и 0.1% Т\уееп® 20; рабочий буфер: ФСБ-Т с 1% БСА; блокирующий буфер: ФСБ-Т с 3% БСА.
Пример 1.
Связывающие домены, направленные против СГО86.
Применяли гибридомы 3Ό1 и ΡυΝ1 для клонирования вариабельных связывающих областей указанных моноклональных антител, направленных против СГО86. Последовательности, соответствующие тяжелой цепи, легкой цепи, линкеру 8сРу и участкам СГОК в составе моноклональных антител ΡυΝ1 и 3Ό1, моноклональных антител, направленных против СГО86, приведены в 8ЕЦ Ν0δ: 305-313 и 318-326 соответственно.
Для конструирования белков 8ΜΣΡ и эксцепторных белков применяли следующие вариабельные области гуманизированного моноклонального антитела ΡυΝ1, направленного против СГО86. Участки СГОК ΡυΝ1 трансплантировали в эмбриональные последовательности человека следующим образом:
(1) ΡυΝ1-11 содержал РК !дку4-4*01 для легкой цепи и РК I§ΗVI-Ρ*01 для тяжелой цепи;
(2) ΡυΝ1-21 содержал РК !^Κν4-1*01 для легкой цепи и РК I§ΗVI-2*02 для тяжелой цепи;
(3) ΡυΝ1-31 содержал РК I§кν4-1*01 для легкой цепи и РК I§ΗV3-11*01 для тяжелой цепи;
(4) ΡυΝ1-12 содержал РК !^Κνί-27*01 для легкой цепи и РК IдΗVI-Ρ*01 для тяжелой цепи;
(5) ΡυΝ1 -22 содержал РК !^Κνί-27*01 для легкой цепи и РК I§ΗVI-2*02 для тяжелой цепи;
(6) ΡυΝ1-32 содержал РК !^Κνί-27*01 для легкой цепи и РК !дИУ3-11*01 для тяжелой цепи.
Участки СГОК эмбриональной последовательности гуманизированных молекул аналогичны участкам в составе исходных молекул ΡυΝ 1.
В результате, также были созданы шесть следующих версий гуманизированных белков 8ΜIΡ ΡυΝ1:
(1) ΡυΝ1-11 (8ЕС) ГО Ν0: 225);
(2) ΡυΝ1-21 (8ЕС) ГО Ν0: 227);
(3) ΡυΝ1-31 (8ЕС) ГО Ν0: 229);
(4) ΡυΝ1-12 (8ЕС) ГО Ν0: 231);
(5) ΡυΝ1-22 (8ЕС) ГО Ν0: 233);
(6) ΡυΝ1-32 (8ЕС) ГО Ν0: 235).
Связывающая активность указанных гуманизированных молекул 8ΜΣΡ ΡυΝ1 показана на фиг. 7. Также для создания эксцепторных молекул применяли вариабельные участки (8сНу) ΡυΝ1 и гуманизированные 8сΡν ΡυΝ1, например I^-10::ΡυN1 (8ЕС) ГО Ν0: 183); ΡυN1::I^-10 (8ЕС) ГО Ν0: 187); рЦШ-21::ГО-10 (8ЕС) ГО Ν0: 237); I^-10::ΡυN1-21 (8ЕС) ГО Ν0: 254); ГО-10 187Α::ΡυΝ1-21 (8ЕЦ ГО Ν0: 258); и также была сконструирован связывающий домен моно-ГО-Ю/ЕЕШ^ с применением короткой шарнирной области А2 (8ЕЦ ГО Ν0: 276) (где аминокислотная последовательность шарнирной области А2 приведена в 8ЕЦ ГО Ν0: 364).
Указанные, а также все другие конструкции, описанные в настоящем документе, клонировали в соответствующие векторы экспрессии млекопитающих и экспрессировали в различных линиях клеток с образованием белка для различных функциональных исследований.
Пример 2.
Анализ связывания эксцепторных молекул с рецептором 1 ГО-10 с помощью ЫАсоге™.
Активность связывания ГО-10-К1 эксцепторной молекулой, включающей эктодомен СТБА4 и домен ГО-К) (8ЕЦ ГО Ν0: 9), исследовали, по существу, следующим способом.
Измерения поверхностного плазмонного резонанса (ППР) проводили с помощью ЫАсоге™ Т100 8РК (РЬагтааа Вю1есЬ АВ, υρρ8α1α) с применением нВ8-Р+ (ОЕ неаЬЬсаге) в качестве подвижного буфера. ГО-10К1 (25 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия, рН 4.0; К&Э 8у8!ет8) непосредственно иммобилизовали на чипе СМ5 с применением стандартной химии сопряжения аминов (ВБасоге Атте СоирЬпд Κίΐ, ОЕ неаЬЬсаге), с итоговыми уровнями иммобилизации, составлявшими 867, 2687 и 6719 Ки (единиц резонанса). Конструкции, содержащие ГО-К), вводили в течение 300 с, при скорости потока, составлявшей 50 мкл/мин, в серии концентраций, составлявших от 100 пМ до 10 нМ. Диссоциацию наблюдали в течение 1200 с и поверхность восстанавливали путем ведения 2 М хлорида магния, рН 7.58, в течение 60 с и с последующим введением 20 мМ ЭДТА (в ИВ8-Р+) в течение 60 с. Взаимодействия путем связывания с поверхностью были стабильны в течение по меньшей мере 30 циклов восстановления. Анализ данных осуществляли с помощью В1аЕУа1иа1юп для Т100, версии 2.0 (ОЕ неаЬЬсаге). Кинетические параметры связывания эксцепторной молекулы СТБА4/ГО-10 с иммобилизованным ГО-ЮГО не соответствовали модели связывания Лэнгмюра 1:1, но с высокой точностью подходили под бивалентную модель связывания аналитов. Величины равновесных констант диссоциации (Кс) с высокой точностью можно рассчитать
- 27 Μ4»ΊΊ для каждой конструкции путем обработки наблюдаемой реакции при насыщении в стационарной модели равновесия, указанные значения приведены в табл. 3. Введение эктодомена СТЬА4 в состав эксцепторного гибридного белка не оказывало значительного влияния на взаимодействие ГО-10/ГО-10К1.
Таблица 3
Иммобилизованный белок Аналит Величина К для первого сайта (М'з1) Величина Ка для второго сайта «') Величина Ка для первого сайта (С1) Величина для второго сайта «’) Величина Ко (нМ)
1Б-1ОК.1 ГО-10* 5.7 χ НТ 2.6 χ Ι0'1 - - 0.46
ГО-10К1 5ЕЦ ГО N0:9 7 χ 105 2.9 χ 101 18 χ НТ 8.6 χ 10'3 0.41**
* Значение получено из литературного источника (Уооп е1 а1. (2006), I. Вю1. СНет. 281:35088-35096).
** Подсчитано на основе ка1 и к41.
Пример 3.
Анализ связывания эксцепторной молекулы с СЭ80 и с СЭ80 и ГЬ-10 методом ИФА.
Оценку активности связывания СГО80 и ГЬ-10К проводили с помощью метода ИФА для абатасепта, конструкции состава СТЬА4-1§, обозначенной в настоящем документе как СТЬА4-Ш (8ЕЦ ГО Ν0: 10 и 11) и для эксцепторной молекулы СТкА4/!Е-10 согласно 8ЕЦ ГО Ν0: 9, по существу, следующим способом.
Связывание СГО80.
В каждую лунку 96-луночного черного планшета Ма.^огр СГО80 (Шпс Са!а1од #437111) наносили СИ80-т[§ (Апсе11 Са!а1од #510-020) в форме раствора, концентрация которого составляла 2 мкг/мл, и инкубировали планшет в течение ночи при 4°С. После этого блокировали планшет с помощью блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% нежирным сухим молоком). В лунки, покрытые СИ80-т!§, добавляли образцы белков, предназначенных для исследования, в серийных разведениях в блокирующем буфере, в двух повторах, планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение приблизительно 1 ч. После отмывки в лунки вносили по 100 мкл конъюгата пероксидазы хрена с ЦС козла, направленными против иммуноглобулинов человека (гамма), разведенных 1:1000 в блокирующем буфере, планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин, после чего инкубировали в течение 10 мин с флуорогенным субстратом пероксидазы Оиап1аВ1и'™ (Ткегто 8с1епййс Са!а1од #15169) при комнатной температуре. Величину поглощения в каждой лунке измеряли при 420 нм. В качестве отрицательного контроля применяли не родственный гибридный белок ТКИ-015.
Результаты описанных экспериментов приведены на фиг. 1. Обнаружили, что СТЬА4-№ связывается с СИ80-т1§ в ходе ИФА так же, как абатасепт, тогда как для эксцепторной молекулы СТкА4/!к-10 наблюдали более слабое связывание с СГО80.
Одновременное связывание эксцепторной молекулы с растворимым рецептором 1 ГЬ-10 ^ГО-10К1) и растворимым СГО80 (δΤΌ80).
В каждую лунку 96-луночного черного планшета Ма.^огр СИ80 (Шпс Са!а1од #437111) наносили δI^-10Ка (К&И 8уδΐетδ Са!а1од #510-020) в форме раствора, концентрация которого составляла 2 мкг/мл, и инкубировали планшет в течение ночи при 40°С. Планшет блокировали с помощью блокирующего буфера (ФСБ-Т с 3% не жирным сухим молоком). В лунки планшета, покрытые δI^-10Ка, добавляли образцы белков, предназначенных для исследования, в серийных разведениях в блокирующем буфере, в двух повторах, планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение приблизительно 1 ч. После отмывки добавляли антитело, направленное против СИ152 (Апсе11 #359-020), в концентрации, составлявшей нг/мкл, или СИ80-т!§ (Апсе11 # 510-020) в концентрации, составлявшей 5 мкг/мл, с последующим добавлением конъюгата пероксидазы хрена с ЦС козла (Рс), направленным против иммуноглобулинов мыши (Иегсе #31439), разведенного 1:10,000 в блокирующем буфере, планшет накрывали и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин, после чего инкубировали в течение 10 мин с флуорогенным субстратом пероксидазы ЦиайаВГО™ (Ткегто 8с1епййс Са!а1од #15169) при комнатной температуре. Величину поглощения в каждой лунке измеряли при 420 нм. В качестве отрицательного контроля применяли не родственный гибридный белок ТКИ-015.
На фиг. 2 приведены результаты, полученные для СТРА4-№ и эксцепторной молекулы СТ^А4::I^-10. согласно 8ЕЦ ГО Ν0: 9. Приведенные результаты показывают, что участки СТЬА4 и !Ь-10 в составе эксцепторной молекулы СТ^А4-Iд-I^-10 способны к одновременному связыванию их лиганда/рецептора.
Пример 4.
Фосфорилирование 8ТАТ3, вызываемое эксцепторной молекулой.
Известно, что связывание ГО-10 с ГО-10-К1 активирует 1ак-1 и Тук, которое, в свою очередь, ведет к активации 8ТАТ3 (см., например, ХУПНапъ е! а1. (2007), 1. Вю1. Скет. 282:6965-6975). Также существуют исследования, в ходе которых было показано, что для изучения фосфорилирования 8ТАТ3 в МКПК
- 28 024877 можно применять метод проточной цитометрии (ЬаРагде е! а1. (2007), ВМС Мо1. Вю1. 8:64). Способность различных конструкций, содержащих в составе 1Ь-10, включая эксцепторную молекулу СТЬА4/1Ь-10, приведенную в 8ЕЦ ГО N0: 9, вызывать фосфорилирование 8ТАТ3 в МКПК человека, исследовали, по существу, следующим способом.
МКПК выделяли у донора-человека и культивировали в течение ночи в полной среде (КРМ1, 10% ФСБ, пенициллин/стрептомицин), концентрация клеток составляла 2χ106 клеток/мл. На следующее утро проводили одну отмывку МКПК, ресуспендировали их в предварительно согретой КРМ1 1640 (без добавок), концентрация клеток составляла 4χ106 клеток/мл, и инкубировали при 37°С в течение 2.5 ч. Исследуемые образцы готовили в 2Х концентрации в 0.25 мл КРМ1 1640 и смешивали с 1 χ 106 РВМС, концентрация которой составляла 1χ106, в 0.25мл КРМ1 1640. После этого образцы инкубировали в течение 15 мин при 37°С. После завершения 15-минутной инкубации в каждую пробирку добавляли по 0.5 мл ледяного буфера ВО Су!ой\ (ВО Вюкаепсек, са! # 554655). После этого клетки инкубировали на льду в течение 30 мин, после чего отмывали 2 мл Д-ФСБ+2.5% ФСБ (буфер РАС8). После декантирования и откручивания образцов на вортексе в каждую пробирку добавляли по 0.5 мл ледяного буфера III ВО РЕКМ (ВО Вюкаепсек, са! # 558050) и образцы инкубировали на льду в течение 30 мин. После этого образцы отмывали 3Х в 2 мл буфера РАС8 и ресуспендировали в ~0.2 мл буфера РАС8 после итоговой отмывки. К каждому образцу добавляли 20 мкл конъюгированного тАЬ, направленного против 8ТАТ3 человека, с ФИТЦ (ВО Вюкаепсек, клон РУ705). Клетки инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. После этого образцы отмывали 3Х в буфере РАС8 для удаления любых не связавшихся антител. Анализ образцов проводили на проточном цитометре Ь8КГО Окно для живых лимфоцитов применяли на основе графиков 88С (бокового светорассеяния) и Р8С (прямого светорассеяния) и определяли значение МР1 (среднюю интенсивность флуоресценции) для ФИТЦ.
