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KR20180105731A - Ｃｄ86 길항제 다중-표적 결합 단백질 - Google Patents

Ｃｄ86 길항제 다중-표적 결합 단백질 Download PDF

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KR20180105731A
KR20180105731A KR1020187026603A KR20187026603A KR20180105731A KR 20180105731 A KR20180105731 A KR 20180105731A KR 1020187026603 A KR1020187026603 A KR 1020187026603A KR 20187026603 A KR20187026603 A KR 20187026603A KR 20180105731 A KR20180105731 A KR 20180105731A
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KR
South Korea
Prior art keywords
seq
fusion protein
domain
binding
binding domain
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020187026603A
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English (en)
Inventor
피터 암스트롱 톰슨
피터 로버트 바움
필립 탄
존 더블유. 블랑켄십
사티쉬 쿠마르 나타라잔
Original Assignee
압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 filed Critical 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨
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Abstract

본 기재내용은 CD86 길항제 결합 도메인 및 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 다른 결합 도메인으로 구성된 다중-특이적인 융합 단백질을 제공한다. 다중-특이적인 융합 단백질은 또한 다른 도메인을 분리시키는 개재 도메인을 포함할 수 있다. 본 기재내용은 또한 다중-특이적인 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 이러한 융합 단백질의 조성물, 및 다중-특이적인 융합 단백질 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.

Description

ＣＤ86 길항제 다중-표적 결합 단백질{CD86 Antagonist Multi-Target Binding Proteins}
[관련 출원의 전후-참조]
본 출원은 2008년 10월 2일자로 출원된 미국 가 특허출원 제61/102,288호; 2008년 10월 2일자로 출원된 제61/102,297호; 2008년 10월 2일자로 출원된 제61/102,307호; 2008년 10월 2일자로 출원된 제61/102,315호; 2008년 10월 2일자로 출원된 제61/102,319호; 2008년 10월 2일자로 출원된 제61/102,327호; 2008년 10월 2일자로 출원된 제61/102,331호; 2008년 10월 2일자로 출원된 제61/102,334호; 및 2008년 10월 2일자로 출원된 제61/102,336호의 35 U.S.C. §119(e) 하의 이익을 청구하며, 여기서, 이들 9개의 가 특허출원은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
[서열 목록에 관한 기술]
본원과 관련된 서열 목록은 종이 복사물대신 문서형식으로 제공되며, 본원에서 명세서내로 참조로 인용된다. 서열 목록을 포함하는 문서 파일의 명칭은 910180_421PC_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 문서 파일은 705 KB이고, 2009년 10월 2일에 생성되었으며, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-Web을 통해 전자 제출되었다.
기술 분야
본 기재내용은 일반적으로 다중-특이적인 결합 분자 및 이의 치료학적 적용의 분야 및 보다 상세하게는 CD86 길항제 결합 도메인, 및 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제와 같은 이종 표적에 대해 특이적인 다른 결합 도메인으로 구성된 융합 단백질은 물론, 이의 조성물 및 치료학적 용도에 관한 것이다.
인간 면역계는 일반적으로 외부 물질 및 병원체에 의한 손상으로부터 신체를 보호한다. 면역계가 신체를 보호하는 한가지 방법은 T 림프구 또는 T-세포로 언급되는 특수 세포를 생산하는 것이다. T-세포와 항원-제시 세포(APC) 사이의 세포내 상호작용은 궁극적으로 항원에 대한 T-세포 반응을 초래하는 T-세포 공자극 시그날(signal)을 생성한다. 완전한 T 세포 활성화는 항원-제시 세포상에 존재하는 항원-MHC 복합체에 대한 T-세포 수용체(TCR)의 결합 및 항원-제시 세포, 특히 수지 세포상에 존재하는 CD86 및/또는 CD80 리간드에 대한 T-세포의 표면에서 수용체 CD28의 결합 둘 다를 필요로 한다.
CD80 (B7-1로서 또한 공지됨)은 인간 B-세포 관련된 활성화 항원으로 원래 기술되었으며 관련된 T-세포 분자 CD28 및 세포독성 T 림프구-관련된 항원-4 (CTLA4)에 대한 수용체인 것으로 후속적으로 밝혀졌다. 후자의 연구에서, CD86(또한 B7-0 또는 B7-2로 공지됨)으로 공지된 CTLA4에 대한 다른 대응수용체가 확인되었다. CD86은 이의 세포외 영역에서 CD80과 약 25% 서열 동질성을 공유한다. CD80 및 CD86은 일반적으로 CD4(+) T 세포의 증식을 개시하고 유지하는 자체 능력에 있어 작용적으로 동등한 것으로 여겨지며[참조: Vasilevko et al. (2002) DNA 세포 Biol. 21:137-49], 분자 둘 다에 대한 이러한 활성을 차단하는 가용성 CTLA4 Ig 융합 단백질을 사용한 임상 데이타는 임상적 장점을 나타내는[참조: Genovese et al. (2005) NEJM 353:114-1123] 반면, CD86의 특수 억제가 유리할 수 있다는 일부 증거가 있다. 예를 들어, CD86 또는 CD80의 개입은 B 세포에서 상이한 효과를 갖는다. 상세하게는, CD80은 정상 B 세포 및 B 세포 림프종 둘 다의 증식 및 IgG 분비에 대한 네가티브 시그날을 제공하는 것으로 밝혀진 반면, CD86은 B 세포의 활성화를 향상시킨다[참조: Suvas et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:7766-7775]. 또한 T 세포상에서 CD80의 개입은 면역억제성이며[참조: Lang et al. (2002) J. Immunol. 168:3786-3792; Taylor et al. (2004) J. Immunol. 172:34-39; Paust et al. (2004) PNAS 101:10398-10403] 이것이 활성화된 APC 또는 T 세포상에서 PD-L1 (CD274) 시그날링을 통해 추가의 면역억제를 중재할 수 있다[참조: Butte et al. (2007) Immunity 27:111-122; Keir (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:677-704]는 증거가 있다. 따라서, CD80 억제의 부재하에서 CD86의 억제는 자가면역 및 염증성 질환은 물론 B 세포 림프종의 치료에 유리할 수 있다.
CTLA4는, 일부 발현이 또한 CD4+CD25+ 조절성 T-세포(Treg) 소단위에서 발견되는, 활성화된 T-세포에서 주로 발현되는 면역글로불린 상과의 제1형 막관통(transmembrane) 당단백질이다. CD86 및 CD80은 CTLA4에 대한 유일한 내인성 리간드인 것으로 여겨지고 있다. CTLA4는 CD86 및 CD80에 CD28과 비교하여 보다 높은 친화성 및 항원항체 결합력으로 결합하는 것으로 밝혀졌으며[참조: Linsley et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-69; Linsley et al. (1994) Immunity 1:793-801], T-세포 활성화의 네가티브 조절인자로서 중요한 역할을 한다. 상세하게는, CD80/CD86에 대한 CTLA4의 결합은 T-세포 반응의 하향 조절, 및 T-세포 항상성 및 말초 내성의 보존을 초래한다. 이는 CD28-의존성 공자극의 길항작용 및 CTLA4 세포질성 테일(cytoplasmic tail)을 통한 직접적인 네가티브 시그날링 둘 다에 기인하는 것으로 여겨진다. CTLA4 구조 및 작용의 고찰을 위해서는 문헌[참조: Teft et al. (2006) Annu. Rev. Immunol. 24:65-97]을 참조한다.
위에서 언급한 바와 같이, 생산성 면역 반응은 TCR의 개입 및 CD80 및/또는 CD86에 대한 CD28의 결합 둘 다를 필요로 한다. CD28 결합의 부재하에서 TCR 결합은 T 세포가 세포자멸사를 겪거나 무력화되도록 한다. 또한, CD28 시그날링은 T 세포에 의한 사이토킨 생산을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 상세하게는, CD28 자극은 활성화된 T 세포에서 IL-2, TNFα, 림프독소, IFNγ 및 GM-CSF의 생산을 5- 내지 50-배 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, CD28에 의한 림포킨 및/또는 사이토킨 유전자 발현의 유도는 면역억제제 사이클로스포린의 존재하에서조차 발생하는 것으로 밝혀졌다[참조: Thompson et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1333-1337]. CD28은 또한 항-세포자멸성 BCL-XL의 상향조절을 유도함으로써 T 세포 생존을 촉진하는 것으로 밝혀졌다[참조: Alegre et al. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:220-228].
CTLA4의 가용성 형태는 CTLA4의 가변성-유사 세포외 도메인을 면역글로불린 불변 도메인에 융합시킴으로써 작제하여 CTLA4-Ig 융합 단백질을 제공해 왔다. 가용성 CTLA-4-Ig는 CD86 및 CD80 둘 다에 결합함으로써 CD28-의존성 공자극을 방지하며[참조: Linsley et al. (1991) J. Exp. Med., 174:561-69], T 세포의 공자극을 억제하는 것으로 밝혀졌으며 사람에서 유리한 면역억제 효과를 갖는다[참조: Bruce & Boyce (2007) Ann. Pharmacother. 41:1153-1162]. CTLA4-Ig 융합 단백질 아바타셉트(abatacept)는 현재 항-TNFα 치료요법에 대한 부적절한 반응의 경우에 류마티스 관절염의 치료를 위해 사용되고 있다. 그러나, 모든 환자가 CTLA4-Ig에 반응하지는 않으며 지속적인 반응은 빈번한 약물 투여를 필요로 하는데, 이는 아마도 부분적으로 CD28과 CD86/CD80의 상호작용의 차단이 Treg의 약한 유도인자이며 질병 상태에서 활성화된 효과기 T 세포 반응을 차단하는데 불충분하기 때문이다.
상세한 설명
본 기재내용은 항원 제시 세포(APC)를 표적화하여 활성을 변경시키는 것을 가능하도록 한다. 예를 들어, T-세포 활성은 CD86에 우선적으로 결합하는 제1의 결합 도메인, 및 제2의 결합 도메인(이종 결합 도메인)을 포함하는 다중-특이적인 xceptor 융합 단백질을 제공함으로써 조절할 수 있다. 특정 양태에서, 다중-특이적인 xceptor 융합 단백질은 제1 결합도메인 및 제2 결합 도메인, 제1 링커 및 제2 링커, 및 개재 도메인(intervening domain)을 포함하며, 여기서 개재 도메인의 한쪽 끝은 CD86 결합 도메인인 제1결합 도메인에 링커를 통해 융합되고 또한 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 제2 결합 도메인에 링커를 통해 융합된다.
특정의 양태에서, CD86 결합 도메인은 CD86 (예를 들면, 모노클로날 항체 3D1 또는 FUN1로부터)에 대해 특이적인 CTLA4 엑토도메인, CD28 엑토도메인, 또는 면역글로불린 가변 영역 결합 도메인(예: scFv)이다. 일부 양태에서, 전체보다 적은 엑토도메인이 사용된다. 예를 들어, CD86에 결합하여 CD28에 대한 CD86의 결합을 방지하는 CTLA4 엑토도메인내 도메인이 사용될 수 있다. 추가의 양태에서, IL10 효능제는 IL10 또는 이의 작용성 영역이다. 추가의 양태에서, HLA-G 효능제는 HLA-G5, HLA-G1, HLA-G 뮤테인 또는 이의 작용성 영역; HLA-G5, HLA-G1 또는 HLA-G 뮤테인의 엑토도메인; 또는 ILT2, ILT4 또는 KIR2DL4에 대해 특이적인 면역글로불린 가변 영역 결합 도메인(예: scFv)이다. 여전히 추가의 양태에서, 이종 결합 도메인은 HGF 또는 이의 서브-도메인과 같은 HGF 효능제이다. 다른 양태에서, 이종 결합 도메인은 IL35R 또는 IL35에 대해 특이적인 면역글로불린 가변 영역 결합 도메인(예: scFv)과 같은 IL35 효능제, 또는 이의 작용성 영역이다. 추가의 양태에서, LIGHT 길항제는 LIGHT에 대해 특이적인 면역글로불린 가변 영역 결합 도메인(예: scFv), 또는 HVEM 엑토도메인 또는 이의 작용성 영역이다. 추가의 양태에서, PD-1 효능제는 PD-1에 대해 특이적인 면역글로불린 가변 영역 결합 도메인(예: scFv), 또는 PD-1 리간드(예를 들면, PD-L1 또는 PD-L2) 또는 이의 작용성 영역이다. 추가의 양태에서, BTLA 효능제는 BTLA에 대해 특이적인 면역글로불린-유사 가변 영역 결합 도메인(예: scFv), 또는 HVEM 엑토도메인 또는 이의 작용성 영역이다. 특정의 양태에서, GITRL 길항제는 GITRL에 대해 특이적인 면역글로불린-유사 가변 영역 결합 도메인(예: scFv), 또는 GITR 엑토도메인, 가용성 GITR, 또는 이의 작용성 영역이다. 특정 양태에서, CD40 길항제는 CD40에 대해 특이적인 면역글로불린-유사 가변 영역 결합 도메인(예: scFv)이다.
본원에서 Xceptor 분자로 언급된, 이러한 다중-특이적인 융합 단백질의 예시적인 구조는 N-BD-ID-ED-C, N-ED-ID-BD-C, N-BD1-ID-BD2-C, 및 N-ED-ID-ED-C를 포함하며, 여기서 N- 및 -C는 각각 아미노- 및 카복시 말단을 말하고; BD는 면역글로불린-유사 또는 면역글로불린 가변 영역 결합 도메인이며; ID는 개재 도메인이고; ED는 수용체 리간드 결합 도메인, 리간드, C-형 렉틴 도메인, 세마포린 또는 세마포린-유사 도메인 등과 같은 세포외 또는 엑토도메인이다. 일부 구조물에서, ID는 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 사이에 배치된 면역글로불린 불변 영역 또는 서브-영역을 포함할 수 있다. 여전히 추가의 구조물에서, BD 및 ED는 동일하거나 상이한 링커(예를 들면, 1 내지 50개의 아미노산을 포함하는 링커), 예를 들면, 면역글로불린 힌지 영역(예를 들면, 상부 및 코어 영역으로 제조될) 또는 이의 작용성 변이체, 또는 렉틴 도메인간 영역 또는 이의 작용성 변이체, 또는 분화의 군집(CD) 분자 스택 영역 또는 이의 작용성 변이체를 통해 ID에 각각 연결되어 있다.
본 기재 내용을 더욱 상세히 설명하기 전에, 본원에 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 이를 이해하는데 도움이 될 수 있다. 추가의 정의는 본 기재내용 전체에 나타내어져 있다.
본 기술에서, 임의의 농도 범위, 퍼센트 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리나타내지 않는 한, 인용한 범위내 특정 정수 값, 및 경우에 따라, 이의 분수(예: 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 소단위, 크기 또는 두께와 같은 특정의 물리적 특징과 관련하여 본원에 인용된 어떠한 숫자 범위도 달리 나타내지 않는 한, 인용된 범위내 특정 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 것으로서, "약" 또는 "으로 필수적으로 이루어진"은 달리 나타내지 않는 한, 나타낸 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "a" 및 "an"는 열거된 성분의 "하나 이상"을 언급한다. 대체어(예를 들면, "또는")의 사용은 대체어 하나, 둘 다 또는 이의 특정 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "포함하다" 및 "함유하다"는 동의어로 사용된다. 또한, 본원에 기술된 구조식 및 치환체의 각종 조합으로부터 유래하는 개개 화합물 또는 화합물의 그룹은, 각각의 화합물 또는 화합물의 그룹이 개별적으로 설정되는 경우와 동일한 정도로 본 출원에 기술된다. 따라서, 특수 구조식 또는 특수 치환체의 선택은 본 기재내용의 영역내에 있다.
본 기재내용에 따른 "결합 도메인" 또는 "결합 영역"은 예를 들면, 안정하거나 일시적인 것(예를 들면, CD86/CD28 복합체)에 상관없이, 생물학적 분자(예를 들면, CD86) 또는 동일하거나 상이한 분자 또는 조립체 또는 응집체 중 하나 이상의 복합체를 특이적으로 인지하여 이에 결합하는 능력을 지닌 특정 단백질, 폴리펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 또는 펩타이드일 수 있다. 이러한 생물학적 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 펩타이드, 아미노산 또는 이의 유도체, 지질, 지방산 또는 이의 유도체; 탄수화물, 사카라이드 또는 이의 유도체; 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 펩타이드 핵산, 핵산 분자 또는 이의 유도체; 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 지단백질, 단백질지질 또는 이의 유도체; 예를 들면, 생물학적 시료 속에 존재할 수 있는 기타 생물학적 분자; 또는 이들의 특정 조합을 포함한다. 결합 영역은 생물학적 분자 또는 목적한 다른 표적에 대한 천연적으로 존재하는, 합성, 반-합성 또는 재조합적으로 생산된 결합 파트너를 포함한다. FACS, 웨스턴 블롯, ELISA, 또는 비아코어 분석(Biacore analysis)을 포함하는, 특수 표적에 특이적으로 결합하는 본 기재내용의 결합 도메인을 확인한 각종 검정이 공지되어 있다.
본 기재내용의 결합 도메인 및 이의 융합 단백질은, 이들이 표적 분자에 예를 들면, 약 105 M-1, 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 또는 1013 M-1 이상의 Ka(즉, 1/M의 단위의 특수 결합 상호작용의 평형 해리 상수) 또는 친화성으로 결합하는 경우, 표적에 "특이적으로 또는 선택적으로 결합하는" 것을 포함하여 바람직한 정도로 결합할 수 있지만, 시험 시료내에 존재하는 다른 성분들에 특이적으로 결합하지 않는다. "고 친화성" 결합 도메인은, Ka 값이 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 1013 M-1, 또는 그 이상인 결합 도메인을 말한다. 이와는 달리, 친화성은 M 단위(예를 들면, 10-5 M 내지 10-13 M)를 갖는 특수 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로 정의할 수 있다. 본 기재내용에 따른 결합 도메인 폴리펩타이드 및 융합 단백질의 친화성은 통상의 기술을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다[참조: 예를 들면, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; 및 미국 특허 제5,283,173호; 제5,468,614호, 또는 등가물].
본 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이 또는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 생성시킬 수 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,291,161호; 제6,291,158호). 공급원은 인간, 카멜리드(camelid)[낙타, 단봉낙타 또는 라마로부터; 참조: Hamers-Casterman et al. (1993) Nature, 363:446 및 Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol., 275:413], 상어[참조: Roux et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804], 어류[참조: Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54:39], 설치류, 조류, 양을 포함하는 각종 종(이는 파아지 라이브러리에서와 같이, 항체, sFv, scFv 또는 Fab로서 구성될 수 있다)으로부터의 항체 유전자 서열, 무작위적인 펩타이드 라이브러리를 암호화하는 서열 또는 피브리노겐 도메인[참조: 예를 들면, Weisel et al. (1985) Science 230:1388], 쿠니츠(Kunitz) 도메인(참조; 예를 들면, 미국 특허 제6,423,498호), 리포칼린 도메인(참조: 예를 들면, 제WO 2006/095164호), V-유사 도메인(참조: 예를 들면, 미국 특허원 공보 제2007/0065431호), C-형 렉틴 도메인 [참조: Zelensky 및 Gready (2005) FEBS J. 272:6179], mAb2 또는 FcabTM(참조: PCT 특허원 공보 제WO 2007/098934호; 제WO 2006/072620호) 등과 같이 대체 비-항체 스캐폴드(scaffold)의 루프 영역내 아미노산의 가공된 다양성을 암호화하는 서열을 포함한다. 추가로, 편리한 시스템(예를 들면, 마우스, HuMAb mouse®, TC mouseTM, KM-mouse®, 라마, 닭, 랫트, 햄스터, 토끼 등)에서 면역원으로서 합성 일본쇄 CD86을 사용하는 하이브리도마 개발을 위한 전통적인 방법을 사용하여 본 기재내용의 결합 도메인을 개발할 수 있다.
항체 기술을 참조하여 당해 분야의 숙련가에게 이해되는 용어는, 본원에 명확하게 정의되지 않는 한, 각각 당해 분야에서 요구되는 의미를 제공한다. 예를 들어, 용어 "VL" 및 "VH"는 각각 항체 경쇄 및 중쇄로부터 기원한 가변 결합 영역을 말한다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역"(CDR) 및 "골격 영역"(FR)으로 공지된, 별개의 잘-정의된 서브-영역으로 제조된다. 용어 "CL" 및 "CH"는 "면역글로불린 불변 영역", 즉 항체 경쇄 또는 중쇄 각각으로부터 유래하는 불변 영역을 말하며, 후자의 영역은, 당해 영역이 유래된 항체의 동형(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM)에 따라서, CH1, CH2, CH3 및 CH4 불변 영역 도메인으로 추가 분리될 수 있는 것으로 이해된다. 불변영역 도메인의 부위는 Fc 영역("결정화가능한 단편" 영역)을 구성하며, 당해 영역은 ADCC(항체-의존성 세포-매개된 세포독성), CDC(상보체-의존성 세포독성) 및 상보체 고정, Fc 수용체에 대한 결합, Fc 영역을 결여한 폴리펩타이드에 비해 보다 큰 생체내 반감기, 단백질 A 결합, 및 아마도 심지어 태반 전이[참조: Capon et al. (1989) Nature, 337:525]와 같은 면역글로불린의 효과기 작용에 관여하는 도메인을 함유한다. 또한, Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 이량체화 또는 다량체화를 허용한다. 본원에서 "링커"로 또한 언급된 "힌지 영역"은 당해 분야에서 항체 또는 항체-유사 분자에 대해 힌지의 형태로서 유연성을 제공하는 것으로 공지된, 항체의 일본쇄의 가변 결합 및 불변 영역 사이에 개재되어 연결하는 아미노산 서열이다.
면역글로불린의 도메인 구조는, 또한 항원 결합 도메인 및 효과기 작용을 부여하는 도메인이 면역글로불린 부류 및 소부류 사이에서 교환될 수 있도록 가공하기 위해 수정될 수 있다. 면역글로불린 구조 및 작용은 예를 들면, 문헌[참조: Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988]을 참조한다. 재조합체 항체 기술의 모든 측면에 대한 집중적인 도입 및 상세한 정보는 문헌[참조: textbook Recombinant Antibodies (John Wiley & Sons, NY, 1999)]에서 찾을 수 있다. 상세한 항체 가공 실험실 프로토콜의 포괄적인 수집은 문헌[참조: R. Kontermann 및 S. Dubel, Eds., The Antibody Engineering Lab Manual (Springer Verlag, Heidelberg/New York, 2000)]에서 찾을 수 있다. 추가의 관련 프로토콜은 또한 문헌[참조: Current Protocols in Immunology (August 2009) published by John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA]에서 이용가능하다.
본원에 사용된 것으로서 "유도체"는 모 화합물과 구조적으로 유사하고(실제로 또는 이론적으로) 모 화합물로부터 유도할 수 있는 화합물의 화학적으로 또는 생물학적으로 변형된 버젼을 말한다. 일반적으로, "유도체"는, 모 화합물이 "유도체"를 생성하기 위한 출발 물질일 수 있는 "유사체"와는 상이한 반면, 모 화합물은 "유사체"를 생성하기 위한 출발 물질로서 필수적으로 사용되지 않을 수 있다. 유사체는 모 화합물과는 상이한 화학적 또는 물리적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 유도체는 보다 친수성일 수 있거나 또는 모 화합물과 비교하여 변경된 반응성(예를 들면, 표적에 대한 이의 친화성을 변경시키는 아미노산 변화를 갖는 CDR)을 가질 수 있다.
용어 "생물학적 시료"는 혈액 시료, 생검 표본, 조직 이식체, 기관 배양물, 생물학적 유액(예를 들면, 혈청, 뇨, CSF) 또는 대상체 또는 생물학적 공급원으로부터의 특정의 다른 조직 또는 세포 또는 기타 제제를 포함한다. 대상체 또는 생물학적 공급원은 예를 들면, 인간 또는 비-인간 동물, 원생 세포 배양물, 또는 염색체적으로 통합되거나 에피솜 재조합체 핵산 서열, 체세포 하이브리드 세포주, 무한증식 또는 무한증식가능한 세포주, 분화되거나 분화가능한 세포주, 형질전환된 세포주 등을 함유할 수 있는 유전적으로 가공된 세포주를 포함하는 배양물 적응된 세포주일 수 있다. 당해 기재내용의 추가의 양태에서, 대상체 또는 생물학적 공급원은 악성 질병, 질환 또는 상태 또는 B 세포 질환을 포함하는 질병, 질환 또는 상태를 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 예측될 수 있다. 특정 양태에서, 대상체 또는 생물학적 공급원은 고증식성, 염증성 또는 자가면역 질병을 갖거나 가질 위험이 있는 것으로 예측될 수 있으며, 본 기재내용의 특정의 다른 양태에서, 대상체 또는 생물학적 공급원은 이러한 질병, 질환 또는 상태의 위험 또는 존재가 없는 것으로 알려질 수 있다.
CD86 결합 도메인
본원에 나타낸 것으로서, CD86은 면역글로불린 상과의 구성원인 제I형 막 단백질을 포함한다. CD86은 항원-제시 세포에 의해 발현되며 2개의 T-세포 단백질 CD28 및 CTLA4에 대한 리간드이다. CD28과 CD28의 결합은 T-세포의 활성화를 위한 공자극 시그날인 반면, CD28과 CTLA4의 결합은 T-세포 활성화를 하향조절하고 면역 반응을 감소시킨다. 대체 스플라이싱은 상이한 동형을 암호화하는 2개의 전사 변이체(유전자뱅크 수탁 번호 제NP_787058.3호 및 제NP_008820.2호)를 생성한다.
본 기재내용의 CD86 결합 도메인은 CD28에 대한 CD86의 결합을 차단함으로써 T-세포 활성화를 하향조절할 수 있다. 고려된 CD86 결합 도메인은 CTLA4 세포외 도메인 또는 이의 서브-도메인, CD28 세포외 도메인 또는 서브-도메인, 또는 CD86-특이적인 항체-기원한 결합 도메인[예: FUN1 모노클로날 항체(참조: 예를 들면, J Pathol. 1993 Mar;169(3):309-15)로부터 유래한 것]을 포함하거나; 또는 3D1 항-CD86 모노클로날 항체로부터 유래한다.
일부 양태에서, CD86 결합 도메인은 서열번호: 1(시그날 펩타이드: 아미노산 1-37)의 인간 CTLA4(유전자뱅크 수탁 번호 제NP_005205호)의 세포외 도메인("엑토도메인")이다. 시그날 펩타이드가 없는 CTLA4 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열번호: 410으로 제공된다. 출원인들은, 특정 연구에서 CTLA4 엑토도메인의 성숙한 폴리펩타이드가 서열번호: 1의 38번 위치의 메티오닌으로부터 개시됨을 나타내었으며, 다른 연구는, 성숙한 폴리펩타이드가 37번 위치의 알라닌에서 개시함을 나타내었다. 추가의 양태에서, CD86 결합 도메인은 야생형 또는 예를 들면, 미국 특허 공보 제2003/0035816호에 기재된 바와 같은 돌연변이되지 않은 CTLA4의 것보다 CD86에 대해 항원항체 결합력이 보다 크도록 하기 위해 돌연변이된 CTLA4의 엑토도메인이다. 특정 양태에서, 돌연변이된 CTLA4 엑토도메인은 서열번호: 410의 29번 아미노산 위치에서 알라닌 또는 타이로신을 포함하고/하거나 104번 위치에서 글루탐산, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민, 이소루이신, 루이신 또는 트레오닌을 포함한다. A29Y L104E CTLA 4 엑토도메인 변이체에 대한 아미노산 서열은 서열번호: 411로 제공된다. 특정의 양태에서, CD86 결합 도메인은 서열번호: 3에서 제공된 서열과 같은 CTLA-4 가변-유사 도메인, 또는 서열번호: 4(CDR1), 서열번호: 5(CDR2) 또는 서열번호: 6(CDR3)과 같은 CTLA-4 가변-유사 도메인의 CDR이다. 이러한 CDR은 예를 들면, 미국 특허 제7,405,288호에 기술되어 있다. 대체 양태에서, CD86 결합 도메인은 서열번호: 2에 제공된 서열과 같은 CD28(유전자뱅크 수탁 번호 제NP_006130.1호)의 세포외 도메인("엑토도메인")이다. 서열번호: 2의 1 내지 18번 아미노산은 시그날 펩타이드이다. 시그날 펩타이드가 없는 CD28의 엑토도메인의 아미노산 서열은 서열번호: 412에서 제공된다.
다른 추가의 양태에서, CD86 결합 도메인은 CD86에 대해 특이적인 scFv와 같은 일본쇄 면역글로불린-유사 도메인을 포함한다. 특정의 양태에서, CD86 결합 도메인은 모노클로날 항체 FUN1 또는 3D1으로부터의 경쇄 및 중쇄 가변 결합 도메인을 함유한다. FUN1 및 3D1 항-CD86 모노클로날 항체로부터의 중쇄, 경쇄, scFv 링커, 및 CDR에 대한 서열은 각각 서열번호: 305 내지 313 및 318 내지 326에 나타내며, 이들은 본 기재내용의 xceptor 분자에서 사용될 수 있다.
하나의 측면에서, 당해 기재내용의 CD86 결합 도메인 또는 이의 융합 단백질은 CD86에 대해 특이적이며 해리 상수(Kd)가 약 10-3 M 내지 약 10-8 M 미만인 친화성을 갖는다. 특정의 바람직한 양태에서, CD86 결합 도메인 또는 이의 융합 단백질은, 약 0.3μM의 친화성으로 CD86과 결합한다.
예시적인 예에서, 당해 기재내용의 CD86 결합 도메인은 합성 또는 재조합체 CD86(유전자뱅크 수탁 번호 제NP_787058.3호 또는 제NP_008820.2호에 설정된 것으로서 아미노산 서열 또는 이의 단편을 사용함)에 대한 결합에 대해 스크리닝함으로써 단편의 Fab 파아지 라이브러리를 사용하여 확인할 수 있다[참조: 예를 들면, Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:344]. 특정 양태에서, CD86 결합 도메인을 생성하기 위해 사용된 CD86 분자는 면역글로불린 Fc 도메인 또는 이의 단편과 같이, 본원에 기술된 것으로서, 또한 개재 도메인 또는 이량체화 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 기재내용의 CD86 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 VH 및 VL 도메인(예를 들면, FUN1, 3D1, 또는 이의 인간화된 유도체)를 포함한다. 다른 예시적인 VH 및 VL 도메인은 미국 특허 제6,827,934호에 기술된 것들을 포함한다. 특정 양태에서, VH 및 VL 도메인은 인간이다. 추가의 양태에서, 서열번호: 305 및 306, 서열번호: 318 및 319의 하나 이상의 경쇄 가변 영역(VL) 또는 하나 이상의 중쇄 가변 영역(VH), 또는 이들 둘 다의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 적어도 100% 동일한 서열을 갖는 본 기재내용의 CD86 결합 도메인이 제공되며, 여기서, 각각의 CDR은 0, 1, 2 또는 3개의 아미노산 변화[즉, 대부분의 변화는 프레임 영역(들)내에 있다]를 가질 수 있다.
