DE60125955T2 - Bioaktive fraktion von eurycoma longifolia - Google Patents

Description

• Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der bioaktiven Naturprodukte und betrifft insbesondere eine von Fraktionen von Eurycoma longifolia abgeleitete Zusammensetzung.
• Hintergrund der Erfindung
• Bestandteile von Eurycoma longifolia, in Malaysia auch als Tongkat Ali bekannt, wurden in der traditionellen Volksmedizin eingesetzt. Extrakte dieser Pflanze sollen allgemein für die Behandlung von zahlreichen Krankheiten und Syndromen nützlich sein: Malaria, Krebs, Angstzustände, Geschwüre sowie männliche Unfruchtbarkeit und sexuelle Dysfunktion. In der Vergangenheit sind viele der Informationen über den medizinischen Wert der Pflanze anekdotisch gewesen. Gut kontrollierte, wiederholbare Extraktionen und Bioaktivitätstests können die Funktion der Bestandteile verdeutlichen. Beispielsweise werden Untersuchungen vorgenommen, um Extrakte von Eurycoma longifolia zu untersuchen, bei denen gezeigt wurde, dass sie cytotoxische Wirkungen haben. Diese Extrakte, die Quassinoide einschließen, umfassen Verbindungen wie Eurycomalakton, Eurycomanol und Eurycomanon, die auf ihre cytotoxischen Eigenschaften und potentielle Verwendung als Anti-Krebs-Mittel, Anti-Malaria-Mittel und Anti-Ulcus-Mittel untersucht wurden.
• Chromatographische Verfahren zur Herstellung von Quassinoid-Extrakten aus Eurycoma longifolia wurden in Chan et. al. (1998) offenbart. Diese Literaturstelle beschreibt die potentielle Verwendbarkeit von solchen Quassionoid-Extrakten für die Behandlung von Krebs, Geschwüren, Malaria und Fieber.
• Im Gegensatz zu Quassionoiden, deren Wirkungen nach stringenten Aufreinigungsstrategien untersucht worden sind, wurden keine Bestandteile aus Eurycoma longifolia mit einer möglichen aphrodisierenden Aktivität und mit Potential für Behandlungen von männlicher Unfruchtbarkeit und sexueller Dysfunktion isoliert. Rohe, mit Butanol, Methanol, Wasser und Chlorofrom extrahierte Fraktionen von Eurycoma longifolia wurden auf ihre verhaltenstypischen Wirkungen in Säugetieren untersucht. Gemische von Verbindungen, die anhand dieser Grundverfahren aufgetrennt wurden, wurden an männliche Mäuse und Ratten verabreicht, um die Wirkungen auf das Sexualverhalten und die Leistungsfähigkeit der Tiere zu bestimmen. (Experimental Animals (Tokyo), 49(1), 35, (2000): Hoon et al., und Int. J. of Pharmacognosy, 35(2), 144, (1997): Hoon et al. offenbaren die Verwendung von Extrakten von Eurycoma longifolia.
• Die Untersuchung der sexuellen Wirkungen von Eurycoma longifolia zielten auf den Einfluss der Rohextrakte auf Orientierungsaktivitäten von sexuell erfahrenen und naiven männlichen Ratten gegenüber empfänglichen Weibchen ab. Die in den behandelten Ratten beobachteten Aktivitäten schließen Aufbeugen, Lecken und anogenitales Beschnüffeln ein. Die Verhaltensweisen der behandelten Ratten im Vergleich zu ihrer Umwelt wurden ebenfalls untersucht, einschließlich der Analyse von Aktivitäten wie Bewegung, Erkundung, Aufzucht und Kletterfähigkeit. Zusätzlich wurden die Ratten auf die Häufigkeit genitaler und nicht genitaler Pflege untersucht. Die Analyse dieser Arten von Verhaltensmerkmalen diente als Test zur Untersuchung der anekdotischen aphrodisierenden Eigenschaften von Eurycoma longifolia, und die Verabreichung der Rohextrakte wurde mit einer erhöhten sexuellen Leistungsfähigkeit der behandelten Tiere in Korrelation gebracht. Obwohl der Einsatz von Verhaltensstudien auf die sexuelle Physiologie von rohen Eurycoma longifolia-Extrakten eine Wirkung zeigt, hat die Forschung keine Aufreinigungsstrategien eingesetzt, um isolierte Bestandteile zu gewinnen. Daher wurden im Stand der Technik nicht die physikalischen Eigenschaften der aphrodisierenden Kandidatenverbindungen von Eurycoma longifolia identifiziert, oder man war nicht in der Lage, die aus Eurycoma longifolia isolierten Verbindungen auf ihre Unfruchtbarkeit oder sexuelle Dysfunktion auf einen zellulären Level zu untersuchen.
