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KR19980066046A - 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질 - Google Patents

고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질 Download PDF

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KR19980066046A
KR19980066046A KR1019970001360A KR19970001360A KR19980066046A KR 19980066046 A KR19980066046 A KR 19980066046A KR 1019970001360 A KR1019970001360 A KR 1019970001360A KR 19970001360 A KR19970001360 A KR 19970001360A KR 19980066046 A KR19980066046 A KR 19980066046A
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ctla4
cys
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정용훈
최덕길
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Abstract

본 발명은 CTLA4의 세포외 부위와 Ig M의 CH2, CH3와 CH4부위가 연결되거나 CTLA4의 세포외 부위와 IgG1 Cys308(308번 아미노산이 시스테인인 IgG1)의 힌지, CH2와 CH3부위가 연결된 것으로, 6개의 CTLA4-Ig 융합단백질이 중합된 헥사머 구조를 가지는 CTLA4-Ig 융합단백질에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 투여량이 감소된 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질이 제공된다.

Description

고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
도 1은 실시예 1의 역전사-중합효소연쇄반응에 의하여 클로닝된 CTLA4 유전자의 구조를 나타낸다.
도 2는 실시예 2의 융합단백질의 발현율을 나타낸다.
도 3은 실시예 2의 CTLA4-IgM 융합유전자의 염기서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 4는 실시예 3의 CTLA4-IgG1 Cys308융합유전자의 염기서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5는 CTLA4-IgM 융합유전자 및 CTLA4-IgG1 Cys308융합유전자의 발현 벡터 pHIGH3neo와 pHIGH3gpt의 제조방법을 나타낸다.
도 6은 CTLA4-IgM 융합단백질 및 CTLA4-IgG1 Cys308융합단백질의 웨스턴블랏 결과를 나타낸다.
도 7은 600kD의 CTLA4-IgM 융합단백질 및 CTLA4-IgG1 Cys308융합단백질의 구조를 나타낸다.
도 8은 CTLA4-IgM 융합단백질 및 CTLA4-IgG1 Cys308융합단백질의 면역억제 효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질에 관한 것으로, 구체적으로는 CTLA4의 세포외 부위와 Ig M의 Cμ 또는 Ig G의 Cγ1 부위를 연결한 융합단백질에 관한 것이다.
장기 이식에 있어서 거부반응은 환자에게 매우 치명적인 것으로, 이는 자기(self)와 비자기(non-self; 외부)를 구별하는 면역반응에 의한 것이다.
T 세포는 장기 이식의 거부반응에 있어 매우 중요한 역할을 하는 것으로, T 세포의 반응은 항원 특이적 자극과 동조 자극 신호(costimulatory signal)의 두가지 신호에 의하여 시작된다. 동조 자극에는 ICAM-1/LFA-1, B7/CD28와 CTLA4, LFA-3/CD2 등의 수많은 리간드/수용체 결합이 관여하며, 이중에서도 특히 T 세포의 CD28은 B7과 결합하여 T 세포 싸이토키닌(cytokinin)의 mRNA를 안정화시키고(June,C.H. et al., Mol Cell Biol 7:4472, 1987/ Lindstent, et al., Science 244;339, 1989), IL-2(interleukin-2), IFN-γ(interfer-γ), TNF-α(tumor necrosis factor-α), 림포톡신(lymphotoxin), GM-CSF(granulocyte·macrophage-colony stimulating factor), IL-3 (interleukin-3)의 생산을 증가시키는 등 T 세포의 반응에 매우 핵심적인 역할을 하고 있다.
따라서, CD28과 B7의 결합을 막으므로써 CD28에 의한 동조 자극을 차단하여 면역반응을 억제한다면, 장기 이식의 거부반응을 억제할 수 있게 된다.
CTLA4는 CD28과 67%의 유사성(homology)을 가지고 있으며, CD28처럼 항원제 시세포(antigen presenting cell, APC)의 B7(B7.1 및 B7.2)에 결합한다.
