DE68920019T2 - Aloe-zusammensetzungen und deren verwendungen. - Google Patents

Description

• Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Acemannan, einer biologisch aktiven Substanz im Gel von Aloe vera für die Herstellung von Arzneimitteln.
• Aloe vera ist keine Kaktuspflanze, wie weit verbreitet angenommen wird, sondern ein Glied der Lilienfamilie. Es sind etwa 360 Spezies von Aloepflanzen bekannt. Harding, Aloes of the World: A Checklist, Index and Code, Excelsa 9: 57 - 94 (1979). Sie scheinen in heißen, ariden Gebieten zu gedeihen und sind im Mittelmeergebiet, Mittelost, Afrika, China, Japan, Mexiko und den südlichen USA weit verstreut. Einige wenige der wesentlichen Spezies, die wegen ihrer medizinischen Eigenschaften verwendet werden, sind Aloe barbadensis Miller (aloe vera), A. arborescens, A. plicatilis, A. vahombe, A. saponaria, A. africana, A. ferox und Aloe perryi. Reynolds, Aloes of Tropical Africa and Madagascar, The Trustees, The Aloe Book Fund, Mbabane Swaziland. Jedoch wird A. barbadensis Miller im allgemeinen als die "echte Aloe" wegen ihrer weit verbreiteten Verwendung und, wiederholt berichtet, effektivsten Heilkraft anerkannt, obwohl in Japan A. arborescens Miller traditionell als ein Volksheilmittel für verschiedene Leiden, die von gastrointestinalen Störungen bis zum Athletenfuß reichten, verwendet wurde.
• Aloe vera ist eine mehrjährige Pflanze mit schwülstigen grünen Blättern, die am Stamm in einem Rosettenmuster vereinigt sind. Die Blätter einer reifen Pflanze können mehr als 25 Zoll (63,5 cm) lang sein mit sägezahnähnlichen Spitzen an ihren Rändern.
• Der Transversalschnitt des Blattes, wie in den Fig.1 und 2 gezeigt, ergibt, daß die äußeren Wände der Epidermis (3) mit dicken Cuticeln bedeckt sind. Unter der Epidermis (3) befindet sich das Mesophyll, welches in Chlorenchymzellen und dünnwandigere Zellen, die als Parenchym bekannt sind, unterschieden wird. Die Parenchymzellen beinhalten eine transparente schleimartige Gallerte (1). Die Vascularbündel (2) mit Innenbündelhüllzellen enthalten den gelben Saft, der laxative Eigenschaften besitzt, und sie sind zwischen den zwei größeren Zellen zwischengelegt. Nadelförmige Kristalle vom Calciumoxalat, welche als metabolisches Nebenprodukt in Pflanzenzellen gebildet werden, finden sich hauptsächlich in dem zentralen Abschnitt des Blattes.
• Aloe vera enthält zwei hauptsächliche Flüssigkeitsquellen, einen gelben Latex (Exudat) und das klare Gel (Pflanzenschleim) . Das getrocknete Exudat aus Blättern von Aloe barbadensis Miller wird als Aloe bezeichnet. Der Handelsname ist Curacao-Aloe. Sie besteht hauptsächlich als Aloin, Aloe-emodin und Phenolen. Bruce, South African Medical Journal, 41: 984 (1967); Morrow et al., Archives of Dermatology, 116: 1064-1065 (1980); Salek et al., Corrosion Prevention & Control, 9-10 (1983); Mapp et al., Planta Medica, 18: 361-365 (1970); Ranwald, Archives Pharmazie, 315: 477-478 (1982). Eine Anzahl von phenolischen Substanzen einschließlich Anthrachinonen und deren Glycosiden sind als pharmazeutisch aktiv bekannt. Bruce, Excelsa 5: 57-68 (1975); Suga et al., Cosmetics and Toiletries, 98: 105-108 (1983).
• Die schleimhaltige Gallerte aus den Parenchymzellen der Pflanze wird als Aloe vera-Gel bezeichnet. Es gibt im allgemeinen keine Anthrachinone, welche sich zersetzen und Verfärbung des Gels bewirken könnten, falls das Gel nicht durch eine ungeeignete Verarbeitungstechnik kontaminiert wird.
• Aloe vera-Gel enthält etwa 98,5 Gew.-% Wasser. Mehr als 60% der Gesamtfeststoffe bestehen aus Polysacchariden von Kohlehydratursprung. Organische Säuren und anorganische Verbindungen, insbesondere Calciumoxalat, machen den restlichen Anteil der Feststoffe aus.
• Ganze Blätter, Exudate und frische Gele aus Aloe-Pflanzen wurden für eine Vielzahl von Leiden beim Menschen verwendet. Der Nachweis ihrer Verwendung als medizinisches Heilmittel kann bis zu den Ägyptern 400 v.Chr. zurückverfolgt werden. Aloe vera wurde ebenfalls zur Einbalsamierung von Toten wie auch zum Schutz der die Einbalsamierung vornehmenden Personen vor todbringendem Mittel benutzt. Andere frühe Zivilisationen verwendeten Aloe vera zur Hautpflege, zur Linderung von Insektenstichen und -bissen, zur Behandlung von Schrammen und Hautgeschwüren, zur Förderung der Wundheilung, zur Verhütung von Haarverlust und als Abführmittel. Es war die traditionelle Medizin für zahlreiche Kulturen als Anthelminthikum, Abführmittel und Magenmittel, und es wurde u.a. bei Lepra, Verbrennungen und allergischen Zuständen eingesetzt. Cole et al., Archives of Dermatology and Syphilology, 47: 250 (1943); Chopra et al., Glossary of Indian Medicinal Plants, Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi; Ship, Journal of the American Medica Association, 238: 1770-1772 (1977); Morton, Atlas of Medicinal Plants of Middle American Bahamas to Yucatan, Charles C. Thomas Publisher, 78-80 (1981); Diez-Martinez, La Zabila, Communicado No. 46 Sobre Recursos Bioticos Potenciales del Pais, INIREB, Mexico (1981); Dastur, Medicinal Plants of India and Pakistan; D.B. Taraporevala Sons & Co., Private Ltd., Bombay 16-17 (1962).
• Aloe vera hat eine lange Geschichte der Akzeptanz durch Leien als "lindernde" oder "heilende" Qualitäten aufweisendes Matrial. Während der letzten Jahre wurden zahlreiche Bücher und Aufsätze, welche wissenschaftliche Anforderungen erfüllen, über Aloe vera geschrieben. Organisationen wie der Aloe vera Council und anerkannte medizinische Institutionen haben durch Veröffentlichungen und Fallstudien von Medizinern, Veterinären und anderen Wissenschaftlern das "Aloe Phänomen" bestätigt. Aloe vera wurde extensiv auf dem Gebiet der Dermatologie, insbesondere zur Behandlung von durch Strahlung hervorgerufenen Hautzuständen, beschrieben. Mackee, X-Rays and Radium in the Treatment of Diseases of the Skin, 3. Auflage, Lean und Febiger, Philadelphia, 319-320 (1938); Rovalti et al., Industrial Medicine and Surgery, 28: 364-368 (1959); Zawahry et al., Quotations From Medical Journals on Aloe Research, Ed. Max B. Skousen, Aloe Vera Research Institute, Cypress, Californien, 18-23 (1977); Cera et al., Journal of the American Animal Hospital Association, 18: 633-638 (1982). Der Umfang der wissenschaftlichen Literatur, welche medizinische Anwendungen in Verdauungsproblemen als ein viruswirksames, bakterizides und fungizides Mittel und bei gynäkologischen Zuständen dokumentiert, ist umfangreich und wurde in angemessener Weise von Grindley und Reynolds (Journal of Ethnopharmacology, 16: 117-151 (1986)) berücksichtigt.