Как показано на фиг. 3 и 4, все конструкции, содержащие в составе ГО-10, усиливали фосфорилирование 8ТАТ3, пропорционально дозе.
Пример 5.
Связывание эксцепторной молекулы с СГО86 и с СГО86 и ГО-10 одновременно.
Для оценки связывания СГО86 применяли линию В-лимфобластоидных клеток человека, экспрессирующих СГО86 (^ГО2-8), и для оценки одновременного связывания антагониста СГО86 и агониста ГО-10, присутствующих в составе эксцепторных молекул, применяли линию клеток СНО, экспрессирующих СГО86 (клетки НиСГО86-2А2) на поверхности, в сочетании с гибридным белком, содержащим растворимый рецептор 1 ГО-10 (ГО-10К1), связанный с Рс-фрагментом 1дС мыши или с антителом, направленным против ГО-10. Вкратце, клетки \УГО-2-8 или НпСЭ86-2А2 инкубировали с исследуемыми молекулами, содержащими антагонист СГО86 в концентрациях, находящихся в интервале от насыщенных до фоновых уровней. Далее, к клеткам НиСГО86-2А2 добавляли гибридный белок ГО-10К1-ти1д или антитело мыши, направленное против ГО-10, в форме комплекса с исследуемыми молекулами, связывающимися с поверхностью клеток посредством СГО86. После завершения инкубации клетки отмывали и вносили антитело Р(аЬ')2, обладающее специфичностью по отношению к Рс-фрагменту эксцепторной молекулы, меченное флуорофором (К-фикоэритрином), гибридный белок ГО-10К-1д или антитело, направленное против ГО-10. После этого клетки с внесенной в них меткой пропускали через проточный цитометр, и данные анализировали с помощью построения графика средней интенсивности флуоресценции для каждого образца. Как показано на фиг. 5, для связывания эксцепторных молекул, содержащих связывающий домен, направленный против СГО86 (например, полученную из гибридомных антител 3Ό1 и ΡυΝ1), с СГО86 на поверхности клеток \УГО-2-8 наблюдали более высокую аффинность, чем для связывания эксцепторных молекул, содержащих эктодомен СТЬА4. В частности, эксцепторная молекула 3О1::ГО-10 (8ЕЦ ГО N0: 189), содержащая участок 3Ό1, направленный против СЭ86, обладала несколько более высокой аффинностью к СО86, чем эксцепторная молекула РиМ::ГО-10 (8ЕЦ ГО N0: 187), содержащая участок ΡυΝ1, направленный против СЭ86, тогда как эксцепторные молекулы, содержащие СТЬА4-1д (8ЕЦ ГО N0: 11) и СТЬА4 (8ЕЦ ГО N0: 173), обладали значительно более низкой аффинностью по отношению к СО86, чем связывающие домены, направленные против СЭ86, полученные из гибридомных антител 3Ό1 и РиШ. Как показано на фиг. 6, эксцепторные молекулы, содержащие антагонист СГО86 и агонист ГО-10, способны одновременно связывать СГО86 на поверхности клеток НпСЭ86-2А2 (клеток СНО собственной разработки, экспрессирующих СГО86 на поверхности) и растворимый ГО-10К1. Более того, на фиг. 6 показано, что варианты ГО-10 обладают различной аффинностью по отношению к ГО-10К1. Например, эксцепторные молекулы СТЬА4::моно-ГО-10 (8ЕЦ ГО N0: 181) и (СТЬА4::ГО-10)-75 (8ЕЦ ГО N0: 173) обладают одинаковой аффинностью по отношению к ГО-10К1, но для эксцепторных молекул, содержащих мутированную форму ГО-10 вируса, СТЬА4::ГО-10 187А (8ЕЦ ГО N0: 191) и СТЬА4::ГО-10 1878 (8ЕЦ ГО N0: 193), наблюдали значительно более низкую аффинность по отношению к ГО-10К1.
В ходе другого эксперимента, исследовали связывание СГО86 различными версиями 8М1Р на основе гуманизированного РиШ. Супернатанты клеток НЕК293, временно трансфицированные шестью различными версиями 8М1Р на основе гуманизированного РиЮ, исследовали по признаку связывания
- 29 024877
СГО86 с применением клеток ИиСЭ86-2А2. На фиг. 7 показано, что РИМ-21 (ЗЕО ГО ΝΟ: 227), обладал самой высокой аффинностью связывания по отношению к СГО86. за ним следует ΕΕΝ1-22 (ЗЕО ГО ΝΟ: 233) и РИМ-11 (ЗЕО ГО ΝΟ: 225); для остальных белков ЗМ1Р на основе гуманизированного РИМ (ΕϋΝ1-12, ЗЕО ГО ΝΟ: 229; ΕϋΝ1-31, ЗЕО ГО ΝΟ: 231; РИМ-32, ЗЕО ГО ΝΟ: 235) не обнаружили значительного связывания.
Пример 6.
Различная длина линкеров, связывающих домены в составе эксцепторных белковю
Проводили оценку стабильности линкеров для молекул СТЬА4::1Ь-10. Все варианты линкеров стабильно трансфицировали в клетки ^ΟΚ1δν и общие стабильные популяции культивировали при 37°С с последующим переходом на 34°С на 3 день. Белки очищали с помощью колонки с белком А и колонки ЗЕС на втором этапе очистки. Для оценки связывания ГО-10 с гибридным белком 1Ь-10К1-ш1§ применяли метод ИФА. Результаты, приведенные на фиг. 8, показали, что связывание ГО-10 эксцепторной молекулой (СТЬА4::ГО-10)-65 (ЗЕО ГО ΝΟ: 9) было пониженным из-за нестабильности линкера, но (СТЬА4::ГО-10)-68 (ЗЕО ГО ΝΟ: 171), (СТЬА4::ГО-10)-69 (ЗЕО ГО ΝΟ: 302) и (СТЬА4::ГО-10)-75 (ЗЕО ГО ΝΟ: 173) были стабильны в указанных условиях культивирования.
Более короткие варианты линкеров в составе эксцепторных белков СТЬА4::ГО-10 также исследовали по признаку связывания ГО-10К.1 с помощью метода ИФА. Более короткие варианты линкеров временно трансфицировали и белки очищали с помощью колонки с белком А. ИФА проводили для измерения связывания ГО-10 с гибридным белком ГО-10К1-ш1д. Результаты, приведенные на фиг. 9, показывают, что более короткие варианты линкеров (СТЬА4::ГО-10)-77 (ЗЕО ГО ΝΟ: 175), 00033 (СТЬА4::ГО-10)-78 (ЗЕО ГО ΝΟ: 177) и (СТЬА4::ГО-10)-79 (ЗЕО ГО ΝΟ: 179) функционируют так же, как линкеры большей длины, для аффинности связывания заднего конца ГО-10 (например, в сравнении с (СТЬА4::ГО-10)-68; ЗЕО ГО ΝΟ: 171).
Пример 7.
Стабильность эксцепторных белков в сыворотке и их фармакокинетические параметры.
Проводили исследование стабильности в сыворотке (СТЬА4::ГО-10)-75 (ЗЕО ГО ΝΟ: 173). В ходе указанного эксперимента изучали очищенный белок из ЗЕО ГО ΝΟ: 173 в сыворотке мыши при 37°С в течение 24, 72 ч и Р/Т (замораживание/оттаивание) и спайки с течением времени анализа (ТО). Все образцы, исследованные на стабильность, анализировали по признаку связывания с СИ80 (с применением клеток 1 Р6 СНО, экспрессирующих СИ80), а также по признаку одновременного связывания с СИ80 и связывания антитела, направленного против ГО-10, с ГО-10 эксцептора. Результаты показали, что белок из ЗЕО ГО ΝΟ: 173 обладал очень высокой стабильностью и сохранял способность связывания ГО-10 после инкубации в сыворотке мыши в исследованных концентрациях (приблизительно от 0.01 приблизительно до 10 нМ).
Исследования фармакокинетических параметров (ФК) для (СТЬА4::ГО-10)-68 (ЗЕО ГО ΝΟ: 171) и (СТЬА4::ГО-10)-75 (ЗЕО ГО ΝΟ: 173) проводили на самцах мышей Ва1Ь/с, в каждой временной точке исследовали 3 мышей. Мышам внутривенно вводили белок в дозе, составлявшей 200 мкг/мышь. Сыворотку мышей отбирали во временных точках 15 мин, 2, 6, 24, 48, 96 ч, 7 и 14 дней после введения. Образцы исследовали на связывание СИ80 (в анализе СТЬА4) и одновременное связывание с СИ80 и антителом, направленным против ГО-10 (в анализе ГО-10). Результаты суммированы в табл. 4.
Таблица 4
Суммарные данные исследования ФК параметров
Расчетные данные ФК для абатасепта, (СТЬА4::1Ь10)-68 и(СТЬА4::ГО-10)-75 Расчетные данные ДЛЯ абатасепта Расчетные данные ФК параметров для (СТЬА4::ГО-10)-68 Расчетные данные ФК параметров для (СТЬА4::ГО-10)-75
Параметр Единицы Анализ СТБА4 Анализ СТБА4 Анализ ГО-10 Анализ СТГОА4 Анализ ГО-10
НЕ ЕатЬда г ч 45.49 32.62 29.36 34.59 31.48
V/ оНз мл/кг 117.30 84.571 158.57 206.48 285.30
С1 оЬз мл/ч/кг 1.79 1.797 3.74 4.14 6.28
Пример 8.
Связывание эксцепторных молекул с СИ80, СИ86 и ГО-10К.1.
Оценку связывания СГО80 и ГО-10К.1 проводили с помощью ИФА и/или связывание СИ86 и ГО-10К.1 изучали с применением клеток СНО, экспрессирующих СИ86, а также ГО-10М-1д или молекул, направленных против ГО-10. Оценку связывания с СИ80 и СГО86 мыши проводили с помощью ИФА с применением антител мыши, меченных биотином. Исследуемые молекулы включали гибридный белок СТЬА4-1§ (ЗЕО ГО ΝΟ: 11), применяемый в качестве контроля, а также следующие эксцепторные молекулы: (СТЬА4::ГО-10)-65 (ЗЕО ГО ΝΟ: 9); (СТЬА4::ГО-10)-68 (ЗЕО ГО ΝΟ: 171); (СТЬА4::ГО-10)-69 (ЗЕО ГО ΝΟ: 302), (СТЕА4::РИЬ2)-65 (ЗЕО ГО ΝΟ: 336), оценку проводили, по существу, способами, описанными в примерах 3 и 5.
- 30 024877
Как показано на фиг. 10 и 11, все эксцепторные молекулы (СТ^А4::I^-10)-65. (СТЕА4::!Е-10)-68 и (СТ^Ά4::I^-10)-69 связывали с ΕΌ80 входе ИФА и ΕΌ86 на поверхности клеток. Результаты, приведенные на фиг. 12, показывают, что эксцепторные молекулы СТЕА4::!Е-10 могут вступать во взаимодействие с ΙΌ-10Κ1 человека. Далее, как показано на фиг. 13, эксцепторные молекулы СТЕА4::!Е-10 способны одновременно связывать как ΒΌ1 (связывающий домен на аминоконце), так и ΒΌ2 (связывающий домен на карбоксиконце) с ΕΌ80 и ΙΌ-10Κ1 в ИФА. Также на фиг. 14 и 15 показано, что эксцепторные молекулы (ΟΓΕΆ4::ΙΕ-10)-65, (ΟΓΕΆ4::ΙΕ-10)-68 и (ΟΓΕΆ4::ΙΕ-10)-69, в особенности это касается молекул человека, способны вступать в перекрестные взаимодействия с Ε'Ό80 мыши и с ΕΌ86 мыши.
Пример 9.
Анализ связывания эксцепторов с ΕΌ80 с помощью ΒΙ^οΐΌ™.
