KR100594353B1

KR100594353B1 - 신규한 인삼잎 및 줄기 다당체, 그 제조방법 및 그를활성성분으로 함유하는 항암제 및 항암보조제 조성물

Info

Publication number: KR100594353B1
Application number: KR1020030020925A
Authority: KR
Inventors: 곽태환; 신명숙; 김지연; 박종국
Original assignee: 주식회사 엠디바이오알파
Priority date: 2002-05-28
Filing date: 2003-04-03
Publication date: 2006-07-03
Anticipated expiration: 2023-04-03
Also published as: KR20050112071A; KR100605292B1; CA2486915C; CN1842341A; JP2005531576A; US7901716B2; KR20030091665A; WO2003099309A1; EP1507544B1; US20060034951A1; EP1507544A4; JP4861619B2; CA2486915A1; AU2003231394A1; KR20030091760A; EP1507544A1; JP2011093928A; CN1842341B; WO2003099308A1; KR20050105435A

Abstract

본 발명은 인삼잎 및/또는 줄기로부터 분리한 다당체 성분을 활성성분으로 함유하는 항암제, 암전이 억제제 및/또는 조혈촉진작용, 골수방어작용, 방사선민감작용이 탁월한 항암제 또는 항암보조제 조성물에 관한 것이다. 다른 한편으로, 본 발명은 인삼속 식물의 잎 및/또는 줄기를 50-180도에서 0.5-20시간 동안 가열 추출하여 다당체 분획을 수득함을 특징으로 하는 제조되는 인삼잎 및 줄기로부터 항암제, 암전이 억제제 및/또는 조혈촉진작용, 골수방어작용, 방사선 민감작용이 탁월한 항암제 또는 항암보조제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

인삼잎, 인삼줄기, 항암제, 암전이 억제제, 조혈촉진, 골수방어, 방사선민감작용, 항암보조제

Description

신규한 인삼잎 및 줄기 다당체, 그 제조방법 및 그를 활성성분으로 함유하는 항암제 및 항암보조제 조성물 {Active fraction having anti-cancer and anti-metastic activity isolated from leaves and stems of Ginseng}

도 1. Panax ginseng C.A. Mayer와 Panax quinquefolium의 잎 및 줄기 다당체의 폐암 전이 활성 비교.

도 2. 고형암에서 MB40100에 의한 항 종양 효과.

도 3. MB40100에 의한 폐암 전이 예방 효과.

도 4. MB40100에 의한 폐암 전이 치료 효과.

도 5. MB40100의 자연살해세포(NK cell) 매개 암세포 세포독성활성능 측정.

도6. 조혈 촉진 실험 : 골수모세포 생성작용(Granulocyte macrophage-colony forming unit, GM-CFU)

도7. MB40100에 의한 항암제 유발 조혈 장애 억제 작용 : 혈액 내 백혈구 수 변화

도8. MB40100에 의한 항암제 유발 조혈 장애 억제 작용 : 혈액 내 혈소판 수 변화

도9. MB40100에 의한 항암제 유발 조혈 장애 억제 작용 : 비장 세포수 변화

도10. MB40100에 의한 항암제 유발 조혈 장애 억제 작용 : 골수 세포수 변화

도11. MB40100에 의한 방사선 방어 작용 : 비장 세포수 변화

도12. MB40100에 의한 방사선 방어 작용 : 골수 세포 수 변화

도13. MB40100에 의한 면역 세포 활성화

도14. MB40100에 의한 항암성 사이토카인 생성

도15. 항암제 병용투여에 의한 부작용 억제효과.

도16. 항암제 병용투여 시 항암 상승 작용.

본 발명은 인삼잎 및/또는 줄기로부터 분리한 다당체 성분을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 NKT 세포, NK세포등 면역세포의 활성화에 의한 항암 및/또는 암전이 억제제 그리고 조혈촉진작용, 골수방어작용, 방사선 민감작용이 탁월한 항암보조제 조성물에 관한 것이다.

다른 한편으로, 인삼속 식물의 잎 및/또는 줄기를 (50-180도에서 0.5-20시간 동안) 열수 추출하여 다당체 분획을 수득하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 인삼잎 및/또는 줄기로부터 항암제, 암전이 억제제 및/또는 조혈촉진작용, 골수방어작용, 방사선민감작용이 탁월한 항암보조제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 미국에서 사망자의 약 20%가 암관련 질환에 의하여 사망하고 있다. 비록 화학요법이 암치료의 주요 수단으로 사용되고 있지만 암치료를 위한 효과적인 약물은 그리 많지가 않다.

암으로 인한 대부분의 사망은 일차 암세포의 결과에 의해서 보다는 오히려 암세포의 전이에 의하여 이루어지는 이차 전이암에 그 원인이 있다. (Fifler, 1991 cancer metastasis. Br. Med. Bull. 47, 157-177). 수많은 실험과 임상연구를 통하여 자연 면역력이 초기 암세포의 전이를 효과적으로 저해하고 치유하는데 중요한 역할을 하는 것으로 확인 되었다. (Schantz et al.,cancer immunol. immunother. 25., 141-148, 1987).

NKT 세포는, T 세포수용체와 함께 NK 세포 수용체도 겸하여 가진 독특한 세포로서, T 세포와 NK 세포라는 별도의 림프구의 특징을 가지고 있다. 이 NKT 세포는 마우스에서 암세포의 간암과 폐암으로의 전이 억제에 중요한 작용세포인 것으로 알려져 있으며 (Hashimoto et al., J. Imunolo., 154, p4333, 1995; Anzai et al., Immunol., 88, p82, 1996), 또한 NKT 세포는 암세포, 기생충 및 리스테리아와 결핵균 등의 세포 내 감염세균의 배제에 중요한 역할을 하는 세포로도 알려져 있다 (Seki et al., Clin. Immunol., 28, p1069, 1996).

한편, 암세포 및 바이러스와 박테리아등의 감염에 대하여 효과적으로 저지할 수 있는 세포는 NKT 세포뿐만 아니라 자연살해세포 (NK), LAK 세포, 그리고 마크 로파아지 등이 알려져 있다. 즉 자연살해세포, LAK 세포, 그리고 마크로파지의 효과적인 활성은 암세포 성장의 저지 및 암전이에 효과적인 것으로 확인 되었다. 또한 면역자극제에 의한 자연살해세포의 활성화는 암세포의 전이에 의한 번식을 효과적으로 억제함이 밝혀졌다.(Herberman, 1984 J. invest. Dermatol. 83, 137-140).

이들 면역체계에 의한 항암, 항전이, 항바이러스의 작용들은 면역계는 활성화는 여러가지 사이토카인의 분비에 의해 매개되어진다. 특히 항암, 항전이, 항바이러스와 연관된 사이토카인으로서 대표적으로 알려져 있는 것은 감마인터페론, 종양괴사인자-알파 등이다.

감마인터페론은 주로 T세포에서 만들어져 면역반응을 조절하고 T, B 세포 호중구, 자연살해세포, 대식세포등에 작용하여 활성화 시켜 암세포를 공격하여 만성 골수성 백혈병, 신장암 치료에 치료제로 이용되고 있다. 또한, DNA 합성을 억제하고 세포증식을 직접 억제하는 작용이 강하여 암 치료뿐만 아니라 다른 인터페론처럼 바이러스 및 박테리아의 증식을 억제하여 항바이러스제제 및 다제내성균 및 진균감염증에 임상적용되고 있다.

