DE68928646T2

DE68928646T2 - Natriuretisches hormon

Info

Publication number: DE68928646T2
Application number: DE68928646T
Authority: DE
Inventors: Neal Bricker; William Wechter
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-07-11
Filing date: 1989-07-10
Publication date: 1998-08-13
Anticipated expiration: 2009-07-11
Also published as: JPH04500957A; EP0429480B1; DE68928646D1; WO1990000394A1; JP2954248B2; CA1332734C; ATE165240T1; EP0429480A4; EP0429480A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Substanz mit natriuretischer Aktivität, die dazu verwendet werden kann, die Ausscheidung von Natrium im Menschen oder in anderen Tieren zu steigern.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bereits seit vielen Jahren wird die Natur des Systems untersucht, das die Ausscheidung von Natrium im Menschen und in anderen terrestrischen Säugetieren kontrolliert. Bis in die frühen 1960er ging man davon aus, daß die Ausscheidung von Natrium in Säugetieren durch Änderungen in einem von zwei Faktoren kontrolliert wird: 1) glomerulare Filtrationsrate ("GFR"); und 2) Aktivität der Mineralokortikoid-Hormone. 1961 konnte jedoch von Dewardener et al., Clinical Science, 21:249-258 (1961), gezeigt werden, daß ein weiterer Faktor oder weitere Faktoren die Natrium-Ausscheidung regulieren. Es wurde beobachtet, daß eine vermehrte Natrium-Ausscheidung (nachfolgend als "Natriurese" bezeichnet) als Folge der Zunahme des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens in Hunden erfolgte, obwohl die GFR und die Aktivität der Mineralokortikoid-Horinone konstant blieb.
Seit den Beobachtungen von Dewardener et al. wurde von Wissenschaftlern auf diesem Gebiet beträchtlicher Aufwand darauf verwendet, die weiteren Faktoren, die die Regulierung der Ausscheidung von Natrium beeinflussen, zu isolieren und identifizieren. In der Annahme, daß ein Hauptmodulator für die Ausscheidung von Natrium existiert, suchte eine Vielzahl von Forschern nach einer Substanz, die als Natriuretisches Hormon bezeichnet wurde. So zum Beispiel N.S. Bricker, "The Control of Sodium Excretion With Normal and Reduced Nephron Populations: Pre-Eminence of Third Factor, Am. J. Med., 43:313 (1967); siehe auch Haber und Haupert, Hypertension, 4:315 (1987).
Vor der vorliegenden Erfindung waren im Labor keine natriuretischen Faktoren in reiner Form isoliert, chemisch definiert oder synthetisiert worden, die auf die Na/K-ATPase-Pumpe wirken. Tatsächlich gibt es Hinweise darauf, daß mehr als eine biochemische Substanz für die beobachteten Wirkungen verantwortlich sein kann. Die von den meisten Wissenschaftlern untersuchten Inhibitoren, der den Natriumtransport aktiv inhibierenden Fraktionen, stellen kleine Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 500 Dalton dar (wenn mittels Ultrafiltration ermittelt). Einige Gruppen haben berichtet, daß die Substanz ein Peptid sein könnte, neuere Studien konnten die Peptid-Natur des Faktors jedoch nicht stützen.
In den vergangenen Dekaden wurde beträchtlicher Forschungsaufwand auf die nachteiligen Auswirkungen einer natriumreichen Diät (zum Beispiel bei Hypertonie) und auf die renale Retention von Natrium in einer Vielzahl von Erkrankungen, darunter Herzerkrankungen, Leberversagen und prämenstruale Syndrome gerichtet. Diuretische Agenzien werden heute in großem Umfang verwendet, um diese pathologischen Zustände zu verhindern oder umzukehren. Die wirksamsten und am meisten verwendeten Diuretika steigern jedoch nicht nur die Ausscheidung von Natrium, sondern können auch einen unerwünschten Verlust von Kalium bewirken. Die Kaliumsupplemente, die als Ersatz verschrieben werden, sind leider grundsätzlich ungenießbar, teuer und für die Patienten kontinuierlich nur schwer zu ertragen.
