DE69835230T2

DE69835230T2 - Verfahren zur herstellung von nordamerikanischen ginseng fraktionen, enthaltende produkte, und verwendung als immunmodulatoren

Info

Publication number: DE69835230T2
Application number: DE69835230T
Authority: DE
Inventors: Jacqueline J. Edmonton SHAN; K. T. Peter Edmonton PANG; Buhan Edmonton HUANG; Lei Edmonton LING
Original assignee: CV Technologies Inc
Current assignee: FX Life Sciences AG
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2018-12-12
Also published as: CN1285752A; JP4458505B2; CN1285752B; US20030124207A1; US6432454B1; JP2002508329A; KR20010032984A; AU752702B2; DK1037645T3; US20080286389A1; US7067160B2; US7763290B2; WO1999030725A1; US20050196471A1; HK1032358A1; ATE332701T1; US20030077341A1; AU1903499A; KR100780521B1; CA2314453A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft chemische Verfahren zur Herstellung von Fraktionen von nord-amerikanischen Ginseng (Panax quinquefolium) und Zusammensetzungen, die diese Fraktion enthalten. Die Produkte der vorliegenden Erfindung können zur Stimulierung der Produktion von Antikörpern oder als Therapeutika verwendet werden, die auf Zustände abzielen, die durch Immunschwäche, wie z.B. Erkältung, Grippe, chronisches Erschöpfungssyndrom, Aids, Krebs, etc. charakterisiert sind. Die Produkte der vorliegenden Erfindung können auch als Präparat für Krebspatienten verwendet werden, die mit einer Chemotherapie oder Bestrahlungstherapie behandelt werden, welche dafür bekannt ist, dass sie eine beträchtliche Unterdrückung des Immunsystems verursacht.
Hintergrund der Erfindung
Seit Jahrhunderten ist die Verwendung bestimmter ungiftiger Mittel wie z.B. pflanzlicher Verbindungen für eine Vielfalt von physiologischen Zuständen, insbesondere im Orient in großem Umfang anerkannt worden. Panax ginseng C.A. Meyer ist die bekannteste traditionelle chinesische Medinzin. Die wesentlichen pharmakologischen Wirkungen von Ginsengextrakten allein oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln umfassen Linderung der Beeinträchtigung der Nierenfunktion, Hemmung von Krebsentstehung und Prävention von Stress. Es besteht auch eine Vielzahl von Berichten über den Einfluss von Ginseng auf die Immunreaktion des Individuums. Einige immunmodulatorische Eigenschaften, über die berichtet worden ist, umfassen die Steigerung der Wirtsresistenz gegenüber Infektion, anti-entzündliche Wirkung, Hemmung von Tumorwachstum sowie die Modulierung gewisser grundlegender Immunfunktion auf Zellebene. Amerikanischer Ginseng, Panax quinquefolium, ist eine weitere Ginsengart, welche als Gesundheitspräparat mit vielen nützlichen gesundheitheitlichen Wirkungen an Beliebtheit gewonnen hat.
Verschiedene Gruppen von Wissenschaftlern haben Versuche zur Isolierung und Aufklärung der Struktur der Polysaccharide, die in Ginseng vorkommen, unternommen. Für einige der Polysaccharide ist gezeigt worden, dass sie bei der Modulierung des Immunsystems wirksam sind.
Eine Reihe von Untersuchungen über die Isolierung, Charakterisierung und biologische Beurteilung von Ginsengpolysacchariden wurde am Kyoritsu College of Pharmacy, Japan von Tomoda's Gruppe ausgeführt. In einer Reihe von Untersuchungen wurden Ginsengpolysaccharide auf Grundlage ihres Säuregrades fraktioniert. Zwei saure Polysaccharide mit immunologischen Wirkungen sind aus der Wurzel von koreanischem Ginseng (Panax ginseng) isoliert worden^(1,2). Die in Scheiben geschnittenen Wurzeln wurden mit heißem Wasser extrahiert. Der Extrakt wurde mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) in Gegenwart von Natriumsulfat behandelt. Das Präzipitat wurde abgetrennt, dialysiert und auf eine Sephadex G-25-Säule, DEAE-Sephacel (Pharmacia) -Säule aufgebracht, um zwei reine Polysaccharide zu ergeben, welche als Ginsenan PA und Ginsenan PB bezeichnet wurden. Gelchromatographie über Toyopearl HW-55F ergab die Werte 1,6 × 10⁵ bzw. 5,5 × 10⁴ für das Molekulargewicht von Ginsenan PA bzw. Ginsenan PB. Quantitative Analysen zeigten, dass Ginsenan PA 21,3 % Arabinose, 53,4% Galactose, 2,0% Rhamnose, 16,0% Galacturonsäure und 2,7% Glucuronsäure enhielt. Das Molverhältnis dieser Zuckerbestandteile betrug 11:22:1:6:1. Ginsenan PB enthielt 11,0% Arabinose, 32,2% Galactose, 8,1 % Rhamnose, 39,9% Galacturonsäure und 5,0% Glucuronsäure enhielt. Das Molverhältnis betrug 3:7:2:8:1. Beide Polysaccharide zeigten in einem Kohlenstoff-Clearance-Test ausgeprägte, das retikuloendotheliale System verstärkende Wirkung und dosisabhängig deutliche Antikomplement-Wirkung und alkalische Phosphataseinduzierende Wirkung.
In einer weiteren Untersuchung ⁽³⁾ wurden aus dem Überstand des obigen Extraktes, der mit CTAB behandelt wurde, zwei weitere Polysaccharide isoliert, d.h. der Überstand wurde in Ethanol gegossen. Das Präzipitat wurde abgetrennt und auf die Säulen DEAE-Sephadex A-25 und Sephadex G-25 aufgebracht, um zwei weitere reine Polysaccharide zu ergeben, welche als S-IA und S-IIA bezeichnet wurden. Gelchromatographie über Toyopearl HW-55F ergab die Werte 5,6 × 10⁴ bzw. 1,0 × 10⁵ für das Molekulargewicht von S-IA bzw. S-IIA. Ginsenan S-IA enthält 42,3 % Arabinose, 50,8% Galactose, 6,9% Galacturonsäure in dem Molverhältnis 8:8:1. Ginsenan S-IIA besteht aus 42,0% L-Arabinose, 32,6% Galactose, 6,2% Glucose und 19,2% Galacturonsäure. Das Molverhältnis beträgt 15:10:2:5.
Verschiedene Polysaccharidfraktionen aus Blättern und Wurzeln von Panax ginseng sind am Oriental Medicine Research Center vom Kitasato Institute, Japan, abgetrennt worden. Die chemischen Eigenschaften und biologischen Wirkungen wurden untersucht und verglichen.⁽⁴⁾
Ginsengwurzeln und -blätter aus China wurden mit Wasser extrahiert, nachdem sie mit Ethanol zur Entfernung ihrer Ginsenoside behandelt wurden, und der Rückstand wurde mit 0,5 M NaOH extrahiert, um wasserlösliche und in Basen lösliche Polysaccharidfraktionen zu ergeben (als GR-2 bzw. GL-2 für die wasserlöslichen Fraktionen und GRA-2 bzw. GLA-2 für die in Basen löslichen Fraktionen bezeichnet). Auf Grundlage des Säuregrades der Polysaccharidbestandteile wurden alle Fraktionen weiterhin durch Behandlung mit Cetyltrimethylammonium in stark saure (als GR-3, GL-3, GRA-3 und GLA-3 bezeichnet), schwach saure (GR-4, GL-4, GRA-4 und GLA-4 bezeichnet) und neutrale Polysaccharidfraktionen (als GR-5, GL-5, GRA-5 und GLA-5 bezeichnet) fraktioniert. Die Wurzeln enthielten eine größere Menge an Polysaccharid als die Blätter. Die stark sauren Polysaccharidfraktionen aus den Wurzeln wiesen einen höheren Gehalt an Uronsäure auf, sogar mehr als 50%. Aus allen Fraktionen wurden ähnliche Zuckerbestandteile nachgewiesen. Es waren Rhamnose, Arabinose, Galactose, Glucose, Galacturonsäure und Glucuronsäure. Galacturonsäure war der Haupturonsäurebestandteil.
Die Fraktion mit der höchsten Antikomplement-Wirkung, GL-3, wurde weiter mittels der Säulen DEAE-Sephadex, Sepharose CL-6B, DEAE-Toyopearl und Ausfällung mit Ethanol fraktioniert, um Fraktionen zu ergeben, die als GL-PI bis GL-PIV bezeichnet wurden.⁽⁵⁾ Alle Fraktionen enthielten 32-44% Uronsäure. Fraktion PI wies das höchste Molekulargewicht von 50.000 auf. PI und PII bestand hauptsächlich aus Rha, Gal und GalA und PIII enthielt zusätzlich Fuc, wobei PIV aus Gal, Glc und GalA bestand. Eine ausführliche strukturelle Bestimmung wurde durchgeführt.
Ein Antiulkus-peptisches Polysaccharid (GL-BIII) wurde mittels Chromatographie über DEAE-Sepharose CL-6B und Sepharose CL-6B aus einer schwach sauren Polysaccharidfraktion GL-4 isoliert. Es bestand hauptsächlich aus Rha, Ara, Man, Gal, Glc, GalA und GlcA im Molverhältnis von 3:4:2:10:1:7:4. Ausführliche strukturelle Bestimmung wurde durchgeführt.⁽⁶⁾
Ein weiteres Makrophagen-Fc-Rezeptor-Expressionssteigerndes Polysaccharid (GL-4IIb2) wurde mittels Anionenaustauschchromatographie über DEAE-Sepharose CL-6B abgetrennt. Die chemische Analyse zeigte, dass die Probe 65% Gesamtkohlenhydrat und 33,7% Uronsäure enthielt. Die Analyse der Zusammensetzung und strukturelle Bestimmung wurden durchgeführt.⁽⁷⁾
Ein weiterer Panax ginseng-Extrakt mit Antikomplement-Aktivität, G-115, wurde von derselben Gruppe untersucht.⁽⁸⁾ G-115 wurde zur Charakterisierung der Wirkstoffe auf Antikomplement- und Mitose-auslösende Aktivitäten hin fraktioniert. Die wirksamste Antikomplement-Aktivität wurde in der Rohpolysaccharidfraktion G-115G beobachtet, während die wasserlösliche dialysierbare Fraktion, G-115E die wirksamste Mitose-auslösende Aktivität zeigte. G-115G wurde weiterhin mittels Ausfällung mit Cetyltrimethylammoniumbromid, Anionenaustauschchromatographie über DEAE-Sepharose und Gelfiltration über Sepharose CL-4B gereinigt, und es wurde ein stark wirksames Antikomplementpolysaccharid G-115I1-Ila-2-3 erhalten. Dieses Polysaccharid war homogen. Sein Molekulargewicht wurde auf 3,68 × 10⁵ geschätzt. Es bestand zusätzlich zu kleinen Mengen von Galcturonsäure, Glucuronsäure und Rhamnose hauptsächlich aus Arabinose, Galactose und Glucose.
Ginsengpolysaccharide wurden am Pharmaceutical Institute, Tohoku University, Japan, von Hikino's Gruppe aus koreanischem, chinesischem und japanischem Ginseng isoliert. Die hypoglykämischen Wirkungen der Ginsengpolysaccharide sind untersucht worden. Die Zusammensetzung und einige Struktureigenschaften sind aufgeklärt worden.^(9-14)
Drei Polysaccharide, Quinquefolans A bis C, wurden aus Amerikanischem Ginseng isoliert.⁽¹⁴⁾ Ihre Molekulargewichte wurden mittels Gelchromatographie über Sephacryl S-500 höher als 2,0 × 10⁶ eingeschätzt. Die neutralen Zuckerkomponenten waren Mannose und Glucose (Molverhältnis 1,0:2,3) für Quinquefolan A, Mannose und Glucose (1,0:5,5) für Quinquefolan B und Xylose für Quinquefolan C. Die sauren Zuckerkomponenten in Quinquefolanen A bis C betrugen 10,8, 11,7 bzw. 7,1 %. Der Gehalt der Peptidgruppen in diesen Glycanen betrug 2,7, 2,9 bzw. 2,3% für Quinquefolane A bis C. All diese Polysaccharide zeigten bei normalen und bei mit Alloxan-behandelten hypoglykämischen Mäusen hypoglykämische Wirkungen.
Ein saures Polysaccharid mit dem Molekulargewicht von 150.000, Ginsan genannt, wurde von einer Forschungsgruppe am Laboratory of Immunology, Korean Cancer Hospital, Seoul, Korea, aus Panax Ginseng isoliert.⁽¹⁵⁾ Dieses Polysaccharid bestand aus 3,7% Protein und 47,1% Hexose (Glucose und Galactose) sowie 43,1 % Uronsäure (Galacturonsäure). Ginsan induzierte die Proliferation von T-Zellen und B-Zellen und erzeugte sowohl aus Natürlichen Killer- als auch aus T-Zellen bis endogen-produzierten multiplen Zytokinen Lymphokin-aktivierte Killerzellen.⁽¹⁶⁾
Miao et al. von der Northeast Normal University of China hat aus Amerikanischem Ginseng Polysaccharide isoliert. Reinigung und strukturelle Analyse wurden durchgeführt.⁽¹⁷⁾
Die biologischen Wirkungen von Polysacchariden aus Amerikanischem Ginseng sind von einer Forschungsgruppe an der Norman Bethune University of Medical Science untersucht worden.^(18,19) Sie haben herausgefunden, dass Polysaccharide aus Amerikanischem Ginseng (PPQ) die Lymphozytentransformation steigerten. Die Wirkung von Polysaccharid aus Panax quinquefolium (PPQ-1) auf die Zytokinproduktion von murinen Milzlymphozyten in vitro wurde untersucht. Die Daten deuten darauf hin, dass PPQ-1 Immunfunktion reguliert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, dass bestimmte amerikanische Ginsengextrakte immunregulatorische Eigenschaften aufweisen. CVT-E002 und daraus gereinigte Fraktion PQ₂ und PQ₂₂₃ stimulieren spezifisch murine Milzzellen zur Proliferation von B-Zellen, welche anschließend eine große Antikörpermenge produzieren. Die Fraktionen erhöhen auch die Serumimmunglobulin- (z.B. Gesamt-IgG) Spiegel und stimulieren Makrophagen zur Produktion von IL-1, IL-6 und TNF-α. Diese Fraktionen können zur Prävention oder Behandlung von allgemeiner Infektion und weiteren, mit Immundefekt in Zusammenhang stehenden Erkrankungen verwendet werden.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von Ginsengfraktionen PQ₂, PQ₂₂₃ und CVT-E002 aus Proben von Amerikanischem Ginseng.
Insbesondere umfasst ein Verfahren zur Herstellung von Ginsengfraktion PQ₂:

– Vereinigen von Amerikanischem Ginseng mit einem ersten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von etwa 80-100 °C für eine Zeitdauer von etwa 2-4 Stunden zur Herstellung einer ersten Ginsenglösung;
– anschließendes Abtrennen der ersten Ginsenglösung zur Herstellung einer Alkohol-/Ginsenglösung und eines ersten Ginsengrückstandes;
– anschließendes Vereinigen des ersten Ginsengrückstandes mit Wasser und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von etwa 80-100 °C für eine Zeitdauer von etwa 2-4 Stunden zur Herstellung einer Lösung des Ginsengrückstandes;
– anschließendes Abtrennen der Lösung des Ginsengrückstandes zur Herstelung eines zweiten Ginsengrückstandes und einer ersten wässrigen Extraktlösung, welche einen ersten Ginsengextrakt enthält;
– Bereitstellen einer zweiten wässrigen Extraktlösung, welche mindestens einen Teil des ersten Ginsengextrakts umfasst, wobei in der zweiten wässrigen Extraktlösung das Verhältnis von erstem Ginsengextrakt zu Wasser etwa 1:18 bis 1:22 beträgt;
– anschließendes Vereinigen der zweiten wässrigen Extraktlösung mit einem zweiten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, wobei das Verhältnis von zweitem Lösungsmittel zu Wasser etwa 1:1 bis 3:5 beträgt, zur Herstellung eines ersten Präzipitates und eines ersten Überstandes;
– anschließendes Vereinigen des ersten Überstandes, der in dem vorhergehenden Schritt hergestellt wurde, mit einem dritten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, wobei das Verhältnis von drittem Lösungsmittel zu erstem Überstand etwa 3:2 bis 3:1 beträgt, zur Herstelung eines zweiten Präzipitates und eines zweiten Überstandes; und
– Isolieren des zweiten Präzipitates zur Herstellung eines Ginsengfraktion PQ₂.

Ein Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂₂₃ umfasst:

– Bereitstellen einer Ginsengfraktion PQ₂ wie oben beschrieben;
– Fraktionieren der Ginsengfraktion PQ₂ zur Herstellung einer ersten Elutionsfraktion und einer zweiten Elutionsfraktion, wobei die erste Elutionsfraktion einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 35 und 50 ml des Elutionsvolumens beobachtet wurde und die zweite Elutionsfraktion einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 50 und 85 ml des Elutionsvolumens beobachtet wurde, wie durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der folgenden Materialien bestimmt wurde: (1) eine Chromatographiesäule, die eine Matrix aus einem kugelförmigen vernetzten Copolymer von Allyldextran und N,N'-Methylenbisacrylamid enthält, welche ein Bett und einem Ausmaß von 16 × 600 mm, ein Bettvolumen von 120 ml und einen Fraktionierungsbereich für globuläre Proteine (MG) von 5.000 bis 250.000 und für Dextrane von 1000 bis 80.000 aufweist und (2) ein Elutionspuffer von Tris-HCl, der 0,1 N HCl und 0,3 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthält; und
– Isolieren und Vereinigen der ersten Elutionsfraktion und der zweiten Elutionsfraktion zur Herstellung der Ginsengfraktion PQ₂₂₃.

Ein Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion CVT-E002 umfasst:

– Vereinigen von Amerikanischem Ginseng mit einem ersten Lösungsmittel, welches einen Alkohol in einem Verhältnis von etwa 7-9 ml von erstem Lösungsmittel pro Gramm Ginseng umfasst, und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von 80-100 °C für eine Zeitdauer von etwa 2-4 Stunden zur Herstellung einer ersten Ginsenglösung;
– anschließendes Abtrennen der ersten Ginsenglösung zur Herstellung einer Alkohol-/Ginsenglösung und eines ersten Ginsengrückstandes;
– anschließendes Vereingen des ersten Ginsengrückstandes mit Wasser in einem Verhältnis von etwa 7-9 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand und Erwärmen der Lösung des Ginsenrückstandes bei einer Temperatur von etwa 80-100 °C für eine Zeitdauer von etwa 2-4 Stunden zur Herstellung einer Lösung des Ginsengrückstandes;
– anschließendes Abtrennen der Lösung des Ginsengrückstandes zur Herstellung eines zweiten Ginsengrückstandes und einer wässrigen Extraktlösung, die einen Ginsengextrakt enthält; und
– Trocknen oder Konzentrieren der wässrigen Extraktlösung zur Herstellung der Ginsengfraktion CVT-E002.

Die folgende Erfindung umfasst auch Ginsengfraktion PQ₂, PQ₂₂₃ und CVT-E002, welche gemäß den oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin Ginsengfraktionen mit spezifischen Kohlenhydratgehalten.
Eine erste Ginsengfraktion weist einen Kohlenhydratgehalt auf, der etwa 2-6 mol% Rhamnose, etwa 41-49 mol% Galacturonsäure, etwa 12-18 mol% Glucose, 16-22 mol% Galactose und etwa 12-19 mol% Arabinose umfasst.
Eine zweite Ginsengfraktion weist einen Kohlenhydratgehalt auf, welcher etwa 3-8 mol% Rhamnose, etwa 36-44 mol% Galacturonsäure, etwa 2-7 mol% Glucose, etwa 25-33 mol% Galactose und etwa 17-25 mol% Arabinose umfasst.
Eine dritte Ginsengfraktion weist einen Kohlenhydratgehalt auf, welcher etwa 0,5 bis 5 mol% Rhamnose, etwa 11-22 mol% Galacturonsäure, etwa 40-60 mol% Glucose, etwa 10-19 mol% Galactose und etwa 11-19 mol% Arabinose umfasst.
Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Ginsengfraktionen der Erfindung umfassen, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung einer Ginsengfraktion gemäß der Erfindung, allein oder in Kombination mit einem anderen Arzneimittel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung eines Zustands geeignet ist, welcher durch Immunschwäche charakterisiert ist.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer Ginsengfraktion der Erfindung zur Stimulierung der Produktion von IL-1, IL-6 und/oder TNF-α in Zellen.
Die Erfindung umfasst weiterhin die Verwendung einer Ginsengfraktion gemäß der Erfindung zur Stimulierung der in vitro- oder in vivo-Produktion von Immunglobulinen.
Auch umfasst ist die Verwendung einer Ginsengfraktion gemäß der Erfindung zur Aktivierung der B-Lymphozytenproliferation und Antikörperproduktion.
Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Behandlung eines Zustandes in einem Patienten, der durch Immunschwäche charakterisiert ist, umfassend das Verabreichen einer zur Behandlung des Zustandes wirksamen Menge einer Ginsengfraktion gemäß der Erfindung an den Patienten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Diagramm, bei dem das Elutionsvolumen gegen den Logarithmus des Molekulargewichtes für Standarddextranproben aufgetragen ist, die über eine Chromatographiesäule eluiert wurden.
2 zeigt ein Chromatogramm der Ginsengfraktion CVT-E002.
3 zeigt ein Chromatogramm von Ginsengfraktion PQ₁.
4 zeigt ein Chromatogramm von Ginsengfraktion PQ₂.
5 zeigt ein Chromatogramm von Ginsengfraktion PQ₃.
6 zeigt ein Chromatogramm von Ginsengfraktion PQ₂₂₃.
7 zeigt die Wirkung von Ginsengfraktion PQ₂₂₃ auf B-Zellproliferation von Maussplenocyten.
8 zeigt die Wirkung von Ginsengfraktion PQ₂₂₃ auf T-Zellproliferation von Maussplenocyten.
9 zeigt die Spezifität der Wirkung von Ginsengfraktion PQ₂₂₃ auf die T- und B-Zellproliferation von Maussplenocyten.
10 zeigt die Wirkung von Ginsengfraktion PQ₂₂₃ auf die in vitro Antikörperproduktion durch Mausmilz.
11 zeigt die Steigerung von Plaque-bildenden Zellen (PFC) in Mäusen, denen Ginsengfraktion PQ₂₂₃ injiziert wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Ein Verfahren zur Herstellung von Ginsengfraktion PQ₂ umfasst:

(a) Vereinigen von Amerikanischem Ginseng mit einem ersten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von etwa 80-100 °C für eine Zeitdauer von etwa 2-4 Stunden zur Herstellung einer ersten Ginsenglösung;
(b) anschließendes Abtrennen der ersten Ginsenglösung zur Herstellung einer Alkohol-/Ginsenglösung und eines ersten Ginsengrückstandes;
(c) anschließendes Vereinigen des ersten Ginsengrückstandes mit Wasser und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von etwa 80-100 °C für eine Zeitdauer von etwa 2-4 Stunden zur Herstellung einer Lösung des Ginsengrückstandes;
(d) anschließendes Abtrennen der Lösung des Ginsengrückstandes zur Herstellung eines zweiten Ginsengrückstandes und einer ersten wässrigen Extraktlösung, welche einen ersten Ginsengextrakt enthält;
(e) Bereitstellen einer zweiten wässrigen Extraktlösung, welche mindestens einen Teil des ersten Ginsengextrakts umfasst, wobei in der zweiten wässrigen Extraktlösung das Verhältnis von erstem Ginsengextrakt zu Wasser etwa 1:18 bis 1:22 beträgt;
(f) anschließendes Vereinigen der zweiten wässrigen Extraktlösung mit einem zweiten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, wobei das Verhältnis von zweitem Lösungsmittel zu Wasser etwa 1:1 bis 3:5 beträgt, zur Herstellung eines ersten Präzipitates und eines ersten Überstandes;
(g) anschließendes Vereinigen des ersten Überstandes, der in Schritt (f) hergestellt wurde, mit einem dritten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, wobei das Verhältnis von drittem Lösungsmittel zu erstem Überstand etwa 3:2 bis 3:1 beträgt, zur Herstellung eines zweiten Präzipitates und eines zweiten Überstandes; und
(h) Isolieren des zweiten Präzipitates zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂.

Der Alkohol in dem ersten Lösungsmittel, dem zweiten Lösungsmittel und dem dritten Lösungsmittel umfasst einen Alkohol, der gegenüber Ginseng inert ist und leicht von dem gewünschten Produkt abgetrennt wird. Ein Fachmann kann leicht Alkohole auswählen, welche diese Anforderungen erfüllen. Bevorzugt umfasst der Alkohol einen gesättigten oder ungesättigten C₁-C₆-Alkohol. Stärker bevorzugt umfasst der Alkohol unabhängig Ethanol oder Methanol.
In jedem der Schritte (a) und (c) ist es bevorzugt, dass die sich ergebende Lösung für eine Zeitdauer von etwa 3 Stunden erwärmt wird. Es ist auch bevorzugt, dass in Schritt (a) das erste Lösungsmittel und der Ginseng in einem Verhältnis von etwa 7-9 ml von erstem Lösungsmittel pro Gramm Ginseng, am stärksten bevorzugt etwa 8 ml von erstem Lösungsmittel pro Gramm Ginseng vereinigt werden. In Schritt (c) ist es bevorzugt, dass das Wasser und der erste Ginsengrückstand in einem Verhältnis von etwa 7-9 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand, am stärksten bevorzugt etwa 8 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand vereingt werden.
In unmittelbarem Anschluss an Schritt (d) kann in dem oben erwähnten Verfahren der erste Ginsengextrakt gegebenenfalls konzentriert werden. Dies kann auf eine beliebige Art und Weise gemäß den dem Fachmann bekannten Methoden durchgeführt werden. Z.B. kann die erste wässrige Lösung, die den ersten Ginsengextrakt enthält, zentrifugiert werden (z.B. mit einer Geschwindigkeit von 2500 bis 10000 UpM für etwa 5-15 Minuten). Die erste wässrige Lösung kann auch filtriert werden. Alternativ oder zusätzlich zum Konzentrieren des ersten Ginsengextraktes kann der erste Ginsengextrakt zur späteren Verwendung gefriergetrocknet werden.
In Schritt (e) kann die zweite wässrige Extraktlösung mindestens einen Teil des ersten Ginsengextraktes umfassen. Es ist wesentlich, dass das Verhältnis von erstem Ginsengextrakt zu Wasser in der zweiten wässrigen Extraktlösung etwa 1:18 bis etwa 1:22, stärker bevorzugt etwa 1:20 beträgt. Dies kann mittels einer beliebigen Vielfalt von Wegen erreicht werden. Wenn der erste Ginsengextrakt im Anschluss an Schritt (d), wie oben beschrieben, konzentriert und/oder gefriergetrocknet wird, sollte zu dem ersten Ginsengextrakt Wasser hinzugefügt werden, um das gewünschte Verhältnis zu erreichen. Alternativ kann ein Teil der ersten wässrigen Extraktlösung oder die gesamte erste wässrige Extraktlösung in der zweiten wässrigen Extraktlösung verwendet werden. Gegebenenfalls kann zum Erreichen des gewünschten Verhältnisses zusätzlich Wasser hinzugefügt werden. Durch die Verwendung von mindestens einem Teil der ersten wässrigen Extraktlösung, welche die gewünschte Menge an erstem Ginsengextrakt enthält, wird das Erfordernis vermieden, zwischen Schritten (d) und (e) zusätzliches Konzentrieren oder Gefriertrocknen durchzuführen.
In Schritt (f) ist es bevorzugt, dass das Verhältnis von zweitem Lösungsmittel zu Wasser etwa 3:4 beträgt.
In Schritt (g) ist es bevorzugt, dass das Verhältnis von drittem Lösungsmittel zu erstem Überstand etwa 2:1 beträgt.
Ein Verfahren zur Herstellung von Ginsengfraktion PQ₂₂₃ umfasst:

(a) Bereitstellen einer Ginsengfraktion PQ₂, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde;
(b) Fraktionieren der Ginsengfraktion PQ₂ zur Herstellung einer ersten Elutionsfraktion und einer zweiten Elutionsfraktion, wobei die erste Elutionsfraktion einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 35 und 50 ml des Elutionsvolumens beobachtet wurde und die zweite Elutionsfraktion einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 50 und 85 ml des Elutionsvolumens beobachtet wurde, wie durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der folgenden Materialien bestimmt wurde: (1) eine Chromatographiesäule, die eine Matrix aus einem kugelförmigen vernetzten Copolymer von Allyldextran und N,N'-Methylenbisacrylamid enthält, welche ein Bett mit einem Ausmaß von 16 × 600 mm, ein Bettvolumen von 120 ml und einen Fraktionierungsbereich für globuläre Proteine (MG) von 5000 bis 250000 und für Dextrane von 1000 bis 80.000 aufweist und (2) ein Elutionspuffer von Tris-HCl, der 0,1 N HCl und 0,3 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthält; und
(c) Isolieren und Vereinigen der ersten Elutionsfraktion und der zweiten Elutionsfraktion zur Herstellung der Ginsengfraktion PQ₂₂₃.

Die erste Elutionsfraktion ist auch als PQ₂A bekannt, und die zweite Elutionsfraktion ist auch als PQ₂B bekannt. Diese Elutionsfraktionen können getrennt isoliert werden. Zusätzlich kann dasselbe oben erwähnte Verfahren zur Herstellung zusätzlicher Elutionsfraktionen PQ₂C (welche einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 95 und 110 ml des Elutionsvolumens beobachtet wurde) und PQ₂D (welche einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 120 und 250 ml des Elutionsvolumens beobachtet wurde) verwendet werden. Jede dieser Fraktionen kann auch getrennt isoliert werden. Zusätzlich können Zusammensetzungen außer PQ₂₂₃, welche zwei oder mehr Fraktionen PQ₂A bis PQ₂D umfassen, ebenso hergestellt werden.
Es ist bevorzugt, dass Ginsengfraktion PQ₂ unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie fraktioniert wird. Andere beliebige Fraktionierungsarten, die dem Fachmann bekannt sind, sind jedoch geeignet.
Die Methode zur Durchführung von Gelfiltrationschromatographie gemäß den Empfehlungen des Herstellers im Hinblick auf Fließgeschwindigkeit, Probevolumen und Temperatur, bei welchen die Methode durchgeführt werden sollte, sind dem Fachmann bekannt. Abweichungen von diesen Faktoren innnerhalb der Angaben des Herstellers beeinträchtigt die Ergebnisse des Chromatographielaufes nicht wesentlich.
Bestimmung des Kohlenhydratgehaltes kann durch eine beliebige, im Fachbereich bekannte Methode durchgeführt werden. Es ist bevorzugt, dass ein Mikrotiterplatten-Assay zur Bestimmung der Kohlenhydratzusammensetzung der Fraktion durchgeführt wird. Ein solcher Assay ist dem Fachmann wohlbekannt. Siehe z.B. Dubois et al. Anal. Chem. 28: 350-56 (1956). Die Extinktion der gemäß dem Mikrotiterplatten-Assay bereitgestellten Probe wird bevorzugt bei 492 nm durchgeführt.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion CVT-E002 umfasst:

(a) Vereinigen von Amerikanischem Ginseng mit einem ersten Lösungsmittel, welches einen Alkohol in einem Verhältnis von etwa 7-9 ml von erstem Lösungsmittel pro Gramm Ginseng umfasst, und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von etwa 80-100 °C für eine Zeitdauer von etwa 2-4 Stunden zur Herstellung einer ersten Ginsenglösung;
(b) anschließendes Abtrennen der ersten Ginsenglösung zur Herstellung einer Alkohol-/Ginsenglösung und eines ersten Ginsengrückstandes;
(c) anschließendes Vereingen des ersten Ginsengrückstandes mit Wasser in einem Verhältnis von etwa 7-9 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand und Erwärmen der Lösung des Ginsenrückstandes bei einer Temperatur von etwa 80-100 °C für eine Zeitdauer von etwa 2-4 Stunden zur Herstellung einer Lösung des Ginsengrückstandes;
(d) anschließendes Abtrennen der Lösung des Ginsengrückstandes zur Herstellung eines zweiten Ginsengrückstandes und einer wässrigen Extraktlösung, die einen Ginsengextrakt enthält; und
(e) Trocknen oder Konzentrieren der wässrigen Extraktlösung zur Herstellung der Ginsengfraktion CVT-E002.