종양괴사인자-알파는 주로 대식세포에 의하여 생산되어지는데 염증반응 등 다양한 면역반응에 관여하며 특히 암세포에 대하여 강력한 독성을 나타내며 현재 일본에서 피부암치료제로 임상시험을 거쳐 등록 전 상태에 있다.

그러나, 항암요법에 이러한 사이토카인을 직접 사용하는 방법은 예기치 못한 염증반응, 구토 등 부작용을 야기시키며, 따라서 최근엔 특정 사이토카인만의 처리하는 방법이 아니라 전반적인 면역계를 활성화 시키는 물질을 찾아내려는 시도가 많이 이루어지고 있다.

그러나, 지금까지 개발되어 보고되어진 자연살해세포를 포함한 면역세포의 활성화에 효과적인 것으로 밝혀진 천연물을 그리 많지 않은 상황인데 그 중 밝혀진 중요한 소재를 보면 참나무과의 식물에 기생하여 사는 상기생 추출물의 렉틴성분이 암치료의 대체요법으로 일부 사용되어지고 있으며 버섯류에 함유되어 잇는 베타글루칸 계열에 속하는 다당류들이 자연살해세포의 활성화에 관여하는 것으로 알려져 있다.

인삼은 예로부터 대표적인 자양강장제로 널리 사용되어온 식물로서 일반적으로 재배하여 채취한 그대로의 수삼을 상온에서 건조시킨 백삼, 또는 수삼을 가열처리하여 제조되는 홍삼의 형태로 사용된다. 인삼의 성분과 약효에 관한 많은 연구 결과가 보고 되어 있는데, 현재 까지 알려진 인삼의 약효로는 노화억제, 항동맥 경화 및 고지혈증 개선, 간기능 항진, 방사선장애제거, 면역증강, 항혈전, 뇌기능항진 항스트레스, 혈당강하, 혈압강하, 또는 항암효과 등이 있다. 이들의 효과를 나타내는 주요 성분은 사포닌 계통의 물질들에 의하여 주로 이루어지고 있는 것으로 알려지고 있다. 인삼의 뿌리에 함유된 산성 다당체의 추출 및 분리를 통하여 이들의 효능에 관한 연구들이 최근 활발하게 진행되는 것으로 알려져 있다. 이들은 주로 마크로파아지를 활성화시켜 종양괴사인자, 일산화질소에 의하여 마크로파지로 하여금 인터페론 감마의 생성을 촉진시켜 마크로파지 매개에 의한 암세포저해를 유도하는 것으로 알려졌다.(특허 0144130 )

지금까지 인삼은 주로 인삼의 뿌리에 관해서만 많은 연구가 이루어진 상태이며, 인삼잎 또는 줄기에 관한 연구는 거의 전무한 상태이다. 인삼잎 또는 줄기가 가지고 있는 장점은 인삼의 뿌리는 약효를 나타내기 위해서는 6년 이상의 장기간 재배한 뿌리에서 약효성분이 제대로 나타내는 것으로 알려져 있지만, 인삼잎 또는 줄기는 매년 생산되어 버려지거나 극히 제한된 용도로 단순 가공되어 사용되어 지고 있는 실정이다. 그러나 만약 인삼잎 또는 줄기에 인삼의 뿌리에서 확인할 수 있는 정도의 약효를 나타내는 생리활성 물질이 함유되어 있다면 이는 부산물의 이용 뿐 아니라 경제적인 면에서도 커다란 부가적인 장점을 갖는다고 할 수 있다.

인삼잎 또는 줄기가 이용되어진 사례를 보면 인삼잎 사포닌을 이용한 화장품의 제조방법(특허공고번호 83-141), 인삼잎을 알카리 조건에서 어글리콘 사포닌을 얻는 방법에 관하여(약학회지, 38(4), 1994, 8), 지구력증강, 스트레스 피로 및 감염에 유효한 용도의 허브차 개발관련, 인삼잎을 포함한 생약초 추출물을 이용한 두피관련 삼푸 및 로션(특허 0023641), 가축의 면역력증진, 성장촉진, 질병감염예 방을 위하여 인삼잎을 포함한 10 여 가지의 한약재 및 허브를 함유한 가축의 발효 미생물제재, 여성의 냉증 치료를 위한 보혈제로서 그리고 인삼잎이 포함된 여성청결티슈(특허 0214223)등에 응용되고 있다.

최근에 인삼잎의 다당체가 마크로파지의 Fc 수용체 발현을 향상시켜 immune complex clearance rate를 높이고, 따라서 자가면역질환에 유효한 응용이 가능할 것으로 예상했으며(progress in biotechnology. vol 14, 1996, 623-630). 인삼잎 유래의 다당체가 위궤양의 치유에 유효한 효과가 있음을 보고하였다.(planta Med. 58, 1992, 445-448)

본 발명자들은 인삼 잎 및/또는 줄기로부터 추출 분리한 다당체 분획이 자연살해 T세포, 자연살해세포, 대식세포 등의 면역세포를 활성화시키고 인터페론 감마, 종양억제 인자 알파 등 사이토카인의 분비를 촉진하여 암세포의 성장 저지 및 암전이 억제에 매우 효과적이며, 또한 조혈촉진작용과 기존 항암제 및 방사선 치료의 부작용을 완화시키는 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 인삼 잎 및/또는 줄기로부터 다당체 분획을 추출, 수득함으로써 제조되는 인삼 잎 및/또는 줄기 추출물을 제공하는 것이며,

다른 한편으로 상기 추출물과 이를 포함하는 약제학적 조성물의 암세포저지 및 암전이 를 경감시키는 항암제, 암전이 억제제, 및/또는 조혈촉진제, 방사선 부 작용 억제제, 항암제 부작용 억제제, 자가면역치료제로의 신규한 용도를 제공하기 위한 것이다.

또 다른 한편으로, 인삼잎 및/또는 줄기를 열수 추출 분리하여 암세포의 성장 저지 및 암전이에 매우 효과적인 인삼잎 및/또는 줄기 추출물 및/또는 활성 다당체 분획의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

상기의 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 인삼속 식물의 잎 및/또는 줄기를 pH 4-10, 50-180도에서 0.5-20시간 동안 가열하여 인삼잎 및/또는 줄기를 추출 분리하고 농축한 후 저급알콜을 이용하여 다당체를 침전 분리하여 유기용매를 제거하여 다당체분획을 수득함으로써 제조되는 인삼잎 및 줄기 추출물을 활성성분으로 함유하는 조성물을 제공한다. 상기 인삼속 식물의 잎으로는 파낙스진생(panax ginseng C.A. Mayer), 파낙스퀸크폴리옴(panax quinquefolium), 파낙스노토진생(panax notoginseng), 파낙스슈도진생(panax pseudoginseng) 또는 파낙스자포니쿰(panax japonicum), 베트남진생(panax vietnamensis Ha et Grushv.) 등을 사용할 수 있으며 상기 인삼잎 및 줄기를 단독 혹은 2종이상 혼합하여 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하면 하기와 같다.

