DE3915928A1 - Polysaccharid und polysaccharidgemisch mit immunstimulierender und antiproliferativer wirkung, verfahren zu ihrer gewinnung und arzneimittel enthaltend diese substanzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Polysaccharid mit immunstimulierender Wirkung, Verfahren zu dessen Gewinnung sowie Arzneimittel enthaltend dieses Poly­ saccharid.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Polysaccharidgemisch, das als Zwischenprodukt bei der Gewinnung der Reinsubstanz anfällt, dessen Her­ stellung und ein Arzneimittel enthaltend dieses Polysaccharidgemisch.

Die Immunstimulation als therapeutisches Konzept ist in der Medizin seit langem bekannt. Im allgemeinen versteht man darunter die Verabreichung von Substanzen, die selbst nur eine geringe bzw. überhaupt keine antigene Wirkung aufweisen, die jedoch in der Lage sind primär auf unspezifische Art und Weise die körpereigenen Abwehrmechanismen zu induzieren. Nach heutigen Erkenntnissen ist eine Vielzahl von Stoffen in der Lage, die Immunabwehr zu stimulieren, wobei insbesondere verschiedene Mineralien, zum Beispiel Al(OH)₃, MgSO₄, Beryllium, pflanzliche Öle mit oder ohne Zusatz von Mykobakterien sowie eine Reihe von pflanzlichen Wirkstoff­ gruppen wie Alkaloide, Sesqui- und Diterpenverbindungen, Chinone und Polysaccharide zu nennen sind. Der gesamte Komplex der Immunstimulierung wird ausführlich beschrieben von zum Beispiel Chedid, L., et al. "Immun­ stimulation", Springer-Verlag , Heidelberg/New York, 1980; Heidelberger, M., "Structure and Immunological Specificity of Polysaccharides"; Fort­ schritte der chem. org. Naturst. 42, 288 (1982); Drews, J., "Immunpharma­ kologie", Springer Verlag, 1986, G. Dannhardt, Therapeutikon 11, November 1988, 653; "Immunopotention" Ciba Foundation Symposium, Elsevier, Amsterdam 1973, "Immunopharmacology of Infectious Diseases, Ed. J.A. Majde, Alan R. Liss, New York, 1987.

Die genaue Wirkungsweise immunstimulierender Substanzen konnte in den meisten Fällen bis heute nicht endgültig geklärt werden. Generell zeigen diese Substanzen unter anderem einen Einfluß auf die Funktion und/oder Proliferation von immunkompetenten Zellen, wobei sie jedoch keine Ge­ dächtnisreaktion hinterlassen. Dies bedeutet, daß als Wirkungsziele für die immunstimulierenden Substanzen die Makrophagen und Granulocyten sowie T- und B-Lymphozyten im Vordergrund stehen. Die Wirkung kann auf direktem oder indirektem Wege, zum Beispiel über das Komplementsystem oder über Lymphozyten, über die Produktion von Kininen, zum Beispiel Interferon, Interleukine, Tumor-Nekrose-Faktor, Colony stimulation factor und andere, sowie über eine Steigerung von Makro- und Mikrophagocytose erfolgen. Wegen der Verflechtung von unspezifischen und spezifischen Abwehr­ mechanismen ist dabei mit Kaskadeneffekten und der gleichzeitigen Beein­ flussung mehrerer Abwehrmechanismen zu rechnen.

In der Medizin ergeben sich als bevorzugte Anwendungsgebiete für die Immunstimulation vor allem die Therapie von Mischinfektionen, chronisch­ persistierenden, chemotherapieresistenten, bakteriellen und viralen Infektionen, die Prophylaxe von opportunistischen Infektionen bei Risiko­ patienten, die Therapie der malignen Erkrankungen und in gewissem Umfang auch die Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Immunstimulantien können auch bei der Zytostatika-Therapie zur teilweisen Kompensation der damit verbundenen Immunsuppression eingesetzt werden.