2개 이상의 폴리펩타이드 또는 핵산 분자 서열의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 "상동성 비율(퍼센트)"은 서열 비교 알고리즘, 수동 정렬 또는 가시적 관측과 같은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 측정한 것으로서, 비교 윈도우(comparison window) 또는 지정된 영역에 걸친 최대 상응성에 대해 비교하고 정렬하는 경우, 특정 영역에 걸쳐 동일한(예를 들면, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 동일하거나 명시된 퍼센트를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 의미한다. 예를 들면, 서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하기에 적합한 바람직한 알고리즘은 각각 문헌[참조: Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389] 및 문헌[참조: Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403]에 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다.
VL 및 VH 도메인이 요구될 수 있는 본원에 기술된 이들 또는 다른 양태 중 어느 것에서, VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬되어 본원에 기술된 바와 같은 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 특정의 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VH 및 VL 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43 내지 166, 244, 307, 320, 355 내지 379 및 383 내지 398에 설정된 바와 같은 아미노산 서열, 예를 들면, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 링커 131(서열번호: 164), 링커 115(서열번호: 148), 또는 서열번호: 244에서 제공된 링커를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조, 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 대한 유사성에 의해 쌍을 이룬 VH 및 VL 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인 서브-결합 도메인을 가질 것이다.
CDR은 카바트(Kabat), 쵸티아(Chothia), AbM, 및 접촉 정의를 포함하는, 당해 분야의 각종 방법에서 정의된다. 카바트 정의는 서열 가변성을 기초로 하며 CDR 영역을 예측하기 위해 가장 일반적으로 사용된 정의이다[참조: Johnson et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:214]. 쵸티아 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기초로 한다[참조: Chothia et al. (1986) J. Mol. Biol. 196:901; Chothia et al. (1989) Nature 342:877]. AbM 정의, 카바트 정의와 쵸티아 정의 사이의 절충은 옥스포드 몰리큘러 그룹에 의해 제조된 항체 구조 모델화용 프로그램의 통합적인 세트(integral suite)이다[참조: Martin et al. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 86:9268; Rees et al., ABMTM, a computer program for modeling variable regions of antibodies, Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.]. 접촉 정의로 공지된 추가의 정의는 최근에 도입되었으며[참조: MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol. 5:732], 이는 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석을 기초로 한다.
통상적으로, 중쇄내 CDR 도메인은 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지 이동하는 순서로 순차적으로 번호매김된, H1, H2, 및 H3로 언급된다. CDR-H1은 길이가 약 10 내지 12개 잔기이며 쵸티아 및 AbM 정의에 따라 Cys 이후에 4개의 잔기, 또는 카바트 정의에 따라 이후의 5개의 잔기로 시작한다. H1은 Trp, Trp-Val, Trp-Ile, 또는 Trp-Ala이 이어서 올 수 있다. H1의 길이는 AbM 정의에 따라 대략 10 내지 12개 잔기인 반면, 쵸티아 정의는 마지막 4개 잔기를 배제한다. CDR-H2는 카바트 및 AbM 정의에 따라 H1의 말단 이후 15개 잔기에서 시작하며, 이는 일반적으로 서열 Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(그러나 변이의 수는 알려져 있다)에 의해 진행되며 일반적으로 서열 Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala가 이어진다. 카바트 정의에 따르면, H2의 길이는 약 16 내지 19개 잔기인 반면, AbM 정의는 길이가 9 내지 12개 잔기인 것으로 예측한다. CDR-H3은 일반적으로 H2의 끝 이후에 33개 잔기로 시작하며, 일반적으로 아미노산 서열 Cys-Ala-Arg이 진행된 후 아미노산 Gly가 이어지고, 3 내지 약 25개 잔기 범위의 길이를 갖는다.
통상적으로, 경쇄내 CDR 영역은 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 이동하는 순서로 연속해서 번호매김된 L1, L2, 및 L3로 언급된다. CDR-L1(길이가 대략 10 내지 17개 잔기)은 일반적으로 약 24번 잔기에서 시작하며 일반적으로 Cys가 이어진다. CDR-L1 이후의 잔기는 항상 Trp이며, 이는 다음 서열의 한쪽에서 시작한다: Trp-Tyr-Gln, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, 또는 Trp-Tyr-Leu. CDR-L2(길이가 약 7개 잔기)는 L1의 끝 이후의 약 16개 잔기에서 시작하며, 이는 일반적으로 잔기 Ile-Tyr, Val-Tyr, Ile-Lys, 또는 Ile-Phe이 따른다. CDR-L3은 일반적으로 L2의 말단 이후의 33개 잔기에서 시작하며 일반적으로 Cys가 이어지고, 이는 일반적으로 서열 Phe-Gly-XXX-Gly이 이어지며 길이가 약 7 내지 11개 잔기이다.
따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-CD86 항체의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 당해 기재내용의 결합 도메인은 골격 영역, 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 CD86에 대해 특이적인 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서, (a) VH 도메인은 중쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) VL 도메인은 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 결합 도메인은 (a)의 VH 아미노산 서열 및 (b)의 VL 아미노산 서열을 포함하거나; 결합 도메인은 (a)의 VH 아미노산 서열 및 (b)의 VL 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, VH 및 VL은 동일한 참조 서열에서 발견된다. 추가의 양태에서, 당해 기재내용의 결합 도메인은 골격 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 CD86에 대해 특이적인 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서, (a) VH 도메인은 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) VL 도메인은 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하거나; (c) 결합 도메인은 (a)의 VH 아미노산 서열 및 (b)의 VL 아미노산 서열을 포함하거나; 결합 도메인은 (a)의 VH 아미노산 서열 및 (b)의 VL 아미노산 서열을 포함하고, 여기서, VH 및 VL 아미노산 서열은 동일한 참조 서열로부터 기원한다.
특이적인 CDR을 포함하는 본원에 기재된 양태 중 어느 것에서도, 결합 도메인은 (i) VH 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인; 또는 (ii) VL 도메인의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인; 또는 (iii) (i)의 VH 도메인 및 (ii)의 VL 도메인 둘 다; 또는 (i)의 VH 도메인 및 (ii)의 VL 도메인 둘 다(여기서, VH 및 VL은 동일한 참조 서열로부터 기원한다)를 포함할 수 있으며, 여기서, 각각의 CDR은 3개 이하의 아미노산 변화(즉, 많은 변화들이 골격 영역(들)내 있다)를 갖는다.
본 기재내용의 xceptor 융합 단백질내 CD86 결합 도메인은 면역글로불린 스캐폴드(scaffold)와 같은 면역글로불린-유사 도메인일 수 있다. 본 기재내용에 의해 고려된 면역글로불린 스캐폴드는 scFv, 도메인 항체, 또는 중쇄-유일 항체를 포함한다. scFv에서, 본 기재내용은, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 본원에 기술되거나 당해 분야에서 결합 분자내 결합 도메인 또는 영역들과 혼화성인 것으로 알려진 어떠한 링커 펩타이드에 의해 결합된다. 예시적인 링커는 (Gly4Ser)n(여기서, n은 1 내지 5이다)와 같은 Gly4Ser 링커 모티프를 기초로 하는 링커이다. 본 기재내용의 융합 단백질의 결합 도메인이 비-인간 면역글로불린을 기초로 하거나 비-인간 CDR을 포함하는 경우, 결합 도메인은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 "인간화"될 수 있다.
이와는 달리, 본 기재내용의 융합 단백질의 CD86 결합 도메인은 면역글로불린 스캐폴드이외의 스캐폴드(scaffold)일 수 있다. 본 기재내용에 의해 고려된 다른 스캐폴드는 작용적 구조내에서 CD86-특이적인 CDR(s)를 나타낸다. 고려된 다른 스캐폴드는 도메인 분자, 피브로넥틴 III 도메인, 안티칼린, 안키린-반복 가공된 결합 분자, 아드넥틴, 쿠니츠(Kunitz) 도메인 또는 단백질 AZ 도메인 아피바디(affibody)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
IL10
위에서 주목한 바와 같이, 특정 양태에서, 본 기재내용은 IL10 효능제(즉, IL10 시그날링을 증가시킬 수 있는 효능제)인 도메인 또는 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, IL10 효능제 결합 도메인은 IL10 또는 IL10Fc, 또는 이의 작용성 서브-도메인이다. 다른 양태에서, IL10 효능제 결합 도메인은 일본쇄 결합 단백질, 예를 들면, IL10R1 또는 IL10R2에 특이적으로 결합할 수 있는 scFv이다. 일부 양태에서, IL10 효능제 결합 도메인은 "I"로 부터 "A" 또는 "S"(본원에서 각각 I87A 또는 I87S로 언급됨)와 같은 서열번호: 7의 87번 위치에서 점 돌연변이를 함유하는 IL10이다. I87 변이체 IL10 분자는 야생형 IL10과 비교하여 면역-자긍성이 거의 없는 것으로 알려져 있다[참조: Ding et al., J. Exp. Med . 191:213, 2000]. 또한, IL10은 통상적으로 다른 단량체의 카복시 말단 도메인에 결합하는 각각의 단량체 분자의 아미노 말단 도메인과 함께 단독 이량체를 형성한다. 하나의 양태에서, IL10 효능제 결합 도메인은 분자의 2개의 서브도메인(아미노 및 카복시 말단 도메인)을 분리시킴으로써 이들 서브도메인이 또한 시험된 분자내 이량체를 형성할 수 있는 짧은 링커(gggsgg 서열번호: 379)를 갖는 IL10 분자이다. 이들은 본원에서 모노IL10 분자로 언급된다.
IL10(유전자뱅크 수탁 번호 제NP_000563.1호; 서열번호: 7)은 알파-나선 구조를 공유하는 사이토킨 상과의 구성원이다. 서열번호: 7의 1 내지 18번 아미노산은 전구체 IL10 단백질의 단일 펩타이드이다. 성숙한 IL10 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 418에서 제공된다. 비록 실험적 증거가 존재하지 않는다고 해도, 모든 과 구성원은 6개의 알파-나선을 지닌다고 제안되고 있다[참조: Fickenscher, H. et al., (2002) Trends Immunol. 23: 89]. IL10은 4개의 시스테인을 가지며, 이들 중 단지 하나가 과 구성원 중에서 보존된다. IL10은 이의 이량체화에 기여하는 V-형 폴드를 입증하므로, 이황화물 결합이 당해 구조에 중요하지 않은 것으로 여겨진다. IL10에 대한 과 구성원의 아미노산 동질성은 20%(IL-19) 내지 28%(IL-20)의 범위이다[참조: Dumouter et al., (2002) Eur. Cytokine Netw. 13:5].
IL10은 처음에 Th1 세포에 의해 IFN-α 및 GM-CSF 사이토킨 생성을 억제한 마우스에서 Th2 사이토킨으로 기술되었다[참조: Moore et al., 2001, Annu. Rev. Immunol. 19:683; Fiorentino et al., (1989) J. Exp. Med. 170: 2081]. 인간 IL10은, 18개의 아미노산 시그날 서열 및 160개의 아미노산 성숙한 분절을 갖는 길이가 178개인 아미노산이다. 이의 분자량은 약 18 kDa(단량체)이다. 인간 IL10은 강력한 N-연결된 글리코실화 부위를 함유하지 않으며 글리코실화되지 않는다[참조: Dumouter et al., (2002) Eur. Cytokine Netw. 13:5; Vieira et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1172]. 이는 2개의 쇄내 이황화물 결합을 형성하는 4개의 시스테인 잔기를 함유한다. 하나의 단량체의 나선 A --> D는 제2 단량체의 나선 E 및 F와 비공유결합적으로 상호작용하여 비공유결합성 V-유형 단독 이량체를 형성한다. 작용 부위는 IL10 분자상에서 맵핑되었다. N-말단에서, 예비-나선 A 잔기 1 내지 9번은 유방 세포 증식에 관여하는 방면, C-말단에서, 나선 F 잔기 152 내지 160번은 백혈구 분비 및 화학주성을 매개한다.
IL10을 발현하는 것으로 공지된 세포는 CD8+ T 세포, 미세아교세포, CD14+(그러나 CD16+는 아니다) 단세포, Th2 CD4+ 세포(마우스), 각질세포, 간 별모양 세포, Th1 및 Th2 CD4+ T 세포(인간), 흑색종 세포, 활성화된 대식구, NK 세포, 수지상 세포, B 세포(CD5+ 및 CD19+) 및 호중구를 포함한다. T 세포상에서, IFN-감마 생산의 IL10 억제의 초기 관측은 본 발명에 이르러 보조 세포에 의해 매개된 간접적인 효과인 것으로 제안된다. 그러나, T 세포상에서의 추가의 효과는 IL10 유도된 CD8+ T 세포 화학주성, IL-8에 대한 CD4+ T 세포 화학주성의 억제, IL-2 생산에 이은 활성화의 억제, Bcl-2 상향-조절을 통한 T 세포 세포자멸사의 억제, 및 T 세포 증식의 차단에 이은 CD28 공자극에 의해 동반된 낮은 항원 노출을 포함한다[참조: Akdis et al., (2001) Immunology 103:131].
B 세포에서, IL10은 관련되어 있으나, 여전히 명백한 작용의 구성원을 갖는다. TNF-β 및 CD40L과 함께, IL10은 미가공(naive) (IgD+) B 세포에서 IgA 생산을 유도한다. TGF-β/CD40L은 부류 스위칭(class switching)을 촉진하는 반면, IL10은 분화 및 성장을 개시하는 것으로 여겨진다. TGF-β가 존재하지 않는 경우, IL10은 IgG1 및 IgG3(사람)을 유도하는데 있어 CD40L과 협동함으로써, IgG 아형(subtype)에 대한 직접적인 스위치 인자일 수 있다. 흥미롭게도, IL10은 IL-4 유도된 IgE 분비에서 다양한 효과를 갖는다. IL10이 IL-4 유도된 부류 스위칭 시기에 존재하는 경우, 이는 효과를 역전시키며; 이것이 IgE 투입 후 존재하는 경우, 이는 IgE 분비를 증강시킨다. 최종적으로, IL10의 존재하에서 CD27/CD70 상호작용은 기억 B 세포로부터 혈장 세포 형성을 촉진한다[참조: Agematsu et al., (1998) Blood 91: 173].
유방 세포 및 NK 세포는 또한 IL10에 의해 영향을 받는다. 유방 세포에서, IL10은 히스타민 방출을 유도하는 반면 GM-CSF 및 TNF-α 방출을 차단한다. 당해 효과는, IL10이 랫트에서 유방 세포에 의해 방출되는 것으로 알려져 있기 때문에 자가분비성일 수 있다. 이의 다면발현적 특성의 증거로서, IL10은 NK 세포상에서 반대 효과를 갖는다. TNF-α 및 GM-CSF 생산을 차단하기 보다는, IL10은 실제로 NK 세포상에서 당해 작용을 촉진한다. 또한, 이는 IL-2 유도된 NK 세포 증식을 강화하며 IL-18에 의해 프라이밍된 NK 세포에서 IFN-γ 분비를 촉진한다. IL-12 및/또는 IL-18 둘 다와 관련해서, IL10은 NK 세포 세포독성을 강화한다[참조: Cai et al., 1999, Eur. J. Immunol. 29: 2658].
IL10은 호중구에서 공지된 소염 효과를 가진다. 이는 케모킨 MIP-1α, MIP-1β 및 IL-8의 분비를 억제하며, 전염증 매개인자 IL-1β 및 TNF-α의 생산을 차단한다. 또한, 이는 호중구의 능력을 감소시켜 슈퍼옥사이드를 생산하며, 그 결과 PMN-매개된 항체-의존성 세포 세포독성을 방해한다. 이는 또한 가능하게는 CXCR1을 통해 IL-8 및 fMLP-유도된 화학주성을 차단한다[참조: Vicioso et al., (1998) Eur. Cytokine Netw. 9:247].
수지상 세포(DC)에서, IL10은 일반적으로 면역억제 효과를 나타낸다. 이는 DC의 사용시 CD14+ 대식구 분화를 촉진하는 것으로 여겨진다. IL10은 DC의 능력을 감소시켜 T 세포, 특히 Th1형 세포에 대하여 자극시키는 것으로 여겨진다. MHC-II 발현과 관련하여, 이는 하향-조절되거나 변화되지 않거나 또는 상향-조절될 수 있다[참조: Sharma et al., (1999) J. Immunol. 163:5020]. CD80 및 CD86과 관련하여, IL10은 이의 발현을 상향-조절하거나 하향-조절한다. B7-2/CD86은 T 세포 활성화에서 중요한 역할을 한다. 당해 분자의 경우, IL10은 상향-조절 및 하향-조절 둘 다에 관여한다. 그러나 아마도 대부분의 현저한 조절은 CD40과 함께 발생한다(IL10은 이의 발현을 감소시키는 것으로 여겨진다). 영역별 수준에서, IL10은 전염증성 사이토킨에 대한 반응시 랑게르한스 세포 이주를 억제함으로써 면역자극을 차단할 수 있다. 달리는, IL10은 일반적으로 CCR1, CCR2 및 CCR5 하향-조절 및 CCR7 상향-조절을 포함하는 염증-유도된 DC 성숙 단계를 차단한다. CCR1, CCR2 및 CCR5의 보유와 함께 당해 차단은 DC가 부위 림프절로 이주하지 못하도록 한다. 당해 결과는 T 세포를 자극시키지 않지만, 이들에 대한 반응없이 전염증성 케모킨에 결합(및 청소)할 것이다[참조: D-Amico et al., (2000) Nat. Immunol. 1:387].
단핵 세포에서, IL10은 다수의 문서화된 효과를 갖는다. 예를 들면, IL10은 세포 표면 MHC-II 발현을 명확하게 감소시키는 것으로 여겨진다. 이는 또한 IL-12 생산에 이은 자극을 억제한다. 이것이 M-CSF와 함께 대식세포에 대한 단핵세포 이전을 촉진하는 동안, 대식구의 표현형은 명확하지 않다(즉, CD16+/세포독성 대 CD16-). IL10은 또한 단핵세포 GM-CSF 분비 및 IL-8 생산을 감소시키는 반면, IL-1ra 방출을 촉진한다[참조: Gesser et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:14620]. 연결 조직 성분인, 하이알루로넥틴(Hyaluronectin)은 본 발명에 이르러 IL10에 대한 반응시 단핵세포에 의해 분비되는 것으로 알려져 있다. 이는 세포 이주, 특히 종양 세포 전이에 있어 일부 중요성을 가질 수 있으며, 여기서, 하이알루로넥틴은 세포외 공간을 통해 세포 이주를 차단하는 것으로 알려져 있다[참조: Gesser et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:14620].
IL10과 쥐(murine) 또는 짧은 고리 원숭이(macaque) Fc 영역(IL10Fc로서 언급됨)의 융합 단백질은 대식구 작용을 억제하고 이자 섬 이종이식체 생존[참조: Feng et al. (1999) Transplantation 68:1775; Asiedu et al. (2007) Cytokine 40:183]을 연장시키고, 쥐 모델에서 패혈성 쇼크를 감소시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Zheng et al. (1995) J. Immunol. 154:5590].
인간 IL10R1은 제한된 수의 세포 유형에서 발현되는 90 내지 110 kDa의 1회-통과 제I형 막통과 당단백질이다[참조: Liu et al., 1994, J. Immunol. 152: 1821]. 약한 발현이 췌장, 골격근, 뇌, 심장 및 신장에서 관측된다. 태반, 폐 및 간은 중간 수준을 나타내었다. 단핵세포, B-세포, 거대 과립구 림프세포 및 T-세포는 높은 수준을 발현한다(참조: Liu et al., 1994, J. Immunol. 152: 1821). 발현된 단백질은 21개의 아미노산 시그날 펩타이드, 215개의 아미노산 세포외 영역, 25개의 아미노산 막관통 분절 및 317개의 아미노산 세포질성 도메인을 함유하는 578개의 아미노산 단백질이다. 세포외 영역 내에는 2개의 FNIII 모티프가 있으며 세포질성 도메인내에는 STAT3 도킹 부위 및 JAK1 관련 영역이 있다[참조: Kotenko et al., 2000 Oncogene 19: 2557; Kotenko et al., 1997, EMBO J. 16: 5894]. IL10R1은 200 pM의 Kd로 인간 IL10에 결합한다.
일부 양태에서, 당해 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이 IL10R1 또는 IL10R2에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인은 사람이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있으며 본원에 기술된 바와 같이 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43 내지 166, 244, 307, 320, 355 내지 379 및 383 내지 398, 예를 들면, 서열번호: 244로 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조, 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 대한 유사성에 의해, 쌍을 이룬 VL 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인 서브-결합 도메인을 가질 수 있다. 추가의 양태에서, 본 기재내용의 IL10R1 또는 IL10R2에 대해 특이적인 결합 도메인은 항-IL10R1 또는 IL10R2 scFv 또는 Fab 단편의 가변 영역으로부터 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나, 또는 지정된 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR"), 또는 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-IL10R1 또는 IL10R2의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 이는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 골격 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 IL10R1 또는 IL10R2에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다.
HLA-G
위에서 서술한 바와 같이, 특정 양태에서, 본 기재내용은 HLA-G 효능제(즉, HLA-G 시그날링을 증가시킬 수 있는 효능제)인 도메인 또는 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, HLA-G 효능제 결합 도메인은 HLA-G1(서열번호: 14), HLA-G5(서열번호: 15) 또는 성숙한 단백질의 147번 위치에서 시스테인이 다른 아미노산, 예를 들면, 세린으로 돌연변이된 HLA-G 무테인이다. HLA-G1 및 HLA-G5의 아미노산 1-24 및 1-23 각각은 시그날 펩타이드를 나타낸다. 다른 양태에서, HLA-G 효능제 도메인은 가변 링커(flexible linker)에 의해 N-말단에 부착된 β-2 마이크로글로불린이 있거나 없는 HLA-G1 또는 HLA-G5의 엑토도메인이다. 이러한 링커의 예는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398에 제공된 것들을 포함하며 하기 기술되어 있다. 가용성 HLA-G1의 제조는 미국 특허공개 공보 제2004/0044182호에 기술되어 있다.
여전히 다른 양태에서, HLA-G 효능제 결합 도메인은 면역글로불린 가변성 결합 도메인, 또는 ILT2, ILT4 또는 KIR2DL4에 특이적으로 결합하는 이의 유도체(예를 들면, 항체, Fab, scFv, 등)이다. ILT2, ILT4 또는 KIR2DL4에 대해 특이적인 항체는 예를 들면, 미국 특허공개 공보 제2003/0232051호에 기술된 것들을 포함한다.
인간 백혈구 항원 G(HLA-G)는 막에 고정(anchor)된 중쇄, 및 경쇄(베타-2 마이클로글로불린)으로 이루어진 이종이합체인 비전통적인 주요 조직적합성 복합체(MHC) 제I 부류 분자이다. HLA-G는 모체 면역계로부터의 태아 조직을 보호하는 면역조절 분자로서 작용한다. HLA-G의 구성적 발현이 태아 조직, 성인 흉선 수질, 각막, 이자섬 및 적혈구 및 내피 세포 전구체에 한정된다고 해도, 이의 발현은 암, 이식, 다발성경화증, 염증병 및 바이러스 감염에서 유도될 수 있다. HLA-G 주요 전사체는 막-결합된 단백질 동형 HLA-G1, -G2, -G3 및 -G4, 및 가용성 단백질 동형 HLA-G5, HLA-G6 및 HLA-G7을 암호화하는 7개의 다른 mRNA를 생성하며, 여기서, HLA-G5는 세포-표면 결합된 HLA-G1 단백질의 가용성 형태이다.
HLA-G가 현저한 면역 자극 작용을 가진 것으로 여겨지지 않는다고 해도, 이는 억제성 수용체, 즉 ILT2, ILT4, KIR2DL4 및 CD8에 결합함으로써, B-세포, T-세포, NK 세포 및 항원-제시 세포와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. HLA-G의 이량체 형태는 ILT4, KIR2DL4 또는 CD8에 대한 친화성보다 몇개 차수 큰 크기의 ILT2에 대한 친화성을 갖는다. HLA-G1은 자궁 및 말초 혈액 NK 세포의 세포 분해성 작용, 세포독성 T 림프구의 항원-특이적인 세포분해성 작용, CD4+ T-세포의 동종증식성 반응, T-세포 및 말초 혈액 NK 세포의 증식, 및 수지 세포의 성숙 및 작용을 억제하는 것으로 밝혀졌다[참조: 예를 들면, Wiendl et al. (2003) Blood, 126:176-185]. HLA-G는 다발성 경화증과 관련된 CNS에서 염증성 반응을 감소시키고[참조: Wiendl et al. (2005) Blood, 128:2689-2704], 이식에서 이식체에 대한 내성을 촉진시키는데 있어 치료제로서 유용할 수 있다고 제안되어 왔다[참조: Carosella et al. (2008) Blood 111:4862-4870].
일부 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 ILT2, ILT4 또는 KIR2DL4에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인은 인간이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있으며 본원에 기재된 바와 같이 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성(compatible)인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398 중 특정의 하나 이상에 설정된 바와 같은 아미노산 서열, 예를 들면, 링커 115(서열번호: 148), 서열번호: 244에 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)을 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조에 대한 유사성 또는 적어도 4개의 특이적인 소-결합 도메인에 의해, 쌍을 이룬 VL 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인 서브-결합 도메인을 가질 수 있다.
추가의 양태에서, 당해 기재내용의 ILT2, ILT4 또는 KIR2DL4에 대해 특이적인 결합 도메인은 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR"), 또는 항-ILT2, -ILT4 또는 -KIR2DL4 scFv 또는 Fab 단편 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나, 또는 설계된 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 당해 기재내용의 결합 도메인은 항-ILT2, -ILT4 또는 -KIR2DL4의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 이는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다.
HGF
위에 서술한 바와 같이, 특정 양태에서 본 기재내용은 HGF 효능제(즉, HGF 시그날링을 증가시킬 수 있는 효능제)인 도메인 또는 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, HGF 효능제 결합 도메인은 HGF 또는 이의 작용성 서브-도메인이다.
간세포 성장 인자(HGF)는 광-온코진성 c-Met 수용체에 대한 결합 후 타이로신 키나제 시그날링 캐스케이드를 활성화시킴으로써 세포 성장, 세포 운동성, 및 형태발생을 조절한다. HGF는 다수의 세포 유형에 영향을 미치며 사이토킨 생산, 세포 이주, 증식 및 생존을 포함하는 각종 생물학적 활성을 조절한다. HGF는 단일의 불활성 폴리펩타이드로서 분비되며 69-kDa 알파-쇄 및 34-kDa 베타-쇄내로 세린 프로테아제에 의해 분해된다. 알파 쇄와 베타 쇄 사이의 이황화물 결합은 활성인, 이종이량체성 분자를 생산한다. HGF 유전자의 대안적인 스플라이싱은 5개의 상이한 동형(동형 1-5; 각각 진뱅크 수탁번호 제NP_000592.3호, 제NP_001010931.1호, 제NP_001010932.1호, 제NP_001010933.1호 및 제NP_001010934.1호; 서열번호: 18-22; 이들 서열 각각의 1 내지 31번 아미노산은 시그날 펩타이드이다)을 생성한다.
HGF는 질병 진행의 예방 및 획득에 있어 중요한 인자인 것으로 여겨진다[참조: Ito et al. (2008) Int. Arch. Allergy Immunol. 146 Suppl 1:82-87]. 예를 들면, HGF는 마우스에서 콜라겐-유도된 관절염을 억제하는데 효과적이고[참조: Okunishi et al. (2007) Jnl. Immunol. 179:5504-5513], 알레르기성 기도 염증의 마우스 모델에서 보호성 역활을 하는데[참조; Okunishi et al. (2005) Jnl. Immunol. 175:4745-4753; Ito et al. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. (2005) 32:268-280] 효과적인 것으로 밝혀졌다.
일부 양태에서, 당해 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 HGF에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인은 인간이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있거나 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 약 30개 이하의 아미노산 링커에 의해 분리될 수 있다. 특정의 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398중의 어느 하나 이상에 설정된 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호: 244에 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조에 대한 유사성 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 의해, 쌍을 이룬 VL 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사상에 의해 적어도 2개의 특이적인 서브-결합 도메인을 가질 수 있다. 추가의 양태에서, 본 기내내용의 HGF에 대해 특이적인 결합 도메인은 항-HGF scFv 또는 Fab 단편의 가변 영역 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나 또는 설계된, 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR"), 또는 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-HGF의 가변 영역으로부터의 단일의 CDR을 포함할 수 있거나, 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 골격 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 HGF에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다.
IL35
위에서 서술한 바와 같이, 특정 양태에서, 본 기재내용은 IL35 효능제(즉, IL35 시그날링을 증가시킬 수 있는 효능제)인 도메인 또는 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, IL35 효능제 결합 도메인은 IL35(예를 들면, 서열번호: 25 및 26) 또는 이의 작용성 서브-도메인이다. 특정 양태에서, IL35 효능제 결합 도메인은 서열번호: 25 및 26의 서열을 포함하는 일본쇄 폴리펩타이드 또는 이의 작용성 서브-도메인이다. 이러한 일본쇄 폴리펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 링커를 포함하는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, IL35 효능제 결합 도메인은 IL35 효능제 활성을 갖는 IL35R에 대해 특이적인, scFv와 같은, 일본쇄 면역글로불린 가변 도메인이다.
IL-35는 IL-12 사이토킨 소계열의 새로이 기술된 사이토킨이다. 이종이합체성 분자는 IL-12 p35 및 IL-27 Ebi3 소단위로 구성된다. 이는 최근에 Treg 작용의 강력한 유도인자이며 관절염의 마우스 모델에서 TH17 반응을 변경시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Niedbala et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37:3021; Collison et al. (2007) Nature 450:566]. 따라서, IL-35 길항작용과 CD86 억제의 결합은 CD28 억제 단독의 치료학적 이점을 증가시키는 것으로 예측된다.
조절성 T-세포(TREGS)는 천식 및 염증성 창자병과 같은 만성 염증성 질병을 제한하고, 항상성 림프구 확장을 조절하기 위해 자가 내성을 유지하고 자가면역성을 예방하는데 중요한 CD4+ T 세포의 중요한 서브-집단이다. IL35는 조절성 T 세포의 확장 및 Th17 세포 발달의 억제를 자극함으로써 면역 반응을 억제하는 것으로 밝혀진 소염성 사이토킨이다[참조: Collison et al. (2007) Nature 450:566-9]. IL35는 엡슈타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스-유도된 유전자 3(EBI3; 서열번호: 25; 시그날 펩타이드: 아미노산 1-20) 및 IL12의 p35소단위(서열번호: 26; 시그날 펩타이드: 아미노산 1-56)로부터 형성된 이종이합체이다[참조: Devergne et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12041-12046; 미국 특허 제5,830,451호; 미국 특허공개 공보 제US 2007/0299026호]이다. 이는 쥐 콜라겐-유도된 관절염 모델에서 EnbrelTM의 것과 동등한 치료학적 효능을 가진다는 것이 밝혀져서[참조: Niedbala et al. (2007) Eur. J. Immunol. 37:3021-3029], 임상 류마티스 관절염에 대한 치료제로서 제안되어 왔다.