린슬리 등(Linsley, P.S. et al, J. Exp. Med.174;561,1991)은 CTLA4와 면역글로불린 IgG를 융합한 단량체의 CTLA4-Ig 융합단백질을 제조하고 이 융합단백질이 면역억제효과를 가지고 있음을 보고한 바 있다. 최근에는 야마다 등(Yamda, A. et al., Microbio. Immunol., 40;513-518,1996)은 펜타머(pentamer)의 CTLA4-IgM 융합단백질을 제조하고 이 융합단백질이 장기이식후 생존을 연장시킨다고 보고하고 있다.
그러나 이 CTLA4-Ig 융합단백질은 그 투여량이 성인 60kg 기준 1회 600mg으로 과다하고 생산비용도 높아 제품의 경제성이 취약하다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 이러한 문제점이 해결된 CTLA4-Ig 융합단백질을 제조하고자 노력하였다.
본 발명의 목적은 투여량이 감소되고 경제성이 향상된 CTLA4-Ig 융합단백질을 제공하는데 있다.
본 발명은 CTLA4의 세포외 부위와 Ig M의 CH2, CH3와 CH4부위가 연결되거나 CTLA4의 세포외 부위와 IgG1 Cys308(308번 아미노산이 시스테인인 IgG1)의 힌지, CH2와 CH3부위가 연결된 것으로, 6개의 CTLA4-Ig 융합단백질이 중합된 헥사머(hexamer) 구조를 가지는 CTLA4-Ig 융합단백질을 제공한다.
CTLA4-Ig 융합단백질의 헥사머 구조는 이웃한 IgM들간 또는 IgG1 Cys308들간에 시스테인의 디셀파이드 결합(disulfide bond)에 의하여 중합체를 형성하는데서 기인한다. 구체적으로 IgM은 414번 및 567번의 시스테인이 디셀파이드 결합을 이루며, IgG1 Cys308은 308번의 시스테인이 디셀파이드 결합을 이룬다. 본 발명의 IgG1 Cys308은 IgG1이 IgM처럼 중합체를 형성하도록 하기 위하여 본 발명에서 IgG1과 IgM의 아미노산 서열상의 유사성을 비교하여 IgM의 414번 시스테인에 해당하는 자리인 IgG1의 CH2부위의 308번 루이신(leucine)을 시스테인으로 변환시킨 것이다.
본 발명은 CTLA4-Ig 융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드(code)하는 DNA 염기서열을 제공한다.
본 발명은 인핸서, 프로모터, N-말단이 절단된 CTLA4 리더 서열 및 CTLA4-Ig 융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드(code)하는 DNA 염기서열을 벡터 pSV2neo와 pSV2gpt에 삽입하여 제조되는 발현 벡터 pHIGH3neo 및 pHIGHgpt를 제공한다. 여기서 N-말단이 절단된 CTLA4 리더 서열은 CTLA4-Ig 융합단백질이 세포외로 분비되도록 한다.
본 발명은 인핸서, 프로모터, N-말단이 절단된 리더 서열 및 CTLA4-Ig 융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드(code)하는 DNA 염기서열을 벡터 pSV2neo와 pSV2gpt에 삽입하여 제조되는 발현 벡터 pHIGH3neo와 pHIGH3gpt를 마우스 SP2/0-Ag14 세포에 도입하여 형질전환시켜 제조되는 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 CTLA4-Ig 융합단백질을 함유하는 면역억제제를 제공한다.
본 발명의 CTLA4-Ig 융합단백질은 가용성 단백질로 항원제공세포의 B7과 결합하므로써, T세포의 CD28과 CTLA4이 B7과 결합하는 것을 막아 T 세포 활성화에 필요한 동시 자극 신호를 차단하여 결국 면역반응을 억제한다.
본 발명의 CTLA4-Ig 융합단백질의 역가는 기존의 CTLA4-Ig 융합단백질의 역가 보다 32-356 배로 매우 높다.
