KR100456089B1

KR100456089B1 - 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 정제하는 방법 및이를 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR100456089B1
Application number: KR10-2004-0055088A
Authority: KR
Inventors: 박용진; 심인섭; 송규용
Original assignee: 박용진
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2004-07-15
Publication date: 2004-11-09
Anticipated expiration: 2024-07-15
Also published as: CA2574022A1; US7744936B2; US20080050426A1; CN1988911A; JP5086805B2; JP2008506684A; CA2574022C; WO2006006750A1; CN100546593C

Abstract

본 발명은 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 정제하는 정제방법 및 이 추출정제액을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 산삼 추출정제액은 암세포의 부착을 저해하고, 암세포의 전이를 억제하며, 면역 활성을 증가 시키는 효과가 있으므로, 이를 함유하는 조성물은 각종 암 질환의 예방 및 치료에 유용한 의약품으로 이용될 수 있다.

Description

항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 정제하는 방법 및 이를 함유하는 조성물{The method for preparing purified extract showing anti-cancer activity from wild ginseng and the composition comprising the same}

본 발명은 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 정제하는 정제 방법 및 이 추출정제액을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

암이란 일반적으로 인체조직을 이루고 있는 세포의 세포주기에 이상이 생겨 정상적으로 분화하지 않고, 성장을 조절할 수 없이 커진 것 중 악성종양인 것으로써, 암은 개시(initiation), 촉진(promotion)및 진행 (progression)의 세 단계를거쳐 발생하며, 충분한 양의 발암물질만으로 발생될 수 있으나 실제적으로는 환경이나 음식물 속에 포함된 소량의 발암개시물질(initiator)에 의해 세포 돌연변이(개시세포)가 일어나고 이렇게 세포들의 수가 기하급수적으로 늘면서 발암촉진물질(tumor promotor)의 자극에 의해 비정상적인 세포분열이 일어났을 때 비로소 암 조직이 형성되기 시작한다고 알려져 있다.

암을 치료하기 위한 항암제의 연구 방법에는 암세포에 대한 직접적인 세포독성 물질을 탐색하는 법, 생체의 면역능력을 조절하는 물질을 탐색하는 법, 암세포의 전이를 억제하는 물질을 탐색하는 법 및 최근에 주목되고 있는 혈관신생을 억제하는 물질을 탐색하는 법 등 다양한 방법들이 진행되고 있다. 또한 암의 예방을 위해서는 암 발생의 여러 기전을 효율적으로 차단함으로써 정상세포가 암세포로 전이되는 과정을 미연에 방지하거나 또는 발암기전의 진행을 지연시키거나 회복시킬 수 있는 물질을 사용할 수 있는데, 이러한 물질은 단기 또는 장기 독성이 없어야하며, 복용이 용이하고 가격이 저렴해야만 한다.