일부 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이 IL35R에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인은 인간이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있으며 본원에 기술된 바와 같이 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 소-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398중 어느 하나 이상에 설정된 바와 같은 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호: 244에 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조, 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 대한 유사성에 의해, 쌍을 이룬 VL쇄 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인 서브-결합 도메인을 가질 수 있다. 추가의 양태에서, 본 기재내용의 IL35R에 대해 특이적인 결합 도메인은 항-IL35R scFv 또는 Fab 단편의 가변 영역으로부터 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나, 또는 설계된, 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR") 또는 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-IL35R의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 이는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다. 특정의 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 골격 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 IL-35R에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다.
LIGHT
위에서 언급한 바와 같이, 특정 양태에서, 본 기재내용은 LIGHT 길항제(즉, LIGHT 시그날링을 억제할 수 있는 길항제)인 도메인 또는 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, LIGHT 길항제 결합 도메인은 HVEM 엑토도메인(또한 sHVEM로 언급됨; 서열번호: 29; 시그날 펩타이드: 아미노산 1-38) 또는 이의 작용성 서브-도메인이다. 다른 양태에서, LIGHT 길항제 결합 도메인은 LIGHT에 대해 특이적인 scFv와 같은 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인이다. 특정 양태에서, LIGHT 길항제 도메인은 PCT 특허공개 공보 제WO 08/027338호에 기술된 바와 같은 VH 및 VL 도메인을 포함하는 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인이다.
LIGHT는 활성화된 T 림프구, 단핵세포, 과립구 및 비성숙 수지 세포상에서 발현되는 TNF 상과의 구성원이다. LIGHT의 2개의 명백한 동형이 보고되어 있다(진뱅크 수탁 번호 제NP_003798.2호 및 제NP_742011.1호). LIGHT는 헤르페스 바이러스 도입 매개인자(HVEM) 및 림프독소 베타 수용체(LTβR)를 통한 시그날링에 의해 T 세포 면역 반응을 조절하는 것으로 밝혀졌다. HVEM 및 LTβR 둘 다는 LIGHT에 고 친화성으로 결합하며, HVEM의 발현은 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포 및 내피 세포에서 검출되고, LTβR은 단핵세포 및 간질 세포에서 발현되나 T 세포 및 B 세포에서는 발현되지 않는다. LIGHT는 CD28-의존성 T 세포 활성화를 위한 공-자극성 분자이며 IFN-γ 및 GM-CSF 생산을 우선적으로 유도하는 것으로 밝혀졌다. LTβR-Ig 융합 단백질 또는 항-LIGHT 항체의 생체내 투여에 의한 LIGHT의 차단은 T 세포-매개된 면역 반응을 감소시키고 쥐 모델에서 이식체-대-숙주병을 완화시킨다[참조; Tamada et al. (2000) Nat. Med. 6:283-9]. LIGHT의 구성적 발현은 조직 파괴 및 자가면역-유사병 증후군을 가져온다[참조: Granger & Rickert (2003) Cytokine Growth Factor Rev. 14:289-96].
일부 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 LIGHT에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인은 인간이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있고 본원에 기술된 바와 같은 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398 중 어느 하나 이상에 설정된 바와 같은 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호: 244에 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조, 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 대한 유사성에 의해, 쌍을 이룬 VL 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인-서브-결합 도메인을 가질 수 있다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 LIGHT에 대해 특이적인 결합 도메인은 항-LIGHT scFv 또는 Fab 단편의 가변 영역 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나, 또는 설계된 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR") 또는 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-LIGHT의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 이는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 골격 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 LIGHT에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다.
PD-1
위에서 언급한 바와 같이, 특정 양태에서, 본 기재내용은 PD-1 효능제(즉, PD-1 시그날링을 증가시킬 수 있는 효능제)인 도메인 또는 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, PD-1 효능제 결합 도메인은 PD1-L1(예를 들면, 서열번호: 32; 시그날 펩타이드: 아미노산 1-18), PD1-L2(예를 들면, 서열번호: 33; 시그날 펩타이드: 아미노산 1-19) 또는 이의 작용성 서브-도메인이다. 다른 양태에서, PD-1 효능제 결합 도메인은 PD-1에 대해 특이적인 scFv와 같은 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인이다. PD-1에 대해 특이적인 항체는 예를 들면, 미국 특허공개 공보 제2006/0210567호에 기술된 것들을 포함한다.
PD-1(진뱅크 수탁 번호 제NP_005009.1호)는 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포상에서 발현되는 CD28/CTLA4 계열의 구성원이다. PD-1은 면역수용체 타이로신-계 억제성 모티프를 함유한다. PD-1은 프로그램화된 사멸-1 리간드 1(PD1-L1; 또한 CD274로 공지됨) 및 프로그램화된 사멸-1 리간드 2(PD1-L2)에 결합함으로써 작용한다. 인간 PD-L1 및 PD-L2는 비성숙 및 성숙한 수지 세포, IFNγ-처리된 단핵 세포 및 소포 수지 세포 둘 다에서 발현된다. PD-1이 결여된 마우스는 다양한 자가면역 병리학을 나타내며, 이는 PD-1이 면역 반응의 네가티브 조절인자임을 입증한다[참조: Nishimura & Honjo (2001) Trends Immunol. 2:265; Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141]. PD1-L1 및 PD1-L2에 대한 PD-1의 결합은 T 세포 활성화의 하향-조절을 초래하는 것으로 밝혀졌다[참조: Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027; Latchman et al. (2001) Nat. Immunol. 2:261; Carter et al. (2002) Eur. J. Immunol. 32:634].
일부 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 PD-1에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인은 사람이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있고 본원에 기술된 바와 같은 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호: 244에 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조, 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 대한 유사성에 의해, 쌍을 이룬 VL 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인-서브-결합 도메인을 가질 수 있다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 PD-1에 대해 특이적인 결합 도메인은 항-PD-1 scFv 또는 Fab 단편의 가변 영역 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나, 또는 설계된 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR") 또는 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-PD-1의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 이는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다.
BTLA
위에서 언급한 바와 같이, 특정 양태에서 본 기재내용은 BTLA 효능제(즉, BTLA 시그날링을 증가시킬 수 있는 효능제)인 결합 영역 또는 도메인을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, BTLA 효능제 결합 도메인은 HVEM 엑토도메인(또한 sHVEM로서 언급됨; 서열번호: 29; 시그날 펩타이드: 아미노산 1-38) 또는 이의 작용성 서브-도메인(예를 들면, 서열번호: 29의 아미노산 54-78)이다. 다른 양태에서, BTLA 효능제 결합 도메인은 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인, 예를 들면, BTLA에 대해 특이적인 scFv이다. BTLA에 대해 특이적인 효능제 항체는 예를 들면, 문헌[참조: Krieg et al. (2005) J. Immunol. 175:6420-6472]에 기술되어 있다.
BTLA(진뱅크 수탁 번호 제NP_001078826.1호 및 제NP_861445.3호; 각각 동형 2 및 1)는 면역글로불린 과의 구성원이며 B-세포, T-세포 및 항원 제시 세포상에서 발현된다. BTLA에 대한 리간드는 헤르페스 바이러스 도입 매개인자(HVEM)이며, 이는 종양-괴사 인자 수용체 과의 구성원이며 또한 LIGHT에 대한 리간드로서 작용한다[참조: Sedy et al. (2005) Nat. Immunol. 6:90-98]. BTLA에 대한 결합 부위는 HVEM의 CRD1(서열번호: 29의 아미노산 54-78; PCT 특허공개 공보 WO 2006/063067호)에서 확인되었다. 당해 부위는 LIGHT에 의해 점유된 부위와는 구별되지만 HVEM의 gD 결합 부위와 중첩된다. LIGHT에 대한 HVEM의 결합이 강력한 명역 반응을 유도하지만, BTLA에 대한 HVEM의 결합은 T 세포 반응의 네가티브 조절을 초래한다[참조: Murphy et al. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:671-681]. 비록 일부 데이타에서, SHP의 보충이 BTLA의 네가티브 조절 활성에 관여하는지에 대해 의문이 제기된다 해도[참조: Chemnitz et al. (2006) J. Immunol. 176:6603-6614], HVEM에 대한 BTLA의 결합은 BTLA의 타이로신 포스포릴화를 활성화시킴으로써 단백질 타이로신 포스파타제 SHP-1 및 SHP-2와의 연합을 유도하는 것이 지적되어 왔다[참조: Gavrieli et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 312:1236].
가용성 HVEM은 CD4+ T 세포의 항-CD3-유도된 증식을 억제하며, 이러한 효과는 항-BTLA 항체에 의해 역전되는 것으로 밝혀졌다[참조: Gonzalez et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:1116-1121]. 유사하게, 효능성 항-BTLA 모노클로날 항체는 항-CD3-매개된 CD4+ T-세포 증식 및 사이토킨 생산을 억제하는 것으로 밝혀졌다[참조: Krieg et al. (2005) J. Immunol. 175:6420-6472]. 완전한 BTLA 유전자를 결여하는 마우스는 실험적인 자가면역 뇌척수염에 대해 증가된 민감성[참조: Watanabe et al. (2003) Nat. Immunol. 4:670-679] 및 지속된 기도 염증[참조: Deppong et al. (2006) J. Immunol. 176:3909-3913]을 나타낸다.
일부 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 BTLA에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인은 사람이다. VL 및 VH 도메인은 인간이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있고 본원에 기술된 바와 같은 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398로 나타탠 바와 같은 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호: 244에 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 대한 유사성에 의해, 쌍을 이룬 VL 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인-서브-결합 도메인을 가질 수 있다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 BTLA에 대해 특이적인 결합 도메인은 항-BTLA scFv 또는 Fab 단편의 가변 영역 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나, 또는 설계된 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR") 또는 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-BTLA의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 이는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다.
GITRL
위에서 언급한 바와 같이, 특정 양태에서 본 기재내용은 GITRL 길항제(즉, GITRL 시그날링을 억제할 수 있는 길항제)인 도메인 또는 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, GITRL 길항제 결합 도메인은 GITR 엑토도메인(또한 sGITR로 언급됨; 서열번호: 39 및 40; 시그날 펩타이드: 이들 서열 각각에 대해 아미노산 1-25) 또는 이의 작용성 서브-도메인이다. 다른 양태에서, GITRL 길항제 결합 도메인은 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인, 예를 들면, GITRL에 대해 특이적인 scFv이다. GITRL에 대한 길항적 항체는 예를 들면, 미국 특허공개 공보 제2005/0014224호에 기술되어 있다.
제I형 막관통 단백질인, 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체(GITR; 또한 AITR로서 공지됨)은 TNF 수용체 상과[참조: Nocentini et al. (2007) Eur. J Immunol. 37:1165-69]의 구성원이다. GITR은 T 세포 증식 및 TCR-매개된 세포자멸사의 조절시 중요한 역활을 한다. GITR 발현은 T 세포상에서 상향조절되며, 높은 수준의 GITR이 CD4+CD25+ 조절성 T 세포 상에서 구성적으로 발현되며[참조: Kwon et al. (2003) Exp. Mol. Med. 35:8-16], 발현은 또한 대식구, B 세포 및 NK 세포에서 일어난다[참조: Liu et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:8202-8210]. GITR의 인지체 리간드, GITRL은 수지 세포 및 B 세포와 같은 항원-제시 세포상에서 구성적으로 발현된다. GITRL에 대한 GITR의 결합은 CD4+CD25- 효과기 T 세포가 CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 억제 효과에 내성이 되도록 하는 것으로 밝혀졌다. GITRL 또는 효능제 항체에 의한 GITR 활성화는 TCR-유도된 T 세포 증식 및 사이토킨 생산을 증가시키고, 항-CD3-유도된 세포자멸사로부터 T 세포를 구조하는 것으로 밝혀졌다[참조: Nocentini et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216-6221]. 또한, GITRL에 대한 GITR의 결합은 T 조절성 세포를 억제하고/하거나 효과기 T 세포가 T 조절성 세포-매개된 억제에 대해 보다 더 내성이 되도록 할 수 있다[참조: Kanamaru et al. (2004) J. Immunol. 172:7306-7314].
연구들에서 실험적 자가면역 뇌염의 유도 상 동안 항-GITR mAb의 투여가 임상병의 중증도 및 CNS 염증 및 자가반응성 T 세포 반응을 현저시 향상시키는 것이 밝혀졌다[참조: Kohm et al. (2004) J. Immunol. 172:4686-4690]. 또한, GITR 시그날링은 쥐 천식 및 콜라겐-유도된 관절염 둘 다를 악화시킨다[참조: Patel et al. (2005) Eur. J., Immunol. 35:3581-90].
일부 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같은 GITRL에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정의 양태에서, VL 및 VH 도메인은 인간이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있고 본원에 기술된 바와 같은 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호: 244에 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조, 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 대한 유사성에 이해, 쌍을 이룬 VL 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인-서브-결합 도메인을 가질 수 있다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 GITRL에 대해 특이적인 결합 도메인은 항-GITRL scFv 또는 Fab 단편의 가변 영역 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나, 또는 설계된 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR") 또는 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-GITRL의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 이는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 골격 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 GITRL에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다.
CD40
위에서 언급한 바와 같이, 특정 양태에서 본 기재내용은 CD40 길항제(즉, CD40 시그날링을 억제할 수 있는 길항제)인 도메인 또는 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 양태에서, CD40 길항제 결합 도메인은 CD40에 대해 특이적인 scFv와 같은 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인이다. CD40에 대한 길항제 항체는 미국 특허공개 공보 제2008/0057070호, 및 미국 특허 제5,874,082호 및 제6,838,261호에 기술되어 있다.
CD40은 정상 및 신생물 B 세포, 수지 세포, 항원 제시 세포, 상피 세포, 단핵 세포 및 내피 세포의 표면에서 발견되는 55 kDa 세포-표면 항원이다. 항원 제시 세포상에서 CD40 발현은 T-헬퍼 및 세포독성 T 림프구의 작용에 있어 중요한 공-자극 역활을 한다. CD40 리간드(CD40L, 또한 CD154로서 공지됨)의 발현은 정상 면역 반응 동안 T 세포에서 상향조절된다. B 세포 발현한 CD40에 대한 T 세포 발현한 CD40L의 결합은 B 세포 증식 및 분화, 항체 생산, 동위원소 스위티(isotope switching) 및 B-세포 기억 생성을 초래한다. 인간 항-CD40 길항제 항체는 사람 만성 림프구 백혈병 세포에서 항백혈병 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다[참조: Luqman et al. (2008) Blood 112:711-720].
일부 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 예를 들면, 미국 특허공개 공보 제2008/0057070호에 기술된 바와 같은 CD40에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인은 인간이다. VL 및 VH 도메인은 한쪽 배향으로 정렬될 수 있고 본원에 기술된 바와 같은 약 30개 이하의 아미노산 링커 또는 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼화성인 스페이서 작용을 제공할 수 있는 어떠한 다른 아미노산 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, VL 및 VH 도메인을 결합시키는 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398로 나타낸 바와 같은 아미노산 서열, 예를 들면, 서열번호: 244에 제공된 링커, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)를 포함한다. 다중-특이적인 결합 도메인은 카멜리드 항체 구조 또는 적어도 4개의 특이적인 서브-결합 도메인에 대한 유사성에 의해, 쌍을 이룬 VL 및 VH 쇄의 보다 통상적인 포유동물 항체 구조에 대한 유사성에 의해 적어도 2개의 특이적인-서브-결합 도메인을 가질 수 있다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 CD40에 대해 특이적인 결합 도메인은 항-CD40 scFv 또는 Fab 단편의 가변 영역 또는 이의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로부터 수득되거나, 기원하거나, 또는 설계된 하나 이상의 상보성 결정 영역("CDR") 또는 하나 이상의 이러한 CDR의 다중 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 결합 도메인은 항-CD40의 가변 영역으로부터의 단일 CDR을 포함할 수 있거나, 이는 동일하거나 상이할 수 있는 다중 CDR을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 예를 들면, 미국 특허공개 공보 제US 2008/0057070호에 기술된 바와 같은 골격 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 포함하는 CD40에 대해 특이적인 VL 및 VH 도메인을 포함한다.
다중-특이적인 융합 단백질
본 기재내용은 CD86에 결합하는 도메인("CD86 결합 도메인") 및 CD86 이외의 분자에 결합하는 도메인("이종 결합 도메인")을 포함하는 다중-특이적인 융합 단백질을 제공한다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제이다.
특정의 양태에서, 이종 결합 도메인은 IL10, IL10Fc, 또는 IL10R1 또는 IL10R2에 특이적으로 결합하는 일본쇄 결합 도메인과 같은 IL10 효능제이다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 HLA-G1, HLA-G5, HLA-G 무테인, 또는 이의 작용성 영역(예를 들면, 엑토도메인), 또는 ILT2, ILT4 또는 KIR2DL4에 특이적으로 결합하는 일본쇄 결합 도메인과 같은 HLA-G 효능제이다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 HGF 또는 이의 서브-도메인과 같은 HGF 효능제이다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 IL35 또는 이의 서브-도메인, 일본쇄 IL35 또는 이의 서브도메인, 또는 IL35R에 대해 특이적이고 IL35 효능제 활성을 갖는 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인과 같은 IL35 효능제이다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 HVEM 엑토도메인 또는 이의 서브-도메인, 또는 LIGHT에 대해 특이적인 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인과 같은 LIGHT 길항제이다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 PD1-L1, PD1-L2 또는 이의 서브-도메인, 또는 PD-1에 대해 특이적인 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인과 같은 PD-1 효능제이다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 HVEM 엑토도메인 또는 이의 서브-도메인, 또는 BTLA에 대해 특이적인 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인과 같은 BTLA 효능제이다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 GITR 엑토도메인 또는 이의 서브-도메인, 또는 GITRL에 대해 특이적인 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인과 같은 GITRL 길항제이다. 특정 양태에서, 이종 결합 도메인은 CD40에 대해 특이적인 일본쇄 면역글로불린-유사 가변 도메인과 같은 CD40 길항제이다.
일반적으로, 본 발명의 융합 단백질은 리더 펩타이드(시그날 펩타이드)를 포함하지 않는 성숙한 단백질을 사용한다. 따라서, 도메인 단백질(예를 들면, CTLA4, CD28, HLA-G1 및 HLA-G5 및 본원에 기술된 기타의 것들)을 결합시키기 위해 본원에 제공된 특정 서열은 리더 펩타이드를 포함하나, 당해 분야의 숙련가들은 시그날 펩타이드를 포함하는 서열로부터 성숙한 단백질 서열을 측정하는 방법을 용이하게 이해할 것이다. 특정의 양태에서, 리더 서열을 포함시키는 것이 유리할 수 있다.
CD86 결합 도메인이 융합 단백질의 아미노-말단에 및 이종 결합 도메인이 융합 단백질의 카복시-말단에 존재할 수 있음은 고려된다. 특정 양태에서, xceptor 분자는 서열번호: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 187, 189, 191, 193, 219, 221, 223, 237, 262, 302, 330, 336, 338, 340, 또는 400으로 나타낸 바와 같다. 이종 결합 도메인이 아미노-말단에 있을 수 있고 CD86 결합 도메인이 카복시-말단에 있을 수 있음이 또한 고려된다. 특정 양태에서, xceptor 분자는 서열번호: 183, 185, 199, 201, 203, 205, 207, 211, 213, 254, 258, 266, 276, 350, 352, 또는 354로 나타낸 바와 같다. 본원에 나타낸 것으로서, 본 기재내용의 결합 도메인은 개재 도메인(예를 들면, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 서브-영역)의 각각의 말단에 융합될 수 있다. 또한, 2개 이상의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이, 링커를 통해 개재 도메인에 각각 연결될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "개재 도메인"은 하나 이상의 결합 도메인에 대해 스캐폴드로서 단순히 작용함으로써 융합 단백질이 주로(예를 들면, 융합 단백질의 집단의 50% 이상) 또는 실질적으로(예를 들면, 융합 단백질의 집단의 90% 이상) 조성물내에 일본쇄 폴리펩타이드로서 존재할 아미노산 서열을 말한다. 예를 들면, 특정의 개재 도메인은 구조적 작용(예를 들면, 스페이싱, 유연성, 경직성) 또는 생물학적 작용(예를 들면, 인간 혈액에서와 같이, 혈장내 증가된 반감기)을 가질 수 있다. 혈장 속에서 본 기재내용의 융합 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있는 예시적인 개재 도메인은 알부민, 트랜스페린, 혈청 단백질 등을 결합시키는 스캐폴드 도메인, 또는 이의 단편을 포함한다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질내 함유된 개재 도메인은 "이량체화 도메인"이며, 이는 수소 결합, 정전기적 상호작용, 반데르 바알스 힘(Van der Waal's force), 이황화물 결합, 소수성 상호작용 등 또는 이의 어떠한 조합에 의한 것과 같은 비-공유 또는 공유 상호작용을 통한 적어도 2개의 일본쇄 폴리펩타이드 또는 단백질의 연합을 촉진할 수 있는 아미노산 서열을 말한다. 예시적인 이량체화 도메인은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 또는 서브-영역을 포함한다. 이량체화 도메인은 이량체 또는 더 높은 차수의 다량체 복합체(예를 들면, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체 등)의 형성을 촉진할 수 있다.
"불변 서브-영역"은 공급원 항체의 모든 불변 영역 도메인이 아닌, 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부 또는 모두에 상응하거나 이로부터 유래한 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열을 언급하기 위해 본원에서 정의된 용어이다. 바람직한 양태에서, 불변 서브-영역은 IgG CH2CH3, 바람직하게는 IgG1 CH2CH3이다. 일부 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질의 불변 영역 도메인은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 및 상보체 활성화 및 상보체-의존성 세포독성(CDC)의 효과기 작용을 결여하거나 최소로 가질수 있지만, 일부 Fc 수용체에 결합하는 능력(예를 들면, FCRn 결합)을 보유하고 생체내에서 비교적 긴 반감기를 보유한다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 인간 IgG1 불변 영역 또는 서브-영역에 융합되며, 여기서, IgG1 고정 영역 또는 서브-영역은 돌연변이된 하나 이상의 다음 아미노산을 갖는다: 234번 위치에서 루이신(L234), 235번 위치에서 루이신(L235), 237번 위치에서 글리신(G237), 318번 위치에서 글루타메이트(E318), 320번 위치에서 라이신(K320), 322번 위치에서 라이신(K322), 또는 이의 조합(카바트에 따른 번호매김). 예를 들면, 이들 아미노산 중 어떠한 하나 이상도 알라닌으로 변화될 수 있다. 추가의 양태에서, IgG1 Fc 도메인은 알라닌으로 돌연변이된(즉, 각각 L234A, L235A, G237A, E318A, K320A, 및 K322A), 각각의 L234, L235, G237, E318, K320, 및 K322(EU 번호매김에 따름)를 가지며, 임의로 또한 N297A 돌연변이(즉, CH2 도메인의 글리코실화의 필수적인 제거)를 갖는다.
Fc 수용체(CD16, CD32, CD64, CD89, FcεR1, FcRn)와 또는 상보체 성분 C1q와의 Fc 상호작용을 변경시킬 수 있는 Fc 도메인 내부 또는 외부에 돌연변이를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,624,821호; Presta (2002) Curr. Pharma. Biotechnol. 3:237]. 본 기재내용의 특수 양태는 인간 IgG로부터의 불변 영역 또는 서브-영역을 갖는 면역글로불린 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함하며, 여기서, FcRn과 단백질 A로 결합하는 것은 ㅂ보존되어 있고, Fc 도메인은 다른 Fc 수용체 또는 C1q와 더 이상 상호작용하지 않거나 최소한으로 상호작용한다. 예를 들면, 본 기재내용의 결합 도메인은 인간 IgG1 불변 영역 또는 서브-영역에 융합될 수 있으며, 여기서, 297번 위치에서 아스파라긴(카바트 번호매긴하에서 N297)은 다른 아미노산으로 돌연변이되어 당해 부위에서 글리코실화를 감소시키거나 제거함으로써 FcγR 및 C1q에 대한 효율적인 Fc 결합을 제거한다. 다른 예시적인 돌연변이는 P331S이며, 이는 C1q 결합을 감쇄시키거나 Fc 결합에 영향을 미치지 않는다.
추가의 양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 참조 서열에 대해 상대적인 변경된 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 예를 들면, 어떠한 각종 유전적 기술도 사용하여 CH2 도메인의 N297(EU 번호매김)과 같이, 글리코실화 부위를 형성하는 하나 이상의 특수 아미노산 잔기를 변경시킬 수 있다[참조: Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1361; Jacquemon et al. (2006) J. Thromb. Haemost. 4:1047; Schuster et al. (2005) Cancer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:831]. 이와는 달리, 본 기재내용의 융합 단백질을 생산하는 숙주 세포를 가공하여 변경된 글리코실화 패턴을 생산할 수 있다. 당해 분야에 공지된 하나의 방법은 예를 들면, ADCC를 증가시키는 이등분된, 비-푸코실화된 변이체의 형태인 변경된 글리코실화를 제공한다. 변이체는 올리고사카라이드-변형된 효소를 함유하는 숙주 세포내 발현으로부터 초래된다. 이와는 달리, BioWa/Kyowa Hakko의 포텔리전트 기술(Potelligent technology)은 본 기재내용에 따라 글리코실화된 분자의 푸코즈 함량을 감소시키는 것으로 고려된다. 하나의 공지된 방법에서, GDP-푸코즈의 생산을 통해, 면역글로불린 Fc 영역의 글리코실화 패턴을 변형시키는 재조합체 면역글로불린 생산을 위한 CHO 숙주 세포가 제공된다.
이와는 달리, 화학적 기술을 사용하여 본 기재내용의 융합 단백질의 글리코실화 패턴을 변경시킨다. 예를 들면, 각종의 글리코시다제 및/또는 만노시다제 억제제는 ADCC 활성을 증가시키고, Fc 수용체 결합을 증가시키며, 글리코실화 패턴을 변경시키는 하나 이상의 바람직한 효과를 제공한다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 다중특이적인 융합 단백질(IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제에 연결된 CD86 길항제 함유)을 발현하는 세포를 당해 숙주 세포에 의해 생산된 면역당단백질 분자의 ADCC를 증가시키는 농도에서 탄수화물 개질제를 포함하는 배양 배지에서 성장시키며, 여기서, 상기 탄수화물 개질제의 농도는 800μM 미만이다. 바람직한 양태에서, 이들 다중특이적인 융합 단백질을 발현하는 세포는 카스타노스페르민 또는 키푸넨신, 보다 바람직하게는 카스타노스페르민을 100μM, 200μM, 300μM, 400μM, 500μM, 600μM, 700μM 또는 800μM와 같은 100-800μM의 농도로 함유하는 배양 배지에서 성장시킨다. 카스타노스페르민과 같은 탄수화물 개질제를 사용하여 글리코실화를 변경시키는 방법은 미국 특허공개 공보 제2009/0041756호 또는 PCT 공보 WO 2008/052030호에서 제공된다.
다른 양태에서, 면역글로불린 Fc 영역은 효과기 세포 Fc 수용체에 대한 결합에 영향을 미치는 아미노산 변형을 가질 수 있다. 이들 변형은 문헌[참조: Presta et al. (2001) Biochem . Soc . Trans. 30:487]에 기술된 시도와 같이, 당해 분야에 공지된 어떠한 기술을 사용해서도 수행할 수 있다. 다른 시도에서, Xencor XmAbTM 기술이 Fc 도메인에 상응하는 불변 서브-영역을 가공함으로써 세포 사멸 효과기 작용을 향상시킨다[참조: Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 103:4005]. 당해 시도를 사용하여, 예를 들면, FCγR에 대한 특이성 및 결합이 개선된 불변 서브-영역을 생성함으로써 세포 사멸 효과기 작용을 향상시킬 수 있다.
다른 추가의 양태에서, 불변 영역 또는 서브-영역은 임의로 개재 도메인과 같은 상응하는 융합 단백질 결여와 비교하여 혈장 반감기 또는 태반 전이를 임의로 증가시킬 수 있다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질의 연장된 혈장 반감기는 사람에서 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 10일, 적어도 12일, 적어도 18일, 적어도 20일, 적어도 24일, 적어도 30일, 적어도 36일, 적어도 40일, 적어도 48일, 적어도 수일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 몇주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 수개월이다.
불변 서브-영역은 다음 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다: CH2 도메인, CH3 도메인(IgA, IgD, IgG, IgE, 또는 IgM), 및 CH4 도메인(IgE 또는 IgM). 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 불변 서브-영역은 면역글로불린 불변 영역의 일부에 상응하는 폴리펩타이드를 말할 수 있다. 불변 서브-영역은 동일하거나 상이한 면역글로불린, 항체 동형, 또는 대립형질 변이체로부터 유래한 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, CH3 도메인은 트렁케이트되며 미국 특허출원 제12/041,590호(이는 PCT/US2007/071052호의 CIP출원이다)에 서열번호: 366-371로 나열된 카복시-말단 서열을 포함한다. 특정의 양태에서, 본 기재내용의 폴리펩타이드의 불변 서브-영역은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 가지며, 이들은 임의로 아미노-말단 링커, 카복시-말단 링커, 또는 말단 둘 다에 링커를 가진다.
"링커"는, 아미노산이 약 2 내지 약 150개인 링커와 같은 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 결합하거나 연결하는 펩타이드이다. 본 기재내용의 융합 단백질에서, 링커는 개재 도메인(예를 들면, 면역글로불린-기원한 불변 서브-영역)을 결합 도메인에 결합시킬 수 있거나 링커는 IL35의 EBI3(서열번호: 25) 및 IL12(서열번호: 26)의 p35 소단위와 같은 이종이합체 분자로부터 형성된 일본쇄 폴리펩타이드내 2개 영역, 또는 결합 도메인의 2개의 가변 영역과 결합할 수 있다. 예를 들면, 링커는 항체 힌지 영역 서열, 수용체에 결합 도메인을 연결시키는 서열, 또는 세포 표면 막관통 영역 또는 막 앵커에 결합 도메인을 연결시키는 서열로부터 수득되거나, 기원하거나 또는 설계된 아미노산 서열일 수 있다. 일부 양태에서, 링커는 생리적인 조건 또는 기타 표준 펩타이드 조건(예를 들면, 펩타이드 정제 조건, 펩타이드 저장을 위한 조건)하에서 적어도 하나의 이황화물 결합에 관여할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 가질 수 있다. 특정의 양태에서, 면역글로불린 힌지 펩타이드에 상응하거나 유사한 링커는 이러한 힌지의 아미노-말단을 향해 배치된 힌지 시스테인에 상응하는 시스테인을 보유한다. 추가의 양태에서, 링커는 IgG1 또는 IgG2A 힌지로부터 기원하며 힌지 시스테인에 상응하는 하나의 시스테인 또는 2개의 시스테인을 갖는다. 특정 양태에서, 하나 이상의 이황화물 결합은 개재 도메인사이에 쇄내 이황화물 결합으로서 형성된다. 다른 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 결합 도메인(즉, 링커 또는 힌지의 부재)에 직접 융합된 개재 도메인을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 개재 도메인은 IgG1 CH2CH3 Fc 부분과 같은 이량체화 도메인이다.
