DE4221753C2 - Immunologisch und antiphlogistisch wirksame Polysaccharide aus Sedum telephium, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Polysaccharide mit immunologischer und antiphlogistischer Wirkung, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese Polysaccharide enthaltende Arzneimittel. Diese Polysaccharide kön­ nen aus Sedum telephium isoliert werden.

Sedum telephium ist eine Crassulacaee, die in Südeuropa, vorzugs­ weise in Italien und Spanien, vorkommt und deren Blätter im Ganzen in der Volksmedizin bei entzündlichen Vorgängen verschiedenster Ursache, wie z. B. bei Verbrennungen, Neurodermitis, Psoriasis, Ekzemen auf die Haut aufgelegt und durch einen Verband fixiert wer­ den. Dabei zeigen die Blätter auch eine lokalanästhetische Wir­ kung. Eine derartige Behandlungsmethode ist naheliegenderweise in größerem Umfang nicht praktikabel.

Auf dem "Second International Symposium Plant Flavonoids in Bio­ logy and Medicine, Strasbourg, August 31 to September 3, 1987" be­ richteten F. F. Vincieri et al., daß die entzündungshemmende Ak­ tivität von Sedum telephium eindeutig einer Flavonoide enthaltend­ en Fraktion zugeordnet werden kann.

Im Gegensatz zu den bisherigen Erkenntnissen betreffend das Wirk­ prinzip aus Sedum telephium hat die Anmelderin gefunden, daß nicht die Flavonoide, die im wesentlichen aktiven Stoffe sind, sondern, daß die aus einer wäßrigen Fraktion isolierbaren Polysaccharide die größte immunologische und antiphlogistische Aktivität in den entsprechenden in vivo- und in vitro-Tests zeigen.

Aus Carbohydrate Research 198 (1990) 323-329 ist eine saure Polysaccharidfraktion aus den Blättern von Malva sylvertris bekannt, die eine antikomplimentäre Wirkung aufweist.

In Chem. Pharm. Bull 38(6) 1667-1671 (1990) werden zwei Polysaccharide aus den Wurzeln von Glycyrrhiza beschrieben, die eine Aktivität auf das retikuloendothetiale System besitzen.

Aus derselben Pflanze wurden auch pektische Polysaccharide mit mitogener und antikomplementärer Aktivität beschrieben, Carbohydrate Research 219 (1991) 142-172.

Polysaccharide mit antiphlogistischer Wirkung aus Achyrocline sind aus der EP-A-422 618 bekannt.

Gegenstand der Erfindung sind daher neue Polysaccharide mit im­ munologischer und antiphlogistischer Aktivität, Verfahren zu ihrer Isolierung aus Sedum telephium und Arzneimittel enthaltend diese Polysaccharide.

Immunstimulierend wirkende Polysaccharide aus höheren Pflanzen sind bekannt (vgl. z. B. Wagner et al. in Arzneimittelforschung Drug Research 35(II), 7, 1069-1075 (1985)). Die bekannten Polysac­ charide weisen Molekulargewichte im Bereich von 25 000 D bis 500 000 D auf. Überraschend dazu hat die Anmelderin gefunden, daß die neuen Polysaccharide Molekulargewichte im Bereich von 10 000 D bis 20 000 D aufweisen, wobei man bisher davon ausgegangen ist, daß nur höhermolekulare Polysaccharide eine immunologische Wirkung besitzen.

Bei den erfindungsgemäßen Polysacchariden handelt es sich um das Polysaccharid der Formel CD, ein saures Glykanogalakturonan mit einem Ga­ lakturonsäureanteil von etwa 45% bis 65% und einem mittleren. Mole­ kulargewicht von etwa 13 000 D (10 000 bis 15 000 D), bestimmt mit der HPGPC und folgender Grundstruktur:

Das Polysaccharid der Formel (I) hat nach dem Ergebnis der Methylierungs­ analyse eine Hauptkette, die sich aus (1→4)alpha-Galakturon­ säure- und (1→2)-verknüpften Rhamnoseeinheiten zusammensetzt. Etwa 20% der Rhamnosereste und etwa 6% der Galakturonsäurereste weisen eine Verzweigungsstelle an C-4 bzw. C-6 zu unterschiedlich aufgebauten Seitenketten auf, die (1→6)-Galaktosereste enthal­ ten, an deren C-3-Position eine endständige Arabinose gebunden ist, bzw. (1→6)-Galaktose- und (1→5)-Arabinoseeinheiten, an deren C-3-Positionen terminale Arabinosereste hängen. Die Seiten­ ketten können aber auch aus (1→4)-Galakturonsäureketten mit ter­ minaler Rhamnose bzw. terminaler Galakturonsäure bestehen. Etwa 60%-70% der Galakturonsäureeinheiten sind mit Methanol ver­ estert. Weiterhin enthält das Polysaccharid einen Proteinanteil von etwa 5% bis 10%. Die optische Drehung liegt bei etwa (+) 140° (± 10%) in H₂O dest.

Die Erfindung betrifft weiterhin das Polysaccharid der Formel (II), das ebenfalls ein saures Glykanogalakturonan mit einem Galakturon­ säureanteil von etwa 25 bis 45% und einem mittleren Molekulargewicht von etwa 14 000 D (11 000 bis 16 000 D), bestimmt in der HPGPC-Gelpermeationschromatographie, ist. Das Polysaccharid weist folgende Grundstruktur auf:

Dieses PS enthält nach dem Ergebnis der Methylierungsanalyse eine Hauptkette mit 1→4 verknüpften Galakturonsäureinheiten, in die im Verhältnis 1 : 1 (1→3)- und (1→2) verknüpfte Rhamnoseein­ heiten eingelagert sein können. Etwa 60% bis 70% der Galakturon­ säureeinheiten sind mit Methanol verestert.