Оценку активности связывания ΕΌ80 проводили для абатасепта (Οπ2ΐκί;·ι®, ΒγΕΙοΙ-Μυοιέ δ/μιφγ, гибридного белка СТЬА4-Ес, содержащего мутации Ε104Ε А29У, аналогичного белатасепту (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 217), трех вариантов эксцепторных молекул СТЕА4::ЕЕ-10, содержащих в составе линкеры, каждый из которых содержит эктодомен СТЬА4 или домен I^-10:(СТ^Ά4::I^-10)-65 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 9), (СТЕА4::П,-10)-68 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 171) и (01^4::^-10)-75 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 173); эксцепторной молекулы, включающей эктодомен СТЬА4 с мутациями Ό104Ε А29У и домен ΙΌ-10 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 219), и эксцепторной молекулы, включающей эктодомен СТЬА4 и домен ΡΌ-Ό1 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 13), по существу, согласно описанному в настоящем документе. Анализ связывания СТЬА4-Ес с СО80/86 с помощью ΒΙ^οΐΌ описывали ранее (Огеепе е! а1. (1996), 1. ΒίοΙ. СЬет. 271:26762-26771; уап Ьег Μοηνο е! а1. (1997), 1. Εχρ. Μβά. 185:393-403; СоШпк е! а1. (2002), ΕνίΜιιηίΙν 17:201-210). Связывание СО80 СТЬА4 характеризуется средней аффинностью (Ка ~200 нМ), высокой скоростью ассоциации (4-8х 105 М-1 с-1) и невысокой скоростью диссоциации (0.090 с-1). Связывание димерного СТЬА4-Ес с СО80 проходит в две фазы, которым соответствуют два значения скорости диссоциации (0.004, 0.086 с-1). Описано, что мутации Ό104Ε А29У в составе СТЬА4-Ес повышают аффинность по отношению к СО80 в два раза по сравнению с СТЬА4-Ес дикого типа (Ьагкеп е! а1. (2005), Ат. ί. Тгап§р1ай. 5:443-453) в основном путем снижения начальной скорости диссоциации (описанной как 0.00108 по сравнению с 0.00221 с-1).
Измерения поверхностного плазмонного резонанса (ППР) проводили с помощью ΒΙ^οΐΌ™ Т100 НИР (ЕЬагтааа Β^οΐесЬ ΆΒ, ирр§а1а) с применением ΗΒδ-ΕΡ+ (0Ε НеаЬЬсаге) в качестве проточного буфера. Ε’Ό80-ιηΙ§Ο (25 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия, рН 4.0; Апсе11, Ιικ) непосредственно иммобилизовали на чипе СМ5 с помощью стандартной химии сопряжения аминов (Βϊηοογο Атте СоирПпд КЬ, 0Ε НеаЬЬсаге), со значениями итоговых уровней иммобилизации, составлявшими 317, 973 и 1678 Кц (единиц резонанса). Конструкции, содержавшие СТЬА4, вводили в течение 150 с, со скоростью потока, составлявшей 10 мкл/мин, в сериях концентраций, находившихся в интервале от 5 нМ до 1 мкМ. Диссоциацию наблюдали в течение 600 с и поверхность восстанавливали путем введения 50 мМ цитрата натрия, 500 мМ хлорида натрия, рН 4.0, в течение 60 с. Взаимодействия связывания с поверхностью были стабильны в течение по меньшей мере 75 восстановительных циклов. Данные анализировали с помощью программного обеспечения Β^аΕνа1иаΐ^οη для Т100 (версия 2.0.1, 0Ε НеаЬЬсаге). Кинетические параметры связывания конструкций, содержащих СТЬА4, с иммобилизованным СО80, не соответствовали модели связывания Лэнгмюра 1:1, но с высокой точностью подходили под модель связывания бивалентных аналитов. Увеличение фазы ассоциации путем увеличения длительности введения не влияло на рассчитываемые кинетические параметры. Величины равновесных констант диссоциации (Кс) с высокой точностью можно рассчитать для каждой конструкции путем обработки наблюдаемой реакции при насыщении в стационарной модели равновесия. Результаты, полученные для всех молекул, связывающих СО80, суммированы в табл. 5.
- 31 024877
Таблица 5
Иммобилизова нный белок Аналит Величина Ка для первого сайта (М ‘з ‘) Величина 10 для первого сайта и1) Величина Ка для второго сайта «') Величина 10 для второго сайта 4) Величина Ко (нМ)
СЭ80 абатасепт 5.5±0.02х105 0.006 0.00019 9 4+1108--:104 130±10
СЭ80 ЯЕО ГО N0:9 1.9+0.01х105 0.008 0.0045+0.0001 0.015+0.0003 233+27
СО80 8Е<2ГОЫО:13 0.36+0.002x10’ 7.4+0.047x104 0.0057 0.064 176+29
СЭ80 5Е<2 ГО N0:171 9.77+5.83х105 0.0145 0.0190 0.0434 37.5+9.5
СО80 5>Е<2 ГО ΝΟ: 173 12.1+6.81х105 0.0124 0.0207 0.0431 28.0+6.5
СО80 5Εζ> ГО N0:217 1.55+0.203x10’ 0.00373 0.00102 0.00332 13.3+6.2
СО80 ЯЕО ГО N0:219 0.908+0.307x10 5 0.00235 0.00406 0.00706 19.1+5.3
Равновесные значения аффинности для эксцепторных молекул определяли для сравнения с соответствующими значениями для абатасепта и опубликованным значением аффинности для СТЬА4-Рс (200 нМ; Огеепе е! а1. 1996, 1Ыб). Кинетические параметры связывания эксцепторной молекулы СТЬА4::РБЬ1 отличались от кинетических характеристик для абатасепта и х-рецепторной молекулы СТЬА4::1Ь-10, хотя после компенсации уровней ассоциации/диссоциации получали сходные значения аффинности. Это может быть следствием того факта, что ΡΌ-Ы связывает СБ80 с более слабой аффинностью, чем СТЬА4 (значение Кс составляет 2.5 мкМ). Аналогично предшествующим исследованиям, варианты СТЬА4, содержащие мутацию Ь104Е Ά29Υ (8ЕЦ ГО ΝΟκ: 217 и 219), обладали более высокой аффинностью по отношению к СБ80, с приблизительно двукратным улучшением в начальной величине константы диссоциации (0.00373 с-1 для 8ЕЦ ГО ΝΟ: 217 по сравнению с 0.006 с-1 для абатасепта).
Пример 10.
Анализ связывания эксцепторных молекул с СГО86 с помощью В1Асоте™.
Оценку активности связывания СГО86 проводили для абатасепта, гибридного белка состава СТЬА4Рс, содержащего мутации Ь104Е А29Υ, аналогичного белтасепту (8ЕЦ ГО ΝΟ: 217), эксцепторной молекулы, содержащей эктодомен СТЬА4 и домен ГО-10 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 9), эксцепторной молекулы, содержащей эктодомен СТЬА4 с мутациями Ь104Е А29У и домен ГО-10 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 219), и для различных конструкций (8М1Р, Р1М8 и эксцепторные молекулы), содержащих вариабельные участки антител 3Ό1 и ΡυΝ1, направленных против СГО86, по существу, в соответствии с описанным в настоящем документе. Связывание СГО86 СТЬА4 характеризуется низкой аффинностью (Кб ~2.2 дМ), высокой скоростью ассоциации (2-13х105 М-1 с-1) и не высокой скоростью диссоциации (0.42 с-1). Описано, что мутации Ь104Е А29У в составе СТЬА4-Рс повышают аффинность по отношению к СГО86 в четыре раза по сравнению с СТЬА4-Рс дикого типа (Ьаткеп е! а1. (2005), Ат. 1. Тгапкрйт!. 5:443-453) в основном путем снижения начальной скорости диссоциации (описанные как 0.00206 по сравнению с 0.00816 с-1). Вероятно, для антител 3Ό1 или ΡυΝ1 не существовало ранее опубликованных данных по кинетическим параметрам или равновесной аффинности, поэтому для них проводили определение относительных значений аффинности.
Домены, связывающие СБ86 с более низкой аффинностью, полученные на основе эктодомена СТЬА4.
Измерения НИР проводили с помощью В1Асоге™ Т100 НИР (РЬатташа Вю1есЬ АВ, иррка1а) с применением НВ8-ЕР+ (ОЕ НеаКЬсате) в качестве проточного буфера. СБ86-т1дО (25 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, рН 4.0, Апсе11, 1пс) иммобилизовали непосредственно на чипе СМ5 с помощью стандартной химии сопряжения аминов (В1асоте Атте СоирПпд Кй, ОЕ НеаЙЬсаге), со значениями итоговых уровней иммобилизации, составлявшими 37, 373 и 903 Ки. Конструкции, содержащие СТЬА4, вводили в течение 150 с, со скоростью потока, составлявшей 10 мкл/мин, в сериях концентраций, находившихся в
- 32 02487 интервале от 4 нМ до 10 мкМ. Диссоциацию наблюдали в течение 600 секунд, и поверхность восстанавливали путем введения 50 мМ цитрата натрия, 500 мМ хлорида натрия, рН 5.0, в течение 60 с (для СТЬА4 дикого типа) или 10 мМ глицином, рН 1.7 (Ь104Е А29У СТЬА4). Взаимодействия связывания с поверхностью и уровни иммобилизации были стабильны в течение по меньшей мере 100 восстановительных циклов. Данные анализировали с помощью программного обеспечения В1аЕуа1иа1юп для Т100 (уегзюп 2.0.1, ОЕ НеаНЪсаге). По причине низкой аффинности СТЬА4 по отношению к СИ86 и очень большой скорости ассоциации и диссоциации (значения, приведенные в литературных источниках, составляют 0.2-1.3х10б М-1 с-1 для ка и 0.42 с-1 для кб, что находится за пределом чувствительности прибора В1Асоге™ Т100), кинетические параметры связывания абатасепта с иммобилизованным СИ86 не удалось определить. Тем не менее, кинетические параметры связывания конструкций, содержащих Ь104Е А29У СТЬА4 (8ЕР ГО N0: 217; 8Е0 ГО N0: 219), с иммобилизованным СИ86 можно определить с приемлемой точностью путем обработки наблюдаемой реакции с помощью бивалентной модели аналитов. Величины равновесных констант диссоциации (Ко) с высокой точностью можно рассчитать для каждой конструкции путем обработки наблюдаемой реакции при насыщении в стационарной модели равновесия. Результаты приведены в табл. 6.
Домены, связывающие СИ86 с более высокой аффинностью, разработанные на основе вариабельных участков антител 3Ώ1 и Ри№.
Измерения НИР проводили аналогично приведенному выше описанию, со следующими исключениями: в качестве проточного буфера применяли НВ8-Р+ (ОЕ НеаОНсаге); диссоциацию наблюдали в течение 1200 с и поверхность восстанавливали путем введения 10 мМ глицина, рН 1.7, в течение 60 с. Кинетические параметры связывания с иммобилизованным СГО86 не возможно было определить во всех случаях. Тем не менее, величины равновесных констант диссоциации (Ко) с высокой точностью можно рассчитать для каждой конструкции путем обработки наблюдаемой реакции при насыщении в стационарной модели равновесия. Результаты приведены в табл. 6.