Daher besteht ein Bedarf an einer hochwirksamen natriuretischen Substanz, die spezifisch die Natrium-Ausscheidung steigert, jedoch keinen Verlust von Kalium bewirkt. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stellt ferner damit zusammenhängende Vorteile zur Verfügung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine im wesentlichen gereinigte natriuretische Substanz zur Verfügung, die als "Natriuretisches Hormon" bezeichnet wird, und welche die Ausscheidung von Natrium steigert, ohne die Ausscheidung von Kalium nachteilig zu beeinflussen. Das Natriuretische Hormon weist einen steroiden Kern, ein Molekulargewicht von 360,4 und eine Summenformel von C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub8;O&sub5; auf.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ansprüche gekennzeichnet.
Nach Anspruch 1 umfaßt das Natriuretische Hormon eine Substanz, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie in der Lage ist, die Ausscheidung von Natrium im Urin von Säugetieren zu steigern ohne einen entsprechenden Anstieg der Ausscheidung von Kalium zu bewirken, wobei diese Substanz:
(i) ein Molekulargewicht von etwa 360 aufweist;
(ii) eine Summenformel von C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub8;O&sub5; aufweist;
(iii) einen steroiden Kern aufweist;
(iv) ein weißes Pulver ist;
(v) einen ultravioletten Haupt-Absorptionspeak bei etwa 220 nm und einen breiten sekundären Peak bei etwa 290 nm aufweist;
(vi) hochresistent gegen extreme Temperaturen ist und biologische Aktivität nach mehr als 1 Jahr bei -80 ºC oder kräftigem Kochen behält;
(vii) wasserlöslich ist;
(viii) polar ist;
(ix) eine deutlich geringere biologische Aktivität aufweist, wenn sie einer 5N HCl ausgesetzt wird;
(x) den transepithelialen Natriumtransport
(1) in einer isolierten Harnblase einer Kröte;
(2) in isolierter Haut eines Frosches;
(3) in einem isolierten, durchströmten, kortikalen Sammeltubulus eines Nephrons von einem Kaninchen;
inhibiert;
(xi) einen Anstieg in der Ausscheidung von Natrium in gesunden Sprague-Dawley-Ratten erzeugt, wenn diese fasten, jedoch freien Zugang zu Wasser haben;
(xii) Natriurese in nicht-anästhesierten urämischen Ratten hervorruft; und
(xiii) den Natrium-Transport der MDBK-Zellen hemmt;
oder eine modifizierte Form davon, in der Ester von Säuren oder funktionellen Hydroxylgruppen vorliegen ohne die biologische Aktivität zu zerstören.
Nach Anspruch 2 kann das Natriuretische Hormon aus Material nach dem Salz-Peak, das mittels Gelfiltration von einer aufkonzentrierten Probe von einem Säugetier, welche diese Substanz in einem wäßrigen Lösungsmittel enthält, abgetrennt wurde, durch ein Verfahren gewonnen werden, bei dem man:
(a) eine biologisch aktive Fraktion des Materials mittels wiederholter Umkehrphasen-Hochdruck-Chromatographie über eine Harz-Säule unter Verwendung von Pyridinium Acetat/ Methanol als Elutionsmittel isoliert;
(b) die isolierte, biologisch aktive Fraktion mit einem trimethylsilylierenden Agens umsetzt;
(c) die trimethylsilylierte, biologisch aktive Fraktion durch einen Gaschromatographen schickt;
(d) das Gas-chromatographierte Produkt mit einer Retentionszeit von etwa 200-700 Sekunden gewinnt;
(e) das Gas-chromatographierte Produkt mittels Säure einer Hydrolyse unterwirft; und
(f) das hydrolysierte Produkt auftrennt, wobei die Substanz erhalten wird.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird das Natriuretische Hormon erhalten, indem man den Urin von urämischen Patienten lyophilisiert und in einem verringerten Volumen deionisiertem Wasser rekonstituiert, um konzentrierte Proben zu erhalten, das konzentrierte Material durch Gelfiltration auftrennt und das Material nach dem Salz-Peak einer Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung eines Pyridiniumacetat/Methanolpuffers unterzieht. Die Aktivität des biologisch aktiven Materials wird mit etwa 45 % Methanol eluiert. Das gereinigte Produkt aus der HPLC wird anschließend trimethylsilyliert und einer Gas-Chromatographie bei erhöhter Temperatur unterzogen. Das einzige Produkt dieser Chromatographie wird daraufhin in sauren Lösungen hydrolysiert, um nach Verdampfung das Natriuretische Hormon zu erhalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das Natriuretische Hormon dazu verwendet, die Ausscheidung von Natrium in Säugetieren zu steigern.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ABBILDUNG

