DE68929208T2

DE68929208T2 - Anwendungen von Acemannan

Info

Publication number: DE68929208T2
Application number: DE68929208T
Authority: DE
Inventors: Robert H Carpenter; Bill H Mcanalley; Harley R Mcdaniel
Original assignee: Carrington Laboratories Inc
Current assignee: Carrington Laboratories Inc
Priority date: 1988-08-05
Filing date: 1989-08-03
Publication date: 2000-09-07
Anticipated expiration: 2009-08-04
Also published as: DE68929208D1; AU4319489A; ATE115405T1; AU637985B2; EP0619117A2; ATE192653T1; JPH03501624A; EP0619117B1; EP0619117A3; EP0382840A1; WO1990001253A1; CA1336581C; EP0382840B1; EP0857485A3; JP2888249B2; EP0965345A2; EP0382840A4; EP0857485A2; US5106616A; DE68920019D1

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Acemannan, einer biologisch aktiven Substanz im Gel von Aloe vera für die Herstellung von Arzneimitteln.
Aloe vera ist keine Kaktuspflanze, wie weit verbreitet angenommen wird, sondern ein Glied der Lilienfamilie. Es sind etwa 360 Spezies von Aloepflanzen bekannt. Harding, Aloes of the World: A Checklist, Index and Code, Excelsa 9: 57-94 (1979). Sie scheinen in heißen, ariden Gebieten zu gedeihen und sind im Mittelmeergebiet, Mittelost, Afrika, China, Japan, Mexico und den südlichen USA weit verbreitet. Einige wenige der wichtigen Spezies, die wegen ihrer medizinischen Eigenschaften verwendet werden, sind Aloe barbadensis Miller (aloe vera), A. arborescens, A. plicatilis, A. vahombe, A. saponaria, A. africana, A. ferox und Aloe perryi. Reynolds, Aloes of Tropical Africa and Madagascar, The Trustees, The Aloe Book Fund, Mbabane Swaziland. Jedoch wird A. barbadensis Miller im allgemeinen als die "echte Aloe" wegen ihrer weit verbreiteten Verwendung und, wie wiederholt berichtet, effektivsten Heilkraft anerkannt, obwohl in Japan A. arborescens Miller traditionell als ein Volksheilmittel für verschiedene Leiden, die von gastrointestinalen Störungen bis zu Dermatophytose reichen, verwendet wurde.
Aloe vera ist eine mehrjährige Pflanze mit schwülstigen, grünen Blättern, die am Stamm in einem Rosettenmuster vereinigt sind. Die Blätter einer reifen Pflanze können mehr als 25 Zoll lang sein mit sägezahnähnlichen Spitzen an ihren Rändern.
Der Transversalschnitt des Blattes, wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt, ergibt, daß die äußeren Wände der Epidermis (3) mit dicken Kutikulas bedeckt sind. Unter der Epidermis (3) befindet sich das Mesophyll, welches in Chlorenchymzellen und dünnwandigere Zellen, die als Parenchym bekannt sind, unterschieden wird. Die Parenchymzellen beinhalten eine transparente, schleimartige Gallerte (1). Die Vascularbündel (2) mit Innenbündelhüllzellen enthalten den gelben Saft, der laxative Eigenschaften besitzt, und sie sind zwischen die zwei größeren Zellen gelegt. Nadelförmige Kristalle von Calciumoxalat, welche als metabolisches Nebenprodukt in Pflanzenzellen gebildet werden, finden sich hauptsächlich in dem zentralen Abschnitt des Blattes.
Aloe vera enthält zwei Hauptflüssigkeitsquellen, einen gel ben Latex (Exudat) und das klare Gel (Pflanzenschleim). Das getrocknete Exudat aus Blättern von Aloe barbadensis Miller wird als Aloe bezeichnet. Der Handelsname ist Curacao-Aloe. Sie besteht hauptsächlich aus Aloin, Aloe-emodin und Phenolen. Bruce, South African Medical Journal, 41: 984 (1967); Morrow et al., Archives of Dermatology, 116: 1064-1065 (1980); Salek et al., Corrosion Prevention & Control, 9-10 (1983); Mapp et al., Planta Medica, 18: 361-365 (1970); Ranwald, Archives Pharmazie, 315: 477-478 (1982). Eine Anzahl von phenolischen Substanzen einschließlich Anthrachinonen und deren Glycosiden sind als pharmazeutisch aktiv bekannt. Bruce, Excelsa 5: 57-68 (1975); Suga et al., Cosmetics and Toiletries, 98: 105-108 (1983).
Die schleimhaltige Gallerte aus den Parenchymzellen der Pflanze wird als Aloe vera-Gel bezeichnet. Es gibt im allgemeinen keine Anthrachinone, welche sich zersetzen und Verfärbung des Gels bewirken könnten, außer wenn das Gel durch eine ungeeignete. Verarbeitungstechnik kontaminiert wird.
Aloe vera-Gel enthält etwa 98,5 Gew.-% Wasser, Mehr als 60% des Gesamtfeststoffs bestehen aus Polysacchariden von Kohlehydratursprung. Organische Säuren und anorganische Verbindungen, insbesondere Calciumoxalat, machen den restlichen Anteil des Feststoffs aus.
Ganze Blätter, Exudate und frische Gele aus Aloe-Pflanzen wurden für eine Vielzahl von Leiden beim Menschen verwendet. Der Nachweis ihrer Verwendung als medizinisches Heilmittel kann bis zu den Ägyptern 400 v. Chr. zurückverfolgt werden. Aloevera wurde ebenfalls zur Einbalsamierung von Toten wie auch zum Schutz der die Einbalsamierung vornehmenden Personen vor todbringendem Mittel benutzt. Andere frühe Zivilisationen verwendeten Aloe vera zur Hautpflege, zur Linderung von Insektenstichen und -bissen, zur Behandlung von Schrammen und Hautgeschwüren, zur Förderung der Wundheilung, zur Verhütung von Haarverlust und als Abführmittel. Es war die traditionelle Medizin für zahlreiche Kulturen als Wurmmittel, Abführmittel und Magenmittel, und es wurde u. a. bei Lepra, Verbrennungen und allergischen Zuständen verwendet. Cole et al., Archives of Dermatology and Syphilology, 47 : 250 (1943); Chopra et al., Glossary of Indian Medicinal Plants, Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi, Ship, Journal of the American Medica Association, 238: 1770-1772 (1977); Morton, Atlas of Medicinal Plants of Middle American Bahamas to Yucatan, Charles C. Thomas Publisher, 78-80 (1981); Diez-Martinez, La Zabila, Communicado No. 46 Sobre Recursos Bioticos Potenciales del Pais, INIREB, Mexico (1981); Dastur, Medicinal Plants of India and Pakistan; D. B. Taraporevala Sons & Co., Private Ltd., Bombay 16-17 (1962).
Aloe vera erfreut sich einer langen Geschichte der Akzeptanz durch Laien, "lindernde" oder "heilende" Qualitäten zu besitzen. Während der letzten Jahre wurden zahlreiche Bücher und Aufsätze, welche wissenschaftliche Anforderungen erfüllen, über Aloe vera geschrieben. Organisationen wie der Aloe vera Council und anerkannte medizinische Institutionen haben durch Veröffentlichungen und Fallstudien von Medizinern, Veterinären und anderen Wissenschaftlern das "Aloe Phänomen" bestätigt. Aloe vera wurde extensiv auf dem Gebiet der Dermatologie, insbesondere zur Behandlung von durch Strahlung hervorgerufenen Hautzuständen, beschrieben. Mackee, X-Rays and Radium in the Treatment of Diseases of the Skin; 3rd Ed., Lea and Febiger, Philadelphia, 319-320 (1938); Rovalti et al., Industrial Medicine and Surgery, 28: 364-368 (1959); Zawahry et al " Quotations From Medical Journals on Aloe Research, Ed. Max B. Skousen, Aloe Vera Research Institute, Cypress, California, 18-23 (1977); Cera et el., Journal of the American Animal Hospital Association, 18: 633-638 (1982). Der Umfang der wissenschaftlichen Literatur, welche medizinische Anwendungen bei Verdauungsproblemen als ein viruswirksames, bakterizides und fungizides Mittel und bei gynäkologischen Leiden dokumentiert, ist umfangreich und wurde in angemessener Weise von Grindley und Reynolds (Journal of Ethnopharmacology, 16: 117-151 (1986)) berücksichtigt.
Die Wichtigkeit von in Aloearten gefundenen Chemikalien wird durch die Tatsache gezeigt, daß sie in jeder bekannten nationalen Pharmakopöe aufgeführt sind. U.S. Pharmacopeia, 20th Revision, The National Formulary, 14th Edition, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville, Maryland, 1. Juli 1980. Jedoch beschreibt die U.S. Pharmakopöe den Arzneimittelanteil des gelben Saftes von Aloepflanzen, jedoch nicht den vom Pflanzenschleim. Das frische nicht-konservierte Gel besteht zu etwa 98,5-99,2% aus Wasser. Der Gesamtfeststoff, der nach der Entfernung des Wassers zurückbleibt, liegt im Bereich von 0,8 bis 1,5%. Der Pflanzenschleim, die Zucker, Fasern, Proteine, Asche, Fette, das Aloin und Harz sind die Hauptbestandteile des Feststoffes. Robson et al., Journal of Burn Care Rehabilitation, 3: 157-163 (1982). Zusammensetzungen, welche Enzyme, organische Säuren, anorganische Salze, Aminosäuren und Alkaloide enthalten, wurden festgestellt. Rowe et al., Journal of the American Pharmaceutical Association, 30: 262-266 (1941); Roboz et al., Journal of the American Chemical Society, 70: 3248-3249 (1948); Waller et al., Proceedings of Oklahoma Academy of Science, 58: 69-76 (1978). In Abhängigkeit von dem Weg, auf welchem die Blätter verarbeitet werden, sind Pflanzenschleim und Zucker die Hauptkomponenten des dehydratisierten Gels. Die gefundenen Zucker sind Galactose, Glucose, Mannose, Rhamnose, Xylose und Uronsäuren. Obwohl sich widersprechende Berichte festgestellt wurden; besteht der Pflanzenschleim hauptsächlich aus Mannan oder Glucomannan. Eberendu et al., The Chemical Characterization of CARRISYN(R) (in Vorbereitung); Mandal et al., Carbohydrate Research, 87: 249-256 (1980b); Roboz et al., Journal of the American Chemical Society, 70: 3248-3249 - (1948); Gowda et al., Carbohydrate Research, 72: 201-205 (1979); Segal et al., Lloydia, 31 : 423 (1968).
Vor dieser Arbeit war die Kontroverse über die Identität des Wirkstoffs bzw. der Wirkstoffe in Aloe vera nicht abgeschlossen. Es ist daher wichtig, klar zwischen den in dem Gel vorhandenen Komponenten und den in den Exudaten gefundenen Komponenten zu unterscheiden. Ein großer Teil des Gels ist ein Pflanzenschleim von hauptsächlich Polysaccharidnatur mit geringeren Mengen von verschiedenen anderen Verbindungen. Es wurde beobachtet, daß in einigen der beobachteten Aktivitäten eine gewisse synergistische Wirkung zwischen der Polysaccharidbasis und anderen Komponenten bestehen kann. Leung, Excelsa 8: 65-68 (1978); Henry, Cosmetics and Toiletries, 94: 42-50 (1979). Beispielsweise berichten mehrere Forscher, daß die effektiven Komponenten für die Wundheilung Tanninsäure (Freytag, Pharmazie, 9: 70 5 (1954)) und eine Art von Polysaccharid sein können. Kawashima et al., Chemical Abstracts, 93: 13075 (1979). Mackee, siehe oben, gab an, daß das Gel, nicht die Rinde oder das Exudat, für die günstigen Effekte bei der Behandlung von Strahlungsverbrennungen verantwortlich war, und er betonte die Wichtigkeit der Verwendung von frischen Blättern für eine effektive Behandlung. Polysaccharide bauen mit der Zeit ab, und bestimmte Molekulargewichtsgrößen können zum Hervorrufen einer spezifischen pharmakologischen Antwort erforderlich sein. Goto et al., Gann, 63: 371-374 (1972).
Es gibt viele Beispiele in der Literatur, daß Polysaccharide pharmakologische und physiologische Aktivitäten zeigen können ohne Unterstützung durch andere Komponenten. G. Gialdroni-Grassi, International Archives of Allergy and Applied Immunology, 76 (Suppl. 1): 119-127 (1985); Ohno et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33: 2564-2568 (1985); Leibovici et al., Chemico- Biological Interactions, 60: 191-200 (1986); Ukai et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 31: 741-744 (1983); Leibovici et al., Anticancer Research, 5: 553-558 (1985). Ein solches Beispiel bezieht sich auf die Entwicklung von Atherosklerose. Hyperlipidämie in der allgemeinen Bevölkerung und insbesondere familiäre Hypercholesterinämie ist mit koronarer Herzkrankheit und Tod verbunden. In Ländern, wo die Aufnahme von Fasern bei der Ernährung hoch ist, scheint Atherosklerose nicht üblich zu sein. Trowell et al., Editors, Refined Carbohydrate Foods and Disease, London, Academic Press, 207 (1975). Es wird berichtet, daß Pectin und Guar Cholesterin bei normalen und hyperlipidämischen Patienten erniedrigen. Kay et al., American Journal of Clinical Nutrition, 30: 171-175 (1977). Johannisbrotgummi, ein aus Mannose und Galactose bestehendes Polysaccharid, setzte die Plasmalipoprotein-Cholesterinkonzentrationen sowohl bei normalen als auch familiär hypercholesterinämischen Personen herab. Zavoral et al., American Journal of Clinical Nutrition, 38: 285-294 (1983). Die Zugabe von Guar-Gummi zu Kohlehydratmahlzeiten erniedrigte den Glucoseanstieg nach dem Essen sowohl bei normalen als auch diabetischen Personen. Jenkins et al., Lancet, 2; 779-780 (1977). Kuhl et al., (Diabetes Care, 6 (2): 152-154 (1983)) zeigten, daß Guar- Gummi eine glycämische Steuerung von schwangeren, insulinabhängigen, diabetischen Patienten zeigte.