Der Alkohol in dem ersten Lösungsmittel umfasst einen Alkohol, welcher gegenüber Ginseng inert ist und leicht von dem gewünschten Produkt abgetrennt wird. Ein Fachmann kann leicht Alkohole auswählen, welche diese Anforderungen erfüllen. Bevorzugt umfasst der Alkohol einen gesättigten oder ungesättigten C₁-C₆-Alkohol. Stärker bevorzugt umfasst der Alkohol Ethanol oder Methanol.
Es ist bevorzugt, dass in Schritt (a) das erste Lösungsmittel und die Probe in einem Verhältnis von etwa 8 ml von ersten Lösungsmittel pro Gramm Probe vereinigt werden. Es ist auch bevorzugt, dass in Schritt (c) das Wasser und der erste Ginsengrückstand in einem Verhältnis von etwa 8 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand vereinigt werden.
In Schritten (a) und (c) ist es bevorzugt, dass die erste Ginsenglösung für eine Zeitdauer von etwa 3 Stunden erwärmt wird. Die Erfindung umfasst auch mehrere Ginsengfraktionen.
Eine erste Ginsengfraktion weist einen Kohlenhydratgehalt auf, welcher etwa 2-6 mol% Rhamnose, etwa 41-49 mol% Galacturonsäure, etwa 12-18 mol% Glucose, etwa 16-22 mol% Galactose und etwa 12-19 mol% Arabinose umfasst. Bevorzugt umfasst der Kohlenhydratgehalt etwa 3-5 mol% Rhamnose, etwa 43-47 mol% Galacturonsäure, etwa 14-16 mol% Glucose, etwa 18-20 mol% Galactose und etwa 14-17 mol% Arabinose. Am stärksten bevorzugt umfasst der Kohlenhydratgehalt etwa 4 mol% Rhamnose, etwa 45 mol% Galacturonsäure, etwa 15 mol% Glucose, etwa 19 mol% Galactose und etwa 15 mol% Arabinose.
Eine zweite Ginsengfraktion gemäß der Erfindung weist einen Kohlenhydratgehalt auf, welcher etwa 3-8 mol% Rhamnose, etwa 36-44 mol% Galacturonsäure, etwa 2-7 mol% Glucose, etwa 25-33 mol% Galactose und etwa 17-25 mol% Arabinose umfasst. Bevorzugt umfasst der Kohlenhydratgehalt etwa 4-7 mol% Rhamnose, etwa 37-42 mol% Galcturonsäure, etwa 3-6 mol% Glucose, etwa 27-32 mol% Galactose und etwa 19-24 mol% Arabinose. Am stärksten bevorzugt umfasst der Kohlenhydratgehalt etwa 5 mol% Rhamnose, etwa 39 mol% Galacturonsäure, etwa 4 mol% Glucose, etwa 29 mol% Galactose und etwa 21 mol% Arabinose.
Eine dritte Ginsengfraktion gemäß der Erfindung weist einen Kohlenhydratgehalt auf, welcher etwa 0,5-5 mol% Rhamnose, etwa 11-22 mol% Galacturonsäure, etwa 40-60 mol% Glucose, etwa 10-19 mol% Galactose und etwa 11-19 mol% Arabinose umfasst. Bevorzugt umfasst der Kohlenhydratgehalt etwa 1-3 mol% Rhamnose, etwa 13-20 mol% Galacturonsäure, etwa 42-57 mol% Glucose, etwa 12-17 mol% Galactose und etwa 13-17 mol% Arabinose.
Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine beliebige Ginsengfraktion gemäß der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen. Ein Fachmann ist mit einem beliebigen pharmazeutischen Träger, welcher in dieser Hinsicht geeignet ist, vertraut, und daher wird das Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen gemäß der Erfindung nicht ausführlich erörtert. Geeigneterweise können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von Tabletten, Kapseln, Flüssigkeiten, Lutschtabletten, Lotionen oder Zäpfchen vorliegen.
Die Erfindung umfasst die Verwendung einer Ginsengfraktion gemäß der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung eines Zustands geeignet ist, welcher durch Immunschwäche wie z.B. Erkältung, Grippe, chronischem Erschöpfungssyndrom, Aids und Krebs charakterisiert ist. Die Ginsengfraktion kann allein oder in Kombination mit einem weiteren Arzneimittel verwendet werden. Die Ginsengfraktionen der Erfindung sind für die gleichzeitige Verabreichung mit einem Chemotherapeutikum oder als Präparat zur Strahlentherapie besonders geeignet, da bekannt ist, dass Krebspatienten eine beträchtliche Unterdrückung des Immunsystems aufweisen.
Die Erfindung beschreibt auch ein Verfahren zur Behandlung eines Zustandes bei einem Patienten, welcher durch Immunschwäche charakterisiert ist, umfassend die Verabreichung einer zur Behandlung des Zustandes wirksamen Menge einer Ginsengfraktion gemäß der Erfindung an den Patienten. Bevorzugt ist der Zustand ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Erkältung, Grippe, chronischem Erschöpfungssyndrom, AIDS und Krebs. Dosierungen von Ginsengfraktionen gemäß der Erfindung hängen von dem bestimmten zu behandelnden Zustand sowie dem Alter, Geschlecht und dem allgemeinen gesundheitlichen Zustand des Patienten ab. Geeignete Dosierungen können jedoch im Bereich zwischen 1 und 5000 mg/kg Körpergewicht pro Tag in Tagesdosen zwischen 1 und 10 liegen. Die Ginsengfraktionen können oral, mittels Injektion oder Infusion, topisch, nasal, ocular, vaginal oder rectal verabreicht werden.
Die Erfindung wird nunmehr durch die folgenden Beispiele weiterhin erläutert.
Beispiel 1: Erstes Verfahren zur Herstellung von Fraktion CVT-E002 und Reinigen dieser Fraktion
Amerikanische Ginsengwurzel wurde chemisch extrahiert und gereinigt, um nacheinander Fraktionen CVT-E001 und CVT-E002 zu ergeben. Eine Menge von CVT-E002 wurde weiterhin gereinigt, um Fraktionen G₁, G₂ und G₃ zu ergeben. Die ausführliche Beschreibung der Methode ist wie folgt. 500 Gramm getrocknete Bodenwurzel wurden mit 4 Liter 85% Ethanol oder 3 Liter 90% Methanol auf einem Wasserbad bei 80-85 °C unter Rühren für 3 Stunden extrahiert und filtriert, um eine Alkohollösung und einen Rückstand zu ergeben. Die Alkohollösung wurde konzentriert und sprühgetrocknet, um ein Produkt von Gesamtsaponinen (CVT-E001) zu ergeben. Der Rückstand wurde mit 4 Litern Wasser auf einem Wasserbad bei 95-100 °C unter Rühren für 3 Stunden extrahiert. Der Extrakt wurde über einen Muslinbeutel filtriert und zentrifugiert, um eine wässrige Lösung zu ergeben, die CVT-E002 enthält, und der verbleibende Rückstand wurde verworfen.
Ein Teil der wässrigen Lösung wurde zur weiteren Reinigung verwendet, und ein gleiches Volumen von 95% Ethanol wurde zu der wässrigen Lösung hinzugefügt, was zur Ausfällung führte. Das Präzipitat wurde zentrifugiert und gefriergetrocknet, um die Fraktion G, zu ergeben. Das Volumen des Übestandes wurde durch Eindampfen vermindert. Ein gleiches Volumen von 95% Ethanol wurde zu dem nächsten Präzipitat, G₂, hinzugefügt, und der verbleibende Überstand wurde mit Ethanol entfernt und gefriergetrocknet, um ein Pulver G₃ herzustellen.
Die weitere Reinigung von G₂ wurde wie folgt durchgeführt. Zwei Gramm G₂ wurden in 80 ml Wasser gelöst und in einem Sigma D-7884-Dialyserohr mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 1200 gegen 3 Volumina Wasser dialysiert. Die Dialyse wurde bei 4 °C für 72 Stunden durchgeführt, wobei Dialysat alle 24 Stunden zweimal gesammelt wurde. Das sich ergebende Dialysat wurde auf 15 ml konzentriert und anschließend mit einem gleichen. Volumen an Methanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde in Wasser gelöst und gefriergetrocknet, um ein Pulver G₂₂ zu ergeben.
Die weitere Reinigung von G₂₂ wurde wie folgt durchgeführt. 1,5 Gramm G₂₂ wurden in 60 ml Wasser gelöst und anschließend in einen Fisher Spectral/Pormembranrohr mit Löchern in Molekülgröße mit einem Ausschlussmolekulargewicht von 1000 bei 4 °C gegen 600 ml Wasser dialysiert. Das erste Dialysat, welches nach 24 Stunden gesammelt wurde, wurde unter Verwendung eines Verdampfungsapparates auf 15 ml konzentriert und anschließend gefriergetrocknet. Das sich ergebende getrocknete Pulver wurde als G₂₂₁ bezeichnet. Auf ähnliche Art und Weise wurde ein zweiter Dialysatansatz nach 48 Stunden gesammelt und als G₂₂₂ bezeichnet. Der zurückgehaltene Anteil wurde konzentriert und gefriergetrocknet, um ein Pulver zu ergeben, welches als G₂₂₃ bezeichnet wurde.
Beispiel 2: Zweites Verfahren zur Herstellung von Fraktion CVT-E002 und Reinigen dieser Fraktion
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von Ginsengfraktion CVT-E002 gemäß der Erfindung ist wie folgt.
1000 g getrocknete Bodenwurzel von Amerikanischem Ginseng wurden mit 8 Litern 85% Ethanol auf einem Wasserbad bei 95-100 °C extrahiert, während 3 Stunden gerührt und filtriert, um eine Alkohollösung und einen Rückstand zu ergeben. Der Rückstand wurde mit Wasser (1:8) auf einem heißen Wasserbad unter kontinuierlichem Rühren für 3 Stunden vereinigt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch filtriert. Das Filtrat wurde bei 5000 UpM für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde konzentriert und gefriergetrocknet, um Extrakt CVT-E002 zu ergeben. Die Menge an CVT-E002, die durch dieses Verfahren hergestellt wurde, ist etwa die gleiche Menge wie gemäß Beispiel 1 hergestellt, d.h. etwa 10% des Gewichts des ursprünglichen Rohginsengs.
Ein Teil von CVT-E002 wurde wie folgt weiter fraktioniert. 1600 ml 95% Ethanol wurde zu einer Lösung von 100 g CVT-E002-Pulver in 2000 ml Wasser hinzugefügt. Das Präzipitat wurde als PQ, isoliert. Der Überstand wurde auf 500 ml konzentriert. Ein weiterer Teil von 95% Ethanol (1000 ml) wurde zu dieser konzentrierten Lösung wiederum hinzugefügt, um eine zweite Präzipitatfraktion zu ergeben. Das Präzipitat wurde isoliert und gefriergetrocknet, um Fraktion PQ₂ zu ergeben. Der Überstand wurde konzentriert und gefriergetrocknet, um PQ₃ zu ergeben.
Beispiel 3: Mitose-auslösender Aktivitätstest
Verschiedene Fraktionen von Amerikanischem Ginseng mit verschiedenen Reinigungsgraden wurden durch Durchmustern auf Grundlage ihrer Mitoseauslösenden Aktivität von Lymphozyten in vitro ausgewählt. Obwohl Mitogenizität in Bezug auf die normalen Vorgänge, die in vivo im Immunsystem auftreten, eher als künstlicher Vorgang betrachtet wird, stellen Mitogene gute Anzeichen für mögliche Effektorfunktion dar.
Das Testverfahren für Mitose-auslösende Aktivität wird wie folgt beschrieben: Balb/C- oder C57B1/6J-Mäuse wurden für den Test verwendet. Balb/C-Mäuse wurden von der Health Sciences Laboratory Animal Services-Einrichtung (University of Alberta, Edmonton, Kanada) erhalten. C57B1/6J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Mäuse in einem Alter von 7-10 Wochen wurden für jeden Versuch nach Alter und Geschlecht eingeteilt. Mäuse wurden durch Genickbruch getötet. Die Milz wurde unter Verwendung aseptischer Methoden entfernt und zwischen den vereisten Enden von zwei Glasobjektträgern zerkleinert. Nach Waschen durch Zentrifugation in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) wurden die Zellen in RPMI 1640-Medium mit einem pH-Wert von 7,4 (Gibco, Grand Island, N.Y.) suspendiert, welches 10% fetales Rinderserum (Flow Labs), 50 mM Mercaptoethanol (ICN Pharmaceuticals, Plainview, N.Y.), und Penicillin-Streptomycin (Gibco) enthält. Kulturen wurden in dreifacher Ausführung in Linbro-Platten mit 96 Vertiefungen und flachem Boden mit 1,25 × 10⁶ Zellen pro ml Endkonzentration angeordnet. Versuchsgruppen wurden mit Versuchsfraktionen angeordnet, welche zuvor mittels Filter sterilisiert und in HBSS gelöst wurden. Kontrollkulturen bestanden aus einer Gruppe ohne Mitogen und Gruppen mit 20 μg/ml Phytohemagglutinin (PHA) oder 25 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS). Es ist bekannt, dass PHA die T-Art von Milzzellen spezifisch stimuliert, während LPS die B-Art von Milzzellen stimuliert. Die Kulturen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre für 72 Stunden inkubiert. Vier Stunden vor Ende der 72-stündigen Inkubation wurde 1 μCi von Tritium-markiertem Thymidin (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Zellen wurden mit einer automatisierten Probenerntemaschine (Skatron, Virginia) geerntet und anschließend wurde die eingebaute Radioaktivität mittels Szintillationsauszählung untersucht. Die Ergebnisse wurden als % Kontrolle berechnet (mittlere ± Standardabweichung, in dreifacher Ausführung).
Die unterschiedlichen Extraktionsbedingungen, die in Beispiel 1 und 2 gezeigt sind, wie z.B. Konzentration von CVT-E002 in Wasser und das Volumen an Ethanol, welches für die Ausfällung verwendet wurde, beeinträchtigen die weitere Fraktionierung des CVT-E002. Die aus diesen zwei Verfahren erhaltenen Produkte wurden auf ihre Mitose-auslösende Aktivität hin verglichen. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen gezeigt. Jeder Test wurde mit drei Ansätzen in dreifacher Ausführung durchgeführt.
Tabelle 1. Mitose-auslösende Aktivität von G₁, G₂ und G₃, die aus dem Verfahren gemäß Beispiel 1 erhalten wurden
Tabelle 2. Mitose-auslösende Aktivität von PQ₁, PQ₂ und PQ₃, die aus dem Verfahren gemäß Beispiel 2 erhalten wurden
Wie Tabellen 1 und 2 anzeigen, entspricht die Änderung des Extraktionsverfahrens zwischen Beispielen 1 und 2 dem Übergang der biologischen Aktivität von der G₁-Fraktion zur PQ₂-Fraktion.
Beispiel 4: Fraktionierung von PQ₂ und ein Verfahren zur Herstellung von Fraktion PQ₂₂₃
CVT-E002, PQ₁, PQ₂ und PQ₃ gemäß Beispiel 2 wurden weiterhin gemäß ihrer Molekulargewichtsverteilung mittels Gelfiltrationschromatographie über einer HiPrep 16/60 Sephacryl S-200-Säule mit Hochauflösung (Phamacia Biotech, Kat. Nr. 17-1166-01), welche eine Matrix aus einem kugelförmigen vernetzten Copolymer von Allyldextran und N,N'-Methylenbisacrylamid, ein Bett mit einem Ausmaß von 16 × 600 mm, ein Bettvolumen von 120 ml und einen Fraktionierungsbereich für globuläre Proteine (MW) von 5000 bis 250000 und für Dextrane von 1000 bis 80.000 aufweist. Dextranproben (MW = 71,4 k, 37,5 k, 19,5 k und 9,5 k) wurden von Sigma bezogen und wurden als Standardproben verwendet. 5 mg jeder Probe wurde in 1 ml Wasser gelöst, auf die Säule geladen und mit Tris-HCl-Puffer, der 0,1 N HCl 0,3 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthält, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min und einer Umgebungstemperatur von 4 °C, eluiert. Eluatvolumen wurde als Anzahl einzelner 5 ml-Anteile gesammelt.
Gesamtkohlenhydratgehalt jedes einzelnen Anteils des Eluates wurde mit einem Mikrotiterplatten-Assay auf Gesamtkohlenhydratgehalt untersucht. Dies ist eine Modifizierung eines in Dubois et al. Anal. Chem. 28 350-56 (1956) beschrieben Verfahrens. Die Gesamtkohlenhydrate in dem Eluat wurden derivatisiert, damit sie bei einem bestimmten Extinktionsspektrum detektierbar sind. D-Glucose wurde als Standardprobe verwendet, und andere verwendete Materialien waren konzentrierte Schwefelsäure (98%) und 5% Phenol. Die Polystyrolmikrotiterplatten wurden von SARSTDT (Quebec, Kanada) bezogen. In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurde 40 μl einer Standardprobenlösung, die 1 bis 10 μg D-Glucose enthält, aufgebracht, und 40 μl 5% Phenol wurde hinzugefügt und gemischt. 200 μl konzentrierter Schwefelsäure wurde anschließend vorsichtig hinzugefügt. Nach Mischen von Reagenz mit dem einzelnen Anteil des Eluats mit einer Mehrkanalpipette wurde die Platte bei 80 °C für 1 Stunde inkubiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Extinktion der Probe bei 492 nm auf einem Multiskan-Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen. Die Daten wurden gespeichert und die Gelfiltrationschromatographie-Ergebnisse wurden unter Verwendung des Microsoft Excel Programms aufgetragen.
Eine Standardkurve wurde erzeugt, indem man eine Reihe von Standarddextranen (Sigma) mit bekannten Molekulargewichten über dieselbe Säule laufen ließ (1). Die Chromatogramme für CVT-E002 und Chargen 21 von PQ₁, PQ₂ und PQ₃ sind in 2-5 gezeigt. In jeder Figur zeigen die Punkte auf der X-Achse das Elutionsvolumen im Hinblick auf ein Fünftel des tatsächlichen Volumens. Um den tatsächlichen Wert des Elutionsvolumens zu erhalten, mussten die Ergebnisse in den Figuren daher mit Fünf multipliziert werden.
Das Gelfiltrationschromatogramm von CVT-E002 (2) zeigte im Wesentlichen drei Peaks. Das Molekulargewicht für den ersten Peak (Elutionsfraktion 7-10) wurde gemäß der Standardkurve auf 70000 oder höher geschätzt (1). Das Molekulargewicht für den dritten Peak (Elutionsfraktion 18-22) wurde auf etwa 1000 geschätzt. Ein kleiner breiter zweiter Peak (Elutionsfraktion 10-17) wurde auch beobachtet. Das Verhältnis dieser drei Peaks betrug 57,2:8,5:34,4.
Das Chromatogramm von PQ, (3) zeigte einen Hauptpeak (Elutionsfraktion 7-10), welcher der Fraktion von CVT-E002 mit hohem Molekulargewicht entspricht, und einen Nebenpeak (Elutionsfraktion 18-21). Das Verhältnis der zwei Peaks betrug 86,8:13,2.
Das Chromatogramm von PQ₂ (4) zeigte drei Hauptpeaks. Der mit A bezeichnete Peak (Elutionsfraktion 7-10) und der mit C bezeichnete Peak (Elutionsfraktion 19-22) entspricht den zwei Hauptpeaks von CVT-E002. Ein weiterer breiter Peak, als B bezeichnet (Elutionsfraktion 10-17) wurde zwischen Peaks A und C beobachtet. Das Molekulargewicht für diesen Peak wurde auf etwa 2000 bis etwa 60000 geschätzt. Das Verhältnis der drei Peaks A bis C betrug 34,1:45,7:20,3. Ein Bereich kleiner Peaks, als D bezeichnet (Elutionsfraktion 24-50, ein Teil davon, welcher in 4 gezeigt ist) wurde auch beobachtet.
Der Chromatograph von PQ₃ (5) zeigte nur einen Hauptpeak (Elutionsfraktion 18-21), welcher der Fraktion von CVT-E002 mit niedrigem Molekulargewicht entsprach.
Fraktione A, B, C und D von PQ₂ wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Die getrockneten Pulver wurden wiederum als PQ₂A, PQ₂B, PQ₂C bzw. PQ₂D bezeichnet. Fraktionen A und B wurden auch vereinigt, und die vereinigte Fraktion wurde PQ₂₂₃ genannt (ein Chromatograph, welcher in 6 gezeigt ist). Die Mitose-auslösende Aktivität von PQ₂A, PQ₂B, PQ₂C und PQ₂D wurde untersucht und mit der Aktivität von Fraktionen PQ₂₂₃, PQ₂ und CVT-E002 verglichen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle 3. Mitose-auslösende Aktivität von Amerikanischen Ginsengfraktionen (³H-Thymidin-Einbau als % Kontrolle)
Wie die Ergebnisse anzeigen, ist die Reihenfolge der Wirksamkeit PQ₂₂₃ > PQ₂ > CVT-E002.
Beispiel 5: Chemische Bestimmung der Gesamtkohlenhydrat- und Proteinzusammensetzung von CVT-E002, PQ₁, PQ₂, PQ₃ und PQ₂₂₃
Drei Ansätze von jeder Fraktion CVT-E002, PQ₁, PQ₂, PQ₃ und PQ₂₂₃ wurden erhalten, und die Gesamtkohlenhydrat- und Proteinzusammensetzung wurden in jeder Fraktion gemessen. Der Gesamtkohlenhydrat wurde durch das Phenol/Schwefelverfahren, wie im Fachbereich bekannt, bestimmt. Der Proteingehalt wurde durch das Lowry-Verfahren, wie im Fachbereich bekannt, bestimmt und Rinderserumalbumin wurde als Standard verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.
Tabelle 4. Vergleich von Protein- und Kohlenhydratgehalt der Fraktionen
Beispiel 6: Chemische Bestimmung der Monosaccharidzusammensetzung von CVT-E002, PQ₁, PQ₂ und PQ₂₂₃
Da der Gesamtkohlenhydrat hauptsächlich die Menge von Polysacchariden und Oligosacchariden darstellt, wurden für bestimmte Fraktionen auch die Molverhältnisse von Monosacchariden bestimmt.
Ansätze von Fraktionen CVT-E002, PQ₁, PQ₂ und PQ₂₂₃ wurden säurekatalysierter Hydrolyse unterzogen, um ihre strukturellen Einheiten, Monosaccharide, freizusetzen. Eine qualitative und quantitative Analyse der freigesetzten Monosaccharide wurde durch HPLC durchgeführt, nachdem sie mit MPP (3-Methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-on) derivatisiert wurden. Die ausführlichen Verfahren sind wie folgt beschrieben: Eine Probelösung in 2 N HCl wurde bei 95-100 °C für 6 h erwärmt. Das Gemisch wurde mit NaOH-Lösung neutralisiert. Ein innerer Standard wurde hinzugefügt. McOH- und wässrige NaOH-Lösung (0,3 N) wurden anschließend zu diesem Gemisch hinzugefügt. Das Gemisch wurde anschließend bei 50-60 °C für 8 hr (oder bei Raumtemperatur für eine Woche) gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser verdünnt (1:10) und durch HPLC analysiert. Die MPP-derivatisierten Proben wurden mit einer C-18-Säule mit einem Elutionsmittel von 18% Acetonitril in 0,1 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7) mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min und einem UV-Detektor bei 245 nm analysiert. Die folgende Tabelle zeigt das Molverhältnis von Monosacchariden CVT-E002, PQ₁, PQ₂ und PQ₂₂₃. Spurenmengen von Glucuronsäure wurden in einigen CVT-E002-, PQ₁-, und PQ₂-Proben nachgewiesen.
Tabelle 5. Monosaccharidzusammensetzung von CVT-E002, PQ₁, PQ₂ und PQ₂₂₃ (% in mol)
Wie das Ergebnis anzeigt, ist die Reihenfolge des Glucosegehalts wie folgt: PQ1 > CVT-E002 > PQ2 > PQ3; und der Gehalt der Galacturonsäure ist wie folgt: PQ2 > PQ223 > CVT-E002 > PQ1.
Beispiel 7: Immunregulation von Ginsengfraktionen
1. Makrophagenaktivität
Die Wirkungen von CVT-E002, PQ₂, G₂ und PQ₂₂₃ auf murine Makrophagen wurden in vitro unter Verwendung peritonealer Exsudatmakrophagen aus C57B1/6-Mäusen untersucht, welche bevorzugt eine zellvermittelte Reaktion bewirken und aus Balb/c-Mäusen, welche bevorzugt eine Antikörper-vermittelte Reaktion bewirken. IL-1-, IL-6- und TNF-α-Produktion wurde nach Stimulation von Makrophagen mit 100 μg/ml Testproben gemessen. Die Verfahren sind wie folgt beschrieben.
A. Präparation von Makrophagen aus peritonealen Exsudatzellen und Zellüberstand.