Figur 1 zeigt eine Darstellung eines ultravioletten Absorptionsspektrums einer gereinigten, aktiven Probe, wie in Beispiel 1 beschrieben.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Im Verlauf der Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung geführt haben, wurde eine Substanz mit natriuretischen Eigenschaften in im wesentlichen reiner Form isoliert. Die Substanz wird als Natriuretisches Hormon bezeichnet. Dieses Natriuretische Hormon kann aus einer Vielzahl von Quellen gewonnen werden, darunter Blut und Urin von Säugetieren, vorzugsweise von Menschen oder Hunden und ausgewählten Gewebe-Homogenaten, wie vom Hypothalamus. Obwohl die Substanz im normalen menschlichen Urin vorliegt, ist die Menge, die aus einer 24stündigen Urinsammlung von urämischen Individuen gewonnen wird, wesentlich größer.
Das Natriuretische Hormon besitzt ein Molekulargewicht von 360,4, eine Summenformel von C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub8;O&sub5; und einen steroiden Kern.
Weitere Informationen, die physikalischen Eigenschaften des Natriuretischen Hormons betreffend, sind auch verfügbar. Es wurde als weißes Pulver isoliert und zeigt einen ultravioletten Haupt-Absorptionspeak bei etwa 220 nm und einen breiten sekundären Peak bei etwa 290 nm. Es konnte gezeigt werden, daß das Natriuretische Hormon hochresistent gegen extreme Temperaturen ist und eine biologische Aktivität, wie im folgenden dargestellt, nach mehr als einem Jahr bei -80 ºC oder kräftigem Kochen behält. Es ist wasserlöslich und es konnte ferner gezeigt werden, daß es auch in bestimmten organischen Lösungsmitteln mit hohen Dielektrizitätskonstanten löslich ist, was auf eine polare Natur hinweist. Es kann von einer Sephadex G-25-Säule unter Verwendung eines Ammoniniumacetat (NH&sub4;OAC)-Puffers, pH 6,8, eluiert werden und erscheint nach dem Salz-Peak.
Die biologische Aktivität des Natriuretischen Hormons ist deutlich verringert, wenn es einer 5N HCl ausgesetzt wurde. Es scheint, daß diese Reaktion auf einer Interaktion der Säure mit Hydroxyl-, Carbonyl- oder Carboxyl-Gruppen am steroiden Kern beruht, die bekanntermaßen Eliminations- (zum Beispiel Dehydration), Rearrangement- (zum Beispiel Aldol-Umkehr) und/oder Hydrolyse- (zum Beispiel Lacton-Spaltung) Reaktionen in geeigneten Umständen vollziehen.
Zusätzlich kann das Natriuretische Hormon unter Verwendung einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)-Säule (Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer C-18 Harzsäule) weiter gereinigt werden, wobei ein 0,2 M Pyridiniumacetatpuffer (pH 5,5)/Methanolgradient, gefolgt von einer wiederholten isokratischen Elution von derselben Säule bei einer Methanolkonzentration von etwa 40 bis 50 %, vorzugsweise 45 %, verwendet wird.
Der Begriff "Natriuretisches Hormon" wird hierin verwendet, um eine Substanz zu bezeichnen, die bei wenigstens einem Säugetier nach deren Zugabe die Rate der Natrium-Ausscheidung steigert, indem die Aktivität der Na-K-Atpase-Aktivität im Nephron inhi- biert wird. Das native menschliche Natriuretische Hormon hat ein Molekulargewicht von 360,4, eine Summenformel von C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub8;O&sub5; und einen steroiden Kern.
Der Begriff Natriuretisches Hormon betrifft sowohl das native Hormon als auch in vitro- oder in vivo-Abwandlungen, welche die natriuretische Aktivität erhalten. Es ist davon auszugehen, daß limitierte Substitutionen der funktionellen Säure-, Hydroxyl- oder Carbonyl-Gruppen durchgeführt werden können, ohne die biologische Aktivität zu zerstören. Ferner werden Fachleute aus dem Gebiet der Steroidchemie und der Arzneimittel sich darüber im klaren sein, daß viele dieser Derivate hergestellt werden können, die biologisch und chemisch äquivalent mit oder sogar aktiver als die genannte Substanz sind. Im vorliegenden Fall bestehen solche Derivate aus Estern der Säure-Funktionen oder Estern der Hydroxyl-Funktionen.
Wenn das Merkmal "im wesentlichen gereinigt" dazu verwendet wird, die Form des Natriuretischen Hormons zu beschreiben, bezeichnet es das Hormon im wesentlichen frei von Proteinen, Steroiden und anderen Materialien, die normalerweise mit dem Natriuretischen Hormon assoziiert sind oder in seiner nativen Umgebung vorliegen.
Der Begriff "nach Salz-Peak", wie hierin verwendet, bezeichnet von einer G-25 Sephadex-Säule eluiertes Material, das unmittelbar nach den Natrium-, Kalium-, Harnstoff- und Kreatinin-enthaltenen Fraktionen erscheint und eine Basisleitfähigkeit an der Basislinie sowie eine UV-Absorption bei 280 nm aufweist.