Es ist bekannt, daß verschiedene Polysaccharide, insbesondere aus Pilzen und höheren Pflanzen, in der Lage sind die Aktivität des Immunsystems zu steigern. Zu den bekanntesten Immunstimulantien aus dieser Reihe gehören die α-1,3/1,6-Glukane Lentinan und Schizophyllan, vergleiche zum Bei­ spiel "Immunpharmacology of Infectious Diseases", Springer Verlag 1986.

Aus der EP-A 02 46 069 ist ein wäßriger Extrakt aus Pflanzen der Gattung Nerium mit proliferationshemmenden Eigenschaften bekannt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein neues Polysaccharid mit immunstimulierender Wirkung, Verfahren zu dessen Gewinnung und ein Arzneimittel enthaltend dieses Polysaccharid zur Verfügung zustellen.

Überraschenderweise hat die Anmelderin gefunden, daß aus den Blättern und Stengeln des Nerium oleander Baumes ein Polysaccharid mit immun­ stimulierender Aktivität isoliert werden kann.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid setzt sich im Gegensatz zu den bisher bekannten Lentinan- und Schizophyllan-Polysacchariden praktisch aus­ schließlich aus α (1→4) verknüpften D-Galakturonsäureeinheiten zusammen, deren Carboxylgruppen zu ca. 90% methyliert sind. Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde mit 30 000 bis 40 000 D, be­ vorzugt mit ca. 35 000 D, in der HPLC-Gelpermeationschromatographie er­ mittelt.

Die Überprüfung der immunstimulierenden Wirkung des erfindungsgemäßen Polysaccharids erfolgte durch in vitro Verfahren, die die Leistungs­ fähigkeit des mononukleären Systems, sowie die Stimulierbarkeit vom T- und B-Lymphozyten zu messen gestatten.

Bei diesen Untersuchungen wurde überraschend gefunden, daß das er­ findungsgemäße Polysaccharid insbesondere die Sekretion des Tumor- Nekrose-Faktors deutlich zu steigern vermag. Der Tumor-Nekrose-Faktor wird von den Makrophagen bei Induktion gebildet und in die Blutbahn abge­ geben. Er spielt in der Tumorabwehr eine wichtige Rolle.

Auch in weiteren Tests zeigte das erfindungsgemäße Polysaccharid immun­ stimulierende Aktivität.

Es wurde weiterhin gefunden, daß ein Polysaccharidgemisch, das als Zwischenprodukt erhalten wird nicht nur eine allgemein immunstimulierende Aktivität, sondern im besonderen auch über eine die Zellproliferation hemmende Aktivität verfügt.

Dieses Polysaccharidgemisch, das man durch Ausfällung der Polysaccharide aus dem Extrakt der Pflanze erhält, enthält im wesentlichen das oben beschriebene α(1→4) verknüpfte Galakturonan, sowie weitere Galak­ turonane unterschiedlichen Molekulargewichts und auch Oligosaccharide.

Als Ausgangsmaterial zur Isolierung der erfindungsgemäßen Polysaccharide sind Stengel und Blätter des Oleanderbaumes (Nerium oleander) geeignet. Vorzugsweise verwendet man die Blätter.

Das Verfahren zur Isolierung des erfindungsgemäßen Polysaccharids besteht im wesentlichen darin, daß man das zerkleinerte Ausgangsmaterial mit der ca. 5-fachen Menge eines polaren anorganischen Lösungsmittels, bevorzugt destilliertes Wasser, für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3 Stunden kocht, anschließend die festen Teile abfiltriert, den Extrakt auf Raumtemperatur abkühlen läßt und nochmals filtriert.

