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KR102127826B1 - 암 치료용 수액제 조성물 - Google Patents

암 치료용 수액제 조성물 Download PDF

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KR102127826B1
KR102127826B1 KR1020180110318A KR20180110318A KR102127826B1 KR 102127826 B1 KR102127826 B1 KR 102127826B1 KR 1020180110318 A KR1020180110318 A KR 1020180110318A KR 20180110318 A KR20180110318 A KR 20180110318A KR 102127826 B1 KR102127826 B1 KR 102127826B1
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Abstract

특정 당을 함유하는 암 치료용 수액제 조성물을 개시한다.

Description

암 치료용 수액제 조성물 {An infusion solution for treating cancer}
본 발명은 암 치료용 수액제 조성물에 관한 것이다.
생명과학 분야에서 다루는 주요 물질은 단백질, 아미노산, 핵산, 지방, 지방산, 탄수화물, 폴리사카라이드 및 당 등이다. 생명과학 및 의학 연구자들은 오랜 시간의 연구를 통해 단백질이 생체 내 주요 커뮤니케이션 분자인 것으로 보고 연구해 왔지만, 모든 메시지를 세포 내부로 전달하는데 있어서 단백질만으로는 부족하다는 결론에 이르렀고, 이에 따라 단백질 분자 및 탄수화물 분자가 결합된 당단백질에 대하여 연구하기 시작하였다.
글루코스(Glucose: Glu), 갈락토스(Galactose: Gal), 만노스(Mannose; Man), L-푸코스(L-Fucose; Fuc), 자일로스(Xylose: Xy), N-아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine: GlcNAc), N-아세틸갈락토사민(N-Acetylgalactosamine: GalNAc), N-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic acid: NANA; 또는 시알산(Sialic acid)) 등 8종의 당은 체내에서 생리활성유지에 매우 중요한 역할을 담당한다.
본 발명자들은 위와 같은 8종의 당을 함유하는 수액제 조성물이 항암 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
한국 공개특허공보 제10-2011-0131699호
본 발명은 특정의 당을 포함하는 암 치료용 수액제 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 특정 당을 함유하는 암 치료용 수액제 조성물을 개시한다.
구체적으로, 본 발명의 수액제 조성물은, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 자일로스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸뉴라민산의 당을 포함한다.
본 발명의 수액제 조성물은 1종 이상의 아미노산을 더 포함할 수 있다.
여기에서, 아미노산은 이소류신, 류신, 리신아세테이트, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민산, 히스티딘, 프롤린, 세린, 티로신, 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.
또는, 상기 아미노산으로서 인체의 단백질을 구성할 수 있는 20종의 아미노산 중 1종 이상이 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 수액제 조성물은 우수한 항암 효과를 나타낸다.
도 1a 및 도 1b는 각각 본 발명의 조성물에 대한 세포 증식 억제 실험 결과를 그래프로 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명의 조성물에 대한 세포 침윤성 억제 실험에서 전이된 세포를 촬영한 것이고, 도 2b는 침윤성 억제를 비교한 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 조성물에 대한 세포 이동성 억제 실험에서 웰 플레이트를 촬영한 사진이고, 도 3c 및 도 3d는 이동성 억제를 비교한 그래프이다.
본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 당 함유 수액제의 제조
시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리주, 미국)사로부터 입수한 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 자일로스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 및 N-아세틸뉴라민산의 8가지의 당을 주사용수(중외제약)에 녹였다. 안정화제로는 아미노산의 일종인 아스파르트산(L-Aspartic acid)을 사용하였다.
제조된 당 함유 수액제의 pH를 조정하기 위하여 1N 농도의 NaOH 용액(삼전순약공업, samchun pure chemical Co.)을 사용하였다. pH 측정기(METTLER TOLEDO Seven Compact pH/Ion)를 사용하여 pH가 7.0이 되도록 맞추었다.
표 1은 상기 당 함유 수액제의 조성을 나타낸 것이다.