현재 사용되고 있는 항암제들은 효소제제나 백신 등의 생물학적 제제, 순수합성 의약품 및 천연물 유래의 의약품 등으로 크게 구분할 수 있는데, 이 중 유전자, 효소, 백신 등을 이용한 항암제는 실용단계에 있는 상태는 아니며 화학요법에 의해 개발된 많은 항암제는 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고(Gillman., et al.,Maxwell Macmillan.,18, pp1202, 1986), 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타났기 때문에 암 치료시 문제점으로 지적되고 있다(Chung., et al.,J. Wonkwang Medical Sci.,3, pp13-34, 1987). 또한 항암제는 암세포의 성장을 효과적으로 억제하기도 하지만, 때로는 정상 세포에 대해서 독성을 나타내기도 하고 암세포가 성장, 증식과 전이를 일으키는 과정에서 변이되면서 항암제에 대한 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점으로 대두되고 있다. 이러한 원인은 대부분의 항암제가 1,000 이하의 분자량을 가지고 있기 때문에, 항암제를 투여하였을 경우 암 조직 뿐 아니라 정상조직에도 침투하여 정상조직, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수기능저하, 위장장애, 탈모증 등의 여러 가지 부작용이 나타나게 된다. 뿐만 아니라 작은 분자량을 가지고 있기 때문에 체내에서 오줌으로 쉽게 배출되어 암 치료에 있어서 많은 양의 약물이 요구되는데서 기인된다. 그러므로 항암제가 지니는 정상세포에 대한 독성, 몸 밖으로의 배출, 그리고 암세포의 저항성이 암 치료에 있어서 가장 큰 문제로 대두되며, 이는 현대 의학이 반드시 풀어야만 하는 과제이다. 따라서 많은 학자들은 이 같은 독성의 작용기전을 밝히기 위하여 많은 연구를 수행하고 있으며(Yamazaki., et al.,Biosci. Biotech. Biochem., 56(1), pp149, 1992; Tompson., et al.,Exp. Cell Res.,41, pp411-427, 1966; Ellem., et al.,Devel. Biol.,118, pp311-330, 1968), 근래에는 세포 배양 기술이 급격히 발달함에 따라 각종 세포를 배양한 후, 여러 독성물질을 투여함으로써 이들의 세포독성에 대한 기전을 세포 수준에서 규명하려는 연구도 활발히 진행되고 있으며, 항암제의 부작용을 최소화하고 치료효과를 높이기 위하여 생약 및 천연물을 이용한 항암제의 개발이 지속적으로 시도되고 있다.

근래에 들어 서양의학의 암 치료법의 부작용을 극복하기 위해, 서양의학을 제외한 기타 모든 의학을 가지고 질병을 치료하는 대체의학이 발달하고 있으며, 그중 가장 대표적인 것이 면역기능 증진을 바탕으로 하는 한의학적 치료법이다.

한의학에서는 면역력을 높이면서 부작용이 덜한 한약재를 추출하여 치료제로 이용하려는 노력을 하고 있으며, 한의학적 치료법 중에서 효과를 더욱 높이기 위한 방법의 한 가지로써 약침요법이 시행되고 있다. 약침요법은 인체에 나타나는 각각의 질병에 대하여 가장 효과적으로 치료할 수 있는 약물을 선정하여 유효성분을 추출한 다음, 이것을 해당 질병을 가장 효과적으로 치료할 수 있는 경혈 또는 통처에 주입하는 방법이다. 이는 순수 한약재를 추출, 정제하여 침을 놓는 자리에 아주 적은 양의 약물을 주입함으로써 침의 작용과 한약의 작용을 동시에 나타내기 때문에 치료의 효과를 극대화 할 수 있다.

그러나 종래의 한약재 추출물은 충분히 정제되지 않아 한약재의 부작용 성분이 남아 있어, 약침이나 주사제용으로는 사용하지 못하거나, 사용 시 발열, 동통, 부종 등의 부작용이 발생하는 문제가 있었다.

또한, 종래의 항암제들은 사용 시 체중감소, 면역력 저하 등의 부작용이 있어 장기간 사용이 어려웠으며, 또한 약초 등의 천연재료를 유기 용매 등을 이용해 항암 물질을 추출해 내는 방법으로 추출물을 정제하거나, 제대로 정제되지 않아 경구투여 외에 주사제 또는 약침용 등으로는 사용할 수 없었던 문제가 있었다.

이에 본 발명자는 산삼 추출정제액으로부터 유효성분이 함유되어 있으면서 불순물이 내재되지 않은 정제액을 이용하여, 세포모델과 동물모델에서 항암 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 정제하는 정제방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

도 1 는 본 발명의 정제공정을 거치지 않은 산양산삼 추출정제액에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도이고,

도 2 은 본 발명의 정제공정을 거친 산양산삼 추출정제액에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 산삼 원료에 물 또는 저급알콜로 가하여 반복적인 증류추출법을 수행하고, 여기서 얻은 추출증류액을 냉동 처리 및 여과 공정을 수행함으로써 수득됨을 특징으로 하는 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 정제하는 방법을 제공한다.