Der Proteingehalt dieses PS beträgt zwischen etwa 2 bis 6%. Die optische Drehung liegt bei etwa +65° (±10%) in H₂O dest.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide können aus Teilen, insbeson­ dere aus den Blättern von Sedum telephium z. B. dadurch isoliert werden, indem man die getrockneten und pulverisierten Teile mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Petrolether oder Isopropanol und einem Alkohol, vorzugsweise Methanol, vorextra­ hiert, wobei man die Extraktion auch in 2 Schritten vornehmen kann, und anschließend den Drogenrückstand mit Wasser im Verhält­ nis 1 : 10 mazeriert. Dann wird der Wasserextrakt filtriert. Es folgt ggf. eine Dialyse und anschließend wird durch Zugabe des gleichen Volumens Ethanol ein Niederschlag erhalten, der nach Ent­ fernen des Überstandes einer Anionenaustauschchromatographie un­ terworfen wird. Durch Elution mit einem Salzgradienten erhält man die sauren Polysaccharidrohfraktionen, die weiter durch Gelfiltra­ tion aufgetrennt und dialysiert werden, wobei man die erfindungs­ gemäßen Polysaccharide in reinem Zustand erhält. Die Polysacchari­ de können anschließend ggf. lyophilisiert werden.

Die Struktur der erfindungsgemäßen Polysaccharide wurde durch Neutralzuckerbestimmung, Uronsäure-Proteinbestimmung, Methylier­ ungsanalyse, Partialhydrolyse mit 0,05 mol/l Trifluoressigsäure über 1,25 Stunden bei 100°C durch Reduktion der Uronsäuren und Molekularge­ wichtsanalyse bestimmt. Durch diese Untersuchungen wurden die Bin­ dungsverhältnisse der erfindungsgemäßen Polysaccharide, wie in den vorstehend genannten Formeln beschrieben, erhalten.

Der Uronsäuregehalt der erfindungsgemäßen Polysaccharide wurde durch den Carbazoltest nach T. Bittner et al. (Analyt. Biochem. 4, 330 (1967)) bestimmt und der Veresterungsgrad mit Methanol wurde mittels NMR-Spektroskopie (Grasdalen, H. et al. Carbohydr. Res. 184, 183 (1988)) bestimmt. Die Ergebnisse zeigten für das Polysac­ charid der Formel (I) einen mittleren Uronsäuregehalt von etwa 55% und für das Polysaccharid der Formel (I) von etwa 35%. Der Veresterungsgrad wurde zu jeweils etwa 60 bis 70% bestimmt.

Bestimmung des Molekulargewichts:
Das Molekulargewicht wurde durch HP-GPC-Chromatographie an µ-Bon­ dagel® E-125 + µ-Bondagel® E-500 sowie an Superose® TM 6 bestimmt.

Als Eichsubstanzen wurden Glucose und die Dextrane 10 T, 15 T, 40 T, 110 T, 500 T und 2000 T verwendet. Als Eluierungsmittel wurde 0,05 mol/l Na-Phosphatpuffer pH 6 mit 0,15 mol/l NaCl verwendet. Zur Detektion wurde ein Differentialrefraktometer R 401, eingesetzt. Daraus wurde für das Polysaccharid der Formel (I) ein mittleres Molekulargewicht von etwa 13 000 D) (Bereich 10 000 bis 15 000 D) und für das Polysaccharid der Formel (II) ein mittleres Molekular­ gewicht von etwa 14 000 D mit einem Bereich von 11 000 bis 16 000 D bestimmt.

Neutralzuckerbestimmung

Zur Bestimmung der Neutralzuckerzusammensetzung der erfindungs­ gemäßen Polysaccharide wurden diese mit 2 mol/l TFA 90 min. bei 121°C erhitzt und anschließend die Neutralzucker im Biotronik-Ana­ lysator sowie nach Darstellung der Alditol-Acetate und NaBH₄- Reduktion aus den durch Hydrolyse gewonnenen Monosacchariden durch GC-Analyse nach Blakeney et al. (Carbohydrate Research 113, 291 (1983)) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
Molare Zuckerzusammensetzung der Neutralzucker:

Die alpha (1→4)-Verknüpfung der Galakturonsäure wurde zusätzlich durch Pectinase-Spaltung und den anschließenden Nachweis der frei­ gesetzten Galakturonsäure bestätigt. (Collins et al. Carbohydr. Res. 93, 136, 1981). Die Partialhydrolyse wurde wie vorstehend be­ schrieben durchgeführt und das erhaltene Partialhydrolysat mit der Methylierungsanalyse untersucht. Daraus wurde die molare Zusammen­ setzung des Partialhydrolysates durch GC bzw. GC-MS erhalten (Harris P. et al. Carbohydr. Res. 127, 59 (1984)).

Zur Aufklärung der Struktur wurden weiterhin die Uronsäuren mit NaBD₄ reduziert (Taylor et al. Biochem. 11, 1383, (1972)) und anschließend durch Methylierungsanalyse untersucht (Harris s. o.).

Die Proteinbestimmung wurde nach Lowry (Lowry O.H.; J. Prot. Chem. 193, 265, (1951)) durchgeführt. Die optische Drehung der Polysac­ charide wurde nach DAB 9 bestimmt.

Die oben angegebene Struktur der erfindungsgemäßen Polysaccharide wurde durch ¹³C-NMR Spektroskopie bestätigt.

Die pharmakologische Wirkung der erfindungsgemäßen Polysaccharide wurde in anerkannten in vivo- und in vitro-Testen untersucht.

Die antiphlogistische Wirkung wurde im Rattenpfotenödemtest (Win­ ter, C.A. et al., Proc. Soc.Exp.Biol.Med., 111, 544 (1962)) unter­ sucht.