• Die Wichtigkeit von in Aloearten gefundenen Chemikalien wird durch die Tatsache gezeigt, daß sie in jeder bekannten nationalen Pharmakopöe aufgeführt sind. U.S. Pharmacopeia, 20. Ausgabe, The National Formulary, 14. Auflage, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland, 1. Juli 1980. Jedoch beschreibt die U.S. Pharmakopöe den Wirkstoffanteil des gelben Saftes von Aloepflanzen, jedoch nicht den Schleimstoff bzw. die Mucilagine. Das frische nicht-konservierte Gel besteht zu etwa 98,5-99,2% aus Wasser. Der Gesamtfeststoff, der nach der Entfernung des Wassers zurückbleibt, liegt im Bereich von 0,8 bis 1,5%. Der Pflanzenschleim, die Zucker, Fasern, Proteine, Asche, Fette, das Aloin und Harz sind die Hauptbestandteile des Feststoffes. Robson et al., Journal of Burn Care Rehabilitation, 3: 157-163 (1982) . Zusammensetzungen, welche Enzyme, organische Säuren, anorganische Salze, Aminosäuren und Alkaloide enthalten, wurden festgestellt. Rowe et al., Journal of the American Pharmaceutical Association, 30: 262-266 (1941); Roboz et al., Journal of the American Chemical Society, 70: 3248-3249 (1948); Waller et al., Proceedings of Oklahoma Academy of Science, 58: 69-76 (1978). In Abhängigkeit von dem Weg, auf welchem die Blätter verarbeitet werden, sind Pflanzenschleim und Zucker die Hauptkomponenten des dehydratisierten Gels. Die gefundenen Zucker sind Galactose, Glucose, Mannose, Rhamnose, Xylose und Uronsäuren. Obwohl sich widersprechende Veröffentlichungen festgestellt wurden, besteht der Pflanzenschleim hauptsächlich aus Mannan oder Glucomannan. Eberendu et al., The Chemical Characterization of CARRISYN (in Vorbereitung); Mandal et al., Carbohydrate Research, 87: 249-256 (1980b); Roboz et al., Journal of the American Chemical Society, 70: 3248-3249 (1948); Gowda et al., Carbohydrate Research, 72: 201-205 (1979); Segal et al., Lloydia, 31: 423 (1968).
• Vor dieser Arbeit war die Kontroverse über die Identität der aktiven Substanz/aktiven Substanzen in Aloe vera nicht abgeschlossen. Es ist daher wichtig, klar zwischen den in dem Gel vorhandenen Komponenten und den in den Exudaten gefundenen Komponenten zu unterscheiden. Ein großer Teil des Gels ist ein Pflanzenschleim von hauptsächlich Polysaccharidnatur mit geringeren Mengen von verschiedenen anderen Verbindungen. Es wurde beobachtet, daß in einigen der beobachteten Aktivitäten eine gewisse synergistische Wirkung zwischen der Polysaccharidbasis und anderen Komponenten bestehen kann. Leung, Excelsa 8: 65-68 (1978); Henry, Cosmetics and Toiletries, 94: 42-50 (1979). Beispielsweise berichten mehrere Forscher, daß die effektiven Komponenten für die Wundheilung Tanninsäure (Freytag, Pharmazie, 9: 705 (1954)) und eine Art von Polysaccharid sein können. Kawashima et al., Chemical Abstracts, 93: 13075 (1979). Mackee, siehe oben, gab an, daß das Gel, nicht die Rinde oder das Exudat, für die günstigen Effekte bei der Behandlung von Strahlungsverbrennungen verantwortlich war, und er betonte die Wichtigkeit der Verwendung von frischen Blättern für eine effektive Behandlung. Polysaccharide bauen mit der Zeit ab, und bestimmte Molekulargewichtsgrößen können zum Hervorrufen eines spezifischen pharmakologischen Ansprechens erforderlich sein. Goto et al., Gann, 63: 371-374 (1972).
• Es gibt viele Beispiele in der Literatur, daß Polysaccharide pharmakologische und physiologische Aktivitäten ohne Unterstützung von anderen Komponenten zeigen können. G. Gialdroni-Grassi, International Archives of Allergy and Applied Immunology, 76 (Suppl. 1): 119-127 (1985); Ohno et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33: 2564-2568 (1985); Leibovici et al., Chemico-Biological Interactions, 60: 191-200 (1986); Ukai et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 31: 741-744 (1983); Leibovici et al., Anticancer Research, 5: 553-558 (1985) . Ein solches Beispiel bezieht sich auf die Entwicklung von Atherosklerose. Hyperlipämie in der allgemeinen Bevölkerung und insbesondere familiäre Hypercholesterinämie ist mit Koronalherzleiden und Tod verbunden. In Ländern, wo die Nahrungsmittelaufnahme von Fasern hoch ist, scheint Atherosklerose nicht üblich zu sein. Trowell et al., Herausgeber, Refined Carbohydrate Foods and Disease, London, Academic Press, 207 (1975). Es wird berichtet, daß Pectin und Guar Cholesterin bei normalen und hyperlipämischen Patienten erniedrigen. Kay et al., American Journal of Clinical Nutrition, 30: 171-175 (1977). Johannisbrotkerngum, ein aus Mannose und Galactose bestehendes Polysaccharid setzte die Plasmalipoprotein-Cholesterinkonzentrationen sowohl bei normalen als auch familiär hypercholesterinämischen Personen herab. Zavoral et al., American Journal of Clinical Nutrition, 38: 285-294 (1983) . Die Zugabe von Guargum zu Carbohydratmahlzeiten erniedrigte den Glucoseanstieg nach dem Essen sowohl bei normalen als auch diabetischen Personen. Jenkins et al., Lancet 2: 779-780 (1977). Kuhl et al., (Diabetes Care, 6 (2): 152-154 (1983)) zeigte, daß Guargum eine glycämische Steuerung von schwangeren insulinabhängigen diabetischen Patienten zeigte.
• Über die Antitumiraktivität von Polysacchariden wurde ausgiebig berichtet. Aus Lentinus cyathiformis hergestellte Polysaccharide steigern bekanntermaßen die Wirtsabwehr gegen Tumore. Rethy et al., Annales Immunologiae Hungaricae, 21: 285-290 (1981). Es gibt mehrere Berichte, daß Polysaccharide aus Pilzen, Hefe oder Bakterienextrakten ein hohes Ausmaß an Wirtsabwehraktivität gegenüber Viren- und Tumorinfestationen hervorrufen können. Chihara et al., Nature, 222: 687 (1969); Schwartzman, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 29: 737 (1932); Rethy, X. International Congress of Microbiology: Moscow, 642 (1966). Suzuki et al. (Journal of Pharmacobio-Dynamics, 7: 492-500 (1984)) berichteten ebenfalls über die Antitumoraktivität einer Polysaccharidfraktion (GF-1), extrahiert aus Fruchtkörpern eines Pilzes, Grifola frondosa. Diese Fraktion zeigte äquivalente, hohe Werte an inhibitierender Aktivität bei der intraperitonealen (IP), intravenösen (IV) und intratumoralen (IT) Applikation. Jedoch war die orale Applikation (PO) nicht effektiv. Die GF-1-Fraktion zeigte ebenfalls Antitumorwirkung gegen die feste Form von Meth-A-Fibrosarcoma und MM 46 Carcinoma bei Mäusen. Lentinan, wobei dies ein 6-verzweigtes B-1-3-gebundenes Glucan ähnlich wie GF-1 ist, war gegenüber Meth-A-Fibrosarcoma nicht wirksam. Chihara, The antitumor polysaccharide Lentinan: an overview; "Manipulation of Host Defense Mechanisms", herausgegeben von Aoki et al., Excerpta Medica, North Holland, 1-16 (1981); Sasaki et al., Carbohydrate Research, 47: 99-104 (1976). Es wurde berichtet, daß synthetisierte verzweigte Polysaccharide Aktivitäten gegenüber Tumoren zeigen. Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 186: 449 (1985). Matsuzaki et al., (Makromol. Chem., 187: 325-331 (1986)) syntetisierten verzweigte Polysaccharide, welche signifikante Aktivitäten zeigten, aus Steinnußmannan (B-(1-4)-D-Mannopyranose) und B-(1-4)-gebundenem Glucomannan. Ein partiell acetyliertes lineares B-(1-3)-D-Mannan, extrahiert aus Fruchtkörpern von Dictyophoria indusiata Fisch, zeigte ebenfalls Antitumoraktivität. Hara et al., Carbohydrate Research, 143: 111 (1982). Es scheint, daß die Antitumorwirkung von dem Typ der Polymerhauptkette und ihrem Polymerisationsgrad abhängt, da B-(1-3)-Glucan-Typpolymere höhere Antitumoraktivität als B-(1-4)-Glucan- und -Hemicellulosepolymere zeigen. Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 187: 325-331 (1986). Ein carboxymethyliertes Derivat von B-(1-3)-Glucan erhalten aus bakteriellem Kulturfiltrat bewirkte starken Zellverlust aus eingeführten Sarcoma 180 Tumoren innerhalb 2 Stunden nach Injektion des Derivats. Baba et al., Journal of Immunopharmacology, 8: 569-572 (1986). Derselbe Autor beobachtete eine kompensatorische Erhöhung von Polymorphonuclear-Leukocyten als Folge der Injektion der Substanz. Übrigens beeinflußte Bestatin, ein bekanntermaßen immunmodulierende Aktivität und Antitumoraktivität besitzendes Dipeptid (Ishizuka et al., Journal of Antibiotics, 32: 642-652 (1980)), weder die Tumorausbeute noch die Zahl von polymorphonuclearen Leukocyten. Baba et al., siehe oben.