상기 추출증류액은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물에 가용한 추출증류액을 포함한다.

구체적으로, 본 발명의 산삼 추출정제액의 정제방법은 산삼 원료를 추출증류하여 1차 추출물을 제조하는 제 1공정; 1차 추출물을 재증류시켜 2차 증류물을 제조하는 제 2공정; 2차 증류물을 냉동 처리하여 냉동분획만을 수득하는 공정을 반복하여 수행하는 제 3공정; 제 3공정으로부터 얻은 냉동분획을 해동 및 여과함으로써 여과액을 수득하는 제 4공정; 제 4공정의 여과액을 중탕 가열한 후 다시 냉동 처리하는 제 5공정; 및 제 5공정의 냉동물을 해동 시킨 후 멸균 처리함으로써 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 수득하는 제 6공정을 포함함을 특징으로 한다.

상기 추출정제액의 정제방법에 있어서, 산삼은 자연산, 재배산 또는 배양된산삼이 사용 가능하다.

상기 산삼 추출정제액을 정제하는 방법을 보다 구체적으로 설명하면,

물, 탄소수 1내지 4의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매, 바람직하게는 물 1 ℓ당 1.0 내지 3.0 ㎏ 비율의 산삼에 물을 가하여 1 내지 4 시간 동안, 바람직하게는 3시간 동안 실온에서 그대로 방치 후, 60 내지 120 ℃, 바람직하게는 80 내지 100 ℃, 보다 바람직하게는 100 ℃의 증류장치에서 6 내지 24시간 동안, 바람직하게는 8 내지 10시간 동안 가열하는 제 1공정을 수행하여 1차 추출물을 얻는 단계;

상기 제 1공정의 1차 추출물을 비등석이 담긴 플라스크에 넣고, 60 내지 120 ℃, 바람직하게는 80 내지 100 ℃, 보다 바람직하게는 100 ℃의 증류장치에서 7 내지 24 시간 동안, 바람직하게는 8 내지 12 시간 동안 1차 추출물의 총 부피 대비 70 내지 90 부피%가 될 때까지 서서히 온도를 올리면서 가열하여 증류시키는 제 2공정을 수행하여 2차 증류물을 얻는 단계;

상기 제 2공정의 2차 증류물을 -5 내지 -15 ℃, 바람직하게는 -8 내지 -12 ℃에서 서서히 비냉동 부분이 전체 부피의 5 %이하가 될 때까지 냉동시킨 다음, 비냉동 부분은 제거하고 남은 증류물을 실온에서 서서히 해동시킨 후, 다시 상기와 같은 냉동 처리과정을 1내지 6회, 바람직하게는 2 내지 5회 반복하는 제 3공정을 수행하여 독성분획이 제거된 냉동분획물을 얻는 단계;

상기 제 3공정의 냉동분획물을 실온에서 완전히 녹인 다음, 0.1 내지 0.6 ㎛ 크기의 여과지를 사용하여 여과하는 제 4공정을 수행하여 여과액을 얻는 단계;

상기 제 4공정의 여과액을 60 내지 120 ℃, 바람직하게는 80 내지 100 ℃에서 20 내지 40분, 바람직하게는 30분 동안 중탕 가열한 후, -30 내지 -10 ℃, 바람직하게는 -15 ℃에서 완전히 냉동시키는 제 5공정을 수행하는 단계;

상기 제 5공정의 냉동물을 실온에서 완전히 해동시킨 후 멸균 처리하여 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 수득하는 제 6공정으로 구성된다.

상기 추출정제액의 정제방법에 있어서, 1차 추출물을 제조하는 제 1공정에 산삼의 첨가 비율을 조절하여 1차 추출물의 농도는 조절이 가능하다.