• Zusammenfassung der Erfindung
• Es wurde nun festgestellt, dass bestimmte aufgereinigte Bestandteile von wässrigen Extrakten von Eurycoma longifolia eine Bioaktivität mit erhöhter Testosteron-Synthese und -freisetzung sowie Spermienaktivität und -freisetzung besitzt. Diese gereinigten Bestandteile umfassen Peptide mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.300 Dalton. Es werden Verfahren zur Behandlung männlicher Unfruchtbarkeit und sexueller Dysfunktion unter Verwendung der gereinigten Bestandteile bereitgestellt. Es werden auch Präparationen, die Extrakte von Wurzeln der Eurycoma longifolia-Pflanze einschließen, bereitgestellt. Die Präparationen können zur Applikation oder Verabreichung über mehrere Routen formuliert sein.
• Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine Fraktion eines wässrigen Extraktes von Eurycoma longifolia umfassen. Die Fraktion umfasst ein Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.300 Dalton. In bestimmten Ausführungsformen besitzt die Fraktion eine Aktivität, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erhöhter Testosteronsynthese, erhöhter Testosteronfreisetzung aus Zellen, erhöhter Spermienzahl und erhöhter Spermienbeweglichkeit. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist das Peptid ein Glycopeptid. In anderen bevorzugten Ausführungsformen hat das Peptid ungefähr 30 bis 39 Aminosäuren, vorzugsweise hat das Peptid ungefähr 36 Aminosäuren.
• Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Isolierung eines bioaktiven Bestandteils aus einem wässrigen Extrakt von Eurycoma longifolia bereitgestellt. Die Verfahren umfassen die Herstellung eines wässrigen Extraktes von Eurycoma longifolia und das Isolieren des bioaktiven Bestandteils aus der Fraktion. Der bioaktive Bestandteil wird durch ein chromatographisches Verfahren isoliert, vorzugsweise einem Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hochleistungsumkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Größenausschlusschromatographie. Der bioaktive Bestandteil umfasst ein Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.300 Dalton. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird eine Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines chromatographischen Mediums ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C4 und C18 durchgeführt. In anderen Ausführungsformen umfassen die Verfahren weiter das Fraktionieren des wässrigen Extraktes unter Verwendung von wenigstens einem Größenausschluss-Chromatographiemedium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bio-Gel P-2 und Bio-Gel P-4 vor der Auftrennung über Chromatographie durch Umkehrphasen-HPLC. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die Bioaktivität ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus zunehmender Testosteron-Synthese, zunehmender Testosteron-Freisetzung aus Zellen, zunehmender Spermienzahl und zunehmender Spermienbeweglichkeit.
• Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden bioaktive Bestandteile von Eurycoma longifolia bereitgestellt, die nach den zuvor genannten Verfahren hergestellt wurden.
• Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die einen wässrigen Extrakt von Eurycoma longifolia umfasst, der zur Behandlung einer sexuellen Dysfunktion oder männlichen Unfruchtbarkeit verwendet werden kann. Die Verwendung umfasst das Verabreichen einer Menge einer Zusammensetzung, die eine Fraktion eines wässrigen Extraktes von Eurycoma longifolia umfasst, an einen Patienten, der Bedarf an einer solchen Behandlung hat. Die Fraktion umfasst ein Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.300 Dalton. Die verabreichte Menge ist wirksam, um eine Aktivität zu erhöhen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus zunehmender Testosteronsynthese, zunehmender Testosteronfreisetzung aus Zellen, zunehmende Spermienzahl und zunehmende Spermienbeweglichkeit. Gemäß anderen Aspekten der Erfindung wird die Verwendung der Zusammensetzung, die einen wässrigen Extrakt von Eurycoma longifolia umfasst, zur Erhöhung der Testoseronsynthese, Erhöhung der Testosteronfreisetzung von Testiszellen, Erhöhung der Spermienzahl und/oder Erhöhung der Spermienbeweglichkeit bereitgestellt. Die Verwendung umfasst das Verabreichen einer Menge der zuvor genannten Eurycoma longifolia-Zusammensetzung, die wirksam ist, um die Testosteronsynthese, die Testosteronfreisetzung von Hodenzellen, die Spermienanzahl bzw. Spermienbeweglichkeit zu erhöhen, an einen Patienten, der Bedarf an einer solchen Behandlung hat.
• Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt. Die Zusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge der zuvor genannten Zusammensetzungen zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
• Diese und andere Aspekte der Erfindung werden im Folgenden in ihren Einzelheiten nachstehend beschrieben.
• Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• 1 zeigt ein schematische Flussdiagramm des Größenausschluss-Chromatographieverfahrens zur Isolierung der biokativen Fraktion von Eurycoma longifolia. Die bioaktiven Fraktionen FDAE und F3AE werden bei den gezeigten Schritten gewonnen.