Wie die folgende Tabelle zeigt, ergibt sowohl das Polysaccharid (I) AM als auch das Polysaccharid (II) eine ausgezeichnete Hemmwir­ kung.

Da beide Polysaccharide noch nach 6 Stunden eine gleich gute, z. T. noch eine stärkere Ödemhemmung zeigen, ist ein Einfluß auch auf die Proliferationsphase einer Entzündung wahrscheinlich.

Komplement-Aktivität (Klassischer Weg)

Der Test auf antikomplementäre Aktivität erfolgte nach der Methode von Kabat et al. Exp. Immunochemistry III, 113 (1961) Springfield.

Die folgende Tabelle zeigt, daß das Polysaccharid (I) eine gute Antikomplement-Aktivität besitzt.

Reduktion der Hämolyse (%)
PS (I)
1 mg/mol
43,5
0,1 mg/ml	13,3
0,01 mg/ml	6,4

Carbon clearance-Test (in vivo-Test)

Der Test wurde nach Biozzi (Biozzi et al., Br.J.Exp.Pathol. 34, 441 (1953)) durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.

Wie aus der Tabelle hervorgeht, zeigt das erfindungsgemäße Polysaccharid (I) mit Regressionskoeffizienten < 1,5 gute bis sehr gute phagozytosesteigernde Wirkungen.

Granulozyten-Phagozytose-Test

Dieser Test wurde durchflußzytometrisch unter Verwendung von La­ tex-Partikeln nach einer abgewandelten Methode von Rothe und Valet (Cytometry 9, 316 (1988)) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle:

Phagozytosestimulierung (%)

Wie aus der Tabelle hervorgeht, zeigen beide erfindungsgemäßen Polysaccharide bei einer Konzentration von 1,0 und 0,1 mg/kg gute bis sehr gute Phagozytosesteigerungen.

Tumor-Nekrose-Faktor-Test

Der Test wurde wie von Ruff und Gifford beschrieben durchgeführt (Ruff et al. in "Lymphokine Reports 2, 235, Academic Press, (1981))". Die Ergebnisse zeigten, daß PS (I) bei einer Konzentra­ tion von 1 mg/ml 4000 U/ml TNF-alpha aus Makrophagen freisetzte. Dieses Ergebnis zeigt einen guten Einfluß auf die Freisetzungs­ fähigkeit des Tumornekrose-Faktors.

Die sehr guten Ergebnisse in den vorstehend beschriebenen in vitro und in vivo-Tests weisen die erfindungsgemäßen Polysaccharide als gute Antiphlogistika aus. Da heute bekannt ist, daß eine Reihe von Hauterkrankungen, vor allem Psoriasis, Neurodermitis und schlecht heilende Wunden, auf einem gestörten Immunstoffwechsel der Epider­ mis beruhen, (vgl. Lancet 338, 225-230 (1991)) und die Epidermis mit den Langerhanszellen, den Keratozyten und den von diesen se­ zernierten Cytokinen einen aktiven Teil des menschlichen Immun­ systems darstellen (J. Krutmann, Z.Allg.Med., 66, 368-372 (1990); Th.A. Luger, Period.biol., Vol. 39, No.1, 97-104 (1991); Grossman et al., Proc.Natl.Acid.Sci., USA, 86, 6367 (1989)), kann angenom­ men werden, daß die erfindungsgemäßen Polysaccharide, insbesondere bei topischer Anwendung das Entzündungsgeschehen vorteilhaft be­ einflussen.

Die erfindungsgemäßen Polysaccharide entweder alleine oder ggf. zusammen mit den weiteren aktiven Bestandteilen, z. B. den Flavo­ noidglykosiden aus Sedum telephium, sind besonders zur Behandlung von Dermatosen, vorzugsweise von infektiösen und entzündlichen Hautveränderungen (Dermatitiden), geeignet.

Es wurde ferner ein Ethyl-Extrakt, der die von F.F. Vincieri (s. o.) beschriebenen Flavonoidglykoside enthält, auf seine anti­ phlogistische Wirkung untersucht. Von den durchgeführten Unter­ suchungen zeigte der Ethylacetatextrakt nur in der Komplement-In­ hibierung und bei der Chemotaxis-Hemmung einen positiven Einfluß. Die Ergebnisse zeigen folgende Tabellen.

Der Ethylacetat-Extrakt von Sedum-telephium besitzt zwei nachgewie­ sene Wirkungen

Nachdem die in der Ethylacetatphase des Drogenextraktes enthalte­ nen Flavonoidglykoside nach oben angegebenen Ergebnissen nur z. T. pharmakologisch wirksam sind, ist der Schluß gerechtfertigt, daß die antiphlogistische und immunologische Wirkung im wesentlichen auf den erfindungsgemäßen Polysacchariden beruht.

Obwohl es grundsätzlich möglich ist, die erfindungsgemäßen Poly­ saccharide alleine zu verabreichen, ist es vorzuziehen, diese in Form einer pharmazeutischen Zubereitung, die die erfindungsgemäßen Polysaccharide wie vorstehend beschrieben und einen dafür pharma­ zeutisch annehmbaren Trägerstoff enthält, zu verabreichen. Üb­ licherweise liegt der aktive Bestandteil in einer derartigen For­ mulierung in einer Konzentration von 0,1 bis 99,9 Gew.-% der For­ mulierung vor.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen enthalten den aktiven Bestandteil in Verbindung mit einem dafür pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff und ggf. weiteren therapeutisch aktiven Bestandteilen. Der Trägerstoff muß annehmbar in dem Sinne sein, daß er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist und keine nachteilige Wirkung auf den Empfänger der Formulie­ rung besitzt.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können durch jedes der auf dem Gebiet der pharmazeutischen Technologie bekannte Verfahren hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können in Form eines Pulvers oder in Form eines Granulats oder in Form einer Lösung oder einer Suspension in einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Flüssigkeit, oder in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder Wasser-in-Öl-Emulsion oder eines Sprays vorliegen. Der aktive Bestandteil kann ebenfalls in Form eines Bolus, eines Electuariums oder einer Paste vorlie­ gen.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können gleichfalls in Form einer liposomalen Zubereitung oder in Form einer Cyclodextrinfor­ mulierung oder in Form eines bioabbaubaren Polymersystems zur Ver­ abreichung des aktiven Bestandteils vorliegen.