또한, 상기 추출정제액의 정제방법에 있어서, 냉동 처리 시에 증류물의 특정성분의 빙점 차이에 따라 냉동 부분과 비냉동 부분으로 구분되는데, 산삼 추출정제액의 성분들 중에서 독성이 강한 성분들은 낮은 빙점으로 인해 밀도가 더 낮은 순수물질 부분부터 순차적으로 냉동 되므로 독성성분이 함유된 비냉동 부분을 제거할 수 있고, 이와 같은 방법을 반복함으로써, 산삼 자체가 갖는 부작용을 일으킬 수 있는 독성성분이 제거된 추출정제액을 제조 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 정제방법으로 정제된 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 정제방법에 의해 정제된 산삼 추출정제액은 정제되지 않은 산삼 추출물을 복용시 발생 가능한 부작용이 없이 암세포의 세포독성을 약화시키고, 암세포에 대한 부착저지 능력 및 전이억제 능력이 있으며, 암세포의 부피증가억제 능력과 면역증강 활성을 나타낸다.

또한, 상기 산삼 추출정제액은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 천연물로부터 분리해낸 성분으로써, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 산삼 추출정제액을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 정제방법에 의해 정제된 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 추출정제액을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 또는 약침제제의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출정제액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출정제액은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출정제액의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경혈, 경구, 직장 또는 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 약침에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경혈에 투여하는 약침의 제제로 사용 할 수 있다.

본 발명의 산삼 추출정제액은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 비교예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 비교예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 비교예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

비교예 1. 정제되지 않은 산양산삼 추출정제액의 제조

경상북도 경산에서 구입하여 세척하고 3 ㎜ 크기로 세절한 산양산삼 2.5 ㎏에 물 1 ℓ를 가한 후 100 ℃에서 8시간 동안 끓인 다음, 여과하여 실온까지 냉각한 후 4 ℃ 이하에서 냉장 보관하여, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

비교예 2. 정제되지 않은 배양산삼 추출정제액의 제조

경희대학교 한방자원학과 연구실에서 구입하여 세척하고 3 ㎜ 크기로 세절한 배양산삼 2 ㎏(건조된 배양산삼의 경우는 400 g)에 물 1 ℓ를 가한 후 끓인 다음, 여과하여 실온까지 냉각한 후 4 ℃ 이하에서 냉장 보관하여, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

실시예 1. 정제된 산양산삼 추출정제액(BN-1)의 제조

경상북도 경산에서 구입하여 세척하고 3 ㎜ 크기로 세절한 산양산삼 2.5 ㎏에 물 1 ℓ를 가하여 20 ℃ 의 실온에서 3 시간 동안 방치하였다. 산양산삼이 담긴 플라스크를 증류장치에 연결하여 100 ℃로 8 시간 동안 가열하여 증류시켜 1차 추출물을 얻었다. 플라스크에 비등석 5 g을 넣은 다음, 1차 추출물을 넣고, 이 플라스크를 증류장치에 연결하였다. 1차 추출물을 온도를 서서히 높이면서 100 ℃로 10 시간 동안 가열하여 증류시켜 2차 증류물을 얻었다. 2차 증류물을 -10 ℃로 서서히 비냉동 부분이 전체 부피의 5 % 이하가 될 때까지 냉동시킨 다음, 비냉동 부분은 제거하고, 실온에서 서서히 해동시킨 다음, 다시 상기의 과정을 2 회 더 반복하였다. 냉동된 냉동분획물을 실온에서 완전히 녹인 다음, 0.1 ~ 0.6 ㎛ 크기의 여과지를 이용하여 여과하고 여과된 여과액을 90 ℃로 30 분 동안 중탕한 다음, -15 ℃로 완전히 냉동시켰다. 냉동된 추출정제액을 실온에서 완전히 녹인 후 멸균 처리된 병에 100 ㎖씩 담아, 4 ℃ 이하에서 냉장 보관하여, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

실시예 2. 정제된 배양산삼 추출정제액(BN-2)의 제조

경희대학교 한방자원학과 연구실(서울, 대한민국)로부터 제공받아 세척하고 3 ㎜ 크기로 세절한 배양산삼 2 ㎏에 물 1 ℓ를 가하여 20 ℃ 의 실온에서 3 시간 동안 방치한 후, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 배양산삼 추출정제액을 제조하여, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