• 2 zeigt ein schematische Flussdiagramm der Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigung für die bioaktiven Fraktionen von Eurycoma longifolia.
• 3 zeigt ein Chromatogramm der Eurycoma longifolia Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigungsdurchläufe für FDAE (obere Spur) und F3AE (untere Spur). Die Zahlen und Aufteilungen am Boden der Spuren bezeichnen die Elutionszeit in Minuten. Die Sterne (*) bezeichnen die bioaktive Fraktion oder den Peak.
• Detaillierte Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von bioaktiven Fraktionen von Extrakten von Eurycoma longifolia für die Behandlung männlicher Unfruchtbarkeit und sexueller Dysfunktion. Männliche Unfruchtbarkeit ist ein häufig vorkommendes Problem und schließt viele Aspekte ein einschließlich, aber nicht beschränkt auf: abnormale Libido, abnormale Spermienbeweglichkeit und abnormale Spermienanzahl. Diese Arten von Abnormalitäten können mit abnormal niedrigen Testosteron-Spiegeln in Beziehung gebracht werden. Beispielsweise besitzen "zwei Drittel der unfruchtbaren Männer eine Teilverminderung der Samenflüssigkeitsparameter und eine geringere Fruchtbarkeit", und "es war eine Vielzahl von empirischen Therapien (z.B. neugebundenes Testosteron, Gonadotrophine, Antiöstrogene) nicht erfolgreich" (Harrison's Principle of Internal Medicine, 1998). Neben der Unfruchtbarkeit können verminderte Testostersonspiegel mit einer fehlenden sexuellen Funktion und einer verminderten Libido korreliert werden, über die viele ältere und in einigen Fällen auch jüngere Männer klagen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Fruchtbarkeits- und antisexuelle Dysfunktions-Präparationen, die solche bioaktiven Fraktionen einschließen.
• Die vorliegende Erfindung umfasst die Identifikation des bioaktiven Bestandteils von Eurycoma longifolia (zur Erhöhung der Testosteron-Freisetzung oder -herstellung oder Spermienbeweglichkeit oder -anzahl) als Peptidmolekül, sehr wahrscheinlich ein Glycopeptid. Wie in den Beispielen unten gezeigt, wurde ein Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.300 Dalton durch eine Reihe von chromatographischen Verfahren aufgereinigt bis hin zu einem Hochleistungsumkehrphasenchromatographie(HPLC)-Aufreingungsschritt. Die Analyse der isolierten und aufgereinigten bioaktiven Fraktion deutete auf das Vorliegen eines bioaktiven Peptids mit ungefähr 4.300 Dalton hin, das mit mehreren Arten von Zuckerresten verbunden ist.
• Eurycoma longifolia-Extrakte können als Ausgangsmaterialien für die hier beschriebenen chromatographischen Verfahren durch eine wässrige Extraktion von Eurycoma longifolia erhalten werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden lediglich die Wurzeln der Pflanze verwendet. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Wurzeln pulverisiert. Es kann eine Vielzahl von hydrophilen Lösungsmitteln für die Extraktionsprozedur verwendet werden einschließlich z.B. Wasser, Methanol, Ethanol und andere Nieder-Alkyl-Alkohole. Die pulverisierten Wurzeln können in einem Lösungsmittel gekocht werden, und Zellreste können von dem Extrakt durch Zentrifugation entfernt werden. Es können mehrere Extraktionen durchgeführt werden, um den wässrigen Extrakt weiter zu verfeinern.
• Wie hier beschrieben, kann eine Vielzahl von chromatographischen Verfahren verwendet werden, um die den Wirkstoff von Eurycoma longifolia enthaltenden Fraktionen zu isolieren. Solche chromatographischen Verfahren umfassen Größenausschlusschromatographie, Gel-Filtrations-Chromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Umkehrphasen-HPLC und Ionenaustausch-Chromatographie. In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem chromatographischen Verfahren um eine Größenausschlusschromatographie. Wie der Fachmann leicht erkennt, kann in einigen Ausführungsformen eine Größenauschlusschromatographie mit Polyacrylamid-Kügelchen wie Biogel P-2 oder Biogel P-4 durchgeführt werden, während in anderen Ausführungsformen die Größenausschlusschromatographie mit anderen Größenausschlussprodukten desselben oder anderer Hersteller durchgeführt werden kann. Die Verfahren zum Auswählen von Größenausschlussmaterialien und -verfahren sind für denjenigen, der auf dem Gebiet der Chromatographie kundig ist, Routine.