1). 1 ml 3% Thioglycollat wurde in die murine Bauchfellhöhle injiziert und peritoneale Exsudatmakrophagen wurden nach 3 Tagen aus der Bauchfellhöhle geerntet.
2). Zellsuspension wurde zweimal mit Hanks-Puffer durch Zentrifugation bei 1100 UpM bei 4 °C für 5 min gewaschen.
3). Makrophagen wurden in RPMI-10% FBS-Medium suspendiert.
4). Zellen wurden gezählt und mit RPMI-10% FBC-Medium auf eine Endkonzentration von 10⁶/ml verdünnt.
5). Makrophagen wurden in 10 × 10⁶/10 ml RPMI-10% FBS bei 37 °C für 2 Stunden kultiviert. Der Überstand wurde verworfen und die ausgefällten Makrophagen wurden zweimal mit 10 ml PBS gewaschen.
6). Makrophagen wurden geerntet und in RPMI-10% FBS resuspendiert.
7). Makrophagen (5 × 10⁵) wurden mit 10 mg/ml LPS oder 100 mg/ml Testprobe für 24 oder 48 Stunden kultiviert, und anschließend wurden die Überstände gesammelt und für den Bioassay mittels Filter sterilisiert (IL-1, IL-6 und TNF-α). Versuche wurden in dreifacher Ausführung ausgeführt.