Т аблица 6
Иммобилизованный белок Аналит Величина Ка для первого сайта (мУ) Зеличина Кд для первого сайта (П Величина Ка дл5 второго сайта <п Величина Ка для второго сайта <П Величина Ко (нМ)
СИ86 абатасепт - -- 3200+1600
СИ86 5Εζ) ГО N0:217 0.847х105 0.01016 0.0298 0.0344 772+300
СИ86 5Εζ) ГО N0:219 0.451х105 0.00910±0.0001 0.011 0.0221 670±180
СИ86 3 ϋΐ 5ΜΙΡ 3.23х1О5 4.40+0.05х10'5 0.0055 0.0276 11.7+1.2
СИ86 3Εζ> ГО N0:189 9.74+0.066х105 7.06+0.04х10'5 0.0094 0.0462 26.5+2.9
СИ86 3Εζ> ГО N0:328 1.12х105 2.37+0.13х10'5 0.00077 0.00377 28.0+1.9
СИ86 3Εζ> ГО N0:185 6.17+0.12х105 8.30+0.12х10'5 0.0124 0.102 35.7+2.5
СИ86 ΡυΝΙ тАЬ 1.29+0.69х105 2.28+ОхЮ'5 0.00278 0.0154 36.0+5.5
СИ86 3Εζ> ГО N0:225 0.139±0.556х105 35.0х10'5 7.5х10'5 1.25±0.25х10'6 119+40
СИ86 3Εζ> ГО N0:227 1.86+0.951х105 13.9х10'5 0.00578 0.0127 26.9+5.4
СИ86 3Εζ> ГО N0:402 0.5х105 9.1х10'5 0.00113 0.00837 70.9+5.9
СИ86 ГО-10-1§ мыши 0.941х105 18х1О'5 0.0203 0.0722 50.6+7
СИ86 3Εζ> ГО N0:254 1.58х1О5 12.8х10'5 0.0064 0.0387 98.6+10
СИ86 3Εζ> ГО N0:258 0.407х105 43.3+1.2х10'5 0.0198 0.0579 88.5+15
СИ86 3Εζ> ГО N0:276 0.126х105 34.4х10'5 0.011 0.0111 178+18
Равновесные значения аффинности для абатасепта (3.2 мкМ) совпадали с описанной аффинностью по отношению к СТЬА4-Рс (2.2 мкМ; Огеепе е! а1. 1996, 1Ыб). Аналогично предшествующим исследованиям, варианты СТЬА4, содержащие мутацию Ь104Е А29У (8ЕР ГО N0: 217; 8Е0 ГО N0: 219), обладали в 4-5 раз более высокой аффинностью по отношению к СИ86 (670-772 нМ). Конструкции, содержащие одноцепочечные участки антитела 3Ώ1 мыши (зсРуз) на Оконце (3Ώ1 8М1Р, 8Е0 ГО N0: 317; 3П1::ГО-10, 8Е0 ГО N0: 189), обладали более высокой аффинностью (11.7, 26.5 нМ), чем соответствующие конструкции, содержащие 3Ώ1 зсРу на С-конце (3Ώ1 Р1М8, 8Е0 ГО N0: 319; 1Ь-10::3П1, 8Е0 ГО N0: 185); в ходе оценки кинетических параметров связывания, похоже, этому послужила причиной как более высокая начальная скорость ассоциации, так и более низкая скорость диссоциации, хотя во всех исследованных случаях аффинность по отношению к СИ86 была по меньшей мере в 100 раз выше, чем у абатасепта. Для антитела Ри№, родительское моноклональное антитело мыши исследовали вместе с белками 8М1Р, содержащими два одноцепочечных участка гуманизированного антитела Ρϋ№ (8Ер ГО N03: 225 и 227); для последнего из двух участков (8ЕР ГО N0: 227) были получены кинетические параметры связывания и общая аффинность по отношению к СГО86, сходные с родительским тАЬ РЕМ (26.9, 36 нМ соответственно), что снова было значительно выше, чем соответствующие характеристики абатасепта. Эксцепторные молекулы или Р1М8, содержащие участки гуманизированного антитела РЕМ на карбоксиконце (1Р-10::Ри№-21, 8Р() ГО N0: 254; (ГО-10 187А::Ри№-21)-75, 8Рр ГО N0: 258; (шарнирная область моно-ГО-10-А2::РиМ-21)-75, (8Ер ГО N0: 276); РШ1-21 Р1М8, 8Р() ГО N0: 402),
- 33 024877 обладали более низкой аффинностью, чем эксцепторные молекулы, содержащие последовательность родительского антитела на аминоконце (Ри№::ГО-10, δΕ^ ГО N0: 187)) или ту же самую последовательность связывания риШ-21 в составе белка δМIΡ (δΕ^ ГО N0: 227).
Пример 11.
Анализ связывания эксцепторных молекул с СБ86 мыши с помощью В^сот™.
Оценку активности связывания СБ86 мыши проводили для абатасепта, гибридного белка СТБА4Рс, содержащего мутации Ρ104Ε А29У, аналогичного белатасепту (δΕ^ ГО N0: 217), двух эксцепторных молекул, содержащих различные линкеры ВБ2 и одинаковые домены СТБА4 и ГО-10 (δΕ^ ГО N08: 171 и 173), эксцептора, содержащего эктодомен СТБА4 с мутациями Ρ104Ε А29У и домен ГО-10 (δΕ^ ГО N0: 219), СТБА4 мыши, соединенный с Рс-фрагментом человека (δΕ^ ГО N0: 404), и различных конструкций, содержащих вариабельные участки антитела С1.1 крысы, направленного против СБ86 мыши, включая два эксцептора, содержащих участок антитела СБ1 и домен ГО-10 человека (СЬ1::ГО-10, δΕ^ ГО N0: 252 и ГО-10::СЬ1, δΕ^ ГО N0: 256), по существу, согласно приведенному ниже описанию. Известно, что СТБА4 вступает в перекрестные взаимодействия с СБ86 мыши, но, насколько известно, ранее не были описаны какие-либо кинетические параметры или результаты измерений аффинности. Также был описан тот факт, что антитело СБ1 крысы обладает специфичностью по отношению к СБ86 мыши, но не были приведены какие-либо кинетические параметры или результаты измерений аффинности. Измерения ПИР проводили с помощью В^сот™ Т100 ППР (РНагтас1а Вю!есН АВ, иррка1а) с применением ΗΒδ-ΕΡ+ ^Ε неа1!йсаге) в качестве проточного буфера. С^86-тIдС мыши (25 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, рН 4.0, Р&Б δу8!ет8, ГОс) иммобилизовали непосредственно на чипе СМ5 с помощью стандартной химии сопряжения аминов (В1асоге Атте СоирНпд Кй, СΕ неа1!Нсаге), с итоговыми значениями уровней иммобилизации, составлявшими 150, 493 и 746 Ри. Конструкции, содержащие СТБА4, вводили в течение 150 с, со скоростью потока, составлявшей 10 мкл/мин, в сериях концентраций, находившихся в интервале от 4 нМ до 8 мкМ. Диссоциацию наблюдали в течение 600 с (для конструкций, содержащих СТБА4) или 1200 с (для конструкций, содержащих СБ1) и поверхность восстанавливали путем введения 10 мМ глицина, рН 1.7, в течение 60 с. Взаимодействия связывания с поверхностью и уровни иммобилизации были стабильны в течение по меньшей мере 100 циклов восстановления. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения Β^аΕνа1иа!^оη для Т100 (версии 2.0.1, СΕ неа1!йсаге). Кинетические параметры связывания с иммобилизованным СБ86 мыши можно определить для всех конструкций и с высокой точностью обработать с помощью бивалентной модели аналитов (табл. 7). Величины равновесных констант диссоциации (Ко) также с высокой точностью можно рассчитать для каждой конструкции путем обработки наблюдаемой реакции при насыщении в стационарной модели равновесия. Для вариантов СТБА4 (δΕ^ ГО N08: 171, 173, 217, 219 и 404), одинаковые равновесные выравнивания по всем трем проточным кюветам при трех значениях плотности при иммобилизации позволили получить более точные результаты, чем выравнивание по одной проточной кювете (так называемое множественное выравнивание Ртах), приведены значения аффинности, полученные таким образом. Результаты приведены в табл. 7.
Таблица 7
Иммобилизованный белок Аналит Величина Ка для первого сайта (МА1) Величина Ка для Величина Ка для Величина Величина Ко (нМ)
первого сайта (к’1) второго сайта (У) Ка для второго сайта (У)
СИ86 мыши 5Εζ) ИЗ N0:171 0.104х105 0.0241 0.0398 0.0627 1540+210
СИ86 мыши 5Εζ) ГО N0:173 0.132х105 0.0228 0.0405 0.0625 1810+230
СИ86 мыши 5Εζ) ГО N0:217 0.278х105 0.0787 0.0728+0.0023 0.168 920+88
СИ86 мыши 5Εζ) ГО N0:219 0.321х105 0.0418 0.00026 0.00193 870+160
СИ86 мыши СТЬА4-1§ мыши 0.278х105 0.0386 0.000659 0.00311 2250+190
СИ86 мыши ОЬ 1 тАЪ 0.789+0.346х105 Ю.бхЮ’5 0.00879 0.00635 37.7+4.4
СИ86 мыши ОЬ 1 5ΜΙΡ 1.18±0.427х105 6.2х10'5 0.00964+0.00031 0.0185 26.2+5.4
СИ86 мыши ОЬ 1 ΡΙΜ5 1.77х105 1.25х10'4 0.0431 0.0977 78.3+20
СИ86 мыши 5Е0 ГО N0:252 2.19х105 1.9Χ10·4 0.00943 0.0182 86.4+8.3
СИ86 мыши 5Εζ) ГО N0:256 6.73х104 4.4х10’5 0.0271 0.088 95.1+13
Эксцепторные молекулы, содержащие домены СТБА4 человека и ГО-10 человека (δΕρ ГО N08: 171 и 173), обладали несколько более высокой аффинностью по отношению к СБ86 мыши (1.54, 1.81 мкМ), чем приведенное значение аффинности для СТБА4-Рс человека по отношению к Нитап СБ86 (2.2 мкМ; Сгеепе е! а1. 1996). Значения аффинности для вариантов СТБА4 человека, содержащих мутацию Ι.104Ε А29У (δΕ^ ГО N08: 217 и 219), по отношению к СБ86 мыши, превышали значения для дикого типа лишь в два раза (870-920 нМ); причиной этому, похоже, может служить сочетание благоприятствующей более
- 34 024877 высокой начальной скорости ассоциации для СЭ86 мыши и неблагоприятной более высокой начальной скорости диссоциации. Похоже, что СТБА4 мыши обладает аналогичной или несколько более слабой общей аффинностью по отношению к СГО86 мыши, чем СТБА4 человека. Для антитела ОЬ1 родительское моноклональное антитело исследовали с 8М1Р, содержащим одноцепочечный участок антитела ОЬ1 (ОЬ1 8М1Р, 8ЕЦ ГО N0: 239); для обеих молекул получили сходные параметры связывания и значения общей аффинности по отношению к СГО86 мыши (37.7, 26.2 нМ соответственно), значительно превышающие (примерно— в 50 раз) значения, полученные для конструкций, содержащих СТБА4 мыши. Для эксцепторных молекул, содержащих ГО-10 и участки антитела 0Ь1 (8ЕЦ ГО N08: 252 и 256), получили значения аффинности по отношению к СГО86 мыши в 3 раза ниже значений для родительского антитела или 8М1Р, хотя причиной этому, похоже, может служить как пониженная начальная скорость ассоциации, так и скорость диссоциации во всех исследованных случаях.
Пример12.
Анализ связывания эксцепторных молекул с РИ1 с помощью В1Асоге™.
Оценку активности связывания ΡΌ1 проводили для РЭЫ-Рс (8ЕЦ ГО N0: 268) и РИЬ2-Рс (8ЕЦ ГО N0: 270), а также для эксцепторных молекул, содержащих эктодомен СТБА4 и участки РИЬ1 (8ЕЦ ГО N0: 13) или РИЬ2 (8ЕЦ ГО N0: 336), по существу, следующим способом. Описано, что в общем случае связывание РЮ1 с РИЬ2 обладает большей аффинностью, чем связывание Р01 с РИЬ1; результаты предшествующих анализов кинетических параметров (Уоипдпак е! а1., (2003) ВюсНет. Вюрйу8. Ке8. СомМ. 307, 672) предлагают средние значения аффинности (112 нМ для РИЬ1, 37 нМ для РИЬ2), тогда как результаты равновесного анализа, произведенного в альтернативной форме (Вийе е! а1., (2007), 1ММипйу 27, 111) предлагают более слабые значения аффинности (770 нМ для РИЬ1, 590 нМ для РИЬ2).
Измерения НИР проводили с помощью В1Асоге™ Т100 НИР (Рйагташа Вю1есН АВ, Ирр8а1а) с применением НВ8-Р+ (ОЕ Неаййсаге) в качестве проточного буфера. Конструкцию, содержащую эктодомен РИ1, соединенный с С-концевой А'ГГад™ (8ЕЦ ГО N0: 406), изначально подвергали биотинилированию с помощью фермента ВиА (А'1бйу, 1пс., Аигога, С0) в 10 мМ Тп8, рН 8.0 и буфер заменяли на ФСБ. Нейтравидин (100 мкг/мл в 10 мМ ацетата натрия, рН 4.0, Тйегто 8шепййс, Коск&гб, ГО), иммобилизованный непосредственно на чипе СМ5 с применением стандартной химии сопряжения аминов (В1асоге Атте Соирйпд Кй, ОЕ Неаййсаге), с итоговыми уровнями иммобилизации, составлявшими 191, 771 и 1522 Ки, применяли для захвата биотинилированного РИ1, значения уровней иммобилизации для которого составляли 171, 597 и 1244 Ки соответственно. Конструкции, содержащие РИЬ1/2, вводили в течение 120 с, со скоростью потока, составлявшей 30 мкл/мин, в сериях концентраций, находившихся в интервале от 6 нМ до 2 мкМ. Диссоциацию наблюдали в течение 1200 с и поверхность восстанавливали путем введения 50 мМ №0Н, 1 М №С1 в течение 30 с. Взаимодействия связывания с поверхностью и уровни иммобилизации были стабильны в течение по меньшей мере 50 восстановительных циклов.
Данные анализировали с помощью программного обеспечения для Т100 (версии 2.0.1,
ОЕ Неаййсаге). Кинетические параметры связывания с иммобилизованным РИ1 можно определить для всех конструкций и с высокой точностью обрабатывать как с применением бивалентной модели аналитов (8ЕЦ ГО N08: 268 и 270), так и с помощью модели связывания 1:1 (8ЕЦ ГО N08: 13 и 336) (табл. 8). Величины равновесных констант диссоциации (Кс) также с высокой точностью можно рассчитать для каждой конструкции путем обработки наблюдаемой реакции при насыщении в стационарной модели равновесия. Результаты приведены в табл. 8.