Über die Antitumoraktivität von Polysacchariden wurde ausgiebig berichtet. Aus Lentinus cyathiformis hergestellte Polysaccharide steigern bekanntermaßen die Wirtsabwehr gegen Tumore. Rethy et al., Annales Immunologiae Hungaricae, 21: 285-290 (1981). Es gibt mehrere Berichte, daß Polysaccharide aus Pilzen, Hefe oder Bakterienextrakten ein hohes Ausmaß an Wirtsabwehraktivität gegenüber Viren- und Tumorinfestationen hervorrufen können. Chihara et al., Nature, 222: 687 (1969); Schwartzman, Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 29: 737 (1932); Rethy, X. International Congress of Microbiology: Moscow, 642 (1966). Suzuki et el. (Journal of Pharmacobio-Dynamics, 7: 492-500 (1984)) berichteten ebenfalls über die Antitumoraktivität einer Polysaccharidfraktion (GF-1), extrahiert aus Fruchtkörpern eines Pilzes, Grifola frondosa. Diese Fraktion zeigte äquivalente, hohe Werte an hemmender Aktivität bei der intraperitonealen (i. p.), intravenösen (i. v.) und intratumoralen (i. t.) Applikation. Jedoch war die orale Applikation (per os) nicht effektiv. Die GF-1 Fraktion zeigte ebenfalls Antitumorwirkung gegen die feste Form von Meth-A-Fibrosarkom und mm 46 Karzinom bei Mäusen. Lentinan, das ein 6-verzweigtes B-1-3-gebundenes Glucan ähnlich wie GF-1 ist, war gegenüber Meth-A-Fibrosarkom nicht wirksam. Chihara, The antitumor polysaccharide Lentinan: an overview; "Manipulation of Host Defense Mechanisms", herausgegeben von Aoki et al., Excerpta Medica, North Holland, 1-16 (1981); Sasaki et al., Carbohydrate Research, 47: 99-104 (1976). Es wurde berichtet, daß synthetisierte verzweigte Polysaccharide Aktivitäten gegenüber Tumoren zeigen. Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 186: 449 (1985). Matsuzaki et al., (Makromol. Chem., 187: 325-331 (1986)) synthetisierten verzweigte Polysaccharide, welche signifikante Aktivitäten zeigten, aus Elfenbeinnußmannan (B-(1-4)-D-Mannopyranose) und B-(1-4)-gebundenem Glucomannan. Ein partiell acetyliertes lineares B-(1-3)-D-Mannan, extrahiert aus Fruchtkörpern von Dictyophoria indusiata Fisch, zeigte ebenfalls Antitumoraktivität. Hara et al., Carbohydrate Research, 143: 111 (1982). Es scheint, daß die Antitumorwirkung von dem Typ der Polymerhauptkette und ihrem Polymerisationsgrad abhängt, da B-(1-3)-Glucantyp-Polymere höhere Antitumoraktivität als B-(1-4)-Glucan und Hemicellulosepolymere zeigen. Matsuzaki et al., Makromol. Chem., 187: 325-331 (1986). Ein carboxymethyliertes Derivat von B-(1-3)- Glucan, erhalten aus Bakterienkulturfiltrat, bewirkte starken Zellverlust von manifestem Sarcoma 180 Tumoren innerhalb 2 Stunden nach Injektion des Derivats. Baba et al., Journal of Immunopharmacology, 8: 569-572 (1986). Derselbe Autor beobachtete eine kompensatorische Erhöhung von polymorphkernigen Leukocyten als Folge der Injektion der Substanz. Übrigens beeinflußte Bestatin, ein bekanntermaßen immunmodulierende Aktivität und Antitumoraktivität besitzendes Dipeptid (Ishizuka et al., Journal of Antibiotics, 32: 642-652 (1980)), weder die Tumorausbeute noch die Zahl von polymorphkernigen Leukocyten. Baba et al., siehe oben.
Es gibt zahlreiche Berichte über den Antitumoreffekt von sulfatierten Polysacchariden einschließlich Heparin (Jolles et al., Acta Univ. Int. Cancer, 16: 682-685 (1960); Suemasu et al., Gann, 61: 125-130 (1970)), sulfatiertem Laminaran und Dextran. Jolles et al., British Journal of Cancer, 17: 109-115 (1963). Yamamoto et al., (Japanese Journal of Experimental Medicine, 54: 143-151 (1984)) berichteten über die Steigerung der Antitumoraktivität einer Fucoidanfraktion durch weitere Sulfatierung. Das sulfatierte Produkt zeigte Aktivität gegen L-1210 Leukämie. Die Autoren postulierten, daß der Mechanismus der Antitumorwirkung teilweise Folge der Hemmung des invasiven Wachstums von L-1210 Zellen sei als ein Ergebnis von elektrostatischer Abstoßung zwischen der Tumorzelle und Mesothelzellen. Yamamoto et al., siehe oben. Es wird ebenfalls berichtet, daß Polysaccharide mit Sulfatgruppen Mitogene für menschliche T-Zellen und Aktivatoren für polyklonale B-Zellen von Mäusen sind. Sugawara et al., Microbiological Immunology, 28 : 831-839 (1984). Im allgemeinen besitzen Homopolysaccharide mit hohem Molekulargewicht und mit Sulfatgruppen diese Eigenschaften. Dorries et al., European Journal of Immunology, 4: 230-233 (1974); Sugawara et al., Cell Immunology, 74: 162-171 (1982).
Es wurde berichtet, daß aus der Hefe Saccharomyces cerbisiae- extrahiertes Glucan ein Modulator für Zell- und Humoralimmunität ist. Wooles et al., Science, 142: 1078-1080 (1963). Das Polysaccharid stimulierte ebenfalls die Wucherung von pluripotenten, blutbildenden Stammzellen von Mäusen, koloniebildenden Granulozytmacrophag-Zellen und Zellen, welche Myeloid- und Erythroidkolonien bilden. Pospisil et al., Experientia, 38: 1232-1234 (1982); Burgaleta et al., Cancer Research, 37: 1739-1742 (1977). Maisin et al., (Radiation Research, 105: 276-281 (1986)) berichteten ebenfalls, daß i. v. Applikation eines Polysaccharids blutbildenden Stammzellen bei Mäusen Schutz gegenüber Exposition von Röntgenstrahlen induzierte, wodurch die Mortalität der so bestrahlten Mäuse abnahm.
V. Lackovic et al., (Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 134: 874-879 (1970)) nahmen Hefezellwände und extrahierten die gesamten Bestandteile, wobei lediglich "Mannane" übrigblieben, die, wie sie fanden, für die Induktion der γ-Interferonbildung von Monocyten verantwortlich waren. Die "gereinigten Mannane", von denen gesagt wird, daß sie für die physiologische Antwort verantwortlich sind, besaßen ein Molekulargewicht von 5.500-20.000 Daltons. Sie stellten die Theorie auf, daß die Mannane peritoneale Macrophagen von Mäusen zur Bildung des γ-Interferons stimulieren. Sie geben an, daß diese isolierten Mannane keine Toxizität zeigten und "sie schlechte Antigene sind". Es gab keinen Hinweis bei Lackovic et al. für die Verwendung dieser "gereinigten Mannane" für Antivirusaktivität oder für IL-1 Stimulation. Wir nehmen an, daß die "gereinigten Mannane" von Lackovic et al. eine Mischung von unbekannten und nicht identifizierten, substituierten und unsubstituierten Mannanen umfaßte.
Seljelid et al., (Experimental Cell Research, 131: 121 (1981)) haben beobachtet, daß unlösliche oder gelbildende Glycane Makrophagen in vitro aktivierten, während die entsprechenden löslichen Glycane dies nicht bewirkten. Sie postulierten, daß die Orientierung, in der das Glycan dem mononuklearen Phagocyten präsentiert wurde, für die Aktivierung entscheidend war. Bogwald et al., (Scandinavian Journal of Immunology, 20: 355-360 (1984)) immobilisierten Glycane, welche einen stimulierenden Effekt auf die Makrophagen in vitro hatten. Dies führte die Autoren zu der Annahme, daß die räumliche Anordnung des Glycans entscheidend für den Effekt auf die Makrophagen in vitro war. Ein aus Candida albicans isoliertes, gereinigtes Polysaccharid induzierte eine Antikörperreaktion durch menschliche periphere Blutlymphocyten in vitro. Wirz et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 33: 199-209 (1984). Es gab signifikante Unterschiede zwischen den Anti-candida-Antikörpern in Seren von normalen und mit Candida infizierten Individuen. Wirz et al., siehe oben.
Die Antivirusaktivität von Polysacchariden und von an Peptide gebundenen Polysacchariden wurde beobachtet. Suzuki et al., Journal of Antibiotics, 32: 1336-1345 (1979). Suzuki et al., siehe oben, berichteten über eine Antiviruswirkung von Peptidomannan (KS-2), das aus Kulturmycelen von Lentinus edodes extrahiert war. Sowohl orale als auch intraperitoneale (i. p.) Applikation erhöhte den Spitzentiter des Seruminterferons, was Mäuse gegen Virusinfektionen schützte. Dies unterschied sich von Dextranphosphat (DP-40) (Suzuki et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 149: 1069-1075 (1975)) und 9-Methylstreptimidon (9-MS) (Saito et al., Antimier. Agent & Chemotherapy, 10: 14-19 (1976)), welche höhere Titer von Interferon in Mäusen nur bei intravenöser (i. v.) oder intraperitonealer (i. p.) Applikation induzierten.
Über die entzündungshemmende Aktivität von Aloe vera-Gel wurde weit verbreitet sowohl durch mündliche Aussagen als auch in angesehenen wissenschaftlichen Zeitschriften berichtet. Rubel (Cosmetics and Toiletries, 98: 109-114 (1983)) diskutierten ausführlich den möglichen Mechanismus der entzündungshemmenden Wirkung von Aloe-Gel. Ukai et al., (Journal of Pharmacobio-Dynamics, 6: 983-990 (1983)) beobachteten entzündungshemmende Aktivität von Polysacchariden, die aus Fruchtkörpern von mehreren Pilzen extrahiert waren. Die Polysaccharide zeigten eine signifikant hemmende Wirkung bei durch Carrageenan induzierten Ödemen. Eines der Polymere, O-acetyliertes-D-Mannan (T-2-HN), zeigte zusätzlich eine stärker ausgeprägte hemmende Wirkung als Phenylbutazon bei Hyperalgesie durch Verbrennungen. Ukai et al., siehe oben. Die Behauptung, daß das Polysaccharid frei von Protein und Lipiden ist, legt es stark nahe, daß die entzündungshemmende Wirkung nur dem acetylierten Mannan zuzuschreiben ist. Andere Forscher haben ebenfalls über entzündungshemmende Wirkungen von komplexen Polysacchariden berichtet (Saeki et al., Japanese Journal of Pharmacology, 24: 109-118 (1974)), von Glycoproteinen (Arita et al., Journal of Pharmacology, 24: 861-869 (1974)) und von sulfatierten Polysacchariden (Rocha et al., Biochemical Pharmacology, 18: 1285-1295 (1969)).
Literaturberichte, daß Polysaccharide pharmakologische und physiologische Aktivitäten besitzen, überfluten weiterhin die Seiten von hochangesehenen wissenschaftlichen Zeitschriften. Es ist daher nicht unlogisch, daß das schleimige Gel von Aloe vera, welches hauptsächlich ein Polysaccharid ist, das Geheimnis der medizinischen Eigenschaften von Aloe vera ist. Die Diskrepanzen darüber, ob das Polysaccharid ein Glucomannan, ein Mannan, ein Pectin oder von irgendeiner anderen Zusammensetzung ist, sind das Ergebnis von chemischen Reinigungsstufen. Bei Verarbeitung von Aloe entsprechend der vorliegenden Erfindung wurde eine teilweise acetylierte Polymannose durchweg als Hauptpolysaccharid mit pharmakologischer Aktivität isoliert. Yagi et al., (Planta Medica. 31: 17-20 (1977)) isolierten unter Anwendung einer schwach modifizierten Extraktionsmethode acetyliertes Mannan (Aloe-Mannan) aus Aloe arborescens Miller var. natalensis. Ovodova (Khim. Prior. Soedin, 83: 93833 (1975)) isolierten jedoch früher Pectin als Hauptkomponente derselben Aloespezies.
Wie zuvor diskutiert, wurde die biologische Aktivität von Polysacchariden seit vielen Jahren erkannt. Aus Pflanzen, Hefe und Bakterien gewonnene Polysaccharidmaterialien haben direkte biologische Aktivität durch Herbeiführen einer Steigerung in Wirtsabwehrsystemen gezeigt. Diese Reaktion wird hauptsächlich durch eine erhöhte Wirtsüberwachung für andere antigene Substanzen manifestiert. Polysaccharide dienen als Adjuvantien (Freunds, etc.) und Immunomodulatoren. Sie wirken ebenfalls als einzigartige, T-Zellen unabhängige Antigene. Sowohl zelluläre als auch humorale Immunität kann beeinflußt werden, und erhöhte Phagocytose von infektiösen Organismen und Tumorzellen wurde beobachtet, wie auch erhöhte Produkton von Immunoglobulinen.
Die Struktur dieser immunologisch aktiven Polysaccharide und die Typen von strukturellen Variationen scheinen die. Faktoren zu sein, welche ihre Potenz und Toxizität steuern. Ihre Wirkungsart(en) bleiben schlecht verständlich; jedoch zeigt ein neuerer Beweis, daß mehrere Polysaccharide Lymphocyten und Makrophagen zur Bildung eines breiten Bereiches von immunologisch aktiven Substanzen induzieren. Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung besitzt alle Attribute dieser immunologisch aktiven Substanzen; sie gehört zu den von allen bekannten biologisch aktiven Polysacchariden am meisten potenten, unterscheidet sich jedoch dadurch, daß keine Toxizität beobachtet wurde. Sie manifestiert ebenfalls spezifische Antivirusaktivität durch Veränderung der viralen Glycoproteinsynthese.
Die in Int. J. Immunopharmacol., Vol. 10, No. 8, 1988, Seiten 967-974 zitierten Referenzen beschreiben, daß Extraktmaterial aus Aloe vera zur Wundbehandlung eingesetzt werden kann und daß die aktive Verbindung dieses Materials Acemannan ist. Andere hierin zitierte Referenzen beschreiben die Fähigkeit von Acemannan, Virusinfektionen zu beschränken.
In Fed. Am. Soc. Exp. Biol. J., Vol. 2, No. 4, 1988, Seite A 682, Abstract 2239, wird ein Mäusemodell unter Verwendung von Tumortargetzellen und Makrophagen, welche mit Carrisyn(R) stimuliert, werden, beschrieben. Es wird angegeben, daß die Freisetzung von Cr&sup5;¹ aus markierten Targetzellen bestimmt wurde, und daß die Ergebnisse dieses in-vitro-Tests zeigen, daß mit Carrisyn(R) aktivierte Makrophagen bis zum 10-fachen effektiver bei der nicht- spezifischen Lyse von Tumorzellen als nicht-stimmulierte Kontrollen waren.
In der WO-A-87 00 052 werden Verfahren zur Herstellung von Aloe-Produkten, damit hergestellte Produkte und deren Zusammensetzungen beschrieben. Diese Patentanmeldung enthält Beispiele, welche zeigen, daß Carrisyn(R) als topisches Wundgel, zur Behandlung von ulzeröser Dickdarmentzündung, Aids und Schmerztic geeignet ist.
In Am. J. Clin. Pathol., Vol. 88, No. 4, 1987, Abstract 534, werden antivirale und immunstimulierende Eigenschaften von Carrisyn(R) beschrieben.