B. Die IL-1-Bestimmung im Überstand.
Die NOB1-Zelllinie ist eine TK-Variante der EL4-Zelllinie, die CTLL-wachstumsstimulierende Aktivität (IL-2) in Reaktion auf IL-1 erzeugt. Da NOB1-Zellen ³HTdR nicht einbauen, kann eine Reaktion auf IL-1 im Hinblick auf die Aufnahme durch die CTLL-Linie gemessen werden. Das Verfahren ist wie folgt beschrieben.

1). 10⁴ CTLL-Zellen wurden mit 4 × 10⁴ NOB1-Zellen in 200 μl 5% FBS in IMDM in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden vereinigt. Seriell verdünnte IL-1-Testproben von 4-, 8-, 16- oder 32-fachen Serienverdünnungen von IL-1-Standards wurden aufgebracht. Das Endvolumen in jeder Vertiefung betrug 200 μl. Jede Probe wurde in dreifacher Ausführung präpariert.
2). Platten wurden für 24 hr in einem 5% CO₂-befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubiert.
3). [³H]-Thymidin wurde für die letzten 5 hr der Inkubation hinzugefügt.
4). Zellen wurden geerntet und [³H]-Thymidin-Einbau wurde mittels Flüssigszintillationsauszählen gemessen.
5). IL-1-Konzentration wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.

Tabelle 6. Wirkung von Ginsengfraktionen auf IL-1-Produktion durch murine Makrophagen
Die Ergebnisse zeigen, dass CVT-E002, PQ₂, G₂ und PQ₂₂₃ Makrophagen von C57B1/6-Mäusen zur Produktion von IL-1 signifikant stimulierten. Alle Testproben zeigten eine ähnliche Wirksamkeit der stimulierenden IL-1-Produktion.
C. Bestimmung von IL-6
Die Proliferation einer murinen B-Zell-Hybridom-Zellinie, B9, ist von IL-6 abhängig. B9-Zellen wurden in einer Reihe von Mikrovertiefungen kultiviert, die Testproben in abnehmender Konzentration enthielten. Das Verfahren ist wie folgt.

1). Die Anzahl von B9-Zellen in einer Teilmenge, die aus dem Kolben mit Stammkultur entnommen wurde, wurde an der Log-Phase des Wachstums ausgezählt.
2). Die Zellen wurden für 5 min in einer Tabletop-Zentrifuge bei 180 × g, 4 °C zentrifugiert, und das Pellet wurde in 10 ml vollständigem RPMI-10-Medium resuspendiert. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt und die Zellen wurden in vollständigem RPMI-10-Medium mit 2 × 10³ Zellen/ml resuspendiert.
3). 100 μl gewaschene Zellen (2 × 10³ Zellen/ml) wurden zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen hinzugefügt.
4). 100 μl von zweifachen Serienverdünnungen der Testproben wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt, wobei 2 oder 3 Reihen der Platte für IL-6-Standards vorbehalten wurden.
5). Die Platten wurden für 72 hr in einem befeuchteten 5% CO₂-Inkubator bei 37 °C inkubiert.
6). [³H]-Thymidin wurde hinzugefügt und die Platten wurden für 4 Stunden bei 37 °C inkubiert.
7). Die Zellen wurden geerntet und [³H]-Thymidineinbau wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers bestimmt.
8). IL-6-Konzentration wurde berechnet. Die Ergebnisse sind wie in der folgenden Tabelle gezeigt.

Tabelle 7. Wirkung von Ginseng auf die IL-6-Produktion durch murine Makrophagen
CVT-E002, PQ₂, und PQ₂₂₃ steigerten die Produktion von IL-6 im Überstand von Makrophagen von C57B1/6- und Balb/c-Mäusen. Die Wirksamkeit beträgt PQ₂₂₃ > PQ₂ > CVT-E002.
D. Messung von TNF-α
Das folgende Protokoll setzte TNF-empfindliche, Actinomycin D-behandelte murine L929-Fibroblasten zur Quantifizierung der TNF-Aktivität in Überständen, die von Zellkulturen abstammten, ein.

1). 4 × 10⁴ L292-Zellen in 50 μl IMDM-5% FSC wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt.
2). 50 μl Testprobe wurde zu der zweiten Vertiefung jeder Reihe hinzugefügt (Säule 2). Zweifache Serien Verdünnungen wurden durch vorsichtiges Mischen des Inhalts von Vertiefung 2 und Überführen von 50 μl von Vertiefung 2 in Vertiefung 3 hergestellt. Der Inhalt von Vertiefung 3 wurden vorsichtig gemischt, und 50 μl von Vertiefung 3 wurde in Vertiefung 4 überführt. Diese Methode wurde bis Vertiefung 12 fortgeführt. Schließlich wurde der Inhalt aller Vertiefungen in Säule 12 vorsichtig gemischt und 50 μl wurde aus jeder Vertiefung verworfen. Zu diesem Zeitpunkt enthielten alle Vertiefungen 50 μl.
3). 50 μl Aktinomycin D-Lösung wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt (2 μl ml).
4). Die Platten wurden für 24 Stunden bei 37 °C in 5% CO₂ an der Luft inkubiert.
5). 5 μl Neutral Red wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platten wurden für 2,5 Stunden inkubiert.
6). Alle Überstände in jeder Vertiefung wurden schnell und vorsichtig gespült und geleert, und die Platten wurden zweimal mit 200 μl PBS gewaschen.
7). Das PBS wurde abgezogen und 100 μl 50% Ethanol in 0,05 M NaH₂PO₄ wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt und für 5 min bei Raumtemperatur geschüttelt.
8). Jede Vertiefung wurde unmittelbar mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei einer Extinktion von 570 nm abgelesen.
9). TNF-α-Konzentration wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt.