실시예 3. 비교예 1 및 실시예 1에 대한 성분분석

상기의 미정제된 산삼추출물인 비교예 1 및 본 발명의 정제된 산삼 추출정제액인 실시예 1에 대한 산삼 사포닌의 성분상 변화를 컬럼(Column) : 페노메넥스 누나(Phenomenex Nuna) C18 컬럼(5㎛, 150×2.0mm), 유속(Flow rate) : 0.3㎖/분, 검출기(Detector) : UV 검출기 203nm, 전개용매조건(Solvent) : CH₃CN:H₂O = 15:85로 전개를 시작하여 CH₃CN:H₂O = 80:20 (0%)에서 30%가 될 때까지 70분 이상 전개, 온도(Temperature) : 실온(room temperature)과 같은 분석조건으로 설정하여 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피, Shimazu사, 일본)를 이용하여 비교 분석한 결과, 비교예 1의 미정제된 산삼추출물 및 실시예 1의 정제된 산삼 추출정제액들은 그 성분상에서 뚜렷한 차이점을 나타냄을 확인 할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).

실험예 1. 암세포의 세포질 부착저지 능력 확인

암세포가 원발생 부위로부터 다른 장기로 이동을 하기 위해서는 이탈을 하여 부유하다가 혈관 내피나 세포질에 부착을 하여야만 한다. 이때 세포질에 존재하는 콜라겐, 라미닌, 젤라틴 등에 부착을 하게 되는데, MDA-MB-231 암세포로부터 상기 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료에 대한 이러한 부착저지 능력을 확인하기 위하여 젤라틴(Gelatin, 0.1%)이 코팅(coating)된 96 웰 플레이트에 MDA-MB-231 세포를 1ㅧ×10⁶/웰로 분주하여 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료를 0, 62.5, 125, 250,500 ㎕/㎖의 농도로 처리한 다음 37 ℃ 배양기에서 대조군 세포가 웰의 바닥면에 붙을 때까지 배양한 후, 96 웰 플레이트를 PBS로 조심스럽게 세척하고 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색액으로 웰에 붙어있는 세포를 염색한 후 620nm 의 흡광도에서 OD 값을 측정하였다.

상기 실험의 결과, 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료 모두에서 MDA-MB-231 암세포의 젤라틴 부착 대하여 농도의존적으로 부착을 억제하였음을 확인하였다(표 1 참조).

시료	농도(㎕/㎖)	부착 억제율(%)
비교예 1	62.5	13.32±2.31
	125	17.21±4.38
	250	20.94±2.06
	500	34.84±1.04
실시예 1	62.5	18.18±0.74
	125	22.81±2.17
	250	29.32±3.33
	500	44.37±5.43
비교예 2	62.5	15.04±3.22
	125	18.90±3.31
	250	20.46±4.46
	500	25.91±6.30
실시예 2	62.5	17.54±1.92
	125	24.56±3.31
	250	32.32±2.91
	500	42.26±3.30

실험예 2. MDA-MB-231 세포를 이용한 암세포에 대한 전이억제 효과 확인

MDA-MB-231 세포를 이용하여 암세포 전이억제 효과를 확인하기 위하여 폴리카보네이트 막(Polycarbonate membrane, 공극 크기 : 8㎛)을 마트리겔(matrigel,50㎍)로 1시간동안 충분히 코팅한 후 24시간동안 공기 중에 건조시켰다. 보이덴 챔버(Boyden chamber)의 하부 구획(lower compartment)에는 0.1% BSA가 첨가된 배지(conditioned media)를 30㎕씩 분주 하였고, 상부 구획(Upper compartment)에는 0.1% BSA를 함유하고, FBS가 없는 RPMI 1640 배지를 사용하여 MDA-MB-231 암세포(1×10⁶)와 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료를 50㎕씩 분주하여 37 ℃, 5% CO₂배양기에서 16시간동안 배양 시킨 후 막(membrane)을 메탄올(MeOH)로 고정한 뒤 큐익(Quic) 용액(Diffco사, U.S.A)으로 염색한 후 현미경으로 상부 구획에서 하부 구획으로 침범(invasion)한 세포의 수를 측정하였다.