Man erhält aus dem Extrakt eine Polysaccharidrohfraktion als Zwischen­ produkt mit immunstimulierender Aktivität durch Fällung mit Alkohol, über Komplexbildung mit Schwermetallsalzen oder quartären Ammoniumsalzen. Vorzugsweise fällt man die Polysaccharide mit Ethanol, den man im Ver­ hältnis von 3 : 1 bis 1 : 3, vorzugsweise im Verhältnis 1 : 1 zusetzt. Nach Stehenlassen für mindestens 12 Stunden filtriert man ab, nimmt den Rück­ stand in destilliertem Wasser auf und wiederholt die Fällung zweimal. Den letzten Rückstand, den man wiederum in Wasser aufnimmt kann man gege­ benenfalls lyophilisieren.

Die Rohfraktion trennt man durch herkömmliche Gelchromatographiever­ fahren, zum Beispiel unter Verwendung einer Biogel® P-60 Säule in nieder- und hochmolekulare Bestandteile auf.

Aus der hochmolekularen Fraktion isoliert man anschließend durch Ionen­ austauschchromatographie, zum Beispiel unter Verwendung einer DEAE- Sepharose® C 6-B Säule, durch Elution mit zum Beispiel einem 0-1 m NaCl Gradienten das erfindungsgemäße Polysaccharid bei einer NaCl Konzentra­ tion von ca. 0,2 m.

Beispiel Isolierung des erfindungsgemäßen Polysaccharids aus Nerium oleander Blättern

Die Ausbeute an Polysacchariden variiert nach Herkunft und Erntezeit des Ausgangsmaterials.

Alle im folgenden beschriebenen Arbeiten wurden, wenn nicht anders ange­ gegeben, bei 4°C ausgeführt.

Die Blätter des Nerium oleander Baumes wurden zerkleinert und in der ca. 5-fachen Menge destillierten Wasser 3 Stunden lang gekocht. Die festen Anteile wurden abfiltriert und nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde ein weiteres mal filtriert. Das Filtrat wurde mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt. Diese Lösung wurde für 12 Stunden stehen gelassen, die gebildete Gel­ suspension abfiltriert und der Rückstand in destilliertem Wasser aufge­ nommen. Diese Lösung wurde wieder mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt und für 12 Stunden stehengelassen. Die gebildete Gelsuspension wurde abfiltriert, der Rückstand in destilliertem Wasser gelöst und ein drittes mal mit Ethanol (96%) 1 : 1 versetzt. Nach Stehenlassen für mindestens 12 Stunden wurde die Gelsuspension abfiltriert, der Rückstand in destilliertem Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Auf diese Weise wurde ein Roh­ extrakt als Zwischenprodukt erhalten.

Dieses Zwischenprodukt wird qualitativ weiterhin durch das in der Fig. 1 gezeigte Chromatogramm charakterisiert. Zur Gewinnung des erfindungs­ gemäßen Polysaccharids wurden die niedermolekularen Substanzen von den hochmolekularen Substanzen schonend getrennt. Dazu wurde der Rohextrakt in Wasser gelöst, die Lösung zentrifugiert und der Überstand auf eine Biogel P-60-Säule gegeben und mit destilliertem Wasser eluiert, wobei zwei Fraktionen erhalten wurden. Die erste Fraktion enthielt ein Polysaccharidgemisch vom Molekulargewichtsbereich 17 000 bis 1 20 000 D. Die zweite Fraktion (MG ca. < 10000 D) enthielt niedermolekulare Poly­ und Oligosaccharide und andere Substanzen.

Das erfindungsgemäße Polysaccharid wurde durch Chromatographie der hoch­ molekularen Fraktion an einer Anionenaustauscher DEAE Sepharose® CL 6 B Säule erhalten. Dazu wurde die hochmolekulare Fraktion in Wasser gelöst und auf die mit DEAE Sepharose® gefüllte Säule gegeben und mit einem 0-1-m NaCl Gradienten eluiert. Dabei eluierte das erfindungsgemäße Poly­ saccharid bei ca. 0,2 m NaCl. Es zeigt eine positive optische Drehung von 38,12° (1 mg/ml H₂O, Raumtemperatur).