Die biologische Aktivität des Natriuretischen Hormons kann mittels einer Vielzahl von Nachweisverfahren bestimmt werden, die Natriumtransport in einer breiten Gruppe von Zelltypen einer Vielzahl von Tierarten beinhalten. Der transepitheliale Natriumtransport wird beispielsweise in der isolierten Harnblase einer Kröte, in isolierter Haut eines Frosches und in isolierten, durchströmten, kortikalen Sammeltubulus eines Nephrons von einem Kaninchen inhibiert. In allen drei Strukturen erfolgt die Inhibition des Natriumtransports nur nach Zugabe des Natriuretischen Hormons zur Blutseite der Struktur. In der isolierten Tubulus Präparation führt die Zugabe zur Oberfläche zu einer Abnahme im Natrium-Austritt (Lumen zum Bad), während eine solche Wirkung nicht erreicht wird, wenn es zur Lumen-Oberf läche gegeben wird. Es erfolgt eine gleichzeitige Abnahme in der transepithelialen elektrischen Spannungsdifferenz (P.D.), wobei das Lumen weniger positiv wird. In Dosis-Wirkungsstudien nähern sich sowohl der Natrium-Austritt als auch P.D. null. Der Begriff "biologisch aktiv", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Material, das eine mehr als 20%ige Hemmung der &sup8;&sup6;Rb-Aufnahme, gemessen nach dem Verfahren in Beispiel II, bewirkt.
Zusätzlich erzeugt das Natriuretische Hormon eine Steigerung in der Natrium-Ausscheidung in gesunden Sprague-Dawley-Ratten, wenn diese fasten, jedoch freien Zugang zu Wasser haben. Es erzeugt auch Natriurese in einer nicht-anästhesierten, urämischen Ratte.
Wenn das Hormon direkt in die renale Arterie einer gesunden Rattenniere infundiert wird, ist die Natriurese mäßig. Wenn eine entsprechende Dosis in die renale Arterie der Niere eines urämischen Tieres gegeben wird, ist die natriuretische Wirkung deutlich gesteigert.
Das Natriuretische Hormon hemmt den Natriumtransport der MDBK- Zellen, einer Zellinie, die ursprünglich aus dem Tubulus einer Rinderniere gewonnen wurde und die unter Verwendung von Zellkulturverfahren erhalten wird. Eine derartige Zellinie ist von der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, erhältlich, wobei sie durch die Zugriffsnummer ATCC CRL6O7I (einer zertifizierten Zellinie) identifiziert ist. Alternativ dazu könnten andere Zellinien in dem Nachweisverfahren verwendet werden, wie die MDCK-Zellen, die aus Tubuh einer Hundeniere entstammen (ATCC CCL34). Das nach der vorliegenden Erfindung bevorzugte Verfahren zum Nachweis der Bioaktivität verwendet, wie in Beispiel II unten beschrieben, einen Mikroassay, der auf der Fähigkeit des erfindungsgemäßen Natriuretischen Hormons beruht, die Aufnahme von &sup8;&sup6;Rb durch MKBK- Zellen, die in Zellkultur gezogen werden, zu verhindern. Ouabain (10&supmin;&sup5;M) wird dabei als Vergleichs-Hemmstoff verwendet. Das Natriuretische Hormon inhibiert ferner den Natrium-Austritt und Influx (in Kurzzeitmessungen) wie auch Rb durch die MDBK-Zellinie in Kultur.
Das Natriuretische Hormon der Erfindung kann in einer Vielzahl von klinischen und diagnostischen Zusammenhängen verwendet werden. Klinische Indikationen umfassen edematöse Zustände, wie Herzversagen durch Verstopfung, Leberzirrhose begleitet von Ödemen oder Aszites, nephrotisches Syndrom und hypertonische Zustände. Da die erfindungsgemäße Substanz gegen Inaktivierung unter sauren und alkalischen Bedingungen resistent ist, ist die orale Aufnahme möglich und bevorzugt. Die Administration über andere Wege, wie intravenös, intramuskulär, transdermal und ähnliche ist jedoch auch effektiv.
Die zu einem beliebigen Zeitpunkt gegebene Menge wird die Ausscheidung von Natrium ausreichend steigern, um ein vorteilhaftes klinisches Ergebnis zu erreichen. Spätere Dosierungen können in übereinstimmung mit den klinischen Wirkungen der Anfangsdosis bestimmt werden. Eine typische Anfangsdosierung würde zwischen etwa 1 und 1000 mg bei einem durchschnittlichen Mensch, vorzugsweise zwischen 10 und 250 mg, und besonders bevorzugt zwischen 25 und 100 mg betragen. Die gesamte Tagesdosis kann aus einer einzelnen individuellen Dosis oder mehreren Dosierungen, die in Intervallen gegeben werden, bestehen.
Arzneimittelzusammensetzungen können zusätzlich zu der aktiven Substanz verschiedene inerte Trägerstoffe und/oder andere inaktive Bestandteile, wie Befeuchtungsmittel, Geschmacksstoffe, Bindemittel und Verdünnungsmittel sowie weitere Bestandteile mit pharmakologischer Aktivität, wie andere Diuretika, welche die distale Abscheidung von Natrium steigern (d.h. Acetazolamid) enthalten
Die Arzneimittelzusammensetzungen können die Form von Tabletten, Kapseln, Injektionslösungen und Suspensionen, oral-verabreichbaren Lösungen und von weiteren Formulierungen aufweisen, die für eine pharmazeutische Verwendung vorgesehen sind. Eine Zusammensetzung, die in einer Tablette verwendet werden soll, könnte 25 mg des aktiven Materials, Calciumstearat, Calciumsulfat, mikrokristalline Cellulose, Pfefferminzöl, Polysorbat 80, Povidon und vorgelatinierte Stärke enthalten.
Zusätzlich zur Verwendung in Menschen kann die natriuretische Substanz der Erfindung auch für ähnliche veterinärmedizinische Zwecke bei domestizierten Tieren verwendet werden, insbesondere bei Haustieren mit Natrium-rückhaltenden Erkrankungen und hohem Blutdruck.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung beschreiben, jedoch nicht beschränken. Obwohl sie typische Ausführungsformen darstellen, die verwendet werden könnten, können andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, alternativ verwendet werden.