CARRISYN(R) ist die Marke, welche von der Patentinhaberin der vorliegenden Erfindung dem gereinigten Ethylalkoholextrakt des inneren Gels der Blätter von Aloe barbadensis Miller gegeben wurde. Die aktive Komponente von CARRISYN(R)-Extrakt wurde mit "Acemannan" von dem United States Adopted Name Council bezeichnet. Nicht weniger als 73% des CARRISYN(R)-Extraktes ist Acemannan; CARRISYN(R)-Extrakt umfaßt im allgemeinen etwa 73% bis 90% Acemannan. CARRISYN(R)-Extrakt wird im allgemeinen hergestellt durch Entfernung der äußeren Schale des Blattes, dann Entfernung und Verarbeitung des inneren Filets oder des Pflanzenschleims durch pH-Einstellung, Ethanolextraktion, Gefriertrocknung und Mahlen. Siehe Serial No. 144 872, angemeldet Januar 1988, eine Continuation-in-Part-Anmeldung von Serial No. 869 261 (jetzt US-Patent 4 735 935). Wie nehmen an, daß durch diese Verarbeitung keine kovalenten Bindungen verändert werden und daß daher keine toxischen Verbindungen gebildet werden. Diese Herstellungsstufen wurden entwickelt, um die Probleme zu überwinden, die durch die Tatsache gegeben sind, daß traditionelle Erzeuger von Aloeprodukten nicht in der Lage waren, die Polysaccharide zu standardisieren und zu stabilisieren. CARRISYN(R)-Extrakt ist ein flockiges, weißes, amorphes Pulver, das in Wasser und Dimethylsulfoxid schlecht löslich und in den meisten anderen organischen Lösungsmitteln unlöslich ist. Dieses Pulver enthält nicht weniger als 73% eines Polysaccharids, das im wesentlichen aus linearen (1-4)- D-Mannosyleinheiten besteht. Das Polysaccharid ist ein langkettiges Polymer, das unregelmäßig mit Acetylgruppen durchsetzt ist, die an das Polymer über ein Sauerstoffatom gebunden sind. Der Generic Name für das Polymer ist Acemannan. Der Acetylierungsgrad beträgt annähernd 0,8 Acetylgruppen pro Monomer, bestimmt nach der alkalischen Hydroxamatmethode (Hestrin, Journal of Biological Chemistry, 180: 240 (1949)). Die Analyse auf neutrale Zuckerbindungen zeigt, daß an die Kette, wahrscheinlich über eine (1-6)-Bindung, eine D-Galactopyranose im Verhältnis von annähernd 1 auf jeweils 7 Zucker gebunden ist. Das 20 : 1 Verhältnis von Mannose zu Galactose zeigt, daß Galactoseeinheiten ebenfalls aneinander gebunden sind, hauptsächlich über eine (1-4)-glycosidische Bindung. Die chemische Struktur von Acemannan kann wie folgt wiedergegeben werden:
Eine detaillierte Beschreibung der zur Herstellung der Zusamensetzung und zur Erkennung dieser Struktur angewandten Verfahren wird im US-Patent No. 4 735 935 und in der US-Patentanmeldung Serial No. 144 872 gegeben.
Acemannan ist eine biologisch aktive Komponente vom CARRISYN(R)-Extrakt, und es gehört zur selben chemischen Klasse wie die T-unabhängigen Antigene LPS (Lipopolysaccharid), FICOL, Dextran und Levan. Die T-unabhängigen Antigene weisen eine Anzahl von gemeinsamen Eigenschaften auf. Insbesondere sind sie alle ganz negativ geladene, große polymere Moleküle mit sich wiederholenden antigenen Determinanten, und viele von ihnen besitzen die Fähigkeit, bei hohen Konzentrationen andere B-Zellklone als die für das Antigen spezifischen zu aktivieren. Dies heißt, daß sie polyklonale B-Zellaktivierung aufweisen. Siehe Roitt, Brostoff und Male, Immunology, 1986, C. V. Mosby Company, St. Louis, Seiten 8.3 und 8.4.
Wenigstens 73% der gereinigten Menge CARRISYN(R)-Extrakt bestehen aus Polysaccharidpolymeren von Acemannan mit Molekulargewichten größer als 10.000 Daltons.
Acemannan ist nicht mutagen oder blastogen in in vitro Testsystemen. Toxikologische Untersuchungen in vivo von Acemannan schließen eine 91-tägige subchronische orale Toxizitätsstudie bei Hunden und eine 180-tägige chronische orale Toxizitätsstudie bei Ratten ein. Bei diesen Studien wurden keine toxischen Effekte bei Hunden, welche bis zu 825 mg/kg Acemannan pro Tag erhielten, festgestellt. Keine klinischen, groben pathologischen oder toxischen Effekte wurden bei Ratten, festgestellt, die bis zu 38.475 ppm Acemannan in ihrer Nahrung erhielten.
Bei Pilotstudien bewirkte die Applikation von Acemannan bei Hunden eine absolute Monocytose in Blutproben, die für vollständige Zählungen von weißen Blutzellen und morphologische Differenzierung entnommen wurden. Innerhalb von 2 Stunden nach der oralen Applikation von hohen Dosen von Acemannan erschienen große aktivierte Monocyten im Kreislauf.
Bei Verwendung eines ELISA Kits, das auf Nanogramm je Millilitermengen empfindlich ist, wurden nachweisbare Acemannankonzentrationen in dem Blut von Hunden nach i. v. Verabreichung gefunden. Die Konzentration sinkt ganz schnell ab und wird kaum nachweisbar nach 195 Minuten. Aufnahme und Konzentration des Acemannans innerhalb des Makrophagen/Monocyten-Systems wurde auch bestimmt.
Es wird angenommen, daß Acemannan als neues und außerordentlich potentes Adjuvans geeignet ist.
Fig. 1 und 2 zeigen abgeschnittene Teile eines Aloe vera Blattes.
Fig. 3 zeigt den zeitlichen Verlauf der Cr&sup5;¹ Freisetzung durch topische Mittel. Kulturen von menschlichen Fibroblasten wurden unterschiedlich lang mit 0,05% Granulex, Hibiclens, Betadine oder CARRISYN(R)-Extrakt (CDWG) inkubiert, und der Prozentsatz der gesamten Freisetzung von Radioaktivität wurde bestimmt. Die Werte sind Mittelwerte von 3-5 getrennten Bestimmungen zu jedem Zeitpunkt. Kontrollzellen (allein mit den Medien behandelt) setzten 3-5% des gesamten Cr&sup5;¹ während 30 Minuten frei.
Fig. 4 zeigt den Einfluß der Konzentration auf Zellschädigung. Kultivierte Fibroblaste wurden mit variierenden Konzentrationen von Hibiclens, Granulex, Betadine oder CARRISYN(R)-Extrakt (CDWG) 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Der Prozentsatz von freigesetztem Cr&sup5;¹ wurde bei jeder Konzentration bestimmt. Die Kontrollfreisetzung (von unbehandelten Zellen) war im Bereich von 1-5%. Die Werte sind Mittelwerte von 3-5 getrennten Bestimmungen.
Fig. 5 zeigt die Freisetzung von Chrom: Wirkung von CDWG und Serum. Zellen wurden in dem Medium allein (dunkle Säulen) oder in einem Medium, das CARRISYN(R)-Extrakt (0,5%) (schraffierte Säulen) enthält, oder in einem Medium mit 10% fötalem Kalbse rum (gestrichelte Säulen) 15 Minuten inkubiert. Betadine, Granulex oder Hibiclens (0,15%) wurden zugegeben und die Inkubation 15 Minuten lang fortgesetzt. Die Werte sind Mittelwerte von 3-4 getrennten Versuchen.
Die toxikologischen Wirkungen von Acemannan wurden in in vivo und in vitro Systemen untersucht.
Acemannan wurde auf mutagene Aktivität in dem Ames Salmonella Mikrosomentest geprüft. Die Tests wurden mit Salmonella typhimurium Stämmen TA1537, TA1538, TA98 und TA100 durchgeführt sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit eines Aroclor 1254-induzierten Rattenleber metabolischen Aktivierungssystem. Acemannan erwies sich als nicht mutagen, wenn gemäß diesen Testverfahren untersucht wurde.
Acemannan wurde in einige in vitro Testsysteme gegeben, um die Toxizität für Zellen, die durch Acemannan verursachte blastogene Reaktion und die Wirkungen auf HIV Virus und HIV-anfällige Zellen zu beurteilen. In vorbereitenden Untersuchungen wurde eine 1 : 10 Verdünnung einer 0,2% Vorratslösung (0,02% Endverdünnung) als nicht toxische Konzentration gewählt unter Verwendung von H-9 Zellen als Zielzellen. Eine 1 : 20 Verdünnung wurde als nicht toxisches Niveau gewählt unter Verwendung normaler Leukocyten als Zielzellen. Die Toxizitätsuntersuchungen zeigten, daß Acemannan bei einer Konzentration von 0,02% eine leicht stimulierende Wirkung auf die Gruppe B-Zellen hatte, wenn es mit dem Medium der Kontrollgruppe A-Zellen verglichen wurde. Das zusammen mit Phytohämagglutinin (PHA) (Gruppe D) untersuchte Arzneimittel hatte eine leicht hemmende Wirkung verglichen mit PHA allein (Gruppe C). Diese beobachteten Unterschiede wurden als nicht signifikant angesehen.
Die untersuchte Konzentration von Acemannan hemmte nicht wesentlich die Infektion von Zielzellen durch HIV-I (früher HTLV- III). Einige Zielzellen wurden mit Virus am Tag 0 infiziert und mit Arzneimitteln vom Tag drei an nach der Infektion (Gruppe III) behandelt. Zusätzlich wurden andere Zielzellen mit Arzneimittel drei Tage vor der Virusinfektion behandelt, und die Kultivierung wurde in Anwesenheit von Arzneimittel (Gruppe IV) fortgesetzt. In beiden Fällen zeigte sich eine ähnliche Virusinfektion und/oder Replikation selbst bei einer hohen Konzentration des positiven Kontrollvirus, wie durch Vergleich von umgekehrten Transkriptasenergebnisen von Tag sieben und Tag 14 gezeigt wurde. Ein unter der zweiten Bedingung behandelter Virus kann eine etwas verminderte Ansteckbarkeit gezeigt haben, aber infolge einer Überbewertung der Arzneimittelaktivität, erlaubten unzureichende Verdünnungen der behandelten Probenpunkte nicht, einen exakten Endpunkt für den Versuch zu erreichen.
Eine 14-tägige Toxizitätsuntersuchung, um einen geeigneten Dosierungsbereich zu bestimmen, wurde unter Verwendung von Sprague-Dawley kurz vorher entwöhnter Ratten durchgeführt, um die toxikologischen Wirkungen von CARRISYN(R)-Extrakt (Acemannan) zu bewerten und anschließend die Dosierung für eine 6-monatige subchronische Untersuchung zu bestimmen. Dosen von 0, 6000, 12500, 25000 und 50000 ppm von CARRISYN(R)-Extrakt wurden in die Nahrung von Gruppen von 10 männlichen und 10 weiblichen Ratten gegeben. Alle Tiere wurden täglich auf Anzeichen von Toxizität, Morbidität und Mortalität beobachtet. Körpergewicht und Nahrungsverbrauch wurden wöchentlich bestimmt. Klinische Chemie- und Hämotologieparameter wurden am Ende bestimmt. Endautopsien wurden während einer 2-tägigen Dauer durchgeführt. Die Organgewichte wurden erhalten, und ausgewählte Gewebe wurden in 10%igem, neutral gepufferten Formalin gehalten. Verbindungsbezogene Veränderungen wurden in den klinischen Anzeichen, dem Körpergewicht, dem Nahrungsverbrauch, der Hämatologie, klinischen Chemie oder Organgewichten nicht beobachtet. Die grobe pathologische Prüfung ergab zufällige, nicht verbindungsbezogene Änderungen. Sprague-Dawley Ratten scheinen daher bis zu 5% CARRISYN(R) in der Nahrung während wenigstens 2-wöchiger Dauer zu vertragen.
In einer anderen Untersuchung mit Ratten wurden 60 Charles River CD Ratten willkürlich sechs Behandlungsgruppen von jeweils fünf männlichen und fünf weiblichen Ratten zugeordnet in einer 2-wöchigen (14 Tage) Forschungsstudie mit oraler Dosierung von Acemannan. CARRISYN(R)-Extrakt (Acemannan) wurde in Baumwollsamenöl als Träger in Mengen suspendiert, die die folgenden Dosen (Behandlung) ergaben: 500, 1000, 2000, 3000 und 5000 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Kontrollratten erhielten nur Baumwollsamenöl- Träger. Alle Behandlungen wurden oral durch künstliche Sondenernährung mit einem konstanten Volumen von 20 ml/kg Körpergewicht verabreicht. Alle Tiere wurden wenigstens zweimal täglich auf offenkundige Anzeichen von Toxizität, Krankheit oder Mortalität beobachtet, und genaue Beobachtungen wurden wenigstens einmal pro Woche vorgenommen. Die individuellen Körpergewichte und Nahrungs verbrauchswerte wurden wöchentlich aufgezeichnet. Fünf Ratten starben einschließlich einer männlichen Ratte in jeder der 2000 und 5000 mg/kg/Tag Gruppen und zwei weibliche Ratten in der 5000 mg/kg/Tag Gruppe. Die eine in der 1000 mg/kg/Tag Gruppe gestorbene weibliche Ratte zeigte vorher keine anomalen Anzeichen. Von den anderen vier Ratten zeigten wenigstens zwei anomale Atmung, rote Verfärbung um den Mund, verminderte Darmentleerung und fühlten sich kalt an. Angeschwollene Bäuche wurden während der zweiten Woche bei allen männlichen Ratten in der höchsten Dosierungsgruppe und bei zwei weiblichen Ratten in der 3000 mg/kg/Tag Gruppe bemerkt. Anomale Atmung wurde bei den meisten Tieren insbesondere während der zweiten Woche bei den 1000, 2000, 3000 und 5000 mg/kg/Tag Dosen beobachtet und bei einer männlichen Ratte bei der 500 mg/kg/Tag Dosis. Die Körpergewichte und/oder der Nahrungsverbrauch waren bei den 5000 mg/kg/Tag männlichen und weiblichen Ratten erniedrigt, verglichen mit denen der Kontrollgruppe. Es wurde angenommen, daß die Atmungsnot und der angeschwollene Bauch, der bei einigen Tieren beobachtet wurde, der physikalischen Beschaffenheit der Versuchssubstanz/Baumwollsamenöl-Mischung eher zuzuordnen ist als der chemischen Beschaffenheit der Versuchssubstanz; es scheint wahrscheinlich, daß die Ratten nicht in der Lage waren, das Material genügend gut zu verdauen, um den Magen normal entleeren zu lassen. Der geschwollene Magen drang in die Brust und verursachte die Atmungsnot.