본 발명의 CTLA4-Ig 융합단백질은 투여량도 성인 60kg 기준 1회 2-13mg로, 유효역가가 기존의 CTLA4-Ig 융합단백질보다 약 45배 내지 260배까지 증가한 것이다. 이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간의 CTLA4- IgG1 및 IgM 유전자의 클로닝
CTLA4, IgG1 및 IgM 유전자는 각각 역전사­중합효소연쇄반응(reverse transcripiton - polymerase chain reaction, RT-PCR) 방법으로 클로닝하였다.
1. CTLA4 유전자의 클로닝
CTLA4 유전자를 클로닝하기 위하여 역전사­중합효소 연쇄반응에 사용한 템플레이트(tamplate)는 건강한 성인의 단핵구 세포의 mRNA로, 다음과 같이 분리하였다.
건강한 성인의 혈액을 채취하고 이를 Ficoll­Hypaque를 사용하여 밀도구배 원심분리(density­gradient centrifugation)하여 단핵구 세포층을 얻었다. 여기에 10% 우태아 함유 RPMI­1640 배지를 가하여 단핵구 세포 5x105세포/㎖로 하고, 류코아글루티닌(leukoagglutinin, Pharmacia사)을 3.5㎍/㎖가 되게 가한 뒤, 5% CO2, 37℃에서 36­48시간 배양한 후 mRNA를 분리하였다.
역전사­중합효소연쇄반응에 사용한 중합효소는 pfu(Stratagene사)이다.
역전사­중합효소연쇄반응에 사용한 프라이머는 5개의 전진 프라이머(forward primer, L1­5)와 1개의 후진 프라이머(reverseward primer)로, 다음과 같다.
전진 프라이머
L1 5'­ATG GCT TGC CTT GGA TTT CAG­3'
L2 5'­ATG CGG CAC AAG GCT CAG CTG AAC­3'
L3 5'­ATG CAG CTG AAC CTG GCT GCC AGG­3'
L4 5'­ATG AGG ACC TGG CCC TGC ACT CTC­3'
L5 5'­ATG CTC CTG TTT TTT CTT CTC TTC­3'
후진 프라이머
5'­CTC TGC AGA ATC TGG GCA CGG TTC AGG ATC­3'
이때 L1 프라이머는 절단없이 자연상태의 CTLA4 그대로 발현되도록, L2는 N 말단에서 6개의 아미노산이 절단되어 발현되도록, L3는 N 말단에서 11개의 아미노산이 절단되어 발현되도록, L4는 N 말단에서 16개의 아미노산이 절단되어 발현되도록, L5는 N 말단에서 22개의 아미노산이 절단되어 발현되도록 고안되었다(도 1).
N 말단에서 아미노산이 절단되어 발현되도록 전진 프라이머를 고안한 것은 리더 서열 일부가 절단되어 발현되도록하여 CTLA4 단백질이 세포외로 분비되도록 하기 위함이고, 5개의 프라이머를 고안한 것은 리더 서열이 단계적으로 절단 발현되도록하여 CTLA4 단백질의 세포외 분비를 가장 많게 하는 리더 서열을 결정하기 위함이다.
역전사­중합효소연쇄반응으로 얻어진 CTLA4 유전자는 pUC 18에 클로닝하였다.
여기서 클로닝된 CTLA4 유전자는 49번 염기가 아데닌에서 구아닌으로, 331번 염기가 구아닌에서 아데닌으로 변환된 것으로 확인되었고, 이에 따라 CTLA4 단백질의 17번 아미노산이 트레오닌에서 알라닌으로, 111번 아미노산이 알라닌에서 트레오닌으로 변환되었다.
2. IgG1 유전자의 클로닝
템플레이트와 프라이머를 제외하고는, 상기한 1.의 방법과 동일하다.
템플레이트는 회복기에 있는 원인 불명의 열 환자의 말초 혈액 림프구 B 세포의 mRNA이다.
프라이머는 IgG1의 상쇄역을 클로닝하기 위하여 고안되었으며 다음과 같다.