Für die topische Verabreichung geeignete erfindungsgemäße Zuberei­ tungen enthalten flüssige oder halbfeste Zubereitungen, wie z. B. Einreibemittel, Lotionen, Verbände, Öl-in-Wasser- oder Wasser-in- Öl-Emulsionen, wie z. B. Cremes, Salben oder Pasten, oder Lösungen oder Suspensionen, wie z. B. Tropfen.

Erfindungsgemäße Zubereitung können den aktiven Bestandteil auch in einer wäßrigen oder verdünnten alkoholischen Lösung enthalten. Der aktive Bestandteil kann ggf. zur Anwendung durch ein Sprühge­ rät in einen feinen Nebel überführt werden.

Die Zubereitungen liegen geeigneterweise in Form einer topischen oder ophtalmologischen Verabreichungsform, insbesondere in Form eines Gels vor.

Zusätzlich zu den vorhin genannten Bestandteilen können die erfin­ dungsgemäßen Zubereitungen einen oder mehrere weitere übliche und bekannte Komponenten, wie z. B. Verdünnungsmittel, Puffersubstan­ zen, Bindemittel, oberflächenaktive Mittel, Verdickungsmittel, Gleitmittel, Konservierungsmittel, Antioxidantien oder Emulgatoren enthalten.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen können zusätzlich zu den be­ schriebenen Polysacchariden als weiteren aktiven Bestandteil ein Flavonoid oder Flavonoide aus Sedum telephium enthalten.

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen zeigten in einem Sensibilisie­ rungstest eine sehr schwache Sensibilisierungpotenz, was den the­ rapeutischen Einsatz als Arzneimittel in Vergleich zu bekannten, gut wirkenden Antiphlogistika mit oft schweren Nebenwirkungen (Cortisone) wesentlich vorteilhafter erscheinen läßt.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Isolierung der erfindungsgemäßen Polysaccharide

300 g gepulverte, getrocknete, oberirdische Teile der Pflanze werden zunächst einer erschöpfenden Soxhletextraktion mit Petrolether und Methanol unterzogen. Vor der weiteren Aufarbei­ tung wurde die Droge getrocknet. Alle nachfolgenden Arbeiten wur­ den, falls nicht anders erwähnt, bei 4°C durchgeführt.

Etwa 300 g entfettete Droge wurden 24 h mit demineralisiertem Wasser im Verhältnis 1 : 10 unter Rühren ausgezogen. Nach Abpressen der Droge wurde der Wasserextrakt filtriert und unter reduziertem Druck bei 40°C auf ein Fünftel seines Volumens eingeengt. Es folgte eine 48stündige Dialyse gegen demineralisiertes Wasser und Gefriertrocknung des Dialysates.

Der Wasserextrakt wurde langsam unter Rühren mit demselben Volu­ men Ethanol versetzt. Am nächsten Tag wurde der klare Überstand vorsichtig abdekantiert, der Niederschlag von der verbleibenden Lösung abzentrifugiert (1 Stunde, 10 000 min^-1 und der Überstand mit der abdekantierten Lösung vereinigt. Das Polysaccharid wurde in wenig Wasser gelöst, 24 h gegen demineralisiertes Wasser dia­ lysiert und anschließend gefriergetrocknet.

Isolierung von PS (I) aus der Ethanol-Fällung

Anionenaustauschchromatographie:
Austauschmaterial:	DEAE-Sepharose®CL-6B
Säule:	A = 2,0 cm²
	L = 25 cm
Eluens:	0,01 M Tris-Puffer pH 7,2
Durchfluß:	30 ml/h
Auftragsmenge:	400 mg H1-Fällung
Gradient:	0-1 mol/l NaCl (250-250)
Gelfiltrationschromatographie: @	Reinigung der sauren Fraktion @	Gelmaterial:	Fraktogel® TSK HW-50 (S)
Säule:	A = 2,0 cm²
	L = 85 cm
Eluens:	1 mol/l NaCl
Durchfluß:	10 ml/h
Auftragemenge:	ca. 30 mg Fraktion 2
Gelfiltrationschromatographie @	Gelmaterial:	Sephacryl® S-200 HR
Säule:	A = 2,0 cm²
	L = 60 cm
Eluens:	1 mol/1 NaCl
Durchfluß:	10 ml/h
Auftragemenge:	20 mg Fraktion 2/1

Mit diesem Reinigungsverfahren wurde das Polysaccharid PS (I) in reinem Zustand erhalten.

Isolierung der Rohpolysaccharide aus alkalisch-wäßrigem Extrakt.

Der Drogenrückstand des Wasserextraktes wurde in der zehnfachen Menge 0,5 mol/l NaOH resuspendiert und 24 h mazeriert.

Im Anschluß wurde der schwarze Rückstand abfiltriert, mit etwas 0,5 mol/l NaOH nachgewaschen und die vereinigten Filtrate unter andauerndem Rühren durch langsames Zutropfen mit dem dreifachen Volumen 96%igem Ethanol versetzt. Der Überstand wurde vorsichtig abdekantiert, verworfen und der gebildete Niederschlag durch Zen­ trifugation (8000 min^-1, 30 min) von der verbleibenden Lösung abge­ trennt.