상기 실험의 결과, 실시예 1 및 실시예 2의 시료는 MDA-MB-231 암세포가 마트리겔로 코팅 된 폴리카보네이트 막의 상부 구획에서 하부 구획으로 전이되는 것을 농도의존적으로 억제함을 확인하였다. 즉, MDA-MB-231 암세포에 시료를 처리하지 않았을 때 보다 실시예 1 및 실시예 2의 시료를 처리한 경우에서 암세포에 대한 전이 억제율이 높았으며, 그 처리 농도가 커질수록 암세포에 대한 전이 억제율이 높아졌음을 알 수 있었다. 또한, 정제 공정을 거치지 않은 비교예 1 및 비교예 2의 시료를 처리한 군보다 정제 공정을 통하여 추출된 실시예 1 및 실시예 2의 시료를 처리한 군에서 보다 높은 암세포 전이 억제율을 확인하였다(표 2 참조).

시료	농도(㎕/㎖)	부착 억제율(%)
비교예 1	62.5	36.43±3.08
	125	49.49±5.85
	250	50.06±1.69
	500	69.54±5.35
실시예 1	62.5	43.54±4.85
	125	59.94±3.12
	250	58.02±3.59
	500	77.75±6.54
비교예 2	62.5	14.11±2.85
	125	38.48±4.22
	250	46.67±5.27
	500	48.05±2.15
실시예 2	62.5	38.32±3.86
	125	47.22±3.05
	250	58.36±3.94
	500	67.69±4.21

실험예 3. 루이스 폐 악성종양(Lewis lung carcinoma) 세포를 이용한 암세포 부피증가억제 효과 확인

테루히로(Teruhiro et al.,Cancer Res.,56, pp2809-14, 1996)의 방법에 준하여 실험을 실시하였다.

실험 동물의 생체내(In vivo)에서 계대배양 중인 루이스 폐 악성종양 세포(Lewis lung carcinoma cell)를 1×10⁶/마리의 세포수가 되도록BDF-1(6주령, 숫컷)의 왼쪽 겨드랑이 부위에 이식하고, 하루 뒤부터 아드리아마이신을 0.5, 1 ㎎/마우스의 농도로, 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료를 각각 50, 100 ㎕/마우스의 농도로 복강주사 하였다. 이때 대조군의 종양부피(tumor volume)가 약 2cm³가 될 때 까지 약 2주간 시료를 투여하였다.

시료 투여 2주 후에 종양의 크기를 측정한 다음 하기의 수학식 1 및 수학식2 의하여 종양의 면적을 구하고 종양부피에 대한 억제율(inhibition of tumor volume)을 측정하였다.

종양부피(㎤) = { L` TIMES `W^{ 2 } } over { 2 }

L(㎝) : 종양 길이(Length of the tumor)

W²(㎠) : 종양 너비(Width of the tumor)

종양부피 억제율(%) = { A`-`B } over { A } TIMES 100

A : 대조군의 종양부피(㎤)

B : 시료투여군의 종양부피(㎤)

상기 실험의 결과, 아드리아마이신을 처리한 대조군과 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료 처리군에 대한 암세포의 부피증가 억제율을 측정한 결과, 정제 공정을 거치지 않은 비교예 1 및 비교예 2의 시료를 처리한 군보다 정제 공정을 통하여 추출된 실시예 1 및 실시예 2의 시료를 처리한 군에서 보다 높은 암세포 부피증가 억제율을 확인하였다(표 3 참조).