본 발명에서는 인삼 잎 및/또는 줄기의 추출물을 제조하기 위하여 인삼속 식물의 잎 및/또는 줄기에 10-20배의 물을 넣어 pH4-10, 50-180도에서 0.5-20시간 동안 가열 추출한다. 사용 가능한 인삼속 식물에는 파낙스진생 뿐만 아니라 파낙스퀸크폴리옴, 파낙스노토진생, 파낙스슈도진생 또는 파낙스자포니쿰, 베트남진생 등이 있다. 이하 보다 자세히 설명한다. 열수 추출한 인삼 잎 및/또는 줄기는 인삼 잎 및/또는 줄기를 포함한 잔사를 제거하기 위하여 추출용액과 잔사를 여과포를 이용하여 분리시킨 후 부유하고 있는 작은 입자를 제거하기 위하여 일련의 정밀 여과 공정 및 원심분리 공정을 거친다. 최종 여과 공정은 0.45 um의 여과 공정 혹은 한외여과 공정을 거쳐 이룰 수 있으며 원심분리는 7,000 회전수에서 30분을 처리하여 이룰 수 있다. 분리 여과 공정이 끝난 분리액에 함유된 다당체의 효과적인 회수를 위하여 농축공정을 거친다. 농축은 진공농축을 이용하여 온도는 70도에서 760 mmHg의 감압 하에서 당도계를 이용하여 20 brix 이상이 될 때까지 농축한다. 농축된 용액을 회수하여 다당체의 효과적인 회수를 위하여 0.1-1M 농도의 염화나트륨을 넣어 용해시킨 후, 보다 바람직하게는 상기 염화나트륨의 농도를 0.5-1M로 조절한 후, 에탄올, 메탄올과 같은 저급알콜 또는 아세톤을 1-4 부피 정도 바람직하게는 2-4부피를 사용하여 인삼 잎 및/또는 줄기 다당체를 침전시킨다. 침전된 인삼 잎 및/또는 줄기 다당체를 95 % 이상의 저급알콜을 이용하여 수회 세척하여 수분 및 불순물을 완전히 제거시킨 후 투석 및 한외여과를 이용하여 염들을 제거한 후 동결 건조시킨다. 건조방법은 일반적인 열풍, 진공건조, 동결건조, 분무건조 중 하나를 택하여 건조한다.

목적하는 제제 또는 용도에 따라, 좀 더 효과적이고 부가적인 분리방법 혹은 정제공정을 채택할 수 있으며, 그 한 예를 예시하고자 한다. 상기 분리 여과 공정이 끝난 분리액의 pH를 약 8.0으로 조정하고 추출액이 0.4 M NaCl/10 mM Tris-HCl이 되도록 하여 음이온 교환수지(상품명: PA312 styrene계 강 염기성 음이온 교환수지, Diaion사)컬럼에 30 ml/min의 속도로 통과시킨다. 이 음이온 교환수지는 미리 0.4 M NaCl/10 mM Tris-HCl로 평형(equilibrium)시켜 색(color)이나 불순물만을 흡착시키고 시료의 다당체들이 흡착 되는 것을 막아준다. 이 음이온 교환수지 컬럼을 사용버퍼로 충분히 세척 하고, 이 통과액의 pH를 약 6~7 사이로 조정한 후 흡착성 수지(상품명: Hp 20, Diaion사) 컬럼에 30~50 ml/min의 속도로 통과시킨다. 증류수로 컬럼을 충분히 세척하고, 통과시킨 시료가 모두 흘러나왔는지는 3배 에탄올 침전법으로 확인한다. 통과액의 부피에 약 3배 부피의 에탄올(95%)를 첨가시켜 다당만을 효과적으로 침전시켜 농축할 수 있다. 이 다당을 회수하기 위하여 원심분리(5000 rpm, 15 min)하여 투석한다. 이 용액의 pH를 8로 조정하고 10 mM Tris-HCl(pH 8) 버퍼를 첨가한 후 음이온 교환수지(상품명: Q sepharose, Phamacia biotech.사)컬럼에 15~20 ml/min의 속도로 흘려주어 흡착되도록 하였다. 버퍼로 충분히 세척 한 후, 0.5M NaCl로 elution 시킨다. 용출시킨 액에 에탄올을 약 3배 부피로 첨가하여 다당을 침전시키고 원심분리(5000 rpm, 15 min)하여 회수하고, 95% 에탄올로 2회 세척하여 불순물을 제거한 후, 분자량 6000 미만으로 투석하여 남은 에탄올을 제거시켜 동결건조 한다.

용매추출을 통하여 얻은 추출물을 1mg/ml의 농도로 3차 증류수로 용해하여 분석한 결과 파낙스 진셍 C.A. 메이여 (Panax ginseng C.A. Mayer)는 중성당 함량 이 68.9%, 산성당 함량이 15.9%, 그리고 단백질 함량은 8.7%로 구성되어 있음을 알 수 있다. 파낙스퀸크폴리옴(panax quinquefolium)은 중성당 함량이 57.8%, 산성당 함량이 35% 그리고 단백질 함량이 5.4 % 있음이 측정되었다.

이온교환수지, 흡착수지등을 사용하여 정밀하게 분리 정제공정을 통하여 얻은 추출물을 1mg/ml의 농도로 3차 증류수로 용해하여 화학분석한 결과, 파낙스 진셍 C.A. 메이여 (Panax ginseng C.A. Mayer)는 중성당 함량이 51.3%, 산성당 함량이 46.8%, 그리고 단백질 함량은 0.1%로 구성되어 있음을 알 수 있다. 당조성은 람노스 5.97%,, 퓨코스 1.22%, 아라비노스 14.86%, 자일로오스 0.44%, 만노스 1.93%, 글루코오스 3%, 갈락토오스 22.7%, 갈락투론산 31.4%, 글루큐론산 14.4%, KDO 1.38% 그리고 DHA(d-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 1.02%등으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 파낙스퀸크폴리옴(panax quinquefolium)은 중성당 함량이 49%, 산성당 함량이 50.8% 그리고 단백질 함량이 0.2 % 있음이 측정되었다. 당조성은 람노스 9.7%, 퓨코스 4.1%, 아라비노스8.7%, 자일로오스 0.7%, 만노스 1.5%, 글루코오스 1.2%, 갈락토오스 12%, 갈락투론산 44%, 글루큐론산 5%, KDO 6%그리고 DHA(d-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 1.2% 등으로 구성되어 있었다.

인삼 잎 및/또는 줄기의 분자량은 대략 340,000 Da에서 6,000Da를 지니며 120,000Da부근에서 평균분자량을 나타냈다.

한편, 인삼 잎 및/또는 줄기의 종류에 따라 당 함량의 조성비는 중성당의 경우 30 내지 80%, 산성당의 경우 10 내지 60%, 단백질의 경우 0.01 내지 10% 범주에서 다양하게 나타났으나, 당조성은 공통적으로 람노스, 퓨코스, 아라비노스, 크실 로스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 갈락투론산, 글루큐론산, KDO 그리고 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)등으로 구성되어 있었으며, 모든 추출물에서 항암, 항전이 및/또는 항암보조제로서의 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

.