Der Rückstand wurde in 1 l H₂O dest gelöst, im Verhältnis 1 + 4 mit Ethanol gefällt, zentrifugiert, dialysiert und weiter wie für das Polysaccharid PS (I) beschrieben aufgearbeitet.

Isolierung des Polysaccharides PS (II) Anionenaustauschchromatographie

Vor dem Aufpumpen auf die Säulen wurden unlösliche Bestandteile der Probenlösungen abzentrifugiert. Die Elution erfolgte wiederum mit 0,01 mol/l Trispuffer pH 7,2 zur Abtrennung neutraler Poly­ saccharide. Saure Fraktionen wurden mit einem linearen NaCl-Gra­ dienten abgelöst. Alle Fraktionen wurden 48 h gegen deminerali­ siertes Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet.

Austauschmaterial:
DEAE-Sepharose® CL-6B
Säule:	A = 5,3 cm²
	L = 30 cm
Eluens:	0,01 mol/l Trispuffer pH 7,2
Durchfluß:	25 ml/h
Auftragemenge:	400 mg 1 + 0,5 Fällung
Gradient:	0-1 mol/l NaCl (250-250)
Gelfiltrationschromatographie: @	Gelmaterial:	Fraktogel® TSK HW-50 (S)
Säule:	A = 2,0 cm²
	L = 85 cm
Eluens:	1 mol/l NaCl
Durchfluß:	10 ml/h
Auftragsmenge: ca.	30 mg Fraktion 6

Durch dieses Verfahren wurde das Polysaccharid (PS II) in reinem Zu­ stand erhalten.

Bestimmung des Veresterungsgrades der Polysaccharide

Der Veresterungsgrad der erfindungsgemäßen Polysaccharide wurde nach der Methode von Grasdalen über Protonen-NMR-Spektroskopie bestimmt. Der Veresterungsgrad wurde aus der Intensität des Sig­ nals für das Zuckerproton H5AMC5 erhalten, welches bei Verester­ ung um ca. 3 ppm Tieffeld verschoben ist. Auf der Grundlage und dem Vergleich der von Grasdalen erhaltenen Ergebnisse und der von Pektinen mit verschiedenen Veresterungsgraden erhaltenen Proto­ nenspektren ließ sich bei den erfindungsgemäßen Polysacchariden ein Veresterungsgrad von ca. 60%-70% ermitteln.

Zu den gleichen Ergebnissen kam man wenn man die Differenz aus den Gesamturonsäuregehalt (bestimmt nach Bitter und Muir (1962)) und den durch den Biotronik-Zuckeranalysator erhaltenen Wert für freie Galakturonsäure und Glukuronsäure bildete.

Uronsäurebestimmung

Die Uronsäure der Polysaccharide wurde nach Bitter et. al. be­ stimmt.

Reagenzien:
a) 0,025 mol/l Dinatriumtetraborat-10-hydrat p. a.
in	konz. H₂SO₄
	b) 0,125% Carbazol p. a. in Ethanol p. a.
	c) Galakturonsäuremonohydrat, 24 h über P₂O₅ getrocknet, gelöst in mit Benzoesäure p. a. gesättigtem, destilliertem Wasser in Konzentrationen von 4 µg und 40 µg/ml
	d) Probenlösungen: 0,1 mg/ml destilliertes, mit Benzoesäure p. a. gesättigtes Wasser

5 ml konz. Schwefelsäure-Reagenz a) werden im Eisbad vorsichtig mit 1 ml Proben- d) bzw. Standardlösung c) überschichtet, erst vorsichtig, dann kräftig geschüttelt und 10 min in siedendem Was­ serbad erhitzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und Zugabe von 0,2 ml Carbazolreagenz b) schließt sich ein 15minütiges Er­ hitzen im Wasserbad an. Die Messung der Extinktion erfolgt nach Abkühlen gegen einen Blindwert bei einer Wellenlänge von 530 nm.

Bestimmung des Molekulargewichts mittels HP-GCP

Säulensysteme:
a) µ-Bondagel® E-125
	µ-Bondagel® E-125 + µ-Bondagel® E-500
	b) Superose® TM 6

Dem jeweiligen Säulensystem wurde eine Vorsäule (10 cm) gefüllt mit I-125 Proteinmaterial vorgeschaltet.

Eluens:
0,05 mol/l Na-Phosphat-Puffer pH 6,0 mit 0,15 mol/l NaCl
Durchfluß:	0,5 ml/min Pumpe
Eichsubstanzen:	Glucose
	Dextran 5 T, 10 T, 15 T, 40 T, 70 T, 110 T, 500 T, 2000 T
Detektoren:	Differentialrefraktometer R 401,
	UV-Detektor, 206 mm
Einspritzmenge:	15 µl einer 1%igen Lösung
Auswertung:	KD = VE-V₀/VT-V₀

Neutralzuckerbestimmung Hydrolyse der Polysaccharide

1-2 mg Polysaccharid wurden in einer 25 ml Glasampulle eingewo­ gen und mit 1-2 ml 2 mol/l Trifluoressigsäure versetzt. Nach dem Verschließen des Gefäßes wurde die Lösung 90 min. bei 121°C im Trockenschrank erhitzt. Nach Zugabe von 0,2 ml Inosit- Standardlösung wurde das Hydrolysat in einen 25 ml Spritzkolben überführt, zur Trockne eingeengt, zweimal in je 2 ml Methanol aufgenommen und abermals einrotiert.

Darstellung der Alditol-Acetate

Wie vorstehend beschrieben wurde das hydrolysierte Polysaccharid in 0,1 ml 1 mol/l Ammoniak gelöst und nach Zugabe von 1 ml NaBH₄-Lösung (2% in DMSO) 90 min bei 40°C im Wasserbad redu­ ziert. Anschließend wurde 0,4 ml Eisessig zur Zerstörung von überschüssigem NaBH₄ zupipetiert.