전진 프라이머
5'­A TCT GCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC­3'
후진 프라이머
5'­TT CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA­3'
3. IgM 유전자의 클로닝
프라이머를 제외하고는, 상기한 2의 방법과 동일하다.
프라이머는 IgM의 상쇄역을 클로닝하기 위하여 고안되었으며 다음과 같다.
전진 프라이머
5'­GAC TGC AGA GCT GCC TCC CAA AGT G­3'
후진 프라이머
5'­GTA GCA GGT GCC AGC TGT GTC TGA­3'
실시예 2 : 최적의 세포외 분비 리더서열의 결정
실시예 1의 1에서 N­말단의 아미노산을 단계적으로 결손시켜 얻은 CTLA4 유전자 5개를 각각 IgG1 유전자와 융합하고, 백터 pHIGH3에 삽입한 뒤, 이를 마우스 골수증 SP2/0-Ag14 세포(ATCC#: CRL 1581)에 전달감염(transfection)시키고 발현시킨 후 48시간 배양한 다음 세포유동분석하여 융합단백질의 발현율을 분석하였다.
그 결과 L1 프라이머를 사용하여 얻은 경우에는 4.9%, L2 프라이머를 사용하여 얻은 경우에는 3.1%, L3 프라이머를 사용하여 얻은 경우에는 0%, L4 프라이머를 사용하여 얻은 경우에는 7.8%, L5 프라이머를 사용하여 얻은 경우에는 6%로 융합단백질이 발현된 것으로 나타나(도 2), L4 프라이머를 사용하여 얻은 경우인 N­말단에서 16개의 아미노산이 절단된 리더 서열이 융합단백질을 가장 많이 세포외로 분비시키는 것으로 확인되었다.
실시예 3 : IgG1 Cys308의 제조
중합효소연쇄반응을 사용하여 IgG1의 308번 루이신(leucine)을 시스테인으로 변환시켜 IgG1 Cys308을 제조하였다.
중합효소연쇄반응에 사용한 프라이머는 다음과 같다.
전진 프라이머
5'­A TCT GCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC­3'
후진 프라이머
5'­TT CTC GAG TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA­3'
변환용 프라이머
5'­CCA GTC CTG GTG ACA GAC GGT GAG GAC­3'
먼저 전진 프라이머와 변환용 프라이머로 일차 중합효소연쇄반응을 실시하고, 다음 이 중합효소연쇄반응 산물과 후진 프라이머로 중합효소연쇄반응을 실시하였다. 증폭된 최종 중합효소연쇄반응 산물은 pUC18 벡터에 클로닝하였다.
실시예 4 : CTLA4­Ig 융합 유전자의 발현 벡터의 구축
SP2/0­Ag14 세포의 게놈 DNA를 추출하고 이를 제한효소 BamH I와 Hind III로 절단한 뒤 니트로셀룰로오스 막에 전이하고, 동위원소로 표지된 5'­ATT TGC ATA TTT GCA TAT TTG CAT­3'와 5'­CTC ATG ACT CAT GAC TCA­3'로 서던 블랏(Southern blot)하여, 5.3 kb 프로모터(promoter)를 클로닝하였다.
한편 SP2/0-Ag14 세포의 게놈 DNA를 제한효소 EcoR I과 BamH I으로 절단하고, 동위원소로 표지된 5'­TGA ATT GAG CAA TGT TGA ATT GAG CAA TGT­3', 5'­TAT TTG GGG AAG GGT ATT TGG GGA AGG­3'로 서먼 블랏하여, 1 kb의 인핸서(enhancer)를 클로닝하였다.