상기와 같이 수득한 인삼잎 및/또는 줄기 추출물 또는 다당체를 함유하는 조성물은 NKT 세포, NK세포, 대식세포, T세포, B 세포등 전반적인 면역계를 활성화시키고 항암과 연관된 사이토카인등의 분비를 촉진시켜 암세포의 증식 및 전이를 현저하게 경감시키는 효과를 가지므로 항암제 및 항전이의 치료제로 사용할 수 있으며 또한 항암제 및 방사선치료로 생긴 백혈구 감소증등의 부작용을 억제함으로써 항암제 및 방사선치료의 보조제로 유용하게 사용할 수 있다

이러한 목적을 위하여 본 발명의 조성물은 그자체로 또는 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를들면 정제, 캅셀제, 액제, 현탁제등의 경구투여용제제, 주사용제제 또는 현탁액 등의 다양한 제제로 제형화 할 수 있다. 또한 경구투여시 약제가 위산에 의해 분해하는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나 정제등의 경구투여용 고형제제를 장용피로 피복한 제제로 제형화하여 투여할 수도 있다.

본 발명에 따르는 인삼잎 및 줄기 추출물의 다당체 분획의 인체에 대한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태에 따라 적절히 사용하여야 하나, 일반적으로 성인에게 1일 100ug-6000mg, 바람직하게는 20-5000mg의 양이 투여되도록 한다.

이하 본 발명을 발명의 구성 및 효과를 나타내기 위하여 실시예에 의거 보다 상세하게 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것 일뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

제조예 1 : 인삼잎 및/또는 줄기의 조다당체 추출물의 제조

파낙스진셍 C.A. 메이여 (Panax ginseng C.A. Mayer) 및 파낙스 퀸크폴리옴(panax quinquefolium)의 잎 및/또는 줄기 100g에 물을 1L 넣어 100도에서 5시간 동안 가열 추출하였다. 추출액과 인삼잎 및/또는 줄기를 부직포를 이용하여 분리시킨 후 7,000회전수에서 30분 원심분리하여 불용성 이물질을 제거한 후 다당체가 함유된 상등액을 70도에서 760mmHg의 감압하에서 농축하여 20brix가 되도록하여 100ml을 얻었다. 농축물에 염화나트륨이 최종 1M이 되도록 녹인 후 에탄올을 3부피가 되도록 300ml을 넣어 혼합시킨 후 1시간 방치하여 상등액과 침전물을 분리하였다. 침전물에 95% 에탄올을 100ml 씩 2회에 걸쳐 세척하여 불순물을 제거한 후 투석하여 동결건조하였다.

제조예 2 : 인삼잎 및/또는 줄기 추출물의 다당체 제조

파낙스진셍 C.A. 메이여 (Panax ginseng C.A. Mayer) 및 파낙스퀸크폴리옴(panax quinquefolium) 500g을 각 각 증류수 5L로 약 3시간 동안 열수 추출하여 이를 거즈를 이용하여 추출액과 슬러지를 분리하였다. 추출액을 원심분리(7000 rpm, 20 min)하여 상등액을 회수한다. 이 상등액의 pH를 약 8.0으로 조정하고 추출액이 0.4 M NaCl/10 mM Tris-HCl이 되도록 하여 음이온 교환수지(상품명: PA312 styrene계 강 염기성 음이온 교환수지)컬럼에 30 ml/min의 속도로 통과시킨다. 이 음이온 교환수지는 미리 0.4 M NaCl/10 mM Tris-HCl로 평형(equilibrium)시켜 색(color)이나 불순물만을 흡착시키고 시료의 다당체들이 흡착 되는 것을 막아준다. 이 음이온 교환수지 컬럼을 사용버퍼로 충분히 washing 하고, 이 통과액의 pH를 약 6~7 사이로 조정한 후 흡착성 수지(상품명: Hp 20 Diaion사) 컬럼에 30~50 ml/min의 속도로 통과시킨다. 증류수로 컬럼을 충분히 washing 하고, 통과시킨 시료가 모두 흘러나왔는지는 3배 에탄올 침전법으로 확인한다. 통과액의 부피에 약 3배 부피의 에탄올(95%)를 첨가시켜 다당만을 효과적으로 침전시켜 농축할 수 있다. 이 다당을 회수하기 위하여 원심분리(5000 rpm, 15 min)하여 투석한다. 이 용액의 pH를 8로 조정하고 10 mM Tris-HCl 버퍼를 첨가한 후 음이온 교환수지(상품명: Q sepharose, Phamacia 사)칼럼에 15~20 ml/min의 속도로 흘려주어 흡착되도록 하였다. 10 mM Tris-HCl 버퍼로 충분히 washing 한 후, 0.5M NaCl로 elution 시킨다. 용출시킨 액에 에탄올을 약 3배 부피로 첨가하여 다당을 침전시키고 원심분리(5000 rpm, 15 min)하여 회수하고, 95% 에탄올로 2회 세 척하여 불순물을 제거한 후, 분자량 6000 미만으로 투석하여 남은 에탄올을 제거시켜 동결건조 한다.

제조예 3 : 인삼잎 및/또는 줄기으로부터 추출물 MB40100의 제조 / 주사제용 시료의 제조방법

파낙스진셍 C.A. 메이여 (Panax ginseng C.A. Mayer) 의 시료를 제조예 2에서 두번째 음이온교환수지인 Q-sepharose 수지에서 용출된 액을 발열성물질의 제거를 위하여 실리카겔이 충진된 컬럼을 통과시킨 후 에탄올을 3배 부피로 첨가하여 다당을 침전시키고 원심분리하여 회수하고 95%에탄올로 2회 세척하여 불순물을 제거한 후 3차 증류수에 용해시킨 후 분자량 6,000으로 투석하여 에탄올을 제거한 후 무균화 를 위하여 0.2um여과장치를 통과시켜 발열반응물질이 없는 무균의 시료를 제조한다. 무균화된 시료를 3ml vial에 일정량씩 분주하여 냉동시킨 후 동결건조하였다. 건조된 시료는 생리식염수에 용해하여 시험을 수행하는데 사용하였다. 또한 이 후에 진행된 실험에 사용된 파낙스 진셍 C.A. 메이여(Panax ginseng C.A. Mayer)의 잎 및 줄기에서 추출한 다당체를 MB40100으로 명명하였다.

실시예 1 : 인삼잎 및/또는 줄기 추출물의 성분분석

상기 제조예에 따라 제조된 추출물의 성분분석을 수행하였다. 총당 함량은 galactose를 표준물질로하여 phenol-sulfuric acid 법(Dubois et al Anal. chem., 28, 350, 1956)으로 산성당 함량은 β-D-galacturonic acid를 표준물질로하여 m-hydroxybiphenyl법(Blumenkrantz et al, Anal. biochem., 54, 484, 1973)으로 단백질함량은 bovine albumin을 표준물질로하여 Lowry법(Lowry et al, J. Biol, Chem., 193, 265, 1951)으로 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)상 물질은 tiobarbituric acid법을 이용하여 각각 정량 분석하였다.

구성당의 분석은 Jones법 (plant physiol., 49, 926, 1972)에 따라 alditol acetate 유도체화하여 gas-liquid chromatography (GLC)법으로 구성당을 분석하였다.