시료	농도(㎕/마우스)	암 성장 억제율(%)
비교예 1	50	30.05±9.47
비교예 1	100	48.95±2.87
실시예 1	50	75.94±10.70
실시예 1	100	90.12±11.25
비교예 2	50	29.04±10.94
비교예 2	100	40.38±13.32
실시예 2	50	73.05±11.37
실시예 2	100	88.94±10.83
아드리아마이신	0.5 mg	31.20±8.05

실험예 4. 체중변화량 측정

상기 실험예 3의 실험 기간 동안 마우스의 체중을 측정한 결과, 대부분의 항암제가 암세포뿐만 아니라 정상세포를 공격하는 독성(부작용) 때문에 실험대상의 체중이 현저하게 줄어드는 것과 달리, 본 발명의 정제공정을 거친 실시예 1 및 실시예 2를 처리한 군에서는 체중감소가 일어나지 않고 증가되는 것을 확인하였다.

실험예 5. B16-F10 흑색종(melanoma) 세포를 이용한 암세포 전이억제 효과 확인

B16-F10 흑색종(melanoma) 세포를 이용한 암세포 전이억제 효과를 확인하기 위하여, B16-F10 흑색종 세포(2.5×10⁵)를 C57BL/6 마우스의 미정맥에 주사한 후, 다음날부터 상기 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료를 매일 1회 100㎕/마우스의 농도로 복강주사 하였고, 암세포 접종 14일 후에 마우스를 희생시킨 후, 폐를 적출하여 폐에 전이된 종양세포의 군집(colony)수를 육안으로 조사하였다.

상기 실험의 결과, 대조군의 군집수가 80.4±17.81로 나타났으며, 이에 비해서 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료를 투여한 군에서는 각각 47.02±13.83, 33.96±10.48, 65.51±11.32, 및 52.23±18.46로 각각 42%, 58%, 18% 및 26%의 폐암전이 억제효과를 나타내어, 정제 공정을 거치지 않은 비교예 1 및 비교예 2의 시료를 처리한 군보다 정제 공정을 통하여 추출된 실시예 1 및 실시예 2의 시료를 처리한 군에서 보다 높은 암세포 전이억제 효과를 확인하였다(표 4 참조).

시료	전이된 종양세포 군집수(Colony number)	전이 억제율(Inhibitory rate)(%)
비교예 1	47.02±13.83	42
실시예 1	33.96±10.48	58
비교예 2	65.51±11.32	18
실시예 2	52.23±18.46	35
대조군	80.4±17.81	0

실험예 6. BALB.c 마우스의 비장 백혈구를 이용한 면역증강 활성 효과 확인

BALB.c 마우스의 비장 백혈구로부터 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2에 대한 면역활성을 확인하기 위하여, 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖), 페니실린(100 U/㎖) 및 우태아 혈청(FBS) 10 % 가한 RPMI 배지에 BALB.c 마우스의 비장 백혈구를 배지 1 ㎖당 1×10⁶세포가 되도록 부유시키고, 상기 비교예 1, 2 및 실시예 1, 2의 시료를 각각 200 ㎕/㎖씩 처리하고, 37 ℃, 5 % CO₂, CO₂배양조건의 배양기내에서 3 일간 배양한 후 임파구 생성 여부를 유세포분석법으로 분석하였고, 대조군에는 아드리아마이신을 200 ㎍/㎖씩 처리하여 비교하였다. 그 결과, 아드리아마이신을 처리한 대조군은 면역력이 감소함을 알 수 있었고(21.6 % 감소), 비교예 1, 2 및 실시예 1,2의 시료를 처리한 군의 임파구의 증가율은 각각 30.6, 57.2, 32.1 및 54.3 %로 나타나, 정제 공정을 거치지 않은 비교예 1 및 비교예 2의 시료를 처리한 군보다 정제 공정을 통하여 추출된 실시예 1 및 실시예 2의 시료를 처리한 군에서 보다 높은 임파구 증가율을 확인하였다(표 5 참조).