• Es gibt zahlreiche Berichte über den Antitumoreffekt von sulfatierten Polysacchariden einschließlich Heparin (Jolles et al., Acta Univ. Int. Cancer, 16: 682-685 (1960); Suemasu et al., Gann, 61: 125-130 (1970)), sulfatiertem Laminaran und Dextran. Jolles et al., British Journal of Cancer, 17: 109-115 (1963). Yamamoto et al., (Japanese Journal of Experimental Medicine, 54: 143-151 (1984)) berichteten die Steigerung der Antitumoraktivität einer Fucoidanfraktion durch weitere Sulfatierung. Das sulfatierte Produkt zeigte Aktivität gegen L-1210 Leukämie. Die Autoren postulierten, daß der Mechanismus der Antitumoraktion teilweise Folge der Inhibierung des invasiven Wachstums von L-1210 Zellen sei als Ergebnis von elektrostatischer Abstoßung zwischen der Tumorzelle und Mesothelzellen. Yamamoto et al., siebe oben. Es wird ebenfalls berichtet, daß Polysaccharide mit Sulfatgruppen Mitogene für menschliche T-Zellen und Aktivatoren für polyklonale B-Zellen von Mäusen sein. Sugawara et al., Microbiological Immunology, 28: 831-839 (1984). Im allgemeinen besitzen Homopolysaccharide von hohem Molekulargewicht mit Sulfatgruppen diese Eigenschaften. Dorries et al., European Journal of Immunology, 4: 230-233 (1974); Sugawara et al., Cell Immunology, 74: 162-171 (1982).
• Es wurde berichtet, daß aus der Hefe Saccharomyces cerisiae extrahiertes Glucan ein Modulator für Zell- und Humoralimmunität ist. Wooles et al., Science, 142: 1078-1080 (1963). Das Polysaccharid stimulierte ebenfalls die Vermehrung von pluripotenten blutbildenden Stammzellen von Mäusen, Granulozytmacrophagen koloniebildenden Zellen und Zellen, welche Myeloid- und Erythroidkolonien bilden. Pospisil et al., Experientia, 38: 1232-1234 (1982); Burgaleta et al., Cancer Research, 37: 1739-1742 (1977). Maisin et al., (Radiation Research, 105: 276-281 (1986)) berichteten ebenfalls, daß IV Applikation eines Polysaccharids Schutz von blutbildenden Stammzellen bei Mäusen gegenüber Röntgenstrahlenexposition induzierte, wodurch die Mortalität der so bestrahlten Mäuse abnahm.
• V. Lackovic et al., (Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 134: 874-879 (1970)) nahmen Hefezellwände und extrahierten das gesamte Bildungsmaterial unter Zurücklassung von lediglich "Mannanen", von denen gefunden wurde, daß sie für die Induktion der τ-Interferonbildung von Monocyten verantwortlich waren. Die "gereinigten Mannane", welche als für das physiologische Ansprechen verantwortlich angesehen wurden, besaßen ein Molekulargewicht von 5.500-20.000 Daltons. Es wurde theoretisch angenommen, daß die Mannane peritoneale Macrophagen von Mäusen zur Bildung des τ-Interferons stimulierten. Es wurde angegeben, daß diese isolierten Mannane keine Toxizität zeigten und "sie schlechte Antigene" sind. Es gab keinen Hinweis bei Lackovic et al. für die Verwendung dieser "gereinigten Mannane" für Antivirusaktivität oder für IL-1 Stimulation. Es wird angenommen, daß die "gereinigten Mannane" von Lackovic et al. eine Gruppierung von unbekannten und nicht identifizierten, substituierten und nichtsubstituierten Mannanen umfaßte.
• Seljelid et al., (Experimental Cell Research, 131: 121 (1981)) haben beobachtet, daß unlösliche oder gelbildende Glycane Makrophagen in vitro aktivierten, während die entsprechenden löslichen Glycane dies nicht bewirkten. Sie forderten, daß die Orientierung, mit welchem das Glycan dem mononuklearen Phagocyten präsentiert wurde, für die Aktivierung entscheidend war. Bogwald et al. (Scandinavian Journal of Immunology, 20: 355-360 (1984)) immobilisierten Glycane, welche einen stimulierenden Effekt auf die Makrophagen in vitro hatten. Dies führte die Autoren zu der Annahme, daß die räumliche Anordnung des Glycans entscheidend für den Effekt auf die Makrophagen in vitro war. Ein aus Candida albicans isoliertes, gereinigtes Polysaccharid induzierte ein Antikörperansprechen durch menschliche periphere Blutlymphocyten in vitro. Wirz et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 33: 199-209 (1984). Es gab signifikante Unterschiede zwischen den Anti-candida-Antikörpern in Seren von normalen und mit Candida infizierten Individuen. Wirz et al., siehe oben.
• Die Antivirusaktivität von Polysacchariden und an Peptiden gebundenen Polysacchariden wurde beobachtet. Suzuki et al., Journal of Antibiotics, 32: 1336-1345 (1979). Suzuki et al., siehe oben, berichteten über eine Antiviruswirkung von Peptidomannan (KS-2), das aus Kulturmycelen von Lentinus edodes extrahiert war. Sowohl orale (PO) als auch intraperitoneale (IP) Applikation erhöhte den Spitzenseruminterferontiter, welcher Mäuse gegenüber Virusinfektionen schützte. Dies unterschied sich von Dextranphosphat (DP-40) (Suzuki et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 149: 1069-1075 (1975)) und 9-Methylstreptimidon (9-MS) (Saito et al., Antimier. Agent & Chemotherapy, 10: 14-19 (1976)), welche höhere Titer von Interferon in Mäusen nur bei intravenöser (IV) oder intraperitonealer (IP) Applikation induzierten.
• Über die antiinflammatorische Aktivität von Aloe vera- Gel wurde weit verbreitet sowohl durch mündliche Bestätigungen als auch in angesehenen wissenschaftlichen Zeitschriften berichtet. Rubel (Cosmetics and Toiletries, 98: 109-114 (1983)) diskutierten vollständig den möglichen Mechanismus des antiinflammatorischen Effektes von Aloe-Gel. Ukai et al., (Journal of Pharmacobio-Dynamics, 6: 983-990 (1983)) beobachteten antiinflammatorische Aktivität von Polysacchariden, die aus Fruchtkörpern von mehreren Pilzen extrahiert waren. Die Polysaccharide zeigten einen signifikanten Inhibitoreffekt bei durch Carrageenan induzierten Ödemen. Eines der Polymere, O-acetyliertes-D-Mannan (T-2-HN) zeigte zusätzlich einen stärker ausgeprägten Inhibitoreffekt als Phenylbutazon bei Hyperalgesie durch Verbrühen. Ukai et al., siehe oben. Die Behauptung, daß das Polysaccharid frei von Protein und Lipiden ist, legt es stark nahe, daß der antiinflammatorische Effekt nur dem acetylierten Mannan zuzuschreiben ist. Andere Forscher haben ebenfalls antiinflammatorische Effekte von komplexen Polysacchariden berichtet (Saeki et al., Japanese Journal of Pharmacology, 24: 109-118 (1974)), von Glycoproteinen (Arita et al., Journal of Pharmacology, 24: 861-869 (1974)) und von sulfatierten Polysacchariden (Rocha et al., Biochemical Pharmacology, 18: 1285-1295 (1969)).
• Literaturberichte, daß Polysaccharide pharmakologische und physiologische Aktivitäten besitzen, überfluten weiterhin die Seiten von hochangesehenen wissenschaftlichen Zeitschriften. Es ist daher nicht unlogisch, daß das Schleimstoffgel von Aloe vera, welches hauptsächlich ein Polysaccharid ist, das Geheimnis der medizinischen Eigenschaften von Aloe vera beinhaltet. Die Diskrepanzen darüber, ob das Polysaccharid ein Glucomannan, ein Mannan, ein Pectin oder von irgendeiner anderen Zusammensetzung ist, sind das Ergebnis von chemischen Reinigungsstufen. Bei Verarbeitung von Aloe entsprechend der vorliegenden Erfindung wurde eine partiell acetylierte Polymannose zuverlässig als Hauptpolysaccharid mit pharmakologischer Aktivität isoliert. Yagi et al., (Planta Medica, 31: 17-20 (1977)) unter Anwendung einer schwach modifizierten Extraktionsmethode isolierten acetyliertes Mannan (Aloe-Mannan) aus Aloe arborescens Miller var. natalensis. Ovodova (Khim. Prior. Soedin, 83: 93833 (1975)) isolierten jedoch früher Pectin als Hauptkomponente derselben Aloespezies.