Tabelle B. Wirkung von Ginseng auf TNF-α-Produktion durch murine Makrophagen
TNF-α-Produktion wurde durch CVT-E002 und PQ₂₂₃ im Überstand von Makrophagen aus Balb/c- oder C57B1/6-Zelllinien induziert. TNF-α im Überstand von Makrophagen aus Balb/c-Mäusen wurde durch G₂ signifikant stimuliert. PQ₂ schien die TNF-α-Produktion durch Makrophagen nicht zu stimulieren.
2. Serumimmunglobulin-Produktion
Serumimmunglobulin-Produktion (Gesamt-IgG) stieg im Vergleich zu Mäusen, denen Wasser verabreicht wurde, um 21 % bei Mäusen, denen CVT-E002 verabreicht wurde, um 26% bei Mäusen, denen PQ₂ verabreicht wurde und um 31 % bei Mäusen, denen PQ₂₂₃ verabreicht wurde, an. Die Wirksamkeit beträgt PQ223 > PQ2 > CVT-E002. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 10. In vivo-Immunglobulinproduktion durch Mäuse (n = 15)
3. Spezifität von Mitose-auslösender Aktivität von PQ₂₂₃
Bekannte Mitogene wie z.B. PHA oder LPS sind im Hinblick auf die Zellart, die sie stimulieren, spezifisch. Es ist von Bedeutung, zu wissen, welche spezifische Milzzellarten durch Ginsengfraktionen stimuliert werden. Wir haben daher die T-Zellen mit einer Affinitätssäule abgetrennt und durch T-Zell-Abreicherung an B-Zellen angereichert.
A. T-Zeli-Anreicherung
Eine einzelne Zellsuspension von Milzzellen wurde auf Lymphozyt-M (Cedarlane Labs) beschichtet, um rote Blutkörperchen zu entfernen. Die Lymphozyten wurden anschließend über eine Affinitätschromatographiesäule (Biotex Co. Ltd., Edmonton, Alberta) geführt, welche B-Zellen durch Haftung an mit Mausimmunglobulin-beschichtete Kügelchen entfernt. Das Elutionsmittel bestand aus einer angereicherten Population von T-Zellen. Bestimmung des prozentualen Anteils von T-Zellen im Verhältnis zu anderen Zellarten wurde durch einen Wachstumsfähigkeitstest unter Verwendung von Anti-thy 1,2 monoklonalem Antikörper und Komplementbehandlung durchgeführt.
B. B-Zell-Anreicherung
Nach Entfernung von roten Blutkörperchen aus der Milzzelpopulation wurden die Lymphozyten für eine Stunde bei 37 °C mit monoklonalem Anti-thy 1,2-Antikörper inkubiert. Kaninchenkomplement mit niedriger Toxizität wurde anschließend hinzugefügt und für eine halbe Stunde bei 4 °C inkubiert. Das Verfahren reicherte die Zellsuspension von T-Zellen ab, was zu einer angereicherten B-Zell-Population führt.
C. Kultivieren mit PQ₂₂₃
B- oder T-Zellen wurden mit variierenden Dosen von PQ₂₂₃ kultiviert, und die Reaktionen wurden bezüglich Tritium-markiertem Thymidin-Einbau gemessen. 7 und 8 zeigen die Proliferationswirkung von PQ₂₂₃ auf verhältnismäßig gereinigte B- bzw. T-Zelien. Kontrollgruppen umfassten Zellen, die mit LPS, einem B-Zell-spezifischen Mitogen, und mit PHA, einem T-Zell-spezifischen Mitogen behandelt wurden. Es wurde nachgewiesen, dass PQ₂₂₃ B-Zellspezifisch war. (siehe 9).
4. Wirkung von PQ₂₂₃ auf Antikörper-Produktion in vitro
Milzzellen wurden für 72 Stunden in Gegenwart variierender Dosen von PQ₂₂₃ kultiviert. Kontrollkulturen bestanden aus einer Gruppe, zu welcher 25 μg LPS hinzugefügt wurde sowie einer weiteren Gruppe, zu welcher kein Mitogen hinzugefügt wurde. Die Überstände wurden auf das Vorliegen von löslichen Immunglobulinen unter Verwendung des Enzymgekoppelten Immunadsorptionstests (ELISA) untersucht. Der Überstand, der lösliche Immunglobuline enthielt, wurde seriell in 0,1 M Tris-Puffer (pH 9) verdünnt. Mikrotiterplatten wurden mit diesem Überstand beschichtet und bei 4 °C über Nacht inkubiert. Die Platten wurden mit PBS-Tween dreimal gewaschen, anschließend wurde 100 μl des Antikörper-Enzym-Konjugates Goat F (ab')2 Anti-Maus-Ig-Meerrettichperoxidase (Tago Inc., Burlingame California) mit einer 1:1000-Verdünnung hinzugefügt. Die Platte wurde für eine Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde wiederum dreimal mit PBS gewaschen, anschließend wurden 100 μl von ABTS-Peroxidasesubstrat (Kirkegaard und Perry Lab Inc.) zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Eine Stunde später wurde Extinktion bei einer Wellenlänge von 405 nm mittels eines Flow Multiscan ELISA-Lesegerätes gemessen.
10 zeigt, dass 50 μg/ml PQ₂₂₃ die Produktion von Immunglobulinen im Vergleich zu derjenigen von 25 μg LPS stimulierte. Eine höhere Konzentration von PQ₂₂₃, 500 μg/ml löste kein höheres Maß an Antikörperproduktion aus. Diese Dosis-Reaktions-Kurve steht mit den proliferativen Reaktionen von heterogener Milzzellpopulation und gereinigten B-Zellen in Übereinstimmung. Diese Ergebnisse beruhen auf vier Versuchen.
5. In vivo Anitkörperplaque-bildende Zellen
Drei Konzentrationen von PQ₂₂₃ wurden i.v. an drei Gruppen von jeweils 3 Mäusen injiziert. Einer Kontrollgruppe wurde eine ausgewogene Salzlösung injiziert. Am Ende von 7 Tagen intravenöser Behandlungen mit PQ₂₂₃ wurden die Mäuse mit 0,2 ml einer 10% SRBC-Suspension in HBSS immunisiert. Fünf Tage nach Immunisierung wurden die Mäuse getötet und einzelne Zellsuspensionen aus der Milz wurden präpariert und auf 4 × 106 Zellen pro ml eingestellt. Eine Teilmenge von 0,1 ml dieser Zellsuspension wurde mit 0,3 ml einer 10% SRBC-Lösung von Mehrschweinschenkomplement und 0,5 ml RPMI-Medium gemischt. Siebzig Mikroliter dieses Gemisches wurde in eine Cunningham-Kammer überführt. Die Kammer wurde mit Paraplastwachs abgedichtet und bei 37 °C für eine Stunde vor dem Auszählen von Plaquebildenden Zellen inkubiert. Alle PFC-Spiegel werden als eine Million Milzzellen ausgedrückt. 11 zeigt, dass alle drei Dosen die Antikörperproduktion in Mäusen, denen die Verbindung injiziert wurde, signifikant steigerte.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen an, dass die Ginsengfraktionen der Erfindung Makrophagen zur Herstellung von Zytokinen, wie z.B. IL-1, IL-6 und TNF-α aktivieren. Sie aktivieren auch Lymphozyten, insbesondere B-Lymphozyten-Proliferation und Antikörperproduktion. Das gesamte humoral vermittelte Immunsystem wurde stimuliert, was auf präventive Wirkungen auf Infektion hindeutet. Die Wirkung der TNF-α-Produktion, über die berichtet wurde, umfasst antivirale und antitumorale Vorteile. Es ist auch berichtet worden, dass TNF-α bei der Behandlung einer Vielfalt von Parasiteninfektionen von therapeutischem Nutzen ist.
Aus den folgenden Literaturstellen wird im Hintergrund der Erfindung Bezug genommen.

1. Tomoda et al., Biol. Pharm. Bull., 16, 22-5 (1993).
2. Tomoda et al., Biol. Pharm. Bull., 17, 1287-91 (1994).
3. Tomoda et al., Biol. Pharm. Bull., 16, 1087-90 (1993).
4. Gao et al. Planta Medica, 55, 9-12 (1989).
5. Gao et al. Carbohydr. Res., 181, 175-87 (1988).
6. Kiyohara et al. Carbohydr. Res., 263, 89-101 (1994).
7. Shin et al. Carbohydr. Res., 300, 239-49 (1997).
8. Yamada et al. Phytotherapy Res, 9, 264-9 (1995).
9. Konno et al. Planta Medica, 50, 434-6 (1984).
10. Hikino et al., unveröffentlicht
11. Oshima et al. J. Ethnopharmacology, 14, 255-9 (1985).
12. Konno et al. Int. J. Crude Drug Res., 25, 53-6 (1987).
13. Konno et al. J. Ethnopharmacology, 14, 69-74 (1985).
14. Oshima et al. J. Natural Products, 50, 188-90 (1987).
15. Lee et al. Anticancer Res., 17, 323-32 (1997).
16. Kim et al. Planta Medica, 64, 110-5 (1998).
17. Miao et al. Shengwu Huaxue ZaZhi, 9, 610-4 (1993).
18. Ma et al. Baiquien Yike Daxue Xuebao, 23, 236-8 (1997).
19. Zhu et al. Zhongguo Yaolixue Tongbao, 13, 76-8 (1997).