상기 제조예1에서 얻은 추출물을 1mg/ml의 농도로 3차 증류수로 용해하여 상기분석법에 따라 분석한 결과 파낙스 진셍 C.A. 메이여 (Panax ginseng C.A. Mayer)는 중성당 함량이 68.9%, 산성당 함량이 15.9%, 그리고 단백질 함량은 8.7%로 구성되어 있음을 알 수 있다. 파낙스퀸크폴리옴(panax quinquefolium)은 중성당 함량이 57.8%, 산성당 함량이 35% 그리고 단백질 함량이 5.4 % 있음이 측정되었다.

상기 제조예2에서 얻은 추출물을 1mg/ml의 농도로 3차 증류수로 용해하여 상기 분석법에 따라 화학분석한 결과, 파낙스 진셍 C.A. 메이여 (Panax ginseng C.A. Mayer)는 중성당 함량이 51.3%, 산성당 함량이 46.8%, 그리고 단백질 함량은 0.1%로 구성되어 있음을 알 수 있다. 당조성은 람노스 5.97%,, 퓨코스 1.22%, 아라비노스 14.86%, 자일로오스 0.44%, 만노스 1.93%, 글루코오스 3%, 갈락토오스 22.7%, 갈락투론산 31.4%, 글루큐론산 14.4%, KDO 1.38% 그리고 DHA(d-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 1.02%등으로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 파낙스퀸크폴리옴(panax quinquefolium)은 중성당 함량이 49%, 산성당 함량이 50.8% 그리고 단백질 함량이 0.2 % 있음이 측정되었다. 당조성은 람노스 9.7%, 퓨코스 4.1%, 아라비노스8.7%, 자일로오스 0.7%, 만노스 1.5%, 글루코오스 1.2%, 갈락토오스 12%, 갈락투론산 44%, 글루큐론산 5%, KDO 6%그리고 DHA(d-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 1.2% 등으로 구성되어 있었다.

분자량은 HPLC(영린)로 확인하였으며 컬럼은 GS-520HQ, GS-320HQ, GS-220HQ(Shodex Asaipack GS series, showa denko사) 컬럼을 차례로 연결하여 측정하였다. 인삼 잎 및/또는 줄기의 분자량은 대략 340,000 Da에서 6,000Da를 지니며 120,000Da부근에서 평균분자량을 나타냈다.

한편, 인삼 잎 및/또는 줄기의 종류에 따라 당 함량의 조성비는 중성당의 경우 30 내지 80%, 산성당의 경우 10 내지 60%, 단백질의 경우 0.01 내지 10% 범주에서 다양하게 나타났으나, 당조성은 공통적으로 람노스, 퓨코스, 아라비노스, 크실로스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 갈락투론산, 글루큐론산, KDO 그리고 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)등으로 구성되어 있었으며, 모든 추출물에서 항암, 항전이 및/또는 항암보조제로서의 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

비교예 1. Panax ginseng C.A.Mayer 및 Panax quinquefolium 의 잎 및 줄기의 다당체 회수에 의한 활성 비교.

상기 제조예에 따라 제조된 각 각의 추출물에 대한 폐암 전이 억제 활성을 측정한 결과, 파낙스 진셍 C.A.메이여 (Panax ginseng C.A. Mayer) 다당체의 경우 88.3%, 파낙스퀸크폴리옴(Panax quinquefolium) 다당체의 경우 83.1%의 전이 억제율을 나타냈으므로, 이후 실험은 상기 실험 방법에 따른 Panax ginseng C.A. Mayer를 이용하여 다당체를 회수하는 공정을 수행하였다. 또한 제조예 3에서 밝힌 바와 같이 파낙스 진셍 C.A. 메이여의 잎 및 줄기에서 얻은 다당체를 MB40100으로 명명하였다.(도 1)

실시예 2 : 인삼잎 및/또는 줄기 추출물인 MB40100에 의한 고형암에 대한 항종양효과

BALB/c 마우스 (20마리/군)에 비상피성종양유래 세포주인 Sarcoma 180 또는 상피성 종양 유래 세포주인 UV2237P 세포를 1x10⁶개씩 사타구니에 투여한 후 3일째부터 MB40100 추출물을 10, 20 mg/Kg 의 농도로 매일 10회 복강투여하고 4주후에 종양의 크기를 대조군과 비교하였다. 도2에서 보듯이 시료 MB40100은 비상피성유래 암의 경우 40%, 30% 그리고 상피성 유래 고형암에 대해서는 35%, 22% 로 고형암의 크기가 감소하는 것으로 보아 이들 고형암에 대해 종양억제하는 것으로 확인되었다. (도 2)

실시예 3: 인삼잎 및/또는 줄기 추출물인 MB40100에 의한 폐암 전이의 예방효과

전이성이 높은 colon 26 carcinoma인 colon 26-M3.1 세포를 7.5%FBS, 비타민 용액, sodium pyruvate, 비필수아미노산 그리고 L-glutamine이 함유된 Eagles MEM에서 단층배양으로 보존되었다. colon 26-M3.1 세포의 폐전이 실험은 Balb/c 마우스에 암세포를 주사하여 전이의 정도를 평가하였다. (Yoo et al, 1994 vaccine 12, 175-180) 시료는 인산으로 완충된 생리식염수에 용해시킨 후 0.2ul의 무균 여과지를 통과시킨 시료를 농도별로 주사하였다. MB40100을 마우스의 혈관에 500ug, 100ug, 20ug, 그리고 4ug의 농도를 각각 주사한 후 colon 26-M3.1(2.5 x 10⁴/mouse)세포를 2일 후에 주사하여 암전이 예방효과를 실험하였다. 암세포를 주사한 후 14일이 경과되었을 때 마우스를 죽인 후 폐를 Bouin's 용액으로 고정시켰다. 폐로 전이된 암세포의 수는 육안으로 계수 하였다. 도3에서 보듯이 혈관 주사에 의한 시료 MB40100은 colon 26-M3.1 세포의 폐전이를 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다. (도 3)

실시예 4 : 인삼잎 및/또는 줄기 추출물인 MB40100에 의한 폐암 전이 치료효과

전이성이 높은 colon 26 carcinoma인 colon 26-M3.1 세포를 7.5% FBS, 비타민 용액, sodium pyruvate, 비필수아미노산 그리고 L-glutamine이 함유된 Eagles MEM에서 단층배양으로 보존되었다. colon 26-M3.1 세포의 폐전이 실험은 C57BL/6 와 Balb/c 마우스에 암세포를 주사하여 전이의 정도를 평가하였다. (Yoo et al, 1994 vaccine 12, 175-180) 시료는 인산으로 완충된 생리식염수에 용해시킨 후 0.2ul의 무균 여과지를 통과시킨 시료를 농도별로 주사하였다. colon 26-M3.1(2.5 x 10⁴/mouse)세포를 1일과 4일 전에 주사하여 암전이를 유도한 후 시료 MB40100을 마우스의 혈관에 500ug, 100ug, 그리고 20ug의 농도를 각각 주사하여 전이된 암세포의 성장을 억제하는 치료효과를 확인하기 위하여 실시하였다. 암세포를 주사한 후 14일이 경과되었을 때 마우스를 죽인 후 폐를 Bouins 용액으로 고정시켰다. 폐로 전이된 암세포의 수는 분할 현미경하에서 암세포의 수를 계수 하였다. 도4 에서 보듯이 혈관 주사에 의한 시료 MB40100은 colon 26-M3.1 세포의 폐조직으로 전이된 암세포의 성장을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 확인되었다. (도 4)