Таблица 8
Иммобилизованный белок Аналит Величина Ка дляВеличина Величина ДЛЯ второго сайта «‘) Величина Кд для второго сайта го1) Величина Ко (нМ)
первого сайта (М_18_1) Кд для первого сайта (<‘)
РИ1 5Е<ЗГО N0:13 0.699х105 0.165 н/о н/о 2360**
РШ 5Е(2 ГО N0:336 1.16х1О5 0.0395 н/о н/о 340**
РЭ1 ЗЕ<2 ГО N0:268 0.96+0.54х105 0.0544 3.18х10‘6 0.000191 246+27
РШ РПЫ-Ес 1.07х105 0.010 н/о н/о 112**
РШ ЗЕО ГО N0:270 1.65хЮ5 0.00724 0.0352 0.395 42+4.4
Ρϋΐ 1ГО1 2-Нс* 1.22х1О5 0.0032 н/о н/о 26**
*Значение, полученное из литературного источника Доипдпак е! а1., (2003), ВюсНет. ВюрНу8. Ке8. Сотт. 307, 672).
** Значение кинетической Кс, рассчитанное на основе значений ка и кз для первого сайта.
- 35 Μ4»ΊΊ
Для РОЫ-Рс (δΕφ ГО ΝΟ: 268) и РОЬ2-Рс (δΕΟ ГО ΝΟ: 270) получили кинетические параметры связывания и общие значения аффинности, сходные со значениями, приведенными в литературе. Эксцепторные молекулы, содержащие СТЬА4, участки РОЬ1 или РОЬ2 в составе которых соединены с карбоксиконцом молекулы (δΕΟ ГО ΝΟ8: 13 и 336), обладали значительно более слабой (примерно в 10 раз) аффинностью по отношению к РЭ1 (2.36, 0.34 мкМ), чем молекулы, полученные в результате слияний с РОЫ/РОБ2 по аминоконцу (246, 42 нМ); причиной этому служит, в первую очередь, значительное повышение начальной скорости диссоциации (0.165, 0.0395 по сравнению с 0.0544, 0.00724), что говорит о том, что комплекс Р0Ь1/2:Р01 может быть нестабилен, если связывающий домен находится в положении ΒΌ2 (на карбоксиконце).
Пример 13.
Блокирование эксцепторными гибридными белками реакций, опосредованных Т-клетками человека.
Данный пример демонстрирует тот факт, что эксцепторные гибридные белки согласно настоящему изобретению способны блокировать реакции, опосредованные Т-клетками, в организме человека. Для исследования блокирования эксцепторными гибридными белками применяли реакцию смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ). Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК), полученные от двух доноров, выделяли с применением стандартных методик и хранили раздельно. На основе предыдущих исследований МКПК, полученные от одного донора, обозначали как популяцию Респондер, а МКПК, полученные от второго донора, обозначали как популяцию Стимулятор. В обе популяции донорных МКПК вносили метку СРδΕ с помощью общепринятых методик. Для предотвращения деления клеток МКПК-респондер обрабатывали митомицином-С (ММС). ММС ^1дта # М4287-2 мг) восстанавливали в стерильной дистиллированной воде (ОЛсо # 15230) в концентрации, составлявшей 0.5 мг/мл. МКПМ-стимулятор суспендировали в концентрации, составлявшей 1х106 клеток/мл в полной среде для культивирования (СМ), (КРМЫ640, содержащая 10% сыворотки В человека, 100 υ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ Ь-глутамин, ХЕАА, Ш-пируват, СМ 0.2 мкм фильтрованный) и добавляли ММС, итоговая концентрация которого составляла 25 мкг/мл. После этого смесь ПКПК-стимулятор/ММС инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 30 мин, после чего клетки отмывали три раза в СМ. Клетки популяции-респондера и популяции-стимулятора ресуспендировали в концентрации, составлявшей 4х106 клеток/мл в СМ и 0.05 мл каждой популяции клеток вносили на 96-луночный плоскодонный планшет для культуры ткани в итоговой концентрации, составлявшей 2х105 клеток/лунку/донор. Все образцы молекул в заданных концентрациях, приведенных на фигурах, вносили на планшет одновременно с клетками (примечание: концентрации, приведенные для антител и гибридных белков, представляют собой молярные эквиваленты). Реакцию СКЛ (96-луночный планшет с внесенными на него МКПК и исследуемыми молекулами) инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение эксперимента. Урожай клеток, полученный в ходе реакции СКЛ, собирали на 7-8 дни и клетки окрашивали с помощью антител с флуоресцентной меткой, направленных против СГО5 (е-Вю8аепсе) и СГО25 (ΒΌ Вю8аепсе8), и пропускали через проточный цитометр (ΕδΚ II, Вес!оп ЭКкещоп). Данные анализировали с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии Р1о\\2о (Тгее8!аг). Применяли следующую стратегию установки окна: клетки, попадавшие в окно лимфоцитов РδС:δδС, анализировали на экспрессию СГО5, клетки, которые затем попадали в окно СГО5+, анализировали на титр СРδΕ и повышенную регуляцию СГО25. Клетки СГО5+, СРδΕ1ο и СО25ЫдЬ относили к активированным Т-клеткам.
На фиг. 16, 17, 21 и 22 показано, что многие различные формы эксцепторных гибридных белков, содержащих антагонист СГО86 в сочетании с гетерологичным связывающим доменом, способны блокировать ответ, опосредованный Т-клетками, в условиях Респондер/Стимулятор в реакции СКЛ.
Пример 14.
Блокирование эксцепторными молекулами, обладающими антагонистическими свойствами по отношению к СГО86, реакций, опосредованных Т-клетками мыши.
Спленоциты мыши двух биологических рас мышей, С57БР/6 (или Β6Ω2Π) и ΒΑ^Β/с, выделяли с помощью метода скальпель/нейлоновой ячейки и лизиса эритроцитов. На основе предыдущих исследований спленоциты, полученные от мышей ί.'57ΒΡ/76 (или Β6Ο2Π), обозначали как популяцию Респондер, а спленоциты, полученные от мышей ΒΑ^Β/с, обозначали как популяцию Стимулятор. В спленоциты, полученные от обеих линий мышей, вносили СРδΕ метку в соответствии с описанным ранее. Для предотвращения деления клеток спленоциты популяции-стимулятора обрабатывали митомицином-С (ММС). ММС ^1дта #М4287-2 мг) восстанавливали в стерильной дистиллированной воде (ОЛсо # 15230) в концентрации 0.5 мг/мл. Популяцию спленоцитов-стимулятор суспендировали в концентрации, 5х107 мл в полной среде для культивирования (СМ), (КРМЕ1640, содержащая 10% ФСБ, 100 υ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ Ь-глутамина, ХЕАА, №-пируват и 0.05 мМ 2-меркаптоэтанол) и добавляли ММС до итоговой концентрации 50 мкг/мл. Затем смесь спленоцитов из популяции-стимулятора с ММС инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение 20 мин, после чего клетки отмывали три раза в СМ. Клетки популяции респондера и стимулятра суспендировали в концентрации, составлявшей 8х106 клеток/мл в СМ, и 0.05 мл каждой из популяций клеток вносили на 96-луночный
- 36 024877 плоскодонный планшет для культуры ткани в итоговой концентрации, составлявшей 4х105 клеток/лунку/расы. Все исследуемые молекулы в заданных концентрациях, приведенных на фиг. 18-20, вносили на планшет одновременно с клетками (примечание: концентрации, приведенные для антител и гибридных белков, представляют собой молярные эквиваленты). После этого реакцию СКЛ (на 96-луночном планшете с внесенными на него спленоцитами/исследуемыми молекулами) инкубировали при 37°С, 5% СО2, в течение эксперимента. Урожай клеток, полученный в ходе реакции СКЛ, собирали на 4-5 дни и клетки окрашивали антителами с внесенными флуоресцентными метками, направленными против СГО5 (ВИ Вю8С1епсе8) и СЭ25 (ВИ Вю8аепсе8), и пропускали через проточный цитометр (ЬЗК II, Вес!оп Июкещоп). Данные анализировали с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии Но\\йо (ТгееЗ!аг). Применяли следующую стратегию установки окна: клетки, попадавшие в окно лимфоцитов РЗС:ЗЗС, анализировали на экспрессию СЭ5, клетки, которые затем попадали в окно СЭ5+, анализировали на титр СРЗЕ и повышенную регуляцию СЭ25. Клетки СЭ5+, СРЗЕ1оте и ί'Ό25Ιιι?|1 относили к активированным Т-клеткам.
На фиг. 16, 17, 21 и 22 показано, что многие различные формы эксцепторных гибридных белков, содержащих антагонист СГО86 в сочетании с гетерологичным связывающим доменом, способны блокировать ответ, опосредованный Т-клетками, в условиях Респондер (В6И2Е1)/Стимулятор (ВАЬВ/с) в реакции СКЛ.
Пример 15.
Иммуностимулирующая активность эксцепторных молекул, содержащих ГЬ-10.
Оценку иммуностимулирующей активности ГЬ-10 в составе различных эксцепторных гибридных белков проводили в ходе анализа пролиферации клеток ш \Дго. В частности, тучные клетки печени мыши линии МС/9 применяли следующим способом: клетки линии МС/9 (Атепсап Туре СиДиге СоДесДоп #СКЬ-8306) выращивали в ИМЕМ или КРМ1 с добавлением 10% ФСБ и 5% Ка! Т-ЗТ1М (ВИ # 354115). Клетки МС/9 отмывали и оставляли в среде без Ка! Т-ЗТ1М на ночь (инкубировали при 37°С, 5% СО2, на 96-луночном плоскодонном планшете, в концентрации 1 х 105 клеток/лунку, 100 мкл/лунку). Белок ГЬ-10 и эксцепторные гибридные белки инкубировали в различных концентрациях в течение 24 ч и пролиферацию измеряли путем введения [3Н]тимидина через 6 ч.
Известно, что вариант 187 ГЬ-10 обладает меньшей иммуностимулирующей активностью по сравнению с 1Ь-10 дикого типа (Ишд е! а1., 1. Ехр. Мей. 191:213, 2000). Обычно 1Ь-10 образует гомодимер с аминоконцевым участком каждой мономерной молекулы путем связывания с карбоксиконцевым участком другого мономера). Вариант 187 ГЬ-10 (187А и 187З), вместе с молекулой ГЬ-10, включающей короткий линкер (ддд8дд; ЗЕР ГО N0: 379), разделяющий два фрагмента ГО-10, дающий возможность указанным доменам образовывать внутримолекулярный димер, исследовали как эксцепторные молекулы, по признаку иммуностимулирующей активности.
На фиг. 23 показано, что ГО-10 мыши способен усиливать пролиферацию клеток МС/9 в большей степени, чем эксцепторная молекула СТЬА4::ГО-10-187А (ЗЕр ГО N0: 191), включающая одиночную мутацию в 87 аминокислотном положении в составе ГО-10. На фиг. 24 показано, что, как ГО-10 человека, так и (СТЬА4::ГО-10)-75 (ЗЕр ГО N0: 173), способны усиливать пролиферацию клеток МС/9 в большей степени, чем СТЬА4::ГО-10-187А (ЗЕр ГО N0: 191) или СТЬА4::моно-ГО-10 (ЗЕр ГО N0: 181).
Пример 16.
Конструирование эксцепторных молекул с направлением их на определенные типы клеток.
В данном примере описан процесс конструирования эксцепторных гибридных белков с направлением их на определенные типы клеток, указанного эффекта достигают путем улучшения аффинности ВИ1 и ВИ2. Были сконструированы четыре эксцепторные молекулы с различной аффинностью по отношению к СГО86 и ГО-10К1 человека. В табл. 9 приведены различные отношения аффинности для указанных четырех молекул. Путем улучшения аффинности по отношению к СГО86 с помощью, например, домена, связывающего СГО86 (например, 3Ό1 или гуманизированного РИ№), и сконструированной молекулы ГО-10 (187А) с более низкой аффинностью по отношению к ГО-10К1 человека, подобное расположение можно применять для улучшения действия, направленного на определенный целевой тип клеток, например на АПК.
- 37 024877
Таблица 9
СБ86 1Ь-1ОК1 1Ы0К1/ СЭ86
Βϋΐ Βϋ2 Аффинность (нМ) Аффинность (нМ) Отношение аффинности
СТБА4 1Ы0 2000* 0.1* 0.00005
СТБА4 1Ы0 187 А 2000* Чо* 0.005
Анти-СО86 1Ь-10 40* Чвг 0.0025
Анти-СО86 11-10 187 А 40* 40я 0.25
* Приблизительные равновесные значения аффинности, полеченные в ходе частных измерений связывания СТАД, 3Б1 и гуманизированного ΡυΝ1 с СБ86.