Die Fig. 1 zeigt ein für die Zusammensetzung des Zwischenprodukts charakteristisches Chromatogramm. Das verwendete Säulensystem ist: µ-Bondagel 125 + µ-Bondagel 500 (getrennte Säulen). Elution mit 0,5 m Phosphatpuffer pH 6,0.

Für das erfindungsgemäße Polysaccharid wurde die folgende Struktur ermittelt:

in der der Rest R einen mittleren Methylierungsgrad von etwa 90% aufweist und im übrigen unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkali- oder Erd­ alkalikation bedeutet.

Die Struktur des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde weiters durch Methanol-Bestimmung und ¹³C-NMR-Spektroskopie untersucht. In diesen Untersuchungen wurde gefunden, daß das Polysaccharid nur aus D- Galakturonsäureeinheiten besteht, die zu ca. 90% methyliert sind.

Die Permethylierungsanalyse lieferte die Bindungsverhältnisse dieses Galakturonans (Hakomori, S.I., J. Biochem. (Tokyo) 55, 205 (1964)).

Die GC-MS Ergebnisse der Permethylierungsanalysen zeigten, daß die Poly­ saccharidkette aus α (1→4) verknüpften D-Galakturonsäureeinheiten be­ steht, deren Carboxylgruppen zu ca. 90% methyliert sind. Außer α (1→4) glykosidischen Bindungen konnten keine anderen Bindungsverhältnisse nachgewiesen werden. Das heißt: Die Polysaccharidkette ist linear aufge­ baut und besitzt keine Verzweigungen.

Zur weiteren Analyse dieses Polysaccharids wurde zunächst das Molekular­ gewicht bestimmt.

Die Molekulargewichtsbestimmung erfolgt mittels HFLC-Gelpermeations­ chromatographie (HP-GPC). Verwendetes HP-GPC-System: µ-Bondagel E 125 + 5 Bondagel E 500 (Fa. Waters).

Puffersystem: 0,5 M Phosphatpuffer, pH 6

Als Vergleichssubstanzen wurden Dextran T 10, T 40, T 70, T 110, T 2000 und Glucose verwendet.

In dieser Methode wurde für das erfindungsgemäße Polysaccharid ein Molekulargewicht von 30 000 bis 40 000 D, vorzugsweise von ca. 35 000 D ermittelt.

Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß das Molekulargewicht in Abhängig­ keit der angewandten Untersuchungsmethoden variieren kann.

Durch den Carbazoltest (Bitter, T. und Muir, H.M., Analyt. Biochem. 4, 330 (1962) wurde der Uronsäuregehalt des erfindungsgemäßen Polysaccharids bestimmt.

Uronsäuregehalt in %

Zur Bestimmung der Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Polysaccharids wurde dieses mit TFA versetzt und 2 Stunden lang bei 121°C im Trocken­ schrank erhitzt. Nach der Entfernung von TFA wurde eine Dünnschicht­ chromatographie durchgeführt.

Adsorbens: Kieselgel G F₂₅₄-Fertigplatten für die Nano-DC(HPTLC) 20×20 cm (Fa. Merck)
Laufmittelsystem: n-Butanol-Aceton-Essigsäure-Wasser (35 : 35 : 10 : 20)
Detektion: Anilindiphenylaminophosphorsäure
Als Ergebnis wurde gefunden, daß nur D-Galacturonsäure nachweisbar ist.

Die α (1→4) Verknüpfung der D-Galakturonsäure wurde zusätzlich mit Pektinase untersucht. Das Polysaccharid wurde in destilliertem Wasser gelöst und mit Pektinase 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. An­ schließend wurde mittels Dünnschichtchromatographie die freigesetzte Galakturonsäure nachgewiesen.

Die pharmakologische Wirkung des erfindungsgemäße Polysaccharids wurde in anerkannten in vitro Tests untersucht.