본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질의 개재 또는 이량체화 도메인을 펩타이드 링커에 의해 하나 이상의 말단 결합 도메인에 연결시킬 수 있다. 스페이싱 작용을 제공하는 것 외에, 링커는 융합 단백질내에서 및 융합 단백질과 다른 표적(들)사이 또는 이들 중 둘 다에서, 융합 단백질의 하나 이상의 결합 도메인을 적절히 배향시키기에 적합한 유동성 또는 강직성을 제공할 수 있다. 또한, 링커는 이를 필요로하는 대상체, 예를 들면 인간에게 투여 후 시험관내 및 생체내 둘 다에서 완전한 길이의 융합 단백질의 발현 및 정제된 단백질의 안정성을 지지할 수 있으며 바람직하게는 동일한 대상에서 비-면역원성 또는 불량한 면역원성이다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질의 개재 도메인 또는 이량체화 도메인의 링커는 인간 면역글로불린 힌지의 일부 또는 모두를 포함할 수 있다.
추가로, 결합 도메인은 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있으며, 이들 가변 영역 도메인은 링커에 의해 결합될 수 있다. 예시적인 가변 영역 결합 도메인 링커는 (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1, (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n, 또는 (Gly4Ser)n와 같은 (GlynSer) 계열(여기서, n은 1 내지 5의 정수이다)에 속하는 것들을 포함한다(참조: 예를 들면, 서열번호: 64, 71, 88, 131, 132, 149, 163 및 164 각각에 상응하는 링커 22, 29, 46, 89, 90, 116, 130, 및 131). 바람직한 양태에서, 이들 (Gly4Ser)-계 링커는 가변 도메인을 연결시키는데 사용하며 개재 도메인(예를 들면, IgG CH2CH3)에 대한 결합 도메인(예를 들면, scFv)을 연결시키는데 사용하지 않는다.
개재 도메인(예를 들면, 면역글로불린-유래한 불변 서브-영역)을 결합 도메인 또는, 결합 도메인의 2개의 가변 영역을 결합시킬 수 있는 링커에 결합시키는데 사용할 수 있는 예시적인 링커는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398에서 나열되어 있다.
본 기재내용에서 고려되는 링커는 예를 들면, 면역글로불린 상과 구성원의 특정의 도메인-간 영역(예를 들면, 항체 힌지 영역) 또는 제II형 막 단백질의 계열인 C-유형 렉틴의 스택(stalk) 영역으로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 이들 링커는, 길이가 약 2 내지 약 150개 아미노산 또는 약 2 내지 약 40개 아미노산 또는 약 8 내지 약 20개 아미노산, 바람직하게는 약 10 내지 약 60개 아미노산, 보다 바람직하게는 약 10 내지 약 30개 아미노산, 및 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 25개 아미노산의 범위이다. 예를 들면, 링커 1은, 길이가 2개 아미노산이고 링커 116은, 길이가 36개 아미노산이다(링커 1-133은 서열번호: 43-166으로 각각 제공되며; 추가의 예시적인 링커는 서열번호: 244, 307, 320, 355-379, 및 383-398로 제공된다).
일반적인 길이 고려를 제외하고, 본 기재내용의 융합 단백질에서 사용하기에 적합한 링커는 IgG 힌지, IgA 힌지, IgD 힌지, IgE 힌지, 또는 이의 변이체 중에서 선택된 항체 힌지 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 링커는 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 또는 이의 단편 또는 변이체 중에서 선택된 항체 힌지 영역(상부 및 코어 영역)일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, "면역글로불린 힌지 영역"인 링커는 CH1의 카복실 말단과 CH2의 아미노 말단(IgG, IgA 및 IgD의 경우) 또는 CH3의 아미노 말단(IgE 및 IgM의 경우) 사이에서 발견된 아미노산을 말한다. 본원에 사용된 것으로서, "야생형 면역글로불린 힌지 영역"은 CH1 및 CH2 영역(IgG, IgA, 및 IgD의 경우) 사이에 중재되어 이들을 연결하거나, 항체의 중쇄에서 발견된 CH2 및 CH3 영역(IgE 및 IgM의 경우) 사이에 중재되어 이들을 연결하는 천연적으로 존재하는 아미노산 서열을 말한다. 바람직한 양태에서, 야생형 면역글로불린 힌지 영역 서열은 인간이다.
결정학상 연구에 따르면, IgG 힌지 도메인은 작용적으로 및 구조적으로 3개 영역으로 세분될 수 있다: 상부 힌지 영역, 코어 또는 중간 힌지 영역, 및 하부 힌지 영역[참조: Shin et al. (1992) Immunological Reviews 130:87]. 예시적인 상부 힌지 영역은 IgG1에서 발견된 EPKSCDKTHT(서열번호: 383), IgG2에서 발견된 ERKCCVE(서열번호: 384), IgG3에서 발견된 ELKTPLGDTTHT(서열번호: 385) 또는 EPKSCDTPPP(서열번호: 386), 및 IgG4에서 발견된 ESKYGPP(서열번호: 387)을 포함한다. 예시적인 중간 힌지 영역은 IgG1 및 IgG2에서 발견된 것으로서 CPPCP(서열번호: 398), IgG3에서 발견된 것으로서 CPRCP(서열번호: 388), 및 IgG4에서 발견된 것으로서 CPSCP(서열번호: 389)를 포함한다. IgG1, IgG2, 및 IgG4 항체 각각이 단일의 상부 및 중간 힌지를 가지는 것으로 여겨진다고 해도, IgG3는 동시에 4개, 즉, ELKTPLGDTTHTCPRCP(서열번호: 390) 및 3개의 EPKSCDTPPPCPRCP(서열번호: 391) 중의 하나를 가진다.
IgA 및 IgD 항체는 IgG-유사 코어 영역을 결여하고 있는 것으로 여겨지며, IgD는 동시에 2개의 상부 힌지 영역(참조: 서열번호: 392 및 393)을 가지는 것으로 여겨진다. IgA1 및 IgA2 항체에서 발견된 예시적인 야생형 상부 힌지 영역은 각각 서열번호: 394 및 395로 나타낸다.
대조적으로, IgE 및 IgM 항체는 대표적인 힌지 영역 대신에 힌지-유사 특성을 가진 CH2 영역을 가진다. IgE 및 IgM의 예시적인 야생형 CH2 상부 힌지-유사 서열은 서열번호: 396(VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQL LCLVSGYTPG TINITWLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQK HWLSDRTYTC QVTYQGHTFE DSTKKCA) 및 서열번호: 397(VIAELPPKVS VFVPPRDGFF GNPRKSKLIC QATGFSPRQI QVSWLREGKQ VGSGVTTDQV QAEAKESGPT TYKVTSTLTI KESDWLGQSM FTCRVDHRGL TFQQNASSMC VP)로 각각 나타낸다.
"변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역" 또는 "변경된 면역글로불린 힌지 영역"은 (a) 30% 이하의 아미노산 변화율(예를 들면, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 이하의 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역, (b) 30% 이하의 아미노산 변화율(예를 들면, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 이하의 아미노산 치환 또는 결실)을 갖는 길이가 적어도 10개 아미노산(예를 들면, 적어도 12, 13, 14 또는 15개 아미노산)인 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 일부, 또는 (c) 코어 힌지 영역을 포함하는 야생형 면역글로불린 힌지의 일부(당해 부위는, 길이가 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 아미노산이거나, 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 아미노산일 수 있다)를 말한다. 특정 양태에서, 야생형 면역글로불린 힌지 영역내 하나 이상의 시스테인 잔기는 하나 이상의 다른 아미노산 잔기(예를 들면, 하나 이상의 세린 잔기)로 치환될 수 있다. 변경된 면역글로불린 힌지 영역은 달리 또는 추가로 다른 아미노산 잔기(예를 들면, 세린 잔기)에 의해 치환된 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 프롤린 잔기를 가질 수 있다.
연결 영역으로 사용될 수 있는 대체 힌지 및 링커 서열은 IgV-유사 또는 IgC-유사 도메인을 연결하는 세포 표면 수용체의 일부로부터 크래프트될 수 있다. 세포 표면 수용체가 다중 IgV-유사 도메인을 동시에 함유하는 IgV-유사 도메인들 사이의 영역 및 세포 표면 수용체가 다중의 동시 IgC-유사 영역을 함유하는 IgC-유사 도메인들 사이의 영역은 또한 연결 영역 또는 링커 펩타이드로서 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 힌지 및 링커 서열은, 길이가 5 내지 60개 아미노산이며, 주로 유동성일 수 있으나, 또한 보다 더 강직인 특성을 제공할 수 있으며 주로 최소의 β-시트 구조(β-sheet structure)를 갖는 α-나선 구조를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 서열은 혈장 및 혈청 속에서 안정하며 단백질분해적 절단에 대해 내성이다. 일부 양태에서, 서열은 이황화물 결합 또는 다중 이황화물 결합을 형성하는 능력을 부여함으로써 분자의 C-말단을 안정화시키는 CPPC(서열번호: 422)와 같은 천연적으로 존재하거나 가해진 모티프를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 서열은 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 힌지 및 링커 서열의 예는 CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD96, CD150, CD166, 및 CD244의 IgV-유사 도메인과 IgC-유사 도메인 사이의 영역 또는 IgC-유사 도메인 또는 IgV-유사 도메인 사이의 영역을 함유할 수 있다. 대체 힌지는 또한 CD69, CD72, 및 CD161과 같은 비-면역글로불린 상과 구성원으로부터 제II형 수용체의 이황화물-함유 영역으로부터 크래프트될 수 있다.
특정의 양태에서, 본 발명의 링커는 스콜피온(scorpion) 링커를 포함한다. 스콜피온 링커는 면역글로불린 상과 구성원의 도메인간 영역으로부터 기원한 펩타이드, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgE 힌지 영역과 같이 면역글로불린 힌지 영역으로부터 유래한 힌지-유사 펩타이드를 포함한다. 특정의 양태에서, 힌지-유사 스콜피온 링커는 생리학적 조건하에서 쇄간 이황화물 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 시스테인을 보유할 것이다. IgG1으로부터 기원한 스콜피온 링커는 1개의 시스테인 또는 2개의 시스테인을 가질 수 있으며, 야생형 IgG1의 N-말단 힌지 시스테인에 상응하는 시스테인을 보유할 수 있다. 비-힌지-유사 펩타이드도 또한 스콜피온 링커로서 고려되며, 단, 이러한 펩타이드는 충분한 공간 및 유연성을 제공함으로써, 하나는 보다 중심에 위치한 불변 서브-영역 도메인에 대해 각각의 단백질 말단(N 및 C)에 대해 위치한, 2개의 결합 도메인을 형성할 수 있는 일본쇄 단백질을 제공한다. 예시적인 비-힌지-유사 스콜피온 링커는 CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D의 스택 영역과 같이, 제II형 막 단백질의 C-형 렉틴 스택 영역의 스택 영역으로부터의 펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 스콜피온 링커는 서열번호: 355-359 및 365로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 링커는 쇄간 이황화물 결합의 형성을 위한 단일의 시스테인 잔기를 갖는다. 다른 양태에서, 링커는 쇄간 이황화물 결합의 형성을 위한 2개의 시스테인 잔기를 갖는다. 추가의 양태에서, 링커는 면역글로불린 도메인내 영역(예를 들면, 항체 힌지 영역) 또는 제II형 C-형 렉틴 스택 영역[제II형 막 단백질로 부터 기원; 참조: 예를 들면, PCT 출원 공보 WO　2007/146968호에 설정된 바와 같은 예시적인 렉틴 스택 영역 서열, 예를 들면, 상기 공보로부터의 서열번호: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287, 289, 297, 305, 307, 309-311, 313-331, 346, 373-377, 380, 또는 381(당해 서열은 본원에 참조로 포함된다)]로부터 유래한다.
하나의 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 CD86 결합 도메인을 함유하는 예시적인 다중-특이적인 융합 단백질은 또한 CD86("이종 결합 도메인") 이외에 표적에 대해 특이적인 적어도 하나의 추가의 결합 영역 또는 도메인을 함유할 것이다. 예를 들어, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 개재 도메인에 의해 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 결합 도메인에 연결된 CD86 결합 도메인을 갖는다. 특정 양태에서, 다중-특이적인 융합 단백질은 제1결합 및 제2 결합 도메인, 제1 및 제2 링커 및 개재 도메인을 포함하며, 여기서, 개재 도메인의 한쪽 말단은 제1 링커를 통해 CD86 결합 도메인(예를 들면, CTLA4 엑토도메인, CD28 엑토도메인, 항-CD86)인 제1 결합 도메인에 융합되고 다른 말단에서 제2 링커를 통해 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 상이한 결합 도메인에 융합된다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질의 제1 링커 및 제2 링커는 예를 들면, 서열번호: 43-166에 제공된 것으로서 링커 1-133 및 서열번호: 244, 307, 320, 355-379 및 383-398에 제공된 링커로부터 각각 독립적으로 선택된다. 예를 들면, 제1 링커 또는 제2 링커는 링커 47, 58, 126-131(각각 서열번호: 89, 100, 및 159-164), 또는 서열번호: 244 또는 355-379로 제공된 링커, 또는 이의 어떠한 조합 중 어느 하나일 수 있다. 추가의 예에서, 하나의 링커는 링커 47(서열번호: 89) 또는 링커 132(서열번호: 165)이고 다른 링커는 서열번호: 355에 제공된 링커, 또는 링커 127(서열번호: 160)이거나, 하나의 링커는 링커 58(서열번호: 100) 또는 링커 133(서열번호: 166)이고 다른 링커는 링커 126(서열번호: 159)이거나, 하나의 링커는 링커 58(서열번호: 100) 또는 링커 133(서열번호: 166)이고 다른 링커는 링커 127(서열번호: 160)이거나, 하나의 링커는 링커 58(서열번호: 100) 또는 링커 133(서열번호: 166)이고 다른 링커는 링커 128(서열번호: 161)이거나, 하나의 링커는 링커 58(서열번호: 100) 또는 링커 133(서열번호: 166)이고 다른 링커는 링커 129(서열번호: 162)이다. 추가의 예에서, CD86에 대해 특이적인 것들과 같이 VH 및 VL 도메인을 포함하는 본 기재내용의 결합 도메인은 서열번호: 244, 서열번호: 89, 링커 46(서열번호: 88), 링커 130(서열번호: 163), 또는 링커 131(서열번호: 164)와 같이 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가(제3)의 링커를 가질 수 있다. 이들 양태 중 어느 것에서도, 링커는 1 내지 5개의 추가의 아미노산을 내부적으로(예를 들면, 링커 131은 (G4S) 코어 서열에 대해 내부에 알라닌을 갖는다), 한쪽 말단상에서(예를 들면, 링커 130은 (G4S) 코어 서열의 아미노-말단상에 세린을 갖는다) 또는 양쪽 말단상에서[예를 들면, 링커 120은 (G4S) 코어 서열의 한쪽 말단에 2개의 아미노산(아스파라긴-타이로신)을 갖고 다른 쪽 말단에 3개의 아미노산(글리신-아스파라긴-세린)을 갖는다] 플랭킹될 수 있으며, 이는 단순히 이러한 재조합체 분자의 창조의 결과일 수 있으며(예를 들면, 핵산 분자를 결합시키기 위한 특수 제한 효소 부위의 사용은 한 개 내지 여러 개의 아미노산의 삽입을 초래할 수 있다), 본 발명의 목적을 위해 어떠한 특수 링커 코어 서열의 일부로 고려될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질의 개재 도메인은 면역글로불린 불변 영역 또는 서브-영역으로 이루어져 있으며, 여기서, 개재 도메인은 CD86 결합 도메인, 및 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 결합 도메인 사이에 배치될 수 있다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질의 개재 도메인은 아미노-말단에서 CD86 결합 도메인을 갖고 카복시-말단에서 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 결합 도메인을 갖는다. 다른 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질의 개재 도메인은 아미노-말단에서 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 결합 도메인을 갖고 카복시-말단에서 CD86 결합 도메인을 갖는다.
추가의 양태에서, 면역글로불린 불변 영역 서브-영역은 면역글로불린 G1(IgG1)의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 관련 양태에서, IgG1 CH2 및 CH3 도메인은 돌연변이된 다음 아미노산 중 하나 이상을 갖는다(즉, 해당 위치에서 상이한 아미노산을 갖는다): 234번 위치에서 루이신(L234), 235번 위치에서 루이신(L235), 237번 위치에서 글리신(G237), 318번 위치에서 글루타메이트(E318), 320번 위치에서 라이신(K320), 322번 위치에서 라이신(K322), 또는 이의 어떠한 조합(카바트에 따른 번호매김). 예를 들면, 이들 아미노산 중 어느 하나를 알라닌으로 변화시킬 수 있다. 추가의 양태에서, 카바트 번호매김에 따라, CH2 도메인은 각각 알라닌으로 돌연변이된 L234, L235, 및 G237(즉, 각각 L234A, L235A, 및 G237A)를 가지고, IgG1 CH3 도메인은 각각 알라닌으로 돌연변이된 E318, K320, 및 K322(즉, 각각 E318A, K320A, 및 K322A)를 가진다.
특정의 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 소 모듈러 약제(SMIPTM)를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 용어 SMIPTM은 모노클로날 및 재조합체 항체보다 향상된 약물 특성을 갖는 고 모듈러 화합물 부류를 말한다. SMIP는 예를 들면, 항체 가변 도메인을 기초로 하여, 표적-특이적인 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드 쇄와 함께, 효과기 세포(예를 들면, 대식구 및 천연 킬러(NK) 세포)의 바람직한 부류의 특이적인 보충 및/또는 상보체-매개된 사멸의 보충을 허용하는 가변 FC 영역을 포함한다. 표적 및 힌지 영역의 선택에 따라서, SMIP는 세포 표면 수용체를 통해 시그날을 제공하거나 시그날링을 차단한다. 본원에 사용된 것으로서, "소 모듈러 면역약제" 또는 "SMIPTM 생성물"로 명명된 가공된 융합 단백질은 미국 특허공개 공보 제2003/133939호, 제2003/0118592호, 및 제2005/0136049호, 및 국제 특허공개 공보 WO02/056910호, WO2005/037989호, 및 WO2005/017148호에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 다중-특이적인 융합 단백질은 미국 특허공개 공보 제2009/0148447호 및 국제 특허공개 공보 WO2009/023386호에 기술된 것들과 같은 PIMS 분자를 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명의 다중-특이적인 융합 단백질은 특이적인 세포 유형을 표적화하기 위해서 상이한 전방 및 후방 말단 친화성으로 가공시킬 수 있다. 예를 들면, 가공된 IL10 효능제(예를 들면, 187A 또는 187S 돌연변이, 또는 모노IL10 구조를 갖는 효능제)보다 CD86에 대해 보다 높은 친화성을 갖는 항-CD86 결합 도메인(예를 들면, 3D1, FUN1, 또는 이의 인간화된 변이체)의 사용은 huIL10R1에 대해 가지며, 본 기재내용의 xceptor 분자에서 이러한 분자의 결합은 항원-제시 세포(APC)와 같이, 목적한 특이적인 세포 유형에 대한 표적화를 지지하기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 융합 단백질은 표적에 대한 바람직한 세포 유형에 따라, CD86에 대해 보다 높거나 낮은 친화성 또는 본원에 기술된 이종 표적 단백질중 어느 것에 대해 보다 높거나 낮은 친화성을 가지도록 제조될 수 있다. 바람직한 양태에서, CD86 길항제 결합 도메인은 이종 결합 도메인이 이의 결합 파트너에 대해 가진 것보다 CD86에 대해 보다 높은 친화성을 가짐으로써 APC에 대해 다중-표적 특이적인 xceptor 분자를 우선적으로 표적화한다.
일부 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 CTLA4 세포외 도메인 또는 소-도메인, CD28 세포외 도메인 또는 서브-도메인, 또는 CD86-특이적인 항체-기원한 결합 도메인을 포함하는 CD86 결합 도메인을 갖는다. 특정 양태에서, CD86-특이적인 항체-기원한 결합 도메인은 FUN1 모노클로날 항체로부터 기원하거나[참조: 예를 들면, J. Pathol. 1993 Mar;169(3):309-15]; 3D1 항-CD86 모노클로날 항체로부터 기원한다. 특정 양태에서, CD86 결합 도메인은 서열번호: 1의 성숙한 폴리펩타이드 서열과 같은 sCTLA4이다. 특정 양태에서, CD86 결합 도메인은 서열번호: 1의 서열과 같은 sCTLA4 또는 서열번호: 3과 같은 CTLA4의 가변-유사 도메인, 또는 이의 서브-도메인이다. 다른 양태에서, CD86 결합 도메인은 서열번호: 2(시그날 펩타이드: 아미노산 1-18)의 성숙한 폴리펩타이드 서열과 같은 sCD28이다. 다른 추가의 양태에서, CD86 결합 도메인은 FUN1(예를 들면, 서열번호: 305 및 306) 또는 3D1(예를 들면, 서열번호: 318 및 319)로부터의, 바람직하게는 scFv의 형태의 경쇄 및 중쇄 가면 도메인을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 CD86 결합 도메인 및 이종 결합 도메인(참조: 예를 들면, 서열번호: 7, 14, 15, 18-22, 25, 26, 29, 32, 33, 36, 39 및 40에 제공된 이종 결합 도메인의 아미노산 서열)을 갖는다.
Xceptor 분자로 본원에서 언급된 이러한 다중-특이적인 단백질의 예시적인 구조는 N-BD1-ID-BD2-C, N-BD2-ID-BD1-C(여기서, N 및 C는 각각 아미노-말단 및 카복시-말단을 나타내고; BD1은 면역글로불린-유사 또는 면역글로불린 가변 영역 결합 도메인, 또는 엑토도메인과 같은 CD86 결합 도메인이며; X는 개재 도메인이고, BD2는 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 결합 도메인이다. 일부 구조에서, X는 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인 사이에 배치된 면역글로불린 불변 영역 또는 서브-영역을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음과 같은 구조를 포함하는 개재 도메인 (X)를 가진다: -L1-X-L2-(여기서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 2 내지 약 150개의 아미노산을 포함하는 링커이고; X는 면역글로불린 불변 영역 또는 서브-영역이다). 추가의 양태에서, 다중-특이적인 융합 단백질은 알부민, 트랜스페린 또는 다른 단백질에 결합하는 혈청 단백질인 개재 도메인을 가질 것이며, 여기서, 융합 단백질은 조성물내에 일본쇄 폴리펩타이드로서 주로 또는 실질적으로 잔존한다.
예시적인 Xceptor 융합 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37, 41, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 236, 238, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 265, 275, 301, 329, 333, 335, 337, 339, 349, 351 및 353에서 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된; 서열번호: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 237, 239, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 266, 276, 302, 330, 334, 336, 338, 340, 350, 352, 및 354에서 제공된다
다른 추가의 양태에서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 다음 구조를 갖는다: N-BD1-X-L2-BD2-C, 여기서, BD1은 CTLA4 엑토도메인에 대해 적어도 약 90% 동일한 결합 도메인과 같은 CD86 결합 도메인이고; -X-는 -L1-CH2CH3-이며, 여기서, L1은 제1 시스테인 또는 제2 시스테인을 치환시킴으로써 임의로 돌연변이된 제1 IgG1 힌지이고, 여기서, -CH2CH3-는 IgG1 Fc 도메인의 CH2CH3 영역이며; L2는 서열번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398 중에서 선택된 링커이고; BD2는 본원에 기술된 바와 같이, IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 결합 도메인이다.
특수 양태에서, 다중-특이적인 Xceptor 융합 단백질은 (a) 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 성숙한 폴리펩타이드 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 적어도 100% 동일한 CD86 결합 도메인, 및 (b) 서열번호: 7, 14, 15, 18-22, 25, 26, 29, 32, 33, 36, 39 및 40에서 제공된 것으로서 위에서 언급한 이종 결합 단백질의 상응하는 성숙한 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 적어도 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인 결합 도메인을 가지며, 여기서, 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 또는 카복시-말단으로부터 아미노-말단까지, (i) (a)의 CD86 결합 도메인 또는 (b)의 CD86 결합 도메인은 제1 링커에 융합되고, (ii) 제1 링커는 서열번호: 409 및 415-417 중 어느 하나에 설정된 것으로서 CH2 및 CH3의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 융합되며, (iii) CH2CH3 고정 영역 폴리펩타이드는 제2 링커에 융합되고, (iv) 제2 링커는 (a)의 CD86 결합 도메인 또는 (b)의 결합 도메인에 융합된다. 특정 양태에서, 제1 링커는 링커 47(서열번호: 89), 링커 132(서열번호: 165) 또는 링커 133(서열번호: 166)이고, 제2 링커는 링커 126-129(서열번호: 159-162) 중 어느 하나이며, CD86 결합 도메인 VH 및 VL 도메인 사이의 추가의(제3) 링커는 링커 130(서열번호: 163) 또는 링커 131(서열번호: 164)이다.
예시적인 Xceptor 융합 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37, 41, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 236, 238, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 265, 275, 301, 329, 333, 335, 337, 339, 349, 351 및 353에서 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 서열번호: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 237, 239, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 266, 276, 302, 330, 334, 336, 338, 340, 350, 352, 및 354에서 제공된다.
다중 특이적인 융합 단백질의 제조
본원에 기술된 결합 도메인 폴리펩타이드 또는 융합 단백질 중 어느 것을 효율적으로 제조하기 위하여, 리더 펩타이드를 사용하여 발현된 폴리펩타이드 및 융합 단백질의 분비를 촉진시킨다. 통상의 리더 펩타이드(시그날 서열) 중 어느 것을 사용하는 것은 초기 발현된 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 분비 경로로 지시하며 리더 펩타이드 및 폴리펩타이드 또는 융합 단백질 사이의 연결부에서 또는 연결부 근처에서 성숙한 폴리펩타이드 또는 융합 단백질로부터 리더 펩타이드의 분해를 초래하는 것으로 예측된다. 특수한 리더 펩타이드는 리더 펩타이드에 대한 암호화 서열의 개시 또는 말단에서 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 용이하게 혼입되도록 함으로써 분자 가공을 촉진시키는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 서열을 사용하는 것과 같이, 당해 분야에 공지된 고려를 기초로 하여 선택될 것이며, 단, 이러한 도입된 서열은, 리더 펩타이드가 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 성숙 동안 절단되지 않는 경우 초기에 발현된 단백질로부터의 리더 펩타이드의 어떠한 바람직한 프로세싱을 허용가능하지 않게 방해하지 않거나 폴리펩타이드 또는 융합 단백질 분자의 어떠한 바람직한 작용을 허용가능하지 않게 방해하지 않는 아미노산을 정의한다. 본 기재내용의 예시적인 리더 펩타이드는 천연의 리더 서열(즉, 천연 단백질을 사용하여 발현된 것들) 또는 H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG(X)n-CO2H(여기서, X는 특정 아미노산이고, n은 0 내지 3이다(서열번호: 167, 419, 420, 및 421) 또는 H3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG-CO2H(서열번호: 168)와 같은 이종 리더 서열의 사용을 포함한다.
본원에서 언급한 바와 같이, 본원에 기술된 엑토도메인, 경쇄 및 중쇄 가변 영역, 및 CDR과 같은 결합 도메인의 변이체 및 유도체가 고려된다. 하나의 예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 특이적인 결합제 아미노산 서열을 보충하는 삽입 변이체가 제공된다. 삽입체는 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 위치할 수 있거나, 특이적인 결합제 아미노산 서열의 내부 영역내에 위치할 수 있다. 본 기재내용의 각종 생성물은 또한 성숙한 특이적인 결합제 생성물, 즉, 리더 또는 시그날 서열이 제거된 특수 결합제 생성물, 및 추가의 아미노 말단 잔기를 갖는 수득되는 단백질을 포함한다. 추가의 아미노 말단 잔기는 다른 단백질로부터 기원할 수 있거나, 특이적인 단백질로부터 기원하는, 확인될 수 없는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있다. -1번 위치에서 추가의 메티오닌 잔기를 가진 폴리펩타이드가 -2 및 -1번 위치에서 추가의 메티오닌 및 라이신 잔기를 갖는 본 기재내용의 폴리펩타이드에서와 같이 고려된다. 추가의 Met, Met-Lys, 또는 Lys 잔기(또는 일반적으로 하나 이상의 염기성 잔기)를 갖는 변이체가 세균 숙주 세포내에서 향상된 재조합체 단백질 생산에 특히 유용하다.
본원에 사용된 것으로서, "아미노산"은 천연(천연적으로 존재하는 것들) 아미노산, 치환된 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 치환된 비-천연 아미노산, 또는 이의 어떠한 조합을 말한다. 천연 아미노산에 대한 지정은 표준 1- 또는 3-문자 코드로서 본원에 서술되어 있다. 천연의 극성 아미노산은 아스파라긴(Asp 또는 N) 및 글루타민(Gln 또는 Q); 아르기닌(Arg 또는 R), 라이신(Lys 또는 K), 히스티딘(His 또는 H), 및 이의 유도체와 같은 염기성 아미노산; 및 아스파르트산(Asp 또는 D) 및 글루탐산(Glu 또는 E), 및 이의 유도체와 같은 산성 아미노산을 포함한다. 천연의 소수성 아미노산은 트립토판(Trp 또는 W), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 이소루이신(Ile 또는 I), 루이신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 발린(Val 또는 V), 및 이의 유도체; 및 글리신(Gly 또는 G), 알라닌(Ala 또는 A), 프롤린(Pro 또는 P), 및 이의 유도체와 같은 다른 비-극성 아미노산을 포함한다. 중간 극성의 천연 아미노산은 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 타이로신(Tyr 또는 Y), 시스테인(Cys 또는 C), 및 이의 유도체를 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 기술된 어떠한 아미노산도 D- 또는 L-배열일 수 있다.
치환 변이체는, 아미노산 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되어 대체 잔기로 치환된 융합 단백질을 포함한다. 일부 양태에서, 치환은 천연적으로 보존성이나; 당해 기재내용은 또한 비-보존성인 치환도 포함한다. 아미노산은 물리적 특성 및 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여도에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산을 당해 분야에서 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로 치환하는 것으로 인지된다. 예시적인 보존적 치환은 하기 표 1(참조: 1997년 3월 13일자로 공개된 WO 97/09433호, 제10면)에 서술되어 있다.
보존적 치환 I
측쇄 특징 아미노산
지방족 비-극성 G, A, P, I, L, V
극성-하전되지 않음 S, T, M, N, Q
극성-하전됨 D, E, K, R
방향족 H, F, W, Y
기타 N, Q, D, E
이와는 달리, 보존적 아미노산은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 문헌[참조: Lehninger(Biohemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77]에 기술된 바와 같이 그룹화할 수 있다.