• Wie zuvor diskutiert, wurde die biologische Aktivität von Polysacchariden seit Jahren erkannt. Aus Pflanzen, Hefe und Bakterien gewonnene Polysaccharidmaterialien haben direkte biologische Aktivität durch Herbeiführen einer Steigerung in Wirtsabwehrsystemen gezeigt. Diese Reaktion wird hauptsächlich durch eine erhöhte Wirtsüberwachung auf andere antigene Substanzen manifestiert. Polysaccharide dienen als Adjuvantien (Freund'sche, etc.) und Immunomodulatoren. Sie wirken ebenfalls als einzigartige von T-Zellen unabhängige Antigene. Sowohl zelluläre als auch humorale Immunität kann beeinflußt werden, und erhöhte Phagocytose von infektiösen Organismen und Tumorzellen wurde beobachtet, wie auch erhöhte Produktion von Immunoglobulinen.
• Die Struktur dieser immunologisch aktiven Polysaccharide und die Typen von strukturellen Variationen scheinen die Faktoren zu sein, welche ihre Potenz und Toxizität kontrollieren. Ihre Wirkungsart(en) bleiben schlecht verständlich; jedoch zeigt neuere Evidenz, daß mehrere Polysaccharide Lymphocyten und Makrophagen zur Bildung eines breiten Bereiches von immunologisch aktiven Substanzen induzieren. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung besitzt alle Attribute dieser immunologisch aktiven Substanzen; sie gehört zu den am meisten potenten von allen bekannten biologisch aktiven Polysacchariden, ist jedoch dadurch verschieden, daß keine Toxizität beobachtet wurde. Sie manifestiert ebenfalls spezifische Antivirusaktivität durch Veränderung der viralen Glycoproteinsynthese.
• In Int. J. Immunopharmacol., Vol. 10, No. 8, 1988, Seiten 967-974, zitierte Referenzen beschreiben, daß Extraktmaterial aus Aloe vera zur Wundbehandlung eingesetzt werden kann und daß die aktive Verbindung dieses Materials Acemannan ist. Andere hierin zitierte Referenzen beschreiben die Fähigkeit von Acemannan, virale Infektionen zu beschränken.
• In Fed. Am. Soc. Exp. Biol. J., Vol. 2, No. 4, 1988, Seite A 682, Abstract 2239, ist ein Mäusemodell unter Verwendung von Tumortargetzellen und Makrophagen, welche mit Carrisyn stimuliert werden, beschrieben. Es wird angegeben, daß die Freisetzung von Cr&sup5;¹ aus markierten Targetzellen bestimmt wurde, und daß die Ergebnisse hiervon bei in-vitro-Tests zeigen, daß Carrisyn Makrophagen bis zum 10-fachen effektiver bei der nicht-spezifischen Lyse von Tumorzellen als nicht-stimulierte Kontrollen aktivierte.
• In der WO-A-87 00 052 sind Verfahren zur Herstellung von Aloe-Produkten beschrieben. Diese Patentanmeldung enthält Beispiele, welche zeigen, daß Carrisyn als örtlich aufzutragendes Wundgel zur Behandlung von ulcerativer Dickdarmentzündung, Aids und Trigeminusneuralgie brauchbar ist.
• In Am. J. Clin. Pathol., Vol. 88, No. 4, 1987, Abstract 534, sind die antiviralen und immunstimulierenden Eigenschaften von Carrisyn beschrieben.
• CARRISYN ist die Märke, welche von der Patentinhaberin der vorliegenden Erfindung dem gereinigten Ethylalkoholextrakt des inneren Gels von Blättern von Aloe barbadensis Miller gegeben wurde. Die aktive Komponente von CARRISYN -Extrakt wurde mit "Acemannan" von dem "United States Adopted Name Council" bezeichnet. Nicht weniger als 73% des CARRISYN -Extraktes ist Acemannan; CARRISYN - Extrakt umfaßt im allgemeinen etwa 73% bis 90% Acemannan. CARRISYN -Extrakt wird im allgemeinen durch Entfernung der äußeren Schale des Blattes, dann Entfernung und Verarbeitung des inneren Filets, oder des Schleimstoffes (Mucilage), durch pH-Einstellung, Ethanolextraktion, Gefriertrocknen und Mahlen hergestellt. Siehe Serial No. 144.872, angemeldet Januar 1988, eine "Continuation-in-Part"-Anmeldung von Serial No. 869.261 (jetzt US-Patent 4 735 935), deren Offenbarung unter Referenz hierauf hier einbezogen wird. Durch Verarbeitung auf diese Weise wird angenommen, daß keine kovalenten Bindungen verändert werden, und daß daher keine toxischen Verbindungen gebildet werden. Diese Herstellungsstufen wurden entwickelt, um die Probleme zu überwinden, welche durch die Tatsache gegeben sind, daß traditionelle Aloeprodukterzeuger nicht die Fähigkeit hatten, die Polysaccharide zu standardisieren und zu stabilisieren. CARRISYN -Extrakt ist ein flockiges weißes amorphes Pulver, welches in Wasser und Dimethylsulfoxid schlecht löslich ist, und in den meisten anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist. Dieses Pulver enthält nicht weniger als 73% eines Polysaccharids, das im wesentlichen aus linearen (1-4)-D-Mannosyleinheiten besteht. Das Polysaccharid ist ein langkettiges Polymeres, das statistisch mit Acetylgruppen durchsetzt ist, welche an das Polymere über ein Sauerstoffatom gebunden sind. Der generische Name für das Polymere ist Acemannan. Der Acetylierungsgrad beträgt annähernd 0,8 Acetylgruppen pro Monomerem, bestimmt nach der alkalischen Hydroxamatmethode (Hestrin, Journal of Biological Chemistry, 180: 240 (1949)). Die Analyse auf neutrale Zuckerbindungen zeigt, daß an die Kette, wahrscheinlich über eine (1-6)-Bindung, eine D-Galactopyranose im Verhältnis von annähernd 1 auf jeweils 7 Zucker gebunden ist. Das 20:1-Verhältnis von Mannose zu Galactose zeigt, daß Galactoseeinheiten ebenfalls aneinander gebunden sind, hauptsächlich über eine (1-4)- glycosidische Bindung. Die chemische Struktur von Acemannan kann wie folgt wiedergegeben werden:
• Eine detaillierte Beschreibung der zur Herstellung der Zusammensetzung und zur Erkennung dieser Struktur angewandt wurden, ist im US-Patent No. 4 735 935 und in der US-Patentanmeldung Serial No. 144.872 gegeben, deren Offenbarung unter Referenz hierauf hier eingeschlossen werden.
• Acemannan ist eine biologisch aktive Komponente vom CARRISYN -Extrat, und es gehört zur selben chemischen Klasse wie die T-unabhängigen Antigene LPS (Lipopolysaccharid), FICOL, Dextran und Levan. Die T-unabhängigen Antigene weisen eine Anzahl von gemeinsamen Eigenschaften auf. Insbesondere sind sie alle sehr negativ geladene, große polymere Moleküle mit sich wiederholenden antigenen Determinanten, und viele hiervon besitzen die Fähigkeit, bei höheren Konzentrationen, andere B-Zellclone als die für das Antigen spezifischen zu aktivieren. Dies heißt, daß sie polyclonale B-Zellaktivierung aufweisen. Siehe Roitt, Brostoff und Male, Immunology, 1986, C.V. Mosby Company, St. Louis, Seiten 8.3 und 8.4.
• Wenigstens 73% des gereinigten insgesamten CARRISYN - Extraktes bestehen aus Polysaccharidpolymeren von Acemannan, welche Molekulargewichte größer als 10.000 Daltons aufweisen.