BEISPIEL 1

Isolierung des Natriuretischen Hormons

24 Stunden Urinproben wurden für Phasen von 1 bis 10 Tagen von nicht-dialysierten Patienten mit Serum-Kreatinin-Konzentrationen von mehr als 8 mg/dl und/oder einer Serum-Kreatinin-Eliminationsrate von weniger als 20-25 ml/Minute gesammelt. Das jeden Tag gesammelte Urinvolumen und alle Arzneimittel, die von dem Patienten genommen wurden, wurde notiert. Jede 24-Stunden-Urinsammlung wurde unter reduziertem Druck und Temperatur zu einem Bodensatz lyophilisiert und in 100 ml deionisiertem Wasser rekonstituiert. Das Produkt wurde anschließend bei 3000 UpM bei 4 ºC zentrifugiert und durch kanniliertes Filterpapier (Whatmann Nr. 1) filtriert.
In Kurzform, aliquote Teilmengen von 25 ml der konzentrierten Urinproben, entsprechend 6 Stunden-Proben des Ursprungsurins, wurden auf einzelne 2,5 x 95 cm Säulen gegeben, die mit Sephadex G-25 (fine grade, Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, NJ) beladen wurden. Die Elution wurde bei 4 ºC mittels Schwerkraft bei einer Flußrate von 55 bis 65 ml/h mit einer Lösung aus 10 mM Ammoniumacetat bei pH 6,8 durchgeführt. Die durchgeflossene Lösung wurde über Nacht in 18 x 150 nm Glasröhrchen (12 ml) unter Verwendung eines automatischen Fraktionssammlers (Modell 7000 Ultrorac, LKB Producer AB, Stockholm, Schweden) gesammelt. Auf der Grundlage der ultravioletten Absorption bei 280 nm (LKB Uvicord) und des elektrischen Leitfähigkeitsnachweises (Modell 5300B conductolyzer mit 5312B Leitfähigkeitszelle, LKB Producter AB) wurden die durchgeflossene Lösung sowie der Inhalt der Röhrchen zu mehreren verschiedenen Fraktionen vereinigt. Die Fraktionen, die Substanzen mit hohem Molekulargewicht (beispielsweise Proteine), Natrium, Kalium, Harnstoff und Kreatinin enthielten, wurden verworfen. Die natriuretische Aktivität war ausschließlich in den Fraktionen gegenwärtig, die unmittelbar nach dem Salz-Peak erschienen. Nur dieser Teil der durchfließenden Lösung wurde anschließend routinemäßig durch Sammlung des Inhalts von 10 nachfolgenden Röhrchen (gesamt 120 ml) gewonnen, wobei mit dem Röhrchen begonnen wurde, in dem die spezifische Leitfähigkeit des Eluats zu Basiswerten zurückgekehrt war, und das Material wurde bis zur Trockenheit über Nacht in einem Glasbehälter lyophilisiert.
Das getrocknete Eluat wurde anschließend in 2,5 ml 80 % 0,2 M Pyridiniumacetat (pH 5,5)/20 % Methanol gelöst, in ein Glas oder Polyethylenbehälter mit Schraubverschluß überführt und bei -80 ºC gelagert. Jeder ml dieser Lösung entsprach dem in etwa 2 Stunden exkretierten Volumen an Ursprungsurin. Es wurde festgestellt, daß die Lagerung der konzentrierten Urinproben oder der Schlußfraktionen für Zeitspannen bis zu mehreren Monaten keinen Einfluß auf die natriuretische Aktivität des Materials hat.
Die Standardfraktionen, die einem Nachweisverfahren unterworfen wurden, enthielten typischerweise weniger als 10 meq/l Natrium und 1 meq/l Kalium, egal ob sie von urämischen Patienten oder gesunden Personen gewonnen wurden. Unterschiede zwischen den Fraktionen von urämischen Patienten und gesunden Personen in Ammonium-, Harnstoff- und Proteinkonzentrationen konnten nicht festgestellt werden. Die Durchschnittswerte betrugen: Ammonium, 24,4 ± 3,7 meq/l; Harnstoff, 15,8 ± 2,6 mg/100 ml; und Protein, 2,0 ± 0,6 mg/ml.