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂, wobei das Verfahren umfasst: (a) Vereinigen von Amerikanischem Ginseng mit einem ersten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von 80-100 °C für eine Zeitdauer von 2-4 Stunden zur Herstellung einer ersten Ginsenglösung; (b) anschließendes Abtrennen der ersten Ginsenglösung zur Herstellung einer Alkohol/Ginsenglösung und eines ersten Ginsengrückstandes; (c) anschließendes Vereinigen des ersten Ginsengrückstandes mit Wasser und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von 80-100 °C für eine Zeitdauer von 2-4 Stunden zur Herstellung einer Lösung des Ginsengrückstandes; (d) anschließendes Abtrennen der Lösung des Ginsengrückstandes zur Herstellung eines zweiten Ginsengrückstandes und einer ersten wässrigen Extraktlösung, welche einen ersten Ginsengextrakt enthält; (e) Bereitstellen einer zweiten wässrigen Extraktlösung, welche mindestens einen Teil des ersten Ginsengextraktes umfasst, wobei in der zweiten wässrigen Extraktlösung das Verhältnis von erstem Ginsengextrakt zu Wasser 1:18 bis 1:22 beträgt; (f) anschließendes Vereinigen der zweiten wässrigen Extraktlösung mit einem zweiten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, wobei das Verhältnis von zweitem Lösungsmittel zu Wasser 1:1 bis 3:5 beträgt, zur Herstellung eines ersten Präzipitates und eines ersten Überstandes; (g) anschließendes Vereinigen des ersten Überstandes, der in Schritt (f) hergestellt wurde, mit einem dritten Lösungsmittel, welches einen Alkohol umfasst, wobei das Verhältnis von drittem Lösungsmittel zu erstem Überstand 3:2 bis 3:1 beträgt, zur Herstellung eines zweiten Präzipitates und eines zweiten Überstandes; und (h) Isolieren des zweiten Präzipitates zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Alkohol in dem ersten Lösungsmittel, dem zweiten Lösungsmittel und dem dritten Lösungsmittel jeweils unabhängig voneinander einen gesättigten oder ungesättigten C₁-C₆-Alkohol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Alkohol in dem ersten Lösungsmittel, dem zweiten Lösungsmittel und dem dritten Lösungsmittel jeweils unabhängig voneinander Ethanol oder Methanol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (e) die zweite wässrige Extraktlösung mindestens einen Teil der ersten wässrigen Extraktlösung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) die sich ergebende Lösung für eine Zeitdauer von 3 Stunden erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) die sich ergebende Lösung für eine Zeitdauer von 3 Stunden erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (e) das Verhältnis von erstem Ginsengextrakt zu Wasser 1:20 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (f) das Verhältnis von zweitem Lösungsmittel zu Wasser 3:4 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (g) das Verhältnis von drittem Lösungsmittel zu erstem Überstand 2:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) das erste Lösungsmittel und der Ginseng in einem Verhältnis von 7-9 ml von erstem Lösungsmittel pro Gramm Ginseng vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (a) das erste Lösungsmittel und der Ginseng in einem Verhältnis von 8 ml von erstem Lösungsmittel pro Gramm Ginseng vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) das Wasser und der erste Ginsengrückstand in einem Verhältnis von 7-9 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt (c) das Wasser und der erste Ginsengrückstand in einem Verhältnis von 8 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand vereinigt werden.
Ginsengfraktion PQ₂, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13.
Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂₂₃, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Ginsengfraktion PQ₂, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13 hergestellt wurde; (b) Fraktionieren der Ginsengfraktion PQ₂ zur Herstellung einer ersten Elutionsfraktion und einer zweiten Elutionsfraktion, wobei die erste Elutionsfraktion einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 35 und 50 ml des Elutionsvolumens beobachtet wurde und die zweite Elutionsfraktion einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 50 und 85 ml des Elutionsvolumens beobachtet wurde, wie durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der folgenden Materialien bestimmt wurde: (1) eine Chromatographiesäule, die eine Matrix aus einem kugelförmigen vernetzten Copolymer von Allyldextran und N,N'-Methylenbisacrylamid enthält, welche ein Bett mit einem Ausmaß von 16 × 600 mm, ein Bettvolumen von 120 ml und einen Fraktionierungsbereich für globuläre Proteine (MG) von 5000 bis 250.000 und für Dextrane von 1000 bis 80.000 aufweist und (2) ein Elutionspuffer von Tris-HCl, der 0,1 N HCl und 0,3 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthält; und (c) Isolieren und Vereinigen der ersten Elutionsfraktion und der zweiten Elutionsfraktion zur Herstellung der Ginsengfraktion PQ₂₂₃.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Ginsengfraktion PQ₂ unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie fraktioniert wird.
Ginsengfraktion PQ₂₂₃, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 15 oder 16.
Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion CVT-E002, wobei das Verfahren umfasst: (a) Vereinigen von Amerikanischem Ginseng mit einem ersten Lösungsmittel, welcher einen Alkohol in einem Verhältnis von etwa 7-9 ml von erstem Lösungsmittel pro Gramm Ginseng umfasst, und Erwärmen der sich ergebenden Lösung bei einer Temperatur von 80-100 °C für eine Zeitdauer von 2-4 Stunden zur Herstellung einer ersten Ginsenglösung; (b) anschließendes Abtrennen der ersten Ginsenglösung zur Herstellung einer Alkohol/Ginsenglösung und eines ersten Ginsengrückstandes; (c) anschließendes Vereinigen des ersten Ginsengrückstandes mit Wasser in einem Verhältnis von 7-9 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand und Erwärmen der Lösung des Ginsengrückstandes bei einer Temperatur von 80-100 °C für eine Zeitdauer von 2-4 Stunden zur Herstellung einer Lösung des Ginsengrückstandes; (d) anschließendes Abtrennen der Lösung des es zur Herstellung eines zweiten Ginsengrückstandes und einer wässrigen Extraktlösung, die einen Ginsengextrakt enthält; und (e) Trocknen oder Konzentrieren der wässrigen Extraktlösung zur Herstellung der Ginsengfraktion CVT-E002.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei in Schritt (a) das erste Lösungsmittel und die Probe in einem Verhältnis von 8 ml von erstem Lösungsmittel pro Gramm Probe vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei in Schritt (c) das Wasser und der erste Ginsengrückstand in einem Verhältnis von 8 ml Wasser pro Gramm Ginsengrückstand vereinigt werden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei in Schritt (a) die erste Ginsenglösung für eine Zeitdauer von 3 Stunden erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei in Schritt (c) die Lösung des Ginsengrückstandes für eine Zeitdauer von 3 Stunden erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Alkohol in dem ersten Lösungsmittel einen gesättigten oder ungesättigten C₁-C₆-Alkohol umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Alkohol in dem ersten Lösungsmittel Ethanol oder Methanol umfasst.
Ginsengfraktion CVT-E002, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 18-24.
Ginsengfraktion mit einem Kohlenhydratgehalt, welcher 2-6 mol% Rhamnose, 41-49 mol% Galacturonsäure, 12-18 mol% Glucose, 16- 22 mol% Galactose und 12-19 mol% Arabinose umfasst.
Ginsengfraktion nach Anspruch 26, wobei der Kohlenhydratgehalt 3-5 mol% Rhamnose, 43-47 mol% Galacturonsäure, 14-16 mol% Glucose, 18-20 mol% Galactose und 14-17 mol% Arabinose umfasst.
Ginsengfraktion nach Anspruch 26, wobei der Kohlenhydratgehalt 4 mol% Rhamnose, 45 mol% Galacturonsäure, 15 mol% Glucose, 19 mol% Galactose und 15 mol% Arabinose umfasst.
Ginsengfraktion mit einem Kohlenhydratgehalt, welcher 3-8 mol% Rhamnose, 36-44 mol% Galacturonsäure, 2-7 mol% Glucose, 25-33 mol% Galactose und 17-25 mol% Arabinose umfasst.
Ginsengfraktion nach Anspruch 29, wobei der Kohlenhydratgehalt 4-7 mol% Rhamnose, 37-42 mol% Galacturonsäure, 3-6 mol% Glucose, 27-32 mol% Galactose und 19-24 mol% Arabinose umfasst.
Ginsengfraktion nach Anspruch 29, wobei der Kohlenhydratgehalt 5 mol% Rhamnose, 39 mol% Galacturonsäure, 4 mol% Glucose, 29 mol% Galactose und 21 mol% Arabinose umfasst.
Ginsengfraktion mit einem Kohlenhydratgehalt, welcher 0,5-5 mol% Rhamnose, 11-22 mol% Galacturonsäure, 40-60 mol% Glucose, 10-19 mol% Galactose und 11-19 mol% Arabinose umfasst.
Ginsengfraktion nach Anspruch 32, wobei der Kohlenhydratgehalt 1-3 mol% Rhamnose, 13-20 mol% Galacturonsäure, 42-57 mol% Glucose, 12-17 mol% Galactose und 13-17 mol% Arabinose umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Ginsengfraktion gemäß einem der Ansprüche 14, 17 oder 25-33 in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Verwendung einer Ginsengfraktion nach einem der Ansprüche 14, 17 oder 25-33 allein oder in Kombination mit einem anderen Arzneimittel zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung eines Zustands geeignet ist, welcher durch Immunschwäche charakterisiert ist.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei der Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erkältung, Grippe, chronischem Erschöpfungssyndrom, AIDS und Krebs.
Verwendung einer Ginsengfraktion nach einem der Ansprüche 14, 17 oder 25-33 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Stimulierung der Produktion von IL-1, IL-6 und/oder TNFα in Zellen geeignet ist.
Verwendung einer Ginsengfraktion nach einem der Ansprüche 14, 17 oder 25-33 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Stimulierung der in vitro- oder in vivo-Produktion von Immunglobulinen geeignet ist.
Verwendung einer Ginsengfraktion nach einem der Ansprüche 14, 17 oder 25-33 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zur Aktivierung von B-Lymphozytenproliferation und Antikörperproduktion davon geeignet ist.
Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂A, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Ginsengfraktion PQ₂, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13 hergestellt wurde; (b) Fraktionieren der Ginsengfraktion PQ₂ zur Herstellung einer Elutionsfraktion, welche einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 35 und 50 ml Elutionsvolumen beobachtet wird, wie durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der folgenden Materialien bestimmt wurde: (1) eine Chromatographiesäule, die eine Matrix aus einem kugelförmigen vernetzten Copolymer von Allyldextran und N,N'-Methylenbisacrylamid enthält, welche ein Bett mit einem Ausmaß von 16 × 600 mm, ein Bettvolumen von 120 ml und einen Fraktionierungsbereich (MW) für globuläre Proteine von 5000 bis 250.000 und für Dextrane von 1000 bis 80.000 aufweist und (2) ein Elutionspuffer von Tris-HCl, der 0,1 N HCl und 0,3 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthält; und (c) Isolieren der Elutionsfraktion zur Herstellung der Ginsengfraktion PQ₂A.
Ginsengfraktion PQ₂A, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 40.
Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂B, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Ginsengfraktion PQ₂, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13 hergestellt wurde; (b) Fraktionieren der Ginsengfraktion PQ₂B zur Herstellung einer Elutionsfraktion, welche einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 50 und 85 ml Elutionsvolumen beobachtet wurde, wie durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der folgenden Materialien bestimmt wurde: (1) eine Chromatographiesäule, die eine Matrix aus einem kugelförmigen vernetzten Copolymer von Allyldextran und N,N'-Methylenbisacrylamid enthält, welche ein Bett mit einem Ausmaß von 16 × 600 mm, ein Bettvolumen von 120 ml und einen Fraktionierungsbereich (MW) für globuläre Proteine von 5000 bis 250.000 und für Dextrane von 1000 bis 80.000 aufweist und (2) ein Elutionspuffer von Tris-HCl, der 0,1 N HCl und 0,3 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthält; und (c) Isolieren der Elutionsfraktion zur Herstellung der Ginsengfraktion PQ₂B.
Ginsengfraktion PQ₂B, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 42.
Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂C, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Ginsengfraktion PQ₂, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13 hergestellt wurde; (b) Fraktionieren der Ginsengfraktion PQ₂ zur Herstellung einer Elutionsfraktion, welche dem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 95 und 110 ml Elutionsvolumen beobachtet wurde, wie durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der folgenden Materialien bestimmt wurde: (1) eine Chromatographiesäule, die eine Matrix, die auf einem kugelförmigen vernetzten Copolymer von Allyldextran und N,N'-Methylenbisacrylamid enthält, welche ein Bett mit einem Ausmaß von 16 × 600 mm, ein Bettvolumen von 120 ml und einen Fraktionierungsbereich (MW) für globuläre Proteine von 5000 bis 250.000 und für Dextrane von 1000 bis 80.000 aufweist und (2) ein Elutionspuffer von Tris-HCl, der 0,1 N HCl und 0,3 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthält; und (c) Isolieren der Elutionsfraktion zur Herstellung der Ginsengfraktion PQ₂C.
Ginsengfraktion PQ₂C, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 44.
Verfahren zur Herstellung einer Ginsengfraktion PQ₂D, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer Ginsengfraktion PQ₂, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13 hergestellt wurde; (b) Fraktionieren der Ginsengfraktion PQ₂ zur Herstellung einer Elutionsfraktion, welche einem Kohlenhydratpeak entspricht, der zwischen 120 und 250 ml Elutionsvolumen beobachtet wurde, wie durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der folgenden Materialien bestimmt wurde: (1) eine Chromatographiesäule, die eine Matrix aus einem kugelförmigen vernetzten Copolymer von Allyldextran und N,N'-Methylenbisacrylamid enthält, welche ein Bett mit einem Ausmaß von 16 × 600 mm, ein Bettvolumen von 120 ml und einen Fraktionierungsbereich (MW) für globuläre Proteine von 5000 bis 250.000 und für Dextrane von 1000 bis 80.000 aufweist und (2) ein Elutionspuffer von Tris-HCl, der 0,1 N HCl und 0,3 M NaCl mit einem pH-Wert von 7,0 enthält; und (c) Isolieren der Elutionsfraktion zur Herstellung der Ginsengfraktion PQ₂D.
Ginsengfraktion PQ₂D, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 46.
Zusammensetzung, welche mindestens zwei der folgenden Ginsengfraktionen umfasst: (a) Ginsengfraktion PQ₂A nach Anspruch 41; (b) Ginsengfraktion PQ₂B nach Anspruch 43; (c) Ginsengfraktion PQ₂C nach Anspruch 45; und (d) Ginsengfraktion PQ₂D nach Anspruch 47.