In Akutversuchen wurde fünf männlichen und fünf weiblichen Ratten auf einmal oral die Versuchssubstanz CARRISYN(R)-Extrakt (Acemannan) mit einer Dosis von 5000 mg%kg verabreicht. Die Versuchssubstanz wurde als Gewicht/Volumen Suspension in Baumwollsamenöl in einem Volumen von 20 ml/kg verabreicht. Die beurteilten Kriterien für die Behandlungswirkung während der 15-tägigen Untersuchungszeit waren Mortalität, pharmakotoxische Anzeichen, Körpergewicht und Pathologie, bestimmt durch Gesamtautopsieuntersuchungen. Es wurde kein Anzeichen einer auf die Versuchssubstanz bezogenen Toxizität bei irgendeinem Tier beobachtet. Es wurde gefunden, daß der LD&sub5;&sub0; Wert der Versuchssubstanz größer als 5000 mg/kg war, wenn sie auf einmal oral den männlichen und weiblichen Ratten verabreicht wurde. Dieselben Ergebnisse wurden erhalten, wenn dasselbe Verfahren durchgeführt wurde unter Verwendung von fünf männlichen und fünf weiblichen Ratten.
Eine 91-tägige subchronische Toxizitätsuntersuchung bei Hun den wurde mit CARRISYN(R)-Extrakt (Acemannan) durchgeführt, um die toxikologischen Reaktionen nach der oralen Verabreichung zu bewerten. Die Untersuchung bestand aus vier Gruppen von vier männlichen und vier weiblichen reinrassigen Beagle-Hunden, die CARRISYN(R)-Extrakt (Acemannan) in oralen Dosen von 0, 100, 400 oder 1500 mg/kg/Tag erhielten, Das Material wurde täglich verabreicht, indem die erforderliche Menge der Versuchssubstanz zur Schaffung der festgelegten Dosis für jeden Hund in eine Futtermenge gegeben wurde, die erwartungsgemäß der Hund während eirjär 1-stündigen Fütterungszeit zu sich nimmt. Die angebotene Futtermenge basierte auf dem Futterverbrauch am Vortag. Alle Hunde erhielten die theoretische-Dosis ± 10%. Die Hunde wurden während des Vorversuchs in wöchentlichen Intervallen und vor der Endautopsie gewogen. Der Futterverbrauch wurde täglich gemessen, wobei 1 Woche vor der Dosierung begonnen wurde. Die Morbidität, Mortalität und Anzeichen von Toxizität wurden täglich vor Beginn und während der Dosierung überwacht. Die Parameter der klinischen Chemie, Elektrophorese, Hämatologie und des Urins wurden während des Vorversuchs, nach 45 Tagen und vor dem Ende bestimmt. Nach der 86. Dosierung wurden Blutproben von den Hunden mit hoher Dosierung und den Kontrollhunden in periodischen Intervallen während einer 24-stündigen Zeitspanne gesammelt, um mögliche Veränderungen bei den weißen Blutzellenparametern zu bewerten. Alle Hunde überlebten bis zum Ende der Untersuchung. Bei der Beendigung wurden die Hunde einer Gesamtautopsieprüfung unterzogen; ausgewählte Organe und Gewebe wurden in 10%igem, neutral gepuffertem Formalin aufbewahrt, und mit Hämotoxylin und Eosin gefärbte Schnitte dieser Gewebe wurden, mikroskopisch untersucht. Ausgewählte Organe von allen Hunden wurden zur Bestimmung der absoluten und relativen Organgewichte ebenso wie für die Berechnung der Organ-zu-Hirn Gewichtsverhältnisse gewogen. Klinische, in den behandelten Tieren bemerkte Anzeichen wurden als zufällige Ergebnisse oder von vergleichbarer Schwere wie diejenigen berücksichtigt, die bei den Kontrolltieren beobachtet wurden, und es wurde nicht angenommen, daß sie sich auf die Verabreichung der Verbindung bezogen. Auf die Verbindung bezogene Veränderungen wurden beim Körpergewicht, beim Futterverbrauch, bei den Parametern der klinischen Chemie, des Urins oder der Elektrophorese nicht beobachtet. Ein möglicher Trend zu einem Ansteigen der absoluten Zahl der Monocyten wurde während der 24-stündigen Reihenblutabnahme bemerkt, aber nur bei den männlichen Hunden. Die mittleren absoluten und relativen Organgewichte wären bei den Kontroll- und mit der Verbindung behandelten Hunden ähnlich. Alle groben und mikroskopischen pathologischen Befunde wurden als zufällig und nicht auf die Verabreichung der Verbindungen bezogen angesehen.
Die pharmakologischen Wirkungen und Effekte von Acemannan wurden in einer Vielzahl von in vitro und in vivo Versuchssystemen untersucht.
Eine Untersuchung wurde durchgeführt unter Verwendung von menschlichen peripheren Blutmonocyten-Zellkulturen und C&sub1;&sub4;-markiertem Acemannan, um den Einbau oder die Absorption von Acemannan in ein biologisches System zu verfolgen (Beispiel 4, unten). In dieser Untersuchung wurden nachweisbare Mengen von C&sub1;&sub4;-markiertem Acemannan von den menschlichen peripheren Monocyten/Makrophagen Zellen absorbiert oder aufgenommen. Ein Spitzeneinbau fand bei 48 Stunden statt. Das C&sub1;&sub4;-markierte Acemannan war bei einer Konzentration von 5 mg/ml nicht cytotoxisch für die Monocyten/Makrophagen Zellen, und die abgebaute Zellmasse, in Gewicht/Volumen (w/v) ausgedrückt, war 760 mal größer als das w/v der abgebauten Acemannanlösung. Diese Ergebnisse deuten an, daß die Makrophagenzellform zur intrazellulären Konzentration von Acemannan auf sehr hohem Niveau fähig ist, das nicht cytotoxisch ist.
Es wurden Versuche durchgeführt zur Entwicklung eines ELISA Kits zum Nachweis von freiem Acemannan in Seren von menschlichen Patienten und Tieren an Serumproben, die von einem 15 kg Hund stammten, dem 3 mg/kg Acemannan i. v. gegeben worden waren. Die Ergebnisse zeigen, daß Acemannan im Serum nachweisbar ist und schnell aus dem Blut entfernt wird. Proben, die 195 Minuten nach der Acemannaninjektion entnommen wurden, enthielten sehr niedrige Konzentrationen.
Um die Eignung von Acemannan für die parenterale Anwendung zu bewerten, wurden zwei Kaninchen 5 mg Acemannan i. v, gegeben, um irgendeine auffallende Wirkung bei dem Kaninchen und irgendeine Veränderung in der Morphologie der weißen Blutzellen 1 Stunde und 2 Stunden nach der Injektion festzustellen. Acemannan verursachte bei keinem Kaninchen eine bemerkbare klinische Veränderung des physischen Zustands. Die Blutproben eines Kaninchens gerannen aus einem unbekannten Grund (wahrscheinlich defekte EDTA Röhrchen). Ein anderer Posten von EDTA Röhrchen wurde für das andere Kaninchen verwendet, und die Blutproben gerannen nicht. Die Anwesenheit einer Zahl von großen mononuklearen Zellen auf dem mit Blut bestrichenen Objektträger, hergestellt 2 Stunden nach der Injektion, wurde dem Acemannan zugeschrieben.
Ein Hauttest wurde bei Kaninchen durchgeführt, um die Reizeigenschaften von Acemannan nach der intradermalen Injektion zu bewerten. Keine kutane oder systemische Reaktion wurde infolge jeder der Testmaterialien nach der Injektion von 0,1 ml einer 1 mg/ml Testlösung bemerkt.
Ein Pyrogenversuch wurde bei Kaninchen gemäß dem Pyrogentestprotokoll durchgeführt, das in U.S.P. XXI, Biological Test [151] beschrieben ist, unter Verwendung einer 1 mg/ml injizierbaren Acemannanlösung. Häufigere Temperaturmessungen wurden durchgeführt als in der U.S.P. festgesetzt wegen der unbekannten systemischen Wirkungen des injizierten Acemannans. Die Temperaturänderungen bei den Versuchstieren überstiegen nicht die durch das U.S.P. Protokoll erlaubten minimalen Änderungen; daher erfüllt die Lösung die U.S.P. Anforderungen für die Abwesenheit von Pyrogenen. Injizierbares Acemannan löst einen maximalen Körpertemperaturanstieg von 0,3ºC aus, gemessen an einem Kaninchen. Es wurde bemerkt, daß dieser Temperaturanstieg 90 Minuten nach der Injektion stattfand. Acemannan ist ein Induktor von Interleukin-1 (IL-1) Produktion durch Makrophagen und Monocyten in vitro. Da IL-1 ein potentes Pyrogen ist, könnte dies den minimalen, verspäteten Temperaturanstieg in diesem Kaninchen erklären.
Um die Eignung von Acemannanlösung für intraarteriellen Gebrauch zu beurteilen, wurde eine Dosis von 1,5 ml injizierbares Acemannan (1 mg/ml) in die Zentralarterie eines Kaninchenohrs ohne Schwierigkeiten injiziert. Das von der Arterie gelieferte Gewebe zeigte nach 24 Stunden, 48 Stunden oder 7 Tagen nach der Injektion keine starken Veränderungen. Obwohl das injizierte Acemannan sogar eine dicke Suspension von Teilchen bildete, wurde das Material von dem lokalen Gewebe gut vertragen und verstopfte nicht die Kapillaren der Ohrspitze.
Ein Versuch wurde auch durchgeführt um festzustellen, ob eine große Dosis von i. p. injiziertem Acemannan Anzeichen von Unwohlsein oder ein Ansteigen der Temperatur auslösen würde. Klinisch-physikalische Basisprüfungen, einschließlich rektaler Temperaturen wurden bei zwei Kaninchen gesammelt. Den Kaninchen wurde eine i. p. Injektion von entweder 5 ml Acemannanlösung (1 mg/ml) oder 5 ml derselben normalen Kochsalzlösung gegeben, die zum Verdünnen und Herstellen des Acemannan-Versuchsmaterials verwendet wurde. Die Kaninchen wurden 1, 2, 24 und 48 Stunden nach der Injektion auf Anzeichen von physischer Änderung, Unwohlsein oder Temperaturerhöhung untersucht. Es wurde keine Reaktion auf jede der Versuchsmaterialien wahrgenommen.
Um die Wirkung von Acemannan auf menschliche, periphere, Blutzellen festzustellen, wurden in vitro Versuche durchgeführt. Es wurde beobachtet, daß Acemannan ein potenter Induktor der Produktion von Interleukin-1 und Prostagladin E&sub2; durch Monocyten und Makrophagen ist.
Vier nicht reinrassigen Hunden wurden Einzeldosen des CARRISYN(R)-Extrakts (Acemannan) gegeben, und sie wurden auf Änderungen bei klinischen Anzeichen und Laborblutparametern beobachtet. Die verabreichten Dosen des CARRISYN(R)-Extrakts lagen im Bereich von 15 bis 1500 mg/kg des Körpergewichts. Ein Kontrollhund wurde einer Placeboverabreichung und Behandlung unterzogen. Anschließend wurden dieselben fünf Hunde für ein 93-tägiges orales Verabreichungsprotokoll mit CARRISYN(R)-Extrakt eingesetzt. Die ausgewählte Dosis betrug 150 mg/kg/Tag. In beiden Untersuchungen zeigten die behandelten Hunde und der Kontrollhund keine Veränderungen im Verhalten oder bei den Ergebnissen der klinischen Prüfung. Der einzige gemessene Parameter, bei dem eine Veränderung bei der Verabreichung der Testsubstanz beobachtet wurde, war ein Anstieg der Zahl der zirkulierenden Monocyten, der während der Differentialzählung der weißen Zellen bemerkt wurde. Einige dieser Monocyten schienen aktiviert zu sein, da sie größer waren als die anderen auf den Blutausstrichen gesehenen Monocyten. Die Autopsie und histopathologische Prüfung aller Hunde am Ende der Versuche zeigte keine abnormen Befunde.
In einer durchgeführten Untersuchung, um eine mögliche biologische Markierung (erhöhte Zahl von zirkulierenden Monocyten) bei oral verabreichten Acemannan bei Hunden zu beurteilen, wurden 20 Beagle (10 männliche und 10 weibliche) in drei Behandlungsgruppen geteilt. CARRISYN(R)-Extrakt (Acemannan) wurde oral in Dosen von 0,05, 0,5 oder 5,0 mg/kg gegeben. Blutausstriche wurden auf die Gesamt- und Differentialzahlen von Leukocyten vor der Acemannanbehandlung und 1, 3, 5, 7 und 24 Stunden nach der Behandlung geprüft. Die Gesamtleukocyten- und Monocytenzahlen stiegen bei den 0,5 und 5,0 mg/kg Behandlungsgruppen an. Der Monocytenanstieg war 7 Stunden nach der Acemannanverabreichung am höchsten. Die Dosis ohne Wirkung für diese mögliche biologische Markierung betrug 0,05 mg/kg.
Da Acemannan die Monocytenfunktion in anderen Versuchen zu erhöhen scheint, wurden Untersuchungen entwickelt, um das Leistungsvermögen von Acemannan, die Immunantwort auf Alloantigen zu erhöhen und zu untersuchen, ob die mögliche Erhöhung ein durch Monocyten veranlaßtes Phänomen ist. Acemannan erhöhte nicht die Lymphocytenreaktion auf syngenische Antigene in der gemischten Lymphocytenkultur (MLC), aber es erhöhte wesentlich die alloantigene Antwort in einer auf die Dosierung bezogenen Art (2,6 · 10&supmin;&sup7; 2,6 · 10&supmin;&sup9; M). Es wurde gezeigt, daß diese Wirkung von Acemannan eine spezifische Antwort ist und mit in vitro Konzentrationen von Acemannan stattfindet, die auch in vivo erreicht werden kann. Eine getrennte Serie von Mischungsversuchen zeigte, daß Acemannaninkubation mit Monocyten durch Monocyten veranlaßte Signale zuließ, um die T-Zellenantwort auf Lektin zu erhöhen. Es wurde geschlossen, daß Acemannan ein Immunverstärker ist, indem es die Lymphocytenantwort auf Alloantigen erhöht. Es wurde unterstellt, daß der Mechanismus eine Erhöhung der Monocytenfreisetzung von IL-1 unter dem Schutz von Alloantigen umfaßt. Dieser Mechanismus kann teilweise das kürzlich beobachtete Leistungsvermögen von Acemannan erklären, bei Tier und Mensch Virusinfektionen zu beseitigen.
Die physikalischen Eigenschaften von Acemannan erlauben es, daß es in allen pharmazeutischen Dosierungsformen, die Fachleuten bekannt sind, formuliert und eingesetzt werden kann. Die biopharmazeutischen und toxikologischen Eigenschaften von Acemannan erlauben es, daß es in Geweben und Organen von lebenden Organismen verwendet und über einen breiten Dosierungsbereich verabreicht werden kann.
Acemannan kann oral oder parenteral verabreicht werden.
Mit geeigneten Hilfsmitteln gemischt, kann Acemannan verpreßt oder in feste Dosierungseinheiten, wie Pillen, Tabletten und beschichtete Tabletten gefüllt oder zu Kapseln verarbeitet werden.
Mit Hilfe von geeigneten flüssigen Trägern kann Acemannan in Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen injiziert werden. Als eine Adjuvanskomponente eines Impfstoffs oder anderen Produkts würde Acemannan mit einer Menge von 0,001 bis 10 mg je Dosierungseinheit des mit dem Adjuvans versehenen Produkts verwendet werden.