• In anderen Ausführungsformen kann das Chromatographieverfahren eine Umkehrphasen-HPLC sein. Vorzugsweise umfasst die Säule in einer Ausführungsform ein auf Kieselsäure basierendes Adsorptionsmittel. In einigen Ausführungsformen ist die Umkehrphasen-HPLC-Säule eine C4-(Butyldimethylchlorsilan)-Säule. In anderen Ausführungsformen ist die Umkehrphasen-HPLC-Säule eine C18-(Oktadecyl)-Säule. Wie der Fachmann erkennt, kann die Säule auch ausgewählt sein aus, aber nicht beschränkt auf: C8, C1-(Trymethylchlorsilan)-, CN- oder Phenyl-Säulen. Verfahren zur Auswahl von Umkehrphasen-HPLC-Säulen, Adsorptionsmitteln und Adsorptionsmodifikationen sind für denjenigen, der auf dem Gebiet der Chromatographie kundig ist, Routine.
• Um die Eigenschaften von Fraktionen von Eurycoma longifolia-Extrakten zu untersuchen, wurde eine Reihe von Experimenten unter Verwendung von Formulierungen der Fraktionen durchgeführt. Die Einzelheiten dieser Experimente sind in den Beispielen unten aufgeführt. Alternative Verfahren zur Untersuchung der Spermienbeweglichkeit, der Spermienanzahl und des Testosteronspiegels sind dem Fachmann bekannt (z.B. siehe Harrison's Principles of Internal Medicine, 1998; Winters et al., 1991; Froman and McLean, 1996; Bomman, et al., 1993) und sollen als solche in dem Test der bioaktiven Fraktion verwendbar sein. In anderen Ausführungsformen kann die Untersuchung der Fraktionen des Eurycoma longifolia-Extraktes das Bestimmen der hier beschriebenen Verhaltensparameter einschließen.
• In einer Gruppe der erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Präparationen neben den von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen, z.B. Fraktionen von Eurycoma longifolia-Extrakten, einen pharmazeutisch verträglichen Träger zur oralen Verabreichung.
• Um eine orale Verabreichung zu ermöglichen, können die von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen mit einem beliebigen pharmazeutisch verträglichen Träger zur oralen Verabreichung vermischt werden. Mit dem Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger zur oralen Verabreichung" ist eine Zusammensetzung gemeint, welche nicht toxisch und für das menschliche Verdauungssystem nicht schädlich ist, und die mit von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen vermischt werden kann, um eine Lösung, Sirup, Emulsion, Gel oder Feststoff zu bilden. Präparationen für eine intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder allgemein parenterale Verabreichung können auch durch bekannte Verfahren im Stand der Technik hergestellt werden.
• Ein Beispiel von Substanzen, die als pharmazeutisch verträgliche Träger zur oralen Verabreichung dienen können, sind Zucker wie Laktose, Glukose und Saccharose; Stärke wie Getreidestärke und Kartoffelstärke; Zellulose und deren Derivate wie Natriumcarboxymethylcellulose, Ehtylcellulose und Celluloseacetat; pulverförmiger Tragacant; Malz; Gelatine; Kalk; Stearinsäure; Magnesiumstearat; Kalziumsulfat; vegetative Öle wie Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl und Getreideöl; Polyole wie Propylenglycol, Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; Polyvinylpyrrolidon; Alginisäure; pyrogenfreies Wasser; isotonische Kochsalzlösung; Phosphatpufferlösungen; Kakaobutter; Emulgatoren sowie andere nicht toxische kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden. Benetzungsmittel und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat sowie Färbemittel, Geschmacksstoffe, Arzneistoffträger, Tablettenzusätze, Stabilisatoren, Antioxidantien und Konservierungsmittel können ebenfalls vorhanden sein. Andere kompatible pharmazeutische Zusätze und Wirkstoffe können in dem pharmazeutisch verträglichen Träger zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten sein.
• Die Präparationen zur oralen Verabreichung können in Form von Tabletten, Kapseln, weichen oder harten Gelatinekapseln, Pillen einschließlich Formulierungen zur verzögerten oder verlängerten Freisetzung, dispersiblen Pulvern oder Granulaten, Bonbons, Packungen, Kapseln aus Stärkemasse, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupe, Aerosole (als Feststoff oder in Flüssigmedium) und dergleichen vorliegen.
• In anderen Gruppen von Ausführungsformen umfassen die erfindungsgemäßen Präparationen neben den von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen, z.B. Fraktionen von Eurycoma longifolia-Extrakten, einen pharmazeutisch verträglichen Träger zur topischen Verabreichung. Solche pharmazeutisch verträglichen Träger sind im Stand der Technik bekannt und umfassen üblicherweise jede beliebige gegenwärtig verwendete und kommerziell erhältliche dermatologische oder kosmetische Zusammensetzung oder Kombinationen von gegenwärtig verwendeten und kommerziell erhältlichen dermatologischen oder kosmetischen Zusammensetzungen. Daher kann man einfach eine erhältliche dermatologische oder kosmetische Zusammensetzung modifizieren, indem eine von Eurycoma longifolia abgeleitete Zusammensetzung zugegeben wird und, wenn notwendig, die Verhältnisse der wässrigen und nicht wässrigen Bestandteile angepasst werden, um eine für eine topische Verabreichung geeignete Konsistenz zu erhalten.