보존적 치환 II
측쇄 특징 아미노산
비-극성(소수성) 지방족 A, L, I, V, P
방향족 F, W
황-함유 M
경계 G
하전되지 않은-극성 하이드록실 S, T, Y
아미드 N, Q
설프하이드릴 C
경계 G
양성으로 하전(염기성) K, R, H
음성으로 하전(산성) D, E
변이체 또는 유도체는 또한 특이적인 발현 시스템의 사용으로부터 발생되는 추가의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 생성물의 일부로서 바람직한 폴리펩타이드를 발현하는 시판되는 벡터의 사용은 바람직한 폴리펩타이드로부터 GST 성분의 분해 후 -1번 위치에서 추가의 글리신 잔기를 갖는 바람직한 폴리펩타이드를 제공한다. 히스티딘 태그가 일반적으로 서열의 카복시 및/또는 아미노 말단에서 아미노 서열내로 혼입된 것들을 포함하는, 다른 벡터 시스템에서의 발현으로부터 수득된 변이체도 또한 고려된다.
본 기재내용의 결합 도메인내 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된 결실 변이체가 또한 고려된다. 결실은 융합 단백질의 말단 한쪽 또는 양쪽에서, 또는 아미노산 서열내 하나 이상의 잔기의 제거로부터 수행될 수 있다.
특정의 예시적인 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 글리코실화되며, 글리코실화 패턴은, 단백질이 발현되는 숙주 세포를 포함하는 각종 인자(재조합체 숙주 세포내에서 제조되는 경우) 및 배양 조건에 의존한다.
본 기재내용은 또한 융합 단백질의 유도체를 제공한다. 유도체는 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 변형을 지닌 특이적인 결합 도메인 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 양태에서, 변형은 천연적으로 공유결합성이며, 예를 들면, 중합체, 지질, 기타 유기 및 무기 잔기와의 화학적 결합을 포함한다. 본 기재내용의 유도체는 특이적인 결합 도메인 폴리펩타이드의 순환 반감기를 증가시키기 위해 제조될 수 있거나, 바람직한 세포, 조직 또는 기관에 대한 폴리펩타이드의 표적화능을 개선시키도록 설계될 수 있다.
본 기재내용은 또한 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 및 제4,179,337호에 기술된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 하나 이상의 수용성 중합체 부착을 포함하도록 공유결합적으로 변형되거나 유도체화된 융합 단백질을 포함한다. 당해 분야에 공지된 여전히 다른 유용한 중합체는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로즈, 및 기타 탄수화물-계 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올, 및 이들 중합체의 혼합물을 포함한다. 특히 바람직한 것은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-유도체화된 단백질이다. 수용성 중합체는 특수 위치, 예를 들면 본 기재내용에 따른 단백질 및 폴리펩타이드의 아미노 말단에서 결합되거나, 폴리펩타이드의 하나 이상의 측쇄에 임의로 부착될 수 있다. 치료능을 개선시키기 위한 PEG의 용도는 미국 특허 제6,133,426호에 기술되어 있다.
본 기재내용의 특수 양태는 면역글로불린 또는 Fc 융합 단백질이다. 이러한 융합 단백질은, 특히 Fc 도메인이 FcRn, 신생 Fc 수용체와 상호작용할 수 있는 경우, 긴 반감기, 예를 들면, 수시간, 1일 이상, 또는 심지어 1주 이상을 가질 수 있다. Fc 도메인내 FcRn에 대한 결합 부위는, 또한 세균 단백질 A 및 G가 결합하는 위치이다. 이들 단백질 사이의 강력한 결합은 예를 들면, 단백질 정제동안 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용함에 의해 본 기재내용의 항체 또는 융합 단백질을 정제하기 위한 수단으로 사용될 수 있다.
단백질 정제 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 이들 기술은 하나의 수준에서, 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획의 조 분획화를 포함한다. 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 부분 또는 완전한 정제(또는 균질성에 대한 정제)를 달성하기 위한 추가의 정제가 흔히 바람직하다. 순수한 융합 단백질의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온-교환 크로마토그래피; 배출 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 및 등전 포커싱이다. 펩타이드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 급속 단백질 액체 크로마토그래피 및 HPLC이다.
본 기재내용의 특정 측면은 정제, 및 특수 양태에서, 융합 단백질의 실질적인 정제에 관한 것이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "정제된 융합 단백질"은 다른 성분들로부터 분리가능한 조성물을 언급하는 것으로 의도되며, 여기서, 융합 단백질은 이의 천연적으로 수득가능한 상태에 대해 특정 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 융합 단백질은 또한 천연적으로 존재할 수 있는 환경으로부터 유리된 융합 단백질을 말한다.
일반적으로, "정제된"은 분획화되어 각종의 다른 성분들이 제거된 융합 단백질 조성물을 말할 것이며, 이러한 조성물은 실질적으로 이의 발현된 생물학적 활성을 보유한다. 용어 "실질적으로 순수한"이 사용되는 경우, 당해 표현은, 융합 단백질이 조성물의 주요 성분을 형성하는, 예를 들면, 조성물 속에 약 50중량%, 약 60 중량%, 약 70 중량%, 약 80 중량%, 약 90 중량%, 약 95 중량%, 약 99 중량% 또는 그 이상을 구성하는 융합 결합 단백질 조성물을 말한다.
정제의 정도를 정량화하기 위한 각종 방법이 본 기재내용의 측면에서 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들은 예를 들면, 활성 분획의 특이적인 결합 활성의 측정, 또는 SDS/PAGE 분석에 의한 분획내 융합 단백질의 양의 평가를 포함한다. 단백질 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 결합 활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 결합 활성과 비교함으로써 본원에서 "-배 정제 수"로 평가되는, 정제도를 계산하는 것이다. 결합 활성의 양을 나타내기 위해 사용된 실제 단위는 물론, 정제를 수반하여 선택된 특수 검정 기술 및 발현된 융합 단백질이 검출가능한 결합 활성을 나타내는지의 여부에 따를 것이다.
단백질 정제에 사용하기에 적합한 각종 기술이 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 이들은 예를 들면, 암모늄 설페이트, PEG, 항체 등을 사용한 침전, 또는 열 변성에 이은 원심분리; 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록실아파타이트, 및 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 단계; 등전 포커싱; 겔 전기영동; 및 이들 및 다른 기술의 조합을 포함한다. 당해 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 각종 정제 단계를 수행하는 순서는 변할 수 있거나, 특정 단계가 생략될 수 있으며, 제외되고도 여전히 실질적으로 정제된 단백질의 제조를 위한 적합한 방법이 수득되는 것으로 여겨진다.
융합 단백질이 항상 이의 최상의 정제된 상태로 제공되어야 하는 일반적인 요건은 없다. 실제로, 거의 실질적으로 정제되지 않은 단백질은 특정 양태에서 유용성을 가질 것으로 고려된다. 부분적 정제는 보다 적은 정제 단계를 조합하여 사용하거나, 동일한 일반적인 정제 도식의 상이한 형태를 사용함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, HPLC 장치를 사용하여 수행된 양이온-교환 컬럼 크로마토그래피가 일반적으로 낮은 압력 크로마토그래피 시스템을 사용하는 동일한 기술보다 더욱 높은 정제를 초래할 것임이 인식된다. 상대적으로 보다 낮은 정제도를 나타내는 방법이 단백질 생성물의 전체 회수 또는 발현된 단백질의 결합 활성을 유지하는데 유리할 수 있다.
폴리펩타이드의 이동이 때때로 SDS/PAGE의 상이한 조건과 함께 현저히 변화할 수 있음은 공지되어 있다[참조: Capaldi et al. (1977) Biochem. Biophys. Res. Comm. 76:425]. 따라서, 상이한 전기영동 조건하에서, 정제되거나 부분 정제된 융합 단백질 발현 생성물의 명확한 분자량은 변할 수 있는 것으로 인식된다.
폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터 및 숙주 세포
본 기재내용은 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(분리되거나 정제되거나 순수한 폴리뉴클레오타이드), 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(클로닝 벡터 및 발현 벡터 포함) 및 본 기재내용에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포(예를 들면, 숙주 세포)를 제공한다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인, 또는 하나 이상의 이러한 결합 도메인을 함유하는 다중-특이적인 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)가 고려된다. 다중-특이적인 융합 단백질을 암호화하는 발현 카세트가 본원에 첨부된 실시예에서 제공된다.
본 기재내용은 또한 본 기재내용의 폴리뉴클레오타이드, 및 특히 재조합체 발현 작제물을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 당해 기재내용은 본 기재내용의 CD86 결합 도메인 및 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제 도메인과 함께 이러한 다중-특이적인 융합 단백질-암호화 서열의 전사, 해독 및 프로세싱을 유발하거나 촉진하는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 다중-특이적인 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 고려한다.
원핵 및 진핵 숙주와 함께 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989)]에 기술되어 있다. 예시적인 클로닝/발현 벡터는 클로닝 벡터, 셔틀 벡터, 및 발현 벡터를 포함하며, 이들은 여기에 함유된 폴리뉴클레오타이드의 증폭, 전달, 및/또는 발현에 적합한 당해 분야에 공지된 플라스미드, 파지미드, 파스미드, 코스미드, 바이러스, 인공 염색체 또는 특정한 핵산 비히클을 기본으로 할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "벡터"는 이것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 벡터는 플라스미드, 효모 인공 염색체 및 바이러스 게놈을 포함한다. 특정의 벡터는 숙주 세포내에서 자가 복제할 수 있는 반면, 다른 벡터는 숙주 세포의 게놈내로 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터가 발현 조절 서열에 작동적으로 연결됨으로써 이들 서열의 발현을 지시할 수 있는 핵산 서열을 함유하는 "재조합체 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")로 본원에 언급되어 있다.
특정 양태에서, 발현 작제물은 플라스미드 벡터로부터 유래한다. 예시적인 작제물은 암피실린 내성 유전자, 폴리아데닐화 시그날 및 T7 프로모터 부위를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 변형된 pNASS 벡터[제조원: 클론테크(Clontech), 캘리포니아 팔로 알토 소재]; CHEF1 프로모터를 갖는 pDEF38 및 pNEF38[제조원: 씨엠씨 이코스 바이올로직스, 인코포레이티드(CMC ICOS Biologics, Inc.)]; 및 CMV 프로모터를 갖는 pD18[제조원: 론자(Lonza)]를 포함한다. 다른 적합한 포유동물 발현 벡터는 잘 공지되어 있다(참조: 예를 들면, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., 상기 참조; 또한 참조: 예를 들면, catalogs from Invitrogen, San Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ). 유전자 증폭에 이은 적절한 선택제(예를 들면, 메토트렉세이트)의 적용으로부터 수득되는 융합 단백질의 향상된 생산 수준을 촉진하기 위해, 적합한 조절 제어하에서 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)-암호화 서열을 포함하는 유용한 작제물을 제조할 수 있다.
일반적으로, 재조합체 발현 벡터는 위에서 기술한 바와 같이, 복제 기원 및 숙주 세포의 형질전환을 허용하는 선택가능한 마커, 및 하부 구조 서열의 전사를 지시하기 위해 고도로-발현된 유전자로부터 유래한 프로모터를 포함할 것이다. 본 기내내용에 따른 폴리뉴클레오타이드와 작동가능하게 연결된 벡터는 클로닝 또는 발현 작제물을 생성한다. 예시적인 클로닝/발현 작제물은 적어도 하나의 발현 조절 성분, 예를 들면, 당해 기재내용의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 인핸서, 인자-특이적인 결합 부위, 터미네이터 및 리보소옴 결합 부위와 같은, 추가의 발현 조절 성분이 또한 본 기재내용에 따른 벡터 및 클로닝/발현 작제물에서 고려된다. 본 기재내용에 따른 폴리뉴클레오타이드의 이종 구조 서열은 적절한 상으로 해독 개시 및 종결 서열과 함께 조립된다. 따라서, 예를 들면, 본원에 제공된 융합 단백질-암호화 핵산이 숙주 세포내에서 이러한 단백질을 발현하기 위한 재조합체 발현 작제물로서 각종 발현 벡터 작제물 중 어느 하나 속에 포함될 수 있다.
적절한 DNA 서열(들)이 예를 들면, 각종 공정에 의해 벡터내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당해 분야에 공지된 과정에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위(들)내로 삽입된다. 클로닝, DNA 분리, 증폭 및 정제, DNA 리가제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제 등을 포함하는 효소 반응을 위한 표준 기술, 및 각종의 분리 기술이 고려된다. 다수의 표준 기술이 예를 들면, 문헌[참조: Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA, 1993); Sambrook et al. (Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1989); Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY, 1982); Glover (Ed.) (DNA Cloning Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK, 1985); Hames and Higgins (Eds.) (Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK, 1985) 등에 기술되어 있다.
발현 벡터내 DNA 서열은 적어도 하나의 적절한 발현 조절 서열(예를 들면, 구성적 프로모터 또는 조절된 프로모터)에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 이러한 발현 조절 서열의 대표적인 예는 위에서 기술한 바와 같은 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 프로모터를 포함한다. 프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선택가능한 마커를 지닌 다른 벡터를 사용하여 어떠한 바람직한 유전자로부터 선택될 수 있다. 진핵세포 프로모터는 CMV 이미디에이트 얼리(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 얼리 및 레이트 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR 및 마우스 메탈로티오네인-I을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당해 분야의 숙련가의 수준내에 있으며, 본 기재내용에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터 또는 조절된 프로모터를 포함하는 특정의 특히 바람직한 재조합체 발현 작제물의 제조가 본원에 기술되어 있다.
본 기재내용의 폴리뉴클레오타이드의 변이체가 또한 고려된다. 변이체 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 바와 같거나, 약 65 내지 68℃에서의 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨 또는 약 42℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨 및 50% 포름아미드의 스트링전트 하이브리드화 조건(stringent hybridization condition)하에서 정의된 서열의 폴리뉴클레오타이드중 하나에 하이브리드화하는 정의된 서열의 폴리뉴클레오타이드의 하나와 적어도 90%, 및 바람직하게는 95%, 99%, 또는 99.9% 동일하다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 본원에 기술된 작용성을 갖는 결합 도메인 또는 이의 융합 단백질을 암호화하는 능력을 보유한다.
용어 "스트링전트"는 당해 분야에서 엄격한 것으로 일반적으로 이해되는 조건을 언급하는데 사용된다. 하이브리드화 스트링전시(hybridization stringency)는 원칙적으로 온도, 이온 강도, 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 결정된다. 하이브리드화 및 세척을 위한 스트링전트 조건의 예는 약 65 내지 68℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨 또는 약 42℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨, 및 50% 포름아미드이다(참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
보다 스트링전트인 조건(예: 고온, 보다 적은 이온 강도, 보다 높은 포름아미드 또는 기타 변성제)을 또한 사용할 수 있으나, 하이브리드화율에 영향을 미칠 것이다. 데옥시올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화에 관한 예에서, 추가의 예시적인 스트링전트 하이브리드화 조건은 37℃(14개-염기 올리고뉴클레오타이드의 경우), 48℃(17개-염기 올리고뉴클레오타이드의 경우), 55℃(20개-염기 올리고뉴클레오타이드의 경우), 및 60℃(23개-염기 올리고뉴클레오타이드의 경우)에서 6x SSC, 0.05% 나트륨 파이로 포스페이트 속에서의 세척을 포함한다.
본 기재내용의 추가의 측면은 본 기재내용의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터/발현 작제물 중 어느 것으로 형질전환되거나 형질감염되거나, 또는 달리는 이를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 본 기재내용의 폴리뉴클레오타이드 또는 클로닝/발현 작제물은 형질전환, 형질감염 및 유전자도입을 포함하는, 당해 분야에 공지된 어떠한 방법을 사용하여 적합한 세포내로 도입된다. 숙주 세포는 예를 들면, 생체외 유전자 치료요법을 포함하는, 생체외 세포 치료요법을 겪는 대상체의 세포를 포함한다. 본 기재내용에 따른 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 단백질을 지니는 경우 본 기재내용의 측면으로서 고려되는 진핵 숙주 세포는 대상체 자신의 세포(예를 들면, 인간 환자 자신의 세포)외에, VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주(발현된 다가 결합 분자의 글리코실화 패턴을 변형시킬 수 있는 변형된 CHO 세포, 참조: 미국 특허공개 공보 제2003/0115614호), COS 세포(예를 들면, COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, HEK293 세포, HepG2 세포, N 세포, 3T3 세포, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포(예를 들면, Sf9 세포), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae ) 세포, 및 본 기재내용에 따른 단백질 또는 펩타이드를 발현시키고, 임의로 분리하는데 유용한 것으로 당해 분야에 공지된 어떠한 다른 진핵 세포도 포함한다. 또한 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli ), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis ), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium ), 스트렙토마이세테(Streptomycete)를 포함하는 원핵 세포, 또는 본 기재내용에 따른 단백질 또는 펩타이드를 발현시키고, 임의로 분리하는데 적합한 것으로 당해 분야에 공지된 어떠한 원핵 세포도 고려된다. 원핵 세포로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리하는데 있어서, 특히 봉입체로부터 단백질을 추출하기 위해 당해 분야에 공지된 기술을 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 적절한 숙주의 선택은 본원의 교시내용으로부터 당해 분야의 숙련가의 영역내에 있다. 본 기재내용의 융합 단백질을 글리코실화하는 숙주 세포도 고려된다.
용어 "재조합체 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 재조합체 발현 벡터를 함유하는 세포를 말한다. 이러한 용어는 특수 대상체 세포만이 아니라 이러한 세포의 후대 세포도 언급하는 것으로 의도된다. 특정의 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 후대 세대에서 발생할 수 있으므로, 이러한 후대는 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 영역내에 포함된다.
재조합체 숙주 세포는 프로모터를 활성화하고, 형질전환체를 선택하거나 특수 유전자를 증폭시키기에 적절하게 변형된 통상의 영양 배지 속에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은, 발현을 위해 선택된 특수 숙주 세포를 위한 배양 조건은 통상의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다. 각종의 포유동물 세포 배양 시스템을 또한 사용하여 재조합체 단백질을 발현시킬 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 문헌[참조: Gluzman (1981) Cell 23:175]에 기술된 원숭이 신장 섬유모세포의 COS-7 주(line), 및 혼화성 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주, 예를 들면, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포 주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진(origin), 적합한 프로모터 및 임의로, 인핸서(enhancer)를 포함할 것이며, 또한 예를 들면, 다가 결합 단백질 발현 작제물의 제조와 관련하여 본원에 기술된 바와 같은, 특정의 필수적인 리보소옴 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 5'-플랭킹 비전사된 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이스로부터 유래한 DNA 서열, 및 폴리아데닐화 부위를 사용하여 요구된 전사되지 않은 유전 성분을 제공할 수 있다. 숙주 세포내로의 작제물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 또는 전기천공[참조: Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology]을 포함하는, 당해 분야의 숙련가가 익숙할 각종 방법으로 수행할 수 있다.
하나의 양태에서, 숙주 세포는 본 기재내용에 따라 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 재조합체 바이러스 작제물에 의해 유전자도입된다. 형질도입된(transduced) 숙주 세포는 바이러스 버딩(virus budding) 동안 바이러스 입자에 의해 혼입된 숙주 세포 막의 일부로부터 기원한 발현된 단백질 또는 폴리펩타이드를 함유하는 바이러스 입자를 생산한다.
조성물 및 사용 방법
CD86, IL-10, HLA-G, IL-35, PD-1, BTLA, LIGHT, GITRL 또는 CD40 조절곤란과 관련된 질병 상태로 고생하는 인간 또는 비-인간 포유동물을 치료하기 위해서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질을 대상체에게 하나 이상의 투여 과정에 따라 질병 상태의 증상을 완화시키기에 효과적인 양으로 투여한다. 폴리펩타이드인 경우, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 하기에 보다 완전히 논의되는 바와 같이, 주사 또는 주입에 의한 정맥내 투여에 사용될 수 있는, 다른 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 안정화제를 임의로 포함하는, 약제학적으로 허용 가능한 희석제 속에 현탁하거나 용해할 수 있다.
약제학적으로 효과적인 투여량은 질병 상태의 발생을 예방하거나 억제하거나, 또는 질병 상태를 치료(증상을 어느 정도, 바람직하게는 모든 증상을 완화시키는)하는데 요구되는 투여량이다. 약제학적으로 효과적인 투여량은 질병의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료하는 대상체의 유형, 치료를 위한 고려하에서의 특정 대상체의 생리학적 특성, 현재의 의약, 및 의학 분야에서 숙련가가 인지할 기타 인자들에 의존한다. 예를 들어, 0.1 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중(이는 단일 투여량으로 또는 다중 투열량으로 시간당, 일당, 주당, 월당 또는 적절한 간격의 이의 어떠한 조합으로서 투여될 수 있다)의 양의 활성 성분을 본 기재내용의 결합 도메인 폴리펩타이드 또는 다중-특이적인 단백질 융합체의 효능에 따라 투여할 수 있다.
특정 측면에서, 융합 단백질의 조성물이 본 기재내용에 의해 제공된다. 본 기재내용의 약제학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 유형의 결합 도메인 또는 융합 단백질을 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함한다. 이러한 담체는 사용된 용량 및 농도에서 수용체에 대해 무독성일 것이다. 치료학적 용도를 위한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 약제학 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조; Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro (Ed.) 1985]에 기술되어 있다. 예를 들면, 생리학적 pH에서 멸균 염수 및 포스페이트 완충된 염수를 사용할 수 있다. 방부제, 안정화제, 염료 등이 약제학적 조성물속에 제공될 수 있다. 예를 들면, 나트륨 벤조에이트, 소르브산, 또는 p-하이브록시벤조산의 에스테르가 방부제로서 가해질 수 있다(참조: Id. at 1449). 또한, 항산화제 및 현탁화제를 사용할 수 있다(Id.). 본 발명의 화합물은 유리 염기 또는 염 형태로서 사용될 수 있으며, 이들 형태 둘 다는 본 발명의 영역내에 있는 것으로 고려된다.
약제학적 조성물은 또한 완충제와 같은 희석제; 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 탄수화물(예를 들면, 글루코즈, 슈크로즈 또는 덱스트린), 킬레이트제(예를 들면, EDTA), 글루타티온 또는 다른 안정화제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 중성의 완충된 염수 또는 비특이적인 혈청 알부민과 혼합된 염수가 예시적인 적절한 희석제이다. 바람직하게는, 생성물은 희석제로서 적절한 부형제 용액을 사용하여 동결건조제로서 제형화된다.
본 기재내용의 조성물은 CD86, IL-10, HLA-G, IL-35, PD-1, BTLA, LIGHT, GITRL 또는 CD40 조절곤란의 결과 또는 이와 관련된 인간 및 비-인간 포유동물에서의 질병 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 위에서 논의한 바와 같이, 예를 들어, CTLA4Ig의 투여에 의한 CD28에 대한 CD86의 결합의 차단은 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. IL10은 면역억제 특성[참조: Commins et al. (2008) J. Allergy Clin. Immunol. 121:1108-11; Ming et al., (2008) Immunity 28:468-476]을 지닌 것으로 알려져 있으며, 유리한 반응이 IL10을 건선 환자[참조; Asadullah et al. (1999) Arch. Dermatol. 135:187-92] 및 염증성 창자병[참조: Schreiber et al. (2000) Gastroenterology 119:1461-72] 환자에게 투여후 관측되었다. 위에서 언급한 바와 같이, HLA-G는 다발 경화증과 관련된 CNS에서 염증 반응을 감소시키는데 유용할 수 있으며[참조; Wiendl et al. (2005) Blood, 128:2689-2704], 이식에서 이식체에 대한 내성을 촉진시키는 치료제로서 유용할 수 있다[참조: Carosella et al. (2008) Blood 111:4862-4870]. HGF는 관절염의 마우스 모델 및 천식의 마우스 모델 둘 다에서 질병을 회복시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. IL35는 관절염의 마우스 모델에서 질병을 회복시키는데 효과적이며 T-세포 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 위에서 논의한 바와 같이, LIGHT 길항제는 이식체 대 숙주병을 회복시키는데 효과적이며 T-세포 증식을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한, LIGHT는 염증성 창자병 및 크론병(Crohn's disease)에서 중요한 역활을 하는 것으로 여겨진다. PD1-L1 또는 PD1-L2 내지 PD-1은 T-세포 활성화 및 사이토킨 생산을 감소시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. BTLA는 T-세포 활성화 및 사이토킨 생산을 감소시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. GITR에 대한 GITRL의 결합은 천식 및 관절염의 동물 모델에서 질병 중증도를 증가시키는 것으로 밝혀졌으며, T 세포 염증 및 면역 반응을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 위에서 논의한 바와 같이, CD40 시그날링은 자가면역 질병, 암 및 기관 및 조직 이식 거부증과 같은 질병에 관여된다.
따라서, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염, 천신, 전신 홍반 루푸스(SLE), 염증성 창자병(크론병 및 궤양대장염 포함), 이식체 대 숙주병, 건선, 다발경화증, 피부근염, 다발근육염, 악성 빈혈, 원발쓸개관간경화증, 급성 파종뇌척수염(ADEM), 애디슨병(Addison's disease), 강직척추염, 항인지질 항체 증후군(APS) 자가면역 간염, 제1형 당뇨병, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 그레이브스병(Graves' disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barresyndrome)(GBS), 하시모토병(Hashimoto's disease), 특발저혈소판자색반병, 홍반 루푸스, 보통천포창, 소그렌 증후군, 측두동맥염[또한, "자이언트 세포 동맥염(giant cell arteritis)"으로 공지됨], 자가면역 용혈빈혈, 물집유사천포창, 맥관염, 복강질환, 자궁내막증, 화농땀샘염, 사이질방광염, 국소피부경화증, 공피증, 발작수면, 뉴로마이오토니아(neuromyotonia), 백반증 및 자가면역 내부 귓병과 같은 각종 자가면역 및/또는 염증 질환을 치료하는데 유용하다. 또한, 본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질은 기관 이식(기질 기관 이식 또는 동종이식 포함), 세포 이식 등에서 치명적인 면역 동종반응을 억제하는데 유용하다.
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 약제학적으로 허용 가능하며 모 화합물의 바람직한 약리학적 활성을 지닌 본 기재내용의 결합 도메인 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 염을 말한다. 이러한 염은 다음을 포함한다: (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기 산과 함께 형성되거나; 아세트산, 프로피온산, 헥사노산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 석신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄포르설폰산, 4-메틸비사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 설폰산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 무콘산 등과 같은 유기 산과 함께 형성된 산부가염; 또는 (2) 모 화합물내에 존재하는 산성 양성자가 예를 들면, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온 또는 알루미윰 이온에 의해 대체되거나; 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 같은 유기 염기와 함께 배위된 경우 형성된 염.
특히 예시적인 양태에서, 본 기재내용의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질은 예를 들면, 거환 주사 또는 주입에 의해 정맥내 투여된다. 정맥내 외의 투여 경로는 경구, 국소, 비경구(예를 들면, 설하 또는 볼내), 설하, 직장, 질내 및 비강내를 포함한다. 본원에서 사용된 것으로서 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내, 해면내, 외이도내, 요도내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 약제학적 조성물은 이에 함유된 활성 성분들이, 조성물을 환자에게 투여하는 경우 생이용성이 되도록 제형화된다. 환자에게 투여될 조성물은 예를 들면, 정제가 단일 용량 단위일 수 있는 경우, 하나 이상의 용량 단위의 형태를 취하며, 또한 에어로졸 형태의 본 기재내용의 하나 이상의 화합물의 용기는 다수의 용량 단위를 유지할 수 있다.
경구 투여의 경우, 슈크로오즈, 카올린, 글리세린, 전분 덱스트란, 사이클로덱스트린, 나트륨 알기네이트, 에틸 셀룰로오즈 및 카복시 메틸셀룰로오즈와 같은 부형제 및/또는 결합제가 존재할 수 있다. 감미제, 방부제, 염료/착색제, 풍미 증진제 또는 어떠한 이의 조합이 임의로 존재할 수 있다. 피복 쉘(coating shell)이 또한 임의 사용될 수 있다.
주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물에서, 하나 이상의 표면활성제, 방부제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제, 등장성 제제 또는 이의 어떠한 조합이 임의로 포함될 수 있다.
본 기재내용에 따른 발현 생성물을 포함하는 제형 또는 핵산-계 제형인 경우, 약 0.01 ㎍/kg 체중 내지 약 100 ㎍/kg 체중이, 예를 들면, 피하, 근육내 또는 정맥내 경로에 의해, 또는 제공된 환경 조건하에서 적합한 것으로 당해 분야에 공지된 어떠한 경로에 의해 투여될 것이다. 예를 들어, 바람직한 용량은 약 1　㎍/kg 내지 약 20 mg/kg이며, 약 5 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg이 특히 바람직하다. 당해 분야의 숙련가에게는 투여 수 및 빈도가 숙주의 반응에 의존할 것임이 명백할 것이다.
본 기재내용의 약제학적 조성물은 예를 들면, 고체, 액체 또는 가스(에어로졸)의 형태와 같이, 환자에게 투여하기 위한 어떠한 형태로 존재할 수 있다. 이 조성물은 액체, 예를 들면, 본원에 기술된 어떠한 경로에 의해 투여하기 위한, 엘릭서르제, 시럽제, 액제, 유제 또는 현탁제의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 액체 약제학적 조성물은, 액제, 현탁제 또는 기타 유사한 형태에 상관없이 하나 이상의 다음 성분들을 포함할 수 있다: 주사용수, 염수 용액(예를 들면, 생리학적 염수), 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁회 매질로서 제공될 수 있는 합성 모노- 또는 디글리세라이드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트와 같은 항산화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 및 나트륨, 클로라이드 또는 덱스트로즈와 같은 강직성(tonicity)을 조절하기 위한 제제. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여량 바이알(vial) 속에 봉입될 수 있다. 생리학적 염수가 바람직한 첨가제이다. 주사가능한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균된다.
제제 속에 알루미늄 염, 유중수 유화액, 생분해가능한 오일 비히클, 수중유 유액, 생분해가능한 미세캅셀 및 리포좀을 포함하는 전달 비히클과 같은 다른 성분을 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이러한 비히클에 사용하기 위한 항원보강제의 예는 N-아세틸무라밀-L-알라닌-D-이소글루타민(MDP), 리포폴리사카라이드(LPS), 글루칸, IL-12, GM-CSF, γ-인터페론 및 IL-15를 포함한다.
비록 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 어떠한 적합한 담체도 본 기재내용의 약제학적 조성물 속에 사용될 수 있다고 해도, 담체의 유형은 투여 방식 및 지속적인 방출이 요구되는지의 여부에 따라서 변할 것이다. 비경구 투여의 경우, 담체는 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스, 완충제 또는 이의 어떠한 조합을 포함할 수 있다. 경구 투여의 경우, 상기 담체중 어느 것 또는 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로오즈, 글루코오즈, 슈크로오즈, 마그네슘 카보네이트 또는 이의 어떠한 조합과 같은 고체 담체를 사용할 수 있다.