15 min später erfolgte die Acetylierung des reduzierten Zucker­ gemisches durch Zusatz von 2 ml Acetanhydrid und 0,2 ml 1-Methylimidazol.

An die nach 15 min mit 20 ml eiskaltem Wasser durchgeführte Hy­ drolyse von überschüssigen Essigsäureanhydrid schloß sich wieder­ um 15 min später die Ausschüttelung der Alditolacetate mit ca. 0,5 ml Dichlormethan an. Die Unterphase wurde direkt zur GC- Analyse verwendet und erfolgte wie nachstehend beschrieben.

Gaschromatographie
Trägergas:
Argon
Detektor:	FID
Temperatur:	Detektor, Einspritzblock: 250°C

Trennung partiell methylierter Alditolacetate
Säulen:
a) OV 225, 25 m, 0,23 mm ID, Chromapack® 14024 Kapillarsäule
Temperatur:	210°C isotherm
	b) CP Sil 19 CB, 25 m, 0,23 mm ID, Chromapack® WCOT Fused Sil.
	Kapillarsäule
	Temperaturprogramm: 150°C/3 min, dann 5°C/min bis 210°C

Trennung der Alditolacetate (quantitative Neutralzuckerbestimmung)
Säule:
Glas, 6 ft×2 mm, GP 3% SP-2330 auf 100/200 Supelcoport
Temperatur:	a) 225°C isotherm
	b) Programm: 210 bzw. 220°C isotherm

Enzymatische Hydrolyse der Polysaccharide mit Pektinase

1 mg Polysaccharid wurde zur Esterspaltung mit 1 ml 1 mol/l Ammo­ niak versetzt und über Nacht verseift, dann einrotiert und fünf­ mal mit je 1 ml Methanol nachgewaschen. Der Rückstand wurde in 200 µl Wasser gelöst und mit 5 µl Pektinase 3 bzw. 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis der freigesetzten Galaktu­ ronsäure erfolgte dünnschichtchromatographisch.

Partialhydrolyse der Polysaccharide

10-30 mg Polysaccharid wurden mit 2,5 ml 0,05 mol/l Trifluor­ essigsäure versetzt und 1,25 h Stunden im Trockenschrank bei 100°C erhitzt. Anschließend wurde das Partialhydrolysat am Rota­ tionsverdampfer eingeengt, in wenig Wasser gelöst, dünnschicht­ chromatographisch untersucht, 24 Stunden gegen demineralisiertes Wasser dialysiert bzw. über eine Biogel® P 2-Säule aufgetrennt und die entsprechenden Fraktionen gefriergetrocknet.

Methylierungsanalyse

2 bis 4 mg der getrockneten Substanz wurden in 200 µl getrockne­ tem Dimethylsulfoxid in einem mit Teflonkappe verschließbarem Borosilikatglasgefäß (ca. 30 auf 100 mm) gelöst und mit Stick­ stoff begast, wobei das Lösen durch Ultrabeschallung oder durch einen Whirlmixer vermittelt werden kann. Falls die Probe in DMSO unlöslich ist, werden nach Zugabe von 200 µl DMSO zwei schnelle Vormethylierungen durchgeführt, wobei für die erste Me­ thylierung 20 µl Kaliummethylsulfinylmethanid zugegeben wird und nach dem Mischen eisgekühltes Methyljodid 5 µl zupippetiert wird. Nach dem Mischen wurde für die zweite Vormethylierung 60 µl K- methylsulphinylmethanid zugegeben, gemischt, eisgekühlt und wei­ tere 15 µl Methyljodid wurden zugegeben.

Nach Lösen der Probe erfolgte die Methylierung. Dazu werden 200 µl K-methylsulphinylmethanid-Lösung (hergestellt aus Kaliumhydrid in getrocknetem DMSO) zugefügt, mit Stickstoff begast und gemischt. Nach 10 min wurde die Lösung gekühlt und eiskaltes Methyljodid (150 µl) zupippetiert. Nachdem der Ansatz unter Mischen wieder Zimmertemperatur erreicht hatte, wurde 10 min nach Zugabe des Methyljodids, 2 : 1 Chloroform-Methanol (3 ml) und 2 ml Wasser zugegeben, wobei nach jeder Zugabe gemischt wurde.

Nach 30 sek/Zentrifugieren (200 g) für die Phasentrennung wurde die obere Phase vorsichtig ohne die Berührungsfläche zu zerstören entfernt. Diese Waschprozedur wurde 4 mal mit je 2 ml Wasser wiederholt. Dann wurden 2 ml 2,2-Dimethoxypropan, 20 µl 18 mol/l Essigsäure und 2 bis 3 Glasperlen zugefügt. Nach dem Mischen wur­ de das Gefäß in ein 90°C heißes Wasserbad gestellt und bis auf 200 µl Lösung abgedampft. Die restliche Lösung wurde mit Stick­ stoff entfernt. Der ölige Rückstand wurde mit 2 mol/l Trifluor­ essigsäure 80,3 ml) im Trockenschrank 1 h bei 121°C hydrolysiert und nach dem Abkühlen auf dem Wasserbad (40°) mit Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt. Für die Reduktion wurde eine frisch berei­ tete 0,5 mol/l Natriumborhydridlösung in 2 mol/l Ammoniak (1 ml) zu dem trockenen Hydrolysat gegeben und 60 min bei 60°C redu­ ziert. Zum Abstoppen der Reaktion wird 0,5 ml Aceton zugefügt und in einem Wasserbad (40°C) wieder unter einem Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde nun in 0,2 ml 18 M Essig­ säure gelöst und durch Zugabe von Ethylacetat (1 ml) und Acetan­ hydrid (3 ml) acetyliert. Nach dem Mischen wurde noch 100 µl 70%ige Perchlorsäure zupippetiert und nochmals gemischt. Nach 5 min wurde eisgekühlt und 10 ml Wasser gefolgt von 200 µl Methyli­ midazol zugegeben, gemischt und 5 min inkubiert. Nach Zufügen von Dichlormethan (1 ml) wurde geschüttelt und nach Phasentrennung die Dichlormethanphase entfernt und für GC bzw. GC/MS verwendet.