Biologisch aktive Fraktionen, wie nach dem Verfahren in Beispiel II bestimmt, des Materials nach dem Salz-Peak des G-25- Eluats wurden auf eine Umkehrphasen-Chromatographie-Säule RP-C- 18 (Brownlee Labs, Licrosorb RP-18, 10 Mikron, Serial 8771) gegeben und mit 80 % 0,2 M Pyridiniumacetat (pH 5,5)/20 % Methanol für 10 Minuten bei etwa 1 ml/Minute, gefolgt von einem Gradienten von 50 % 0,2 M Pyridiniumacetat (pH 5,5)/20 % Methanol über einen Phase von 60 Minuten eluiert. Die Fraktionen wurden in Intervallen von einer Minute gesammelt. Alternativ dazu kann eine Beckman Ultrasphere ODS (C-18), (Beckman Instruments, Brea, CA) 5 Mikron, verwendet werden, obwohl die Zeit, zu der die gewünschte Substanz eluiert, variieren wird und mittels der hierin beschriebenen in vivo- und in vitro-Nachweisverfahren festgestellt werden muß. Die gewünschte Substanz, die nach etwa 45 Minuten, plus oder minus 5 Minuten, eluierte, wurde mittels Fluoreszenztransmission nachgewiesen (Aminco Fluoro Monitor, American Instruments Co., Silver Spring, MD, unter Verwendung von Glasfiltern: Anregung 310-410 nm und Emission 475-650 nm. Einzelne Röhrchen wurden unter Verwendung einer "Speed Vacuum" (Savant Instruments, Farmingday, NY) bis zur Trockenheit verdampft, in deionisiertem Wasser wiedergelöst und anschließend auf biologische Aktivität nach dem Verfahren gemäß Beispiel II hin untersucht. Biologisch aktive Fraktionen wurden kombiniert und erneut über dieselbe Säule chromatographiert, wobei eine isokratische Elution unter Verwendung von 56 % 0,2 M Pyridiniumacetat (pH 5,5)/44 % Methanol durchgeführt wurde. Nach Verdampfung der entsprechenden Fraktionen, die ausgesucht wurden, weil sie in der Lage waren, den Transport von radioaktivem Rubidium, wie in dem Nachweisverfahren in Beispiel II beschrieben, zu hemmen, wurde auf diesem Weg ein scheinbar homogener Feststoff isoliert. Mit dem von Bricker et al., J. Clin. Invest., 53:1559-1567 (1974), auf die hierin Bezug genommen wird, beschriebenen Verfahren wurde bestätigt, daß die in vivo-Aktivität dieses Materials, sowie des der vorhergehenden Schritte der Reinigung in der Ratte natriuretisch wirkt.
Das ultraviolette Adsorptionsspektrum dieses Materials zeigte ein Maximum bei etwa 220 und 290 nm. Das Material wies eine intrinsische Fluoreszenz in einem Beckinan Fluorometer, Beckman Instruments, Brea, CA, auf.
Das biologisch aktive Material wurde anschließend mit einem großen Überschuß an 1:1 Pyridin:BSTFA (Bistrimethylsilyltrifluoracetamid) bei 50 ºC für 30 Minuten umgesetzt. Die resultierende Mischung wurde danach in einen Gas-Chromatograph geladen, wobei eine 15 m fusionierte Kieselerde-Kapillar-Säule (J&W Scientific DB-5-30W) verwendet und als Nachweismittel ein hochauflösendes E-I-Massenspektrometer benutzt wurde. Die Retentionszeit des einzigen Produktes betrug 200 bis 700 Sekunden. Keine weiteren Produkte wurden nachgewiesen. Die Trimethylsilyl-Gruppen wurden durch Behandlung mit 1N Salzsäure für 1 Stunde hydrolysiert, wodurch, nach Lyophilisierung, ein im wesentlichen gereinigter weißer Feststoff, das Natriuretische Hormon, erhalten wurde.