본 기재내용의 다중-특이적인 융합 단백질 조성물과 함께 제2 제제의 투여가 또한 고려된다. 제2 제제는 염증, 자가면역성 및 암과 같은 특수 질병 상태를 위한 표준 치료로서 당해 분야에서 허용 가능한 것일 수 있다. 고려되는 예시적인 제2 제제는 사이토킨, 성장 인자, 스테로이드, NSAID, DMARD, 화학치료제, 방사선치료제 또는 기타 활성제 및 보조제를 포함한다.
본 기재내용은 본 기재내용의 약제학적 조성물을 포함하는 용량 단위를 고려한다. 이러한 용량 단위는 예를 들면, 단일-투여량 또는 하나는 동결건조된 형태의 본 기재내용의 약제학적 조성물을 포함하고 다른 것은 재구성용 희석제를 포함하는, 2개-구획 바이알 또는 주사기를 포함하는 다중 투여량을 포함한다. 다중-투여량 용량 단위는 또한 예를 들면, 정맥내 주입 장치에 연결된 백(bag) 또는 튜브일 수 있다.
본 기재내용은 또한 단일 투여량 또는 다중-투여량 용기, 예를 들면, 바이알 내 약제학적 조성물, 및 본원에 기술된 바와 같은 질환으로 고생하는 환자에게 조성물을 투여하기 위한 지침서 세트를 포함하는 키트(kit)를 고려한다.
본 명세서에서 언급된 모든 미국 특허, 미국 특허공개 공보, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원, 비-특허 공보, 표, 서열, 웹 페이지 등은 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다. 다음 실시예는 본 기재내용을 설명하기 위한 것이지만, 이에 한정되지 않는 것으로 의도된다.
본 발명은 CD86 길항제 결합 도메인, 및 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제와 같은 이종 표적에 대해 특이적인 다른 결합 도메인으로 구성된 융합 단백질은 물론, 이의 조성물 및 치료학적 용도를 제공한다.
도 1은 아바타셉트, CTLA4-Ig(N2)(서열번호: 11), 및 IL10에 융합된 CTLA4 엑토도메인을 함유하는 다중-특이적인 xceptor 융합 단백질(서열번호: 9)을 포함하는 각종 단백질에 의한 CD80에 대한 결합을 나타낸다.
도 2는 CTLA4-Ig(N2)(서열번호: 11) 및 IL10에 융합된 CTLA4 엑토도메인을 함유하는 다중-특이적인 xceptor 융합 단백질(서열번호: 9)이 가용성 IL10Ra(sIL10Ra)에 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 3 및 도 4는 IL10에 융합된 CTLA4 엑토도메인을 함유하는 다중-특이적인 xceptor 융합 단백질(서열번호: 9)이 PBMC에서 STAT3 포스포릴화를 유도할 수 있음을 나타낸다.
도 5는 3D1으로부터의 항-CD86 결합 도메인을 함유하는 xceptor 및 사람화된 FUN1 모노클로날 항체가 WIL2-S 세포상에서 CD86에 결합함을 나타낸다.
도 6은 CD86 결합 도메인을 함유하는 xceptor 및 IL10이 세포 표면 CD86 및 sIL10Ra에 동시에 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 7은 각종의 상이한 버젼의 인간화된 항-CD86 FUN1 SMIP가 CD86에 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 8은 xceptor의 카복시-말단(BD2)에 대해 IL10을 결합시키는 각종 링커를 갖는 CTLA4::IL10 xceptor 분자가 IL10R1-Ig에 결합할 수 있음을 나타낸다. △-서열번호: 9; ◇-서열번호: 171; ●-서열번호: 302; ▲-서열번호: 173.
도 9는 xceptor의 카복시-말단(BD2)에 IL10을 결합시키는 짧은 링커를 갖는 CTLA4::IL10 xceptor 분자가 IL10R1-Ig를 결합시킬 수 있음을 나타낸다. △-서열번호: 171; ◇-서열번호: 175; ●-서열번호: 177; ▲-서열번호: 179.
도 10은, 몇개의 xceptor 단백질이 CD80에 결합함을 나타낸다.
도 11은 몇개의 xceptor 단백질이 CD86에 결합함을 나타낸다.
도 12는 몇개의 xceptor 단백질이 sIL10Ra에 결합함을 나타낸다.
도 13은 몇개의 xceptor 단백질이 CD80 및 sIL10Ra에 동시에 결합할 수 있음을 나타낸다.
도 14는 몇개의 xceptor 단백질이 마우스 CD80과 교차반응성임을 나타낸다.
도 15는 몇개의 xceptor 단백질이 마우스 CD86과 교차반응성임을 나타낸다.
도 16 및 17은 몇개의 xceptor 단백질이 MLR 검정에서 인간 T 세포 반응을 차단함을 나타낸다.
도 18 내지 도 20은 몇개의 xceptor 단백질이 MLR 검정에서 마우스 T 세포 반응을 차단함을 나타낸다.
도 21 및 도 22는 변이체 IL10(I87위치 돌연변이를 가진 IL10 또는 모노IL10) 또는 변이체 CTLA4를 함유하는 몇개의 xceptor 단백질이 MLR 검정에서 인간 T 세포 반응을 차단함을 나타낸다.
도 23은 변이체 IL10(I87 위치 돌연변이를 지닌 IL10 또는 모노IL10)을 함유하는 몇 개의 xceptor 단백질이 MC/9 세포 증식 검정에서 마우스 IL10보다 덜 면역자극성임을 나타낸다.
도 24는 변이체 IL10(I87 위치 돌연변이를 지닌 IL10 또는 모노IL10)을 함유하는 몇개의 xceptor 단백질이 MC/9 세포 증식 검정에서 인간 IL10보다 덜 면역자극성임을 나타낸다.
실시예
Xceptor 서열
CTLA4 엑토도메인을 가진 예시적인 다중-특이적인 융합 단백질의 뉴클레오타이드 발현 카세트 및 아미노산 서열을 각각 서열번호: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37 및 41 및 서열번호: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38, 및 42에 제공한다. 이들 예시적인 다중-특이적인 융합 단백질의 활성을 하기 실시예 1 내지 6에 기술된 바와 같이 시험하였다. 다음 실시예에서 사용된 약어는 다음 용어를 포함한다: PBS-T: PBS, pH 7.2 내지 7.4 및 0.1% Tween® 20; 작업 완충액: 1% BSA가 들어있는 PBS-T; 차단 완충액: 3% BSA가 들어있는 PBS-T.
실시예 1
항-CD86 결합 도메인
하이브리도마 3D1 및 FUN1을 사용하여 이들 모노클로날 항체의 항-CD86 가변 결합 도메인을 클로닝하였다. FUN1 및 3D1 항-CD86 모노클로날 항체로부터의 중쇄, 경쇄, scFv 링커, 및 CDR에 대한 서열은 각각 서열번호: 305 내지 313 및 318 내지 326에서 찾을 수 있다.
다음의 인간화된 FUN1 항-CD86 모노클로날 항체 가변 결합 도메인을 사용하여 SMIP 단백질 및 xceptor을 작제하였다. FUN1 CDR을 인간 배선 서열 내로 다음과 같이 이식하였다: (1) FUN1-11은 경쇄의 경우 Igkv4-1*01 FR 및 중쇄의 경우 IgHV1-F*01 FR을 가진다; (2) FUN1-21은 경쇄의 경우 Igkv4-1*01 FR 및 중쇄의 경우 IgHV1-2*02 FR을 가진다; (3) FUN1-31은 경쇄의 경우 Igkv4-1*01 FR 및 중쇄의 경우 IgHV3-11*01 FR을 가진다; (4) FUN1-12는 경쇄의 경우 Igkv1-27*01 FR을 및 중쇄의 경우 IgHV1-F*01 FR을 가진다; (5) FUN1-22는 경쇄의 경우 Igkv1-27*01 FR 및 중쇄의 경우 IgHV1-2*02 FR을 가진다; 및 (6) FUN1-32는 경쇄의 경우 Igkv1-27*01 FR 및 중쇄의 경우 IgHV3-11*01 FR을 가진다. 인간화된 분자에 대한 배선 CDR은 원래의 FUN1 분자와 유사하다.
연속적으로, 사람화된 FUN1 SMIP 단백질의 6개 버젼을 다음과 같이 또한 생성하였다: (1) FUN1-11(서열번호: 225); (2) FUN1-21(서열번호: 227); (3) FUN1-31(서열번호: 229); (4) FUN1-12(서열번호: 231); (5) FUN1-22(서열번호: 233); 및 (6) FUN1-32(서열번호: 235). 이들 인간화된 FUN1 SMIP 분자의 결합 활성은 도 7에 나타낸다. 또한, FUN1 가변 도메인(scFv) 및 인간화된 FUN1 scFv를 사용하여 IL10::FUN1(서열번호: 183); FUN1::IL10(서열번호: 187); FUN1-21::IL10(서열번호: 237); IL10::FUN1-21(서열번호: 254); IL10 I87A::FUN1-21(서열번호: 258)와 같은 xcepart 을 제조하였으며; 또한 모노IL10::FUN1-21 결합 도메인을 또한 짧은 A2 힌지(서열번호: 276)(여기서, A2 힌지 아미노산 서열은 서열번호: 364로 나타낸다)를 사용하여 제조하였다.
본원에 기술된 이들 및 모든 다른 작제물을 적절한 포유동물 발현 벡터내로 클로닝하고 각종 세포주내에서 발현시켜 특수 작용적 검정을 위한 단백질을 생산하였다.
실시예 2
BIAcoreTM에 의한 IL10-R1에 대한 Xceptor 결합
IL10-R1 결합 활성을 CTLA4 엑토도메인 및 IL10 도메인(서열번호: 9)을 포함하는 Xceptor에 대해 실질적으로 다음과 같이 시험하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR) 측정을 BIAcoreTM T100 SPR[제조원: 파마시아 바이오테크 에이비(Pharmacia Biotech AB), 업살라 소재] 상에서 HBS-P+[제조원: 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)]를 러닝 완충액(running buffer)으로 사용하여 수행하였다. IL-10R1[10 mM 아세트산나트륨 중 25 ㎍/mL, pH 4.0; 제조원; 알 앤드 디 시스템스(R&D Systems)]을 CM5 칩 상에 표준 아민 커플링 화학[제조원: 비아코어 아민 커플링 키트(Biacore Amine Coupling Kit), 지이 헬쓰케어]을 사용하여 867, 2687, 및 6719 Ru(공명 단위)의 최종 고정화 수준으로 직접 고정화시켰다. IL-10-함유 작제물에 300초 동안, 50 μl/분의 유동 속도에서, 100 pM 내지 10 nM의 일련의 농도로 주사하였다. 해리를 1200 초 동안 모니터링하고, 표면을 2M 염화마그네슘, pH 7.58을 60초 동안 주사한 후 20 mM EDTA(HBS-P+ 중)를 60초 동안 주사하여 재생시켰다. 표면과의 결합 상호작용은 적어도 30회의 재생 주기를 통해 안정하였다. 데이타를 BiaEvaluation을 사용하여 T100, 버젼 2.0(제조원: 지이 헬쓰케어)을 사용하여 분석하였다. 고정화된 IL-10R1에 대한 CTLA4/IL10 Xceptor의 결합 동력학은 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델에 고정할 수 없다고 해도, 2가 분석물 결합 모델에 대해 고 정확성으로 고정시킬 수 있다. 평형 해리 상수(KD)는 정지 상태 평형 모델에 대한 포화시 관측된 반응을 고정시킴으로써 각각의 작제물에 대해 고 정확성으로 계산할 수 있으며, 하기 표 3에 제공된다. Xceptor 융합 단백질내 CTLA4 엑토도메인의 혼입은 IL10/IL10R1 상호작용에 있어 명백한 효과를 가지지 않았다.
고정화된 단백질 분석물 제1 부위 ka (M-1s-1) 제1 부위
kd (s-1)		 제2 부위
ka (s-1)		 제2 부위
kd (s-1)		 KD (nM)
IL10-R1 IL10* 5.7 x　105 2.6 x　10-4 - - 0.46
IL10-R1 서열번호: 9 7 x　105 2.9 x　10-4 18 x 10-3 8.6 x 10-3 0.41**
* 문헌 값[참조: Yoon et al. (2006) J. Biol. Chem 281:35088-35096]** ka1 및 kd1으로부터의 계산치
실시예 3
ELISA에 의한 CD80 및, CD80 및 IL10 둘 다에 대한 Xceptor 결합
CD80 및 IL10R 결합 활성을 ELISA에 의해 아바타셉트, CTLA4-N2로서 언급된 CTLA4-Ig 작제물(서열번호: 10 및 11), 및 서열번호: 9의 CTLA4/IL10 Xceptor에 대해 실질적으로 다음과 같이 시험하였다.
CD80 결합
96-웰 블랙 맥시소프(black Maxisorp) CD80 플레이트(Nunc Catalog #437111)의 각각의 웰을 CD80-mIg(Ancell Catalog #510-020)로 2㎍/ml 용액을 사용하여 피복하고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이후에 플레이트를 차단 완충액(3% 탈지분유가 들어있는 PBS-T)로 차단하였다. 차단 완충액으로 일련 희석시킨 시험할 단백질 시료를 중복 웰(duplicate well) 속에서 CD80-mIg 피복된 플레이트에 가하고, 실온에서 약 1시간 동안 항온처리하였다. 세척한 후, 차단 완충액 속에 1:1,000으로 희석시킨 100μl/웰의 서양 고추냉이 퍼옥시다제 염소 항-인간 IgG(감마)를 가하고, 플레이트를 덮고, 실온에서 60분 동안 항온처리한 후, 실온에서 QuantaBluTM 형광성 퍼옥시다제 기질(Thermo Scientific Catolog #15169) 속에서 10분 동안 항온처리하였다. 각각의 웰의 흡광도를 420 nm에서 판독하였다. 관련되지 않은 융합 단백질 TRU-015를 네가티브 대조군으로서 사용하였다.
당해 실험의 결과를 도 1에 나타낸다. CTLA4-N2는 당해 ELISA 포맷에서 CD80-mIg에 대해 아바타셉트에 결합하는 반면, CTLA4/IL10 Xceptor는 보다 약한 CD80 결합을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
sIL10R1 및 sCD80 둘 다에 대한 Xceptor 결합
96-웰 블랙 막시소프 CD80 플레이트(Nunc Catalog #437111)의 각각의 웰을 sIL10Ra(R&D Systems Catalog #510-020)을 사용하여 2　㎍/ml 용액에서 피복시키고 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이후에, 플레이트를 차단 완충액(3% 탈지분유가 들어있는 PBS-T)으로 차단하였다. 차단 완충액 속에 일련 희석시킨 시험할 단백질의 시료를 중복 웰 속에서 sIL10Ra 피복된 플레이트에 가하고, 플레이트를 덮고, 실온에서 약 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 항-CD152 항체(Ancell #359-020)을 10ng/μl에서 또는 CD80-mIg(Ancell # 510-020)을 5 ㎍/ml에서 가한 후 차단 완충액 속에 1:10,000으로 희석시킨 서양 고추냉이 퍼옥시다제 염소 항-마우스 IgG (Fc)(Pierce #31439)을 가하고, 플레이트를 덮고, 실온에서 60분 동안 항온처리한 후, 실온에서 QuantaBluTM 형광성 퍼옥시다제 기질(Thermo Scientific Catolog #15169) 속에서 10분 동안 항온처리하였다. 각각의 웰의 흡광도를 420 nm에서 판독하였다. 관련되지 않은 융합 단백질 TRU-015를 네가티브 대조군으로 사용하였다.
도 2는 CTLA4-N2 및 서열번호: 9의 CTLA4::IL10 xceptor에 대해 수득된 결과를 나타낸다. 이들 결과는, CTLA4 및, CTLA4-Ig-IL10 Xceptor의 IL10 도메인 둘 다가 이들의 리간드/수용체에 동시 결합할 수 있음을 입증한다.
실시예 4
STAT3 포스포릴화를 유도하는 Xceptor
IL10-R1에 대한 IL10의 결합은 Jak-1 및 Tyk를 활성화시킴으로써 결국 STAT3의 활성화를 초래하는 것으로 알려져 있다[참조: 예를 들면, Williams et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:6965-6975]. 또한, 연구들에서, 유동 세포계산기(flow cytometry) 사용하여 PBMC중 STAT3의 포스포릴화를 연구할 수 있음이 입증되어 있다[참조: Lafarge et al. (2007) BMC Mol. Biol. 8:64]. 서열번호: 9의 CTLA4/IL10 Xceptor를 포함하는 가변 IL10-함유 작제물의 인간 PBMC에서 STAT3의 포스포릴화를 유도하는 능력은 실질적으로 다음과 같이 시험하였다.
PBMC를 인간 공여자로부터 분리하여 완전 배지(RPMI, 10% FBS, pen/strep) 속에서 2x106 세포/ml로 밤새 항온처리하였다. 다음날 아침에, PBMC를 1회 세척하고, 예비-가온시킨 RPMI 1640(보충물 없음)과 함께 4x106 세포/ml로 재현탁시키고 37℃에서 2.5시간 동안 항온처리하였다. 처리물은 2X 농도에서 0.25mL의 RPMI 1640 속에서 제조하고 0.25mL의 RPMI 1640 중의 1x106 PBMC와와 혼합하였다. 이후에, 시료를 37℃에서 15분 동안 항온처리하였다. 15분 항온처리를 완료한 후, 0.5mL의 빙냉 BD 사이토픽스(Cytofix) 완충액[제조원: 비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 제품 번호: 554655)를 각각의 튜브에 가하였다. 세포를 방상에서 30분 동안 항온처리한 후 2ml의 DPBS+2.5% FBS(FACS 완충액)으로 세척하였다. 경사제거하고 시료를 와동시킨 후, 0.5mL의 빙냉 BD PERM BUFFER III(제조: 비디 바이오사이언시스, 제품 번호 558050)을 각각의 튜브에 가한 후 시료를 빙상에서 30분 동안 항온처리하였다. 시료를 2mL의 FACS 완충액으로 3회 세척하고, 최종 세척 후 약 0.2mL의 FACS 완충액 속에 재현탁시켰다. 20μL의 FITC 접합된 항-인간 STAT3 mAb(제조원: 비디 바이오사이언스, 클론 PY705)를 각각의 시료에 가하였다. 세포를 암실 속에서 실온으로 30분 동안 항온처리하였다. 이후에, 시료를 FACS 완충액으로 3회 세척하여 어떠한 결합하지 않은 항체도 제거하였다. 시료를 LSRII 유동 세포계산기 상에서 분석하였다. 게이트(gate)를 SSC 및 FSC 프로파일을 기준으로 한 생 림프구에 적용시키고 FITC용 MFI를 측정하였다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 모든 IL-10 함유 작제물은 투여량 의존적 양식으로 STAT3 포스포릴화를 증가시켰다.
실시예 5
CD86, 및 CD86 및 IL10 둘 다에 대한 Xceptor 결합
CD86(WIL2-S)를 발현하는 인간 B-림포블라스토이드(lymphoblastoid) 세포주를 사용하여 CD86 결합을 시험하고, 표면에 CD86을 발현하는 CHO 세포주(HuCD86-2A2 세포)를 쥐 IgG Fc 또는 항-IL10 항체에 연결된 가용성 IL10 수용체 1(IL10R1) 융합 단백질과 함께 사용하여 xceptor 분자상에서 발견된 CD86 길항제 및 IL10 효능제의 동시 결합을 시험하였다. 요약하면, WIL2-S 또는 HuCD86-2A2 세포를 CD86 길항제를 함유하는 시험 분자와 함께 포화로부터 배경 수준에 이르는 범위의 농도로 항온처리하였다. HuCD86-2A2 세포에, IL10R1-muIg 융합 단백질 또는 쥐 항-IL10 항체를 추가로 가하여 CD86을 통해 세포 표면에 결합된 시험 분자와 복합체를 형성시켰다. 항온처리한 후, 세포를 세척하고 형광단(R-피코에리트린)은 xceptor 분자의 Fc 부위에 대해 특이적인 F(Ab')2 항체, IL10R-Ig 융합 단백질, 또는 항-IL10 항체를 태그시켰다. 이후, 태그된 세포를 유동 세포계산기를 통과시키고 각각의 시료의 중간 형광성 강도를 플롯팅함으로써 데이타를 분석하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 항-CD86 결합 도메인(예를 들면, 하이브리도마 항체 3D1 및 FUN1로부터)을 함유하는 xceptor 분자에 의한 WIL2-S 세포상에서의 CD86에 대한 결합은 xceptor 분자를 함유하는 CTLA4 엑토도메인의 결합보다 더 높은 친화성을 나타내었다. 보다 상세하게는, xceptor 3D1::IL10(서열번호: 189)을 함유하는 항-CD86 3D1은 CD86에 대해 xceptor FUN1::IL10(서열번호: 187)을 함유하는 항-CD86 FUN1보다 약간 더 높은 친화성을 가진 반면, CTLA4-Ig (서열번호: 11) 및 xceptor를 함유하는 CTLA4(서열번호: 173)은 CD86에 대해 하이브리도마 항체 3D1 및 FUN1으로부터의 항-CD86 결합 도메인보다 훨씬 더 낮은 친화성을 가졌다.
도 6에 나타낸 바와 같이, CD86 길항제 및 IL10 효능제를 함유하는 xceptor 분자는 HuCD86-2A2 세포 (회사내부에서 개발된 세포 표면에서 CD86을 발현하는 CHO 세포) 상의 CD86 및 가용성 IL10R1을 동시 결합시킬 수 있다. 또한, 도 6은, IL10 변이체가 IL10R1에 대해 상이한 결합 친화성을 가졌음을 나타낸다. 예를 들면, xceptor 분자 CTLA4::모노IL10(서열번호: 181) 및 (CTLA4::IL10)-75(서열번호: 173)는 IL10R1에 대해 유사한 친화성을 가진 반면, 바이러스의 돌연변이된 IL10 형태, CTLA4::IL10I87A(서열번호: 191) 및 CTLA4::IL10I87S(서열번호: 193)을 함유하는 xceptor는 IL10R1에 대해 훨씬 더 낮은 친화성을 나타내었다.
다른 시험에서, 상이한 버젼의 인간화된 FUN1 SMIP를 CD86 결합에 대해 시험하였다. 6개의 상이한 버젼의 인간화된 FUN1 SMIP로 일시적으로 형질감염시킨 HEK293 세포의 상층액을 CD86 결합에 대해 HuCD86-2A2 세포를 사용하여 시험하였다. 도 7은, FUN1-21(서열번호: 227)이 CD86에 이어 FUN1-22(서열번호: 233) 및 이어서 FUN1-11(서열번호: 225)에 대해 가장 우수한 결합 친화성을 가졌으며; 나머지 인간화된 FUN1 SMIP 단백질(FUN1-12, 서열번호: 229; FUN1-31, 서열번호: 231; FUN1-32, 서열번호: 235)은 검출가능한 결합을 나타내지 않았음을 나타내었다.
실시예 6
Xceptor 단백질내 다양한 결합 도메인 링커의 길이
CTLA4::IL10 분자에 대한 링커 안정성을 시험하였다. 모든 링커 변이체를 CHOK1SV 세포 속에서 안정하게 형질감염시키고 안정한 대량의 집단을 37℃에서 항온처리한 후 3일 째에 34℃로 이동시켰다. 단백질을 단백질 A 컬럼으로 정제한 후 제2 단계 SEC 컬럼에서 정제하였다. ELISA 검정을 수행하여 IL10R1-mIg 융합 단백질에 대한 IL10 결합을 측정하였다. 도 8의 결과는, xceptor(CTLA4::IL10)-65(서열번호: 9)가 링커의 불안정성으로 인하여 감소된 IL10 결합을 가졌지만, (CTLA4::IL10)-68(서열번호: 171), (CTLA4::IL10)-69(서열번호: 302), 및 (CTLA4::IL10)-75(서열번호: 173)은 이들 배양 조건에서 안정하였음을 나타내었다.
보다 짧은 링커 변이체는 또한 CTLA4::IL10 xceptor 단백질 속에서 IL10R1에 대한 결합에 대해 ELISA로 시험하였다. 보다 짧은 링커 변이체를 일시적으로 형질감염시키고 단백질은 단백질 A 컬럼 정제하였다. ELISA 분석을 수행하여 IL10R1-mIg 융합 단백질에 대한 IL10 결합을 측정하였다. 도 9의 결과는, 보다 짧은 링커 변이체(CTLA4::IL10)-77(서열번호: 175), Q0033(CTLA4::IL10)-78(서열번호: 177), 및 (CTLA4::IL10)-79(서열번호: 179), 및 역 말단(back end) IL10 결합 친화성[예를 들면, (CTLA4::IL10)-68과 비교함; 서열번호: 171]을 시험하였음을 나타낸다.
실시예 7
Xceptor 단백질의 혈청 안정성 및 약력학
(CTLA4::IL10)-75(서열번호: 173)의 혈청 안정성을 시험하였다. 당해 시험에서, 서열번호: 173의 정제된 단백질을 마우스 혈청 속에서 37℃에서 24시간, 72시간 및 F/T(동결/해동) 및 스파이크(spike) 동안 검정 시기(T0)에 처리하였다. 모든 안정성 시료를 CD80(CD80 발현 1F6 CHO 세포 사용)에 대한 이들의 결합, 및 CD80에 대한 동시 결합 및 xceptor 상에서 IL10에 결합하는 항-IL10 항체 결합을 시험하였다. 그 결과는, 서열번호: 173이 매우 안정하며 마우스 혈청중에서 시험 농도(약 0.01nM 내지 약 10nM)에서 항온처리한 후 항-IL10 결합을 유지함을 나타내었다.
(CTLA4::IL10)-68 (서열번호: 171) 및 (CTLA4::IL10)-75 (서열번호: 173)에 대한 약력학적(PK) 연구를 암컷 Balb/c 마우스 속에서 3마리 마우스/싯점을 사용하여 수행하였다. 마우스에 200 ㎍/마우스를 정맥내 주사하였다. 마우스 혈청을 처리한 지 15분, 2시간, 6시간, 24시간, 48시간, 96시간, 7일 및 14일 후에 수집하였다. 시료를 CD80 결합(CTLA4 검정) 및 CD80 및 항-IL10 항체(IL10 검정)에 대한 동시 결합에 대해 시험하였다. 그 결과를 하기 표 4에 요약한다.
PK 연구 요약
아바타셉트, (CTLA4::IL10)-68 및 (CTLA4::IL10)-75에 대한 PK 평가치 아바타셉트 평가치 (CTLA4::IL10)-68 PK 매개변수 평가치 (CTLA4::IL10)-75 PK 매개변수 평가치
매개변수 단위 CTLA4
검정		 CTLA4
검정		 IL-10
검정		 CTLA4
검정		 IL-10
검정
HL_람다_z hr 45.49 32.62 29.36 34.59 31.48
Vz_obs mL/kg 117.30 84.571 158.57 206.48 285.30
Cl_obs mL/hr/kg 1.79 1.797 3.74 4.14 6.28
실시예 8
CD80, CD86 및 IL10R1에 대한 Xceptor 결합
CD80 및 IL10R1 결합을 ELISA로 시험하고/하거나 CD86 및 IL10R1 결합을 CD86-발현 CHO 세포 및 IL10R1-Ig 또는 항-IL10을 사용하여 시험하였다. 마우스 CD80 및 CD86에 대한 결합을 ELISA로 바이오틴-표지된 항체를 사용하여 시험하였다. 시험한 분자는 실질적으로 실시예 3 및 5에 기술된 바와 같은, 대조군 CTLA4-Ig(서열번호: 11) 융합 단백질, 및 다음 시험 xceptor 분자:(CTLA4::IL10)-65(서열번호: 9); (CTLA4::IL10)-68(서열번호: 171); (CTLA4::IL10)-69(서열번호: 302), (CTLA4::PDL2)-65(서열번호: 336)을 포함하였다.
도 10 및 11에 나타낸 바와 같이, (CTLA4::IL10)-65, (CTLA4::IL10)-68, 및 (CTLA4::IL10)-69 xceptor 분자 모두는 CD80에 ELISA에 의해 결합하였고 세포상에서 CD86에 결합하였다. 또한, 도 12에 나타낸 결과는, CTLA4::IL10 xceptor 분자는 huIL10R1과 상호작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, CTLA4::IL10 xceptor는 ELISA에 의해 CD80 및 IL10R1에 대해 동시에 BD1(아미노-말단 결합 도메인) 및 BD2(카복시-말단 결합 도메인) 둘 다를 동시에 관여할 수 있다. 또한, 도 14 및 15는, 인간 분자에 대해 특이적인, (CTLA4::IL10)-65, (CTLA4::IL10)-68, 및 (CTLA4::IL10)-69 xceptor 분자가 마우스 CD80 및 마우스 CD86 둘 다와 교차반응할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9
BIAcoreTM에 의한 CD80에 대한 Xceptor 결합
CD80 결합 활성은, 실질적으로 본원에 기술된 바와 같이, 아바타셉트[Orencia® 제조원: 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb], 벨라타셉트(서열번호: 217)와 유사한, L104E A29Y 돌연변이를 함유하는 CTLA4-Fc 융합체, 각각 CTLA4 엑토도메인 및 IL10 도메인: (CTLA4::IL10)-65(서열번호: 9), (CTLA4::IL10)-68(서열번호: 171), 및 (CTLA4::IL10)-75(서열번호: 173)을 갖는 3개의 CTLA4::IL10 xceptor 링커 변이체; L104E A29Y 돌연변이 및 IL10 도메인(서열번호: 219)를 갖는 CTLA4 엑토도메인을 포함하는 xceptor, 및 CTLA4 엑토도메인 및 PD-L1 도메인(서열번호: 13)을 함유하는 xceptor에 대해 시험하였다. BIAcore에 의한 CD80/86에 대한 CTLA4-Fc의 결합의 시험은 이미 기술되어 있다[참조; Greene et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:26762-26771; van der Merwe et al. (1997) J. Exp. Med. 185:393-403; Collins et al. (2002) Immunity 17:201-210]. CTLA4에 의한 CD80의 결합은 중간의 친화성(Kd = ~200 nM)이며, 신속한 온 비율(fast on rate)(4-8 x 105 M-1s-1) 및 중간 오프 비율(moderate off rate)(0.090 s-1)을 특징으로 한다. CD80에 대한 이량체성 CTLA4-Fc의 결합은 이상(biphasic)이며, 2개의 오프 비율(0.004, 0.086 s-1)을 지니는 것으로 보고되었다. CTLA4-Fc 상에서 L104E A29Y 돌연변이는, 주로 초기 오프-비율(0.00108 대 0.00221 s-1로 보고됨)을 감소시킴으로써, CD80에 대해 야생형 CTLA4-Fc보다 2배 친화성을 증가시키는 것으로 보고되었다 (Larsen et al (2005)Am. J. Transplant. 5:443-453).