시료	시료 처리 농도	임파구 증가량(%)
아드리아마이신	200㎍/㎖	-21.6
비교예 1	200㎕/㎖	30.6
실시예 1	200㎕/㎖	57.2
비교예 2	200㎕/㎖	32.1
실시예 2	200㎕/㎖	54.3

실험예 7. 급성독성 실험

7-1. 경구투여

ICR계 마우스(몸무게 25±5 g)와 스프라그-도올리계(sprague-dawly) 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 실시예 1의 조성물을 각각 100, 250, 500 및 1000 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

7-2. 복강투여

ICR계 마우스(몸무게 25±5 g)와 스프라그-도올리계(sprague-dawly) 랫트를각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 실시예 2의 조성물을 각각 25, 50, 100 및 200㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

실험 결과, 본 발명의 조성물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

본 발명의 산삼 추출정제액은 아래와 같은 제형으로 제조될 수 있으며, 아래의 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1의 추출정제액 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 추출정제액 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1의 추출정제액 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 2의 추출정제액 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 2의 추출정제액 1000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 유효성분으로 함유하는 조성물은 암세포의 부착을 저해하고, 암세포의 전이를 억제하며, 면역 활성을 증가 시키는 효과가 있으므로 각종 암 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품으로 이용될 수 있다.

Claims

산삼 원료를 추출증류하여 1차 추출물을 제조하는 제 1공정; 1차 추출물을 재증류시켜 2차 증류물을 제조하는 제 2공정; 2차 증류물을 냉동 처리하여 냉동분획만을 수득하는 공정을 반복하여 수행하는 제 3공정; 제 3공정으로부터 얻은 냉동분획을 해동 및 여과함으로써 여과액을 수득하는 제 4공정; 제 4공정의 여과액을 중탕 가열한 후 다시 냉동 처리하는 제 5공정; 및 제 5공정의 냉동물을 해동 시킨 후 멸균 처리하는 제 6공정을 수행함으로써 수득됨을 특징으로 하는 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 1공정의 증류물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매로 증류추출 된 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 2항에 있어서, 상기 증류물은 물로 증류추출 된 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 1공정은 물 1 ℓ당 1.0 내지 3.0 ㎏ 비율의 산삼에 물을 가하여 1 내지 4 시간 동안 실온에서 방치 후, 60 내지 120 ℃의 증류장치에서 6 내지 24시간 동안 가열함을 특징으로 하는 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 2공정은 상기 제 1공정의 1차 추출물을 비등석이 담긴 플라스크에 넣고, 60 내지 120 ℃의 증류장치에서 7 내지 24 시간 동안 1차 추출물의 총 부피 대비 70 내지 90 부피%가 될 때까지 가열하여 증류시킴을 특징으로 하는 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 3공정은 상기 제 2공정의 2차 증류물을 -5 내지 -15 ℃에서 비냉동 부분이 전체 부피의 5 %가 될 때까지 냉동시킨 다음, 비냉동 부분은 제거하고 남은 증류물을 실온에서 해동시킨 후, 다시 상기와 같은 냉동 처리과정을 1 내지 6회 반복함을 특징으로 하는 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 4공정은 상기 제 3공정의 냉동분획물을 실온에서 녹인 다음, 0.1 내지 0.6 ㎛ 크기의 여과지를 사용하여 여과함을 특징으로 하는 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 제 5공정은 상기 제 4공정의 여과액을 60 내지 120 ℃에서 20 내지 40분 동안 중탕 가열한 후, -30 내지 -10 ℃에서 냉동시킴을 특징으로 하는 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 1항에 있어서, 상기 산삼은 자연산, 재배산 또는 배양된 산삼임을 특징으로 하는 산삼 추출정제액의 정제방법.
제 1항의 정제방법에 의해 정제된 항암 활성을 갖는 산삼 추출정제액을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 10항에 있어서, 상기 약학조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태를 포함하는 경구형 제형인 약학조성물.
제 10항에 있어서, 상기 약학조성물은 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 또는 약침제제 형태인 약학조성물.