성분 당 함유
수액제
당 (mg) L-(-)-Fucose 31
D-(+)-Galactose 31
D-(+)-Xylose 31
D-(+)-Glucose 31
D-(+)-Mannose 31
N-Acetylneuraminic acid 31
N-Acetyl-D-galactosamine 31
N-Acetyl-D-glucosamine 31
안정화제 (mg) Aspartic acid 20
용제 주사용수 q.s.
pH 조절제
(μL)
1N NaOH q.s.
Total 10 mL
* 총 10mL 기준의 조성표이다(실제로는 50mL를 제조하였다)
실시예 2: 당 및 아미노산 함유 수액제의 제조
시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리주, 미국)사로부터 입수한 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 자일로스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민, 및 N-아세틸뉴라민산의 8가지의 당을 주사용수(Water for injection, 중외제약)에 녹인 후, 이를 시판 중인 아미노산 수액제인 89.4% 푸로아민주(Proamin injection, 한올바이오파마㈜)에 혼합하였다. 푸로아민주에는 이소류신, 류신, 리신아세테이트, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민산, 히스티딘, 프롤린, 세린, 티로신, 글리신 등의 아미노산이 함유되어 있다. 안정화제로는 아미노구아니딘(Aminoguanidine, Sigma-Aldrich)을 사용하였다.
제조된 당 및 아미노산 함유 수액제의 pH를 조정하기 위하여 1N 농도의 NaOH 용액(삼전순약공업, samchun pure chemical Co.)을 사용하였다. pH 측정기(METTLER TOLEDO Seven Compact pH/Ion)를 사용하여 pH가 7.0이 되도록 맞추었다.
표 2는 상기 당 및 아미노산 함유 수액제의 조성을 나타낸 것이다.
성분 당 및 아미노산
함유 수액제
당 (mg) L-(-)-Fucose 31
D-(+)-Galactose 31
D-(+)-Xylose 31
D-(+)-Glucose 31
D-(+)-Mannose 31
N-Acetylneuraminic acid 31
N-Acetyl-D-galactosamine 31
N-Acetyl-D-glucosamine 31
아미노산 (mg) L-Isoleucine 28
L-Leucine 62.5
L-Lysine Acetate 62
L-Methionine 17.5
L-Phenylalanine 46.75
L-Threonine 32.5
L-Tryptophan 6.5
L-Valine 22.5
L-Alanine 31.25
L-Arginine 39.5
L-Aspartic Acid 19
L-Cysteine 5
L-Glutamic Acid 32.5
L-Histidine 30
L-Proline 16.5
L-Serine 11
L-Tyrosine 1.75
Aminoacetic Acid 53.5
안정화제 (mg) Aminoguanidine 40
용제 주사용수 q.s.
pH 조절제
(μL)
1N NaOH q.s.
Total 10 mL
* 총 10mL 기준의 조성표이다(실제로는 50mL를 제조하였다)
실시예 3: 세포 증식능 억제 시험
가. 실험 방법
자궁경부암 환자의 세포에서 유래한 헬라(HeLa) 세포를 37℃5% CO2에서 배양하고, 5000~10000개(in Opti-MEM media) 정도의 세포를 96 well plate에 놓은 후 음성대조군(Normal), 당 함유 수액제 원액, 당 함유 수액제 원액의 10배 희석액, 당 함유 수액제 원액의 100배 희석액, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액의 10배 희석액, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액의 100배 희석액으로 처리하여 6개의 시료들이 세포 증식능에 미치는 영향을 MTT 실험법으로 확인한다.