BEISPIEL II

Mikroassay der biologischen Aktivität

Die natriuretische Aktivität des Natriuretischen Hormons kann durch seine Wirkung auf die Aufnahme von &sup8;&sup6;Rb durch MDBK (Malbin Darby Bovine Kidney Cell)-Kulturen bestimmt werden. In Kurzform wird die Aufnahme von &sup8;&sup6;Rb (welches sich biologisch wie Kalium verhält) von den Zellen durch Faktoren inhibiert, die die Aktivität des Enzyms, Na-K-Atpase, inhibieren. Ouabain ist ein bekannter Hemmstoff dieses Enzyms und die Zugabe von Ouabain zu einer Präparation von MDBK-Zellen, die Rb enthält, kann zu einer Hemmung von bis zu 90 % der &sup8;&sup6;Rb-Aufnahme durch die Zellen führen.
Etwa 200 000 MDBK-Zellen wurden in Schalen plattiert, die 12 2mm² Vertiefungen enthielten, und für 4 Tage bei 37 ºC in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco Nr. 430-2100) gezogen, wozu (pro Liter) 3,7 g Natriumbicarbonat, 5 mg Phenolrot, 10 % fötales Rinderserum, 10&sup6;-Einheiten Penicillin-G-Sulfat, 0,1 g Äquivalente der Base Streptomycinsulfat, 7,34 mg Polymyxin-B- Sulfat und 3,4 mg Fungizone gegeben worden war und in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2;, 95 % Luft belassen. Die Zellen wurden konfluent und erreichten eine Konzentration von etwa 10&sup6;-Zellen pro Vertiefung. Um das Nachweisverfahren durchzuführen, wurden die Zellen für 30 Minuten mit einem Volumen von 50-75 ul des Testmaterials, was wenigstens 2-5 Minuten an Ursprungsurin entspricht, in verstärktem DMEM (500 ul) bei 37 ºC vorinkubiert. Nach dieser Vorinkubation wurden etwa 5 x 10&sup5; cpm &sup8;&sup6;Rb und weitere 50-75 ul des Testmaterials zu jeder Vertiefung gegeben und die Zellen wurden bei 37 ºC für weitere 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde mit einmal kaltem PBS gestoppt und zweimal mit 0,5 ml kaltem PBS gewaschen. Die Waschlösungen wurden verworfen. 0,5 ml 5 %iger TCA wurden zu jeder Vertiefung gegeben und für 10 Minuten bei 37 ºC inkubiert, um die Radioaktivität innerhalb der Zellen freizusetzen. Die Überstände jeder Vertiefung wurden anschließend in ein Mikrofugen-Röhrchen (1 ml) überführt. Eine aliquote Teilmenge von 100 ul (im Doppelversuch) wurde in Scintillisationsröhrchen überführt, die Scintillisationsflüssigkeit enthielten (Ready Safe für wässrige Lösungen, Beckman Instruments, Brea, CA). Die &sup8;&sup6;Rb-Aktivität wurde in einem Scintillisationszähler (Beckman LS 3-801) gezählt. Die Zellen wurden anschließend mit PBS gewaschen und über Nacht bei 37 ºC in 500 ul 0,1 N NaOH verdaut. Am folgenden Tag wurden die hydrolysierten Zellen durch das Mikro-Coomassie-Verfahren (F. Chiapelli et al., Analytical Bioch., 94:160, 1974), auf die hierin Bezug genommen wird, auf Proteine hin analysiert. In jedem Satz Nachweisverfahren wurden PBS und 10&supmin;&sup5; M Ouabain als negative und positive Kontrollen, respektive, verwendet. Die Ergebnisse wurden als cpm/mg Zellprotein aufgenommen. Fraktionen, die die &sup8;&sup6;Rb-Aufnahme um mehr als 20 % hemmten, wurden als aktiv eingestuft. Die meisten aktiven Proben inhibierten die &sup8;&sup6;Rb- Aufnahme zu einem wesentlich größeren Prozentsatz. Typische Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt.
Obwohl die Erfindung im Hinblick auf die gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, sollte klar sein, daß eine Vielzahl von Änderungen durchgeführt werden können. Die Erfindung wird dementsprechend nur durch die nachfolgenden Ansprüche beschränkt. TABELLE 1 Jede Probe wurde doppelt gemessen und gemittelt.

Claims

1. Im wesentlichen gereinigtes Natriuretisches Hormon, das eine Substanz aufweist, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie in der Lage ist, die Ausscheidung von Natrium im Urin von Säugetieren zu steigern ohne einen entsprechenden Anstieg der Ausscheidung von Kalium zu bewirken, wobei diese Substanz:

(i) ein Molekulargewicht von etwa 360 aufweist;

(ii) eine Summenformel von C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub8;O&sub5; aufweist;

(iii) einen steroiden Kern aufweist;

(iv) ein weißes Pulver ist;

(v) einen ultravioletten Haupt-Absorptionspeak bei etwa 220 nm und einen breiten sekundären Peak bei etwa 290 nm aufweist;

(vi) hochresistent gegen extreme Temperaturen ist und biologische Aktivität nach mehr als 1 Jahr bei -80 ºC oder kräftigem Kochen behält;

(vii) wasserlöslich ist;

(viii) polar ist;

(ix) eine deutlich geringere biologische Aktivität aufweist, wenn sie einer 5N HCl ausgesetzt wird;

(x) den transepithelialen Natriumtransport

(1) in einer isolierten Harnblase einer Kröte;

(2) in isolierter Haut eines Frosches;

(3) in einem isolierten, durchströmten, kortikalen Sammeltubulus eines Nephrons von einem Kaninchen;

inhibiert;

(xi) einen Anstieg in der Ausscheidung von Natrium in gesunden Sprague-Dawley-Ratten erzeugt, wenn diese fasten jedoch freien Zugang zu Wasser haben;

(xii) Natriurese in nicht-anästhesierten urämischen Ratten hervorruft; und

(xiii) den Natrium-Transport der MDBK-Zellen hemmt;

oder eine modifizierte Form davon, in der Ester von Säuren oder funktionellen Hydroxylgruppen vorliegen ohne die biologische Aktivität zu zerstören.