실시예 5 : 인삼잎 및/또는 줄기 MB40100의 자연살해세포 매개 암세포 세포독성활성 능력 측정

자연살해세포 매개 세포독성활성은 방사선동위원소인 ⁵¹Cr의 방출량을 측정하여 활성을 측정하였다.(Yoo et al, 1997, Jpn. J. cancer Res. 88, 184-190). 그룹당 Balb/c 마우스 2마리에 MB40100시료를 500ug, 100ug, 20ug, 4ug 씩 혈관 주사하였다. 시료 MB40100을 500ug, 100ug, 20ug, 그리고 4ug 씩 주사한 후 2일 경과한 후 마우스의 비장세포를 회수하였다. ⁵¹Cr-labelled Yac-1 cells(1 x 10⁴/100ul/well)에 각 비장세포용액(100ul/well)을 effector(splenocytes) 대비 target(Yac-1)세포의 비율(E/T 비율)이 100:1, 50:1, 25:1, 그리고 12.5:1이 되도록 U-bottomed 96-well plate에 넣었다. 배양은 5%이산화탄소 상태에서 37도에서 6시간 배양하였다. 배양 후 plate를 900 x g에서 10분간 원심분리하여 각 well에 있는 상등액을 면봉에 흡착시켜 감마계수기를 사용하여 방출되는 방사선동위원소 양을 측정하였다. 자연살해세포에 의하여 발생된 세포독성 활성의 비율은 다음의 공식에 따라 radioactivity(count/min)로 계산하였다.

cytotoxicity(%)=[(experimental release-spontaneous release)/(maximum

release-spontaneous release)] x 100

도5에서 보는바와 같이 MB40100를 농도별로 주사하여 얻은 마우스의 비장세포 중의 자연살해세포는 무처리 대조군에 비하여 농도 의존적으로 상해활성의 증가 양상을 보였으며 500ug, 100ug, 그리고 20ug 처리군의 경우 무처리군의 상해활성 대비 3배에서 10배의 높은 활성 증가 경향을 나타냈다. 한편 자연살해세포의 활성은 E/T비율에 따라 다소 변동을 갖게 되는데 본 실시예에서는 각 E/T비율에 무관하게 월등한 활성증가 양상을 보였다. (도 5)

실시예 6 조혈 촉진 실험 : 골수모세포 생성작용 (Granulocyte macrophage-colony forming unit, GM-CFU)

35mm 배양 용기 (with 2mm grid, Nalgen Nunc) 에 MB40100 다당체를 농도별로 처리한 다음 1 ml 의 MethoCult (Stem Cell, Canada) 배지를 사용하여 골수 세포를 1x10⁵ cell/ml 로 넣고 37도, 5% 이산화탄소 배양기에서 7일간 배양한다. 대조군으로는 MB40100 을 처리하지 않고 배지만 가하였으며, 7일간 배양 후 2 mm grid 된 60 mm petridish에 배양된 35 mm petridish를 얹어 현미경으로 MB40을 10 ug 처리한 군에서 colony 수는 168로 대조군과 차이는 없었으나, 50 ug, 100ug 첨가한 군은 colony 수가 각 각 36.6%와 32.5% 증가하는 것이 나타났다 (도 6)

실시예 7. MB40100에 의한 항암제 유발 조혈 장애 억제 작용

항암제(cyclophosphamide)를 처리하게 되면 체내 면역 억제제로 작용되어 각 종 면역기관의 세포수가 감소하는 부작용이 수반된다. 그러므로 항암제(cyclophosphamide)투여 후 나타나는 부작용을 격감시키기 위하여 MB40100을 병용투여 하여 면역세포 수를 확인하였다.

싸이클로포스파마이드 투여 (250mg/kg) 48시간 전 또는 24시간째에 MB40100 다당체를 농도별 (10mg/kg, 20mg/kg) 로 복강 내 투여하였으며 7일째 마우스를 희생시켜 골수세포와 비장세포를 얻은 후 트리판 블루 배제법 (tryphan blue exclusion) 으로 각각의 세포수를 측정하였다.

말초혈액구수는 마우스의 안구 기저부 정맥총에서 헤파린이 처리된 모세유리관을 이용하여 신속히 채혈하였으면 K3-EDTA 가 처리된 채혈관에 모아 자동혈구 측정기로 말구 혈액을 검사하였다.

A. 싸이클로포스파마이드 처리후 말초 혈액 내 백혈구(WBC) 수 변화

정상 마우스의 안구 기저부 정맥총에서 채취한 혈액을 자동혈구 측정기로 측정한 결과 WBC 수는 평균 7800 여개로 나타났으며 cyclophosphamide 투여 군은 정상 마우스보다 약 30% 줄어든 5300 여개로 나타났다. 반면, cylophosphamide 투여 2일 전에 MB40을 10 mg/kg, 20 mg/kg 처리 한 결과 6600, 6400 여개로 항암제 단독 투여군 보다 백혈수 수치가 15% 정도 증가함을 알 수 있었다.

또한 cyclophosphamide 투여 1일 후 투여한 군에서도 약 12.1% 백혈구 수가 증가 하였으나, MB40100의 농도에 의한 차이는 볼 수 없었다. 위 항암제 투여 전, 후 2회 투여 군에서도 백혈구 수치는 증가하였으며, 그 회복 효과는 약 15% 로 나타났다.(도 7)

B. 말초 혈액 내 혈소판 수치 변화

정상 마우스보다 항암제 단독 처리한 마우스의 혈소판 수는 약 56% 감소하였다. MB40100을 미리 처리한 경우 혈소판 수치가 6.6% 증가 됨으로써 회복효과가 있음을 보여주었다. 항암제 투여 전이나 후 처리에 상관없이 약 6~7% 증가됨을 알 수 있었다.(도 8)

C. 비장 세포 수 변화

cyclophosphamide 단독 처리군은 정상 마우스보다 비장 세포수가 72.8% 감소하였다. 반면, MB40100을 항암제 투여 전에 20mg/kg 투여 시, 비장 세포수가 항암제 단독 처리군보다 26.8% 증가되었고, 항암제 투여 후 10 mg/kg, 20 mg/kg 투여군에서도 각 각 33%, 43% 증가됨으로써 MB40100이 항암제에 의한 면역 억제 작용을 충분히 완충시켜 줄 수 있다고 보여진다.(도 9)

D. 골수세포 수 변화

cyclophosphamide를 처리 7일 후 치사한 마우스에서 골수 세포를 확인 한 결과, 정상 마우스의 골수세포는 41.1X10⁶cells/ml 이었고 cyclophosphamide를 처리한 마우스의 골수세포 수는 29.6X10⁶cells/ml 으로 항암제 처리에 의해 29.2%의 골수세포가 감소하였다. 반면 MB40100을 항암제 처리 2일 전에 10 mg/kg, 20 mg/kg 처리한 마우스에서는 항암제 처리 군보다 각 각 17.1%, 18.1% 증가하였다. 또한 항암제 처리 후 MB40100을 20 mg/Kg을 처리한 군에서는 골수세포 수가 정상 마우스보다 10.78% 증가되었다.(도 10)

실시예 8. MB40100에 의한 방사선 방어 작용

항 암 치료 시 병행되는 방사선 조사는 골수세포가 파괴시키고 정상적인 면역 세포들의 생산 및 분화과정에 영향을 주어 조혈 및 면역기능의 악화를 초래하게 된다. 방사선 치료 과정에서 MB40100의 병용 투여에 의해 항 암 치료 시 일어날 수 있는 면역력 악화를 완충시키는 작용을 하는지 확인하고자 하였다.