100μl의 헬라세포(5×105 cells/ml)를 96 well plate에 넣고 18시간 동안 미리 배양한 후, 당 함유 수액제 원액, 당 함유 수액제 원액의 10배 희석액, 당 함유 수액제 원액의 100배 희석액, 당 및 아미노산 함유 수액제의 원액, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액의 10배 희석액, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액의 100배 희석액을 각각 100μl씩 0, 24, 48, 72, 96시간 마다 배지에 적용시켰다. 시료로 처리할 때마다 분석 대상 세포 중 일부를 MTT 용액 10μl/well으로 처리하였다. MTT 용액으로 처리한 세포는 3~4시간 37℃5% CO2에서 배양하고, 15% 로릴 황산 나트륨(sodium dodecyl sulfate)을 첨가하여 반응을 멈추게 하고, 포르마잔(formazan)을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 용해시킨 뒤, 다음 날 분광 광도계(ELISA reader)로 570nm 파장의 흡광도를 측정하여 시료를 분석하였다.
이러한 세포 증식 분석 실험을 통해, 본 발명의 수액제 조성물이 세포 증식 및 세포 독성에 미치는 영향을 실험하였다.
나. 실험 결과
48시간 경과 시 및 72시간 경과 시의 세포 증식 억제 실험 결과를 도 1a 및 도 1b에 도시하였다.
시료 1번(당 및 아미노산 함유 수액제 원액) 및 시료 4번(당 함유 수액제 원액)으로 처리한 경우, 20% 내지 50% 정도의 헬라 세포의 분열 억제가 관찰되었다.
세포 분열 억제 효과는 고농도일수록 높았다. 따라서, 본 발명의 수액제의 세포 분열 억제 효과는 농도 의존적인 것으로 보인다.
이와 같이, 본 발명에 따른 수액제 조성물은 우수한 항암 효과를 나타내었다.
실시예 4: 세포 침윤성에 미치는 영향을 확인하는 실험
가. 실험 방법
본 발명의 수액제가 세포의 이동성 및 침윤성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, matrigel 기질에서 약 3일간 나눠서 세포가 기질을 뚫고 통과하는지 여부를 실험하였다.
실험 첫째날에 20℃로 보관되어 있던 matrigel을 4℃로 옮겨서 녹였다.
둘째날에 실험 조건에 따라 희석 배율을 설정하여 matrigel을 배지(no FBS, no Antibiotics)에 2배 정도 희석시키고, 희석된 matrigel 100μl를 transwell에 넣고 24 well plate에 넣은 뒤 UV에 1시간 이상 쬐어 멸균시키고, 이를 겔 형태로 굳혀서 matrigel로 transwell의 표면을 코팅하였다. 암세포 5000~10000개(in Opti-MEM media)를 transwell matrigel 위에 입히고, 바로 당 함유 수액제 또는 당 및 아미노산 함유 수액제를 일정량 주가하였다. transwell 아래에는 10% FBS 소혈청 배지를 1mL 넣었다.
실험 마지막날에는 matrigel을 피펫으로 흡입하여 빨아들인 후에 3.7% 포름알데하이드(formaldehyde)로 transwell을 옮겨 세포를 고정시켰다. 세포를 PBS로 3번 세척한 뒤, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 5분 동안 염색시키고, 증류수로 5번 세척하고, 에오신(eosin)으로 10분간 염색시키고, 증류수로 3번 세척 한 뒤, 70% 에탄올(ethanol)로 3번 세척하고, 마지막으로 100% 에탄올로 세척하였다.
Transwell에 붙어있는 세포의 바닥면을 칼날로 잘라낸 뒤 슬라이드 글라스에 기포가 발생하지 않도록 고정용액으로 밀착시켜 고정시킨 뒤, 광학 현미경으로 암세포의 전이를 관찰하였다.
나. 실험 결과
도 2a는 전이된 암세포를 광학 현미경으로 촬영한 것이고, 도 2b는 각 시료로 처리한 경우에 전이된 세포의 수를 계수하여 이를 음성 대조군과 대비한 그래프이다.
암세포의 전이과정에서 필수적인 침윤 과정에서, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액으로 처리한 경우에는 암세포의 전이가 20% 억제되었고, 당 함유 수액제 원액으로 처리한 경우에는 암세포의 전이가 50% 억제되었다.
이와 같이, 본 발명에 따른 수액제 조성물은 암제포의 전이 억제가 우수하다.