표면 플라스몬 공명(SPR) 측정은 BIAcoreTM T100 SPR[제조원: 파마시아 바이오테크 에이비(Pharmacia Biotech AB), 업살라 소재] 상에서 러닝 완충액으로서 HBS-EP+(제조원: 지이 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. CD80-mIgG(10 mM 아세트산나트륨중 25㎍/mL, pH 4.0; 제조원: 안셀, 인코포레이티드)를 CM5 칩 상에 표준 아민 커플링 화학[Biacore Amine Coupling Kit, 제조원: 지이 헬쓰케어]을 사용하여, 317, 973, 및 1678 Ru(공명 단위)의 최종 고정화 수준으로 직접 고정시켰다. CTLA4-함유 작제물을 150초 동안 10μl/분의 유동 속도로, 5 nM 내지 1μM의 일련의 농도에서 주사하였다. 해리도를 600초 동안 모니터링하고, 표면을 50 mM 시트르산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 4.0으로 60초 동안 주입시킴으로써 재생시켰다. 표면과의 결합 상호작용은 적어도 75 재생 주기를 통해 안정하였다. 데이타를 T100 소프트웨어(버젼 2.0.1, 제조원: 지이 헬쓰케어)용 비아이밸류에이션(BiaEvaluation)을 사용하여 분석하였다.
고정화된 CD80에 대한 CTLA4 작제물의 결합 역학은 1:1 랑뮈르 결합 모델(Langmuir binding model)에 고정될 수 없었지만, 2가 분석물 결합 모델에 대해 고 정확도로 고정될 수 있었다. 주사 기간을 증가시킴으로써 해리 상을 증가시키는 것은 계산된 역학적 매개변수를 변경시키지 않았다. 평형 해리 상수(KD)는 항정 상태(steady-state) 평형 모델에 대한 포화도에서 관측된 반응을 맞춤으로써 각각의 작제물에 대해 고 정확도로 계산할 수 있다. 모든 CD80 결합 분자에 대한 결과는 하기 표 5에 요약한다.
고정화된 단백질 분석물 제1 부위 ka
(M-1s-1)		 제1 부위 kd (s-1) 제2 부위
ka (s-1)		 제2 부위 kd
(s-1)		 KD (nM)
CD80 아바타셉트 5.5 + 0.02 x 105 0.006 0.00019 9.4 + 0.08 x 10-4 130 + 10
CD80 서열번호: 9 1.9 + 0.01 x 105 0.008 0.0045 + 0.0001 0.015 + 0.0003 233 + 27
CD80 서열번호: 13 0.36 + 0.002 x 105 7.4 + 0.047 x 10-4 0.0057 0.064 176 + 29
CD80 서열번호: 171 9.77 + 5.83 x 105 0.0145 0.0190 0.0434 37.5 + 9.5
CD80 서열번호: 173 12.1 + 6.81 x 105 0.0124 0.0207 0.0431 28.0 + 6.5
CD80 서열번호: 217 1.55 + 0.203 x 105 0.00373 0.00102 0.00332 13.3 + 6.2
CD80 서열번호: 219 0.908 + 0.307 x 105 0.00235 0.00406 0.00706 19.1 + 5.3
Xceptor에 대한 평형 친화성을 아바타셉트 및, CTLA4-Fc(200 nM; 참조: Greene et al. 1996, Ibid)에 대해 보고된 친화성에 대해 비슷한지를 측정하였다. CTLA4::PDL1 xceptor에 대한 결합 역학은, 비록 온/오프 비율 보상이 유사한 친화성을 제공한다고 해도, 아바타셉트 또는 CTLA4::IL10 xceptor에 대한 것들과는 상이하였다. 이는, PD-L1이 CD80과 CTLA4(2.5μM의 KD)보다 더 약한 친화성으로 결합한다는 사실에 기인할 수 있다. 앞서의 연구와 유사하게, L104E A29Y 돌연변이를 함유하는 CTLA4 변이체(서열번호: 217 및 219)는 CD80에 대해, 초기 오프 비율에 있어서 대략 2배의 증가(아바타셉트에 대해 0.006 s-1과 비교하여 서열번호: 217에 대해 0.00373 s-1)로 CD80에 대해 보다 높은 친화성을 가졌다.
실시예 10
BIAcoreTM에 의한 CD86에 대한 XCEPTOR 결합
CD86 결합 활성을 아바타셉트, 벨라타셉트(서열번호: 217)과 유사한, L104E A29Y 돌연변이를 함유하는 CTLA4-Fc 융합체, CTLA4 엑토도메인 및 IL10 도메인(서열번호: 9)을 함유하는 xceptor, L104E A29Y 돌연변이 및 IL10 도메인(서열번호: 219)을 지닌 CTLA4 엑토도메인을 함유하는 xceptor, 및 3D1 및 FUN1 항-CD86 항체로부터의 항체 가변 도메인을 함유하는 상이한 작제물(SMIP, PIMS, 및 xceptor)에 대해 실질적으로 본원에 기술된 바와 같이 시험하였다. CTLA4에 의한 CD86의 결합은 낮은 친화성(Kd = ~2.2 μM)이며, 신속한 온 비율(2-13x105 M-1s-1) 및 중간 오프 비율(0.42 s-1)을 특징으로 한다. CTLA4-Fc 상의 L104E A29Y 돌연변이는 주로 초기 오프-비율(0.00206 대 0.00816 s-1로 보고됨)을 감소시킴으로써 야생형 CTLA4-Fc보다 CD86에 대한 친화성을 4배 증가시키는 것으로 보고되어 왔다[참조: Larsen et al (2005) Am. J. Transplant. 5:443-453]. 명백하게, 3D1 또는 FUN1 항체에 대한 역학적 또는 평형 친화성 데이타는 앞서 보고되지 않았으므로, 이의 상대적인 친화성을 측정하였다.
보다 낮은-친화성 CD86 결합 도메인은 CTLA4 엑토도메인을 기초로 하였다. SPR 측정은 BIAcoreTM T100 SPR(제조원: 파마시아 바이오테크 에이비, 업살라 소재) 상에서 러닝 완충액으로서 HBS-EP+(제조원: 지이 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. CD86-mIgG(10 mM 아세트산나트륨 중 25 ㎍/mL, , pH 4.0, 제조원: 안셀, 인코포레이티드)을 CM5 칩상에 표준 아민 커플링 화학(Biacore Amine Coupling Kit, 제조원: 지이 헬쓰케어)을 사용하여 37, 373, 및 903 Ru의 최종 고정화 수준으로 직접 고정화시켰다. CTLA4-함유 작제물을 150초 동안 10μl/분의 유속에서 4 nM 내지 10 μM의 일련의 농도로 주사하였다. 해리를 600초 동안 모니터링하고, 표면을 50 mM 시트르산나트륨, 500 mM 염화나트륨, pH 5.0을 60초동안(야생형 CTLA4) 또는 10 mM 글리신, pH 1.7(L104E A29Y CTLA4)을 주사함으로써 재생시켰다. 표면과의 결합 상호작용, 및 고정화 수준은 적어도 100회의 재생 주기 전체에서 안정하였다. 데이타는 T100 소프트웨어(버젼 2.0.1, 제조원: 지이 헬쓰케어)용 BiaEvaluation를 사용하여 분석하였다. CD86에 대한 CTLA4의 낮은 친화성 및 고정화된 CD86에 대한 아바타셉트의 매우 신속한 온 및 오프 비율(문헌 값은 BIAcoreTM T100 장치에 대한 검측 한계에서 Kd의 경우 0.2-1.3 x 106 M-1s-1 및 kd의 경우 0.42 s-1이다)은 측정할 수 없었다. 고정화된 CD86에 대한 L104E A29Y CTLA4 도메인(서열번호: 217; 서열번호: 219)을 갖는 작제물의 결합 역학은, 그러나, 2가 분석물 모델에 대해 관측된 반응을 고정시킴으로써 충분한 정확도로 측정될 수 있었다. 평형 해리 상수(KD)는 항정-상태 평형 모델에 대한 포화도에서 관측된 반응을 고정시킴으로써 모든 작제물에 대해 고 정확도로 계산할 수 있었다. 결과는 하기 표 6에 나타낸다.
고-친화성 CD86 결합 도메인은 3D1 및 FUN1 항체 가변 도메인을 기초로 하였다. SPR 측정은 다음을 제외하고는 위에서 나열한 바와 같이 측정하였다: HBS-P+(제조원: 지이 헬쓰케어)를 러닝 완충액으로 사용하였고; 해리는 1200초 동안 모니터링하였으며; 표면은 10 mM 글리신, pH 1.7을 60초 동안 주사함으로써 재생시켰다. 고정화된 CD86에 대한 결합 역학은 모든 경우에서 측정될 수 있었다. 그러나, 평형 해리 상수(KD)는 항정-상태 평형 모델에 대한 포화도에서 관측된 반응을 고정시킴으로써 각각의 작제물에 대해 고 정확도로 계산할 수 있었다. 그 결과는 하기 표 6에 나타낸다.
고정화된 단백질 분석물 제1 부위 ka
(M-1s-1)		 제1 부위 kd (s-1) 제2 부위
ka (s-1)		 제2 부위 kd (s-1) KD (nM)
CD86 아바타셉트 -- -- -- -- 3200 + 1600
CD86 서열번호: 217 0.847 x 105 0.01016 0.0298 0.0344 772 + 300
CD86 서열번호: 219 0.451 x 105 0.00910 + 0.0001 0.011 0.0221 670 + 180
CD86 3D1 SMIP 3.23 x 105 4.40 + 0.05 x 10-5 0.0055 0.0276 11.7 + 1.2
CD86 서열번호: 189 9.74 + 0.066 x 105 7.06 + 0.04 x 10-5 0.0094 0.0462 26.5 + 2.9
CD86 서열번호: 328 1.12 x 105 2.37 + 0.13 x 10-5 0.00077 0.00377 28.0 + 1.9
CD86 서열번호: 185 6.17 + 0.12 x 105 8.30 + 0.12 x 10-5 0.0124 0.102 35.7 + 2.5
CD86 FUN1 mAb 1.29 + 0.69 x 105 2.28 + 0 x 10-5 0.00278 0.0154 36.0 + 5.5
CD86 서열번호: 225 0.139 + 0.556 x 105 35.0 x 10-5 7.5 x 10-5 1.25 + 0.25 x 10-6 119 + 40
CD86 서열번호: 227 1.86 + 0.951 x 105 13.9 x 10-5 0.00578 0.0127 26.9 + 5.4
CD86 서열번호: 402 0.5 x 105 9.1 x 10-5 0.00113 0.00837 70.9 + 5.9
CD86 muIL10-Ig 0.941 x 105 18 x 10-5 0.0203 0.0722 50.6 + 7
CD86 서열번호: 254 1.58 x 105 12.8 x 10-5 0.0064 0.0387 98.6 + 10
CD86 서열번호: 258 0.407 x 105 43.3 + 1.2 x 10-5 0.0198 0.0579 88.5 + 19
CD86 서열번호: 276 0.126 x 105 34.4 x 10-5 0.011 0.0111 178 + 18
아바타셉트(3.2 mM)에 대한 평형 친화성은 CTLA4-Fc에 대해 보고된 친화성(2.2 μM; 참조: Greene et al. 1996, Ibid)과 유사하였다. 앞서의 연구와 유사하게, L104E A29Y 돌연변이(서열번호: 217; 서열번호: 219)를 함유하는 CTLA4 변이체는 CD86(670 - 772 nM)에 대해 4 내지 5배 더 높은 친화성을 가졌다. N-말단(3D1 SMIP, 서열번호: 317; 3D1::IL10, 서열번호: 189) 상에 3D1 쥐 일본쇄 항체 단편(scFvs)을 함유하는 작제물은 C-말단(3D1 PIMS, 서열번호: 319; IL10::3D1, 서열번호: 185) 상에 3D1 scFv를 갖는 상응하는 작제물보다 더 높은 친화성(11.7, 26.5 nM)을 가졌으며; 결합 역학의 시험시, 비록 모든 경우에서, 친화성이 아바타셉트보다 CD86에 대해 적어도 100배 더 높았다 하더라도, 이는 보다 높은 초기 온-비율 및 보다 낮은 초기-오프 비율 둘 다로 부터 기인하는 것으로 여겨졌다. FUN1 항체의 경우, 모 쥐 모노클로날 항체를 2개의 인간화된 일본쇄 FUN1 항체 단편(서열번호: 225 및 227)을 함유하는 SMIP 단백질과 함께 시험하였으며, 이들 2개 단편중 후자(서열번호: 227)는 유사한 결합 역학을 나타내었고, 모 FUN1 mAb(각각 26.9, 36 nM)와 같이 CD86에 대한 전체적인 친화성은 다시 아바타셉트의 것보다 현저히 더 높았다. 카복시-말단(IL10::FUN1-21, 서열번호: 254; (IL10 I87A:: FUN1-21)-75, 서열번호: 258; (모노IL10-A2 힌지:: FUN1-21)-75, (서열번호: 276); FUN1-21 PIMS, 서열번호: 402)에서 사람화된 FUN1 항체 분획을 함유하는 xceptor 또는 PIMS 분자는 아미노 말단(FUN1::IL10, 서열번호: 187) 또는, SMIP 단백질(서열번호: 227) 상에서 동일한 FUN1-21 결합 서열을 함유하는 xceptor보다 더 낮은 친화성을 가졌다.
실시예 11
BIAcoreTM에 의한 쥐 CD86에 대한 Xceptor 결합
쥐 CD86 결합 활성을 아바타셉트, 발라타셉트(서열번호: 217)와 유사한, L104E A29Y 돌연변이를 함유하는 CTLA4-Fc 융합체, 상이한 BD2 링커를 함유하지만 동일한 CTLA4 및 IL10 도메인(서열번호: 171 및 173)을 함유하는 2개의 xceptor, L104E A29Y 돌연변이 및 IL10 도메인(서열번호: 219)을 함유하는 CTLA4 엑토도메인을 함유하는 xceptor, 인간 Fc 도메인(서열번호: 404)에 대한 쥐 CTLA4 융합체, 및 GL1 항체 단편 및 인간 IL10 도메인 (GL1::IL10, 서열번호: 252; 및 IL10::GL1, 서열번호: 256)을 함유하는 2개의 xceptor를 포함하는, 랫트 GL1 항-쥐 CD86 항체로부터의 항체 가변 도메인을 함유하는 상이한 작제물에 대해 실질적으로 하기 기술된 바와 같이 시험하였다. 인간 CTLA4는 쥐 CD86에 대해 교차-반응성인 것으로 알려져 있으나, 본 발명자들의 최대 지식으로는, 역학적 또는 친화성 측정법은 선행기술에 기술되어 있지 않다. 유사하게, 랫트 GL1 항체는 쥐 CD86에 대해 특이적인 것으로 기술되어 왔지만, 역학적 또는 친화성 측정법은 보고되어 있지 않다.
SPR 측정을 BIAcoreTM T100 SPR(제조원: 파마시아 바이오테크 에이비, 업살라 소재) 상에서 HBS-EP+(제조원: 지이 헬쓰케어)를 러닝 완충액으로 사용하여 수행하였다. 쥐 CD86-mIgG(10 mM 아세트산나트륨중 25㎍/mL, pH 4.0, 제조원: 알 앤드 디 시스템스, 인코포레이티드)를 CM5 칩상에 표준 아민 커플링 화학(Biacore Amine Coupling Kit, 제조원: 지이 헬쓰케어)을 사용하여 150, 493, 및 746 Ru의 최종 고정화 수준으로 직접 고정화시켰다. CTLA4-함유 작제물을 150초 동안 10μl/분의 유동 속도에서, 4 nM 내지 8μM의 일련의 농도에서 주사하였다. 해리를 600초(CTLA4 작제물) 또는 1200초(GL1 작제물) 동안 모니터링하고, 표면을 10 mM 글리신, pH 1.7을 60초 동안 주사하여 재생시켰다. 표면과의 결합 상호작용, 및 고정화 수준은 적어도 100회의 재생 주기 전체에서 안정화하였다. 데이타를 T100 소프트웨어(버젼 2.0.1, 제조원: 지이 헬쓰케어)용 BiaEvaluation를 사용하여 분석하였다. 고정화된 쥐 CD86에 대한 결합 역학은 모든 작제물에 대해 측정할 수 있었으며, 2가 분석물 모델에 대해 고 정확도로 고정되었다(표 7). 평형 해리 상수(KD)는 또한 항정-상태 평형 모델에 대하여 포화시 관측된 반응을 맞춤시킴으로써 각각의 작제물에 대해 고 정확도로 계산할 수 있었다. CTLA4 변이체(서열번호: 171, 173, 217, 219, 및 404)의 경우, 3개의 상이한 고정화 밀도에서 모든 3개의 유동 세포에 걸친 동시 평형 고정은 어떠한 하나의 유동 세포(소위 "다중 Rmax' 맞춤)을 맞추는 것보다 더 정확한 결과를 제공하였으므로, 이들 친화성을 나열한다. 그 결과는 하기 표 7에 나타낸다.
고정화된 단백질 분석물 제1 부위 ka
(M-1s-1)		 제1 부위 kd (s-1) 제2 부위
ka (s-1)		 제2 부위 kd (s-1) KD (nM)
muCD86 서열번호: 171 0.104 x 105 0.0241 0.0398 0.0627 1540 + 210
muCD86 서열번호: 173 0.132 x 105 0.0228 0.0405 0.0625 1810 + 230
muCD86 서열번호: 217 0.278 x 105 0.0787 0.0728 + 0.0023 0.168 920 + 88
muCD86 서열번호: 219 0.321 x 105 0.0418 0.00026 0.00193 870 + 160
muCD86 muCTLA4-Ig 0.278 x 105 0.0386 0.000659 0.00311 2250 + 190
muCD86 GL1 mAb 0.789 + 0.346 x 105 10.6 x 10-5 0.00879 0.00635 37.7 + 4.4
muCD86 GL1 SMIP 1.18 + 0.427 x 105 6.2 x 10-5 0.00964 + 0.00031 0.0185 26.2 + 5.4
muCD86 GL1 PIMS 1.77 x 105 1.25 x 10-4 0.0431 0.0977 78.3 + 20
muCD86 서열번호: 252 2.19 x 105 1.9 x 10-4 0.00943 0.0182 86.4 + 8.3
muCD86 서열번호: 256 6.73 x 104 4.4 x 10-5 0.0271 0.088 95.1 + 13
인간 CTLA4 및 인간 IL10 도메인(서열번호: 171 및 173)을 함유하는 xceptor는 쥐 CD86 (1.54, 1.81μM)에 대해 인간 CD86(2.2μM; 참조: Greene et al. 1996)에 대한 인간 CTLA4-Fc에 대해 보고된 친화성 보다 약간 더 높은 친화성을 갖는다. L104E A29Y 돌연변이(서열번호: 217 및 219)를 함유하는 인간 CTLA4 변이체는 쥐 CD86(870-920 nM)보다 단지 2배 더 높은 친화성을 가졌으며; 이는 쥐 CD86에 대해 유리한 보다 높은 초기 온-비율 및 유해하게 보다 높은 초기 오프-비율의 조합으로부터 기인하는 것으로 여겨진다. 쥐 CTLA4는 인간 CTLA4보다 쥐 CD86에 대해 유사하거나 약간 더 낮은 전체 친화성을 갖는 것으로 여겨진다. GL1 항체의 경우, 모 랫트 모노클로날 항체를 일본쇄 GL1 항체 단편(GL1 SMIP, 서열번호: 239)을 함유하는 SMIP와 함께 시험하였으며; 둘 다 쥐 CD86에 대해 유사한 결합 역학 및 전체적인 친화성(각각 37.7, 26.2 nM)을 나타내었으며, 이는 인간 또는 쥐 CTLA4-함유 작제물보다 현저히 보다 더(~50 배) 높았다. IL-10 및 GL1 항체 단편(서열번호: 252 및 256)을 함유하는 xceptor는, 비록 각각의 경우 감소된 초기 온-비율 또는 오프-비율로부터 발생하는 것으로 여겨진다고 해도, 모 항체 또는 SMIP와 비교하여 쥐 CD86에 대해 3배 더 낮은 친화성을 나타내었다.
실시예 12
BIAcoreTM에 의한 PD1에 대한 Xceptor 결합
PD1 결합 활성을 PDL1-Fc(서열번호: 268) 및 PDL2-Fc(서열번호: 270), 및 또한 CTLA4 엑토도메인 및 PDL1(서열번호: 13) 또는 PDL2(서열번호: 336) 도메인을 함유하는 xceptor에 대해 실질적으로 다음과 같이 시험하였다. PDL2에 의한 PD1의 결합은 일반적으로 PDL1에 의한 PD1의 결합보다 더 높은 친화성이 있는 것으로 보고되어 왔으며; 선행 역학적 분석[참조: Youngnak et al, (2003) Biochem. Biophys. Res. Comm. 307, 672]은 중간의 친화성(PDL1의 경우 112 nM, PDL2의 경우 37 nM)이 있는 것으로 제안한 반면, 대체 포맷으로 수행한 평형 분석[참조: Butte et al, (2007) Immunity 27, 111]은 보다 약한 친화성(PDL1의 경우 770 nM, PDL2의 경우 590 nM)을 제안하였다.
SPR 측정은 BIAcoreTM T100 SPR(제조원: 파마시아 바이오테크 에이비, 업살라 소재) 상에서 러닝 완충액으로서 HBS-P+(제조원: 지이 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. C-말단 AviTagTM(서열번호: 406)에 융합된 PD1 엑토도메인을 지닌 작제물을 초기에 10 mM 트리스, pH 8.0 중 BirA 효소[제조원: 아비디티, 인코포레이티드(Avidity, Inc.),콜로라도 아우라 소재]를 사용하여 바이오티닐화하고 완충액을 PBS로 교환하였다. 뉴트라비딘[10 mM 아세트산나트륨 중 10㎍/mL, pH 4.0, 제조원: 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 일리노이 록포드 소재]을 CM5 칩상에 표준 아민 커플링 화학(Biacore Amine Coupling Kit, 제조원: 지이 헬쓰케어)을 191, 771, 및 1522 Ru의 최종 고정화 수준에서 사용하여 직접 고정화시키고, 바이오티닐화된 PD1을 각각 171, 597, 및 1244 Ru의 수준에서 포획하는데 사용하였다. PDL1/2-함유 작제물을 120초 동안 30μl/분의 유동 속도에서 6 nM 내지 2μM의 일련의 농도에서 주사하였다. 해리를 1200초 동안 모니터링하고, 표면을 50 mM NaOH, 1M NaCl을 30초 동안 주사함으로써 재생시켰다. 표면과의 결합 상호작용, 및 고정화 수준은 적어도 50회 재생 주기 전체에서 안정하였다.
데이타를 T100 소프트웨어(버젼 2.0.1, 제조원: 지이 헬쓰케어)용 BiaEvaluation을 사용하여 분석하였다. 고정화된 PD1에 대한 결합 역학은 모든 작제물에 대해 측정할 수 있었으며 2가 분석물 모델(서열번호: 268 및 270) 또는 1:1 결합 모델(서열번호: 13 및 336)에 대해 고 정확도로 맞출 수 있었다(표 8). 평형 해리 상수(KD)는 또한 일정-상태 평형 모델에 대해 포화시 관측된 반응을 맞춤으로써 각각의 작제물에 대해 고 정확도로 계산할 수 있었다. 결과는 하기 표 8에 나타낸다.
고정화된 단백질 분석물 제1 부위 ka
(M-1s-1)		 제1 부위
kd (s-1)		 제2 부위
ka (s-1)		 제2 부위 kd (s-1) KD (nM)
PD1 서열번호: 13 0.699 x 105 0.165 n/a n/a 2360**
PD1 서열번호: 336 1.16 x 105 0.0395 n/a n/a 340**
PD1 서열번호: 268 0.96 + 0.54 x 105 0.0544 3.18 x 10-6 0.000191 246 + 27
PD1 PDL1-Fc* 1.07 x 105 0.010 n/a n/a 112**
PD1 서열번호: 270 1.65 x 105 0.00724 0.0352 0.395 42 + 4.4
PD1 PDL2-Fc* 1.22 x 105 0.0032 n/a n/a 26**
* 문헌 값[참조: Youngnak et al, (2003) Bi℃hem. Biophys. Res. Comm. 307, 672]** 제1 부위 ka 및 kd로부터 계산된 KD
PDL1-Fc(서열번호: 268) 및 PDL2-Fc(서열번호: 270)는 문헌에 보고된 것들에 대해 유사한 결합 역학 및 전체적인 친화성을 나타내었다. 카복시-말단(서열번호: 13 및 336)에서 융합된 PDL1 또는 PDL2 도메인을 갖는 CTLA4를 함유하는 Xceptor는 아미노-말단 PDL1/PDL2 융합체(246, 42 nM)보다 PD1에 대해 현저히 보다 약한(~10배) 친화성(각각 2.36, 0.34μM)을 가졌으며; 이는 주로 초기 오프-율(0.165, 0.0395 대 0.0544, 0.00724)에서의 현저한 증거로부터 발생하며, 이러한 사실은, PDL1/2:PD1 복합체가, 결합 도메인이 BD2(카복시-말단) 위치에 존재하는 경우 탈안정화될 수 있음을 나타낸다.
실시예 13
사람 T 세포 반응을 차단하는 Xceptor 융합 단백질
본 실시예는, 본 기재내용의 xceptor 융합 단백질이 인간 T 세포 반응을 차단할 수 있음을 증명한다. 혼합된 림프구 반응(MLR)을 사용하여 xceptor 융합 단백질에 의한 차단을 시험하였다. 요약하면, 2명의 공여자로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 표준 방법을 사용하여 분리하고 분리된 채로 유지시켰다. 앞서의 연구를 기초로 하여, 하나의 공여자로부터의 PBMC를 "반응인자" 집단으로 지정하고 제2 공여자로부터의 PBMC를 "자극인자" 집단으로 지정하였다. 공여자 PBMC 둘 다를 CFSE로 표준 방법을 사용하여 표지하였다. 세포 분열을 방지하기 위해, 자극인자 PBMC를 미토마이신-C(MMC)로 처리하였다. MMC[제조원: 시그마(Sigma) 제품 번호: M4287-2mg]를 멸균 증류수[제조원: 기브코(Gibco) 제품 번호: 15230) 속에 0.5mg/ml의 농도로 재구성시켰다. 자극인자 PBMC를 완전 배양 배지(CM)(10% 사람 B 혈청 RPM1-1640, 100 U/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, NEAA, Na-피루베이트, CM 0.2μm 여과됨) 속에서 1x106/ml의 농도로 현탁시키고 MMC를 25㎍/ml의 최종 농도로 가하였다. 이어서, 자극인자 PBMC/MMC 혼합물을 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 항온처리한 후 세포를 CM으로 3회 세척하였다. 반응인자 및 자극인자 세포를 CM 중 4x106/ml의 농도에서 현탁시키고 96 웰-평편 바닥 조직 배양 플레이트의 웰당 0.05ml의 각각의 세포 집단을 최종 2x105 세포/웰/공여자에 대해 가하였다. 도면에 나타낸 지정된 농도에서 모든 처리물을 세포와 동시에 프레이트에 가하였다(항체 및 융합 단백질에 대해 나타낸 농도는 몰 당량임에 주목한다). 이후에, MLR 조건(96 웰 플레이트 PBMC 처리 완료)을 37℃, 5% CO2에서 시험 과정 동안 항온처리하였다. MLR 시험물을 7 내지 8일 동안 수거하고 이때 세포를 CD5 [제조원: 이-바이오사이언스(e-Bioscience)] 및 CD25(제조원: 비디 바이오사이언스)에 대해 형광성으로 태그된 항체로 염색하고 유동 세포계산기[LSR II, 제조원: 벡톤 디킨슨(Becton Dickenson)]에서 수행하였다. 데이타를 FlowJo 유동 세포분석기 소프트웨어[제조원: 트리스타(TreeStar)]을 사용하여 분석하였다. 게이팅 전략(gating strategy)은 다음과 같다: FSC:SSC 림프구 게이트내에 있는 세포를 CD5 발현에 대해 분석한 후, 연속적으로 CD5+ 게이트내에 속한 세포를 CFSE 희석 및 CD25 상향-조절에 대해 분석하였다. CD5+, CFSE저 및 CD25고인 세포를 활성화된 T 세포로 고려하였다.
도 16, 17, 21, 및 22는, CD86 길항제와 이종 결합 도메인을 함유하는 많은 상이한 종류의 xceptor 융합 단백질을 반응인자/자극인자 MLR 상태에 대해 T 세포 반응을 차단할 수 있음을 나타낸다.
실시예 14
마우스 T 세포 반응을 차단하는 CD86 길항제 Xceptor
2마리의 상이한 마우스 균주, C57BL/6(또는 B6D2F1) 및 BALB/c로부터의 마우스 비장세포를 스칼펠/나일론 메쉬(Scalpel/nylon mesh) 및 RBC 분해 방법을 사용하여 분리하였다. 앞서의 연구를 기초로 하여, 마우스 균주 C57BI/6(또는 B6D2F1)으로부터의 비장세포를 "반응인자" 집단으로 지정하고, 마우스 균주 BALB/c로부터의 비장세포를 "자극인자" 집단으로 지정하였다. 마우스 균주 비장 세포 둘 다를 앞서 기술한 바와 같이 CFSE로 표지하였다. 세포 분열을 방지하기 위해, 자극인자 비장세포를 미토마이신-C(MMC)로 처리하였다. MMC(시그마 제품번호: M4287-2mg)를 멸균 증류수(기브코 제품번호 15230) 속에서 0.5　mg/ml의 농도로 재구성하였다. 자극인자 비장세포를 완전 배양 배지(CM)(10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, NEAA, Na-피루베이트, 및 0.05 mM 2-머캅토에탄올) 속에서 5x107/ml의 농도로 현탁시키고 MMC를 50㎍/ml의 최종 농도로 가하였다. 이어서, 자극인자 비장세포/MMC 혼합물을 37℃, 5% CO2 속에서 20분 동안 항온처리한 후, 세포를 CM으로 3회 세척하였다. 반응인자 및 자극인자 세포를 CM 속에서 8x106/ml의 농도로 현탁시키고 0.05ml의 각각의 세포 집단을 96　웰-평편 바닥 조직 배양 플레이트의 웰당 최종 4x105 세포/웰/균주의 농도로 가하였다. 도 18 내지 20에 나타낸 지정된 농도에서 모든 처리물을 세포와 동시에 플레이트에 가하였다(항체 및 융합 단백질에 대해 나타낸 농도는 몰 당량임을 주목한다). 이후에, MLR 상태(비장세포/처리 설정이 된 96 웰 플레이트)를 37℃, 5% CO2에서 시험 과정 동안 항온처리하였다. MLR 시험물을 4 내지 5일 동안 수거하고 이때 세포를 CD5(제조원: 비디 바이오사이언시즈) 및 CD25(제조원: 비디 바이오사이언시즈)에 대해 형광 태그된 항체로 염색하고 유동 세포분석기[LSR II, 제조원: 벡톤 디켄슨(Becton Dickenson)] 상에서 수행하였다. 데이타를 FlowJo 유동 세포분석기 소프트웨어(제조원: 트리스타)를 사용하여 분석하였다. 게이팅 방법은 다음과 같았다: FSC:SSC 림프구 게이트내에 포함되는 세포를 CD5 발현에 대해 분석한 후, 후속적으로 CD5+ 게이트내에 포함되는 세포를 CFSE 희석 및 CD25 상향-조절에 대해 분석하였다. CD5+, CFSE저 및 CD25고인 세포를 활성화된 T 세포로 고려하였다.