체중이 18~22 g 인 자성 Balb/c 마우스에 48시간 전 MB40100 다당체를 복강내 투여한 후 준 치사량인 4.5 그레이 (Gy) 의 코발트 (⁶⁰Co) 감마선을 전신에 조사하였다. 방사선 조사후 5일째와 9일째 마우스를 희생시켜 골수와 비장세포를 얻은 다음, 트리판 블루 배제법으로 각각의 세포수를 측정하였다. 대조군으로는 PBS를 투여하였다.

A. 비장세포(splenocyte) 수 변화.

정상 마우스를 준 치사량인 4.5 Gy의 방사선을 조사하고 5일 후 비장 세포 수를 세어 본 결과 15.8X10⁴cells/ml로 정상 마우스 비장 세포의 3%만을 유지하였으며, 9일 후에는 14.8%로 자가 회복의 경향을 나타냈다. 방사선을 조사하기 2일 전에 MB40100을 10 mg/kg 투여한 마우스의 경우 5일째에7.6%, 9일째에 18.2%의 비장 세포 수 증가가 이루어졌었다. 또한 동일시기에 MB40을 20 mg/Kg을 투여하여 5일 경과한 마우스의 경우는 4.6%로 10 mg/Kg보다 회복정도가 약했으며, 9일째의 경우도 5일 째와 마찬가지로 더 이상 비장세포 수가 증가되지 않았다. 방사선 조사 1일 후 처리한 경우도 마찬가지로 방사선 조사 군보다 비장 세포수의 증가가 나타났으며, 농도에 따른 경향은 없었다. 그러나 방사선 조사 전과 후에 MB40100을 처리했을 때 방사선 단독 처리 군에 비해 높은 비장 세포 수를 나타냄으로써 방사선에 의한 면역세포의 보호작용을 확인할 수 있었다.(도 11)

B. 골수세포(Bone marrow cell) 수 변화

치사량의 방사선을 조사 후 5일 째 마우스의 좌측 대퇴부에서 골수세포를 회수한 결과 정상 마우스의 5.3% 수준의 골수세포를 가지고 있었다. 방사선 조사 후 9일 째 마우스의 골수세포 수는 정상 마우스의 11.8% 만을 지니고 있었다. 그러나 MB40100을 방사선 조사 전, 후에 10 mg/Kg 이나 20 mg/Kg 처리하고 5일 후 치사한 마우스의 경우는 대부분 6 ~ 7%의 골수세포 수 증가가 관찰되었으며, 9일 후 치사한 마우스는 약 15.7% 정도의 골수세포 수 증가가 이루어짐을 확인할 수 있었다. 따라서 MB40100이 방사선 처리된 마우스의 골수세포를 보호하는 골수방어작용을 하여 조혈기능을 유지시킬 수 있다는 것을 의미한다.(도 12)

실시예 9. 면역세포 활성화 작용 및 항암성 사이토카인 생성

C57/BL6 마우스에 MB40100 다당체를 10mg/kg 농도로 복강투여한 후 시간에 따라 비장세포를 회수 한 후 각 면역세포의 형광표지된 수용체를 이용하여 FACS 분석하였다. 분석결과 자연살해T 세포(NKT cell), 자연살해세포(NK cell), 수지상세포(Dendritic cell), 대식세포(macrophage), CD4, CD8세포, B 세포 등 면역에 관련된 모든 세포가 활성화 됨을 알 수 있었고, MB40100 처리후 약 16 시간에서 최대로 활성화 됨을 알 수 있었다.(도 13)

각 면역세포에서 분비되는 사이토카인을 측정하기 위하여 MB40100 다당체를 10 mg/kg 으로 C57/BL6 마우스에 복강주사한 후 16시간 뒤에 비장세포를 회수한 후 각 형광표지된 면역세포의 수용기와 사이토카인 항체를 이용하여 각 면역세포에서 나온 사이토카인을 intracellular staining 방법을 통하여 측정하였다. 그 결과, MB40100을 투여한 군에서는 NKT cell과 T cell의 TNF-a 와 IL-3의 증가가 관찰되었으며, 대식세포와 수지상세포에서의 IL-12와 TNF-a의 증가됨을 확인할 수 있었다. (도 14)

실시예 10. 항암제 병용투여에 의한 효과 상승 작용

C57BL/6 마우스에 cancer cell line B16-BL16을 마우스 당 1X10⁵ cells로 피내(i.d)주사 한다. 시료는 마우스 당 1mg, 200 ug의 농도로 0.2 um filter로 여과한 후 암 주사 1일 후부터 3일 간격으로 4회 미 정맥주사 하였다. 항암제(Cisplatin)은 마우스 당 100ug, 50ug, 20 ug의 농도로 미 정맥주사 하였으며, 항암제 단독처리 군과 시료와 병용 처리군으로 나누어 tumor size와 체중을 비교하였다. 그 결과, 시료를 1mg 처리한 군에서는 약 43% 정도의 암증식 억제 활성이 유도되었다. Cisplatin을 50 ug 단독으로 투여한 군에서는 체중감소나 운동성 저하 등 심각한 부작용이 관찰되었다. 반면, Cisplatin과 시료의 병용처리 군에서는 낮은 암 억제율을 보였으나, 운동성이 활발하며, 정상 마우스정도의 체중을 회복하는 등 Cisplatin에 의한 부작용을 극복하는 현상이 관찰되었다. 이러한 이유 는 MB40100의 조혈계 자극 및 면역자극활성에 기인하는 것이라고 판단된다. (도 15,16)

실시예 11. 항암제(taxol)와 병용 투여시 항암 상승 작용

Athymic nude mouse(male)을 대상으로 항암제(Taxol), 시료 단독 투여 , 병용투여 군으로나누어 tumor의 size를 측정하였다. 항암제는 12.5 mg/Kg의 농도로 tumor 투여 6일 후 부터 3일 간격으로 마우스 상태와 독성을 고려하여 7회 투여하였고, 시료는 10 mg/Kg의 농도로 암 주사 2일 전 1회, 암 투여 후 3일 간격으로 항암제 처리날짜 겹치지 않게 복강투여 하였다. 사용된 cancer cell line은 PC-3이며, 마우스당 2x10⁶cells 의 농도로 피하 주사하였다.