실시예 5: 세포의 이동성을 확인하는 실험
가. 실험 방법
암세포의 전이 및 생존 능력과 관련하여 세포의 이동성을 확인하기 위하여, 세포에 흠집을 내어 시료 처리를 했을 때 흠집을 낸 부분에서 세포가 얼마만큼 이동하는지를 비교하는 이동성 실험을 수행하였다.
세포를 12 well plate에 80% confluency로 6개의 시험 조성물들(즉, 당 함유 수액제 원액, 당 함유 수액제 원액의 10배 희석액, 당 함유 수액제 원액의 100배 희석액, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액의 10배 희석액, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액의 100배 희석액)로 처리하였다.
6개의 시료로 처리한 후 24시간 경과 시에, 200μl 황색 피펫 팁으로 12 well plate에 가운데 부분에 흠집(상처)을 낸 후, 세포군에 흠집이 나 있는 12 well plate를 광학 현미경이 장착된 카메라로 촬영하였다(0 hour). 다시 12시간 및 24시간 경과 후에 세포군 중의 흠집난 부분의 폭 변화를 광학 현미경에 장착된 눈금렌즈를 사용하여 측정하고, 이를 통해 세포군 중의 흠집 부위의 폭 변화량을 0 hour 때의 폭과 비교하여 세포들의 이동성을 평가하였다. 본 실험에서는 암세포를 이용하였기 때문에 세포의 이동량을 감소시키는 경우 암에서의 전이율을 낮출 수 있다.
나. 실험 결과
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 조성물에 대한 세포 이동성 억제 실험에서 웰 플레이트를 촬영한 사진이다. 여기에서, 노란색의 두 선은 웰 플레이트에서 세포가 존재하지 않는 부분과 세포가 존재하는 부분의 경계를 표시하는 가상의 선이다. 따라서, 플레이트에 흠집을 낸 0H 때에는 흠집에 의하여 세포가 제거된 부분이 노란색 선 사이로 표시되며, 시간이 경과함에 따라 노란색 선 바깥쪽에 존재하던 세포가 흠집난 부분으로 이동하게 되어, (세포가 존재하는 부분과 세포가 존재하지 않는 부분의 경계를 의미하는) 가상의 노란색 선의 폭은 점차로 줄어들게 된다.
도 3c 및 도 3d는 각 시료로 처리한 경우에 0 hour에 생긴 세포 흠집의 폭과 비교하였을 때, 12 시간(도 3c) 및 24시간(도 3d) 후에 변화된 폭의 변화(변화된 폭의 값이 세포의 이동 거리를 의미한다)를 백분율로 계산하여 나타낸 그래프이다. 따라서, 폭의 변화가 적은 경우에 세포의 이동성이 적다고 할 수 있다.
도 3c 및 도 3d를 참조하면, 당 및 아미노산 함유 수액제 원액 처리시 암세포의 이동이 50% 내지 70% 억제되고, 당 함유 수액제 원액 처리시에는 암세포의 이동이 20% 내지 30% 억제되었다. 또한, 본 발명의 수액제 원액의 희석액에서도 암세포 이동 억제 효과가 나타났다.
Migration 값(세포가 이동한 거리값)이 작을수록 암세포의 이동성이 작은 것이므로, 암의 전이를 감소시켜 항암 효과가 있는 것으로 볼 수 있다. 실험 결과, 본 발명의 수액제 조성물로 처리한 경우에 세포의 이동성이 적게 나타났으므로 항암 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 수액제 조성물은 항암 효과가 우수하다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 자일로스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸뉴라민산을 포함하며, 추가로 아미노산을 더 포함하는 암 치료용의 정맥 주사용 수액제 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아미노산은 이소류신, 류신, 리신아세테이트, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민산, 히스티딘, 프롤린, 세린, 티로신, 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 수액제 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 아미노산은 단백질을 구성할 수 있는 20종의 아미노산 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 수액제 조성물.
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