Beispiel 1 Herstellung einer injizierbaren CARRISYN(R)- Lösung

A. Herstellung der Lösung: CARRISYN(R)-Extrakt (Acemannan) wird entsprechend dem US-Patent 4 735 935 hergestellt. 12 Proben von CARRISYN(R)-Extrakt in feuchter Form, welche jeweils annähernd 100 g wiegen, werden in sterile Mason-Becher gegeben und lyophilisiert (2 Einheiten: eine von Unitop(R) - 600 SL, die andere Freeze Mobile(R) 21, beide von Vertis Corp., Gardiner, NY). Das erhaltene rohe CARRISYN(R)-Pulver wird gewogen, und die Gewichte werden aufgezeichnet. Annähernd 87 g des fertigen lyophilisierten Rohproduktes werden erhalten. Eine "Fast Touch"-Kaffeemühle von Krup(R), Model 203 (Robert Krup N. A., Closter, NJ) wird mit 50% Isopropylalkohol (Delta, Dallas) keimfrei gemacht und trocknen gelassen. Die Operateure sollten sterile Bedingungen einhalten und sollten vorzugsweise Handschuhe und Laborkittel tragen. Alle Arbeiten werden in einem Biological Safety Cabinet durchgeführt, das mit Desinfektionsmittel Bac-Down(R) (enthaltend sowohl (1) n-Alkyl-(60% C&sub1;&sub4;, 30% C&sub1;&sub6;, 5% C&sub1;&sub2;, 5% C&sub1;&sub8;)-dimethylbenzylammoniumchlorid und (2) n-Alkyl (68% C&sub1;&sub2; 32% C&sub1;&sub4;)-dimethylethylbenzylammoniumchlorid, vertrieben von Curtin Matherson Scientific, Houston, Texas), gereinigt und mit sauberen Unterlagen ausgelegt ist. Sterile Corning Gefäße werden vor der Zugabe des gemahlenen CARRISYN(R) gewogen. Annähernd 5 g des lyophilisierten rohen CARRISYN(R)-Pulvers wird gemahlen, nachdem die großen Stücke zu kleineren Stücken mit sterilen B-P-Klingen geschnitten sind. Das CARRISYN(R)-Pulver wird auf 100 mesh unter pulsierender Einwirkung gemahlen, um es zu einer feinen Pulverform zu zerkleinern. Das feine CARRISYN(R)-Pulver wird in sterile Corning-Becher gefüllt und erneut gewogen. Zur Bildung einer Lösung werden 5 g des feingemahlenen CARRISYN(R)-Pulvers in 1 l sterile 0,9%-ige Normalsalzlösung (Travenol Co., Deerfield, Illinois) überführt, welche 0,5% Chlorbutanol (Kodak Co., Rochester, New York) enthält, und sie wird in eine große sterile, pyrogenfreie Flasche (1,5 l) gegeben. Die CARRISYN(R)-Salzlösung wird auf einem Orbitron(R) Rotator (Boekel Co., S. N. HRO 8155-27, Philadelphia, Pa.) in einen Kühlschrank über Nacht gestellt, damit die CARRISYN(R)-haltige Lösung solubilisiert. Die CARRISYN(R)-Salzlösung wird dann aus dem Rotator entnommen und aufrecht in dem Kühlschrank 1 h angeordnet, damit sich die Teilchen absetzen können.
B. Abfüllen in Flaschen: Kommerzielle sterile 60 ml i. v.-Flaschen für subkutane i. v.-Injektion (Wheaton Co., Millville, New Jersey) mit sterilen Gummistopfen werden mit deionisiertem Wasser gespült, mit Aluminiumfolie abgedeckt und 15 min bei 15 lbs Druck und 121ºC im Autoklaven behandelt. Die sterilen Flaschen werden in einem 170ºC Trockenofen über Nacht zur Inaktivierung irgendeines restlichen Pyrogens angeordnet. Die Kappen für die Flaschen werden ebenfalls abgespült und zusammen mit den Flaschen im Autoklaven behandelt. Die CARRISYN(R)-Salzlösung wird in Teilmengen von 10 ml in die sterilen, pyrogenfreien 60 ml Flaschen abgefüllt. Dieser Vorgang erfolgt in einem Biological Safety Cabinet (Class 2, Type A, Germ Free Co., Model 820, Miami, Florida). Die gewünschte Konzentration beträgt annähernd 50 mg CARRISYN(R)/50 ml oder 1 mg/ml Salzlösung. Die Flaschen werden mit den sterilen Gummistopfen verschlossen. Die CARRISYN(R)-Salzlösungen in den mit Kappen versehenen Flaschen werden lyophilisiert. Nachdem die Proben trocken sind, werden Flaschen mit Metallbändern verschlossen und geeignet markiert. Die Proben werden dann bis zur Freigabe aus der Qualitätskontrolle und durch das Sicherheitspersonal entsprechend Good Manufacturing Practices aufbewahrt. 25 ml normale Salzlösung U.S.P. werden zu den Inhalten der 60 ml Behälter zugesetzt, wenn sie zur Verwendung fertig sind. Die Mischung sollte gut geschüttelt werden, bevor sie dem Patienten verabreicht wird.