2. Verfahren zur Gewinnung einer im wesentlichen gereinigten natriuretischen Hormon-Substanz nach Anspruch 1 aus Material nach dem Salz-Peak, das mittels Gelfiltration von einer aufkonzentrierten Probe von einem Säugetier, welche diese Substanz in einem wäßrigen Lösungsmittel enthält, abgetrennt wurde, dadurch gekennzeichnet, daß man:

(a) eine biologisch aktive Fraktion des Materials mittels wiederholter Umkehrphasen-Hochdruck-Chromatographie über eine Harz-Säule unter Verwendung von Pyridinium Acetat/ Methanol als Elutionsmittel isoliert;

(b) die isolierte, biologisch aktive Fraktion mit einem trimethylsilylierenden Agens umsetzt;

(c) die trimethylsilylierte, biologisch aktive Fraktion durch einen Gaschromatographen schickt;

(d) das Gas-chromatographierte Produkt mit einer Retentionszeit von etwa 200-700 Sekunden gewinnt;

(e) das Gas-chromatographierte Produkt mittels Säure einer Hydrolyse unterwirft; und

(f) das hydrolysierte Produkt auftrennt, wobei die Substanz erhalten wird.

3. Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen gereinigten, Natriuretischen Hormons nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Material nach dem Salz-Peak durch ein Verfahren hergestellt wird, bei dem man:

(a) eine Probe von einem Säugetier, die die Substanz in einem wäßrigen Lösungsmittel enthält, vorkonzentriert, indem man das wäßrige Lösungsmittel aus der Säugetierprobe, die die Substanz enthält, entfernt;

(b) die vorkonzentrierte Probe mit einem reduzierten Volumen an deionisiertem Wasser rekonstituiert; und

(c) die rekonstituierte Probe einer Gelfiltration über eine Sephadex G-25 Säule unter Verwendung einer Ammoniumacetat-Lösung als Elutionsmittel unterwirft und lediglich das Material gewinnt, welches unmittelbar nach dem Salz-Peak erscheint, um das Material nach dem Salz-Peak zu erhalten.

4. Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen gereinigten, Natriuretischen Hormons nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ferner die Vorkonzentration mittels Lyophilisation durchführt.

5. Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen gereinigten, Natriuretischen Hormons nach den Ansprüchen 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß ferner das Elutionsmittel eine 10 mM Ammoniumacetat-Lösung mit einem pH-Wert von 6,8 ist.

6. Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen gereinigten, Natriuretischen Hormons nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ferner die Säugetierprobe aus der Gruppe bestehend aus Blut, Urin und Hypothalamusgewebe ausgewählt ist.

7. Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen gereinigten, Natriuretischen Hormons nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ferner das Agens zur Trimethylsilylierung aus 1 : 1 Pyridin : Bistrimethylsilyltrifluoracetamid besteht.

8. Verfahren zur Gewinnung eines im wesentlichen gereinigten, Natriuretischen Hormons nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ferner die Säure-Hydrolyse mit einer 1N Salzsäure durchführt.

9. Im wesentlichen gereinigtes Natriuretisches Hormon nach Anspruch 1, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8.

10. Natriuretisches Hormon nach einem der Ansprüche 1 und 9 zur Verwendung als Arzneimittel.

11. Natriuretisches Hormon nach einem der Ansprüche 1 und 9 zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung ödematöser Zustände oder von Hochdruck.

12. Verwendung eines Natriuretischen Hormons nach einem der Ansprüche 1 und 9 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung ödematöser Zustände oder von Hochdruck in einem Säugetier.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Säugetieren mit ödematösen Zuständen oder Hochdruck, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung eine ausreichende Menge einer natriuretischen Hormon-Substanz nach einem der Ansprüche 1 und 9 aufweist, um die ödematösen Zustände oder den Hochdruck zu behandeln, und ein pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz in einer Menge von etwa 1- 1000 mg vorliegt.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach den Ansprüchen 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz in einer Menge von etwa 10-250 mg vorliegt.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz in einer Menge von etwa 25-100 mg vorliegt.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerstoff Befeuchtungsmittel, Geschmacksstoffe, Bindemittel und Verdünnungsmittel umfaßt.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung eine Form aufweist, die aus der Gruppe bestehend aus Tabletten, Kapseln, Injektionslösungen, Suspension und oral verabreichbaren Lösungen ausgewählt ist.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Tabletten etwa 25 mg der Substanz, Calciumstearat, Calciumsulfat, mikrokristalline Cellulose, Pfefferminzöl, Polysorbat 80, Povidon und vorgelatinierte Stärke umfassen enthalten.