• Acemannan ist nicht mutagen oder blastogen in in vitro Testsystemen. Toxikologische Untersuchungen in vivo von Acemannan schließen eine 91-tägige subchronische orale Toxizitätsstudie bei Hunden und eine 180-tägige chronische orale Toxizitätsstudie bei Ratten ein. Bei diesen Studien wurden keine toxischen Effekte bei Hunden, welche bis zu 825 mg/kg Acemannan pro Tag erhielten, festgestellt. Keine klinischen groben pathologischen oder toxischen Effekte wurden bei Ratten, welche bis zu 38.475 ppm Acemannan in ihrer Nahrung erhielten, festgestellt.
• Bei Pilotstudien bewirkte die Applikation von Acemannan bei Hunden eine absolute Monocytose in Blutproben, welche für vollständige Zählungen von weißen Blutzellen und Morphologiedifferential entnommen wurden. Innerhalb von 2 Stunden nach der oralen Applikation von hohen Dosen von Acemannan erschienen große aktiviete Monocyten im Kreislauf.
• Es wurde nun gefunden, daß Acemannan für die Behandlung eines Tumors brauchbar ist, wenn es einem Säugetier in einer ausreichenden Menge, um Monocyten- und Macrophagenstimulation herbeizuführen, die Aktivität von natürlichen Killerzellen und die Lyse von spezifischen Tumorzellen durch weiße Zellen und/oder Antikörper zu erhöhen, appliziert wird.
• Die pharmakologischen Wirkungen und Effekte von Acemannan wurden bei einer Vielzahl von Testsystemen in vitro und in vivo untersucht.
• Die Untersuchung wurde unter Benutzung von menschlichen pierpheren Blutmonocytenzellkulturen und C¹&sup4;-markiertem Acemannan zur Verfolgung der Inkorporation oder Adsorption von Acemannan in ein biologisches System durchgeführt. Bei dieser Untersuchung wurden nachweisbare Mengen von C¹&sup4;-markiertem Acemannan von den menschlichen peripheren Monocyten/Macrophagenzellen adsorbiert oder verdaut. Die Spitzeninkorporation trat nach 48 Stunden auf. Das C¹&sup4;-markierte Acemannan bei einer Konzentration von 5 mg/ml war für die Monocyten/Macrophagenzellen nicht cytotoxisch, und die verdaute Zellmasse, ausgedrückt in Gewicht/Volumen (w/v) war 760 mal größer als der Wert w/v der verdauten Acemannanlösung. Diese Ergebnisse legen es nahe, daß die Macrophagenzellform zur intrazellulären Konzentration von Acemannan bei sehr hohen Pegeln in der Lage ist, welche nicht cytotoxisch sind.
• Versuche zur Entwicklung eines ELISA-Kits zum Nachweis von freiem Acemannan in Seren von menschlichen Patienten und Tieren wurden an Serumproben durchgeführt, die von einem Hund von 15 kg, dem 3 mg/kg Acemannan IV gegeben worden waren, erhalten wurden. Die Ergebnisse zeigten an, daß Acemannan im Serum nachweisbar ist und rasch von Blut klärte. 195 Minuten nach der Acemannaninjektion genommene Proben enthielten sehr niedrige Konzentrationen.
• Zur Abschätzung der Geeignetheit von Acemannan für die parenterale Anwendung wurden zwei Kaninchen 5 mg Acemannan IV gegeben, um irgendeinen offensichtlichen Effekt auf das Kaninchen und irgendeine Änderung der Morphologie der weißen Blutzellen 1 und 2 Stunden nach der Injektion festzustellen. Acemannan bewirkte keine beobachtbare klinische Änderung im physikalischen Zustand bei einem der Kaninchen. Die Blutproben von einem Kaninchen klumpten aus einem nicht bekannten Grund (wahrscheinlich defekte EDTA-Röhrchen). Ein anderer Satz von EDTA-Röhrchen wurde für das andere Kaninchen verwendet, und die Blutproben klumpten nicht. Die Anwesenheit einer Anzahl von großen mononuklearen Zellen auf dem Objektträger mit Blutschmierprobe hergestellt 2 h nach der Injektion, wurde Acemannan zugeschrieben.
• Ein dermatologischer Test wurde an Kaninchen durchgeführt, um die Reizeigenschaften von Acemannan nach intradermaler Injektion abzuschätzen. Keine cutane oder systemische Reaktion wurde beim Ansprechen auf irgendeines der Testmaterialien nach der Injektion von 0,1 ml einer Testlösung von 1 mg/ml festgestellt.
• Ein Pyrogenversuch wurde bei Kaninchen entsprechend dem Pyrogentestprotokoll, wie es in der U.S.P. XXI, Biological Test [151] angegeben ist, unter Verwendung einer injizierbaren Lösung mit 1 mg/ml Acemannan durchgeführt. Es wurden häufigere Temperaturmessungen durchgeführt, als in der U.S.P. angegeben ist wegen der nichtbekannten systemischen Effekte von injiziertem Acemannan. Temperaturänderungen in den Testtieren überschritten nicht die minimalen Veränderungen, welche durch das U.S.P. Protokoll erlaubt sind; daher genügt die Lösung den Anforderungen der U.S.P. für das Fehlen von pyrogenen Stoffen. Injizierbares Acemannan bewirkte einen maximalen Körpertemperaturanstieg von 0,3ºC, gemessen bei einem Kaninchen. Es wurde festgestellt, daß dieser Temperaturanstieg 90 min nach der Injektion auftrat. Acemannan ist ein Induktionsmittel für die Sekretion von Interleukin-1 (Il-1) durch Macrophagen und Monocyten in vitro. Da Il-1 ein potentes pyrogenes Mittel ist, könnte dies den minimalen, verzögerten Temperaturanstieg bei diesem Kaninchen erklären.
• Zur Ermittlung der Geeignetheit von Acemannanlösung für die intra-arterielle Anwendung wurde eine Dosis von 1,5 ml injizierbarem Acemannan (1 mg/ml) ohne Schwierigkeit in die Zentralarterie eines Kaninchenohrs injiziert. Das von der Arterie versorgte Gewebe zeigte keine starken Veränderungen nach 24 h, 48 h oder 7 d nach Injektion. Obwohl das injizierbare Acemannan eine dicke Suspension von Teilchen bildete, wurde das Material von dem örtlichen Gewebe gut toleriert und verstopfte nicht die Kapillaren der Ohrspitze.
• Es wurde ebenfalls ein Versuch durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine große Dosis von IP injiziertem Acemannan Anzeichen von Unbehagen oder einen Temperaturanstieg auslösten. Klinisch-physikalische Prüfungen des Grundzustandes einschließlich rektalen Temperaturen wurden an zwei Kaninchen gesammelt. Den Kaninchen wurden IP-Injektionen von entweder 5 ml Acemannanlösung (1 mg/ml) oder 5 ml derselben normalen Salzlösung, welche zur Verdünnung und Herstellung des Acemannantestmaterials verwendet wurde, gegeben. Die Kaninchen wurden 1, 2, 24 und 48 h nach der Injektion auf Anzeichen von physikalischer Änderung, Unbehagen oder Temperaturanstieg untersucht. Es wurde keine Reaktion auf irgendeines der Testmaterialien festgestellt.
• Zur Bestimmung des Effektes von Acemannan auf menschliche periphere Bluthaftzellen wurden in vitro Assays durchgeführt. Es wurde beobachtet, daß Acemannan ein potentes Induktionsmittel zur Bildung von Interleukin-1 und Prostalandin E&sub2; durch Monocyten und Macrophagen ist.
• Vier Bastardhunden wurden einzelne Dosen von CARRISYN -Extrakt (Acemannan) zugegeben und es wurden die Änderungen in klinischen Anzeichen und Laborblutparametern beobachtet. Die applizierten Dosen von CARRISYN -Extrakt reichten von 15 bis 1500 mg/kg Körpergewicht. Ein Kontrollhund wurde einer Placeboapplikation und -manipulation unterzogen. Anschließend wurden dieselben fünf Hunde einem 93- tägigen oralen Applikationsprotokoll mit CARRISYN -Extrakt unterzogen. Die ausgewählte Dosis betrug 150 mg/kg/Tag. Bei beiden Studien zeigten behandelte Hunde und Kontrollhunde keine Änderungen im Verhalten oder in den Ergebnissen der klinischen Überprüfung. Der einzige gemessene Parameter, bei dem eine Änderung bei der Applikation der Testsubstanz beobachtet wurde, war ein Ansteigen der Anzahl der zirkulierenden Monocyten, die während der Differentialauszählung der weißen Zellen festgestellt wurde. Einige dieser Monocyten schienen aktiviert zu sein, da sie größer als andere, auf dem Objektträger mit Blut sichtbaren Monocyten waren. Nekropsie und histopathologische Untersuchung aller Hunde am Ende der Studien zeigten keine abnormalen Befunde.