Bestimmung der optischen Drehung (DABa)
Wellenlänge:
589 nm (Na)
Konzentration c:	0,1%
Lösungsmittel:	H₂O dest.
Durchführung:	Eine 0,1%ige Lösung der Substanz in 20,0°C warmem Wasser wurde zehnmal hintereinander gemessen und aus den erhaltenen Werten der Mittelwert α gebildet. Dieser wurde in die Formel eingesetzt und die optische Drehung berechnet.
optische Drehung:	[α]20 D = 100 xα/l×c

C13-NMR-Spektroskopie
Geräte:
a) Kernresonanzspektrometer 360 MHz,
	b) Kernresonanzspektrometer 500 MHz,
Lösungsmittel:	D₂O 99,9%
Standard:	Methanol intern, 49,00 ppm von TMS
Temperatur:	Raumtemperatur, falls nicht anders angegeben;
für das 500 MHz Protonen-NMR:	60°C

Die Verschiebungen der Signale werden nach der δ-Skala in ppm an­ gegeben.

Hemmung des Rattenpfotenödems nach Winter (1965)

In die rechte hintere Rattenpfote wurden subcutan 0,005 ml einer 1,0%igen Carrageenanlösung eine Stunde nach der intravenösen oder intraperitonealen Gabe einer Polysaccharidlösung (1-10 mg/kg in 0,9% NaCl) injiziert. Das Ödemvolumen wurde innerhalb der ersten 6 Stunden nach der Carrageenanprovokation stündlich mit einem Plethysmometer gemessen. Nach einem Zeitraum von 24 h erfolgte normalerweise die letzte Volu­ menbestimmung. Die prozentuale Reduktion des Ödemvolumens wurde auf eine NaCl-Kontrolle (0,9%) bezogen. Als Referenzsubstanz diente Indometacin (10 mg/kg).

Bestimmung der Gesamtkomplementaktivität CP2

Die in Puffer gelöste Substanz wurde mit konz. Serum (NHS) 30 Mi­ nuten bei 37°C inkubiert (2+1). Anschließend wurde die Reaktion im Eiswasserbad abgestoppt. 16 µl dieses Vorinkubationsansatzes werden daraufhin mit Puffer verdünnt und 125 µl einer sensibili­ sierten Hammelerythrozytensuspension in einer Konzentration von 2,5·10⁸ Z/ml zupipettiert. Nach einer weiteren Inkubation von 25 bis 35 Minuten (je nach Testablauf), wurde die Reaktion wie­ derum im Eiswasserbad abgestoppt. Die Reaktionsansätze wurden mit 480 g, 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert und die Überstände bei 412 nm gemessen. Als Kontrollwerte dient ein nur aus Puffer, Serum und Erythrozyten bestehender PK-Wert (völlig unbeeinflußte Reak­ tion), ein aus Erythrozyten und Puffer bestehender D-Wert (Eigen­ hämolyse der Erythrozyten) und ein aus Erythrozyten in dest. Was­ ser bestehender F-Wert (Totalhämolyse). Außerdem wurde die sub­ stanzeigene Zytotoxizität sowie ihre Eigenfärbung und diejenige des Serums ermittelt. Die Berechnung der prozentualen Beeinflus­ sung der Komplementreaktion erfolgen nach spektrophotometrischer Auswertung, wobei ein durch unbeeinflußte Reaktion des Testan­ satzes ermittelter Kontrollwert als Bezug diente und neben der Zytotoxität der Substanzen (NK_Subst.), die Eigenfärbungen der Substanzlösungen und der Serumverdünnungen (E-Wert_Subst., E- Wert_NHS) Korrekturgrößen bildeten.

Ext._Subst. = Ext._{Subst. gem.} - (NK_Subst. + E-Wert_Subst. + E-Wert_NHS)

Die Aktivität einer Substanz drückt sich in der prozentualen Re­ duktion der Hämolyse aus:

%-Reduktion der Hämolyse = 100-Ext._Subst./Ext._PK-WERT×100.

CP1

Der Test CP1 wurde im Prinzip wie für CP2 durchgeführt mit dem Unterschied, daß keine 30minütige Vorinkubation der Substanz bei 37°C erfolgte.

Carbon-Clearance-Test (Biozzi et. al. 1953)
Versuchstiere: NMRI-Mäuse, männlich, 20-25 g Lebendgewicht
Kollektivgröße: 6 bis 8 Tiere in der Substanz- und in der NaCl-Kontrollgruppe.

24 Stunden vor Testbeginn erhielten das Substanzkollektiv die Polysaccharidlösung in physiol. Kochsalzlösung in einer Konzen­ tration von 10 mg/kg Maus, die Kontrollgruppe entsprechende Vo­ lumina physiologischer Kochsalzlösung i.p. verabreicht. Am näch­ sten Tag wurde jeder Maus pro 30 g Körpergewicht 0,3 ml Tusche­ suspension in die Schwanzvene injiziert. Die Blutentnahme von 25 µ aus dem retroorbitalen Venenplexus erfolgte 3, 6, 9, 12 und 15 min später mit heparinisierten Einmalmikropipetten, die Blutproben wurden sofort in 2 ml destilliertem Wasser hämoly­ siert und die Extinktionen bei 650 nm bestimmt.