1 kb의 인핸서(enhancer)와 5.3 kb 프로모터(promoter)를 pUC 19에서 융합한 다음, pUC 18에 클로닝한 CTLA4­Ig 융합 유전자(실시예 2의 CTLA4­IgM 융합 유전자 및 실시예 3의 CTLA4­IgG1 Cys308융합 유전자, 도 3 및 도 4)의 앞부분인 Sal I 자리에 삽입하여 인핸서­프로모터­CTLA4­Ig 융합 유전자를 pUC 18에 클로닝하였다. 여기에 EcoR I과 Hind III를 처리하여 인핸서­프로모터­CTLA4­Ig 융합 유전자만을 절단하고 이를 pSV2neo와 pSV2gpt에 삽입하여 발현벡터 pHIGH3neo와 pHIGH3gpt를 구축하였다(도 5).
실시예 5 : CTLA4­Ig 융합 유전자의 발현 및 CTLA4-Ig 융합단백질의 정제
마우스 SP2/0­Ag14 세포를 10% 우태아 혈청 함유 DMEM 배지 (10% FCS­DME)에서 배양하고 여기에 PBS를 가하여 SP2/0­Ag14 세포 5x106세포/㎖로 하고, 이 세포 현탁액 0.2㎖를 일렉트로포레이션(electroporation)용 큐베트(cuvette, BioRad사)에 넣고 정제된 실시예 4의 CTLA4-Ig 융합 유전자의 발현벡터 15㎍을 첨가하였다. 이를 일렉트로포레이터(electroporator, BTX 820)에 넣고 480V, 99μsec, 2cycle 조건하에서 일렉트로포레이션을 실시하였다.
이 세포들을 geneticin G418(Gibco사) 1500μg/㎖가 함유된 FCS­DMEM 배지에서 3주간 배양하고, 형성된 집락을 분리수거하여 증폭 배양한 다음 세포 유동 분석기와 효소 면역 검사법으로 CTLA4­Ig 융합 유전자의 발현 여부를 검사하였다.
이 세포들을 우 형청 배지에서 대량 배양한 후 배양물에 암모니움 썰패이트(ammonium sulfate)를 가하여 CTLA4­Ig 융합단백질을 침전시킨 다음 단백질 A(Protein A)로 친화크로마토그래피(affinity chromtography)하여 CTLA4­Ig 융합단백질을 정제하였다.
이 CTLA4­Ig 융합단백질의 생화학적 특성을 알기위하여 전기영동하여 웨스턴 블랏(Western blot) 한 결과(도 6), CTLA4­IgM 융합단백질은 2 종류, CTLA4­IgG1 Cys308융합단백질은 6 종류로 나타냈는데 이중 600kD의 CTLA4­Ig 융합단백질을 분리하여 정제하였다. 이 600kD의 CTLA4­Ig 융합단백질은 기존의 CTLA4-Ig 융합단백질(100kD)보다 6배 큰 것으로, 6개의 CTLA4­Ig 융합단백질이 중합된 헥사머이다(도 7).
실시예 6 : CTLA4­Ig 융합단백질의 면역억제효과
기존의 CTLA4-Ig 융합단백질을 비교예 1로 하고, pentamer의 CTLA4­Ig 융합단백질을 비교예 2로 하고, 헥사머 CTLA4­Ig 융합단백질을 실시예로 하여 이들의 면역억제효과를 다음과 같이 조사하였다.
건강한 성인 두사람으로부터 말초 혈액 림프구를 분리한 다음 한사람의 세포에60Co 방사선 300 rad을 조사하였다. 두 사람의 세포를 각각 96­웰 플레이트(96­well plate)에 2.5x104세포/웰로 넣고 37℃, 5% CO2조건하에서 88­96시간동안 배양한 다음, 웰당 0.5μCi3H­티미딘(3H­thymidine, NEN Research product)를 가하고 5시간 동안 추가 배양하였다.
배양된 세포를 세포수거기(Titertek, Flow lab.)를 사용하여 유리 여과지에 흡착시킨 후 시험관에 넣고 씬틸레이션 용액(Scintillation cocktail) 5㎕을 첨가하여 β액상 씬틸레이션 계수기(β­liquid scintillation counter)로 방사능 활성도(radioactivity)를 측정하였다. 모든 실험은 3개씩 동일한 조건하에서 실시하여 평균값을 취하였다. 이때 첨가물이 없이 얻은 방사능을 기준(100%)으로 하여 상기에서 제조된 융합단백질의 첨가시에 얻은 값을 %로 구하였다. 그리고 이값이 50%되는 선을 50% 분열억제선으로 정하였으며, 이때 첨가된 융합단백질의 농도를 구하여 각 융합단백질간의 역가를 비교하였다.