• Wie hier verwendet, bezeichnet der Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger zur topischen Verabreichung" eine Zusammensetzung, die zur topischen Verabreichung an menschliche Haut durch Aufstreichen oder Einreiben geeignet ist, ohne Irritationen an der menschlichen Haut hervorzurufen, und die mit von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzungen vermischt werden kann, um eine Lösung, Emulsion, Gel, Lotion, Salbe, Balsam, Creme oder aufstreichbaren Feststoff oder Paste zu bilden. Solche pharmazeutisch verträglichen Träger können Weichmacher, oberflächenaktive Substanzen, Befeuchtungsmittel, Gleitmittel, Verdicker, Abdichtmittel, bakteriozide Substanzen, perkutan penetrierende Mittel und Konservierungsmittel einschließen. Zusätzlich können verschiedene kosmetische Mittel wie Duftstoffe und Pigmente in einem pharmazeutisch verträglichen Träger zur topischen Verabreichung eingeschlossen sein.
• Eine Ausführungsform, bei der die Verwendung einer Zusammensetzung zur Behandlung von sexueller Dysfunktion oder männlicher Unfruchtbarkeit der hier beschriebenen entspricht, besteht in der Verabreichung des von Eurycoma longifolia abgeleiteten bioaktiven Agenz an ein Individuum. Wie hier verwendet, bezeichnet ein Individuum einen Menschen, einen nicht menschlichen Primaten, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze oder Nager. In allen Ausführungsformen sind menschliche Individuen bevorzugt. In allen Ausführungsformen sind männliche Individuen bevorzugt. Vorzugsweise ist das Individuum ein Mensch, der unter Verdacht steht, an einer sexuellen Dysfunktion zu leiden oder unfruchtbar zu sein oder bei dem eine sexuelle Dysfunktion oder Unfruchtbarkeit diagnostiziert wurde.
• In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der Testosteronsynthese, der Testosteronfreisetzung von Hodenzellen, der Spermienzahl und/oder der Spermienbeweglichkeit offenbart und verwendet eine Präparation, die eine von Eurycoma longifolia abgeleitete Zusammensetzung einschließt, die das bioaktive Agenz umfasst. In einer Ausführungsform kann die Präparation der von Eurycoma longifolia abgeleiteten Zusammensetzung zusammen mit anderen Arzneimitteln verabreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, um die Testosteronsynthese, Testosteronfreisetzung, Spermienzahl oder Spermienbeweglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise kann die Anwendung eines Pflasters für eine langsame Testosteronfreisetzung mit einer gleichzeitigen Verabreichung der bioaktiven Formulierung von Eurycoma longifolia begleitet sein.
• Die erfindungsgemäßen bioaktiven Formulierungen von Eurycoma longifolia werden in wirksamen Mengen, alleine oder als Cocktail mit anderen Verbindungen verabreicht. Eine wirksame Menge ist eine Menge, die ausreichend ist, um die Testosteronsynthese, die Testosteronfreisetzung von der Testis, die Spermienanzahl oder die Spermienbeweglichkeit zu erhöhen. Die effektiven Mengen werden natürlich von der Schwere des zu behandelnden Zustands, den individuellen Patientenparametern einschließlich dem Alter, dem physiologischen Zustand, der Größe, dem Gewicht, der gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der Verabreichung abhängen. Diese Faktoren sind für den Fachmann bekannt und können durch reine Routine-Experimente ermittelt werden. Es ist allgemein bevorzugt, dass eine Maximaldosis verwendet wird, welche der nach medizinischer Einschätzung sichersten Dosis entspricht.
• Im Allgemeinen liegen die täglichen Dosen für aktive Verbindungen bei ungefähr 0,01 gm/kg pro Tag bis 2000 gm/kg pro Tag. Es wird erwartet, dass die oralen Dosen in dem Bereich von 10 bis 500 gm/kg in einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag die erwünschten Ergebnisse liefern. Für den Fall, dass die Antwort in einem Individuum für solche Dosen nicht ausreicht, können höhere Dosen (oder wirksame höhere Dosen durch eine andere, lokalisierte Verabreichungsroute) bis zu dem Grad, den der Patient toleriert, eingesetzt werden. Die Dosierungsbereiche können zur Behandlung von individuellen Patienten und entsprechend dem behandelten spezifischen Zustand angepasst werden. Es können mehrere Dosen pro Tag vorgesehen sein, um geeignete systemische Spiegel der Verbindungen zu erreichen.