Beispiel 2 Biologische Aktivität

Es ist sowohl bei in vivo als auch bei in vitro Versuchen beobachtet worden, daß CARRISYN(R)-Extrakt die Wucherung von Fibroblastzellen fördert. Eine Förderung um den Faktor 2-3 gegenüber der Kontrolle ist gelegentlich registriert worden. Tabelle 1 zeigt die Zahlen der Fibroblastwucherung, die durch CARRISYN(R)- Extrakt bei einer Konzentration von 0,1% (Gewicht/Volumen) während einer 72-stündigen Zeitspanne bewirkt wurde. Diese Versuche wurden durchgeführt, um die Zellantwort auf Proben von CARRISYN(R)-Extrakt zu beurteilen, die unter verschiedenen Bedingungen hergestellt waren. Tabelle 1 Wirkung von CARRISYN(R)-Extrakt auf die Fibrolastwucherung

Beispiel 3 Cytotoxizität für menschliche Fibroblasten in Kultur

Kulturen von menschlichen Fibroblasten wurden verwendet, um die Cytotoxizität von einigen topischen Mitteln zu bestimmen, die üblicherweise zur Reinigung von Wunden verwendet werden. Das Ziel war, ein CARRISYN(R)-Extrakt haltiges Wundgel mit einigen Standard-Reinigungsmitteln zu vergleichen, die verschiedene Wirkungsarten haben. Diese Standard-Reinigungsmittel sind entwickelt, um den bakteriellen Schaden und den Gewebeabbau nach dem Bruch der epidermalen Sperre zu verringern. Die Freisetzung von radioaktivem Chrom und die Aufnahme von Trypanblaufarbstoff wurden verwendet, um die Cytotoxität zu messen. Die Fibroblastkulturen wurden durch so hohe Konzentrationen von CARRISYN(R)-Extrakt wie 0,5% nicht geschädigt. Im Gegensatz dazu setzten Povidon-Iod (Betadine), Trypsin und Balsam von Peru (Granulex), Chlorhexidin (Hibiclens) und Wasserstoffperoxid Cr&sup5;¹ aus markierten Zellen frei. Betadine, Hibiclens und Granulex erhöhten auch die Färbung mit Trypanblau, aber die Behandlung mit CARRISYN(R)- Extrakt machte das nicht. Auf diesen in vitro Untersuchungen basierend, scheint CARRISYN(R)-Extrakt für die topische Anwendung sicher zu sein.
Zellkulturen: Menschliche Hautfibroblaste wurden aus Explantaten von den Vorhäuten von Neugeborenen und aus Proben von der Haut von Erwachsenen, die aus dem unteren Bauch beim Caesarean Abschnitt gesammelt waren, gezüchtet. Das Gewebe wurde von Fett und subcutanem Bindegewebe gesäubert, in 2 mm³ Teilchen zerkleinert und in einen kleinen (25 cm²) Kulturkolben gelegt. Das Kulturmedium, das aus Minimum Essential Medium (MEM) (Inland Laboratories), ergänzt mit 5% fötalem Kalbserum (Hazelton), 200 mM Glutamin und 1% Antibiotika bestand, wurde zugegeben, und die Kulturen wurden auf 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; gehalten.
Eine Mischung von Keratinocyten und Fibroblasten wuchs von den Ecken des Gewebes innerhalb von wenigen Tagen. Die Keratinocyten teilten sich nicht, aber innerhalb von 16-21 Tagen wucherten die Fibroblasten unter Bildung von Monoschichten von verlängerten Zellen mit einem charakteristischen wirbelförmigen Muster. Alle Kulturen wurden wenigstens dreimal vor der Verwendung Passagen unterzogen und wurden für bis zu 10-15 Passagen verwendet.
Topische Mittel: Einige Produkte, die üblicherweise für dies Behandlung von Wunden und Dekubitalgeschwüre verwendet werden, wurden direkt den standardisierten Kulturen von menschlichen Fibroblasten zugesetzt, um die Cytotoxizität in einem in vitro System zu messen. Povidon-Iod Lösung (Betadine), Wasserstoffperoxid, Granulex und Chlorhexidin (Hibiclens) sind üblicherweise verwendete Reinigungsmittel mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen. Diese Verbindungen (0,001-0,5%) wurden mit CARRISYN(R)- Extrakt auf cytotoxische Wirkungen auf Fibroblastkulturen verglichen.
Behandlung der Zellen: Zellen von zusammenfließenden Monoschichten wurden mit 0,25% Trypsin abgelöst, nachdem sie kurz (5-10 min) einer Pucks-EDTA Lösung ausgesetzt waren. Die suspendierten Zellen wurden zu einer Pille zentrifugiert, einmal mit frischem Medium gewaschen und wieder in MEM, ergänzt mit Glutamin. Antibiotika und 1% fötalem Kalbserum suspendiert. Die Zellzahl wurde in einem elektronischen Zellzähler (Coulter Electronics, Hialeah, F1) bestimmt und durch Verdünnung, wie für die einzelnen Versuche erforderlich, eingestellt. Die Zellen wurden mit Cr&sup5;¹ (1 Ci/ml) markiert und in 24-Well Multititerplatten bei einer Dichte von 10&sup5; pro Vertiefung ausgestichen. Die Platten wurden 18 Stunden in den Inkubator zurückgebracht. Bei Beginn jedes Versuchs wurde das radioaktive Medium durch Absaugen entfernt, und jede Vertiefung wurde viermal mit frischem MEM plus 1% fötalem Kalbserum gewaschen. MEM allein oder MEM-haltige verschiedene Verdünnungen der Testsubstanzen wurden hinzugegeben, um die Vertiefungen zu replizieren, und die Platten wurden weitere 1-30 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubationszeitspanne wurden die Medien gesammelt und zur Messung von freigesetzter Radioaktivität aufbewahrt. Die Zellen in jeder Vertiefung wurden aufgelöst durch Zugabe von 0,5 ml Triton X-100 (1%) mit 0,1 M NaOH, und die Proben der Lysate wurden zur Messung der Radioaktivität verwendet.
Messung der Cytotoxizität: Die Cytotoxizität wurde durch die Freisetzung von radioaktivem Chrom aus den markierten Fibroblasten quantifiziert, die mit verschiedenen chemischen Mitteln inkubiert worden waren. Die prozentuale Freisetzung wurde berechnet, indem die Menge der Radioaktivität auf Medium und Zellen aufgeteilt wurde.
Eine andere Bewertung der Cytotoxizität wurde vorgenommen durch Färben mit Trypanblau. Die Zellen wurden mit jedem der Versuchsmittel 15 Minuten inkubiert. Trypanblau (1%) wurde zu jeder Vertiefung zugesetzt, und die Inkubation wurde während weiterer 5 Minuten fortgesetzt. Die Proben wurden mit Lichtmikroskopie untersucht und mit einer Nikon 35-mm Kamera photographiert, die an einem Nikon Invertphasenkontrast-Mikroskop befestigt war. Die Cytotoxizität wurde beurteilt, indem der Prozentsatz der mit Trypanblau gefärbten Zellen im Vergleich mit den (unbehandelten) Kontrollzellen bestimmt wurde. Tabelle 2 Cytotoxizität von topischen Präparaten, bestimmt durch Trypanblaufärbung
Die Zellkulturen wurden mit jedem der Mittel oder mit Medium allein 15 Minuten inkubiert. Trypanblau (1%) wurde aufgetragen, und nach 5 Minuten wurden die Kerne gezählt. Das Ergebnis ist ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten Zellkerne innerhalb des Gesichtsfelds, die gefärbt waren.
Zeitverlauf der Zellschädigung: Direkte Zellschädigung durch die topischen Mittel fand schnell statt und spiegelte sich in einer erhöhten Freisetzung von Cr&sup5;¹ aus den Zellen wieder. Fibroblastenkulturen, die mit dem Medium allein oder mit 10% fötalem Kalbserum behandelt waren, setzten nicht mehr als 5% der gesamten Chrommarkierung während einer Inkubation von 5-60 Minuten frei (Fig. 3). Im Gegensatz dazu setzten mit 0,05% Granulex oder Hibiclens behandelte Zellen zwischen 55% und 62% der gesamten Markierung innerhalb von 5 Minuten frei. Betadine war etwas weniger wirksam. Eine Inkubation während 10 oder 15 Minuten erhöhte die freigesetzte Menge bei allen drei Mitteln, aber eine längere Inkubation (30 Minuten) erhöhte die Freisetzung der Radioaktivität nicht merklich. Mit CARRISYN(R)-Extrakt (CDWG) (0,05%) behandelte Zellen setzten nicht mehr als 5% der gesamten Markierung während einer 30-minütigen Inkubation frei.
Einfluß der Konzentration auf die Zellschädigung: Die verschiedenen Mittel wurden auf Cytotoxizität in Konzentrationen im Bereich von 0,005 bis 0,05% untersucht. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, setzten Granulex und Hibiclens (0,01%) annähernd 25% bzw. 70% der gesamten Chrommarkierung aus den Fibroblasten frei. Die Freisetzung durch die niedrigsten Konzentrationen von Betadine (0,005 und 0,01%) war nicht größer als die durch das Medium allein, aber die 0,015% Betadine ausgesetzten Zellen setzten mehr als 70% ihrer gesamten Radioaktivität frei. CARRISYN(R)-Extrakt in Konzentrationen bis zu 0,5% setzte nicht mehr als das Medium allein frei.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Trypanblau Färbung verwendet wurde, um die Zellschädigung zu beurteilen. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, tötete eine Inkubation während 15 Minuten mit 0,01% Betadine, Hibiclens oder Granulex 100% der Zellen. Die Inkubation mit CARRISYN(R)-Extrakt mit derselben Konzentration tötete nur 5%. Wasserstoffperoxid mit einer Konzentration von 0,01% beschädigte die Zellen stark, wie durch Veränderungen in der Morphologie beurteilt wurde, aber die Trypanblau Färbung durch dieses Mittel konnte wegen seiner entfärbenden Wirkungen nicht gemessen werden.
Wirkungen von kombinierten Mitteln: In einigen Versuchen wurde CARRISYN(R)-Extrakt vor der Zugabe von anderen topischen Mitteln zu Fibroblastkulturen gegeben um zu bestimmen, ob der Ex trakt eine schützende Wirkung hat. Die cytotoxische Wirkung wurde in dem Medium allein und im Medium, das 10% fötales Kalbserum enthielt, gemessen. Fig. 5 zeigt, daß, obwohl CARRISYN(R)-Extrakt allein die Zellen nicht schädigt, er die Menge des durch Betadine, Granulex oder Hibiclens während einer 15-minütigen Inkubationszeit freigesetzten Menge Cr&sup5;¹ nicht ändert. Ähnlich ändert der Gehalt von fötalem Kalbserum in dem Inkubationsmedium nicht die cytotoxische Wirkung dieser Mittel.
Für eine unabhängige Beurteilung der Wirkungen einer nicht lyophilisierten, unstabilisierten früheren Version des CARRISYN(R)-Extrakts auf verbrannte Gewebe bei Tieren siehe Miguel Rodriguez-Bigas et al., "Comparative Evaluation of Aloe Vera in the Management of Burn Wounds in Guinea Pigs", 81 Plastic and Reconstructive Surgery 81: 386 (1988).