그 결과 실시예의 CTLA4­Ig 융합단백질의 50% 분열억제농도는 0.009­0.022μg/㎖(평균 0.016μg/㎖)로, 비교예 1 CTLA4­Ig 융합단백질의 0.7­3.2μg/㎖(평균 1.4μg/㎖), 비교예 2 CTLA4­Ig 융합단백질의 0.031­0.056(평균 0.44μg/㎖)보다 낮아(도 8), 실시예의 CTLA4­Ig 융합단백질이 기존 융합단백질인 비교예 1의 CTLA4­Ig 융합단백질에 비하여 32­356배(평균 88배)의 높은 역가를 나타내었다.

Claims (12)

  1. CTLA4­Ig 융합단백질에 있어서, CTLA4의 세포외 부위와 Ig M의 CH2, CH3와 CH4부위가 연결되어 있고 이 융합단백질 6개가 중합되어 헥사머 구조를 가지는 것을 특징으로하는 CTLA4-IgM 융합단백질.
  2. 제 1항의 CTLA4­IgM 융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드하는 도 4의 DNA 염기서열.
  3. 인핸서, 프로모터, N 말단이 절단된 CTLA4의 리더 서열 및 제 1항의 CTLA4­IgM 융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드(code)하는 DNA 염기서열을 연결하고 벡터 pSV2neo에 삽입하여 제조되는 발현 벡터 pHIGH3neo.
  4. 제 3항에 있어서, 리더서열이 N 말단에서 16개의 아미노산이 절단된 것을 특징으로 하는 발현 벡터 pHIGH3neo.
  5. 인핸서, 프로모터, N 말단이 절단된 CTLA4의 리더 서열 및 제 1항의 CTLA4­IgM 융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드(code)하는 DNA 염기서열을 연결하고 벡터 pSV2neo에 삽입하여 제조되는 발한 벡터 pHIGH3neo를 마우스 SP2/0­Ag14 세포에 도입하여 형질전환시켜 제조되는 형질전환체.
  6. 제 1항의 CTLA4­IgM 융합단백질을 함유하는 면역억제제.
  7. CTLA4­Ig 융합단백질에 있어서, CTLA4의 세포외 부위와 IgG1 Cys308(308번 아미노산이 시스테인인 IgG1)의 힌지, CH2와 CH3부위가 연결되어 있고 이 융합단백질 6개가 중합되어 헥사머 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 CTLA4­IgG1 Cys308융합단백질.
  8. 제 7항의 CTLA4­IgG1 Cys308융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드하는 도 3의 DNA 염기서열.
  9. 인핸서, 프로모터, N 말단이 절단된 CTLA4의 리더 서열 및 제 7항의 CTLA4­IgG1 Cys308융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드(code)하는 DNA 염기서열을 연결하고 벡터 pSV2neo에 삽입하여 제조되는 발현 벡터 pHIGH3neo.
  10. 제 9항에 있어서, 리더서열이 N 말단에저 16개의 아미노산이 절단된 것을 특징으로 하는 발현 벡터 pHIGH3neo.
  11. 인핸서, 프로모터, N 말단이 절단된 CTLA4의 리더 서열 및 제 7항의 CTLA4­IgG1 Cys308융합단백질에 상응하는 아미노산 서열을 코드(code)하는 DNA 염기서열을 연결하고 벡터 pSV2neo에 삽입하여 제조되는 발현 벡터 pHIGH3neo를 마우스 SP2/0­Ag14 세포에 도입하여 형질전환시켜 제조되는 형질전환체.
  12. 제 7항의 CTLA4-IgG1 Cys308융합단백질을 함유하는 면역억제제.
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