• Bei einer zur Bestimmung eines möglichen biologischen Markers (erhöhte Anzahl von zirkulierenden Monocyten) durchgeführten Studie für oral appliziertes Acemannan in Hunden wurden 20 Beagle-Hunde (10 männliche und 10 weibliche Tiere) in drei Behandlungsgruppen unterteilt. CARRISYN -Extrakt (Acemannan) wurde oral in Dosen von 0,05; 0,5 oder 5,0 mg/kg gegeben. Es wurden Blutschmierpräparate auf gesamte und differentielle WBC-Zählungen vor der Acemannanbehandlung und 1, 3, 5, 7 und 24 h nach der Behandlung untersucht. Die Gesamt- WBC-Zählungen und Monocytenzählungen stiegen in den Behandlungsgruppen mit 0,5 und 5,0 mg/kg an. Die Monocytose betrug maximal 7 h nach der Acemannanapplikation. Der Dosispegel ohne Effekt für diesen potentiellen biologischen Marker betrug 0,05 mg/kg.
• Da es schien, daß Acemannan die Monocytenfunktion in anderen Experimenten förderte, wurden Studien entwickelt, um die Fähigkeit von Acemannan zur Erhöhung des Immunansprechens auf Alloantigen zu fördern, und zum Test, ob die potentielle Steigerung eine durch Monocyten vorangetriebene Erscheinung ist. Acemannan förderte nicht das Lymphocytenansprechen auf syngenische Antigene in der Mischlymphocytenkultur (MLC), jedoch erhöhte es wesentlich das Alloantigenansprechen in einer von der Dosis abhängigen Weise (2,6 x 10&supmin;&sup7; - 2,6 x 10&supmin;&sup9;M). Es wurde gezeigt, daß dieser Effekt von Acemannan ein spezifisches Ansprechen ist und mit in vitro Konzentrationen von Acemannan auftritt, welche ebenfalls in vivo erzielt werden können. Eine getrennte Serie von Mischexperimenten zeigte, daß Acemannaninkubation mit Monocyten es ermöglichte, daß monocyten-verursachte Signale das T-Zellansprechen auf Lectin fördern. Es wurde geschlossen, daß Acemannan ein Immunostimulator ist, da es das Lymphocytenansprechen auf Alloantigen erhöht. Dieser Mechanismus kann teilweise die kürzlich beobachtete Fähigkeit von Acemannan erklären, virale Infektionen bei Tier und Mensch aufzuheben.
• Der Effekt von CARRISYN -Extrakt (73%-90% Acemannan) wurde in vitro untersucht, um seinen Effekt auf phagocytische Funktion zu bestätigen. CARRISYN -Extrakt wurde IP in CBA-Mäuse injiziert, und peritoneale Macrophagen und Milz- Macrophagen wurden 3 Tage später gesammelt. Thioglycolat und Salzlösung wurden in ähnlicher Weise als positive bzw. negative Kontrolle eingesetzt. Die Macrophagen wurden mit roten Blutzellen von Schafen (SRBC) als Verdauungsteilchen inkubiert bei Anwesenheit und Abwesenheit von Anti-SRBC-Titern, und die Phagocytose wurde histologisch als Prozentsatz der Zellen, welche SRBC verdauten, gemessen. Obwohl nichtspezifische Phagocytose nach der Behandlung mit CARRISYN -Extrakt schwach erhöht war, war die Phagocytose bei Vorhandensein von Antikörper signifikant erhöht. Bei Anwesenheit von Komplement wurde die durch CARRISYN stimulierte Antikörper-vermittelte Phagocytose in einem sehr viel größeren Ausmaß erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, daß CARRISYN -Extrakt die Anzahl der Macrophagen erhöht und deren phagocytische Aktivität verbessert. Solches Ansprechverhalten kann zu seiner Effektivität als ein Stimulanz der Wundheilung und als ein antiinfektiöses Mittel beitragen.
• Mit CARRISYN -Extrakt (Acemannan) stimulierten Macrophagen wurden ebenfalls mit durch Thioglycolat stimulierte und Kontrollmacrophagen in vivo und in vitro verglichen, um die Effekte von stimulierten Phagocyten auf nichtspezifischen Tumortod zu bestimmen. Durch Thioglycolat stimulierte Macrophagen, inkubiert mit Cr&sup5;¹-Targetzellen, setzten Cr&sup5;¹ mit einem Durchschnittswert von 2800 cpm frei, während mit CARRISYN -Extrakt markierte Zellen Radioaktivität mit einem Durchschnittswert von 3100 cpm (cpm = counts per minute = Zählungen/min) freisetzten. Es gab keinen statistischen Unterschied zwischen diesen Gruppen. Nichtstimulierte Macrophagen ergaben Freisetzungen im Bereich von 2800 cpm. Jedoch hatten mit CARRISYN -Extrakt in vitro stimulierte Macrophagen eine Cr&sup5;¹-Freisetzung von 21.000 cpm. Dies zeigt zwei offensichtliche Fakten. CARRISYN -Extrakt induziert nicht einen langanhaltenden cytolytischen Effekt, und seine Aktivierung kann in einer relativ kurzen Zeit in Gewebekultur auftreten. Die prozentuale Cytotoxizität war parallel zur cpm. Ein nachfolgendes Experiment wurde unter Verwendung des cytotoxischen Assays über die Zeit durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß der cytotoxische Effekt so früh wie 6 h nach der Stimulierung beginnt und auf seinen Maximalwert in 12 h ansteigt. Der Mechanismus dieser Aktivierung wurde nicht untersucht. Die bei diesen Forschungen gezeigten Daten zeigen, daß CARRISYN -Extrakt (Acemannan) eine wichtige Rolle bei der nichtspezifischen Therapie von Krebs haben kann.
• Die physikalischen Eigenschaften von Acemannan erlauben es, daß es in alle pharmazeutischen Dosierungsformen formuliert und eingegeben werden kann, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Die biopharmazeutischen und toxikologischen Eigenschaften von Acemannan erlauben, daß es in Geweben und Organen von lebenden Organismen eingesetzt wird, und daß es über einem breiten Bereich von Dosierungen appliziert werden kann.
• Acemannan kann oral, parenteral, topisch und lokal in einer täglichen Dosis von 0,001 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag appliziert werden.
• In Mischung mit geeigneten Hilfsstoffen kann Acemannan in feste Dosierungseinheiten komprimiert oder eingefüllt werden wie Pillen, Tabletten und Dragees oder zu Kapseln verarbeitet werden. Diese oralen Dosierungsformen sollten bei einer Dosierung von etwa 0,1 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag appliziert werden.
• Mittels geeigneter flüssiger Träger kann Acemannan in Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen injiziert werden. Diese Produkte sollten mit einer Rate von 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag appliziert werden. Als Hilfskomponente einer Vaccine oder eines anderen Produktes könnte Acemannan mit einer Rate von 0,001 bis 10 mg pro Einheitsdosis an mit Hilfsstoff versetztem Produkt verwendet werden.
• Als allgemeine Regel gilt, daß Acemannan in Menschen bei der Applikation in beliebiger Form effektiv wird, durch welche wenigstens 10mg/kg Körpergewicht/Tag verfügbar ist.
• Topische Applikation von Acemannan kann in Form eines verarbeiteten Gels, Creme, Lotion, Lösung, Salbe oder Pulver erfolgen. Diese Formulierungen könnten bis zu 90% Acemannan enthalten.
Beispiel 1 DIE EFFEKTE VON CARRISYN AUF DIE NICHTSPEZIFISCHE TUMORLYSE
• Dieses Beispiel untersucht die Möglichkeit von nichtspezifischem Tumortod, induziert von durch CARRISYN - Extrakt stimulierten Phagocyten.
A. Arbeitsweisen
• CARRYSIN -Extrakt-Polymeres: CARRISYN -Extrakt (Acemannan) wurde in einer getrockneten Form gehalten. Die für jedes Experiment erforderliche Menge wurde eingewogen und mit 2-minütigen Expositionen bei 600 Watt Leistung in der Mikrowelle bestrahlt. Das Material wurde in ein steriles Zentrifugenrohr (15 ml) überführt und für eine weitere Minute mit Mikrowellen bestrahlt. Das Material wurde in Hanks'scher Gleichgewichtssalzlösung (HBSS) auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Bei einigen Experimenten wurde das Material ohne offensichtlichen Aktivitätsverlust durch Autoklavenbehandlung sterilisiert.