Da es bislang keine spezifischen Testmethoden zur Überprüfung der immun­ stimulierenden Wirkung von Substanzen gibt, verwendet man bis heute primär solche in vitro- und in vivo-Verfahren, die den Einfluß von Verbindungen oder Pflanzenextrakten auf den Funktionszustand und die Leistungsfähigkeit des mononuklearen Systems, sowie die Stimulierbarkeit von T- und B-Lymphozyten zu messen gestatten.

Bei diesen Untersuchungen wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Polysaccharid insbesondere im Tumor-Nekrose Faktor Freisetzungstest wirksam ist.

TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) ist ein Protein, das beim Menschen aus 157 Aminosäuren besteht. Es wird bei Induktion in Makrophagen synthetisiert und in die Blutbahn abgegeben. TNF stimuliert das Abwehrsystem und tötet die Tumorzellen ab. Bei dem TNF-Test wird die zu testende Substanz den Versuchstieren injiziert. Danach wird im Blut der Versuchstiere die TNF-Konzentration anhand der nekrotischen Wirkung auf Tumorzellinien gemessen und als Parameter für die stimulatorische Wirkung der Test­ substanzen verwendet.

Der Tumor-Nekrose-Faktor-Test (TNF-T) wurde nach Stimpl, M., Proksch, A., Wagner, H. und Lohmann-Matthes, M.L. Infection and Immunity 46, 845 (1984), durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dar­ gestellt.

TNF-Test-Ergebnisse

PS = erfindungsgemäßes Polysaccharid

Wie aus der Tabelle entnehmbar ist, bewirkt das erfindungsgemäße Poly­ saccharid eine deutliche Steigerung der TNF Konzentration, d.h. es induziert in den Makrophagen die Synthese des TNF.

Die immunstimulierende Wirkung der als Zwischenprodukt erhaltenen Roh­ fraktion wurde ebenfall im Tumor-Nekrose-Faktor Freisetzungstest, s.o., überprüft. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle.

TNF-T-Ergebnisse

Die immunstimulierende Wirkung der Polysaccharidrohfraktion wurde zusätzlich im Granulozyten-Test nach Brandt untersucht (Brandt, L., Scand. J. Haemat.(Suppl.)2 (1967).

Im Granulozyten-Test nach Brandt wird durch in vitro-Versuche die Zahl der phagozytierten Hefezellen oder Bakterien durch eine Granulozyten­ fraktion, die aus Humanserum gewonnen wurde, unter dem Mikroskop bestimmt. Man mißt die prozentuale Steigerung der Phagozytose durch die erfindungsgemäßen Polysaccharide. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.

Wie die Ergebnisse in der Tabelle zeigen, bewirkt das als Zwischenprodukt erhaltene Polysaccharidgemisch eine deutliche Steigerung der Phagozytose, die mit den im TNF-Freisetzungstest erhaltenen Stimulierungsdaten gut korrelieren.

Dieses Zwischenprodukt besitzt weiterhin eine die Zellvermehrung hemmende Wirkung (antiproliferative Wirkung).

Das erfindungsgemäße Polysaccharid bzw. das Polysacchridgemisch kann entweder getrennt als Reinsubstanz oder in Form von pharmazeutischen Zubereitungen verabreicht werden, wenngleich es im allgemeinen wirksamer ist, die Verbindung in Form einer pharmazeutischen Zubereitung zu ver­ abreichen. Vorzugsweise liegt die Zubereitung in Form einer Formulierung vor, die

• 1) das erfindungsgemäße Polysaccharid bzw. das Polysacchridgemisch allein enthält und
• 2) eines oder mehrere geeignete Bindemittel, Trägermaterialien und/oder weitere Hilfsstoffe und
• 3) gegebenenfalls weitere therapeutische Wirkstoffe oder Adjuvantien aufweist.

Die Trägermaterialien, Bindemittel und/oder Hilfsstoffe müssen pharma­ zeutisch und pharmakologisch verträglich sein, so daß sie mit den anderen Bestandteilen der Zubereitung vereinbar sind und keine nachteilige Wirkung auf den behandelten Organismus ausüben.