그 결과, tumor 주사 후 14일부터 31일까지 tumor size를 관찰한 결과, 항암제와 시료를 병용 투여한 군에서 taxol 단독 투여군보다 더 낮은 tumor size가 관찰되었다. 이것으로 MB40100과 항암제의 병용 투여에 의한 고형암의 저지 효과를 확인할 수 있었다. (도 17)

실시예 12: 정제의 제조

옥수수전분 34g

결절성셀룰로오즈 10g

맥주효모 40g

마그네슘스테아래이트 1g

제조예1의 다당체분획 15g

계 100g

상기한 처방에 따라 각 성분을 균일하게 혼합한 다음 타정기에서 압축 성형하여 1정당 500mg의 정제를 제조하였다.

실시예 13 : 분말제의 제조

맥주효모 45g

마그네슘스테아레이트 5g

제조예1의 다당체분획 50g

계 100g

상기 처방을 균일하게 혼합한 후 조립기를 이용하여 조립하여 충진캅셀에 500mg이 되도록 충진하였다.

본 발명에 따른 인삼잎 및/또는 줄기를 추출하여 추출물 또는 다당체 분획을 수득함으로써 제조되는 인삼잎 및/또는 줄기의 추출물 또는 다당체 분획물은 암세포의 전이를 효과적으로 경감시키는 효과를 가짐으로써 항암치료제, 암전이 예방 및 치료제 또는 항암치료를 나타내는 의약품 및 방사선치료의 보조제로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 인삼잎 및/또는 줄기 추출물 또는 이로부터 수득한 다당체 분획을 활성성분으로 함유하는 조성물은 NKT 세포, NK세포, 대식세포, T세포, B 세포등 전반적인 면역계를 활성화시키고 항암과 연관된 사이토카인등의 분비를 촉진시켜 암세포의 증식 및 전이를 현저하게 경감시키는 효과를 가지므로 항암제 및 항전이의 치료제로 사용할 수 있으며 또한 항암제 및 방사선치료로 생긴 백혈구 감소증 등의 부작용을 억제함으로써 항암제 및 방사선치료의 보조제로 유용하게 사용할 수 있다

Claims

인삼(panax)속 식물로서 파낙스 진생(panax ginseng) 및/또는 파낙스 퀸크폴리옴(panax quinquefolium)의 잎 및/또는 줄기 추출물을 활성성분으로 포함하는 항암 및/또는 항암보조제 조성물로서, 상기 추출물은 중성당, 산성당 및/또는 단백질이 포함된 단백다당을 포함하는 다당체로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 잎 및/또는 줄기 추출물은 열수 추출된 것임을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 다당체의 당 조성은 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 다당체의 당 구성은 람노스, 퓨코스, 아라비노스, 크실로스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 갈락투론산, 글루큐론산, KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid), 그리고 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 암세포 성장저해 및/또는 암전이 억제 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 상피성 또는 비상피성 유래의 고형암에 대한 치료 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 암 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 조혈촉진, 골수방어, 면역증강, 방사선 치료보조, 항바이러스, 항진균 활성 중 적어도 하나 이상의 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서, 상기 조성물은 조혈촉진 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물
제11항에 있어서, 상기 조성물은 백혈구나 혈소판 감소증 등 항암제의 부작용을 억제하는 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물
제11항에 있어서, 상기 조성물은 방사선으로부터 골수 및 비장을 보호하는 활성을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물
제11항에 있어서, 상기 조성물은 자연살해 T 세포, 자연살해세포, 대식세포, T세포, B 세포의 면역계의 활성을 증강시키는 것을 특징으로 하는 조성물
제11항에 있어서, 상기 조성물은 면역증강된 자연살해 T 세포, 자연살해세포, 대식세포, T세포, B 세포의 항암물질인 종양괴사인자, 감마인터페론 및 인터루킨1의 분비를 촉진시켜 항암활성, 항진균 및/또는 항바이러스성을 보이는 것을 특징으로 하는 조성물
제1항에 있어서, 제 2 의 항암제 및/또는 항암보조제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
제17항에 있어서, 제 2 의 항암제는 탁솔 또는 시스플라틴(Cisplatin) 중에서 선택된 하나 이상인 것임을 특징으로 하는 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
제21항에 있어서, 식용음료 또는 식품의 형태로서 제제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항, 제4항, 제6항 및 제7항 중의 어느 하나에 따른 조성물을 활성성분으로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조혈촉진제, 골수 방어제, 면역증강제, 항암보조제, 방사선치료보조제, 항바이러스제, 항진균제, 암 예방 및 치료용 제제.
제23항에 있어서, 제산제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 제제
제23항에 있어서, 상기 제제가 정제, 산제, 경질 또는 연질 캅셀제, 현탁제, 주사용 제제, 유화액, 비경구 투여용의 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제인 것을 특징으로 하는 조혈촉진제, 골수 방어제, 면역증강제, 항암보조제, 방사선치료보조제, 항바이러스제, 항진균제, 암 예방 및 치료용 제제.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 활성성분의 함량이 성인 체중 1 Kg 당 0.1~6000 mg/일 범위로 투여됨을 특징으로 하는 조혈촉진제, 골수 방어제, 면역증강제, 항암보조제, 방사선치료보조제, 항바이러스제, 항진균제, 암 예방 및 치료용 제제.
a) 인삼(panax)속 식물의 잎 및 줄기를 가열처리하여 조 추출물을 얻는 단계; b) 선택적으로, 상기 추출물을 농축하는 단계; c) 저급알콜 또는 아세톤을 사용하여 조 추출물에 포함된 다당체를 침전, 분리시키는 단계; 및 d) 유기용매를 제거하여 다당체분획을 얻는 단계를 포함하는 제1항에 따른 인삼 잎 및/또는 줄기 추출물의 제조방법.
제 27항에 있어서, 상기 c)단계 및/또는 d)단계 이전에 음이온 교환 크로마토그래피법에 의한 정제단계와 투석단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법
제27항에 있어서, 상기 가열 처리는 인삼속 식물의 잎 및/또는 줄기에 물을 넣어 50 내지 180도 온도범위에서, 0.5 내지 20시간 동안 가열추출하는 것임을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제27항에 있어서, 상기 저급알콜은 에탄올, 메탄올, 아이소포로필알콜, 또는 프로판올인 것임을 특징으로 하는 제조방법.
제27항 내지 제29항 및 제31항 중 어느 하나에 따른 제조방법에 의해서 제조된 인삼 잎 및/또는 줄기 추출물로서, 상기 추출물은 중성당 함량이 30 내지 80 %이고, 산성당 함량은 10내지 60 %, 그리고 단백질 함량은 0.01 내지 10 %로 구성됨을 특징으로 하는 추출물.
제32항에 있어서, 상기 추출물은 단백질을 포함하지 않는 것임을 특징으로 하는 추출물.
제32항에 있어서, 상기 추출물은 상기 인삼 잎 및/또는 줄기 다당체로 구성되고 상기 다당체의 분자량은 대략 340,000 Da 내지 6,000 Da 임을 특징으로 하는 추출물.
제32항 내지 제34항 중 어느 하나에 있어서, 상기 추출물의 당조성은 람노스, 퓨코스, 아라비노스, 크실로스, 만노스, 글루코스, 갈락토스, 갈락투론산, 글루큐론산, KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid) 그리고 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid)등으로 구성된 것임을 특징으로 하는 추출물.