도 18 내지 20은, CD86 길항제를 이종 결합 도메인과 함께 함유하는 많은 상이한 종류의 xceptor 융합 단백질이 반응인자(B6D2F1)/자극인자(BALB/c) MLR 조건에 대한 마우스 T 세포 반응을 차단할 수 있음을 나타낸다.
실시예 15
IL10을 함유하는 Xceptor 분자의 면역자극 활성
각종 xceptor 융합 단백질에서 IL10의 면역자극 활성을 시험관내 세포 증식 검정에서 시험하였다. 특히, MC/9 마우스 비만 간 세포주를 다음과 같이 사용하였다: MC/9 세포주[아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) 수탁 번호 제CRL-8306호]을 DMEM 또는 RPMI와 10% FBS 및 5% 랫트 T-STIM(BD 제품번호 354115) 속에서 성장시켰다. MC/9 세포를 세척하고 랫트 T-STIM이 없는 배지 속에서 밤새(37℃, 5% CO2, 96 웰 평편 바닥 플레이트 속에서 1 x 105 세포/웰로, 100μl/웰) 두었다. 각종 농도의 IL10 단백질 및 xceptor 융합 단백질을 24시간 동안 항온처리하고 증식을 6시간 후 [3H]티미딘으로 평가하였다.
IL10의 I87 변이체는 야생형 IL10과 비교하여 거의 면역-자극성이 없는 것으로 공지되어 있다(참조: Ding et al., J. Exp. Med. 191:213, 2000). IL10은 일반적으로 다른 단량체의 카복시 말단 도메인에 결합하는 각각의 단량체 분자의 아미노 말단 도메인과 단독 이량체를 형성한다. IL10 I87 변이체(I87A 및 I87S)와, IL10의 2개의 소도메인을 추가로 분리하여 이들 소도메인이 분자내 이량체를 형성하도록 하는 짧은 링커(gggsgg; 서열번호: 379)를 갖는 IL10 분자를 면역자극 활성에 대해 xceptor 포맷에서 시험하였다.
도 23은, 마우스 IL10이 MC/9 세포 증식을 IL10의 87번 아미노산에서 단일 돌연변이를 함유하는, CTLA4::IL10-I87A (서열번호: 191) xceptor 보다 더욱 큰 정도로 MC/9 세포 증식을 향상시킬 수 있음을 나타낸다. 도 24는, 인간 IL10 및 (CTLA4::IL10)-75(서열번호: 173) 둘 다가 MC/9 세포 증식을 CTLA4::IL10-I87A(서열번호: 191) 또는 CTLA4::모노IL-10(서열번호: 181)보다 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 16
표적 특이적인 세포 유형에 대한 Xceptor 분자의 가공
본 실시예는 Xceptor 융합 단백질을 가공하여 특이적인 세포 유형을 표적함을 기술한다. 이는 BD1 및 BD2 친화성을 가공함으로써 달성한다. 4개의 Xceptor 분자를 CD86 및 huIL10R1에 대한 상이한 친화성으로 가공하였다. 표 9는 이들 4개 분자에 대한 상이한 친화성 비를 나타낸다. 예를 들면, CD86 결합 도메인(예를 들면, 3D1 또는 인간화된 FUN1) 및 huIL10R1에 대해 보다 낮은 친화성을 갖는 가공된 IL10 분자(I87A)의 사용을 통한 CD86에 대한 친화성을 개선시킴으로써, 이러한 배열을 사용하여 APC와 같은 목적한 특이적인 세포 유형을 표적화하기에 유리할 수 있다.
CD86 IL10R1 IL10R1/CD86
BD1 BD2 친화성(nM) 친화성 (nM) 친화성 비
CLTA4 IL10 2000* 0.1& 0.00005
CTLA4 IL10 I87A 2000* 10# 0.005
항-CD86 IL10 40* 0.1& 0.0025
항-CD86 IL10 I87A 40* 10# 0.25
* CD86에 대한 CTLA4, 3D1 및 인간화된 FUN1 결합의 내부 측정으로부터 대략적인 평형 친화성& 문헌[참조: Tan et al. (J. Biol. Chem. 268: 21053, 1993]을 기초로 한 대략적인 친화성
# 문헌[참조: Ding et al. (J. Exp. Med. 191: 213, 2000]을 기초로 한 대략적인 친화성
실시예 17
생체내 류마티스 관절염 동물 모델에서 Xceptor 활성
류마티스 관절염
본원에 기재된 xceptor 분자중 어느 것의 치료학적 효능은 류마티스 관절염(RA)의 2마리의 쥐 모델, 즉 콜라겐 유도된 관절염(CIA) 및 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제(G6PI) 모델 중 적어도 하나에서 시험한다. 이들 모델 각각은 RA에서 치료학적 약물의 특정 경우의 효능을 예측하는데 유용한 것으로 밝혀졌다[참조: Holmdahl (2000) Arthritis Res. 2:169; Holmdahl (2006) Immunol. Lett. 103:86; Holmdahl (2007) Methods Mol. Med. 136:185; McDevitt, H. (2000) Arthritis Res. 2:85; Kamradt and Schubert (2005) Arthritis Res. Ther. 7:20].
(a) CIA 모델
CIA 모델은 이의 병리학 및 면역학적 기초의 측면에서 관절염의 가장 잘 특징화된 마우스 모델이다. 또한, 이는 RA의 가장 광범위하게 사용되는 모델이며, 비록 환자에서 질병을 억제하는 약물의 능력을 예측하는데 완전하지 않다고 해도, RA에 대한 잠재적인 새로운 치료제를 조사하는 경우 다수에 의해 선택 모델인 것으로 고려된다[참조: Jirholt et al. (2001) Arthritis Res. 3:87; Van den Berg, W.B. (2002) Curr. Rheumatol. Rep. 4:232; Rosloniec (2003) Collagen-Induced Arthritis. In Current Protocols in Immunology, eds. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ].
CIA 모델에서, 관절염은 수컷 DBA/1 마우스를 완전 프루언드 항원보강제(Complete Freund's Adjuvant)(CFA) 중 콜라겐 II(CII)로 면역화시킴으로써 유도된다. 상세하게는, 마우스에게 -21일째에 CFA중 CII를 경피내/피하로 주사하고 0일 째에 불완전 프루언드 항원보강제(IFA)중 CII로 부스트(boost)한다. 마우스는 CII/IFA로 부스트한지 며칠내로 관절염의 임상 징후로 발전한다. CII/CFA로 면역화시킨 마우스의 소세트(0% 내지 10%)는 부스트 부재하에 0일째 또는 0일째 근처에서 관절염의 징후로 발전하며 이들은 시험에서 제외되었다. 일부 CIA 시험에서, 부스트를 제외시키고 그 대신에 마우스를 CII/CFA로 면역화(즉, 처음 처리일이 0일이다)한 후 21일째에 시작하여 Xceptor 또는 대조군으로 처리하였다.
마우스를 Xceptor, 비히클(PBS), 또는 음성 또는 양성 대조군으로 예방 및/또는 치료 섭생으로 처리하였다. 예방적 처리는 0일째에 시작하여 대조군(처리되지 않은) 마우스에서 질병의 피크 전체를 통해 지속한다. 치료학적 처리는, 마우스의 대부분이 관절염의 약한 징후를 나타낼 때 시작한다. 관절염의 CIA 및 G6PI-유도된 모델 둘 다에서 우수한 효능을 갖는 것으로 밝혀진 Enbrel®을 양성 대조군으로 사용한다. 매 시험에서 수집한 데이타는 관절염의 임상 점수 및 누적 발생 정도를 포함한다. CIA 모델에서 관절염의 임상 징후는 하기 표 10에 나타낸 바와 같이 0 내지 4의 점수를 사용하여 점수를 매긴다.
점수 관찰
0 명백한 팽윤 또는 발적이 없음
1 숫자 1 내지 3의 팽윤/발적
2 숫자 3 이상에서 발적 및/또는 팽윤, 발로 확장되는 약한 팽윤, 팽윤되거나 적색인 발목, 또는 앞발의 약한 팽윤/발적
3 약한 내지 중간의 발적이 있는 팽윤된 발
4 전체 발에서 극도의 발적 및 팽윤
(b) G6PI 모델
G6PI 모델에서, 관절염은 DBA/1 마우스를 항원보강제중 G6PI으로 면역화시켜 유도한다[참조: Kamradt and Schubert (2005) Arthritis Res. Ther. 7:20; Schubert et al., (2004) J. Immunol. 172:4503; Biokermann, R. et al. (2005) Arthritis Res. Ther. 7:R1316; Iwanami et al., (2008) Arthritis Rheum. 58:754; Matsumoto et al., (2008) Arthritis Res. Ther. 10:R66]. G6PI는 신체의 사실상 모든 세포에 존재하는 효소이며 면역화가 관절 특이적인 질병을 유도하는지의 이유는 알려져 있지 않다. CTLA4-Ig, TNF 길항제(예를 들면, Enbrel®) 및 항-IL6 수용체 모노클로날 항체와 같은 다수의 제제는 G6PI 모델에서 관절염의 발달을 억제하는 것으로 나타났다.
수컷 DBA/1 마우스를 완전 프루언드 항원보강제(CFA) 중 G6PI으로 면역화하여 관절염을 유도한다. 상세하게는, 마우스에게 0일째에 CFA중 G6PI를 경피내/피하에 주사하고 면역화하고 며칠내에 관절염의 임상 징후를 발달시킨다. 위에서 논의한 CIA 모델을 사용하는 것과 같이, 마우스를 xceptor, 비히클(PBS), 또는 음성 또는 양성 대조군으로 예방 및/또는 치료 섭생으로 처리한다. 예방적 처리는 0일 째에 시작하며 대조군 마우스에서 질병의 피크 전체를 통해 지속한다. 치료학적 처리는, 대부분의 마우스가 약한 관절염 징후를 나타내는 경우 시작한다. 관절염의 CIA 및 G6PI-유도된 모델 둘 다에서 우수한 효능을 갖는 것으로 나타난 Enbrel®을 양성 대조군으로 사용한다. 매 시험에서 수집한 데이타는 관절염의 임상 점수 및 누적 발생 정도를 포함한다. G6PI 모델에서 관절염의 임상 징후는 CIA 모델의 경우 사용한 것과 유사한 규모를 사용하여 점수를 매긴다.
본 발명은 본원에 개략적으로 나타낸 구체적인 양태와 관련지어 기술하였지만, 많은 변경, 개질 및 변화가 당해 분야의 숙련가에게 익숙할 것임은 명백하다. 따라서, 위에서 나타낸 본 기재내용의 양태들은 예시적인 것이며, 이들로써 제한하지 않는 것으로 의도된다. 다양한 변화가 다음의 특허청구범위에 정의된 바와 같은 본 기재내용의 취지 및 영역으로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 언급되고/되거나 출원 데이터 면에 나열된 특허, 특허출원 공개공보, 특허출원 및 비-특허 공보 모두는 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
<110> EMERGENT PRODUCT DEVELOPMENT SEATTLE, LLC <120> CD86 ANTAGONIST MULTI-TARGET BINDING PROTEINS <130> IPA110251-US-D2 <150> US61/102,288 <151> 2008-10-02 <150> US61/102,297 <151> 2008-10-02 <150> US61/102,307 <151> 2008-10-02 <150> US61/102,315 <151> 2008-10-02 <150> US61/102,319 <151> 2008-10-02 <150> US61/102,327 <151> 2008-10-02 <150> US61/102,331 <151> 2008-10-02 <150> US61/102,334 <151> 2008-10-02 <150> US61/102,336 <151> 2008-10-02 <160> 422 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile 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aaggactgag ggccatggac acgggactct acatctgcaa ggtggagctc 360 atgtacccac cgccatacta cctgggcata ggcaacggaa cccagattta tgtaattgat 420 ccagaaccgt gcccagattc tgacctcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc 480 ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggt gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 540 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 600 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 660 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 720 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggcgtacg cgtgcgcggt ctccaacaaa 780 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 840 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 900 tgcctggtca aaggcttcta tccaagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 960 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1020 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1080 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1140 cagaggcaca acaattcttc cctgaataca agaactcaga aagcacgtca ttctccgaat 1200 tctagcccag gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg 1260 cctaacatgc ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttcaaatg 1320 aaggatcagc tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac 1380 ctgggttgcc aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccccaa 1440 gctgagaacc aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag 1500 accctcaggc tgaggctacg gcgctgtcat cgatttcttc cctgtgaaaa caagagcaag 1560 gccgtggagc aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc 1620 atgagtgagt ttgacatctt catcaactac atagaagcct acatgacaat gaagatacga 1680 aactaatcta gagcggccgc caaaggaaaa gaagaaatac aattcatgaa ttcaaaaaat 1740 cagcaaagac taccctaatc aaaatagatc cagcactgaa gataaaaacc aaaaaagtga 1800 atactgcaga ccaatgtgct aatagatgta ctaggaataa aggacttcca ttcacttgca 1860 aggcttttgt ttttgataaa gcaagaaaac aatgcctctg gttccccttc aatagcatgt 1920 caagtggagt gaaaaaagaa tttggccatg aatttgacct ctatgaaaac aaagactaca 1980 ttagaaactg catcattggt aaaggacgca gctacaaggg aacagtatct atcactaaga 2040 gtggcatcaa atgtcagccc tggagttcca tgataccaca cgaacacagc tttttgcctt 2100 cgagctatcg gggtaaagac ctacaggaaa actactgtcg aaatcctcga ggggaagaag 2160 ggggaccctg gtgtttcaca agcaatccag aggtacgcta cgaagtctgt gacattcctc 2220 agtgttcaga agttgaatgc atgacctgca atggggagag ttatcgaggt ctcatggatc 2280 atacagaatc aggcaagatt tgtcagcgct gggatcatca gacaccacac cggcacaaat 2340 tcttgcctga aagatatccc gacaagggct ttgatgataa ttattgccgc aatcccgatg 2400 gccagccgag gccatggtgc tatactcttg accctcacac ccgctgggag tactgtgcaa 2460 ttaaaacatg cgctgacaat actatgaatg acactgatgt tcctttggaa acaactgaat 2520 gcatccaagg tcaaggagaa ggctacaggg gcactgtcaa taccatttgg aatggaattc 2580 catgtcagcg ttgggattct cagtatcctc acgagcatga catgactcct gaaaatttca 2640 agtgcaagga cctacgagaa aattactgcc gaaatccaga tgggtctgaa tcaccctggt 2700 gttttaccac tgatccaaac atccgagttg gctactgctc ccaaattcca aactgtgata 2760 tgtcacatgg acaagattgt tatcgtggga atggcaaaaa ttatatgggc aacttatccc 2820 aaacaagatc tggactaaca tgttcaatgt gggacaagaa catggaagac ttacatcgtc 2880 atatcttctg ggaaccagat gcaagtaagc tgaatgagaa ttactgccga aatccagatg 2940 atgatgctca tggaccctgg tgctacacgg gaaatccact cattccttgg gattattgcc 3000 ctatttctcg ttgtgaaggt gataccacac ctacaatagt caatttagac catcccgtaa 3060 tatcttgtgc caaaacgaaa caattgcgag ttgtaaatgg gattccaaca cgaacaaaca 3120 taggatggat ggttagtttg agatacagaa ataaacatat ctgcggagga tcattgataa 3180 aggagagttg ggttcttact gcacgacagt gtttcccttc tcgagacttg aaagattatg 3240 aagcttggct tggaattcat gatgtccacg gaagaggaga tgagaaatgc aaacaggttc 3300 tcaatgtttc ccagctggta tatggccctg aaggatcaga tctggtttta atgaagcttg 3360 ccaggcctgc tgtcctggat gattttgtta gtacgattga tttacctaat tatggatgca 3420 caattcctga aaagaccagt tgcagtgttt atggctgggg ctacactgga ttgatcaact 3480 atgatggcct attacgagtg gcacatctct atataatggg aaatgagaaa tgcagccagc 3540 atcatcgagg gaaggtgact ctgaatgagt ctgaaatatg tgctggggct gaaaagattg 3600 gatcaggacc atgtgagggg gattatggtg gcccacttgt ttgtgagcaa cataaaatga 3660 gaatggttct tggtgtcatt 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caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 660 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 720 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggcgtacg cgtgcgcggt ctccaacaaa 780 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 840 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 900 tgcctggtca aaggcttcta tccaagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 960 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1020 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1080 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1140 cagaggcaca acaattcttc cctgaataca agaactcaga aagcacgtca ttctccgaat 1200 tctttattca cagtgacagt ccctaaggaa ctgtacataa tagagcatgg cagcaatgtg 1260 accctggaat gcaactttga cactggaagt catgtgaacc ttggagcaat aacagccagt 1320 ttgcaaaagg tggaaaatga tacatcccca caccgtgaaa gagccacttt gctggaggag 1380 cagctgcccc tagggaaggc ctcgttccac atacctcaag tccaagtgag ggacgaagga 1440 cagtaccaat gcataatcat ctatggggtc 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aaggactgag ggccatggac acgggactct acatctgcaa ggtggagctc 360 atgtacccac cgccatacta cctgggcata ggcaacggaa cccagattta tgtaattgat 420 ccagaaccgt gcccagattc tgacctcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc 480 ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggt gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 540 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 600 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 660 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 720 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggcgtacg cgtgcgcggt ctccaacaaa 780 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 840 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 900 tgcctggtca aaggcttcta tccaagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 960 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1020 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1080 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1140 cagaggcaca acaattcttc cctgaataca agaactcaga aagcacgtca ttctccgaat 1200 tctcagcgcc ccaccggggg tcccgggtgc ggccctgggc gcctcctgct tgggacggga 1260 acggacgcgc gctgctgccg ggttcacacg acgcgctgct gccgcgatta cccgggcgag 1320 gagtgctgtt ccgagtggga ctgcatgtgt gtccagcctg aattccactg cggagaccct 1380 tgctgcacga cctgccggca ccacccttgt cccccaggcc agggggtaca gtcccagggg 1440 aaattcagtt ttggcttcca gtgtatcgac tgtgcctcgg ggaccttctc cgggggccac 1500 gaaggccact gcaaaccttg gacagactgc acccagttcg ggtttctcac tgtgttccct 1560 gggaacaaga cccacaacgc tgtgtgcgtc ccagggtccc ccccggcaga gccgcttggg 1620 taagcggccg c 1631 <210> 42 <211> 516 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein having a CTLA4 ectodomain and an GITR domain <400> 42 Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val 20 25 30 Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys 35 40 45 Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser 50 55 60 Ile Cys 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cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 780 ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 840 ggcttctatc caagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 900 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 960 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1020 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ctcattattc 1080 aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa agttacagcc cgaattctag cccaggccag 1140 ggcacccagt ctgagaacag ctgcacccac ttcccaggca acctgcctaa catgcttcga 1200 gatctccgag atgccttcag cagagtgaag actttctttc aaatgaagga tcagctggac 1260 aacttgttgt taaaggagtc cttgctggag gactttaagg gttacctggg ttgccaagcc 1320 ttgtctgaga tgatccagtt ttacctggag gaggtgatgc cccaagctga gaaccaagac 1380 ccagacatca aggcgcatgt gaactccctg ggggagaacc tgaagaccct caggctgagg 1440 ctacggcgct gtcatcgatt tcttccctgt gaaaacaaga gcaaggccgt ggagcaggtg 1500 aagaatgcct ttaataagct ccaagagaaa ggcatctaca aagccatgag tgagtttgac 1560 atcttcatca actacataga agcctacatg acaatgaaga tacgaaacta a 1611 <210> 171 <211> 536 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A CTLA4::IL10 fusion protein with H68 linker <400> 171 Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val 20 25 30 Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys 35 40 45 Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser 50 55 60 Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln 65 70 75 80 Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu 85 90 95 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile 100 105 110 Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Leu Glu Pro Lys 115 120 125 Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 130 135 140 Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 145 150 155 160 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 165 170 175 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atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1260 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1320 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1380 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1440 aactcattat tcaaccaaga agttcaaatt cccttgaccg aaagttacag cccgaattct 1500 agcccaggcc agggcaccca gtctgagaac agctgcaccc acttcccagg caacctgcct 1560 aacatgcttc gagatctccg agatgccttc agcagagtga agactttctt tcaaatgaag 1620 gatcagctgg acaacttgtt gttaaaggag tccttgctgg aggactttaa gggttacctg 1680 ggttgccaag ccttgtctga gatgatccag ttttacctgg aggaggtgat gccccaagct 1740 gagaaccaag acccagacat caaggcgcat gtgaactccc tgggggagaa cctgaagacc 1800 ctcaggctga ggctacggcg ctgtcatcga tttcttccct gtgaaaacaa gagcaaggcc 1860 gtggagcagg tgaagaatgc ctttaataag ctccaagaga aaggcatcta caaagccatg 1920 agtgagtttg acatcttcat caactacata gaagcctaca tgacaatgaa gatacgaaac 1980 taa 1983 <210> 252 <211> 660 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse anti-CD86::IL10 fusion 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aggacaccct catgatctcc 600 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 660 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 720 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 780 aatggcaagg cgtacgcgtg cgcggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 840 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 900 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 960 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1020 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1080 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1140 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaact cattattcaa ccaagaagtt 1200 caaattccct tgaccgaaag ttacagcccg aattctcagg tgcagctggt gcagtctggg 1260 gctgaggtga agaagcctgg ggcctcagtg aaggtctcct gcaaggcttc tggatacacc 1320 ttcaccgact acaacatgaa ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg 1380 ggaaatattg atccttacta tggtggtact agttacaatc agaagttcaa gggcagggtc 1440 accatgacca gggacacgtc catcagcaca gcctacatgg agctgagcag gctgagatct 1500 gacgacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga tgggactata ggtacgacga cgggagggct 1560 tactatgtta tggacttctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtggaggc 1620 ggttcaggcg gaggtggatc cggcggtggc ggatcgggtg gcggcggatc tgacatcgtg 1680 atgacccagt ctccagactc cctggctgtg tctctgggcg agagggccac catcaactgc 1740 aagtccagcc agagtgtttt atacagctcc aaccagaaga actacttagc ttggtaccag 1800 cagaaaccag gacagcctcc taagctgctc atttactggg catctacccg ggaatccggg 1860 gtccctgacc gattcagtgg cagcgggtct gggacagatt tcactctcac catcagcagc 1920 ctgcaggctg aagatgtggc agtttattac tgtcatcaat acctctactc gtggacgttt 1980 ggccagggga ccaagctgga gatcaaacgg taa 2013 <210> 254 <211> 670 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL10::humanized Fun1 M0115 fusion protein <400> 254 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp 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cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 780 aatggcaagg cgtacgcgtg cgcggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 840 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 900 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatcca 960 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1020 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1080 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1140 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaact cattattcaa ccaagaagtt 1200 caaattccct tgaccgaaag ttacagcccg aattctgagg tgcagctggt ggagtctgct 1260 ggaggtttag tgcagcctgg aaggtcccta aaactctcct gtgcagcctc aggattcact 1320 ttcagtgact attacatggc ctgggtccgc caggctccaa cgaaggggct ggagtgggtc 1380 gcaaccatta gtcatgacgg tagtagtact tactatcgag actccgtgaa gggccgattc 1440 acaatctcca gagataatgc aaaaaccatc ctatacctgc aaatggacag tctgaggtct 1500 gaggacacgg ccacttattt ctgtgcaaga cagaatatta tggattattg gggccaagga 1560 gtcatggtca cagtctcctc agggggtgga ggctctggtg gcggtggctc tggcggaggt 1620 ggatccggtg gcggcggatc tgacattgtg atgacccaga ctccatcctc ccaggctgtg 1680 tcagcagggg agaaggtcac tatgagctgc aagtccagtc agagtctttt gtacagtaga 1740 gaccagagta actacttggc ctggtaccag cagaaacctg ggcagtctcc taaactactt 1800 atctacttgg catccactag ggaatcaggg gtccctgatc gcttcatagg cagtggctct 1860 gggacagact tcactctgac catcagcagt gtgcaggctg aagatctggc agattattac 1920 tgtcagcagc attacaacta tccgctcacg ttcggttctg ggaccaagct agaaatcaaa 1980 taa 1983 <210> 256 <211> 660 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL10::anti-mouse CD86 fusion protein <400> 256 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro 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Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 419 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous leader sequence <220> <221> VARIANT <222> (23) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 419 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Xaa 20 <210> 420 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous leader sequence <220> <221> VARIANT <222> (23)..(24) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 420 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Xaa Xaa 20 <210> 421 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heterologous leader sequence <220> <221> VARIANT <222> (23)..(24) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 421 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 422 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> A naturally occurring or added motif that confers the capacity to form a disulfide bond <400> 422 Cys Pro Pro Cys 1

Claims (35)

  1. 개재 도메인(Intervening domain)에 의해 이종 결합 도메인에 연결된 CD86 결합 도메인을 포함하는 다중-특이적인 융합단백질로서, 상기 이종 결합 도메인은 IL-10 효능제, HLA-G 효능제, HGF 효능제, IL-35 효능제, PD-1 효능제, BTLA 효능제, LIGHT 길항제, GITRL 길항제 또는 CD40 길항제인, 다중-특이적인 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD86 결합 도메인이 CTLA4 엑토도메인 또는 CTLA4 엑토도메인의 서브-도메인인 다중-특이적인 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CD86 결합 도메인이 CD86에 대해 특이적인 Fab, scFv, 도메인 항체, 또는 중쇄-유일 항체인 다중-특이적인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 CD86 결합 도메인이 FUN1 항-CD86 항체의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인 또는 이의 인간화된 변이체를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 FUN1 결합 도메인이 서열 번호: 187 또는 237의 1 내지 258번 아미노산을 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 CD86 결합 도메인이 서열 번호: 1 내지 6 중의 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호: 7, 14, 15, 18-22, 25, 26, 29, 32, 33, 39 및 40 중의 어느 하나에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호: 7에서 제공된 아미노산 서열 또는 87번 위치에서 점 돌연변이를 포함하는 이의 변이체를 포함하는, IL-10 효능제를 포함하는 다중-특이적인 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호: 14 또는 15에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 HLA-G 효능제를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호 18 내지 22 중의 어느 하나에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 HGF 효능제를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  11. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호: 25 또는 26에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 IL-35 효능제를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  12. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호: 32 또는 33에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 PD-1 효능제를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  13. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호: 29에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 BTLA 효능제를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  14. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호: 29에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 LIGHT 길항제를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  15. 제1항에 있어서, 상기 이종 결합 도메인이 서열 번호: 39 또는 40에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는 GITRL 길항제를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  16. 제1항에 있어서, 상기 개재 도메인이 CD86 결합 도메인과 이종 결합 도메인 사이에 배치된 면역글로불린 불변 영역 또는 서브-영역을 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역 또는 서브-영역이 IgG1 CH2CH3인 다중-특이적인 융합 단백질.
  18. 제1항에 있어서, 상기 개재 도메인이 제1 링커와 제2 링커 사이에 배치된 면역글로불린 불변 영역을 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 링커 및 제2 링커가 서열 번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398에서 제공된 링커로부터 독립적으로 선택된 것인 다중-특이적인 융합 단백질.
  20. 제18항에 있어서, 상기 개재 도메인이 사람 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 트랜스페린, 또는 혈청 단백질에 결합하는 스캐폴드 도메인(scaffold domain)을 포함하는 다중-특이적인 융합 단백질.
  21. 제1항에 있어서, 상기 개재 도메인이 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음과 같은 구조를 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질:
    -L1-X-L2-
    여기서,
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 2 내지 약 150개 아미노산을 포함하는 링커이고;
    X는 면역글로불린 불변 영역 또는 서브-영역, 알부민, 트랜스페린, 또는 다른 단백질에 결합하는 혈청 단백질이다.
  22. 제21항에 있어서, 상기 면역글로불린 불변 영역 또는 서브-영역이 IgG1 CH2CH3인 다중-특이적인 융합 단백질.
  23. 제21항에 있어서, 상기 L1이 임의로 하나 이상의 시스테인을 다른 아미노산으로 돌연변이시킨, 사람 면역글로불린 힌지 영역인 다중-특이적인 융합 단백질.
  24. 제21항 또는 제23항에 있어서, 상기 X가 임의로 돌연변이되어 FcγRI-III 상호작용이 제거되어 있으나 FcRn 상호작용을 보유하고 있는, 사람 IgG1 Fc 도메인 또는 적어도 하나의 이의 CH 도메인인 다중-특이적인 융합 단백질.
  25. 제1항에 있어서, 상기 개재 도메인이 이량체화 도메인인 다중-특이적인 융합 단백질.
  26. 제1항에 있어서, 다음 구조를 갖는 다중-특이적인 융합 단백질:
    N-BD1-X-L2-BD2-C
    상기 구조에서,
    BD1은 CTLA4의 엑토도메인에 대해 적어도 약 90% 동일한 CD86 결합 도메인이고;
    -X-는 -L1-CH2CH3-이고,
    여기서, L1은 제1 시스테인을 치환함으로써 임의로 돌연변이된 제1 IgG1 힌지(hinge)이고, 여기서, -CH2CH3-는 임의로 돌연변이되어 FcγRI-III 상호작용이 제거되나 FcRn 상호작용은 보유하는 IgG1 Fc 도메인의 CH2CH3 영역이며;
    L2는 서열 번호: 43-166, 244, 307, 320, 355-379 및 383-398 중에서 선택된 링커이고;
    BD2는 이종 결합 도메인이다.
  27. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열 번호: 9, 13, 17, 24, 28, 31, 35, 38, 42, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 237, 239, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 266, 276, 302, 330, 334, 336, 338, 340, 350, 352, 및 354 중의 어느 하나에서 제공된 아미노산 서열을 포함하는, 다중-특이적인 융합 단백질.
  28. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 다중-특이적인 융합 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 다중-특이적인 융합 단백질이 조성물 속에 이량체 또는 다량체로 존재하는 조성물.
  30. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 따른 다중-특이적인 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  31. 제30항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 서열 번호: 8, 12, 16, 23, 27, 30, 34, 37, 41, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 236, 238, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 265, 275, 301, 329, 333, 335, 337, 339, 349, 351 및 353 중의 어느 하나에서 제공된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  32. 발현 대조군 서열에 작동가능하게 연결된 제30항 또는 제31항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 벡터.
  33. 제32항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  34. 제1항 내지 제33항 중의 어느 한 항에 따른 다중-특이적인 융합 단백질 또는 이의 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, CD86, IL-10, HLA-G, HGF, IL-35, PD-1, BTLA, LIGHT, GITRL 또는 CD40과 관련된 질환을 가진 대상체를 치료하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 질환이 류마티스 관절염, 연소성 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스 또는 기질 기관 이식인 방법.
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