Die Formulierungen schließen jene ein, die für die parenterale (ein­ schließlich subkutane, intradermale, intramuskuläre und intravenöse) oder orale Verabreichung geeignet sind, wenngleich der am besten geeignete Verabreichungsweg von dem Zustand des Patienten abhängt.

Die Herstellung der Formulierungen erfolgt unter Anwendung von an sich auf dem Gebiet der Pharmazie bekannten Verfahren. Alle Verfahren schließen den Schritt ein, das erfindungsgemäße Polysaccharid bzw. das Polysaccharidgemisch (d.h. den Wirkstoff) mit dem Trägermaterial, Binde­ mittel und/oder Hilfsstoffe, wobei letztere einen zusätzlichen Bestand­ teil darstellen, zu vermischen bzw. zu vereinigen. Im allgemeinen werden die Formulierungen dadurch hergestellt, daß man den Wirkstoff mit den flüssigen Trägermaterialien oder den feinteiligen Trägermaterialien oder beiden innig vermischt und dann erforderlichenfalls das erhaltene Produkt in die gewünschte Verabreichungsform bringt. Die erfindungsgemäßen Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können in Form von diskreten Einheiten, wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, die jeweils eine vorbestimmte Menge des erfindungsgemäßen Wirkstoffes enthalten, sowie in Form von Pulvern oder Granulaten, in Form einer Lösung oder einer Suspension in einer wäßrigen oder nicht wäßrigen Flüssigkeit, oder in Form einer Emulsion zum Beispiel in Form von Liposomen, vorliegen.

Der Wirkstoff kann auch in Form eines Bolus oder einer Paste vorliegen.

Die Tabletten kann man durch Pressen oder Vergießen herstellen, wobei man gegebenenfalls eines oder mehrere der üblichen Hilfsmittel zugibt.

Die für die parenterale Verabreichung geeigneten Formulierungen schließen sterile Injektionslösungen in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Materialen, die die Formulierung im Hinblick auf den menschlichen Organismus isotonisch machen, ein. Weiter kann das erfindungsgemäße Polysaccharid bzw. Poly­ saccharidgemisch in Form von sterilen Suspensionen in wäßrigen oder nicht wäßrigen Medien, die Suspensionsmittel und Verdickungsmittel enthalten können, vorliegen. Die Formulierungen können als Einzel- oder Mehrfach-Dosis vorliegen, beispielsweise in Form von Ampullen oder dicht verschlossenen Fläschchen und können auch in lyophilisierter Form ge­ lagert werden, so daß es lediglich erforderlich ist, bei notwendiger Ver­ abreichung steriles flüssiges Trägermaterial, beispielsweise für In­ jektionszwecke geeignetes Wasser, unmittelbar vor Verwendung zuzugeben. Die unmittelbar vor der Verabreichung bereiteten Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulver, Granulaten und Tabletten der oben beschriebenen Art bereitet werden.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können neben den vorhin genannten Bestandteilen andere für die in Rede stehenden Formulierungen geeignete Bestandteile enthalten. So können beispielsweise die auf oralem Weg zu verabreichenden pharmazeutischen Zubereitungen Aromastoffe enthalten.

Die zur Applikation geeigneten Mengen des Wirkstoffes variieren in Ab­ hängigkeit vom jeweiligen Therapiegebiet. Im allgemeinen enthält eine Einzeldosis 5 bis 95% aktiven Bestandteil. Dies entspricht bei einer einmaligen Applikation zum Beispiel 50µg bis 100 mg pro Dosis/Mensch parenteral und 1 mg bis 500 mg peroral. Diese Dosierung kann jedoch in Abhängigkeit des Verabreichungsweges, des Patientenzustandes und des Therapiegebietes in breiten Grenzen variieren.