• Zellen: Es wurden Makrophagen aus dem Peritonealraum von weiblichen BALB/c Mäusen, erhalten vom Harlan/Sprague Dawley, geerntet. Entweder Thioglycolatbrühe (25 mg/kg) oder CARRISYN -Extrakt (25 mg/kg) wurde in einige Gruppen der Tiere sechs Tage vor dem Ernten IP injiziert. Mit Salzlösung stimulierte Zellen wurden ebenfalls als eine zusätzliche Kontrolle verwendet. Die geernteten Zellen wurden dreimal in HBSS gewaschen und in RPMI-1640 bis auf eine Konzentration von 5x10&sup6;/Zellen/ml verdünnt.
• Targetzellen: Targetzellen wurden von der American Type Culture Collection (C#H/HeN Fibro Sarcoma L929) erhalten und in Kultur gehalten. Das Markieren wurde mit 5,555 GBq (150 mCi) Chrom&sup5;¹ (Cr&sup5;¹), gemischt mit 1 ml der 10&sup7; Zellen in RPMI-1640 enthaltenden Zellsuspension, durchgeführt. Die Zellen wurden für 1 h inkubiert, dreimal mit RPMI-1640 gewaschen und auf eine Endkonzentration von 5 x 10&sup4; Zellen/ml eingestellt.
• Assay: Gleiche Teile von Effektorzellen (100 Zellen/1) wurden in Mikrotiterplatten mit flachem Boden angeordnet. Cr&sup5;¹-markierte Zellen wurden mit einem Minimum von drei Replikaten pro experimentellem Punkt zugegeben. Die Testplatten wurden bei 37ºC in 7% CO&sub2; (zuvor 5% CO&sub2;) für 20 h inkubiert. Uberstehende Flüssigkeit (100 Zellen/1) wurden nach Zentrifugieren der Platten mit 250 x G für 15 min erhalten. Die Menge an Radioaktivität wurde mit einem Packard-Gammazähler festgestellt. Die Kontrollen bestanden aus Thymocyten. Die Prozentsatz an Cytotoxizität (%CT) wurde bestimmt nach: % CT = cpm in Testzellen - cpm Kontrollzellen/Gesamt-cpm der Targetzellen
B. Ergebnisse
• Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse der anfänglichen Experimente. TABELLE 11 EFFEKT VON CARRISYN -EXTRAKT AUF CYTOTOXIZITÄT Zellen cpm ± S.D.a % Cytotoxizität Thioglycolat, stimuliert in vivo Thioglycolat, stimuliert in vitro nichtstimuliert CARRISYN , stimuliert in vivo und in vitro a = Gesamt-cpm der Targetzelle = 42.000
• Thioglycolat-stimulierte Macrophagen, inkubiert mit Cr&sup5;¹-Targetzellen, setzten Cr&sup5;¹ mit einem Durchschnittswert von 2800 cpm frei, während CARRISYN -Extrakt-markierte Zellen Radioaktivität mit einem Durchschnittswert von 3100 cpm freisetzten. Es gab keine statistische Differenz zwischen diesen Gruppen. Nichtstimulierte Macrophagen setzten im Bereich von 2800 cpm frei. Jedoch hatten mit CARRISYN - Extrakt in vitro stimulierte Macrophagen eine Cr&sup5;¹-Freisetzung von 21.000 cpm. Dies zeigt zwei offensichtliche Fakten. CARRISYN -Extrakt induziert nicht einen lang anhaltenden cytolytischen Effekt, und seine Aktivierung kann in einer relativ kurzen Zeit in Gewebekultur auftreten. Die prozentuale Cytotoxizität ist parallel zu cpm.
• Ein nachfolgendes Experiment unter Verwendung des cytotoxischen Assays im Zeitablauf ist in Tabelle 12 gezeigt. TABELLE 12 ZEITABHÄNGIGKEITSEFFEKT VON CARRISYN -EXTRAKT AUF CYTOTOXIZITÄT Zeita Stimulierung cpmb % Cytotoxizität CARRISYN -Extrakt Thioglycolat a = Zeit in Stunden nach Injektion b = cpm der Kontrollzellen = 39.000
• Der cytotoxische Effekt von CARRISYN -Extrakt begann innerhalb 6 h nach der Stimulierung und stieg auf sein Maximum nach 9 h an. Der Mechanismus dieser Aktivierung wurde nicht untersucht.
• Die in diesem Beispiel gezeigten Daten zeigen, daß CARRISYN -Extrakt eine wichtige Rolle bei der nichtspezifischen Therapie von Krebs haben kann.
• Screening von CARRISYN -Extrakt auf potentielle Wirksamkeit gegen Pferde-Sarcoid. Drei Sarcoide an zwei Pferden wurden sowohl IV als auch intraläsionär mit CARRISYN - Extrakt behandelt. Das Ziel dieses Versuches war die Bestimmung, ob CARRISYN -Extrakt eine effektive Behandlung gegen Pferde-Sarcoid sein könnte, und ebenfalls die Beobachtung der Patienten auf abträgliche Reaktionen. Beim Pferd 1 löste sich ein Sarcoid vollständig auf, während ein zweites Sarcoid nicht in der Größe abnahm. Ein drittes nodales Sarcoid entwickelte sich während der Behandlung. Beim Pferd 2 löste sich ein einzelnes Sarcoid vollständig auf. Diese Ergebnisse legen es nahe, daß CARRISYN -Extrakt brauchbar bei der Behandlung von Pferde-Sarcoid sein kann.
• Zwei Pferde mit drei verdächtigen Läsionen wurden auf einem Markt erworben. Die Läsionen wurden photographiert, ausgemessen und von einem Histopathen als Sarcoide bestätigt.
• Pferd 1: Tag 1. Jede der zwei Läsionen auf dem rechten hinteren Schenkel wurde durch direkte Injektion (Nadel 20 ga., Außendurchmesser 0,8974 mm, Innendurchmesser 0,5897), mit 50 mg CARRISYN -Extrakt, verdünnt in 10 ml Salzlösung (Läsion 1) und 5 ml Salzlösung (Läsion 2) behandelt. 25 mg CARRISYN -Extrakt, verdünnt in 7,5 ml Salzlösung wurden ebenfalls IV gegeben.
• Tag 7, Läsion 1 (obere Läsion) wurde behandelt (Nadel 18 ga., Außendurchmesser 12,7 mm, Innendurchmesser 8,38 mm) mit 50 mg CARRISYN -Extrakt, verdünnt in 10 ml Salzlösung. Läsion 2 wurde behandelt mit 25 mg verdünnt in 7,5 ml Salzlösung. 50 mg in 10 ml Salzlösung wurden IV gegeben.
• Tag 14. Läsion 1 wurde mit 50 mg in 10 ml Salzlösung behandelt, während die Läsion 2 mit 25 mg in 5 ml Salzlösung behandelt wurde. 75 mg in 25 ml Salzlösung wurden IV gegeben.
• Tag 21. Läsion 1 wurde mit 50 mg in 10 ml Salzlösung behandelt, und Läsion 2 wurde mit 25 mg in 10 ml Salzlösung behandelt. 100 mg in 25 ml Salzlösung wurden IV injiziert.
• Tag 29. Läsion 1 wurde wie am Tag 21 behandelt, jedoch wurde die Läsion 2 wegen lokalem Anschwellen nicht direkt behandelt. 100 mg in 25 ml Salzlösung wurden IV gegeben.
• Tag 42. Läsion 1 wurde nicht direkt behandelt, Läsion 2 wurde mit 25 mg in 10 ml Salzlösung behandelt. 100 mg in 50 ml Salzlösung wurden IV gegeben.
• Tag 57. Pferd 1 wurde euthanisiert, und es wurden Gewebeproben an dem Ort der Läsion 1, aus der Läsion 2, den Leistenlymphknoten und einer nodalen Läsion auf seiner linken Schulter, welche sich im Verlauf der Behandlung entwickelt hatte, entnommen.
• Pferd 2: Tag 1. Die Läsion am unteren linken Thorax wurde mit 50 mg CARRISYN -Extrakt, verdünnt in 30 ml Salzlösung behandelt. Eine Hälfte wurde subkutan (S/Q) injiziert, und die andere Hälfte intraläsional.
• An den Tagen 6, 16, 24, 30, 49, 56, 63, 70 und 77 wurden dem Pferd 2 100 mg CARRISYN -Extrakt IV gegeben, verdünnt in 60-120 ml Salzlösung, wobei die Menge an Verdünnungsmittel je nach Erfordernis variierte, um eine klare Lösung herzustellen.