Auswertung: Aus dem Quotienten der Regressionskoeffizienten RC (lg E/t) von Substanz- und Kontrollgruppe ergibt sich die Akti­ vität.
Granulocytentest nach Brandt (Brandt et. al. Scand. J. Hematolo­ gy, Suppl. 2)

Hefesuspension: 0,5 g Bäckerhefe wurden nach Aufschwemmen mit physiolog. Kochsalzlösung 30 min im Wasserbad gekocht, abge­ kühlt, zweimal durch Gaze filtriert und mit physiolog. Kochsalz­ lösung in einer Neubauer-Zählkammer nach Anfärben mit Türks-Lö­ sung auf 3·10⁷ Zellen/ml eingestellt.

50 µl in PBS gelöste Substanz bzw. nur PBS wurden in 280 µl PBS, 20 µl autologem Serum oder Plasma und 100 µl Zellsuspension ge­ mischt und im Wasserbad bei mittlerer Schüttelstufe 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden je Ansatz 50 µl Hefensuspen­ sion zugegeben. Es wurde gemischt und weitere 30 min im Wasserbad belassen. Nach Abstoppen der Phagocytose mit 20 µl 0,2 M EDTA- Lösung wurden 300 µl jedes Ansatzes auf entfettete Objektträger verteilt und 2 h bei Raumtemperatur getrocknet. Die Färbung er­ folgt nach 5-7minütiger Fixierung mit Methanol mit May-Grün­ wald-Lösung (60 sec.), gepuffertem dest. Wasser (2 min), Giemsa- GebrauchsIösung (3 min) und Leitungswasser (2 min).

Auswertung: Ermittlung der durchschnittlich phagocytierten Hefe­ partikel pro Granulocyt aus 200 bis 300 Zellen = Phagocytosein­ dex. Jeder Objektträger wurde mindestens zweimal ausgezählt.

Eine neuere Methode des Granulozytentestes mit Durchflußzytome­ trie (Rothe u. Valet), die ebenfalls verwendet wurde, erlaubt die Phagozytose von menschlichen Leukozyten zu bestimmen, in dem He­ fe- oder Latexpartikel mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie Fluor­ esceinisothiocyanat, Teufelsgelb, 2,3-Dicyano-hydrochinon oder Acridinorange konjugiert werden und dann anschließend als Fluor­ eszenzprobe durchflußzytometrisch mit einem Facsan gemessen wer­ den.

Stimulierung des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF ) nach Ruff und Gifford (1981)
2·10⁵ Makrophagen wurden nach 24stündiger Kultivierung in RPMI-1640-Medium, supplementiert mit Antibiotika und 10% fötalem Kälberserum, zweimal gewaschen und mit RPMI-1640 Medium ohne Se­ rum 24 h weiterkultiviert, nachdem serielle Verdünnungen der Sub­ stanz über eine Mikrotiterplatte verteilt wurden.

Anschließend wurden die TFN-haltigen Überstände in zweifachen Verdünnungsreihen in eine Mikrotiterplatte pipettiert, auf die zuvor gleichmäßig 30 000 L929 Fibroblasten je well aus einer Suspension von 300 000 Zellen pro Milliliter ausgesäht wurden. Nach Zugabe von 100 µl einer Actinomycin D Lösung (5 µg/ml) je well und anschließender 18stündiger Inkubation erfolgte die mikroskopische Auswertung der Platte, wobei diejenige Substanz­ konzentration 1 Unit TNF-α freisetzte, die 50% der Fibroblasten abtötete.

Claims (5)

1. Polysaccharid mit einer Grundstruktur entsprechend der Formel (I)

• (i) einem mittleren Molekulargewicht von etwa 13 000 D,
• (ii) einem mittleren Uronsäuregehalt von etwa 55%,
• (iii) einem mittleren Proteingehalt von etwa 7%,
• (iv) einer mittleren optischen Drehung von etwa (+) 140° und
• (v) einer mittleren Neutralzuckerzusammensetzung von etwa 5,0% Rhamnose, etwa 4,0% Arabinose, etwa 8,0% Galaktose und etwa 0,5% Glucose.

2. Polysaccharid mit einer Grundstruktur entsprechend der Formel (II)

• (i) einem mittleren Molekulargewicht von etwa 14 000 D,
• (ii) einem mittleren Uronsäuregehalt von etwa 35%,
• (iii) einem mittleren Proteingehalt von etwa 4%,
• (iv) einer mittleren optischen Drehung von etwa (+) 65° und
• (v) einer mittleren Neutralzuckerzusammensetzung von etwa 11% Rhamnose, etwa 7% Arabinose, etwa 1% Xylose, etwa 6% Galaktose, etwa 1% Glucose.

3. Verfahren zur Isolierung der Polysaccharide nach Anspruch 1 und 2 aus Sedum telephium, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise getrocknete und pulverisierte Teile der Pflanze mit einem organischen Lö­ sungsmittel extrahiert, den Rückstand mit H₂O oder einer wäßrig-alkali­ schen Lösung extrahiert oder den Rückstand des H₂O-Extraktes einer wäßrig-alkalischen Extraktion unterzieht, aus den erhaltenen Extrakten die Polysaccharide ausfällt, das Präzipitat durch Anionenaustauschchromatographie auftrennt und aus der erhaltenen sauren Fraktion durch Gelchromatographie die Polysaccha­ ride isoliert.

4. Pharmazeutische Zubereitung enthaltend als Wirkstoff mindestens ein Poly­ saccharid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in Verbindung mit üblichen Trä­ ger- und Hilfsstoffen.

5. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich­ net, daß als weiterer aktiver Bestandteil ein Flavonoid oder Flavonoide aus Sedum telephium enthalten ist/sind.