• Es ist eine Vielzahl von Verabreichungsrouten verfügbar. Der spezifische, ausgewählte Modus hängt natürlich von der spezifischen, ausgewählten Formulierung, der Schwere des zu behandelnden Zustandes und der für die therapeutische Wirksamkeit erforderlichen Dosierung ab. Die erfindungsgemäßen Verfahren können, allgemein gesprochen, unter Verwendung eines beliebigen Verabreichungsmodus, der medizinisch annehmbar ist, durchgeführt werden, das heißt jeglicher Modus, der wirksame Spiegel der aktiven Verbindungen erzeugt, ohne klinisch nicht akzeptable Nebenwirkungen hervorzurufen. Solche Verabreichungsmodi umfassen orale, rektale, topische, nasale, transdermale oder parenterale Routen. Der Ausdruck "parenteral" umfasst eine subkutane, intravenöse, intramuskuläre Verabreichung oder Infusion. Intravenöse und intramuskuläre Routen sind für eine langfristige Therapie und Prophylaxe nicht besonders geeignet. In wirksamen Notfallsituationen ist eine intravenöse Verabreichung bevorzugt. Eine orale Verabreichung wird aufgrund des Befindens des Patienten sowie des Dosierungsplanes für eine prophylaktische Behandlung bevorzugt.
• Die Zusammensetzungen können leicht in einer Einheitsdosisform vorliegen und durch bekannte Verfahren im Stand der Technik der Pharmazie hergestellt werden. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem die aktiven Verbindungen gleichmäßig mit einem Flüssigkeitsträger, einem fein aufgeteilten Festträger oder beiden zusammengebracht werden und anschließend das Produkt, wenn notwendig, geformt wird.
• Die für eine orale Verabreichung geeigneten Zusammensetzungen können als diskrete Einheiten vorliegen, wie z.B. Kapseln, Kapseln aus Stärkemasse, Tabletten oder Bonbons, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge der aktiven Verbindung enthält. Andere Zusammensetzungen umfassen Suspensionen in wässrigen Flüssigkeiten oder nicht wässrigen Flüssigkeiten wie z.B. Sirup, Elixier oder Emulsion.
• Andere Abgabesysteme können zeitabhängige Verzögerungs- oder Erhaltungsabgabesysteme umfassen. Solche Systeme können wiederholte Verabreichungen der wirksamen Verbindungen der Erfindung vermeiden, was für das Individuum und den Arzt leichter ist. Es sind viele Arten von freisetzenden Abgabesystemen verfügbar und dem Fachmann bekannt. Diese umfassen Polymer-basierende Systeme wie z.B. Polymilchsäure und Polyglycolsäure, Polyanhydride und Polycaprolacton; nicht-polymere Systeme, die Lipide sind einschließlich Sterole wie z.B. Cholesterol, Cholesterol-Ester und Fettsäuren oder neutrale Fette, wie z.B. Mono-, Di- und Triglyceride; Hydrogel-Freisetzungssysteme, silastische Systeme; Peptid-basierende Systeme; Wachsbeschichtungen, gepresste Tabletten unter Verwendung konventioneller Bindestoffe und Arzneimittelstoffträger, teilweise fusionierte Implantate und dergleichen. Spezifische Beispiele umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: (a) Erosionalsysteme, in denen das Polysaccharid in einer Form innerhalb einer Matrix enthalten ist, beispielsweise beschrieben in den US-Patentnummern 4,452,775 (Kent); 4,667,014 (Nestor et al.); und 4,748,034 und 5,239,660 (Leonard), und (b) Diffusionssysteme, in denen ein aktiver Bestandteil bei einer kontrollierten Rate durch ein Polymer dringt, beispielsweise beschrieben in den US-Patentnummern 3,832,253 (Higuchi et al.) und 3,854,480 (Zaffaroni). Zusätzlich kann ein Pumpen-basiertes Hardware-Abgabesystem verwendet werden, von denen einige zur Implantation angepasst sind.
• Beispiele
• Beispiel 1: Isolierung von bioaktiven Fraktionen von Eurycoma longifolia
• Einleitung
• Partiell aufgereinigte Extrakte von Wurzeln aus Eurycoma longifolia wurden durch mehrere Aufreinigungsschritte erhalten, einschließlich Reflux und zwei Runden einer Größenauschlusschromatographie.