• An den Tagen 105, 113 und 120 wurde die Läsion mit 25 mg CARRISYN -Extrakt verdünnt in 5 ml Salzlösung, intraläsional und S/Q an der Basis der Läsion behandelt. Eine zusätzliche Menge von 75 mg wurde IV gegeben.
• Ergebnisse-Pferd 1: Tag 1. Läsion 1 maß 2,5 cm (horizontale Länge) x 2,5 cm (vertikale Höhe) x 1 cm (Stärke). Die Auflösung dieser Läsion ergibt sich unten: Pferd 1 - Läsion 1 Tag Messungen jetzt gleich auf mit Hautoberfläche flach und trocken fast ganz geheilt vollständig geheilt
• Die Läsion 2 maß 2 cm x 2 cm x 1 cm am Tag 1 und veränderte sich niemals signifikant. Die Ergebnisse der Läsion 2 sind unten angegeben: Pferd 1 - Läsion 2 Tag Messungen - ganzes Gelenk noch gequollen und schmerzempfindlich Größe schwach geringer - nochgeschwollen, nicht so schmerzempfindlich gleiche Größe - Gelenkschwellung erniedrigt auf 65%
• Ergebnisse - Pferd 2: Tag 1. Die Läsion maß 5 cm x 3,5 cm x 2,5 cm mit einer gestielten Basis von 2,5 cm. Die Änderungen bis zur vollständigen Auflösung sind unten gezeigt: Pferd 2 - Läsion 1 Tag Messungen keine Änderung - stärker granulomatös weniger granulomatös Läsion vollständig aufgelöst
• Nach IV-Applikation gab es keine Änderung in der Herzgeschwindigkeit und kein Schwitzen, keine Muskelfasciculation oder offensichtliche Anzeichen von Schmerz. Eine schwache Zunahme der Tiefe der Atmung wurde nur beim Pferd 1 festgestellt. Lokal zeigte Pferd 1 eine inflammatorische Cellulitis von milder Natur bei der Läsion 1 und von einem akuten schmerzvollen Typ bei Läsion 2, so hoch, daß die Läsion keine Injektion erhielt, wie für Tag 29 angegeben. Die Läsion 2 war stärker fibrös und es war sehr viel schwieriger, hierin zu injizieren, so daß stärkerer S/Q-Verlust auftrat. Dies könnte für das Fehlen des Effektes bei Läsion 2 die Ursache sein. Pferd 2 zeigte keine Cellulitis.
• Die Tatsache, daß sich ein nodulares Sarcoid im Verlauf der Behandlung entwickelte, führt zu dem Verdacht, daß der Haupteffekt von CARRISYN -Extrakt eine lokale Gewebereaktion statt eine systemische Reaktion ist, obwohl IV-Applikation das Sarcoid für intraläsionale Behandlung sensibilieren kann.
• Das exakte Datum, zu welchem die Läsion bei Pferd 2 sich auflöste, ist nicht bekannt, da die untersuchende Person zwischen dem Tag 113 und dem Tag 177 wegen Krankheit 60 Tage abwesend war. Unter Beurteilung aus dem Fehlen einer signifikanten Reduzierung der Tumorgröße am Tag 56 scheint es so zu sein, daß eine wöchentliche IV-Applikation alleine wenig Effekt auf das Sarcoid bei Pferd 2 hatte.
BEISPIEL 2 Präparation von injizierbarer CARRISYN -Lösung A. Herstellung der Lösung
• CARRISYN -Extrakt (Acemannan) wird entsprechend dem US-Patent 4 735 935 hergestellt. 12 Proben von CARRISYN -Extrakt in feuchter Form, welche jeweils annähernd 100 g wogen, wurden in sterilen Mason-Bechern angeordnet und lyophilisiert (2 Einheiten: eine von Untop - 600 SL, die andere Freeze Mobile 21, beide von Vertis Corp., Gardiner, NY). Das erhaltene rohe CARRISYN -Pulver wurde ausgewogen, und die Gewichte aufgezeichnet. Annähernd 87 g des fertigen lyophilisierten Rohproduktes werden erhalten. Eine "Fast Touch"-Kaffeemühle von Krup , Modell 203 (Robert Krup N.A., Closter, NJ) wird mit 50% Isopropylalkohol (Delta, Dallas) keimfrei gemacht und trocknen gelassen. Die Operateure sollten sterile Bedingungen einhalten und sollten vorzugsweise Handschuhe und Laborkittel tragen. Alle Arbeit wird in einer biologischen Sicherheitsbox durchgeführt, der mit Desinfektionsmittel Bac-Down (enthaltend sowohl (1) n-Alkyl-(60% C&sub1;&sub4;, 30% C&sub1;&sub6;, 5% C&sub1;&sub2;, 5 % C&sub1;&sub8;)- dimethylbenzylammoniumchlorid und (2) n-Alkyl (68% C&sub1;&sub2;, 32% C&sub1;&sub4;)-dimethylethylbenzylammoniumchlorid, vertrieben von Curtin Matherson Scientific, Houston, Texas) gereinigt und mit sauberen Unterlagen ausgelegt war. Sterile Corning-Gefäße wurden vor der Zugabe des gemahlenen CARRISYN ausgewogen. Annähernd 5 g des lyophilisierten rohen CARRISYN - Pulvers wird gemahlen, nachdem die großen Stücke zu kleineren Stücken mit sterilen B-P-Klingen geschnitten waren. Das CARRISYN -Pulver wird auf 100 mesh (0,15 mm) unter Schwingeinwirkung gemahlen, um es zu einem feinen Pulver zu zerkleinern. Das feine CARRISYN -Pulver wird in sterile Corning- Becher eingefüllt und erneut ausgewogen. Zur Bildung einer Lösung werden 5 g des feingemahlenen CARRISYN -Pulvers in 1 l sterile 0,9% Normalsalzlösung (Travenol Co., Deerfield, Illinois) überführt, welche 0,5% Chlorbutanol (Kodak Co., Rochester, New York) enthält, und sie werden in einer großen sterilen pyrogenfreien Flasche (1,5 l) angeordnet. Die CARRISYN -Salzlösung wird auf einem Schüttler Orbitron (Boekel Co., S.N. HRO 8155-27, Philadelphia, Pa.) in einem Kühlschrank über Nacht angeordnet, damit sich die CARRISYN -enthaltende Lösung solubilisiert. Die CARRISYN -Salzlösung wird dann aus dem Rührer entnommen und aufrecht in dem Kühlschrank für 1 h angeordnet, damit sich die Teilchen absetzen können.
B. Überführung in Flaschen
• Kommerzielle sterile 60 ml IV-Flaschen für subkutane IV-Injektion (Wheaton Co., Millville, New Jersey) mit sterilen Gummistopfen wurden mit entionisiertem Wasser gespült, mit Aluminiumfolie verkappt und für 15 min bei 1,03 bar (15 lbs.) Druck und 121ºC im Autoklaven behandelt. Die sterilen Flaschen wurden in einem 170ºC Trockenofen über Nacht zur Inaktivierung irgendwelcher rückständigen Pyrogene angeordnet. Die Kappen für die Flaschen wurden ebenfalls abgespült und zusammen mit den Flaschen im Autoklaven behandelt. Die CARRISYN -Salzlösung wurde in Teilmengen von 10 ml in die sterilen pyrogenfreien 60 ml Flaschen abgefüllt. Dieser Vorgang erfolgte in einer biologischen Sicherheitsbox (Klasse 2, Typ A, Germ Free Co., Modell 820, Miami, Florida). Die gewünschte Konzentration beträgt annähernd 50 mg CARRISYN /50 ml oder 1 mg/ml Salzlösung. Die Flaschen werden mit den sterilen Gummistopfen verkappt. Die CARRISYN -Salzlösungen in den mit Kappen versehenen Flaschen werden lyophilisiert. Nachdem die Proben trocken sind, werden Flaschen mit Metallbändern kappenverschlossen und geeignet markiert. Die Proben werden dann bis zur Freigabe aus der Qualitätskontrolle und das Sicherheitspersonal entsprechend geeigneten Herstellungspraktiken aufbewahrt.
• Beim Fertigmachen zur Anwendung werden 25 ml normale Salzlösung U.S.P. zu den Inhalten der 60 ml Behälter zugesetzt. Die Mischung sollte gut vor der Applikation bei dem Patienten geschüttelt werden.

Claims (1)

1. Verwendung von Acemannan für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Tumors in einem Säugetier.