Claims (21)

1. Polysaccharid der allgemeinen Formel: in der der Rest R einen mittleren Methylierungsgrad von etwa 90% aufweist und im übrigen unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkali­ oder Erdalkalikationen bedeutet und das ein Molekulargewicht von 30 000 bis 40 000 D, bestimmt in der HPLC-Gelpermeationschromato­ graphie, aufweist

2. Polysaccharid nach Anspruch 1, in dem mindestens 80%, vorzugsweise etwa 90% der Carboxylgruppen methyliert sind.

3. Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es aus Pflanzen der Gattung Nerium erhalten wurde.

4. Verfahren zur Gewinnung eines Polysaccharids nach einem der An­ sprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß man

• a) Teile des Nerium oleander Baumes in einem polaren anorganischen Lösungsmittel kocht;
• b) die Festteile abfiltriert, nach Abkühlen bei Raumtemperatur wieder filtriert, die Polysaccharide ausfällt, den Niederschlag abfiltriert und in einem polaren anorganischen Lösungsmittel aufnimmt und diesen Rohextrakt gegebenenfalls lyophilisiert;
• c) den Rohextrakt durch Gelfiltration in eine hoch- und nieder­ molekulare Fraktion auftrennt und das saure Polysaccharid aus der hochmolekularen Fraktion durch Ionenaustauschchromatographie und Elution mit einem Salzgradienten eluiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem man in Stufe a) als polares anorganisches Lösungsmittel destilliertes Wasser verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem man die festen Teile in etwa der 5-fachen Menge destilliertem Wasser kocht.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei dem man das Ausgangs­ material für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3 Stunden, kocht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, bei dem man die Polysaccharide in Stufe b) durch Zusatz von Ethanol (96%) im Verhältnis 1 : 1 ausfällt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem man die Ethanolfällung zweimal wiederholt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, bei dem man in Stufe c) die Elution mit einem 0-1-m NaCl Gradienten durchführt.

11. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem man die Blätter von Nerium oleander als Ausgangsmaterial verwendet.

12. Polysaccharidgemisch mit immunstimulierender und antiproliferativer Wirkung aus Pflanzen der Gattung Nerium, erhältlich durch:

• a) Kochen von Teilen der Pflanze in einem polaren anorganischen Lösungsmittel;
• b) Abtrennen der festen Anteile, Abkühlen des Extraktes auf Raum­ temperatur, Filtration und Ausfällung der Polysaccharide; Ab­ trennung des Niederschlags, Lösen des Rückstandes und gegebenen­ falls Lyophilisation.

13. Polysaccharidgemisch nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das polare anorganische Lösungsmittel in Stufe a) Wasser ist.

14. Polysaccharidgemisch nach Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Pflanzenteile in der 5-fachen Menge Wasser für 2 bis 4, vorzugsweise 2,5 bis 3 Stunden kocht.

15. Polysaccharidgemisch nach Anspruch 12, 13 oder 14, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Polysaccharide in Stufe b) durch Zusatz von Ethanol (96%) im Verhältnis 1 : 1 ausfällt.

16. Polysaccharidgemisch nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ethanolfällung zweimal wiederholt.

17. Polysaccharidgemisch nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen ein Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weitere Galakturone verschiedenen Molekular­ gewichts und Oligosaccharide enthält.

18. Polysaccharidgemisch nach einem der Ansprüche 12 bis 17, weiter ge­ kennzeicnnet durch das HPLC Chromatogramm gemäß Fig. 1, erhalten bei Auftrennung des Polysaccharidgemisches über µ-Bondagel 125 und µ-Bondagel 500 und Elution mit 0,5 m Phosphatpuffer pH 6,0.

19. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend als aktiven Bestandteil ein Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein Polysacchari­ gemisch nach einem der Ansprüche 12 bis 18 in Verbindung mit üblichen pharmakologisch annehmbaren Träger und/oder Hilfsstoffen.

20. Verwendung eines Polysaccharids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder des Polysaccharidgemisches nach einem der Ansprüche 12 bis 18 als Immunstimulans.

21. Verwendung eines Polysaccharidgemisches nach einem der Ansprüche 12 bis 18 als antiproliferatives Mittel.