• Verfahren
• Der Ausgangsschritt bei der Isolierung einer bioaktiven Fraktion von Eurycoma longifolia bestand in der Pulverisierung von 500 gm E. longifolia-Wurzel, gefolgt von Kochen für 8 Stunden in 8 l destilliertem Wasser. Das gekochte Gemisch wurde dann zentrifugiert, das Pellet verworfen und der geklärte Überstand gesammelt und gefriergetrocknet, um ungefähr 30 gm zu ergeben. Diese Fraktion wurde als "FDAE" identifiziert und ein Teil des FDAE wurde für eine weitere Aufreinigung und den in den Beispielen 3 und 4 gezeigten Tests zurückgestellt. Von den verbleibenden gefriergetrockneten FDAE-Pellets wurden 15 gm in 50 ml destilliertem Wasser resuspendiert und eine Bio-Gel P-2-Säule (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mit einem internen Durchmesser von 45 mm und einem Bettvolumen von 280 ml geladen und von der Säule mit destilliertem Wasser eluiert. Das Eluat wurde in zwei Fraktionen gesammelt, die anhand der Farbe unterschieden werden konnten, wobei die Anfangsfraktion in brauner Farbe und die zweite Fraktion in fluoreszierendem Gelb vorlag. Die Anfangsfraktion (Fraktion 1) wurde gefriergetrocknet.
• Von der gefriergetrockneten Fraktion wurden 1,5 gm in 10–15 ml destilliertem Wasser resuspendiert und auf eine 20 × 800 mm, 260 ml Bettvolumen Bio-Gel P-4-Säule (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) geladen und mit destilliertem Wasser eluiert. Basierend auf der unterschiedlichen Verfärbung wurden 4 Fraktionen des Eluats gesammelt, gefriergetrocknet und zur Messung der Bioaktivität verwendet. 1 fasst das Aufreinigungsschema zusammen.
• Ergebnisse
• Die dritte eluierte Fraktion wurde als "F3AE" bezeichnet. Ein Teil von F3AE wurde in den im Beispiel 2 gezeigten Bioaktivitätsexperimenten eingesetzt, und ein Teil von F3AE wurde wie in Beispiel 3 beschrieben weiter aufgereinigt.
• Beispiel 2: Biotest von bioaktiven Fraktionen von Aufreinigungsprozeduren für Eurycoma longifolia
• Einleitung
• Um die Bioaktivität der dritten eluierten Fraktion F3AE zu untersuchen, wurde ein Teil der eluierten Fraktion unter Verwendung von Standard-Testosteron- und Spermienuntersuchungs-Verfahren untersucht.
• Verfahren
• Unter Verwendung von Standardverfahren wurden In-vivo-Radioimmunotest-Messungen von Testosteron unter Verwendung von Plasma aus Test- und Kontrolltieren durchgeführt. Zusätzlich wurden In-Vitro-Hormontests unter Verwendung von standardgemäßen Gas-Chromatographie-Verfahren durchgeführt. Eine Spermienanalyse zur Konzentration und Beweglichkeit wurde unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt.
• Ergebnisse
• Die Ergebnisse des Biotests sind in Tabelle 1 gezeigt.
• Tabelle 1: Ergebnisse der In-vivo- und In-Vitro-Bioaktivitäts-Tests

  
• Beispiel 3: Alternatives Verfahren zur Isolierung von bioaktiven Fraktionen von Eurycoma longifolia
• Einleitung
• Entsprechend der Anfangsauftrennung der Fraktionen von Eurycoma longifolia (s. Beispiel 1). Es wurde ein Teil von FDAE (s. Beispiel 1) und ein Teil der bioaktiven Fraktion F3AE, die von der E. longifolia-Wurzel isoliert wurde (s. Beispiel 2) unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC-Verfahren aufgereinigt und unter Verwendung von Aminosäureanalyse, Zuckeranalyse und Massenspektroskopieverfahren charakterisiert.
• Verfahren
• Jede Fraktion FDAE oder Fraktion F3AE (s. Beispiel 1 und 2, Verfahrensabschnitte) wurde auf eine Rainin-C4-Säule auf einem Rainin-HPLC-System (Rainin Instrument Co., Wob urn, MA) für eine Umkehrphasenauftrennung geladen. Die sechzigminütige HPLC-Aufreinigung wurde bei einer konstanten Durchflussrate von 1 ml/min laufengelassen. Es wurden jeweils FDAE oder F3AE mit ungefähr 1 gm/ml destilliertem Wasser zum Zeitpunkt 0 initiiert. Die mobile Phase betrug 100% 0,1 Trifluoressigsäure (TFA) für die ersten 10 Minuten und wurde dann durch 100% 0,1% TFA auf 100% Acetonitril über die verbleibenden 50 Minuten des Durchlaufes ausgewechselt. Die Fraktionen wurden über den gesamten Durchlauf gesammelt, und das Eluat wurde anhand einer UV-Detektion bei 245 nm beobachtet und anschließend gefriergetrocknet. 3 zeigt chromatographische Spuren der Auftrennungen von dem FDAE-Durchlauf (A) und dem F3AE-Durchlauf (B). Ein einzelner, mit dem "*" bezeichneter Peak in der unteren Spur in 3 entspricht der in Beispiel 2 charakterisierten bioaktiven Fraktion. Der Gehalt des einzelnen Peaks, der nach 9 Minuten eluiert wurde, wurde einer Peptidanalyse und einer Zuckeranalyse unter Verwendung von Standardverfahren unterzogen. Es wurde auch eine Massenspektroskopieanalyse mit der 9-Minuten-Fraktion entsprechend den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung einer oberflächenverstärkten Laserdesorptionsionisierung durchgeführt (SELDI; z.B. Ciphergen, Palo Alto, CA).