& Приблизительное значение аффинности на основе данных приведенных у 1ап е! а1. (I. Вю1. СЬет. 268: 21053, 1993) # Приблизительное значение аффинности на основе данных приведенных у Бт§ е! а1. (I. Е\р. Мей. 191: 213, 2000).
Пример 17.
Активность эксцепторных молекул ш νί\Ό в моделях ревматоидного артрита животных.
Ревматоидный артрит.
Оценку терапевтической эффективности любой из молекул эксцепторов, описанных в настоящем документе, проводят по меньшей мере на двух моделях ревматоидного артрита мыши (РА), а именно - на моделях коллаген-индуцированного артрита (С1А) и глюкоза-6-фосфат изомеразы (Ο6ΡΙ). Было показано удобство каждой из указанных моделей для прогноза эффективности отдельных классов терапевтических препаратов при РА (см. Но1тйаЬ1 (2000), АйЬгЫк Кек. 2:169; Но1тйаЬ1 (2006), 1ттипо1. Ье!!. 103:86; Но1тйаЬ1 (2007), Ме!Ьойк Мо1. Мей. 136:185; МсОсуНГ Н. (2000), АйЬгШк Кек. 2:85; Катгай! апй 8сЬиЬег1 (2005), АйЬгЫк Кек. ΤΙκγ. 7:20).
(а) Модель С1А.
Модель С1А является наиболее подробно описанной моделью артрита мышей с точки зрения патогенеза и иммунологической основы. Также она представляет собой наиболее широко применяемую модель РА, и, хотя не является совершенной для прогнозирования способности лекарственных препаратов к ингибированию заболевания в организме пациентов, многими она считается предпочтительной моделью для исследования потенциальных новых лекарственных средств, применяемых при РА (ЛгЬоЬ е! а1. (2001), АйЬгЫк Кек. 3:87; Уап йеп Вегд, \У.В. (2002), Сигг. КЬеита!о1. Кер. 4:232; Кок1отес (2003), Со11адеп-1пйисей АйЬгЫк. 1п Сиггеп! Рго!осо1к ш 1ттипо1оду, ейк. СоЬдап е! а1., 1оЬп \УПеу & §опк, 1пс, НоЬокеп, ΝΤ).
В модели С1А артрит вызывают при помощи иммунизации самцов мыши ЭВА/1 коллагеном II (С11) с полным адъювантом Фрейнда (СРА). В частности, мышам чрескожно/подкожно вводили С11 с СРА на 21 день, делали бустерную инъекцию С11 с неполным адъювантом Фрейнда (1РА) на 0 день. У мышей развивались клинические признаки артрита в течение дней бустерной инъекции С11/1РА. В субпопуляции мышей (0 до 10%), иммунизированных С117СРА, развивались признаки артрита на 0 день или приблизительно на 0 день без бустерной инъекции, и их исключали из эксперимента. В некоторых экспериментах с С1А, бустерную инъекцию исключали и вместо этого мышей подвергали воздействию Эксцептора или контроля начиная с 21 дня после иммунизации Си/СРА (т.е. день первого введения является 0 днем).
Мышей подвергали воздействию эксцепторной молекулы, среды (ФСБ) или отрицательного или положительного контроля в профилактическом и/или терапевтическом режиме. Профилактическое воздействие начинают на 0 день и продолжают в ходе пика заболевания у контрольных (не подвергнутых воздействию) мышей. Терапевтическое воздействие начинают, когда у большинства мышей появляются слабые признаки артрита. Энбрель®, для которого была доказана высокая эффективность в моделях артрита С1А и артрита, вызываемого О6Р1, применяли в качестве положительного контроля. Данные, полученные в ходе каждого эксперимента, включают клинические показатели и кумулятивную частоту возникновения артрита. Клинические признаки артрита в модели С1А оценивали по шкале от 0 до 4, как показано в табл. 10.
- 38 024877
Таблица 10
Оценка Наблюдения
0 Отсутствие явной опухоли или покраснения
1 Опухоль/покраснение одного-трех пальцев
2 Покраснение и/или опухоль более трех пальцев, легкая опухоль, распространяющаяся по лапе, распухание или покраснение лодыжки или легкое распухание/покраснение передней лапы
3 Распухшая лапа с покраснением от легкого до среднего
4 Сильное покраснение и опухоль целой лапы
(Ъ) Модель С6РБ.
В модели С6РБ артрит вызывают путем иммунизации мышей ЭВЛ/1 С6РБ с адъювантом (Катгаб! апб ЗсЬиЪей (2005), Агйгйк Кек. ТЬег. 7:20; ЗсЬиЪей е! а1., (2004), Б. Бттипо1. 172:4503; Воскегтапп, К. е! а1. (2005), АгБЬгШк Кек. ТЬег. 7:К1316; БтапатБ е! а1., (2008), АгЙгШк КЬеит. 58:754; Ма!кито!о е! а1., (2008), АгБЬгШк Кек. ТЬег. 10:К66). С6РБ представляет собой фермент, присутствующий фактически во всех клетках организма и не известно, по какой причине иммунизация вызывает специфичные заболевания суставов. Для некоторых агентов, например СТЬА4-Б§, антагонисты ФНО (например, Энбрель®) и моноклональные антитела, направленные против БЬ-6, была доказана способность ингибировать развитие артрита в модели С6РБ.
Самцов ЭВА/1 иммунизируют С6РБ с полным адъювантом Фрейнда (СРА) для стимулирования развития артрита. В частности, мышам чрескожно/подкожно вводили С6РБ с СРА на 0 день, и клинические признаки артрита развивались в течение дней иммунизации. Как в случае модели СБА, описанной выше, мышей подвергали воздействию эксцепторной молекулы, среды (ФСБ) или отрицательного или положительного контроля в профилактическом и/или терапевтическом режиме. Профилактическое воздействие начинают на 0 день и продолжают в течение пика заболевания у контрольных мышей. Терапевтическое воздействие начинают тогда, когда у большинства мышей появлялись слабые признаки артрита. Энбрель®, для которого была доказана высокая эффективность в моделях артрита СБА и артрита, вызываемого С6РБ, применяли в качестве положительного контроля. Данные, полученные в ходе каждого эксперимента, включают клинические показатели и кумулятивную частоту возникновения артрита. Клинические признаки артрита в модели С6РБ оценивали по шкале, сходной с применяемой в модели СБА.

Claims (29)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Мультиспецифичный гибридный белок для ингибирования активности Т-клеток или блокирования реакций, опосредуемых Т-клетками, содержащий домен, связывающий СГО86, соединенный с гетерологичным связывающим доменом посредством промежуточного домена, характеризующийся тем, что указанный гетерологичный связывающий домен представляет собой агонист БЬ-10.
  2. 2. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что домен, связывающий СГО86, представляет собой эктодомен СТЬА-4 или субдомен эктодомена СТБА4.
  3. 3. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что домен, связывающий СЭ86, представляет собой РаЪ, ксРу, доменное антитело или антитело, состоящее только из тяжелой цепи, обладающее специфичностью по отношению к СГО86.
  4. 4. Мультиспецифичный гибридный белок по п.3, отличающийся тем, что домен, связывающий СГО86, содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела РиХ1, направленного против СГО86, или его гуманизированного варианта.
  5. 5. Мультиспецифичный гибридный белок по п.4, отличающийся тем, что домен, связывающий СГО86, содержит аминокислоты 1-258 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 187 или 237.
  6. 6. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что домен, связывающий СГО86, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 81®) ГО N0^ 3-6, 410 и 412.
  7. 7. Мультиспецифичный гибридный белок по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанный агонист БЬ-10 содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 7 или ее вариант, содержащий точечную мутацию в положении 87 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 7, где аминокислотный остаток в положении 87 представляет собой аланин, глицин, валин, лейцин, пролин, фенилаланин, тирозин, триптофан, серин, треонин, цистеин, метионин, аспарагин, глютамин, лизин, аргинин, гистидин, аспартат или глютамат.
  8. 8. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный промежуточный домен содержит константную область иммуноглобулина или фрагмент константной области иммуноглобулина, расположенные между указанными доменом, связывающим СГО86, и гетерологичным связывающим доменом.
  9. 9. Мультиспецифичный гибридный белок по п.8, отличающийся тем, что указанная константная
    - 39 024877 область иммуноглобулина или фрагмент константной области иммуноглобулина содержат домены СН2 и СН3 Ι8θ1.
  10. 10. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный промежуточный домен содержит константную область иммуноглобулина, расположенную между первым и вторым линкерами, причем указанные первый и второй линкеры содержат последовательности, независимо выбранные из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО5: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 и 383-398.
  11. 11. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный промежуточный домен содержит следующую структуру, в направлении от Ν-конца к С-концу: -Ь1-Х-Ь2-, где Ь1 и Ь2 независимо представляют собой линкер, содержащий от приблизительно 2 до приблизительно 150 аминокислот; и Х выбран из группы, состоящей из константной области иммуноглобулина, фрагмента константной области иммуноглобулина, альбумина, трансферрина и каркасного домена, связывающего белок сыворотки.
  12. 12. Мультиспецифичный гибридный белок по п.11, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина или фрагмент константной области иммуноглобулина содержит домены СН2 и СН3
    Ι§Ο1.
  13. 13. Мультиспецифичный гибридный белок по п.11, отличающийся тем, что Ь1 представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина человека и, необязательно, один или более остатков цистеина в составе указанного шарнирного участка иммуноглобулина человека заменены на другую аминокислоту.
  14. 14. Мультиспецифичный гибридный белок по п.11, отличающийся тем, что X представляет собой Рс-фрагмент Ι§01 человека или по меньшей мере один домен СН из его состава.
  15. 15. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный промежуточный домен содержит домен димеризации.
  16. 16. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, имеющий следующее строение:
    ^ВП1-Х-Ь2-ВП2-С, где ВЭ1 представляет собой домен, связывающий СЭ86, причем указанный домен, связывающий СГО86, по меньшей мере приблизительно на 90% идентичен эктодомену СТЬА-4;
    -Х- представляет собой -Ь1-СН2СН3-, где Ь1 представляет собой шарнирный участок 1§О1 и -СН2СН3представляет собой домены СН2СН3 Рс-фрагмента Ι§Ο1;
    Ь2 представляет собой линкер, выбранный из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО5: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 и 383-398; и
    ВЭ2 представляет собой агонист ГО-10.
  17. 17. Мультиспецифичный гибридный белок по п.16, где Ь1 представляет собой шарнирный участок 1дС1, подвергнутый мутации замены первого остатка цистеина.
  18. 18. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что указанный гибридный белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕО ГО Ю8: 9, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 237, 239, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 276, 302, 330, 334, 350, 352 и 354.
  19. 19. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что домен, связывающий СГО86, содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где тяжелая цепь содержит СГОКЕ имеющий последовательность ЗЕО ГО NО: 308, СГОК2, имеющий последовательность ЗЕО ГО NО: 309, и СГОК3, имеющий последовательность ЗЕО ГО NО: 310, и где легкая цепь содержит СЭК.1, имеющий последовательность ЗЕО ГО NО: 311, СГОК2, имеющий последовательность ЗЕО ГО NО: 312, и СГОК3, имеющий последовательность ЗЕО ГО NО: 313.
  20. 20. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что агонист ГО-10 представляет собой моно-ГО-10.
  21. 21. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что агонист ГО-10 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей ЗЕО ГО 380-382.
  22. 22. Мультиспецифичный гибридный белок по п.1, отличающийся тем, что промежуточный домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей ЗЕО ГО 409 и 415-417.
  23. 23. Мультиспецифичный гибридный белок по п.10, отличающийся тем, что первый линкер выбран из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО5: 89, 100 и159-164.
  24. 24. Полинуклеотид, кодирующий мультиспецифичный гибридный белок по п.1.
  25. 25. Полинуклеотид по п.24, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ЗЕО ГО NО5: 8, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 236, 238, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 265, 275, 301, 329, 333, 349, 351 и 353.
  26. 26. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.24, функционально связанный с последовательностью, контролирующей экспрессию.
  27. 27. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.26.
  28. 28. Способ лечения заболевания, ассоциированного с СГО86, ГО-10 или их комбинацией, у субъекта,
    - 40 024877 включающий введение терапевтически эффективного количества мультиспецифичного гибридного белка по п.1.