Beispiel 4 Monocyten/Makrophagen-Aufnahme von C¹&sup4;-markiertem Acemannan In Vitro

Eine Pilotstudie wurde ausgedacht unter Verwendung von Monocyten- Zellkulturen von menschlichem peripherem Blut und Kohlenstoff¹&sup4;- markiertem Acemannan, um den Einbau oder die Absorption von Acemannan in das biologische System zu verfolgen. Der Zweck dieses Versuchs war zu bestimmen, ob die Aufnahme von C¹&sup4;-markiertem Acemannan durch normale, periphere Monocyten/Makrophagen-Zellen (a) nachweisbar, (b) mit der Zeit konstant oder sporadisch, (c) cytotoxisch bei 0,5% Gew./Vol. Konzentration ist und (d) schließlich, ob Monocyten/Makrophagen-Zellen fähig sind, Acemannan innerhalb der Zelle selbst auf Werte zu konzentrieren, die höher sind als die in der Kulturumgebung (Medium) vorliegenden.
A. Herstellung von C¹&sup4;-Acemannan: 100 mg von C¹&sup4;-markiertem Acemannan, das aus dem Gel von Aloepflanzen stammte, die in C¹&sup4;-markiertem Kohlendioxid gewachsen waren, wurde in ein 50 ml Zentrifugenrohr aus Polypropylen eingewogen. 5 ml von sterilem Wasser, das das Antibiotikum Gentamicin, 100 mg/ml, enthielt, wurden zugegeben. Fünf Tage später wurden 5 ml RPMI 1640 + Ab + 1% Hepes + 10% durch Hitze inaktiviertes fötales Kalbserum + 1% L-Glutamin dem Rohr zugesetzt. Die Solubilisierung mit gelegentlichem Bewegen ließ man bei Kühlschranktemperaturen (5ºC) 1 Woche lang fortschreiten. Am Tag 14 wurden 2,5 ml der 10 mg/ml Acemannanlösung in jedes von drei sterilen 10 ml Röhrchen gegeben. 2¹/&sub2; ml Monocyten/Makrophagen-Medium wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 5 mg/ml in 5 ml zu erhalten. Diese 5 ml Prä parate wurden dann in jedes von drei 25-cm² Gewebekulturkolben überführt, die annähernd 500.000 Monocyten/Makrophagen-Zellen aus peripherem Blut stammend enthielten.
B. Herstellung von Monocyten/Makrophagen Zellen von peripherem Blut: In EDTA gesammeltes Blut wurde von der hämatologischen Abteilung des Dallas/Ft. Worth Medical Center erhalten. Es wurde nur Blut mit normalen hämatologischen Parametern verwendet. Das zweistufige Trennungsverfahren unter Verwendung des Sepratech Corporation's Sepracell-MN(R) Systems folgte, um eine relativ reine (88% ± 9,27) Monocyten-Zellfraktion zu erhalten. Diese Suspension wurde in jedes von drei Corning #25100 25-cm² Gewebekulturkolben mit einer Zelldichte von annähernd 750.000 Zellen je Kolben eingefüllt. Um die angenommene Zellmasse durch die endgültige Zahl der Zellen in dem Versuch zu bestätigen, wurden die Zellen aus zwei 25-cm² Kolben, jeder weniger als 50% konfluent, geerntet und auf einem Coulter Model ZM Electronic Zellzähler gezählt. Die zwei Kolben ergaben annähernd 750.000 Zellen (grob äquivalent zu einem konfluenten Kolben). 80% Konfluenz würden gleich 625.000 Zellen sein; daher scheinen die in der Berechnung verwendeten 500.000 Zellen/Kolben vernünftig zu sein. Das Monocyten/Makrophagen-Medium (RPMI 1640 + Antibiotikum + 1% Hepes + 10% durch Hitze inaktiviertes fötales Kalbserum + 1% L-Glutamin) wurde zugegeben, und die Kolben wurden in einem 5% CO&sub2; Inkubator 1 Woche gehalten, um die Monocyten in die Makrophagenform reifen zu lassen. Das Medium wurde einmal während der Reifungswoche ersetzt. Am Tag 7 wurde jeder Kolben reichlich mit frischem Monocyten/Makrophagen-Medium gewaschen. Die zurückbleibenden anhaftenden Zellen, die sich festgehängt und vergrößert hatten, wobei sie annähernd 80% des Oberflächenbereichs einnahmen, wurden frei von Medium gesaugt. Die 5 ml Teilmengen von C¹&sup4;-markiertem Acemannan mit einer Konzentration von 5 mg/ml wurden in jedem der drei Kolben mit den anhaftenden Zellen gegeben.
C. Herstellungsschritte für Versuche von C¹&sup4;-Aufnahme durch Flüssigszintillation: 24, 48 und 72 Stunden wurde jeder der drei Versuchskolben wie folgt behandelt: die Acemannanlösung wurde aus dem Inkubationskolben entfernt und in ein 15 ml steriles, konisches Zentrifugenrohr aus Polystyrol (überstehendes Rohr) gefüllt. Der Kolben wurde mit 1 ml Monocyten/Makrophagen-Medium unter rotierender Bewegung gewaschen, um alle restliche Acemannanlösung zu sammeln. Die Waschlösung wurde dem überstehenden Rohr zugesetzt. Ein Milliliter Trypanblau (0,01% in PBS) wurde in den Kolben gegeben, 5 Minuten stehengelassen, und der Kolben wurde durch Phasenkontrastmikroskopie untersucht. Weniger als 1% der anhaftenden Zellen waren positiv (lebensunfähig). Das Trypanblau wurde entfernt. Der Kolben wurde einmal mit 1 ml Pucks EDTA gewaschen, das verworfen wurde. Pucks EDTA wurde zum Kolben mit anhaftenden Zellen gegeben und bei 30ºC annähernd 3 Minuten stehengelassen. Das Pucks EDTA wurde entfernt und in ein 15 ml steriles, konisches Zentrifugenrohr aus Polystyrol (Zellmasserohr) überführt. Drei Milliliter Pucks mit 12,5% Trypsin wurden in 1 ml Anteilen zugegeben, um die anhaftenden Zellen abzulösen. Ein Gummischaber wurde nach der letzten Zugabe verwendet, um die restlichen anhaftenden Zellen frei zu schaben. Das Endvolumen der Zellen in Pucks/Trypsin betrug annähernd 4 ml in dem Zellmasserohr. Die Prüfung der Kolben durch Phasenkontrastmikroskopie zeigte sehr wenige Zellen, die im Kolben verblieben waren. Die gesamte C¹&sup4;-markierte Acemannanlösung, die nicht in den Zellkolben verwendet wurde, wurde als eine Kontrolle zurückgehalten.
Alle Rohre plus Kolben wurden bis zur Säurehydrolyse gekühlt. Alle Rohre wurden gefroren und auf einem Virtis Gefriertrockner lyophilisiert. Fünf Milliliter 2 N TFA (Trifluoressigsäure) wurden zu dem lyophilisierten Material gegeben. Nachdem es gelöst war, wurden die Inhalte jedes Rohrs in Schraubverschlußrohre aus Pyrex-Glas überführt und in einen 70ºC Ofen gestellt. Die Inhalte ließ man digerieren und das Volumen vermindern, bis annähernd 1 ml übrigblieb. Die Rohre wurden aus dem Ofen entfernt und abkühlen gelassen mit mehrfachen Wirbeldurchmischungen, um trockenes Material an den Rohrwänden zu lösen. Zu diesem Zeitpunkt enthielten die Rohre annähernd 1 ml einer dunklen Flüssigkeit und etwas unlösliche Ablagerung. Zwei Zehntel Milliliter 35% H&sub2;O&sub2; wurden zu jedem der überstehenden Rohre und zu dem Kontrollrohr gegeben. Die Rohre wurden verschlossen im Dunklen über Nacht stehengelassen, um eine maximale Entfärbung der restlichen Flüssigkeit, die das digerierte C¹&sup4; enthielt, zu erreichen. Drei Zehntel Milliliter Wasser wurden zu jedem der Zellmasserohre gegeben. Die gesamten Inhalte jedes der sieben Digestionsrohre wurden in ein 20 ml Szintillations-Glasfläschchen überführt. Jedes Digestionsrohr wurde mit 3 ml ScintiVerse Bio HP (Fisher Scientific) Szintillationsflüssigkeit gewaschen, die dem Szintillations-Glasfläschchen zugesetzt wurden. Das Glasfläschchen wurde dann bis zum Füllungsvermögen (20 ml) mit Szintillationsflüssigkeit gefüllt. Die Inhalte wurden einige unterschiedliche Male durch Schütteln gemischt, dann über Nacht zur Seite gestellt, damit sich das unlösliche Material absetzt, bevor in einem Packard Minaxi Tri-Carb 4000 Serien beta-Zähler gezählt wurde.
Basierend auf dem CPM der sieben Proben, wurden Berechnungen für eine prozentuale Aufnahme von zur Verfügung stehendem C¹&sup4;- markiertem Acemannan gemacht. Diese Prozente wurden gegen die Zeit aufgetragen. Von den Berechnungen und der Aufzeichnung wurde bestimmt, daß die Aufnahme durch die Zellmasse 2,0% bei 24 Stunden, 5,16% bei 48 Stunden und 3,48% bei 72 Stunden betrug. Weitere Berechnungen wurden gemacht; indem die Zählimpulse der sieben Proben summiert wurden. Diese Summe stellt die gesamten 100 mg des verwendeten C¹&sup4;-markierten Acemannan dar. Die gesamten Zählimpulse wurden verwendet, um die Menge in Milligramm jeder gezählten Zellmasse abzuleiten. Die höchste Aufnahme, 5,16% in 48 Stunden entsprach 0,97 mg des durch die Monocyten/Makrophagen- Zellmasse absorbierten oder aufgenommenen markierten Acemannans. Wenn man veranschlagt, daß 500.000 lebensfähige Zellen in der Zellmasse waren, jede mit einer Aufnahme von C¹&sup4;-markiertem Acemannan, war eine berechnete Menge von 1,9 · 10&supmin;&sup6; mg Acemannan in jeder Zelle. Geigy Scientific Tables, Vol. 3, S. 205 gibt das Volumen eines Monocyten mit 470 Femtoliter (f1) an. Das Volumen jeder Zelle wurde mit 500 f1 berechnet, da sich Monocyten in Makrophagen vergrößern. Dies ergibt einen Gew./Vol. Wert von 3800 Femtogramm/f1. Vergleicht man dies mit dem Gew./Vol. Wert des C¹&sup4;- markierten Acemannans, 5 mg/ml, so ergibt sich ein Konzentrationsverhältnis in den Zellen, das 760 mal größer ist als im Überstand.
Auf dieser Pilotstudie basierend, waren die nachweisbaren Mengen des C¹&sup4;-markierten Acemannans bei einer Konzentration von 5 mg/ml nicht cytotoxisch für die Monocyten/Makrophagen Zellen, und die digerierte Zellmasse in Gewicht/Volumen (Gew./Vol.) war 760 mal größer als das Gew./Vol. der digerierten Acemannanlösung.

Beispiel 5 Projekt zur Bestimmung der Wirksamkeit von CARRISYN(R)-Extrakt auf die Induktion einer schützenden Immunantwort in Handelsgeflügel

Landesweit kosten Verluste wegen Krankheit und Problemen im Management die Geflügelindustrie mehr als $ 2,0 Milliarden jährlich. Infektiöse Mittel, wie infektiöser Bursakrankheit-Virus (IBDV), ein Retrovirus, der Mortalität und/oder Morbilität verbunden mit Immunsuppression herbeiführt, verursacht schwere ökonomische Verluste für die Geflügelindustrie. IBDV zielt spezifisch auf Vorläufer B-Zellen in der Bursa Fabricii, was zu einem selektiven Abbau des humoralen Zweigs des Immunsystems führt. Dies verursacht einen immunsuppressiven Zustand, verwandt mit AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome).
Die Geflügelindustrie impft routinemäßig Geflügelscharen gegen IBDV durch orale Verabreichung von lebenden Viren oder durch subkutane Injektion von inaktivierten Viren. Obwohl beide Impfmethoden wirksam eine Immunantwort hervorrufen können, werden mit der Verwendung von Impfstoffen verbundene Probleme geschaffen. Impfstoffe mit lebenden Viren sind wirksamer beim Auslösen einer schützenden Immunantwort auf einen spezifischen Stamm, aber der Virus selbst kann in Virulenz zurückfallen oder die Replikation des Impfstoffstammes kann vorübergehende Immunsuppression verursachen, was zu einer erhöhten Anfälligkeit der Geflügelschar für sekundäre Krankheitserreger führt. Impfstoffe mit abgetöteten Viren ergeben nicht dieselben Probleme wie solche, die mit lebende Viren enthaltenden Impfstoffen verbunden sind, aber die Immunantwort ist verringert und ist dosisäbhängig. Zahlreiche Alternativen zur Impfung, die komplizierte High-Tech-Lösungen umfassen, werden beurteilt, aber die direkte Modulation der Immunantwort durch Einführung einer zusätzlichen Komponente in einen Impfstoff mit abgetöteten Viren, stellt eine möglicherweise einfache Lösung dar.
CARRISYN(R)-Extrakt, basierend auf vorläufigen Beobachtungen, wirkt als ein Immunmodulator, und dieses Projekt wurde entwickelt um zu bestimmen, ob diese Verbindung die Immunantwort auf einen Impfstoff mit einem abgetöteten infektiösen Bursakrankheit-Virus (IBDV) stimuliert.
A. Tiere: Küken, die aus von SPATAS, Inc. gelieferten Eiern ausgebrütet waren, wurden für alle Versuche verwendet. Die Eier wurden ausgebrütet, und einen Tag alte Küken wurden in Horsfall Units gesetzt.
B. Antigen: BursaVac K (Ölemulsion) - CARRISYN(R)-Extrakt verwendet: Lot #80226-001, resuspendiert auf 1 oder 2 mg/ml (vgl. Versuchsausführung)