• Ergebnisse
• Die Einzelpeakelution nach 9 Minuten wurde, basierend auf den in Beispiel 2 beschriebenen Biotests als bioaktiv bestimmt. Der Peak wurde anhand mehrerer Verfahren analysiert, um dessen Zusammensetzung zu bestimmen. Die nach 9 Minuten eluierte Verbindung bestand aus ungefähr 33 bis 36 Peptiden und war mit ungefähr mit 3 Arten von Zuckern verbunden einschl.: Xylose, Glucose und Fucose, und besaß eine Masse von ungefähr 4.300 Dalton.
• Literaturstellen
• Chan K. L., C. Y. Choo, H. Morita und H. Itokawa (1988), High performance Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis of Eurycoma longifolia, Planta Medica 64: 741–745.
• Harrisons's Principles of Internal Medicine, 14/e, (1998) McGraw-Hill Companies, New York.
• Winter, S. J., Medhamurthy, V. L Gay, and T. M. Plant (1991) A comparison of moment to moment and diurnal changes in circulating inhibin and testosterone concentrations in male rhesus monkeys (Macaca mulatta). Endocrinology 129(4): 1755–61.
• Froman, D. P. and D. J. McLean (1996) Objective measurement of sperm motility based upon sperm penetration of Accudenz. Poult. Sci. 75(6): 776–84.
• Du Toit, D., M. S. Bornman, M. P. Van Der Merwe, D. J. Du Plessis, and J. M. Oosthuizen (1993) Differential sperm motility scoring and sperm ATP concentrations. Arch. Androl. 30(1): 69–71.

Claims (16)

1. Zusammensetzung, umfassend eine Fraktion von einem wässrigen Extrakt von Eurycoma longifolia, wobei die Fraktion ein Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4300 Dalton umfasst.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Fraktion eine Aktivität besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus zunehmender Testosteronsynthese, zunehmender Testosteronfreisetzung aus Zellen, zunehmender Spermienanzahl und zunehmender Spermienbeweglichkeit.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Peptid ein Glykopeptid ist.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Peptid 30 bis 39 Aminosäuren besitzt.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Peptid 36 Aminosäuren besitzt.
6. Verfahren zur Isolierung eines bioaktiven Bestandteils aus einem wässrigen Extrakt von Eurycoma longifolia, umfassend Herstellen eines wässrigen Extraktes von Eurycoma longifolia und Isolieren des bioaktiven Bestandteils durch ein chromatographisches Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Größenausschlusschromatographie, wobei der bioaktive Bestandteil ein Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4300 Dalton umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines chromatographischen Mediums ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C4 und C18 durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, ferner umfassend die Fraktionierung des wässrigen Extraktes unter Verwendung von mindestens einem Größenausschlusschromatographie-Mediums ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bio-Gel P-2 und Bio-Gel P-4 vor der chromatographischen Auftrennung durch Umkehrphasen-HPLC.
9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Bioaktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus zunehmender Testosteronsynthese, zunehmender Testosteronfreisetzung aus Zellen, zunehmender Spermienanzahl und zunehmender Spermienbeweglichkeit.
10. Bioaktiver Bestandteil von Eurycoma longifolia, hergestellt durch das Verfahren gemäß Anspruch 6.
11. Verwendung der Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von sexueller Dysfunktion oder männlicher Unfruchtbarkeit durch zunehmende Testosteronsynthese, zunehmende Testosteronfreisetzung aus Zellen, zunehmende Spermienanzahl oder zunehmende Spermienbeweglichkeit.
12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung in einer Menge verabreicht wird, die zur Steigerung der Testosteronsynthese wirksam ist.
13. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung in einer Menge verabreicht wird, die zur Steigerung der Testosteronfreisetzung aus Hodenzellen wirksam ist.
14. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung in einer Menge verabreicht wird, die zur Steigerung der Spermienanzahl wirksam ist.
15. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung in einer Menge verabreicht wird, die zur Steigerung der Spermienbeweglichkeit wirksam ist.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge der Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.