  29. 29. Способ лечения субъекта с аутоиммунным заболеванием, выбранным из группы, состоящей из ревматоидного артрита, юношеского ревматоидного артрита, астмы, системной красной волчанки, воспалительного заболевания кишечника (включая болезнь Крона и язвенный колит), реакции трансплантатпротив-хозяина, псориаза, множественного склероза, дерматомиозита, полимиозита, злокачественной анемии, первичного билиарного цирроза, острого диссеминированного энцефаломиелита, болезни Аддисона, анкилозирующего спондилита, антифосфолипидного синдрома, аутоиммунного гепатита, диабетического миелита 1 типа, синдрома Гудпасчера, болезни Грейвса, синдрома Гийена-Барре, тиреоидита Хашимото, идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, красной волчанки, обыкновенной пузырчатки, синдрома Шегрена, темпорального артрита (также известного как узелковый периартериит), аутоиммунной гемолитической анемии, буллезного пемфигоида, васкулита, глютеновой энтеропатии, эндометриоза, гнойного гидраденита, интерстициального цистита, очаговой склеродермии, склеродермии, нарколепсии, нейромиотонии, витилиго и аутоиммунного заболевания внутреннего уха, или применения в ходе подавления неблагоприятной иммунной реакции на аллотрансплантат органа, включающий введение терапевтически эффективного количества мультиспецифичного гибридного белка по п.1.
EA201170443A 2008-10-02 2009-10-02 Связывающие множество мишеней белки, обладающие антагонистическими свойствами по отношению к cd86 EA024877B1 (ru)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10233408P 2008-10-02 2008-10-02
US10228808P 2008-10-02 2008-10-02
US10231508P 2008-10-02 2008-10-02
US10230708P 2008-10-02 2008-10-02
US10233608P 2008-10-02 2008-10-02
US10233108P 2008-10-02 2008-10-02
US10231908P 2008-10-02 2008-10-02
US10229708P 2008-10-02 2008-10-02
US10232708P 2008-10-02 2008-10-02
PCT/US2009/059446 WO2010040105A2 (en) 2008-10-02 2009-10-02 Cd86 antagonist multi-target binding proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201170443A1 EA201170443A1 (ru) 2011-12-30
EA024877B1 true EA024877B1 (ru) 2016-10-31

Family

ID=41557444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201170443A EA024877B1 (ru) 2008-10-02 2009-10-02 Связывающие множество мишеней белки, обладающие антагонистическими свойствами по отношению к cd86

Country Status (23)

Country Link
US (2) US9493564B2 (ru)
EP (2) EP3281955A1 (ru)
JP (4) JP5840494B2 (ru)
KR (5) KR20180105731A (ru)
CN (2) CN102227447A (ru)
AU (4) AU2009298131B2 (ru)
BR (1) BRPI0920749A8 (ru)
CA (2) CA3038442A1 (ru)
CY (1) CY1119874T1 (ru)
DK (1) DK2344540T3 (ru)
EA (1) EA024877B1 (ru)
ES (1) ES2657220T3 (ru)
HK (1) HK1251000A1 (ru)
HR (1) HRP20180045T1 (ru)
LT (1) LT2344540T (ru)
MX (1) MX338825B (ru)
NO (1) NO2344540T3 (ru)
NZ (1) NZ592420A (ru)
PL (1) PL2344540T3 (ru)
PT (1) PT2344540T (ru)
SI (1) SI2344540T1 (ru)
WO (1) WO2010040105A2 (ru)
ZA (1) ZA201102637B (ru)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7030219B2 (en) 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
WO2010003101A2 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Il6 immunotherapeutics
KR20110044991A (ko) * 2008-07-02 2011-05-03 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 ＴＮＦ-α 길항제 다-표적 결합 단백질
LT2344540T (lt) * 2008-10-02 2018-03-26 Aptevo Research And Development Llc Prie daugybinių taikinių prisirišantys cd86 antagonistiniai baltymai
CN102292352A (zh) * 2008-10-10 2011-12-21 新兴产品开发西雅图有限公司 Tcr复合物免疫治疗剂
JP2013512251A (ja) * 2009-11-24 2013-04-11 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−ｌ１／ｐｄ−ｌ２の同時阻害
US9090691B2 (en) 2010-09-15 2015-07-28 Applied Molecular Transport Llc Systems and methods of delivery of bioactive agents using bacterial toxin-derived transport sequences
US11246915B2 (en) 2010-09-15 2022-02-15 Applied Molecular Transport Inc. Cholix toxin-derived fusion molecules for oral delivery of biologically active cargo
CN101962413B (zh) * 2010-09-21 2013-03-13 中国科学技术大学 具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因与应用
JP2014518615A (ja) * 2011-04-22 2014-08-07 エマージェント プロダクト デベロップメント シアトル， エルエルシー 前立腺特異的膜抗原結合タンパク質および関連組成物ならびに方法
HUE038668T2 (hu) * 2011-11-08 2018-11-28 Umc Utrecht Holding Bv Interleukin-4-et és interleukin-10-et tartalmazó fúziós fehérje
CN104487587A (zh) 2012-04-20 2015-04-01 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd3结合多肽
ES2749200T3 (es) 2012-05-10 2020-03-19 Bioatla Llc Anticuerpos monoclonales multiespecíficos
EP2897638A1 (en) 2012-09-24 2015-07-29 Montana State University-Bozeman Recombinant lactococcus lactis expressing escherichia coli colonization factor antigen i (cfa/i) fimbriae and their methods of use
AR097306A1 (es) * 2013-08-20 2016-03-02 Merck Sharp & Dohme Modulación de la inmunidad tumoral
UA119659C2 (uk) 2013-12-12 2019-07-25 Шанхай Хенжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Антитіло до pd-1, його антигензв'язуючий фрагмент та їхнє медичне застосування
JP6202339B2 (ja) * 2013-12-19 2017-09-27 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター ＧＭ−ＣＳＦ産生Ｔ細胞制御剤、及びＴｈ１／Ｔｈ２免疫バランス調節剤
CA2935665A1 (en) * 2014-02-06 2015-08-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Interleukine 10 immunoconjugates
CN103923934B (zh) * 2014-03-22 2016-11-02 复旦大学 一种具有免疫负调控作用的基因工程蛋白及其制备方法与应用
KR102598038B1 (ko) * 2014-05-07 2023-11-07 어플라이드 몰레큘라 트랜스포트 인크. 생물학적 활성 화물의 경구 전달용 콜릭스 독소-유래 융합 분자
AU2015258875B2 (en) * 2014-05-16 2020-12-24 Baylor Research Institute Methods and compositions for treating autoimmune and inflammatory conditions
WO2016174575A1 (en) * 2015-04-29 2016-11-03 Mediolanum Farmaceutici S.P.A. A soluble chimeric interleukin-10 receptor and therapeutic use thereof
SG10201913625XA (en) 2015-08-07 2020-03-30 Imaginab Inc Antigen binding constructs to target molecules
JP7002446B2 (ja) 2015-09-21 2022-03-04 アプティーボ リサーチ アンド デベロップメント エルエルシー Ｃｄ３結合ポリペプチド
WO2017058859A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 Celgene Corporation Pd-1 binding proteins and methods of use thereof
SG11201801984TA (en) * 2015-10-01 2018-04-27 Heat Biologics Inc Compositions and methods for adjoining type i and type ii extracellular domains as heterologous chimeric proteins
KR101918456B1 (ko) * 2015-12-15 2018-11-16 앱클론(주) Cd80 및 cd86에 특이적으로 결합하는 항체
WO2017143406A1 (en) * 2016-02-26 2017-08-31 Imunexus Pty Ltd Multi-specific molecules
MX2019002867A (es) * 2016-09-19 2019-11-12 Celgene Corp Metodos de tratamiento de trastornos inmunologicos usando proteinas de union a pd-1.
JP2019534859A (ja) * 2016-09-19 2019-12-05 セルジーン コーポレイション Ｐｄ−１結合タンパク質を使用して白斑を治療する方法
EP3551047A1 (en) 2016-12-07 2019-10-16 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
BR112019018915A2 (pt) 2017-03-15 2020-04-14 Pandion Therapeutics Inc imunotolerância direcionada
EP3601338A4 (en) * 2017-03-29 2020-12-16 Celgene Corporation FORMULATIONS INCLUDING PROTEINS BINDING PD-1 AND THEIR PREPARATION METHODS
US20210138213A1 (en) 2017-03-30 2021-05-13 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
MX2019013517A (es) 2017-05-24 2020-08-17 Pandion Operations Inc Inmunotolerancia dirigida.
IL272103B2 (en) 2017-07-20 2024-10-01 Aptevo Res & Development Llc Antigen binding proteins binding to 5T4 and 4-1BB and related compositions and methods of treating cancer
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
WO2019177053A1 (ja) * 2018-03-13 2019-09-19 国立大学法人北海道大学 全身性エリテマトーデス又は全身性エリテマトーデスに起因して生じる疾患の予防又は治療剤及び膠原病の予防又は治療剤
SG11202010011RA (en) 2018-04-17 2020-11-27 Celldex Therapeutics Inc Anti-cd27 and anti-pd-l1 antibodies and bispecific constructs
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
US20230041197A1 (en) 2018-06-20 2023-02-09 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
MX2021002294A (es) * 2018-08-29 2021-05-27 Shattuck Labs Inc Terapias de combinacion que comprenden proteinas quimericas basadas en pd-1.
CA3119060A1 (en) 2018-11-07 2020-05-14 Applied Molecular Transport Inc. Delivery constructs for transcytosis and related methods
CA3120619A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
WO2020144332A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge (Idibell) Fusion protein with immunosuppressive activity
EP3927728A2 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Xencor, Inc. Untargeted and targeted il-10 fc-fusion proteins
GB2620875B (en) 2019-04-19 2024-05-08 Synerkine Pharma B V A fusion protein comprising IL13
BR112021023345A2 (pt) 2019-05-20 2022-02-01 Pandion Operations Inc Imunotolerância com alvo em madcam
EP3980067A4 (en) * 2019-06-10 2023-08-02 Apollomics Inc. (Hangzhou) ANTIBODY INTERLEUKIN FUSION PROTEIN AND METHODS OF USE
AU2020291012A1 (en) 2019-06-12 2021-12-16 AskGene Pharma, Inc. Novel IL-15 prodrugs and methods of use thereof
KR20210006302A (ko) * 2019-07-08 2021-01-18 주식회사 프로젠 신규 il-10 변이체 단백질 및 그의 용도
JP2022540187A (ja) * 2019-07-08 2022-09-14 プロジェン・カンパニー・リミテッド 新規融合タンパク質及びその用途
BR112022002761A2 (pt) 2019-08-12 2022-08-09 Aptevo Res & Development Llc Proteínas de ligação a 4-1bb e ox40 e composições e métodos relacionados, anticorpos contra 4-1bb, anticorpos contra ox40
KR20220066056A (ko) 2019-08-16 2022-05-23 어플라이드 몰레큘라 트랜스포트 인크. 조성물, 제형, 및 인터루킨 제조 및 정제
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
CA3164385A1 (en) 2020-01-13 2021-07-22 Aptevo Research And Development Llc Formulations for protein therapeutics
KR20220140500A (ko) * 2020-01-13 2022-10-18 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 약물 전달 시스템 성분에 대한 치료제 단백질의 흡착을 방지하기 위한 방법 및 조성물
US11981715B2 (en) 2020-02-21 2024-05-14 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a CD39 effector
WO2021243028A1 (en) * 2020-05-27 2021-12-02 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bispecific molecules for selectively modulating t cells
CN116322785A (zh) 2020-07-20 2023-06-23 德卡生物科学公司 包含il-10的双细胞因子融合蛋白
CA3200314A1 (en) 2020-12-01 2022-06-09 Peter Pavlik Tumor-associated antigens and cd-3 binding proteins, related compositions, and methods
CN117500824A (zh) * 2021-02-01 2024-02-02 奥美药业有限公司 包含IL-10或TGF-β激动剂多肽的嵌合分子
WO2022246244A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Aptevo Research And Development Llc Dosing regimens for protein therapeutics
WO2024107752A2 (en) * 2022-11-15 2024-05-23 Onestone Therapeutics Llc Compositions and methods for immunomodulatory bifunctional fusion molecules
WO2024148328A2 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Aptevo Research And Development Llc Bispecific pd-l1 and cd40 binding molecules and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020150559A1 (en) * 1996-07-23 2002-10-17 Deboer Mark Induction of T cell tolerance with CD40/B7 antagonists
WO2004076488A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 Theravision Gmbh A molecule which binds cd80 and cd86

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US6291161B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertiore
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
CA2110518C (en) 1991-06-27 2007-05-22 Peter S. Linsley Ctla4 receptor, fusion proteins containing it and uses thereof
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US6090914A (en) 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5833976A (en) 1991-08-06 1998-11-10 Schering Corporation Use of interleukin-10 (IL-10) to treat endotoxin- or superantigen-induced toxicity
US5874082A (en) 1992-07-09 1999-02-23 Chiron Corporation Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation
US6482919B2 (en) 1993-02-01 2002-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
WO1995001994A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Synergen, Inc. Recombinant ctla4 polypeptides and methods for making the same
US6084067A (en) 1993-07-26 2000-07-04 Dana-Farber Cancer Institute CTLA4/CD28 ligands and uses therefor
US6824779B1 (en) 1993-07-26 2004-11-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for inhibiting the interaction of B7-2 with its natural ligand
KR960704041A (ko) 1993-07-26 1996-08-31 에릭 에스. 딕커 사람 인터루킨-10의 효능제 및 길항제(Agonists and antagonists of human interleukin-10)
US6010880A (en) 1994-01-11 2000-01-04 Dyax Corp. Inhibitors of human plasmin derived from the kunitz domains
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
GB9518220D0 (en) 1995-09-06 1995-11-08 Medical Res Council Checkpoint gene
US5830451A (en) 1996-07-19 1998-11-03 Brigham & Women's Hospital, Inc. Haematopoietic cytokine Epstein Barr virus-induced protein
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
ZA98533B (en) 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
WO1998058965A2 (en) 1997-06-20 1998-12-30 Innogenetics N.V. B7-binding molecules for treating immune diseases
DE69922159T2 (de) 1998-01-23 2005-12-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Mehrzweck-antikörperderivate
NZ506453A (en) * 1998-02-19 2003-02-28 Xcyte Therapies Inc Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
AUPP221098A0 (en) 1998-03-06 1998-04-02 Diatech Pty Ltd V-like domain binding molecules
ATE251181T1 (de) 1998-07-28 2003-10-15 Micromet Ag Heterominikörper
US6428985B1 (en) 1998-12-02 2002-08-06 The Regents Of The University Of Michigan Immunosuppressive structural definition of IL-10
US6972125B2 (en) 1999-02-12 2005-12-06 Genetics Institute, Llc Humanized immunoglobulin reactive with B7-2 and methods of treatment therewith
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
US6699972B1 (en) 1999-06-25 2004-03-02 Academia Sinica Chimeric protein and method of controlling tumor growth using the protein
WO2001008700A1 (en) 1999-07-28 2001-02-08 Genetics Institute, Inc. Preventing immune-mediated abortion by inhibiting costimulation
ES2330406T3 (es) * 1999-07-30 2009-12-10 Schering Corporation Citocinas de mamifero; reactivos relacionados.