C. Versuchsausführung:

Untersuchung #1 (Gruppe 1). Für die Untersuchung #1 wurden 25 zwei Wochen alte Küken in fünf Gruppen geteilt. Die Küken in jeder Gruppe wurden, wie folgt, geimpft:
Gruppe 1 - Kontrolle, simuliert geimpft
Gruppe 2 - subkutan in den Rückenbereich geimpft mit 0,5 ml Ölemulsion-Impfstoff
Gruppe 3 - subkutan geimpft mit 0,25 ml Ölemulsion-Impfstoff (Bio-Burs K; Key Vet., Gainesville, GA), gemischt mit 0,25 ml CARRISYN(R)-Extrakt (0,5 mg/ml), suspendiert in Wasser (1 : 1)
Gruppe 4 - oral geimpft mit 0,5 ml Mikrokapseln, suspendiert in saurem Wasser
Gruppe 5 - oral geimpft mit 0,5 ml Mikrokapseln, suspendiert in saurem Wasser mit 0,5 mg CARRISYN(R)-Extrakt
Untersuchung #2 (Gruppe 2). Für die Untersuchung #2 wurden 117 eine Woche alte SPF Küken in sechs Gruppen geteilt. Die Küken in jeder Gruppe wurden, wie folgt, geimpft:
Gruppe 1 - Kontrolle, simuliert geimpft
Gruppe 2 - subkutan über dem Rücken geimpft mit 0,5 ml CARRISYN(R)-Extrakt (2 mg/ml), suspendiert in Wasser
Gruppe 3 - subkutan über dem Rücken geimpft mit 0,5 ml Ölemulsion-Impfstoff (Bio-Burs K; Key Vet., Gainesville, GA)
Gruppe 4 - subkutan über dem Rücken geimpft mit 0,25 ml Ölemulsion-Impfstoff, gemischt mit 0,25 ml CARRISYN(R)-Extrakt (1 mg/ml), suspendiert in Wasser (1 : 1)
Gruppe 5 - subkutan über dem Rücken geimpft mit 0,25 ml Ölemulsion-Impfstoff, gemischt mit 0,25 ml CARRISYN(R)-Extrakt (2 mg/ml), suspendiert in Wasser (1 : 1)
Gruppe 6 - subkutan über dem Rücken geimpft mit 0,5 ml Ölemulsion-Impfstoff und über dem Oberschenkelbereich mit 0,5 ml CARRISYN(R)-Extrakt (2 mg/ml), suspendiert in Wasser
Für beide Untersuchungen wurde Serum von jedem Küken in wöchentlichen Intervallen gesammelt, und die Serum IBDV ELISA Titer wurden bestimmt unter Verwendung käuflich erhältlicher AgriTech IBDV ELISA Kits. ELISA Titer wurden bestimmt unter Verwendung von FlockChek Software, ein von AgriTech, Inc. vertriebenes Programm.
D. Ergebnisse: Die Küken zeigten kein Unwohlsein oder Nebenwirkungen als Folge der subkutanen oder peroralen Verabreichung von in Wasser oder Ölemulsion suspendiertem CARRISYN(R)-Extrakt.
Bei der Untersuchung #1 (Gruppe 1) sind die mittleren ELISA Titer bis zu der sechsten Woche nach der Impfung in Tabelle 6 dargestellt: Tabelle 6 Immunstimulierende Wirkungen von CARRISYN(R)-Extrakt: Untersuchung #1
Zwei Wochen nach der ursprünglichen Impfung begannen die Titer auf IBDV in den mit Ölemulsion oder mit durch CARRISYN(R)-Extrakt ergänzter Ölemulsion zu steigen. Die mit dem Ölemulsion-Impfstoff, der mit CARRISYN(R)-Extrakt ergänzt war, behandelten Küken hatten einen Gesamtdurchschnittstiter annähernd 3,9 mal höher als diejenigen, die mit Ölemulsion-Impfstoff geimpft waren. Drei Wochen nach der Impfung wurden die Küken wieder geimpft, wobei jedes Küken dieselbe Antigenmischung erhielt, wie sie für die ursprüngliche Impfung angegeben ist. Eine Woche nach der zweiten Impfung hatte sich der Unterschied beim Durchschnitstiterverhältnis auf annähernd 4,1 erhöht. Danach fiel das Verhältnis 2 Wochen nach der zweiten Impfung auf annähernd 2,1, als die Durchschnittstiter für beide Gruppen ihren Spitzenwert erreicht hatten. 3 Wochen nach der zweiten Impfung hatten die Durchschnittstiter für beide geimpfte Gruppen begonnen abzunehmen, aber die Abnahme im Titer bei den Küken, die allein mit Ölemulsion geimpft waren, war steiler mit einem Abfall im Titer von 55% verglichen mit 31% bei den Küken, die mit durch CARRISYN(R)-Extrakt ergänzter Ölemulsion geimpft waren. Die Aufrechterhaltung des höheren Titers bei den mit durch CARRISYN(R)-Extrakt ergänzter Ölemulsion behandelten Vögeln scheint eine Folge der verlängerten immunstimulierenden Wirkungen von CARRISYN(R)-Extrakt zu sein, was auf eine verlängerte Wirkung von CARRISYN(R)-Extakt hinwies.
Drei Wochen nach der zweiten Impfung wurden die Küken von der Ölemulsion-Impfstoff Gruppe (#2) und der durch CARRISYN(R)- Extrakt ergänzten Ölemulsion-Impfstoff Gruppe (#3) wieder in zwei Gruppen (A und B) geteilt. Die Gruppe A Küken wurden einem homologen, lebenden Impfstoffstamm ausgesetzt, und die Gruppe B Küken wurden einem virulenten Feldstamm ausgesetzt. Drei Tage nach der Exposition wurden alle Küken einer Autopsie unterzogen. Es bestand keine Wirkung auf das Immunsystem bei den einem Impfstoffstamm ausgesetzten Gruppe A Küken. Aber alle Gruppe B Küken hatten Schädigungen, wie durch Histopathologie gezeigt wurde. Dies sind die erwarteten Ergebnisse; wenn aber Küken, denen nur eine ursprüngliche Impfung gegeben wurde, ausgesetzt worden wären, ist es wahrscheinlich, daß ein größeres Übergewicht an Schädigungen bei Küken festgestellt worden wäre, denen nur der Ölemulsion- Impfstoff gegeben wurde. Falls die Küken mit dem lebende Viren enthaltenden Impfstoff geimpft worden wären, wären Schädigungen in den lymphoiden Organen bei den Küken gesehen worden, die gegen die Exposition des homologen Virus resistent waren.
Für die Untersuchung #2 wurden die Gruppengrößen und die Impfprotokolle geändert. Wie aus Tabelle 7 gesehen werden kann, paßten die Ergebnisse nicht zusammen: Tabelle 7 Immunstimulierende Wirkungen von CARRISYN(R)-Extrakt: Untersuchung #2
Es wurde anfangs bemerkt, daß Unterschiede bei den Vögeln zwei Wochen nach der Injektion bestanden. Es waren mehr zu klein gebliebene Vögel als man erwarten würde, und einige der Stellen, wo die Küken beringt waren, schienen infiziert zu sein; sie hatten Drucknekrosen, was zu einer Toxinfreisetzung führen würde, zu sätzlich zu der sekundären bakteriellen Infektion. In einer Bemühung, das letztere Problem zu umgehen, wurden die Küken neu beringt und mit einem topischen Antibiotikum behandelt. Die bereits beschriebenen Probleme würden jedoch wahrscheinlich eine Gesamtimmunsuppression verursachen, die die Ergebnisse dieser Untersuchung ungültig machen würde. Daher wurde die Untersuchung beendet.
Trotz der mit der Untersuchung #2 verbundenen negativen Faktoren, verursachte CARRISYN(R)-Extrakt eine insgesamt stimulierende Wirkung des Immunsystems, was als eine erhöhte Immunantwort auf Test-Antigene erkannt wird, die an Stellen verabreicht wurden, die entfernt von der Stelle der CARRISYN(R)-Extrakt Verabreichung war. Obwohl der anfängliche Eindruck war, daß CARRISYN(R)-Extrakt mit dem Ölemulsion-Impfstoff gemischt werden muß, scheint es, daß eine erhöhte Immunantwort hervorgerufen wurde, wenn das Antigen und der CARRISYN(R)-Extrakt ebenfalls getrennt angeboten wurden. Dieses Ergebnis erlaubt Forschung nach alternativen Impfmethoden und Anwendungen für diese Verbindung.
CARRISYN(R)-Extakt scheint Adjuvanseigenschaften zu haben. Er scheint das Fortbestehen oder die wirksame Darstellung von IBDV Antigen innerhalb des Körpers zu erhöhen, wobei er möglicherweise zur Freisetzung von Lymphokinen und einer verstärkten Lymphocytantwort führt. CARRISYN(R)-Extrakt mußte mit Ölemulsion- Impfstoff gemischt werden, es scheint, daß eine verstärkte Immunantwort ebenso ausgelöst wurde, wenn das Antigen und der CARRISYN(R)-Extrakt getrennt dargeboten wurden. Dieses Ergebnis erlaubt Forschung nach alternativen Impfungsmethoden und Anwendungen für diese Verbindung.
CARRISYN(R)-Extrakt scheint Adjuvanseigenschaften zu haben. Er scheint das Fortbestehen oder die wirksame Darstellung von IBDV-Antigen innerhalb, des Körpers zu erhöhen, wobei er möglicherweise zur Freisetzung von Lymphokinen und einer verstärkten Lymphocytenantwort führt.
Die erwartete Verwendung von Acemannan ist als Adjuvans, wobei der CARRISYN(R)-Extrakt die Antwort auf irgendeinen inaktivierten Impfstoff fördert, der Virus-, Parasiten- oder Bakterien- Antigen enthält, einschließlich der folgenden: Rinderimpstoffe - infektiöse Rinder-Rhinotracheitis, Parainfluenza 3, Atmungs- Synctialvirus, Rindervirus-Durchfall, Rotavirus, Coronavirus, Bluetongue, Tollwut, Clostridien-Krankheiten, Fußfäule, Binde hautentzündung, Anaplasmose, Babesiose, Pasteurellose, Salmonellose, Kolibazilleninfektion, Corynebakterium sp., Vibrose, Brucellose, Leptospirose, Haemophilus somnus, Maul- und Klauenseuche, Papillomavirus und Staphylokokken Mastites; Schafimpfstoffe - Clostridien-Krankheiten, Fußfäule, Tollwut, Maul- und Klauenseuche, Erysipel, Springkrankheit und käseartige Lymphadenitis; Schweineimpfstoffe - Parvovirus, Erysipel, ansteckende Gastroenteritis, Pseudotollwut, Bordetella Bronchiseptica, Kolibazilleninfektion, Pasteurellose, Maul- und Klauenseuche, Clostridien-Krankheiten, Leptospirose und Haemophilus pleuropneumonia; Pferdeimpfstoffe - Influenza, Rhinolungenentzündung, Tetanus, Druse, Pferdearteritis, Ost-, West-, Venezuela-Enzephalitis und Tollwut; Katzenimpfstoffe - Rhinotracheitis, Katzenleukämle, Calicivirus, Chlamydiose, Lentivirus, Katzenfieber, Tollwut und infektiöse Peritonitis; Hundeimpfstoffe - Staupe, Adenovirus (Typen 1 und 2), Tollwut, Parvovirus, Leptospirose, Parainfluenza, Koronavirus, Masern, Rhodococcus equi, Tetanus und Tollwut; und Vogelimpfstoffe - infektiöse Bursakrankheit, Newcastle Krankheit, infektiöse Bronchitis, infektiöse Kehlkopftracheitis, Mareks Krankheit und Coccidiose.

Claims

1. Verwendung von Acemannan für die Herstellung eines Arzneimittels für ein Impfstoff-Adjuvans.

2. Verwendung von Acemannan nach Anspruch 1, wobei das Acemannan als ein Impfstoff-Adjuvans Arzneimittel im Bereich von etwa 0,001 mg bis etwa 10 mg pro Impfstoffdosis vorliegt.