WO2001068134A2 (en) * 2000-03-14 2001-09-20 Genetics Institute, Inc. Therapies that improve graft survival, using antibodies against a b7 antigen
US20020071839A1 (en) 2000-03-14 2002-06-13 Mary Collins Use of a combination of agents that modulate B7 activity in inhibiting intestinal allograft rejection
WO2001088159A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Euro-Celtique S.A. Cd28 synthebody for the modulation of immune responses
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
TWI319405B (en) * 2000-05-26 2010-01-11 Bristol Myers Squibb Co Soluble ctla4 mutant molecules and uses thereof
CA2410551A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw (Vib) Heterodimeric fusion proteins
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
WO2002034290A2 (en) 2000-10-23 2002-05-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies and other ligands directed against kir2dl4 receptor for production of interferon gamma
US7723482B2 (en) 2000-12-26 2010-05-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Anti-CD28 antibody
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP2316951A1 (en) 2001-01-17 2011-05-04 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
US6924358B2 (en) 2001-03-05 2005-08-02 Agensys, Inc. 121P1F1: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
US20050118164A1 (en) 2001-03-09 2005-06-02 William Herman Targeted ligands
US20040058445A1 (en) 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
DE60225914T2 (de) 2001-05-23 2009-07-23 Bristol-Myers Squibb Co. Verfahren zum schützen eines allogenen inseltransplantats mit löslichen ctla4-mutationsmolekülen
US20100081792A1 (en) * 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
US20040044182A1 (en) 2001-09-17 2004-03-04 Hunt Joan S Expression, preparation,uses, and sequence of recombinantly-derived soluble hla-g
CN1692127A (zh) 2002-07-25 2005-11-02 健泰科生物技术公司 Taci抗体及其用途
AU2003288675B2 (en) 2002-12-23 2010-07-22 Medimmune Limited Antibodies against PD-1 and uses therefor
KR20060052681A (ko) 2003-05-23 2006-05-19 와이어쓰 Ｇｉｔｒ 리간드, ｇｉｔｒ 리간드-연관 분자, 항체 및그의 용도
US7754209B2 (en) 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
EP1670499A4 (en) 2003-08-04 2009-07-22 Bristol Myers Squibb Co METHODS OF TREATING A CARDIOVASCULAR DISEASE USING A SOLUBLE CTLA4 MOLECULE
CA2543484C (en) 2003-10-27 2014-02-04 Amgen Inc. Modulation of immune response to an immunogen with ctla-4 and tnfbp
WO2005052166A1 (en) 2003-11-29 2005-06-09 Young-Jin Chae Recombinant peptide vector comprising the gene for treatment for autoimmune diseases.
JP2008500812A (ja) 2004-03-18 2008-01-17 ザ ユニバーシティー コート オブ ザ ユニバーシティー オブ グラスゴウ 免疫抑制サイトカイン
US20080057070A1 (en) 2004-11-04 2008-03-06 Chiron Corporation Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use
WO2006048749A1 (en) 2004-11-04 2006-05-11 Pfizer Products Inc. Ctla-4 antibody and aromatase inhibitor or combination treatment for breast cancer
US20090311280A1 (en) 2004-12-09 2009-12-17 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Novel tnf receptor regulatory domain
DK1772465T3 (da) 2005-01-05 2009-05-25 F Star Biotech Forsch & Entw Syntetiske immunoglobulindomæner med modificerede bindingsegenskaber i områder af molekylet, der ikke er komplementaritetsbestemmende regioner
GB0504767D0 (en) 2005-03-08 2005-04-13 Ares Trading Sa Lipocalin protein
SG10201702670VA (en) 2005-06-08 2017-06-29 Dana Farber Cancer Inst Inc Methods and compositions for the treatment of persistent infections and cancer by inhibiting the programmed cell death 1 (pd-1) pathway
WO2006138670A2 (en) 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corporation Antibody complexes
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
AR056142A1 (es) 2005-10-21 2007-09-19 Amgen Inc Metodos para generar el anticuerpo igg monovalente
EP1829895A1 (en) 2006-03-03 2007-09-05 f-star Biotechnologische Forschungs- und Entwicklungsges.m.b.H. Bispecific molecule binding TLR9 and CD32 and comprising a T cell epitope for treatment of allergies
JP2009530290A (ja) 2006-03-16 2009-08-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｃｄ４抗体を使用するループスの治療方法
CA2646508A1 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
EP3805269A1 (en) 2006-06-12 2021-04-14 Aptevo Research and Development LLC Single-chain multivalent binding proteins with effector function
MX2009002151A (es) 2006-08-28 2009-07-03 Kirin Pharma Kk Anticuerpos monoclonales humanos especificos para light humano antagonistas.
GB0620934D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
EP2076538A2 (en) 2006-10-24 2009-07-08 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Materials and methods for improved immunoglycoproteins
WO2008071447A2 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system
AU2008287195A1 (en) 2007-07-06 2009-02-19 Emergent Product Development Seattle, Llc Binding peptides having a C-terminally disposed specific binding domain
PL2222697T3 (pl) 2007-11-01 2013-05-31 Astellas Pharma Inc Immunosupresyjne polipeptydy i kwasy nukleinowe
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
AU2009276717A1 (en) 2008-07-28 2010-02-04 Emergent Product Development Seattle, Llc Multi-specific binding proteins targeting B cell disorders
WO2010034441A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-egfr/anti-igf-1r antibodies
LT2344540T (lt) * 2008-10-02 2018-03-26 Aptevo Research And Development Llc Prie daugybinių taikinių prisirišantys cd86 antagonistiniai baltymai
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CN102292352A (zh) 2008-10-10 2011-12-21 新兴产品开发西雅图有限公司 Tcr复合物免疫治疗剂
SG176219A1 (en) 2009-05-27 2011-12-29 Hoffmann La Roche Tri- or tetraspecific antibodies
US20130052195A1 (en) 2009-12-23 2013-02-28 Emergent Product Development Seattle,LLC Compositions Comprising TNF-alpha and IL-6 Antagonists and Methods of Use Thereof
US20130089554A1 (en) 2009-12-29 2013-04-11 Emergent Product Development Seattle, Llc RON Binding Constructs and Methods of Use Thereof
WO2012045334A1 (en) 2010-10-05 2012-04-12 Synthon Bv Biologically active il-10 fusion proteins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020150559A1 (en) * 1996-07-23 2002-10-17 Deboer Mark Induction of T cell tolerance with CD40/B7 antagonists
WO2004076488A1 (en) * 2003-02-27 2004-09-10 Theravision Gmbh A molecule which binds cd80 and cd86

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019014757A (ja) 2019-01-31
US20120100139A1 (en) 2012-04-26
CN107056951A (zh) 2017-08-18
AU2014203429A1 (en) 2014-07-10
CA2739460A1 (en) 2010-04-08
BRPI0920749A2 (pt) 2016-05-03
CY1119874T1 (el) 2018-06-27
EP2344540B1 (en) 2017-11-29
SI2344540T1 (en) 2018-04-30
AU2009298131A1 (en) 2010-04-08
ZA201102637B (en) 2016-09-28
WO2010040105A2 (en) 2010-04-08
AU2016208322A1 (en) 2016-08-11
EP2344540A2 (en) 2011-07-20
MX338825B (es) 2016-05-03
HK1251000A1 (zh) 2019-01-18
PL2344540T3 (pl) 2018-05-30
JP6521915B2 (ja) 2019-05-29
KR20170091801A (ko) 2017-08-09
KR20180105731A (ko) 2018-09-28
AU2009298131B2 (en) 2016-07-14
CA2739460C (en) 2019-05-21
CN102227447A (zh) 2011-10-26
KR20110074895A (ko) 2011-07-04
US9493564B2 (en) 2016-11-15
KR101900953B1 (ko) 2018-09-21
HRP20180045T1 (hr) 2018-03-23
KR20190064664A (ko) 2019-06-10
NZ592420A (en) 2012-12-21
AU2018203491A1 (en) 2018-06-07
JP2016188249A (ja) 2016-11-04
US20170015747A1 (en) 2017-01-19
JP2012504425A (ja) 2012-02-23
WO2010040105A3 (en) 2010-06-03
EP3281955A1 (en) 2018-02-14
NO2344540T3 (ru) 2018-04-28
CA3038442A1 (en) 2010-04-08
PT2344540T (pt) 2018-02-02
KR20160120812A (ko) 2016-10-18
BRPI0920749A8 (pt) 2017-12-12
MX2011003611A (es) 2011-05-10
JP5840494B2 (ja) 2016-01-06
DK2344540T3 (da) 2018-01-29
ES2657220T3 (es) 2018-03-02
LT2344540T (lt) 2018-03-26
JP2014239700A (ja) 2014-12-25
EA201170443A1 (ru) 2011-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024877B1 (ru) Связывающие множество мишеней белки, обладающие антагонистическими свойствами по отношению к cd86
JP7134204B2 (ja) キメラ受容体及びその使用方法
TWI844073B (zh) 介白素-21突變蛋白及治療方法
JP7023709B2 (ja) 抗炎症特性を有するペプチド
US20210017247A1 (en) Fusion Molecules Targeting Immune Regulatory Cells and Uses Thereof
ES2899779T3 (es) Receptores antigénicos quiméricos dirigidos a receptor acoplado a proteína G y usos de los mismos
JP2020096644A (ja) ペプチドキメラ抗原受容体ｔ細胞スイッチおよびその使用
JP2024155943A (ja) トランスフォーミング増殖因子ベータ応答性ポリペプチド及びその使用方法
JP2024069500A (ja) 抗ｇｐｃ３一本鎖抗体を含むｃａｒ
UA125382C2 (uk) Антитіла проти людського vista та їх застосування
CN106061999B (zh) Il-21抗体
CN106380521A (zh) 用于肿瘤靶向治疗的白细胞介素-15融合蛋白
JP2022528030A (ja) 多機能性融合タンパク質及びその使用
KR20220035032A (ko) 변이체 icos 리간드(icosl) 융합 단백질의 방법 및 용도
JP2022543960A (ja) Ｍｈｃ ｉｉ／ｃｉｉ複合体の生成
CN114302743B (zh) 用于治疗关节炎的hla-dr/cii肽复合体
US10781423B2 (en) Method for producing B cell population
ES2936075T3 (es) Activador de células T reguladoras, y uso del mismo
US20230242666A1 (en) Methods and Compositions for the Reduction of Chimeric Antigen Receptor Tonic Signaling
Vargas Receptors of the TNFSF in the biology and regulation of Tregs
JP2024528038A (ja) 調節性ｔ細胞を標的として自己免疫疾患を処置するための滑膜細胞外マトリックス特異的キメラ抗原受容体
CN116234575A (zh) 激动剂抗cd40抗体

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU