DE69726285T2

DE69726285T2 - Isolierung von immunglobulinen

Info

Publication number: DE69726285T2
Application number: DE69726285T
Authority: DE
Inventors: Otto Allan LIHME; Bendix Marie Hansen
Original assignee: Upfront Chromatography AS
Current assignee: Upfront Chromatography AS
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2017-09-02
Also published as: US6919436B2; JP2001501595A; US7442779B2; CA2876986C; EP0921855B1; ATE441476T1; CA2264177C; CA2264177A1; CA2876986A1; JP4425994B2; EP1386660B1; ES2332893T3; DE69726285D1; US7745582B2; DE69739567D1; WO1998008603A1; EP1386660A1; AU729039B2; US6498236B1; EP0921855A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung oder Reinigung von Immunglobulinen aus verschiedenen Ausgangsmaterialien und Festphasenmatrizen dafür.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Immunglobuline – oder Antikörper – bilden eine sehr wichtige Klasse von Proteinen, welche in verschiedenen Körperflüssigkeiten von Säugetieren, Vögeln und Fischen vorhanden sind, wobei sie als Schutzmittel des Tiers gegen Stoffe, Bakterien und Viren, die das Tier angreifen, dienen. Immunglobuline sind typischerweise in Blut, Milch und Speichel von Tieren sowie in anderen Körperflüssigkeiten und -sekreten vorhanden.
Die biologische Aktivität, welche die Immunglobuline besitzen, wird heute in einem Umfang unterschiedlicher Anwendungen in der Human- und Veterinärdiagnostik, Gesundheitsvorsorge und im therapeutischen Bereich genutzt.
Diagnostik
Antikörper werden seit vielen Jahren als wichtiges analytisches Hilfsmittel in Verbindung mit dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung vieler verschiedener Substanzen, die für die Diagnose von Erkrankungen von Bedeutung sind, verwendet und sind in zunehmendem Maße auf Gebieten wie Qualitätskontrolle von Nahrungsmitteln, Umweltkontrolle, Suchtmittel und Überwachung und Kontrolle industrieller Verfahren wichtig.
Für diese Zwecke können die gewünschten Antikörper durch Hyperimmunisierung geeigneter Wirtstiere, wie z. B. Kaninchen und Schaf, oder alternativ, durch Herstellung monoklonaler Antikörper in Hybridoma-Zellkulturen hergestellt werden.
Der primären Herstellung der Antikörper entweder in einem Wirtstier oder in Zellkultur folgend, wird der Antikörper typischerweise aus der Hauptmasse anderer Stoffe in dem Ausgangsmaterial durch eine Art eines Isolierungsverfahrens isoliert. Das ist notwendig, um bei der analytischen Verwendung eine Störung der Antikörperaktivität durch diese anderen Stoffe zu vermeiden.
Gesundheitsvorsorge und therapeutische Verwendungen
Die passive Immunisierung durch intramuskuläre Injektion von Imminglobulinkonzentraten ist eine gut bekannte Verwendung zum temporären Schutz gegen Infektionskrankheiten, die typischerweise angewandt wird, wenn Menschen von einem Teil der Welt in einen anderen reisen. Der Erfolg dieser An von Behandlung beim Menschen wird jetzt auf dem Gebiet der Veterinärmedizin weiter verfolgt, wo die passive Immunisierung neugeborener Rinder, Pferde, Schweine und Hühner angewandt und entwickelt wird, um die Überlebensrate dieser Tiere während ihrer ersten fünf Lebenswochen zu erhöhen. Eine wichtige Frage auf diesem Gebiet sind natürlich die Kosten solch einer Behandlung, welche in hohem Maße von den Kosten der Herstellung des Immunglobulinkonzentrats abhängen.
Isolate von tierischen Immunglobulinen, z. B. aus Kuhmilch, werden außerdem als ein Produkt zur oralen Gesundheitsvorsorge oder sogar als therapeutisches Produkt untersucht, um gastrointestinale Infektionen, z. B. bei AIDS-Patienten, zu vermeiden oder zu behandeln. Für solche Anwendungen ist sowohl der Reinheitsgrad des Produkts als auch der Preis von größter Bedeutung.
Eine differenziertere Anwendung von Antikörpern für die therapeutische Verwendung beruht auf dem so genannten "Drug Targeting", wobei hochwirksame Arzneimittel an Antikörper mit spezifischen Bindungsaffinitäten zu speziellen Zellen im menschlichen Organismus, z. B. Krebszellen, kovalent gebunden sind. Dieses Verfahren gewährleistet, dass das Arzneimittel auf den erkrankten Zellen konzentriert wird, was die größte Wirkung des Arzneimittels ohne die starken Nebenwirkungen, die bei Verwendung von Chemotherapie häufig auftreten, ergibt. Für derartige Zwecke müssen die Antikörper sehr sorgfältig kontrolliert und von hoher Reinheit sein, und der typische Weg der Durchführung der primären Herstellung ist entweder das Herstellen monoklonaler Antikörper in Hybridoma-Zellkultur oder das Fermentieren von gentechnisch veränderten Bakterien, z. B. E. coli.
Isolierung der Immunglobuline
Alle vorstehend erwähnten Anwendungen von Immunglobulinen erfordern irgendeine Art der Isolierung des Antikörpers aus dem rohen Ausgangsmaterial, aber jede Anwendungsart hat ihre eigenen sehr unterschiedlichen Forderungen in Bezug auf die Endreinheit und die zulässigen Kosten des Antikörperprodukts.
Es existiert allgemein ein sehr breiter Bereich unterschiedlicher Verfahren, die zur Isolierung von Immunglobulinen verfügbar sind, wodurch sich ein ausgedehnter Bereich von Endreinheiten, Ausbeuten und Kosten des Produkts ergibt.
Herkömmliche Verfahren zur Isolierung von Immunglobulinen gründen sich auf die selektive reversible Ausfällung der die Immunglobuline umfassenden Proteinfraktion, während andere Proteingruppen in Lösung bleiben. Typische Fällungsmittel sind Ethanol, Polyethylenglycol, lyotrope (antichaotrope) Salze, wie Ammoniumsulfat und Kaliumphosphat, und Caprylsäure.
Typischerweise ergeben diese Fällungsverfahren sehr unreine Produkte, obgleich sie zeit- und arbeitsaufwendig zugleich sind. Außerdem erschwert der Zusatz des Fällungsmittels zum Ausgangsmaterial die Verwendung des Überstands für andere Zwecke und verursacht ein Entsorgungsproblem. Das ist besonders wichtig, wenn von großtechnischer Reinigung von Immunglobulinen aus z. B. Molke und Blutplasma gesprochen wird.
Ionenaustauschchromatographie ist ein weiteres gut bekanntes Verfahren der Proteinfraktionierung, das häufig zur Isolierung von Immunglobulinen verwendet wird. Dieses Verfahren ist jedoch im Allgemeinen nicht anwendbar wegen der Einschränkungen bei Ionenstärke und pH-Wert, die notwendig sind, um ein effizientes Binden des Antikörpers zu gewährleisten, zusammen mit den unterschiedlichen isoelektrischen Punkten verschiedener Immunglobuline.
Die Protein-A- and Protein-G-Affinitätschromatographie sind sehr populäre und weitverbreitete Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Immunglobulinen, insbesondere zur Isolierung monoklonaler Antikörper, hauptsächlich wegen der einfachen Handhabung und der erhaltenen hohen Reinheit. Obwohl sie populär sind, ist jedoch zu erkennen, dass Protein A und Protein G für den Anwender einige Probleme mit sich bringen, und zwar: sehr hohe Kosten, wechselnde Bindungseffizienz der unterschiedlichen monoklonalen Antikörper (insbesondere Maus-IgG₁), Auslaufen von Protein A/Protein G in das Produkt und geringe Stabilität der Matrix in typischen Reinigungslösungen, z. B. 1 M Natriumhydroxid. Jeder dieser Nachteile hat seine speziellen Folgen bei der Einzelanwendung, die von unbedeutenden bis zu schwerwiegenden und untragbaren Folgen reichen.
Die hydrophobe Chromatographie ist ebenfalls ein Verfahren, das zur Isolierung von Immunglobulinen viel beschrieben wird, z. B. in "Application Note 210, BioProcess Media", veröffentlicht von Pharmacia LKB Biotechnology, 1991. In diesem Dokument wird ein Produkt nach dem neuesten Stand der Technik, "Phenyl Sepharose High Performance", für die Reinigung monoklonaler Antikörper aus Zellkulturüberständen beschrieben. Wie bei anderen bisher verwendeten hydrophoben Matrizen ist es notwendig, lyotrope Salze zum Ausgangsmaterial hinzuzugeben, um die Immunglobulinbindung effizient zu machen. Der gebundene Antikörper wird aus der Matrix durch Herabsetzen der Konzentration des lyotropen Salzes in einem kontinuierlichen oder schrittweisen Gradienten freigesetzt. Es wird empfohlen, die hydrophobe Chromatographie mit einem weiteren Schritt zu kombinieren, wenn ein hochreines Produkt das Ziel ist.
Der Nachteil dieses Verfahrens ist die Notwendigkeit, dem Ausgangsmaterial lyotropes Salz zuzusetzen, weil dies ein Entsorgungsproblem und dadurch erhöhte Kosten für den großtechnischen Anwender verursacht. Für andere Ausgangsmaterialien als Zellkulturüberstände wie Molke, Blutplasma und Eidotter würde der Zusatz lyotroper Salze zu den Ausgangsmaterialien in vielen Fällen bei großtechnischen Anwendungen untragbar sein, weil das Salz jegliche wirtschaftlich mögliche Verwendung des von Immunglobulin entleerten Ausgangsmaterials verhindern würde, verbunden mit dem Problem der Entsorgung von mehreren Tausend Litern Abfall.
Die thiophile Adsorptionschromatographie wurde 1985 durch J. Porath als ein neues chromatographisches Adsorptionsprinzip zur Isolierung von Immunglobulinen eingeführt (J. Porath et al.; FEBS Letters 1985, Bd. 185, S. 306). In diesem Artikel wird beschrieben, wie mit Divinylsulfon aktivierte Agarose, gekoppelt mit verschiedenen, eine freie Mercaptogruppe umfassenden Liganden, eine spezifische Bindung von Immunglobulinen in der Gegenwart von 0,5 M Kaliumsulfat, d. h. einem lyotropem Salz, zeigt. Es wurde postuliert, dass die Sulfongruppe, aus dem Vinylsulfon-Spacer, und der erhaltene Thioether im Ligand eine strukturelle Notwendigkeit war, um die beschriebene Spezifität und Kapazität zur Bindung von Antikörpern zu erzielen. Später wurde jedoch gezeigt, dass der Thioether durch Stickstoff oder Sauerstoff ersetzt werden konnte, wenn der Ligand außerdem einen aromatischen Rest umfasste (K. L. Knudsen et al., Analytical Biochemistry 1992, Bd. 201, S. 170).
Obwohl die für die thiophile Chromatographie beschriebenen Matrizen im Allgemeinen eine gute Leistung zeigen, haben sie ebenfalls einen großen Nachteil darin, dass dem Ausgangsmaterial lyotrope Salze zuzugeben werden müssen, um die effiziente Bindung des Immunglobulins zu gewährleisten, was aus den vorstehend erörterten Gründen ein Problem ist.
Andere thiophile Liganden, die an die epoxyaktivierte Agarose gekoppelt sind, wurden offenbart von J. Porath et al., Makromol. Chem., Makromol. Symp. 1988, Bd. 17, S. 359 und A. Schwarz et al., Journal of Chromatography B 1995, Bd. 664, S. 83–88, z. B. 2-Mercatopyridin, 2-Mercaptopyrimidin und 2-Mercaptothiazolin. All diese Affinitätsmatrizen weisen jedoch immer noch ungeeignete Affinitätskonstanten zur Gewährleistung einer effizienten Bindung des Antikörpers ohne zugesetzte lyotrope Salze auf.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wurde jetzt überraschenderweise festgestellt, dass einige Arten von aromatischen oder heteroaromatischen Stoffen, die an eine Festphasenmatrix gebunden sind, in einem neuen Verfahren zur Isolierung und/oder Reinigung verschiedener Arten von Immunglobulinen aus sehr unterschiedlichen Ausgangsmaterialien mit hoher Effizienz und mit besonderen Vorteilen in Bezug auf die Verwendung von wenig oder keinen Salzen, insbesondere lyotropen Salzen, beim Bindungsvorgang und in Bezug auf das Vermögen, einen großen Umfang von Immunglobulinen zu binden, verwendet werden können. Außerdem weisen diese Matrizen spezielle Vorteile in Bezug auf die Stabilität in NaOH auf, was besonders wichtig ist, wenn die Festphasenmatrizen nach der Verwendung zu regenerieren sind.
Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein wie in Anspruch 1 definiertes Verfahren zur Isolierung von Immunglobulinen zur Verfügung zu stellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Isolierung von Immunglobulinen Das Verfahren zur Isolierung von Immunglobulinen kann allgemein in mehrere Schritte aufgegliedert werden:

(a) Äquilibrieren der Festphasenmatrix
(b) Kontaktieren der Festphase mit Immunglobulinlösung
(c) Waschen der Festphase
(d) Trennen der Festphase von der Lösung
(e) Eluieren des gebundenen Imminglobulins
(f) Regenerieren der Festphasenmatrix.

Es kann jedoch von der spezifischen Anwendung abhängen, ob jedes Mal oder überhaupt alle Schritte ausgeführt werden. Daher sind die einzigen obligatorischen Schritte die Schritte des Kontaktierens, Trennens und Eluierens, während die Schritte des Äquilibrierens, Waschens und Regenerierens gemäß den speziellen Anforderungen, die für die konkrete Anwendung wichtig sind, durchgeführt oder nicht durchgeführt werden können. Die An des Trennungsschritts hängt vom konkreten Aufbau (siehe unten) ab.
Äquilibrieren
Bevor die Festphasenmatrix mit der Immunglobulin enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird, ist es bevorzugt zu gewährleisten, dass sich sowohl die Matrix als auch die Lösung in einem Zustand befinden, der zur gewünschten Bindung des Immunglobulins führt. In dieser Hinsicht kann es deshalb notwendig sein, Parameter wie pH-Wert, Ionenstärke und Temperatur einzustellen und in einigen Fällen Stoffe unterschiedlicher Art zuzusetzen, um die Bindung der Immunglobuline zu fördern und/oder um die Bindung von Verunreinigungen zu verhindern.
Daher ist es ein optionaler Schritt, eine Äquilibrierung der Festphasenmatrix durch Waschen dieser mit einer Lösung (z. B. einem Puffer zur Einstellung des pH-Werts, der Ionenstärke usw. oder zum Einbringen eines Detergens) vorzunehmen, wodurch der Festphase die nötigen Charakteristika verliehen werden.
Kontaktieren
Wenn die Festphasenmatrix in Form von Teilchen von entweder sphärischer oder unregelmäßiger Form vorliegt, kann das Kontaktieren einer ein oder mehrere Immunglobuline enthaltenden Lösung entweder in einer gepackten (packed bed) Säule oder in einer fluidisierten/expandierten (fluidised/expanded bed) Säule, die die Festphasenmatrix enthält, durchgeführt werden. Es kann auch in einem einfachen Chargenarbeitsgang durchgeführt werden, wobei die Festphasenmatrix mit der Lösung eine Zeit lang gemischt wird, um Binden des (der) Immunglobulins(e) zu gestatten.
Wann immer die Festphasenmatrix in Form von permeablen oder semipermeablen Membranen oder Bahnen vorliegt, wird das Kontaktieren im Allgemeinen durch Pumpen/Pressen der Immunglobulin enthaltenden Lösung über die Oberfläche und/oder durch eine poröse Struktur der Membran oder Bahn ausgeführt, um zu gewährleisten, dass die Immunglobuline in engen Kontakt mit den an der Oberfläche und/oder in den porösen Strukturen immobilisierten Liganden kommen.
Weitere Richtlinien für dieses Verfahren sind in "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", P. Gagnon, Validated Biosystems, 1996, beschrieben.
Waschen
Nach dem Kontaktieren der Festphasenmatrix mit der Immunglobulin enthaltenden Lösung wird gegebenenfalls ein Waschverfahren durchgeführt, um ungebundene oder lose gebundene Stoffe wie andere Proteine, Lipide, Nucleinsäuren oder weitere Fremdstoffe von der Matrix zu entfernen. Jedoch in einigen Fällen, in denen eine hohe Reinheit des Immunglobulins nicht entscheidend ist, kann das Waschverfahren weggelassen werden, wodurch sowohl ein Verfahrensschritt als auch Waschlösung eingespart wird.
In anderen Fällen, in denen eine sehr hohe Reinheit des Immunglobulins benötigt wird, können mehrere unterschiedliche Waschverfahren mit verschiedenen Waschpuffern verwendet werden, bevor mit dem Eluieren begonnen wird.
Die verwendeten Waschpuffer werden von der Beschaffenheit des chromatographischen Adsorbens und dem die Immunglobuline bindenden Liganden abhängen. Der Waschpuffer sollte die Bindung der Immunglobuline an das Adsorbens nicht stören, d. h. pH-Wert, Salzkonzentration und andere Zusatzstoffe sollten so eingestellt werden, dass nur die unerwünschten Verunreinigungen entweder durch einfachen Austausch der Lösung, die die Verunreinigungen enthält und sich in dem und um das Adsorbens befindet, durch den Waschpuffer oder in Kombination damit auch durch Freisetzen von Verunreinigungen, die an das Adsorbens gebunden sind, entfernt werden. Das Freisetzen von an die Matrix gebundenen Verunreinigungen kann entweder durch Veränderung des pH-Werts und/oder der Ionenstärke oder durch Zusetzen eines Stoffes zum Waschpuffer, welcher konkurrierend entweder mit dem Adsorbens oder der Verunreinigung in Wechselwirkung tritt und dadurch die Verunreinigung aus dem Adsorbens verdrängt, realisiert werden.
Das Waschen (Verfahrensschritt (c) in dem erfindungsgemäßen Verfahren) wird bevorzugt durchgeführt, um Rückstände aus der die Immunglobuline enthaltenden Lösung zu entfernen und um andere Arten von Biomolekülen zu entziehen.
Eluieren
Das Eluieren des gebundenen Immunglobulins wird im Allgemeinen durch Kontaktieren der das gebundene Immunglobulin umfassenden Festphasenmatrix mit einer Lösung, die das Immunglobulin vom Liganden auf der Matrix freisetzt, vollzogen. Das Immunglobulin wird dadurch in die Lösung freigesetzt und kann aus der Matrix gewaschen werden. Die zum Freisetzen des Immunglobulins verwendete Lösung sollte im Allgemeinen andere Charakteristika als die aufweisen, die zum Binden des Immunglobulins verwendet wurde, z. B. kann die Lösung einen anderen pH-Wert, eine andere Ionenstärke, eine andere Temperatur haben und/oder organische Lösungsmittel (bevorzugt nur kleine Mengen), Detergenzien, chaotrope Verbindungen und andere Denaturierungsmittel umfassen. Kombinationen von Veränderungen bei diesen anderen Parametern können ebenfalls allgemein angewandt werden.
Das Eluieren kann außerdem durch Verwenden einer Lösung, bei der die Bedingungen allmählich von bindenden zu nichtbindenden Bedingungen verändert werden, durchgeführt werden, ein Verfahren, welches typischerweise als Gradientenelution formuliert wird.
Sobald das Immunglobulin aus der Festphasenmatrix in die Elutionslösung freigesetzt ist, kann es aus dieser durch verschiedene optionale Wege, die an sich bekannt sind, gewonnen werden. Im einfachsten Fall kann das Imminglobulin ohne Veränderungen direkt verwendet werden, aber in vielen Fällen wird irgendeine Art eines Anreicherungsverfahrens bevorzugt, z. B. Ultrafiltration, Gefriertrocknung oder Ausfällung (z. B. Aussalzung). Die Immunglobulinlösung kann außerdem sehr gut in einem weiteren Behandlungsschritt von optionalem Charakter weiter gereinigt werden.
Regenerieren
Die Festphasenmatrix kann gegebenenfalls gereinigt, d. h. nach dem Eluieren des Immunglobulins regeneriert, werden. Dieses Verfahren wird typischerweise regelmäßig durchgeführt, um das Aufbauen von Verunreinigungen, die die Oberfläche der Festphase verderben, auf ein Mindestmaß zu reduzieren und/oder um die Matrix zu sterilisieren, um eine Verunreinigung des Produkts mit Mikroorganismen, die sich vermehren und von der Festphase und der während des Verfahrens verwendeten Ausrüstung austreten, zu vermeiden. Ein populärer Weg der Ausführung eines derartigen Regenerierungsschrittes ist es, die Festphasenmatrix mit Lösungen, die zum Reinigen der Matrix und/oder zum Abtöten von Mikroorganismen imstande sind, zu reinigen. Typische Lösungen für diese Zwecke würden z. B. 0,1–1,0 M Natriumhydroxid; Lösungen von Persäuren oder Wasserstoffperoxid; Denaturierungsmittel wie Guadiniumhydrochlorid; Lösungen, die aktives Chlor umfassen, wie Hypochloritlösungen; organische Lösungsmittel wie Ethanol; Detergenzien usw. sein. Ein für diesen Zweck besonders bevorzugtes Verfahren ist die Verwendung von 0,1–1,0 M Natriumhydroxid wegen der sehr hohen Effizienz, des niedrigen Preises, der Leichtigkeit der Neutralisation mit Salzsäure und des Fehlens von Abfallproblemen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt das Verfahren ein: (i) Äquilibrieren (optionaler Schritt), (ii) Kontaktieren, (iii) Waschen (optionaler Schritt), (iv) Trennen, (v) Eluieren und (vi) Regenerieren, wobei der Zyklus der Schritte (i)–(v) vor dem Regenerieren ein oder mehrere Male wiederholt wird und wobei die Festphasenmatrix nach dem Regenerieren wiederverwendet wird.
Die bei den Schritten sowohl des Bindens, Waschens als auch des Eluierens verwendeten Bedingungen können sehr entscheidend für die resultierende Bindungseffizienz, Ausbeute und Reinheit des Immunglobulins sein. Verschiedene erfindungsgemäße Festphasenmatrizen können unterschiedliche Bedingungen des Bindens, Waschens und Eluierens erfordern, um ein optimales Ergebnis zu erreichen. Die Beschaffenheit des Ausgangsmaterials wird ebenso eine sehr bedeutende Auswirkung auf die für dieses spezielle Isolierungsverfahren ausgewählten Bedingungen haben, z. B. verhalten sich sehr verdünnte Lösungen monoklonaler Antikörper in Hybridoma-Zellkulturüberständen (typischerweise 10–100 μg/ml) anders als dieselbe Art von Antikörpern in konzentrierteren Lösungen wie Aszites-Flüssigkeiten (1–5 mg/ml), und Immunglobuline in z. B. Molke (1–2 mg/ml) benötigen andere Bedingungen als Immunglobuline aus Blutplasmal Blutserum (5–20 mg/ml) usw.
Außerdem kann die Zusammensetzung, d. h. der Anteil verschiedener Arten von Verunreinigungen, zwischen unterschiedlichen Ausgangsmaterialien erheblich variieren, z. B. hat Eidotter eine ganz andere Zusammensetzung im Vergleich zu Hybridoma-Zellkulturüberständen.
Wie vorstehend erwähnt ist es im Allgemeinen möglich, der Immunglobulin enthaltenden Lösung verschiedene Stoffe zuzusetzen, um die Bindung der Antikörper an die Festphasenmatrix zu verstärken.
In einer speziellen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Isolierung von Immunglobulinen und Festphasenmatrizen dafür, wobei sich ein isoliertes Immunglobulin in einer Reinheit von mindestens 10%, wie mindestens 30%, bevorzugt mindestens 50%, wie mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 80%, wie 90%, besonders bevorzugt mindestens 99% ergibt.
Wie vorstehend erwähnt, wird vermutet, dass der pH-Wert des Maximums der Bindungseffizienz für die Festphasenmatrizen im Bereich von 2,0 bis 10,0, am wahrscheinlichsten im Bereich von 3,0 bis 9,0, liegt. Es ist deshalb sehr wichtig, das Isolierungsverfahren in der Nähe dieses Maximums durchzuführen (welches natürlich für verschiedene Kombinationen Immunglobuline/Festphasenmatrizen variieren kann). Daher liegt der pH-Wert der die Immunglobuline (oder Proteine allgemein) enthaltenden Lösung bevorzugt im Bereich von 2,0 bis 10, wie im Bereich von 3,0 bis 9,0. In Abhängigkeit von der Ligandenart und dem Matrixgrundgerüst, ist der Bereich des pH-Werts jedoch bevorzugt 3,0 bis 7,0 oder 6,0 bis 9,0.
Man ist der Überzeugung, wenn der Ligand vom Typ -X-A-SP2-ACID ist, dass dann der pH-Wert der die Immunglobuline enthaltenden Lösung im Bereich von 2,0 bis 6,0, bevorzugt im Bereich von 2,5 bis 5,5 wie im Bereich von 3,0 bis 5,5 oder im Bereich von 4,0 bis 5,5, liegen sollte, entsprechend einem erwarteten Maximum der Bindungseffizienz für diesen speziellen Matrixtyp.
In Bezug auf den vorstehenden Verfahrensschritt (b) des Kontaktierens wurde festgestellt, dass es notwendig ist, Überschussmengen an lyotropem Salz zuzusetzen, um die Immunglobuline an die Matrix zu binden. Daher muss die Gesamtsalzkonzentration, einschließlich z. B. NaCl, der die Immunglobuline enthaltenden Lösung nur so sein, dass sie einer Ionenstärke von höchstens 2,0, bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 2,0, wie 0,05 bis 1,4, besonders bevorzugt im Bereich von 0,05 bis 1,0, entspricht. Als eine weitere Voraussetzung sollte die Konzentration des lyotropen Salzes als solchem höchstens 0,4 M, bevorzugt höchstens 0,3 M, insbesondere höchstens 0,2 M, wie höchstens 0,1 M, betragen.
Beispiele für lyotrope Salze werden in "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", P. Gagnon, Validated Biosystems, 1996, beschrieben, wo die Hofmeister-Reihe lyotroper Ionen vorgestellt wird.
Was die Konzentration der Immunglobuline in der Lösung betrifft, wird vermutet, dass die Festphasenmatrizen über einen sehr großen Konzentrationsbereich wirken können, deshalb glaubt man, dass die Festphasenmatrizen gleichmäßig effizient bei einer Konzentration der Immunglobuline in der die Immunglobuline enthaltenden Lösung im Bereich von 0,001 bis 0,2 mg/ml, bevorzugt 0,01 bis 0,1 mg/ml, wie in Hybridoma-Zellkulturüberständen, im Bereich von 0,2 bis 2,0 mg/ml, wie in Milch und Molke, im Bereich von 5,0 bis 20 mg/ml, wie in verschiedenen tierischen Blutseren und Blutplasmen, und selbst im Bereich von 20–80 mg/ml, wie in Kolostrum, wirken.
Es wurde festgestellt, dass die vorliegende Erfindung besonders geeignet für Lösungen ist, die Immunglobuline im Bereich von 0,1 bis 30 mg pro Gramm Festphasenmatrix, wie im Bereich von 0,2 bis 2 oder im Bereich von 5,0 bis 25 mg pro Gramm Festphasenmatrix, umfassen.
So kann die die Immunglobuline enthaltende Lösung sowohl eine künstliche als auch eine biologische Lösung von Immunglobulinen sein wie rohe Fermentationsnährbrühen; Zellkulturen von Säugetieren, wie Hybridoma-Zellkulturen; Fermentationsnährbrühen von Kulturen gentechnisch veränderter Mikroorganismen, wie E. coli; Aszites-Flüssigkeiten, wie Aszites-Flüssigkeit von Maus und Ratte; Milch, Molke, Blut, Blutplasma und Blutserum von Mensch, Maus, Ratte, Kuh, Schwein, Kaninchen, Ziege, Meerschweinchen und Esel; und Eidotter, wie Hühnereidotter.
Außerdem wurde gezeigt (siehe die Beispiele), dass besondere Vorteile in Bezug auf die Reinheit erzielt werden können, wenn die die Immunglobuline enthaltende Lösung ein negativ geladenes Detergens umfasst. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird vermutet, dass das Detergens das Anhaften anderer Biomoleküle an die Matrix unterdrückt. Beispiele für ein derartiges Detergens sind Octylsulfat, Bromphenolblau, Octansulfonat, Natriumlaurylsarcosinat und Hexansulfonat.
Auch beim Waschschritt (Verfahrensschritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens) ist es, wahrscheinlich aus denselben Gründen, vorteilhaft, ein negativ geladenes Detergens zu verwenden. Das Detergens kann allein oder in Kombination mit einem Puffer, z. B. einem Puffer eines lyotropen Salzes, verwendet werden. Die Verwendung lyotroper Salze beim Waschschritt (kleines Volumen) stellt ein geringeres Abfallproblem im Vergleich zur Verwendung von lyotropen Salzen bei den Bindungsvorgängen (Verfahrensschritt (a)) (in dem der Bindungsvorgang in den meisten Fällen die Verwendung großer Volumens einschließt) dar.
Die ausgezeichneten Eigenschaften der Festphasenmatrizen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren können außerdem sogar ohne die Verwendung organischer Lösungsmittel beim Eluierungsschritt (Verfahrensschritt (d)) formuliert werden, daher umfasst der Eluent bevorzugt weniger als 10% (Vol./Vol.), stärker bevorzugt weniger als 5%, organische Lösungsmittel. Am meisten bevorzugt werden überhaupt keine organischen Lösungsmittel verwendet.
In einer anderen Ausführungsform, wie im Beispiel 14 aufgezeigt, kann eine größere Menge ungiftiger Lösungsmittel, z. B. Propylenglycol, verwendet werden, z. B. bis zu 40% Propylenglycol.
Sowohl der Schritt des Kontaktierens (Verfahrensschritt (b)) als auch der nachfolgende Schritt, d. h. Trennen, Waschen und Eluieren, kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden. Die ausgewählten physikalischen Maßnahmen werden oft durch den Maßstab und dadurch bestimmt, ob das Verfahren wiederholt werden muss. Die erfindungsgemäße Festphasenmatrix kann in nahezu allen für die Entwicklung und für industrielle Zwecke verwendeten Anordnungen verwendet werden. So kann die Festphasenmatrix mit der die Immunglobuline enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht werden, z. B. in einem Chargenverfahren mit Rühren, in einem chromatographischen Verfahren mit gepackter (packed bed) Säule und in einem Verfahren mit fluidisierter Säule (fluidised bed). Weitere Richtlinien für dieses Verfahren sind in "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", P. Gagnon, Validated Biosystems, 1996, beschrieben.
Andere notwendige Maßnahmen zur Durchführung der Isolierung von Immunglobulinen gemäß der Erfindung folgen herkömmlichen Methoden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Immunglobulinen aus einer großen Auswahl von Ausgangsmaterialien mit unterschiedlichen Konzentrationen an Immunglobulinen, die sich typischerweise zwischen etwa 10 μg/ml in Überständen von Hybridoma-Zellkulturen und etwa 1–2 mg/ml in Milch und Molke und etwa 5– 20 mg/ml in verschiedenen tierischen Blutseren/Blutplasmen und bis zu 50–60 mg/ml in Kolostrum bewegen, zur Verfügung. Die Beschaffenheit und die relative Konzentration verschiedener Verunreinigungen, die die Bindung und die Isolierung von Immunglobulinen möglicherweise beeinträchtigen, variieren zwischen den unterschiedlichen Immunglobulinquellen ebenfalls in hohem Maße.
Für einige Anwendungen von Immunglobulinen ist es sehr wichtig, dass die Immunglobuline äußerst rein sind, z. B. eine Reinheit von mehr als 99% aufweisen. Das trifft insbesondere zu, wann immer die Immunglobuline therapeutisch verwendet werden, ist aber auch für andere Verwendungen notwendig. Auf diagnostischem Gebiet kann der benötigte Reinheitsgrad von einigen Faktoren abhängen, wie, ob der Antikörper underivatisiert zu verwenden ist, wobei in diesem Fall kein hoher Reinheitsgrad, d. h. weniger als 50%, benötigt wird, oder ob der Antikörper mit einem Signalmolekül wie einem Enzym, z. B. Meerrettichperoxidase, markiert werden muss, wobei es in diesem Fall oft erforderlich ist, dass der Antikörper eine Reinheit von mindestens 80% oder mehr aufweist. Für andere Anwendungen kann die Notwendigkeit der Reinheit entsprechend anders sein. Es scheint jedoch eine generelle Forderung zu sein, dass die Reinheit des Immunglobulins mindestens 10% auf Trockenmaterialbasis beträgt, um eine geeignete Verwendung des Produkts zu ermöglichen. Die vorliegende Erfindung stellt jedoch, wie es selbstverständlich sein sollte, Richtlinien zur Lösung dieser Probleme zur Verfügung.
Festphasenmatrizen
Wie vorstehend beschrieben schließt das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung einer Festphasenmatrix, wobei die Festphasenmatrix ein funktionalisiertes Matrixgrundgerüst, das eine Mehrzahl funktioneller Gruppen trägt, umfasst, der folgenden Formel M-SP1-L ein, wobei M das Matrixgrundgerüst bezeichnet, SP1 einen Spacer bezeichnet, welcher kein von Divinylsulfon abgeleiteter Spacer ist, und L einen Liganden bezeichnet, welcher sich von Verbindungen, ausgewählt aus Benzimidazolen; Benzothiazolen und Benzoxazolen, ableitet, mit der Maßgabe, dass das Molekulargewicht des Liganden -L höchstens 500 Dalton beträgt, welche bestimmte Kriterien erfüllen muss.
Die Festphasenmatrix, als Matrixgrundgerüst, kann jedes natürliche oder synthetische und organische oder anorganische Material umfassen, von dem an sich bekannt ist, dass es bei der Festphasentrennung von Proteinen und anderen Biomolekülen verwendbar ist, z. B. natürliche oder synthetische Polysaccharide, wie Agar-Agar und Agarosen; Cellulosen, Celluloseether, wie Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose; Stärken; Gummi, wie Guargummi und Gummi arabicum, Gum Ghatti, Traganthgummi, Johannisbrotgummi, Xanthangummi; Pektine; Mucine; Dextrane; Chitine; Chitosane; Alginate; Carrageenane; Heparine; Gelatinen; synthetische Polymere, wie Polyacrylamide und Polymethacrylamide; Polyimide; Polyester; Polyether; polymere Vinylverbindungen, wie Polyvinylalkohole und Polystyrole; Polyalkene; anorganische Materialien, wie siliciumdioxidhaltige Materialien, wie Siliciumdioxid, einschließlich amorpher Kieselerde und Quarz; Silicamaterialien; Metallsilicate, geregelte poröse Gläser und Keramiken; Metalloxide und -sulfide; oder Kombinationen dieser natürlichen oder synthetischen und organischen oder anorganischen Materialien.
Das Matrixgrundgerüst wird bevorzugt ausgewählt aus Agar-Agar, Agarosen, Cellulosen, Celluloseethern, wie Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyamiden, wie Poly(meth)acrylamiden, Polyvinylalkoholen, Silicamaterialien und porösen Gläsern.
Als Matrixgrundgerüste besonders interessante Festphasenmaterialien sind z. B. Agar- oder Agarosekügelchen, wie Sepharose- und Superose-Kügelchen von Pharmacia Biotech, Schweden, und Biogel A von Biorad, USA; Kügelchen auf Dextranbasis, wie Sephadex, Pharmacia Biotech; Kügelchen und Membranen auf Cellulosebasis, wie Cellulose Perloza von Secheza, Tschechoslowakei; Verbundkügelchen, wie Sephacryl und Superdex, Pharmacia Biotech; Kügelchen aus synthetischen organischen Polymeren, wie Fractogel von Toso-Haas, USA; Medien POROS von Perceptive Biosystems, USA, Bio-Rex, Bio-Gel P und Macro Prep von Biorad, HEMA und Separon von TESSEK und Medien Hyper D und Trisacryl von BioSepra, USA, Enzacryl und Azlactone, 3M, USA; Kügelchen aus siliciumdioxidhaltigen Materialien, wie geregeltes poröses Glas, PROSEP, von Bioprocessing, England und Spherocil, BioSepra; und beschichtete Silicaverbundmaterialien in Form von Kügelchen oder Membranen, wie ACTI-DISK, ACTI-MOD und CycloSep von Arbor Technologies, USA.
Sowohl das Grundgerüst der Festphasenmatrix als auch die resultierende funktionalisierte Festphasenmatrix, können typischerweise z. B. in Form von unregelmäßigen Partikeln oder sphärischen Kügelchen, Membranen oder Folien, geformten Oberflächen oder Stäben vorliegen. Das Festphasenmaterial kann außerdem vollständig oder teilweise permeabel oder vollständig impermeabel für Proteine sein. In einer besonders interessanten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die Matrix in Form unregelmäßiger oder sphärischer Kügelchen mit Größen im Bereich von 1–10000 μm, bevorzugt 10–1000 μm; wie 10–60 μm für Hochleistungsanwendungen und wie 50–500 μm, bevorzugt 50–300 μm, für präparative Zwecke vor.
Eine besonders interessante Form der Matrix ist eine Matrix mit kontrollierter Dichte in Form eines Konglomerats, das Teilchen mit kontrollierter Dichte umfasst. Diese Konglomerate, welche insbesondere bei großtechnischen Verfahren sowohl für die fluidisierte (fluidised bed) oder expandierte (expanded bed) Chromatographie als auch verschiedene Chargen-Chromatographieverfahren in ungepackten Säulen, z. B. einfache Chargenadsorption in gerührten Behältern, verwendbar sind, sind in WO 92/00799 beschrieben, welches hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die Liganden L können an das Festphasenmaterial über jede Art kovalenter Bindung, von der an sich bekannt ist, dass sie für diesen Zweck verwendbar ist, gebunden werden, entweder durch eine direkte chemische Reaktion zwischen dem Ligand und dem Festphasenmaterial oder durch eine vorausgehende Aktivierung des Festphasenmaterials oder des Liganden mit einem geeigneten Reagens, von dem an sich bekannt ist, dass es das Verbinden des Matrixgrundgerüstes und des Liganden ermöglicht. Beispiele derartiger geeigneter Aktivierungsmittel sind Epichlorhydrin, Epibromhydrin, Allylglycidylether; Bisepoxide, wie Butandioldiglycidylether; halogensubstituierte aliphatische Verbindungen, wie Dichlorpropanol; Carbonyldiimidazol; Aldehyde, wie Glutardialdehyd; Chinone; Cyanbromid; Periodate, wie Natriummetaperiodat; Carbodiimide; Chlortriazine, wie Cyanurchlorid; Sulfonylchloride, wie Tosylchlorid und Tresylchlorid; N-Hydroxysuccinimid; 2-Fluor-1-methylpyridiniumtoluol-4-sulfonate; Oxazolone; Maleimide; Pyridyldisulfide und Hydrazide. Unter diesen sind die Aktivierungsmittel bevorzugt, die eine andere Spacergruppe SP1 als eine Einfachbindung überlassen, z. B. Epichlorhydrin, Epibromhydrin, Allylglycidylether; Bisepoxide; halogensubstituierte aliphatische Verbindungen; Aldehyde; Chinone; Cyanbromid; Chlortriazine; Oxazolone; Maleimide; Pyridyldisulfide und Hydrazide.
Für besonders interessante Aktivierungsmittel werden Epoxyverbindungen, wie Epichlorhydrin, Allylglycidylether und Butandioldiglycidylether gehalten.
In bestimmten Fällen kann das Aktivierungsmittel sogar einen Teil der Funktionalität bilden, der zur Bindung der Immunglobuline an die Festphasenmatrix beiträgt. In anderen Fällen wird das Aktivierungsmittel während der Reaktion der funktionellen Gruppe mit der Matrix von der Matrix freigesetzt. Das ist der Fall, wenn Carbodiimidazole und Carbodiimide verwendet werden.
Die vorstehend erwähnten Möglichkeiten machen es wichtig, die Anwesenheit eines optionalen Spacers SP1, der die Matrix M und den Liganden L verbindet, festzulegen. In dem vorliegenden Zusammenhang ist der Spacer SP1 als Teil des Aktivierungsmittels zu betrachten, welcher das Bindeglied zwischen der Matrix und dem Liganden bildet. Daher entspricht der Spacer SP1 den Aktivierungsmitteln und den damit verbundenen Kopplungsreaktionen. In einigen Fällen, wenn z. B. Carbodiimide verwendet werden, bildet das Aktivierungsmittel eine aktivierte Form der Matrix oder des Ligandenreagens. Nach der Kopplung werden keine Teile des Aktivierungsmittels zwischen dem Liganden und der Matrix hinterlassen, und dadurch ist SP1 nur eine Einfachbindung.
In anderen Fällen ist der Spacer SP1 ein integraler Bestandteil der die Bindungscharakteristika bewirkenden funktionellen Gruppe, d. h. des Liganden, und das wird besonders bedeutsam sein, wenn der Spacer SP1 funktionell aktive Stellen oder Substituenten wie Thiole, Amine, saure Reste, Nitrogruppen, Hydroxygruppen, Nitrigruppen oder andere Gruppen, die imstande sind, über eine Wasserstoffbindung, elektrostatische Bindung oder Abstoßung, Ladungsübertragung oder dergleichen in Wechselwirkung zu treten, umfasst.
In noch anderen Fällen kann der Spacer SP1 eine Benzimidazol-, Benzothiazol- oder Benzoxazolverbindung umfassen, welche eine bedeutende Rolle für die Bindungscharakteristika der Festphasenmatrix spielt. Das würde beispielsweise der Fall sein, wenn Chinone oder Chlortriazine als Aktivierungsmittel für die Festphasenmatrix oder den Liganden verwendet würden.
Der Spacer SP1 ist bevorzugt eine Einfachbindung oder ein Diradikal, abgeleitet von einem Aktivierungsmittel, ausgewählt aus Epichlorhydrin, Allylglycidylether, Bisepoxiden, wie Butandioldiglycidylether, halogensubstituierten aliphatischen Verbindungen, wie 1,3-Dichlorpropan-2-ol, Aldehyden, wie Glutardialdehyd, Chinonen, Cyanbromid, Chlortriazinen, wie Cyanurchlorid, 2-Fluor-1-methylpyridiniumtoluol-4-sulfonaten, Maleimiden, Oxazolonen und Hydraziden.
Der Spacer SP1 ist bevorzugt ausgewählt aus kurzkettigen aliphatischen Diradikalen, z. B. der Formel -CH₂-CH(OH)-CH₂- (abgeleitet von Epichlorhydrin), -(CH₂)₃-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-(abgeleitet von Allylglycidylether) oder -CH₂-CH(OH)-CH₂-O-(CH₂)₄-O-CH₂-CH(OH)-CH₂- (abgeleitet von Butandioldiglycidylether), oder einer Einfachbindung.
Wegen des Risikos des Auslaufens des Stoffes (z. B. des Liganden und/oder des Spacers) von einer Festphasenmatrix in das eluierte Produkt (z. B. das Immunglobulin) ist das Molekulargewicht des Liganden (oder des Liganden und des optionalen Spacers) günstigerweise so niedrig wie möglich zu wählen. Ein Hauptnachteil der Verwendung von Protein A, Protein G, synthetischen Peptiden und anderen Liganden mit relativ hohem Molekulargewicht (z. B. Farbstoffen) ist, dass es schwierig oder sogar unmöglich sein kann, aufgrund der geringen Differenz zwischen den jeweiligen Molekulargewichten und der natürlichen Tendenz der Komponenten, sich miteinander zu verbinden, einen freigesetzen Liganden (gegebenenfalls einschließlich des Spacers) vom eluierten Immunglobulin zu trennen. Das kann eine schädliche Auswirkung in jenen Fällen haben, in denen das Immunglobulin als ein therapeutisches Mittel verwendet werden soll, unter Verursachung eines allergischen Schocks oder anderer schwerer Symptome beim Patienten. Je kleiner das Molekulargewicht des Liganden (einschließlich seines Spacers) ist, umso wirksamer kann ein ausgelaufener Ligand von dem Immunglobulinprodukt getrennt werden. Ein weiterer bedeutender Vorteil des Vorliegens des kleinstmöglichen Molekulargewichts des Liganden (oder des Ligand-Spacer-Konjugats) ist, dass irgendein ausgelaufener Stoff, der vor der Injektion/Ingestion beim Patienten nicht vom Immunglobulin getrennt werden konnte, ein Minimum der Antigenität verursachen wird, je geringer das Molekulargewicht ist, und dadurch im Allgemeinen relativ besser verträglich für den Organismus als Liganden höheren Molekulgewichts sein wird.
Der Ligand L sollte deshalb ein Molekulargewicht unter 500 Dalton, bevorzugt unter 400 Dalton, stärker bevorzugt unter 300 Dalton, wie unter 250 Dalton, oder sogar unter 200 Dalton haben.
In Bezug auf das Ligand-Spacer-Konjugat (-SP1-L) ist bevorzugt, dass das Molekulargewicht unter 500 Dalton, stärker bevorzugt unter 400 Dalton, wie unter 300 Dalton, oder sogar unter 250 Dalton liegt.
Gemäß der Erfindung umfasst die Matrix Liganden, die es entweder allein oder in Kombination mit einem Spacer SP1 (und sogar dem Matrixgrundgerüst) ermöglichen, Immunglobuline zu binden. Es wurde gefunden, dass der Ligand aus Benzimidazolen, Benzothiazolen und Benzoxazolen ausgewählt ist, die einen oder mehrere Substituenten tragen können, von denen einer bevorzugt ein eine saure Einheit umfassender Substituent ist.
Auch wenn die Liganden hier und nachfolgend unter Verwendung der Nomenklatur entsprechend der einzelnen und eigenständigen chemischen Verbindung, von der sie abgeleitet sind, bezeichnet sind, sollte es selbstverständlich sein, dass der eigentliche Ligand L ein Rest einer derartigen Verbindung ist.
Basierend auf unseren vorläufigen Ergebnissen, werden jedoch besonders bevorzugt Matrizen verwendet, die Benzimidazole, wie 2-Aminobenzimidazol, 2-Mercaptobenzimidazol und 2-Mercapto-5-nitrobenzimidazol; Benzothiazole, wie 2-Aminobenzothiazol, 2-Amino-6- nitrobenzothiazol, 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercapto-6-ethoxybenzothiazol; Benzoxazole, wie 2-Mercaptobenzoxazol umfassen.
Die detaillierte Struktur des Liganden scheint wichtige funktionelle Charakteristika zu bestimmten, die für die Isolierung von Immunglobulinen aus verschiedenen Quellen relevant sind. Daher scheinen unterschiedliche Liganden, die entfernt oder nah miteinander in Zusammenhang stehende Strukturen umfassen, zu signifikanten Änderungen der Bindungsstärke, Bindungsselektivität, der Bindungskapazität und der Gesamtausbeute an Immunglobulin zu führen, wenn sie bei der Isolierung von Antikörpern aus verschiedenen Ausgangsmaterialien verwendet werden.
Zur Bindung der Immunglobuline bei einem pH-Wert nahe dem neutralen (etwa pH-Wert 5 bis pH-Wert 9) wird die Verwendung eines Liganden bevorzugt, der Reste umfasst, die sich von einem mit einem heteroaromatischen Ringsystem kondensierten Benzolring ableiten, z. B. eines Liganden, ausgewählt aus Benzimidazolen, wie 2-Mercaptobenzimidazol und 2-Mercapto-5-nitrobenzimidazol; Benzothiazolen, wie 2-Amino-6-nitrobenzothiazol, 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercapto-6-ethoxybenzothiazol; Benzoxazolen, wie 2-Mercaptobenzoxazol. Nicht zu der ersteren Gruppe der Liganden gehörend, aber ebenfalls zur Bindung der Immunglobuline bei einem pH-Wert nahe dem neutralen bevorzugt, sind Liganden, ausgewählt aus Thiophenolen, wie Thiophenol und 2-Aminothiophenol.
Daher, wie aus den vorstehenden und den hier gezeigten Ergebnissen ersichtlich, ist der Ligand L bevorzugt ausgewählt aus Resten der folgenden Formel -X-A-SUB wobei X -O-, -S- oder -NH- bezeichnet, A Benzimidazole, Benzothiazole und Benzoxazole bezeichnet und SUB einen oder mehrere Substituenten bezeichnet.
Es ist selbstverständlich, dass X ein wesentlicher Teil des Liganden ist, in dem die Benzimidazol-, Benzothiazol- oder Benzoxazolverbindung, die den Ligandenteil der Festphasenmatrix nach der Umsetzung mit einem aktivierten Matrixgrundgerüst bildet, eine Hydroxygruppe (X ist -O-), eine Mercaptogruppe (X ist -S-) oder eine Aminogruppe (X ist -NH-), die direkt an die Benzimidazole, Benzothiazole oder Benzoxazole gebunden ist, einschließen muss. Es sollte selbstverständlich sein, dass, wenn die Benzimidazol-, Benzothiazol- oder Benzoxazolverbindung beispielsweise sowohl eine Hydroxygruppe als auch eine Aminogruppe umfasst, die erhaltene Festphasenmatrix ein Gemisch aus Liganden, die an den Verknüpfer über die Aminogruppe bzw. über die Hydroxygruppe gebunden sind, umfassen kann.
Agarose-Matrixgrundgerüste und von Epoxyverbindungen abgeleitete Spacer sind besonders wichtig in Kombination mit diesen bevorzugten Ligandengruppen.
In Bezug auf die Substituenten an den Benzimidazolen, Benzothiazolen und Benzoxazolen umfasst SUB bevorzugt mindestens einen sauren Rest.
In einer besonders interessanten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst SUB mindestens einen Substituenten der folgenden Formel -SP2-ACID wobei SP2 einen optionalen zweiten Spacer bezeichnet und ACID einen sauren Rest bezeichnet.
In diesem Zusammenhang soll der Begriff "saurer Rest" Reste mit einem pK_s-Wert von weniger als etwa 6,0, wie eine Carbonsäuregruppe (-COOH), eine Sulfonsäuregruppe (-SO₂H), eine Sulfinsäuregruppe (-S(O)OH), eine Phosphinsäuregruppe (-PH(O)(OH)), Phosphonsäuremonoesterreste (-P(O)(OH)(OR)) und eine Phosphonsäuregruppe (-P(O)(OH)₂) bedeuten. Der pK_s-Wert des sauren Restes sollte bevorzugt im Bereich von 1,0 bis 6,0 liegen.
Der saure Rest ist bevorzugt aus Carbonsäure, Sulfonsäure und Phosphonsäure ausgewählt.
Der Rest SP2 ist aus einem C_1-6-Alkylen- und einem C_2-6-Alkenylenrest ausgewählt oder SP2 bezeichnet eine Einfachbindung. Beispiele für relevante Diradikale sind Methylen, Ethylen, Propylen, Propenylen, Isopropylen und Cyclohexylen. SP2 bezeichnet bevorzugt Methylen, Ethenylen oder eine Einfachbindung.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezeichnet SUB einen Rest -SP2-ACID. In diesem Fall ist SP2 vorzugsweise eine Einfachbindung.
SUB kann jedoch einen Substituenten -SP2-ACID sowie einen oder mehrere weitere Substituenten bezeichnen, unabhängig voneinander ausgewählt aus einer Hydroxy-, Amino-, Cyanogruppe, einem Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminorest, einem Halogenatom wie Iod, Brom, Chlor und Fluor, einer Sulfanyl-, Nitrogruppe, einem C_1-6-Alkylcarboxy- und Aminocarboxyrest, einem Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarboxyrest, einer Carboxy-, Sulfono-, Sulfonamidgruppe, einem Phosphonsäureesterrest mit einem C_1-6-Alkylrest, einem gegebenenfalls substituierten C_1-12-Alkylrest, einem gegebenenfalls substituierten C_2-12-Alkenylrest, einem gegebenenfalls substituierten C_1-12-Alkinylrest und einem gegebenenfalls substituierten C_1-12-Alkoxyrest, einem Thioesterrest, oder der Substituent ist ein Sauerstoffatom, welches gemeinsam mit zwei Valenzen eines Kohlenstoffatoms der aromatischen oder heteroaromatischen Einheit eine Oxogruppe bildet. Außerdem kann SUB einen weiteren wie vorstehend bestimmten Rest -SP2-ACID bezeichnen. Es sollte selbstverständlich sein, dass die für SUB definierten Substituenten den optionalen Substituenten für L entsprechen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet SUB einen Substituenten -SP2-ACID sowie einen oder mehrere weitere Substituenten, unabhängig voneinander ausgewählt aus einer Hydroxy-, Amino-, Cyanogruppe, einem Halogenatom, einer Sulfanyl-, Nitrogruppe, einem gegebenenfalls substituierten C_1-6-Alkylrest, einer Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isobutyl- und Cyclohexylgruppe, einem gegebenenfalls substituierten C_2-6-Alkenylrest, einem gegebenenfalls substituierten C_2-6-Alkinylrest, einem gegebenenfalls substituierten C_1-6-Alkoxyrest, einer Carboxy- und Sulfonogruppe, oder der Substituent ist ein Sauerstoffatom, welches gemeinsam mit zwei Valenzen eines Kohlenstoffatoms der aromatischen oder heteroaromatischen Einheit eine Oxogruppe bildet. Auch in diesem Fall bezeichnet SP2 bevorzugt eine Methylen-, Ethenylengruppe oder eine Einfachbindung, vorzugsweise eine Einfachbindung.
In diesem Zusammenhang soll der Begriff "C_1-12-Alkylrest" Alkylreste mit 1–12 Kohlenstoffatomen bedeuten, die geradkettig oder verzweigt oder cyclisch sein können, wie eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Octyl-, Dodecyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Decalinylgruppe usw.
Der Begriff "gegebenenfalls substituierter C_1-12-Alkylrest" soll einen C_1-12-Alkylrest bedeuten, der mit einem oder mehreren, bevorzugt 1–3, Resten substituiert sein kann, ausgewählt aus einer Carboxygruppe; einer geschützten Carboxygruppe, wie einem Carboxyesterrest, z. B. einem C_1- ₆-Alkoxycarbonylrest; einem Aminocarbonylrest; einem Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminocarbonylrest; einem Amino-C_1-6-alkylaminocarbonylrest; einem Mono- und Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonylrest; einer Aminogruppe; einem Mono- und Di(C_1-6-alkyl)aminorest; einem C_1-6-Alkylcarbonylaminorest; einer Hydroxygruppe; einer geschützten Hydroxygruppe, wie einer Acyloxygruppe, z. B. C_1-6-Alkanoyloxyrest; einer Sulfonogruppe; einem C_1-6-Alkylsulfonyloxyrest; einer Nitrogruppe; einer Phenylgruppe; einem Phenyl-C_1-6-Alkylrest; einem Halogenatom; einer Nitrilogruppe und einer Mercaptogruppe.
Beispiele für substituierte C_1-12-Alkylreste sind ein Carboxy-C_1-12-alkylrest (z. B. Carboxymethyl- und Carboxyethylgruppe), ein geschützter Carboxy-C_1-12-alkylrest, wie ein veresterter Carboxy-C_1-6-alkylrest (z. B. ein C_1-6-Alkoxycarbonyl-C_1-12-alkylrest, wie Methoxycarbonylmethyl-, Ethoxycarbonylmethyl- und Methoxycarbonylethylgruppe), ein Aminocarbonyl-C_1-12-alkylrest (z. B. Aminocarbonylethyl-, Aminocarbonylethyl- und Aminocarbonylpropylgruppe), ein C_1-6-Alkylaminocarbonyl-C_1-12-alkylrest (z. B. Methylaminocarbonylmethyl- und Ethylaminocarbonylmethylgruppe), ein Amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl-C_1-12-alkylrest (z. B. Aminomethylaminocarbonylmethyl- und Aminoethylaminocarbonylmethylgruppe), ein Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-6-alkylaminocarbonyl-C_1-12-alkylrest (z. B. Dimethylaminomethylaminocarbonylmethyl- und Dimethylaminoethylaminocarbonylmethylgruppe), ein Mono- oder Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-12-alkylrest (z. B. Dimethylaminomethyl- und Dimethylaminoethylgruppe), ein Hydroxy-C_1-12-alkylrest (z. B. Hydroxymethyl- und Hydroxyethylgruppe), ein geschützter Hydroxy-C_1-12-alkylrest, wie ein Acyloxy-C_1-12-alkylrest (z. B. ein C_1-6-Alkanoyloxy-C_1-12-alkylrest, wie Acetyloxyethyl-, Acetyloxypropyl-, Acetyloxybutyl-, Acetyloxypentyl-, Propionyloxymethyl-, Butyryloxymethyl- und Hexanoyloxymethylgruppe).
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "C_2-12-Alkenylrest" einfach, zweifach oder mehrfach ungesättigte Alkylreste mit 2–12 Kohlenstoffatomen bedeuten, die geradkettig oder verzweigt oder cyclisch sein können, in welchen die Doppelbindungen) überall in der Kette oder dem/den Ringen) vorliegen kann können, z. B. Vinyl-, 1-Propenyl-, 2-Propenyl-, Hexenyl-, Decenyl-, 1,3-Heptadienyl-, Cyclohexenylgruppe usw. Einige der Substituenten existieren sowohl in einer cis- als auch in einer trans-Konfiguration. Der Umfang der Erfindung umfasst sowohl die cis- als auch die trans-Formen.
In vorliegendem Zusammenhang soll der Begriff "C_2-12-Alkinylrest" einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest mit 2–12 Kohlenstoffatomen und das Einbringen einer oder mehrerer Dreifachbindungen bedeuten, z. B. Ethinyl-, 1-Propinyl-, 2-Butinyl-, 1,6-Heptadiinylgruppe usw.
Bei den Ausdrücken "gegebenenfalls substituierter C_2-12-Alkenylrest" und "gegebenenfalls substituierter C_2-12-Alkinylrest" soll der Begriff " gegebenenfalls substituiert" bedeuten, dass die Einheit einmal oder mehrmals, vorzugsweise 1- bis 3-mal, mit einem der vorstehend für den "gegebenenfalls substituierten C_1-12-Alkylrest" definierten Reste substituiert sein kann.
Der Begriff "gegebenenfalls substituierter C_1-12-Alkoxylrest" bezeichnet, wie bei der herkömmlichen chemischen Nomenklatur, einen gegebenenfalls substituierten C_1-12-Alkyl-oxyrest, der einmal oder mehrmals, vorzugsweise 1- bis 3-mal, mit den für den vorstehend beschriebenen "gegebenenfalls substituierten Alkylrest" angezeigten Substituenten substituiert sein kann.
Die Begriffe "C_1-6-Alkylrest", "C_2-6-Alkenylrest", "C_2-6-Alkinylrest" und "C_1-6-Alkoxyrest" spiegeln die kürzeren Analoga von "C_1-12-Alkylrest", "C_2-12-Alkenylrest", "C_2-12-Alkinylrest" und "C_1-12-Alkoxyrest" wider.
Die Begriffe "C_1-6-Alkylenrest" und "C_2-6-Alkenylenrest" sollen Diradikale der für den "C_1-6-Alkylrest" bzw. "C_2-6-Alkenylrest" definierten Reste bedeuten.
Die vorliegende Erfindung sollte nicht an eine spezielle Theorie gebunden sein, man stellt sich jedoch vor, dass die spezielle Elektronenkonfiguration der Benzimidazole, Benzothiazole und Benzoxazole in Kombination mit einem oder mehreren Heteroatomen, welche sich im heteroaromatischen Ringsystem oder als ein Substituent daran befinden, sowohl an der spezifischen Bindung von Immunglobulinen als auch an der Bindung anderer Proteine beteiligt ist.
Daher umfasst der Ligand in einer interessanten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mindestens ein Stickstoff-, Schwefel- oder Phosphoratom, z. B. als ein Ringatom oder als ein Substituent am (hetero)aromatischen Ring, wie eine Amino- oder Nitrogruppe oder eine Sulfonsäuregruppe oder eine Phosphonsäuregruppe.
Eine besonders interessante Kombination von Substituenten scheint jede Kombination aus mindestens einer Amino- oder Mercaptogruppe mit mindestens einem sauren Rest, ausgewählt aus Carbonsäuren, Sulfonsäuren und Phosphonsäuren, zu sein.
Man stellt sich vor, dass eine Kombination aus zwei oder mehr Liganden des hier definierten Typs an demselben Matrixgrundgerüst zu bestimmten Vorteilen in Bezug auf eine hohe Bindungseffizientz und/oder hohe Reinheit des Immunglobulins führen kann.
In einer wichtigen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind jedoch alle funktionellen Gruppen auf der Festphasenmatrix im Wesentlichen identisch.
Es kann außerdem festgestellt werden, dass die Bindungseffizienz und Produktreinheit durch Kopplung des Liganden an eine Matrix, die bereits negativ oder positiv geladene Einheiten, wie positiv geladene Aminogruppen oder negativ geladene Carbonsäure-, Sulfonsäure- oder Phosphonsäuregruppen, umfasst, erhöht werden.
Die Ligandkonzentration kann auch für die funktionellen Charakteristika einer erfindungsgemäßen Matrix von größerer Bedeutung sein, z. B. ein Ligand kann einen hohen Grad der selektiven Bindung von Immunglobulinen bei einer Ligandkonzentration zeigen, während eine Erhöhung der Ligandkonzentration zu einer Abnahme der Bindungsselektivität führt. Wie einem Fachmann gut bekannt, können zu hohe Ligandkonzentrationen zu einer starken Bindung von unerwünschten Verunreinigungen über den Mechanismus von Mehrfachbindungsstellen führen, weil die Liganden zu dicht auf dem Festphasenmatrixgrundgerüst verteilt sind. Wenn die Ligandkonzentration niedrig gehalten wird, werden die Liganden mit größeren Abständen angeordnet sein, und deshalb wird das Binden von Verunreinigungen über die Bindung an Mehrfachbindungsstellen nicht ablaufen.
Ein weiterer negativer Effekt zu hoher Ligandkonzentration ist das Risiko der Bindung von gewünschtem Protein, z. B. dem Immunglobulin, durch Mehrfachbindungsstellen. Solch eine Mehrfachbindung kann zu Schwierigkeiten beim Freisetzen des Proteins, z. B. des Immunglobulins, mit einem geeigneten Elutionspuffer führen. In einigen Fällen kann es sogar notwendig sein, starke Denaturierungsbedingungen und/oder organische Lösungsmittel zur Freisetzung des Produkts von derartigen zu stark substituierten Festphasenmatrizen zu benützen – unter Abnahme der biologischen Aktivität als Folge.
Die Ligandkonzentration der Festphasenmatrizen kann auf verschiedene Arten offenbart werden. Eine Art der Beschreibung der Ligandkonzentration ist es, die pro Gramm Trockenmaterial vorhandene Ligandmenge zu offenbaren (z. B. in μmol/g Trockenmaterial). Das ist das direkt erhaltene Ergebnis, wenn die Ligandkonzentration beispielsweise durch Elementaranalyse der getrockneten (z. B. gefriergetrockneten) Proben der Festphasenmatrix gemessen wird. Die Ligandkonzentration kann jedoch auch als die auf 1 ml feuchte und sedimentierte Festphasenmatrix vorhandene Ligandmenge offenbart werden (oft auch als 1 ml gepackte (packed bed) Matrix bezeichnet). Das ist eine Zahl, die aus einer auf die getrocknete Festphasenmatrix (z. B. μmol/g Trockenmaterial) bezogene Messung leicht berechnet werden kann, wenn gleichzeitig der Trockenmaterialgehalt der hydratisierten Festphasenmatrix bestimmt wird (d. h. Gramm Trockenmaterial/ml feuchte sedimentierte Festphasenmatrix). Noch eine weitere Art des Offenbarens der Ligandkonzentration ist die in ein Gramm feuchter, aber durch Absaugen abgetropfter Matrix vorhandene Ligandmenge. Diese Zahl wird wiederum leicht aus einer auf Trockenmaterial bezogenen Messung berechnet, wenn gleichzeitig der Trockenmaterialgehalt der Festphase pro Gramm feuchte, aber durch Absaugen abgetropfte Matrix bestimmt wird.
Daher liegt die Ligandkonzentration der erfindungsgemäßen Festphasenmatrizen bevorzugt im Bereich von 10–990 μmol/g Trockenmaterial der Festphasenmatrix, wie 100–990 μmol/g, stärker bevorzugt 200–980 μmol/g, insbesondere 250–975 μmol/g; oder
die Ligandkonzentration der erfindungsgemäßen Festphasenmatrizen liegt bevorzugt im Bereich von 1–145 μmol/ml hydratisierte, sedimentierte Festphasenmatrix, wie 10–120 μmol/ml, stärker bevorzugt 15–100 μmol/ml, insbesondere 20–80 μmol/ml; oder d
ie Ligandkonzentration der erfindungsgemäßen Festphasenmatrizen liegt bevorzugt im Bereich von 1–130 μmol/g feuchte, aber durch Absaugen abgetropfte Festphasenmatrix, wie 10–110 μmol/g, stärker bevorzugt 20–100 μmol/g, insbesondere 20–90 μmol/g.
Deshalb müssen die Festphasenmatrizen, die im Umfang der vorliegenden Erfindung nützlich sind, mindestens die Kriterien (a) und (c) oder die Kriterien (b) und (c) erfüllen. Vorzugsweise sind alle drei Kriterien erfüllt.
Was Kriterium (a) betrifft, ist es in Kombination mit den anderen hier dargestellten Kriterien oder als eine Alternative dazu sehr erwünscht, dass die Festphasenmatrix eine Bindungseffizienz von mindestens 50% aufweist, wenn bei einem pH-Wert im Bereich von 2,0 bis 10,0 in dem hier beschriebenen "Standard-Immunglobulinbindungstest" getestet wird. Es wird angenommen, dass das Bindungseffizienzmaximum (welches ziemlich genau, bis auf eine halbe pH-Einheit, durch Testen der Bindungseffizienz über einen pH-Bereich unter Verwendung von z. B. Erhöhungen um 0,5 pH-Einheiten abgeschätzt werden kann) der meisten erfindungsgemäßen Matrizen im Bereich von 3,0 bis 9,0, z. B. im Bereich von 3,0 bis 7,0 oder im Bereich von 6,0 bis 9,0 in Abhängigkeit von der Beschaffenheit des Liganden liegt.
Es wurde festgestellt, dass die Bindungseffizienz beim pH-Wert 4,5 und beim pH-Wert 7,0 besonders wichtig ist, wenn eine allgemeine Einschätzung einer Festphasenmatrix zur Isolierung von Immunglobulinen vorgenommen wird, daher bezieht sich die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform auf eine Festphasenmatrix mit einer Bindungseffizienz von mindestens 50% beim pH-Wert 4,5 oder beim pH-Wert 7,0 in dem hier beschriebenen "Standard-Immunglobulinbindungstest".
Deshalb weist die Festphasenmatrix in einer besonders interessanten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Bindungseffizienz von mindestens 50%, bevorzugt mindestens 60%, stärker bevorzugt mindestens 70%, insbesondere mindestens 80%, wie mindestens 90% in dem hier beschriebenen "Standard-Immunglobulinbindungstest" auf, bei mindestens einem pH-Wert des Lösungsmittels im Bereich von pH-Wert 1,0 bis pH-Wert 11,0, besonders im Bereich von pH-Wert 3,0 bis pH-Wert 9,0, und ganz besonders beim pH-Wert 4,5 oder 7,0.
Außerdem ist es auch das Ziel der vorliegenden Erfindung, Festphasenmatrizen zur Verfügung zu stellen, die einen großen Bereich von Immunglobulinen binden können, so dass sich der Endbenutzer auf eine Festphasenmatrix anstelle einiger Produkte, die für jeden Klon von Immunglobulinen einzeln getestet werden müssen, verlassen kann.
Daher weist die Festphasenmatrix, was Kriterium (b) betrifft, bevorzugt eine durchschnittliche Bindungseffizienz von mindestens 50%, wie mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, insbesondere mindestens 90%, für die Immunglobuline auf, die im "Monoklonalen Antikörperarray-Bindungstest" getestet werden, wenn bei einem pH-Wert im Bereich von 2,0 bis 10,0, wie im Bereich von 3,0 bis 9,0, z. B. im Bereich von 3,0 bis 7,0 oder im Bereich von 6,0 bis 9,0, getestet wird. Typischerweise wird die Bindungseffizienz bei zwei pH-Werten, z. B. beim pH-Wert 4,5 und pH-Wert 7,0, gemessen, und das Optimum wird dann durch Verändern des pH-Werts in Stufen von 0,5 in der Nähe des einen der beiden pH-Werte, der die vielversprechendste Bindungseffizienz ergibt, festgestellt.
Die funktionelle Stabilität der Matrix, welche in Bezug auf das geringere Risiko des Auswaschens und die Möglichkeit der Regenerierung interessant und wichtig ist, kann durch die chemische Struktur des Liganden beeinflusst werden, d. h. die Stabilität gegen harte Regenerierungsbedingungen, wie 1 M Natriumhydroxid, ist sowohl von der Ligandstruktur als auch vom Matrixgrundgerüst und von jeglicher Spacereinheit abhängig.
Deshalb wird, was Kriterium (c) betrifft, bevorzugt, dass die Stabilität (siehe Beispiel 8) der Festphasenmatrix in 1 M NaOH so ist, dass Inkubation der Matrix in 1 M NaOH in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 7 Tage die Bindungseffizienz bei einem pH-Wert im Bereich von einer pH-Einheit unterhalb des pH-Werts des Bindungsmaximums bis zu einer pH-Einheit oberhalb des pH-Werts des Bindungsmaximums, wie in dem hier beschriebenen "Standard-Immunglobulinbindungstest" bestimmt, um weniger als 50%, bevorzugt weniger als 25%, im Vergleich zu einer entsprechenden unbehandelten Matrix verringert. Vorzugsweise beträgt die Abnahme weniger als 15%, wie weniger als 10%, insbesondere weniger als 5%.
Synthese von Festphasenmatrizen
Im Allgemeinen kann eine Festphasenmatrix durch an sich bekannte Verfahren, z. B. Aktivierung der Festphasenmatrix mit einem geeigneten, an sich bekannten Reagens, gefolgt von Kopplung des Liganden an die aktivierte Matrix, gegebenenfalls Einbringen eines Spacers SP1 zwischen dem Liganden und der Matrix zunächst durch Kopplung des Spacers an die aktivierte Matrix, gefolgt von Kopplung des Liganden an den Spacer über ein geeignetes Kondensationsreagens oder sogar eine zweite Aktivierung des Spacers, gefolgt von Kopplung des Liganden derivatisiert werden, damit sie kovalent gebundene Liganden gemäß der Erfindung umfasst.
Die Reihenfolge und Auswahl der Reagenzien kann vom konkreten anzukoppelnden Liganden und dem Festphasenmaterial abhängen, das unter Berücksichtigung z. B. des Gehalts an reaktiven Gruppen wie Hydroxyl-, Amino-, Mercapto- und Silanolgruppen usw. zu derivatisieren ist. In einigen Fällen kann es bevorzugt sein, den Liganden anstelle der Festphasenmatrix zu aktivieren oder derivatisieren, gefolgt von einer Umsetzung des derivatisierten Liganden mit der Festphasenmatrix.
Daher wird in einem bevorzugten Verfahren zum Synthetisieren einer erfindungsgemäßen Festphasenmatrix die Festphasenmatrix zuerst mit einem Reagens umgesetzt, das mit der Festphasenmatrix reagieren und sie dadurch für eine weitere Umsetzung mit dem Liganden aktivieren kann, gegebenenfalls das Aktivierungsmittel ausgewaschen, gefolgt von einer Umsetzung der aktivierten Festphasenmatrix mit einer den Liganden umfassenden Lösung und gegebenenfalls gefolgt von Waschen der Festphasenmatrix, die den kovalent immobilisierten Liganden umfasst, mit einem oder mehreren geeigneten Lösungen zur Reinigung der Matrix von überschüssigen Reaktanten.
In einigen Fällen kann es möglich sein, die Aktivierung und die Kopplung des Liganden durch Mischen von zwei Reagenzien und durch paralleles Ablaufenlassen der Umsetzungen zu kombinieren. Das ist ein großer Vorteil, weil das sowohl Kosten und Zeit spart als auch das Abwasservolumen minimiert. Deshalb werden der Aktivierungs- und Kopplungsschritt vorzugsweise in einem kombinierten Schritt durchgeführt.
Außerdem ist es ein bedeutender Vorteil, wenn die Aktivierungs- und/oder Kopplungsreaktion vollzogen werden können, ohne dass dem Reaktionsmedium organische Lösungsmittel zugesetzt werden müssen. Diese organischen Lösungsmittel werden oft verwendet, um die reaktiven Reagenzien löslich zu machen oder um zu gewährleisten, dass die Hydrolyse reaktiver Arten auf einem Minimum gehalten wird. Die Verwendung organischer Lösungsmittel erhöht jedoch die Kosten und Risiken des Verfahrens wegen der Explosionsgefahr, des Risikos von Gesundheitsschäden, der Abfallprobleme und der relativ hohen Preise der Lösungsmittel selbst. Deshalb wird das Aktivierungs- und/oder Kopplungsverfahren bevorzugt ohne den Zusatz irgendeines organischen Lösungsmittels zum Reaktionsmedium durchgeführt.
BEISPIELE
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele 1–15 veranschaulicht:
1. Derivatisierung von Festphasen
1A) Aktivierung von Agarosekügelchen mit Epichlorhydrin
Aktivierung von Agarosekügelchen von Hispanagar:
"Hohes" Aktivierungsniveau:
Ungefähr 1000 ml einer 1 : 1 Suspension von Agarosekügelchen in Wasser (Hispanagar, 6% Agarosekügelchen, Partikelgröße: 100–140 μm) wurden auf einem Sinterglastrichter mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von Absaugentwässerung über eine Minute. 700 g feuchte, aber abgetropfte Agarosekügelchen wurden in ein Gemisch aus 560 ml Wasser und 70 ml 32,5% Gew./Vol. NaOH eingewogen. Dieser Suspension wurden dann 90 ml Epichlorhydrin (ALDRICH, Kat.-Nr.: E105-5) zugesetzt, gefolgt von leichtem Rühren mit einem Flügelrührer bei Raumtemperatur (20–25°C) über 6 Stunden. Die Agarosekügelchen wurden dann auf einem Saugfilter mit ungefähr 20 1 Wasser gewaschen gewaschen und schließlich in Wasser suspendiert. Es wurde festgestellt, dass die aktivierten Agarosekügelchen in dieser Suspension mehrere Wochen haltbar waren, wenn sie bei 4°C gelagert wurden.
Die Konzentration aktiver Epoxygruppen auf den aktivierten Agarosekügelchen wurde durch Thiosulfattitration bestimmt, wie beschrieben in J. Porath, T. Låås, J.-C. Janson, Journal of Chromatography 1975, Bd. 103, S. 49–69 und in L. Sundberg & J. Porath, Journal of Chromatography 1974, Bd. 90, S. 87–98. Die Ergebnisse aus dieser Titration zeigten an, dass die aktivierten Kügelchen eine Konzentration von 70 μmol Epoxygruppen pro Gramm feuchte, aber durch Absaugen abgetropfte Kügelchen, 972 μmol/g Trockenmaterial oder 54 μmol/ml feuchte, sedimentierte Kügelchen (wässrige Lösung) entsprechend, aufwiesen.
"Niedriges " Aktivierungsniveau:
Zur Herstellung einer Matrix mit einem geringerem Gehalt aktiver Epoxygruppen wurde dasselbe Verfahren wie vorstehend beschrieben befolgt, mit der Ausnahme, dass das Reaktionsgemisch aus 200 g feuchten, aber abgetropfte Agarosekügelchen, 160 ml Wasser, 20 ml 2 M Natriumhydroxid und 11,5 ml Epichlorhydrin bestand.
Die Thiosulfattitration zeigte das Vorhandensein von 21 μmol Epoxygruppen pro Gramm feuchte, aber durch Absaugen abgetropfte Kügelchen, 292 μmol/g Trockenmaterial oder 16 μmol/ml feuchte sedimentierte Kügelchen (wässrige Lösung) entsprechend, an.
Aktivierung von Agarosekügelchen von Pharmacia und Biorad:
Dasselbe Aktivierungsverfahren wie vorstehend beschrieben wurde zur Aktivierung von Agarosekügelchen von Pharmacia (Sepharose 4B und Sepharose 6B) und Biorad (Gel Biogel A– 5m, Partikelgröße: 38–75 μm und Gel Biogel A–15m, Partikelgröße: 75–150 μm) verwendet.
Die Titration aktiver Epoxygruppen auf diesen Festphasen lieferte die folgenden Ergebnisse: μmol Epoxygruppen pro Gramm abgetropfte Kügelchen:

Sepharose 4B: 40

Sepharose 6B: 52

Gel Biogel A–5m: 65

Gel Biogel A–15m: 46
1B) Aktivierung von Fractogel mit Epichlorhydrin
Fractogel TSK HW-55 (F), Partikelgröße: 32–63 μm, von MERCK (Kat.-Nr.: 14981) und Fractogel TSK HW-65 (F), Partikelgröße: 32–63 μm, MERCK (Kat.-Nr.: 14984) wurden mit Epichlorhydrin mit demselben Verfahren wie vorstehend für Agarosekügelchen beschrieben aktiviert. Die erhaltene Konzentration aktiver Epoxygruppen auf diesen Festphasen betrug 98 bzw. 53 μmol/g abgetropfte Kügelchen.
1C) Aktivierung von Agarosekügelchen mit Butandioldiglycidylether
100 g 6% Agarosekügelchen von Hispanagar wurden auf einem Sinterglastrichter mit Wasser gewaschen und eine Minute durch Absaugen abgetropft. Die Kügelchen wurden in 75 ml 0,6 M NaOH suspendiert und nachfolgend 75 ml 1,4-Butandioldiglycidylether hinzugefügt. Leichtes Rühren mit einem Flügelrührer wurde bei Raumtemperatur über 18 Stunden vollzogen, wonach die Matrix mit Wasser (ca. 3 l) gewaschen wurde.
Die Thiosulfattitration der Menge der in die Matrix eingebrachten Epoxygruppen ergab einen Gehalt von 55 μmol/g durch Absaugen abgetropfte Matrix.
1E) Kopplung von Liganden an aktivierte Matrizen
Generelles Kopplungsverfahren:
Alle Kopplungen unterschiedlicher Liganden an die im Beispiel 1A–D erwähnten aktivierten Matrizen wurden nach dem folgenden allgemeinen Verfahren ausgeführt:

1) Die aktivierten Kügelchen wurden mit 2–3 Volumenteilen entmineralisierten Wassers gewaschen. Die Kügelchen wurden durch leichtes Absaugen auf einem Sinterglastrichter abgetropft, und 20 g feuchtes, aber abgetropftes Gel wurden in eine 100-ml-Kunststoffflasche mit Schraubverschluss eingewogen.
2) 1 g des Liganden wurde in 20 ml Wasser gelöst und mit 2 M Natriumhydroxid auf pH-Wert 10,5–11,0 titriert (bei einigen Liganden mit geringer Löslichkeit wurde der pH-Wert auf pH-Wert 11,5–12,5 eingestellt). Die so erhaltene Lösung wurde mit der aktivierten Matrix vermischt. Das Gel wurde mit der Lösung unter leichtem Vermischen auf einem Rollenmischer 18 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
3) Das Gel wurde dann mit 2 l Wasser gewaschen.

In jenen Fällen, in denen der Ligand eine schlechte Löslichkeit in Wasser aufwies, wurde stattdessen eine 50%ige Ethanollösung zum Auflösen verwendet, gefolgt von Titration mit 2 M Natriumhydroxid auf pH-Wert 10,5–11,0. In denselben Fällen wurde das letzte Waschen mit Wasser durch einen Waschschritt mit 1 l 50%igem Ethanol, gefolgt von einem weiteren Waschschritt mit 1 l Wasser, ersetzt.
Wann immer möglich, wurde die Konzentration des an die Matrizen gekoppelten Liganden durch Elementaranalyse von Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel bestimmt. In einigen Fällen war es außerdem möglich, die Menge des gekoppelten Liganden durch Säure-Base-Titration der charakteristischen funktionellen Gruppen am gekoppelten Liganden zu ermitteln.
Kopplung von Liganden an epoxyaktivierte Agarosekügelchen, 6%:
Die folgenden chemischen Substanzen (Liganden) wurden an mit Epichlorhydrin aktivierte 6% Agarosekügelchen (Beispiel 1A) (Hispanagar, Partikelgröße: 100–140 μm) gemäß dem nachstehend angegebenen generellen Kopplungsverfahren gekoppelt:
2-Mercaptobenzimidazol, 2-Mercapto-5-nitrobenzimidazol, 2-Amino-6-nitrobenzothiazol, 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercaptobenzoxazol.
Die durch Elementaranalyse gefriergetrockneter Proben auf den jeweiligen Matrizen bestimmten Ligandkonzentrationen lagen allgemein alle im Bereich zwischen 50 und 70 μmol Ligand pro Gramm feuchte, aber durch Absaugen abgetropfte Matrix.
1F) Koppeln von Liganden an verschiedene Festphasen
Die folgenden anderen Festphasen: epoxyaktivierte Agarosekügelchen von Hispanagar, aktiviert auf einem niedrigen Niveau (Beispiel 1A), epoxyaktivierte Agarosekügelchen von Pharmacia und Biorad (Beispiel 1A), epoxyaktiviertes Fractogel von Merck (Beispiel 1B) und mit Butandioldiglycidylether aktivierte Agarosekügelchen von Hispanagar (Beispiel 1C) wurden jeweils mit 2-Mercaptobenzimidazol (2-MBI) gekoppelt.
Dem vorstehend im Beispiel 1E beschriebenen allgemeinen Kopplungsverfahren wurde bei allen Kopplungen gefolgt.
Die erhaltenen Ligandkonzentrationen wurden durch Elementaranalyse gefriergetrockneter Proben auf den jeweiligen Matrizen ermittelt und als μmol Ligand pro Gramm feuchte, aber durch Absaugen getrocknete Matrix berechnet und angegeben (1 g feuchte, aber durch Absaugen getrocknete Matrix entspricht ca. 1,1–1,3 ml sedimentierter Kügelchen, während der Trockenmaterialgehalt zwischen den verschiedenen Kügelchentypen erheblich mehr variieren kann).
Ligandkonzentration für die synthetisierten Festphasenmatrizen: (angegeben als μmol/g feuchte, aber durch Absaugen getrocknete Kügelchen)
Epoxyaktivierte Agarosekügelchen von Hispanagar, aktiviert auf einem niedrigen Nivau (Beispiel 1A):
Epoxyaktivierte Agarosekügelchen von Pharmacia und Biorad (Beispiel 1A)
Epoxyaktiviertes Fractogel von Merck (Beispiel 1B):
Mit Butandioldiglydidylether aktivierte Agarosekügelchen von Hispanagar (Beispiel 1C):
2. Standard-Immunglobulinbindungstest
Um all die verschiedenen gemäß Beispiel 1 hergestellten Festphasenmaterialien zu testen, wurde ein standardisierter Test, der jederzeit reproduziert werden kann, entwickelt. Der Test wird konzipiert, um die Immunglobulinbindungseffizienz der verschiedenen Matrizen unter standardisierten Bedingungen in Bezug auf die Zusammensetzung und den pH-Wert des Ausgangsmaterials zu ermitteln.
Um die maximale Relevanz des Tests zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern aus verdünnten Zellkulturüberständen zu gewährleisten, haben wir die zur Kultivierung von Hybridoma-Zellen verwendeten Bedingungen durch Mischen eines typischen Zellkulturmediums mit fötalem Kälberserum simuliert und diesem "künstlichen Kulturüberstand" gereinigtes Mausimmunglobulin zugesetzt. Alle Reagenzien sind Standardreagenzien und im Handel erhältlich.
Definition des "künstlichen Kulturüberstands ":
Für 250 ml Lösung:
236,5 ml Zellkulturwachstumsmedium, DMEM (Imperial, Großbritannien, Kat.-Nr.: 7-385-14), 12,5 ml fötales Kälberserum (Life Technologies, Dänemark, Kat.-Nr.: 10106-060), 1,0 ml gereinigtes polyklonales murines IgG (Sigma, USA, Kat.-Nr.: I-8765, 10 mg/ml), 0,244 g Natriumazid (Sigma, USA, Kat.-Nr.: 5-2002),
resultierend in einer Lösung, die 40 μg murines IgG/ml, 5% fötales Kälberserum und 15 ml Natriumazid enthält und einen pH-Wert von ca. 8,0 aufweist.
Es zeigt sich, dass die Lösung bei 4°C über mehrere Wochen ohne irgendeine Schädigung der Immunglobuline stabil ist.
Standardverfahren:
Ungefähr 100 mg der zu testenden Matrix werden auf einem Sinterglastrichter mit 10 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von Absaugentwässerung über 60 Sekunden. 100 mg feuchte (abgetropfte) Festphasenmatrix werden in ein 3,0-ml-Reagenzglas eingewogen, und 2,50 ml "künstlicher Kulturüberstand" mit dem pH-Wert, bei dem die Matrix zu testen ist, werden hinzugegeben. Das Reagenzglas wird mit einem Stopfen verschlossen, und die Suspension wird auf einem Rollenmischer 2 Stunden bei Raumtemperatur (20–25°C) inkubiert. Das Reagenzglas wird dann 5 Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um die Matrix zu sedimentieren. Der Überstand wird anschließend aus der Festphasenmatrix durch Pipettieren in ein separates Reagenzglas abgetrennt, unter Vermeidung des Verschleppens irgendwelcher Matrixteilchen. Nachfolgend wird eine Bestimmung der Konzentration des ungebundenen Immunglobulins in dem Überstand durch einfache radiale Immundiffusion (wie durch D. Catty und C. Raykundalia "Antibodies – a practical approach" 1988, I, 137–168 beschrieben) unter Verwendung von Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulinen als ausfällendem Antikörper (DAKO, Dänemark, Kat.-Nr.: Z109) durchgeführt.
Der prozentuale Anteil des an die Matrix gebundenen Mausimmunglobulins wird dann gemäß der folgenden Formel berechnet: Gebundener prozentualer Anteil = (1 – (Konzentration Überstand/Konzentration Ausgangsmaterial)) × 100%
Die Genauigkeit dieses Verfahrens ist besser als +/- 5%.
2A) Untersuchung auf hohe Immunglobulinbindungseffizienz
Das vorstehend beschriebend Standardverfahren zur Untersuchung der Bindungseffizienz wurde zum Testen eines großen Bereichs verschiedener Festphasenmatrizen, die auf mit Epichlorhydrin aktivierten 6% Agarosekügelchen von Hispanagar basieren und gemäß Beispiel 1A und 1E synthetisiert wurden, verwendet.
Die Ergebnisse des beim pH-Wert 4,5 bzw. pH-Wert 7,0 durchgeführten Bindungstests sind in der nachstehenden Tabelle I dargelegt:
Tabelle I
Wie aus dem Ergebnis von 1-Aminocyclohexancarbonsäure (Referenz) zu ersehen ist, scheint eine aromatische oder heteroaromatische Einheit für eine effiziente Bindung notwendig zu sein.
3. Monoklonaler Antikörperarray-Bindungstest
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Unterschiede in der Bindungseffizienz zwischen Festphasenmatrizen nach dem Stand der Technik und den erfindungsgemäßen Festphasenmatrizen zur Reinigung von Immunglobulinen.
Für die Vergleichsuntersuchung wurden 7 verschiedene Zelllinien zur Herstellung von 7 unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern von American Type Culture Collection (ATCC) erworben und gemäß einem Standardverfahren wie nachstehend beschrieben vermehrt. Danach wurde die Bindungseffizienz jedes monoklonalen Antikörpers mit jeder der Festphasen Protein-A-Agarose (Matrix nach dem Stand der Technik), Avidchrom (Matrix nach dem Stand der Technik) und 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose getestet.
Die Untersuchung wurde konzipiert, um die Antikörperbindungseffizienz während der Chargeninkubation von 5 verschiedenen Festphasen mit Kulturüberständen aus 7 unterschiedlichen, im Handel erhältlichen Zelllinien zu bestimmen.
Monoklonale Antikörper:
Zelllinien: Die folgenden sieben Zelllinien, erhältlich von American Type Culture Collection, wurden in den standardisierten Aufbau eingeschlossen:
Kulturen: Die in der Untersuchung verwendeten Kulturüberstände monoklonaler Antikörper wurden durch Kultur der entsprechenden Hybridoma-Zellen von Maus und Ratte in einem Medium mit fötalem Kälberserum (RPMI-X, Medicult, Dänemark, Kat.-Nr. 20230500 + 5% fötales Kälberserum, Imperial, Großbritannien, Kat.-Nr. 83041) hergestellt. Die für das Kultivieren der fünf Zelllinien verwendete Verfahrensweise ist im Stand der Technik gut etabliert und in G. Brown und N. R. Ling "Antibodies – a practical approach" 1988, Bd. Z, S. 81– 104 beschrieben. Nach 3 Wochen Kultur wurden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt, und der Überstand wurde filtriert, um alle restlichen Partikel zu entfernen. Die Konzentration an monoklonalem Antikörper in den fünf verschiedenen Kulturüberständen wurde durch einfache radiale Immundiffusion (wie in D. Catty und C. Raykundalia "Antibodies – a practical approach" 1988, Bd. I, S. 137–168 beschrieben) unter Verwendung von Kaninchen-anti-MausImmunglobulinen und Kaninchen-anti-Ratte-Immunglobulinen als ausfällendem Antikörper (DAKO, Dänemark, Kat.-Nr.: Z109 und Z147) ermittelt, und es wurde festgestellt, dass sie für alle Klone im Bereich von 30 bis 60 μg/ml lag. Danach wurde der Gehalt an monoklonalem Antikörper in jedem Kulturüberstand durch Verdünnen vereinheitlicht, um eine Endkonzentration von 30 μg/ml zu erzielen. Um für alle Überstände ähnliche Bedingungen zu gewährleisten, wurde das Verdünnen mit Kulturmedium, das 5% fötales Kälberserum beinhaltete, vorgenommen.
Festphasen: Protein-A-Agarose von Repligen Corporation, USA, Kat.-Nr.: IPA-300, Chargen-Nr.: RN 2917; Avidchrom von Unisyn Technologies, USA, Kat.-Nr.: 3100-0025, Chargen-Nr.: 96-0404-1; 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose wurden auf mit Epichlorhydrin aktivierten 6% Agarosekügelchen von Hispanagar, Spanien, aufgebaut und synthetisiert wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben. Die Ligandkonzentrationen wurden durch Elementaranalyse gemessen, und es ergaben sich 65, 69 bzw. 69 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix (903, 958 und 958 μmol/g Trockenmaterial entsprechend, wenn durch Elementaranalyse gefriergetrockneter Proben gemessen).
Die drei verschiedenen Festphasenmatrizen wurden auf ihre Bindungseffizienz für monoklonale Antikörper durch Inkubation mit den 7 unterschiedlichen Überständen monoklonaler Antikörper (eingestellt auf 30 μg Antikörper/ml) nach folgendem Verfahren getestet:
Standardverfahren für den "Monoklonalen Antikörperarray-Bindungstest":
Ungefähr 100 mg der zu testenden Matrix werden auf einem Sinterglastrichter mit 10 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von Absaugentwässerung über 60 Sekunden. 100 mg feuchte (abgetropfte) Festphasenmatrix werden in ein 3,0-ml-Reagenzglas eingewogen, und 4,0 ml des Kulturüberstands monoklonaler Antikörper, eingestellt auf den pH-Wert, bei dem die Matrix zu testen ist, werden hinzugegeben. Das Reagenzglas wird mit einem Stopfen verschlossen, und die Suspension wird auf einem Rollenmischer 2 Stunden bei Raumtemperatur (20–25°C) inkubiert. Das Reagenzglas wird dann 5 Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um die Matrix zu sedimentieren. Der Überstand wird anschließend aus der Festphasenmatrix durch Pipettieren in ein separates Reagenzglas abgetrennt, unter Vermeidung des Verschleppens irgendwelcher Matrixteilchen. Nachfolgend wird eine Bestimmung der Konzentration des ungebundenen Immunglobulins in dem Überstand durch einfache radiale Immundiffusion durchgeführt.
Der prozentuale Anteil des an die Matrix gebundenen monoklonalen Antikörpers wird dann gemäß der folgenden Formel berechnet: Gebundener prozentualer Anteil = (1 – (Konzentration im Überstand/30 μg/ml)) × 100%
Die Genauigkeit dieses Verfahrens ist besser als +/- 5%.
Einstellungen des pH-Werts der Kulturüberstände für die verschiedenen Festphasen:
Protein-A-Agarose: Die Kulturüberstände monoklonaler Antikörper wurden durch den Zusatz von Tris/HCl bis zu einer Endkonzentration an Tris von 0,05 M auf pH-Wert 8,2 eingestellt.
Avidchrom: Die Kulturüberstände monoklonaler Antikörper wurden durch Zusatz von Kaliumhydrogenphosphat/HCl bis zu einer Endkonzentration an Phosphat von 0,05 M auf den pH-Wert 7,4 eingestellt.
2-Mercaptobenzimidazol: Die Kulturüberstände monoklonaler Antikörper wurden durch Zusatz von Kaliumhydrogenphosphat/HCl bis zu einer Endkonzentration an Phosphat von 0,05 M auf den pH-Wert 7,0 eingestellt.
Bindungseffizienz in %
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigt die erfindungsgemäße Festphasenmatrix, d. h. 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose, eine sehr konstante hohe Bindungseffizienz mit den verschiedenen Klonen (typischerweise im Bereich von 50–100% Bindung), während die Festphasenmatrizen nach dem Stand der Technik, Protein-A-Agarose und Avidchrom, eine viel stärker schwankende Bindungseffizienz (im Bereich von 0–100% Bindung) zeigen. Die durchschnittliche Bindungseffizienz wurde für jedes Adsorbens berechnet, und es ist auch aus diesen Daten zu ersehen, dass die Adsorbenzien nach dem Stand der Technik mit durchschnittlichen Bindungseffizienzen von 52 und 53% wesentlich weniger effizient sind als die erfindungsgemäßen Adsorbenzien, die durchschnittliche Bindungseffizienzen im Bereich von 75–95% aufweisen.
4. 2-Mercaptobenzoesäure als Ligand (erläuterndes Beispiel)
Isolierung von Immunglobulinen unter verschiedenen Bindungs- und Waschbedingungen
Untersuchungen der Festphasenmatrix mit 2-Mercaptobenzoesäure unter Verwendung des "künstlichen Kulturüberstands", wie im Beispiel 2 beschrieben, wurden mit dem Ziel der Veranschaulichung der optimalen Bindungs- und Waschbedingungen zum Erzielen der maximalen Bindungskapazität sowie der maximalen Ausbeute und Reinheit des Antikörpers im Eluat durchgeführt.
2-Mercaptobenzoesäure-Agarose wurde auf mit Epichlorhydrin aktivierte 6% Agarosekügelchen von Hispanagar aufgebaut und synthetisiert, wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben. Die Ligandkonzentration wurde mit zwei verschiedenen Verfahren gemessen, und es ergaben sich 65 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix, bestimmt mit Elementaranalyse, und 60 μmol/g, ermittelt mit Säure-Base-Titration des immobilisierten Benzoesäureteils des Liganden.
Im Allgemeinen wurden die Versuche gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt:

1) Ein kleiner Aliquot 2-Mercaptobenzoesäure-Agarose wurde auf einem Sinterglastrichter mit Wasser (das gesamte Wasser hatte, wenn nicht anders angegeben, die Qualität von Milli-Q-Wasser) durch leichtes Absaugen gewaschen, gefolgt von Ableiten des Einlagerungswassers durch leichtes Absaugen über eine Minute.
2) 0,4 g feuchte, aber abgetropfte Matrix wurden dann in ein Reagenzglas eingewogen, gefolgt von Zugabe von 10 ml "künstlicher Kulturüberstand", der für den speziellen Versuch einen spezifischen pH-Wert aufwies. Mit oder ohne weitere Zusatzstoffe wurde die Suspension danach auf einem Rollenmischer 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um eine effiziente Bindung der Immunglobuline zu gewährleisten.
3) Der Inkubation folgend wurde die Matrix in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 5 mm verlagert, überschüssiger "künstlichen Kulturüberstand" abgeleitet und gemäß einem für den speziellen Versuch spezifischen Schema gewaschen. Das Waschen wurde unter Zusatz von 4 × 4 ml Waschpuffer zur Säule und Sammeln des Durchlaufs von der Säule in einer Fraktion vorgenommen.
4) Das letzte Eluieren des gebundenen Immunglobulins wurde mit einem speziellen Elutionspuffer unter Zusatz von 4 × 2,5 ml Puffer zur Säule und Sammeln des Eluats in einer Fraktion durchgeführt. In dem Versuch wurden keine Pumpen verwendet, alle Säulen wurden durch Schwerkraft durchlaufen (bei einer ungefähren Flussrate von 0,5–1,0 ml/min).
5) Analysen wurden durchgeführt, um die relative Verteilung des Immunglobulins zwischen der ungebundenen Fraktion im Überstand nach der Bindung, der (den) Waschfraktionen) und dem Eluat zu ermitteln. Das wurde durch einfache radiale Immundiffusion (wie in D. Catty und C. Raykundalia "Antibodies – a practical approach" 1988, Bd. I, S. 137–168 beschrieben) unter Verwendung von Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulinen als ausfällender Antikörper (DAKO A/S, Dänemark, Kat.-Nr.: Z 109) durchgeführt.

Die Bindungskapazität wurde dann aus der im Überstand vorhandenen Menge ungebundenen Immunglobulins berechnet und als prozentualer Anteil der der Matrix im Ausgangsmaterial zugesetzten Gesamtmenge ausgedrückt.
Die Ausbeute wurde als prozentualer Anteil des in der Eluatfraktion gefundenen zugesetzten Immunglobulins errechnet (d. h. eine Ausbeute von 100% entspricht dem Vorhandensein von 1 mg IgG im Eluat).
Die Reinheit des eluierten Immunglobulins wurde durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidelektrophorese) unter Reduktionsbedingungen, gefolgt von Anfärben der Proteinbanden mit Coomassie-Brillantblau, analysiert (Fertiggel 4–20% Tris-Glycin, 1 mm, Kat.-Nr.: EC6025, Durchlaufzeit: 1 Stunde bei 30 mA; SDS-Tris-Glycin-Laufpuffer, Kat.-Nr. LC2675; Tris-Glycin-Probenpuffer, Kat.-Nr.: LC2676; Coomassie-Anfärbungskit, LC6025; alle Chemikalien von Novex, USA).
Der in Prozent des Gesamtproteingehalts ausgedrückte Reinheitsgrad wurde durch Scannen und Bildverarbeitung des mit Coomassie angefärbten und getrockneten Polyacrylamidgels ermittelt. Für diesen Zweck wurde das System CREAM, erhältlich von Kem-En-Tec A/S, Dänemark (Kat.-Nr.: 6010 + 6050) verwendet.
4A) Der Effekt des Durchführens der Bindung bei verschiedenen pH-Werten
Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um den pH-Wert-Bereich zu veranschaulichen, in welchem eine Ligandenmatrix, hier die 2-Mercaptobenzoesäure-Matrix, die Immunglobuline aus dem "künstlichen Kulturüberstand" effizient binden würde. Wie Tabelle I, Beispiel 2 zeigt, bindet diese Matrix 100% beim pH-Wert 4,5 und 0% beim pH-Wert 7. In diesem Versuch werden die Bindungseffizienz, Ausbeute und Reinheit des Eluats bestimmt, wenn die Bindung im pH-Wert-Bereich 3,0–6,5 vollzogen wird. In allen Beispielen war der verwendete Waschpuffer 10 mM Citronensäurepuffer, eingestellt mit 1 M Natriumhydroxid auf denselben pH-Wert wie der pH-Wert der Bindung. Der verwendete Elutionspuffer war in allen Fällen 0,05 M Borsäure/NaOH + 0,5 M Natriumchlorid, pH-Wert 8,6.
Ergebnisse:
Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, wird eine effiziente Bindung bei pH-Werten unter 6,0 erzielt, wobei 100% beim pH-Wert 4,5 erreicht werden. Gleichzeitig gibt es ein Anzeichen dafür, dass eine relativ höhere Reinheit erhalten werden kann, wenn der Bindungsschritt bei einem höheren pH-Wert als 4,5 durchgeführt wird.
4B) Der Effekt verschiedener Waschverfahren/pH-Werte des Waschpuffers
Eine Versuchsreihe mit dem Ziel der Optimierung der Reinheit des Eluats unter Aufrechterhaltung der Ausbeute auf einem hohen Wert wurde durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde ein Umfang unterschiedlicher Waschverfahren getestet. Alle Versuche wurden mit pH-Wert 4,5 als pH-Wert der Bindung durchgeführt, und alle Eluate wurden mit 0,05 M Borsäure/NaOH + 0,5 M NaCl, pH-Wert 8,6 ausgeführt.
Ergebnisse:
Wie aus der Tabelle ersichtlich kann die Reinheit des Eluats durch Waschen mit einem höheren pH-Wert gesteigert werden, eine Erhöhung des pH-Werts über 5,5 verringert jedoch erheblich die Ausbeute.
4C) Der Effekt verschiedener Waschverfahren/lyotroper Salze bei hohem pH-Wert
Es wurden Versuche, wie in 3B beschrieben, durchgeführt, abgesehen davon, dass eine Reihe von Waschpuffern, die unterschiedliche lyotrope Salze beim pH-Wert 8,0 enthielten, auf ihr Vermögen, die Reinheit des Eluats ohne bedeutende Abnahme der Ausbeute zu verbessern, getestet wurde.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein lyotroper Salze im Waschpuffer, verbunden mit einem höheren pH-Wert als dem pH-Wert der Bindung, die Reinheit des Eluats wesentlich erhöhen kann, ohne die Ausbeute zu verringern. Es ist außerdem offensichtlich, dass eine bestimmte Konzentration der lyotropen Salze notwendig ist, um dieses Ergebnis zu erhalten. Zu niedrige Konzentrationen führen zum Verlust an Immunglobulin in der Waschfraktion, was zu sehr niedrigen Ausbeuten führt. Wie zu ersehen ist, ist die notwendige Konzentration von der Beschaffenheit des lyotropen Salzes abhängig, z. B. muss Ammoniumsulfat, welches als stark lyotropes Salz nach der Hofmeister-Reihe (s. Gagnon, hierin zitiert) angesehen wird, nur eine Konzentration von etwa 1,0–1,1 M aufweisen, um eine hohe Ausbeute im Eluat zu gewährleisten, während Natriumchlorid, das als schwach lyotropes Salz nach der Hofmeister-Reihe betrachtet wird, eine Konzentration von etwa 4 M aufweisen muss, bevor die Ausbeute auf einen akzeptablen Wert ansteigt.
4D) Der Effekt verschiedener Waschverfahren/unterschiedlicher Zusatzstoffe
Der Effekt des Zusetzens von Detergenzien und anderen Zusatzstoffen zum Waschpuffer wurde in Versuchen untersucht, die wie vorstehend beschrieben durchgeführt wurden (Beispiel 4B und 4C).
Ergebnisse:
Die Ergebnisse aus diesen Versuchen zeigen eindeutig den positiven Effekt auf die Reinheit des Eluats, das durch Waschen der Matrix mit Puffern mit einem negativ geladenden Detergens (z. B. Octansulfonsäure, Hexansulfonsäure, Octylsulfat und Natriumlaurylsarcosinat) erhalten wurde, während der Zusatz von ungeladenen Detergenzien wie Tween 20 und Pluronic F-68 einen geringen oder keinen Effekt auf die Reinheit des eluierten Immunglobulins zu haben scheint. Ebenso zeigt sich, dass Bromphenolblau, welches für eine hohe Affinität zur Bindung von Albumin (eine unerwünschten Verunreinigung) bekannt ist, ebenfalls einen erheblichen Effekt auf die Reinheit hat, ohne die Produktausbeute zu beeinträchtigen. Außerdem scheint der erhaltene Effekt unabhängig davon zu sein, ob der Waschpuffer hohe Konzentrationen lyotroper Salze umfasst oder nicht, sowie unabhängig von der Wahl des verwendeten lyotropen Salzes, wenn vorhanden.
4E) Der Effekt verschiedener Zusatzstoffe während der Bindung
Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um den Effekt der Zugabe verschiedener Detergenzien und anderer chemischer Substanzen zum "künstlichen Kulturüberstand" während der Inkubation mit der 2-Mercaptobenzoesäure-Agarose auf Reinheit und Ausbeute zu veranschaulichen. Für alle Versuche betrug der pH-Wert der Bindung 5,0, war der verwendete Waschpuffer 1,1 M Ammoniumsulfat/NaOH, pH-Wert 8,0 und der Elutionspuffer 0,05 M Borsäure/NaOH + 0,5 M Natriumchlorid, pH-Wert 8,6. Die Versuche wurden ansonsten durchgeführt wie in dem vorstehenden generellen Verfahren beschrieben.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse zeigen, dass der Zusatz bestimmter negativ geladener Detergenzien (oder amphophiler Substanzen) zum "künstlichen Kulturüberstand" vor der Inkubation mit 2-Mercaptobenzoesäure-Agarose einen bedeutenden Einfluss auf die Endreinheit des Eluats hat. Das ist beispielsweise bei Substanzen wie Capronsäure und Caprylsäure sowie Laurylsarcosinat der Fall, während andere negativ geladene Substanzen, wie Benzoesäure, Laurylsulfobetain, Suberinsäure, Sebacinsäure und Octansulfonsäure, in den getesteten Konzentrationen einen sehr geringen Effekt zu haben scheinen. Es wird außerdem bemerkt, dass das neutrale Detergens Tween 20 und das positive Detergens 1-Octyl-N-methylglucamin beide keinen Effekt haben.
4F) Der Effekt verschiedener Waschpuffer in Kombination mit dem Zusatz von Natriumlaurylsarcosinat zum Ausgangsmaterial
Das folgende Beispiel veranschaulicht den Effekt des Kombinierens des Zusatzes eines negativ geladenen Detergens zum Ausgangsmaterial mit einer Reihe verschiedener Waschpufferzusam mensetzungen. In allen Versuchen wird dem "künstlichen Kulturüberstand" vor dem Mischen mit 2-Mercaptobenzoesäure-Agarose 1 mg/ml Natriumlaurylsarcosinat zugegeben, wobei der pH-Wert der Bindung 5,0 betrug und der Elutionspuffer in allen Fällen 0,05 M Borsäure/NaOH + 0,5 M Natriumchlorid, pH-Wert 8,6 war. Ansonsten wurde dem vorstehend beschriebenen generellen Verfahren gefolgt.
Ergebnisse:
5. 4-Aminobenzoesäure als Ligand (erläuterndes Beispiel)
Isolierung von monoklonalen Antikörpern unter unterschiedlichen Bedingungen
Die folgenden Versuche veranschaulichen den Einfluss unterschiedlicher Bindungs- und Waschbedingungen auf die Leistung von 4-Aminobenzoesäure-Agarose, die auf 6% Agarose von Hispanagar basiert und gemäß Beispiel 1A und 1E synthetisiert wurde. Die verwendete Matrix wurde durch Elementaranalyse analysiert und ein Gehalt von 69 μmol 4-Aminobenzoesäuregruppen pro ml feuchte, aber abgetropfte Matrix ermittelt.
Die Versuche wurden durchgeführt wie im generellen Verfahren im Beispiel 4 beschrieben.
5A) Der Effekt des Durchführens der Bindung bei unterschiedlichen pH-Werten
Der folgende Versuch wurde durchgeführt, um den pH-Wert-Bereich, in welchem die 4-Benzoesäure-Matrix Iminunglobuline aus dem "künstlichen Kulturüberstand" effizient binden würde, zu veranschaulichen. In diesem Versuch werden die Bindungseffizienz, Ausbeute und Reinheit des Eluats bestimmt, wenn die Bindung im pH-Wert-Bereich 4,0–6,5 durchgeführt wird. In allen Fällen war der verwendete Waschpuffer 10 mM Citronensäurepuffer, eingestellt mit 1 M Natriumhydroxid auf denselben pH-Wert wie der pH-Wert der Bindung. Der verwendete Elutionspuffer war in allen Beispielen 0,05 M Borsäure/NaOH + 0,5 M Natriumchlorid, pH-Wert 8,6.
Ergebnisse:
Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, wird eine effiziente Bindung bei pH-Werten unter 5,5 erzielt, wobei beim pH-Wert 4,5 90% erreicht werden. Gleichzeitig gibt es ein Anzeichen dafür, dass eine relativ höhere Reinheit erhalten werden kann, wenn der Bindungsschritt bei einem höheren pH-Wert als 4,5 durchgeführt wird.
5B) Der Effekt verschiedener Waschverfahren/pH-Werte des Waschpuffers
Eine Versuchsreihe mit dem Ziel der Optimierung der Reinheit des Eluats unter Aufrechterhaltung der Ausbeute auf einem hohen Wert wurde durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde ein Umfang unterschiedlicher Waschverfahren getestet. Alle Versuche wurden mit pH-Wert 4,5 als pH-Wert der Bindung durchgeführt, und alle Eluate wurden mit 0,05 M Borsäure/NaOH + 0,5 M NaCl, pH-Wert 8,6 durchgeführt.
Ergebnisse:
Wie aus der Tabelle ersichtlich, kann die Reinheit des Eluats durch Waschen mit einem höheren pH-Wert gesteigert werden, eine Erhöhung des pH-Werts über 6,0 verringert jedoch die Ausbeute bedeutend.
6. 2-Mercaptonicotinsäure (erläuterndes Beispiel)
Isolierung von monoklonalen Antikörpern unter unterschiedlichen Bedingungen
Die folgenden Versuche veranschaulichen den Einfluss unterschiedlicher Bindungs- und Waschbedingungen auf die Leistung von auf mit Epichlorhydrin aktivierter 6% Agarose basierender 2-Mercaptonicotinsäure-Agarose. Die verwendete Matrix wurde durch Elementaranalyse analysiert und ein Gehalt von 63 μmol 2-Mercaptonicotinsäuregruppen pro ml feuchte, aber abgetropfte Matrix ermittelt.
Die Versuche wurden durchgeführt wie im generellen Verfahren im Beispiel 4 beschrieben.
In diesen beiden Versuchen wurde der Effekt der Veränderung des pH-Werts der Bindung auf Ausbeute und Reinheit des erhaltenen Eluats untersucht, während die Wasch- und Elutionsbedingungen konstant gehalten wurden. In beiden Fällen war der Waschpuffer 1,1 M Ammoniumsulfat/NaOH, pH-Wert 8,0 + 5 mg/ml Octylsulfat, und der Elutionspuffer war 0,05 M Borsäure/NaOH, pH-Wert 8,6 + 0,5 M Natriumchlorid.
Der "künstliche Kulturüberstand" wurde jeweils mit 1 M Salzsäure auf pH-Wert 4,5 und 5,0 eingestellt, und es wurden keine weiteren Zusätze vorgenommen.
Ergebnisse:
Wie ersichtlich ist, liefert diese Matrix bei beiden pH-Werten der Bindung eine hervorragende Ausbeute an Immunglobulin im Eluat, während die Reinheit des eluierten Immunglobulins durch Erhöhung des pH-Werts der Bindung von pH-Wert 4,5 auf pH-Wert 5,0 erheblich erhöht wird.
Effekt des Zusetzens von Natriumlaurylsarconsinat zum Ausgangsmaterial
In den folgenden Versuchen wird der Effekt des Zusetzens verschiedener Mengen Natriumlaurylsarcosinat zum "künstlichen Kulturüberstand" bei zwei unterschiedlichen pH-Werten der Bindung untersucht. In allen Versuchen war der verwendete Waschpuffer 1,1 M Ammoniumsulfat/NaOH, pH-Wert 7,5, und der Elutionspuffer war 0,05 M Borsäure/NaOH, pH-Wert 8,6 + 0,5 M Natriumchlorid.
Vor dem Mischen mit der Festphasenmatrix wurde dem "künstlichen Kulturüberstand" Natriumlaurylsarcosinat in drei unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt und dieser dann mit 1 M Salzsäure auf pH-Wert 4,5 bzw. 5,0 eingestellt. Ergebnisse: Bindung beim pH-Wert 4,5:
Bindung beim pH-Wert 5,0:

SLS =: Natriumlaurylsarcosinat (engl.: Sodium Lauryl Sarcosinate)

7. 2-Mercaptobenzimidazol
Isolierung von monoklonalen Antikörpern
Wie die Tabelle I zeigt, stellt 2-Mercaptoimidazol eine weitere sehr interessante Gruppe von Liganden (Benzimidazole, Benzoxazole und Benzothiazole) zur Isolierung von Immunglobulin dar. Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung dieses im Beispiel 2 beschriebenen Liganden zur Bindung und Isolierung von Immunglobulinen aus dem "künstlichen Kulturüberstand".
2-Mercaptobenzimidazol-Agarose wurde auf mit Epichlorhydrin aktivierte 6% Agarosekügelchen von Hispanagar aufgebaut und synthetisiert wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben. Die Ligandkonzentration wurde durch Elementaranalyse gemessen, und es wurden 69 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix festgestellt.
In den folgenden Versuchen werden die Ausbeute und Reinheit, die durch Inkubation der 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose mit dem "künstlichen Kulturüberstand" mit unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzten Polyvinylpyrrolidons erhalten wurden, durch Befolgen des im Beispiel 4 beschriebenen allgemeinen Verfahrens ermittelt. Der pH-Wert der Bindung wurde mit Salzsäure auf pH-Wert 7,5 eingestellt, der Waschpuffer war 0,01 M Kaliumphosphat + 0,5 M Natriumchlorid, pH-Wert 7,5, und der Elutionspuffer war 0,01 M Citronensäure/NaOH, pH-Wert 3,5. Ergebnisse:

PVP:: Polyvinylpyrrolidon

Die Ergebnisse zeigen, dass 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose fast den gesamten verwendeten monoklonalen Antikörper binden kann (d. h. Ergeben einer Ausbeute von 95%) und gleichzeitig ein Eluat liefern kann, welches im Wesentlichen gereinigt ist. Die Reinheit kann durch Zusetzen von Substanzen wie Polyvinylpyrrolidon sogar noch erhöht werden.
8. Stabilität bei hohem pH-Wert
2-Mercaptobenzimidazol wurde sowohl an mit Epichlorhydrin aktivierte 6% Agarosekügelchen (Hispanagar), hergestellt wie im Beispiel 1A beschrieben, als auch an mit Divinylsulfon aktivierte 6% Agarosekügelchen (Hispanagar), hergestellt gemäß Beispiel 1D, gekoppelt. Beide Kopplungsverfahren waren gemäß Beispiel 1E.
Der Gehalt der beiden Matrizen an 2-Mercaptobenzimidazol wurde durch Elementaranalyse ermittelt, und es wurden 69 μmol/g feuchte (abgetropfte) Matrix bzw. 42 μmol/ml feuchte (abgetropfte) Matrix festgestellt.
Beide Matrizen wurden auf ihre Stabilität gegen Inkubation mit 1 M Natriumhydroxid durch Befolgen des nachstehend beschriebenen Verfahrens getestet:
Standardstabilitätstest

I) Ungefähr 1000 mg der zu testenden Matrix werden auf einem Sinterglastrichter mit 100 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen, gefolgt von Absaugentwässerung über 60 s. 500 mg feuchte (abgetropfte) Festphasenmatrix werden in ein 10,0-ml-Reagenzglas, beschriftet mit "NaOH", eingewogen, und 9,0 ml 1 M Natriumhydroxid werden hinzugegeben, gefolgt von leichtem Vermischen über 1 min. Weitere 500 mg feuchte (abgetropfte) Festphasenmatrix werden in ein 10-ml-Reagenzglas, beschriftet mit "Wasser", eingewogen, und 9,0 ml Wasser werden hinzugegeben, gefolgt von leichtem Vermischen über 1 min. Die Reagenzgläser werden fest verschlossen mit Stopfen bei Raumtemperatur (20–25°C) über 7 Tage dunkel aufbewahrt. Die Matrizen werden dann getrennt auf einem Sinterglastrichter mit 200 ml Wasser gewaschen, gefolgt von Absaugentwässerung über 60 Sekunden.
II) Jede der Festphasenmatrizen wird im "Standard-Immunglobulinbindungstest", definiert im Beispiel 2, getestet.

Die Stabilität der Festphasenmatrix gegen 1 M Natriumhydroxid wird anschließend als prozentualer Anteil im Vergleich zur Kontrollprobe, die nur in Wasser inkubiert wird, nach der folgenden Formel berechnet und ausgedrückt: Stabilität = (gebundener prozentualer Anteil der mit NaOH behandelten Matrix/ gebundener prozentualen Anteil der Kontrollprobe) × 100%
Ergebnisse
Die Ergebnisse lassen erkennen, dass mit divinylsulfonaktivierter Agarose hergestellte Matrizen eine schlechte Stabilität in 1 M NaOH aufweisen, während epoxyaktivierte Agarose stabile Festphasenmatrizen liefert. Es wird außerdem gezeigt, dass 2-Mercaptobenzimidazol in sich selbst ein stabiler Ligand ist.
9. Isolierung polyklonaler Antikörper aus verschiedenen Spezies
2-Mercaptobenzoesäure als Ligand
Das folgenden Beispiel veranschaulicht sowohl die Bindungseffizienz von 2-Mercaptobenzoesäure-Agarose gegenüber polyklonalen Antikörpern aus verschiedenen Spezies als auch Ausbeute und Reinheit des Antikörpers im Eluat. Für die Untersuchung wurden Seren von 5 verschiedenen Species verwendet.
Polyklonale Antikörper: Die verwendeten polyklonalen Antikörper wurden aus normalen Seren von den folgenden Spezies erzeugt: Ziege, Pferd, Kaninchen, Schwein und Mensch. Die Seren wurden aus frisch gezogenem Blut durch leichtes Zentrifugieren nach Koagulation über 24 Stunden bei Raumtemperatur erhalten.
Festphasenmatrix: 2-Mercaptobenzoesäure-Agarose wurde auf epoxyaktivierte 6% Agarosekügelchen von Hispanagar aufgebaut und synthetisiert wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben. Die Ligandkonzentration wurde durch Elementaranalyse gemessen, und es wurden 65 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix festgestellt.
Die Festphasenmatrix wurde auf ihre Bindungseffizienz gegenüber polyklonalen Antikörpern in einer Säule gemäß dem folgenden Verfahren getestet:

1) Die Matrix wurde auf einem Sinterglastrichter mit Wasser gewaschen und am Schluss abgetropft. 1 g feuchte, aber abgetropfte Festphasenmatrix wurde in eine dünne Säule (Innendurchmesser 5 mm) eingewogen. Die Matrix wurde mit 5 ml Puffer (10 mM Natriumcitrat, pH-Wert 5,0) gewaschen. 1 ml Probe (eingestellt mit 1 M Salzsäure auf pH-Wert 5,0) wurde auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 20 ml Waschpuffer I (1,1 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 8,0, 5 mg/ml Natrium-1-octansulfonat enthaltend) gewaschen. Die Säule wurde mit 5 ml Waschpuffer II (1,1 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 8,0) gewaschen. Die Matrix wurde mit 10 ml Elutionspuffer (0,05 M Borsäure/NaOH + 0,5 M Natriumchlorid, pH-Wert 8,6) eluiert. In den Versuchen wurden keine Pumpen verwendet, alle Säulen wurden durch Schwerkraft durchlaufen (bei einer ungefähren Flussrate von 0,5–1,0 ml/min).
2) Analysen wurden durchgeführt, um die relative Verteilung des Immunglobulins zwischen der ungebundenen Fraktion im Durchlauf nach der Bindung, der (den) Waschfraktionen) und dem Eluat zu ermitteln. Das wurde durch einfache radiale Immundiffusion (wie in D. Catty und C. Raykundalia "Antibodies – a practical approach" 1988, Bd. I, S. 137–168 beschrieben) unter Verwendung von Spezies spezifischer Antiimmunglobuline als ausfällende Antikörper realisiert.

Die Bindungskapazität wurde dann aus der im Durchlauf vorhandenen Menge ungebundenen Immunglobulins berechnet und als ein prozentualer Anteil der der Matrix im Ausgangsmaterial zugesetzten Gesamtmenge ausgedrückt.
Die Ausbeute wurde als der prozentuale Anteil des zugesetzten Immunglobulins, der in der Eluatfraktion gefunden wurde, errechnet.
Die Reinheit des eluierten Immunglobulins wurde durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidelektrophorese) unter Reduktionsbedingungen, gefolgt von Anfärben der Proteinbanden mit Coomassie-Brillantblau, analysiert (Fertiggel 4–20% Tris-Glycin, 1 mm, Kat.-Nr.: EC6025, Durchlaufzeit: 1 Stunde bei 30 mA; SDS-Tris-Glycin-Laufpuffer, Kat.-Nr. LC2675; Tris-Glycin-Probenpuffer, Kat.-Nr.: LC2676; Coomassie-Anfärbungskit, LC6025; alle Chemikalien von Novex, USA).
Der in Prozent des Gesamtproteingehalts ausgedrückte Reinheitsgrad wurde durch Scannen und Bildverarbeitung des mit Coomassie angefärbten und getrockneten Polyacrylamidgels ermittelt. Für diesen Zweck verwendeten wir das System CREAM, erhältlich von Kem-En-Tec A/S, Dänemark (Kat.-Nr.: 6010 + 6050).
Ergebnisse
10. Isolierung von IgG aus Rinderserum
2-Mercaptobenzimidazol als Ligand
Das folgende Beispiel veranschaulicht, dass es mit 2-Mercaptoimidazol als Ligand möglich ist, IgG aus Rinderserum zu isolieren und zu reinigen.
Rinderserum: Das verwendete Rinderserum war normales Serum. Dieses Serum wurde aus frisch gezogenem Blut durch leichtes Zentrifugieren nach Koagulation über 24 Stunden bei Raumtemperatur erhalten.
Festphasenmatrix: 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose wurde auf epoxyaktivierte 6% Agarosekügelchen von Hispanagar aufgebaut und synthetisiert wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben. Die Ligandkonzentration wurde durch Elementaranalyse gemessen, und es wurden 69 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix festgestellt.
Die Festphasenmatrix wurde auf ihre Bindungseffizienz gegenüber polyklonalen Antikörpern in einer Säule gemäß dem folgenden Verfahren getestet:

1) Die Matrix wurde auf einem Sinterglastrichter mit Wasser gewaschen und am Schluss abgetropft. 2 g feuchte, aber abgetropfte Festphasenmatrix wurden in eine dünne Säule (Innendurchmesser 5 mm) eingewogen. Die Matrix wurde mit 5 ml Puffer (10 mM Natriumcitrat, pH-Wert 7,0) gewaschen. 2 ml Rinderserum wurden auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 10 ml Waschpuffer (10 mM Natriumcitrat, 0,25 M NaCl, pH-Wert 7,0) gewaschen. Die Matrix wurde mit 20 ml Elutionspuffer (10 mM Natriumcitrat, pH-Wert 3,0) eluiert. Die Flussrate betrug 1,0 ml/min.
2) Analysen wurden durchgeführt, um die relative Verteilung des Immunglobulins zwischen der nichtgebundenen Fraktion im Durchlauf nach der Bindung, der (den) Waschfraktionen) und dem Eluat zu ermitteln. Das wurde durch einfache radiale Immundiffusion (wie in D. Catty und C. Raykundalia "Antibodies – a practical approach" 1988, Bd. I, S. 137–168 beschrieben) unter Verwendung von Kaninchen-anti-Rind-Immunglobulinen (DAKO, Dänemark, Kat.-Nr.: Z247) als ausfällender Antikörper realisiert.

Die Bindungskapazität wurde dann aus der im Durchlauf vorhandenen Menge ungebundenen Immunglobulins berechnet und als prozentualer Anteil der der Matrix im Ausgangsmaterial zugesetzten Gesamtmenge ausgedrückt.
Die Ausbeute und Reinheit wurden wie im Beispiel 4 beschrieben ermittelt.
Ergebnisse:
11. Isolierung von Immunglobulinen aus Eidotter
2-Mercaptobenzimidazol als Ligand
Das folgende Beispiel veranschaulicht, dass es mit 2-Mercaptoimidazol als Ligand möglich ist, Immunglobuline aus Eidotter zu isolieren.
Eidotter: Eidotter (aus normalen Hühnereiern) wurden 1 : 1 mit 0,25 M NaCl verdünnt. Die Probe wurde 20 Minuten bei 10 000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.
Festphasenmatrix: 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose wurde auf epoxyaktivierte 6% Agarosekügelchen von Hispanagar aufgebaut und synthetisiert wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben. Die Ligandkonzentration wurde durch Elementaranalyse gemessen, und es wurden 69 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix festgestellt.
Die Festphasenmatrix wurde auf ihre Effizienz zur Bindung von Immunglobulinen aus Eidotter in einer Säule gemäß dem folgenden Verfahren getestet:

1) Die Matrix wurde auf einem Sinterglastrichter mit Wasser gewaschen und am Schluss abgetropft. 2 g feuchte, aber abgetropfte Festphasenmatrix werden in eine dünne Säule (Innendurchmesser 5 mm) eingewogen. Die Matrix wurde mit 10 ml Puffer (10 mM KHP₂O₄, 6,1) gewaschen. 4 ml der Probe wurden auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 10 ml Waschpuffer (10 mM KHP₂O₄, 6,1) gewaschen. Die Matrix wurde mit 16 ml Elutionspuffer (10 mM Natriumcitrat, pH-Wert 3,5) eluiert.
2) Analysen wurden durchgeführt, um die relative Verteilung des Immunglobulins zwischen der nichtgebundenen Fraktion im Durchlauf nach der Bindung, der (den) Waschfraktionen) und dem Eluat zu ermitteln. Das wurde durch einfache radiale Immundiffusion (wie in D. Catty und C. Raykundalia "Antibodies – a practical approach" 1988, Bd. I, S. 137–168 beschrieben) unter Verwendung von Kaninchen-anti-Huhn-Immunglobulinen IgG (Sigma, USA, Kat.-Nr.: C-6409) als ausfällender Antikörper realisiert.

Die Bindungskapazität wurde dann aus der im Durchlauf vorhandenen Menge ungebundenen Immunglobulins berechnet und als prozentualer Anteil der der Matrix im Ausgangsmaterial zugesetzten Gesamtmenge ausgedrückt.
Die Ausbeute und Reinheit wurden ermittelt wie im Beispiel 4 beschrieben.
Ergebnisse:
12. Depletion von IgG und Hämoglobin aus fötalem Kälberserum
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Effizienz einiger erfindungsgemäßer Festphasen zur Depletion von IgG und Hämoglobin aus fötalem Kälberserum. Die Untersuchung wurde entwickelt, um die Bindungseffizienz während der Chargeninkubation mit 14 verschiedenen Festphasen zu ermitteln.
Fötales Kälberserum: Das fötale Kälberserum wurde aus frisch gezogenem Blut durch leichtes Zentrifugieren nach Koagulation über 24 Stunden bei Raumtemperatur erhalten.
Festphase: Die folgenden Festphasen wurden verwendet: 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose, 2-Mercapto-5-nitrobenzimidazol-Agarose und 2-Mercaptobenzoxazol-Agarose. All diese Agarosen wurden auf epoxyaktivierte 6% Agarosekügelchen von Hispanagar aufgebaut und wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben synthetisiert. Die Ligandkonzentration wurde für alle Matrizen durch Elementaranalyse gemessen, und sie wurde im Bereich 60–70 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix festgestellt.
Die Festphasenmatrizen wurden auf ihre Effizienz zur Depletion von IgG und Hämoglobin aus fötalem Kälberserum gemäß dem folgenden Verfahren getestet:

1) Die Matrix wurde auf einem Sinterglastrichter mit 0,25 M NaCl gewaschen und am Schluss abgetropft. 0,5 g feuchte, aber abgetropfte Festphasenmatrix werden in ein Reagenzglas eingewogen und 5 ml fötales Kälberserum hinzugegeben. Die Suspension wurde dann auf einem Rollenmischer 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
2) Nach der Inkubation wurde das Reagenzglas 5 Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um die Matrix zu sedimentieren, und eine Probe des Überstands wurde zur Bestimmung der im Serum verbliebenen Menge an IgG entnommen. Diese wurde durch einfache radiale Immundiffusion (wie in D. Catty und C. Raykundalia "Antibodies – a practical approach" 1988, Bd. I, S. 137–168 beschrieben) unter Verwendung von Kaninchen-anti-Rind-Immunglobulinen (DAKO, Dänemark, Kat.-Nr.: Z247) als ausfällender Antikörper vorgenommen.
3) Die Hämoglobinkonzentration wurde spektralphotometrisch bei 414 nm gemessen. Der prozentuale Anteil des ungebunden im Serum verbliebenen Hämoglobins wird so berechnet: (AbS₄₁₄ nm, absorbiertes fötales Kälberserum/AbS₄₁₄ nm fötales Kälberserum) × 100%

Ergebnisse:
13. Isolierung von Trypsinogen und Chymotrypsinogen aus Rinderpankreas mit
2-Mercaptobenzoesäure (erläuterndes Beispiel)
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung von 2-Mercaptobenzoesäure-Agarose als eine geeignete Matrix zur Isolierung und Reinigung von Proteasen, z. B. Trypsin und Chymotrypsin, aus Rinderpankreas.
Pankreasextrakt: Die beiden Proteasen wurden als die Proenzyme Trypsinogen und Chymotrypsinogen durch Extraktion mit Schwefelsäure aus einem Rinderpankreasextrakt, wie in M. Laskowski, Methods in Enzymology 1955, Bd. II, S. 9–10 beschrieben, hergestellt. Nach dem Extrahieren wurde die Suspension durch Zusatz von 2 M Natriumhydroxid auf pH-Wert 2,5 eingestellt und durch Filtrieren und Zentrifugieren über 30 Minuten bei 4000 Umdrehungen pro Minute geklärt. Unmittelbar vor der Reinigung wurde der Extrakt mit 2 M NaOH auf pH-Wert 4,5 eingestellt und 5 Minuten bei 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, der Überstand wurde gesammelt.
Festphasenmatrix: 2-Mercaptobenzoesäure-Agarose wurde auf mit Epichlorhydrin aktivierte 6% Agarosekügelchen von Hispanagar aufgebaut und wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben synthetisiert. Die Ligandkonzentration wurde durch zwei unterschiedliche Verfahren gemessen, und es wurden 65 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix, bestimmt durch Elementaranalyse, und 60 μmol/g, ermittelt durch Säure-Base-Titration des immobilisierten Benzoesäureteils des Liganden ermittelt, festgestellt.
Die Festphasenmatrix wurde auf ihre Effizienz zur Bindung von Trypsin und Chymotrypsin gemäß dem folgenden Verfahren getestet:

1) Die Matrix wurde auf einem Sinterglastrichter mit Wasser gewaschen und am Schluss abgetropft. 2,5 g feuchte, aber abgetropfte Festphasenmatrix wurden in eine Säule (Innendurchmesser 5 mm) eingewogen. Die Matrix wurde mit 10 ml Puffer (10 mM Natriumcitrat, pH-Wert 4,5) gewaschen. 50 ml des Extrakts wurden auf die Säule aufgebracht. Die Matrix wurde mit 15 ml Waschpuffer (10 mM Natriumcitrat, pH-Wert 4,5) gewaschen. Die Matrix wurde mit 10 ml Elutionspuffer (50 mM Borsäure, 0,5 M NaCl, pH-Wert 8,7) eluiert.
2) Die Reinheit des eluierten Immunglobulins wurde durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidelektrophorese) unter Reduktionsbedingungen, gefolgt von Anfärben der Proteinbanden mit Coomassie-Brillantblau, analysiert (Fertiggel 4–20% Tris-Glycin, 1 mm, Kat.-Nr.: EC6025, Durchlaufzeit: 1 Stunde bei 30 mA; SDS-Tris-Glycin-Laufpuffer, Kat.-Nr. LC2675; Tris-Glycin-Probenpuffer, Kat.-Nr.: LC2676; Coomassie-Anfärbungskit, LC6025; alle Chemikalien von Novex, USA).

Ergebnisse:
Wie aus diesen Ergebnissen zu ersehen ist, wird überraschenderweise festgestellt, dass dieser Ligandtyp, d. h. aromatische Liganden, die gemäß der Erfindung einen sauren Rest umfassen, hier vertreten durch 2-Mercaptobenzoesäure als spezifischer Ligand, Proteine wie Proteinasen bei relativ niedrigen pH-Werten und bei relativ hoher Ionenstärke (d. h. ca. 0,25 in der Ionenstärke) sehr effizient binden kann.
14. Reinigung von Immunglobulinen aus Pferdeserum
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Verwendung von an Agarosekügelchen gekoppeltem 2-Mercaptobenzimidazol zur Reinigung von Immunglobulinen aus Pferdeserum. Es veranschaulicht außerdem die Verwendung verschiedener Elutionsbedingungen bei diesem Matrixtyp.
Pferdeserum: Das Pferdeserum wurde aus frisch gezogenem Blut durch leichtes Zentrifugieren nach Koagulation über 24 Stunden bei Raumtemperatur erhalten.
Festphasenmatrix: 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose wurde hergestellt wie im Beispiel 1A und 1E beschrieben. Die Ligandkonzentration wurde zu 69 μmol/g feuchte, aber abgetropfte Matrix bestimmt.
Verfahren:

1) Die Matrix wurde auf einem Sinterglastrichter mit Wasser gewaschen und am Schluss abgetropft. 2 g feuchte, aber abgetropfte 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose werden in eine dünne Säule (Innendurchmesser 5 mm) eingewogen. Die Matrix wurde mit 5 ml 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,0 gewaschen. 2 ml Pferdeserum, eingestellt mit 0,1 M HCl auf pH-Wert 7,0, wurden auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde mit 10 ml Waschpuffer (10 mM Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH-Wert 7,0) gewaschen. Die Matrix wurde mit 20 ml Elutionspuffer (siehe unten) eluiert. Die Flussrate betrug 1,0 ml/min. Diesem Verfahren wurde in drei identischen Versuchen, außer der Verwendung von drei unterschiedlichen Elutionspuffern, gefolgt: Elutionspuffer A = 20 mM Natriumcitrat, pH-Wert 3,0 Elutionspuffer B = 50 mM Ethanolamin/HCl, pH-Wert 11,0 Elutionspuffer C = 10 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,0 + 30% Vol./Vol. 1,2-Propandiol
2) Analysen wurden durchgeführt, um die relative Verteilung des Immunglobulins zwischen der ungebundenen Fraktion im Durchlauf nach der Bindung, der (den) Waschfraktionen) und dem Eluat zu ermitteln. Das wurde durch einfache radiale Immundiffusion (wie in D. Catty und C. Raykundalia "Antibodies – a practical approach" 1988, Bd. I, S. 137–168 beschrieben) unter Verwendung von Kaninchen-anti-Pferd-Immunglobulin G (Sigma, USA, Kat.-Nr.: H-9015) als ausfällender Antikörper realisiert.

Die Bindungskapazität wurde dann aus der im Durchlauf vorhandenen Menge ungebundenen Immunglobulins berechnet und als prozentualer Anteil der der Matrix im Ausgangsmaterial zugesetzten Gesamtmenge ausgedrückt. Die Ausbeute und Reinheit wurden ermittelt wie im Beispiel 4 beschrieben.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse zeigten, dass 2-Mercaptobenzimidazol-Agarose eine wirksame Festphasenmatrix zur Reinigung von Pferdeimmunglobulinen ist und dass die Elution entweder mit schwach sauren oder schwach basischen Puffern oder aber auch mit einem neutralen Puffer, der ein nichttoxisches organisches Lösungsmittel, wie 1,2-Propandiol, umfasst, ohne Ausbeute und Reinheit des eluierten Immunglobulins zu beeinträchtigen, durchgeführt werden kann.
15. Bindungseffizienz verschiedener Festphasenmatrizen gegenüber Rinderserumalbumin
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Effizienz verschiedener Festphasenmatrizen in einem Standard-Bindungstest für Rinderserumalbumin.
Festphasen: Ein ausgewählter Umfang an Festphasenmatrizen wurde auf Basis mit Epichlorhydrin aktivierter Agarosekügelchen von Hispanagar, hergestellt wie im Beispiel 1A und 1E, beschrieben. Die Liganden sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
Rinderserumalbuminlösung, pH-Wert 4,0 (BSA – engl.: bovine serum albumin, pH-Wert 4,0): Gereinigtes Rinderserumalbumin (Biofac A/S, Dänemark) wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml in 20 mM Natriumcitrat, pH-Wert 4,0 + 0,2 M Natriumchlorid gelöst.
Rinderserumalbuminlösung, pH-Wert 7,0 (BSA, pH-Wert 7,0): Gereinigtes Rinderserumalbumin (Biofac A/S, Dänemark) wurde bis zu einer Endkonzentration von 10 mg/ml in 20 mM Natriumcitrat, pH-Wert 7,0 + 0,2 M Natriumchlorid gelöst.
Verfahren:
Standard-Albuminbindungstest:
Die Festphasenmatrizen wurden mit 10 Volumenteilen entmineralisierten Wassers auf einem Vakuumfilter gewaschen und durch leichtes Absaugen über 1 min abgetropft. Zwei Proben von 1 g durch Absaugen abgetropfter Matrix wurden dann in zwei 10-ml-Reagenzgläser eingewogen, gefolgt von Zusetzen von 6,0 ml BSA, pH-Wert 4,0, zum ersten Reagenzglas und 6,0 ml BSA, pH-Wert 7,0, zum zweiten Reagenzglas. Zwei Proben von 1,0 g underivatisierten, durch Absaugen abgetropften, einfachen Agarosekügelchen von Hispanagar wurden als negativen Kontrollproben ebenfalls 6,0 ml der beiden BSA-Lösungen zugesetzt. Die Reagenzgläser wurden dann mit einem Stopfen verschlossen, und die Suspension wurde auf einem Rollenmischer 2 Stunden bei Raumtemperatur (20–25°C) inkubiert. Das Reagenzglas wurde dann 5 min bei 2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um die Matrix zu sedimentieren. Die Überstände wurden anschließend aus der Festphasenmatrix durch Pipettieren in separate Reagenzgläser abgetrennt, unter Vermeidung des Verschleppens irgendwelcher Matrixteilchen, und durch einen feinen nichtadsorbierenden 0,2-μm-Filter (Millipore, USA) filtriert. Nachfolgend wird eine Bestimmung der Konzentration des ungebundenen BSA in dem Überstand durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 280 nm auf einem Spektralphotometer durchgeführt.
Die Menge des an die Matrizen gebundenen BSA wurde dann gemäß der folgenden Formel berechnet: mg BSA, gebunden pro g durch Absaugen abgetropfte Matrix = (1-(OD des Testüberstands/OD der Kontrollprobe)) × 60
Die Genauigkeit dieses Verfahrens ist besser als +/- 5%.
Ergebnisse:
Die Tabelle gibt die Menge des gebundenen BSA in mg pro Gramm feuchte, aber durch Absaugen agbetropfte Matrix als Funktion des gekoppelten Liganden und des pH-Werts der BSA-Lösung an.

Claims

Verfahren zur Isolierung von Immunglobulinen aus einer ein oder mehrere Immunglobuline enthaltenden Lösung, umfassend die nachstehenden Verfahrensschritte: a) Kontaktieren einer ein oder mehrere Immunglobuline enthaltenden Lösung, welche einen pH-Wert im Bereich von 2,0 bis 10,0, eine Gesamtsalzkonzentration entsprechend einer Ionenstärke von höchstens 2,0 und lyotrope Salze in einer Konzentration von höchstens 0,4 M aufweist, mit einer Festphasenmatrix der allgemeinen Formel M-SP1-L, wobei M das Matrixgrundgerüst bezeichnet, SP1 einen Spacer bezeichnet, welcher kein von Divinylsulfon abgeleiteter Spacer ist, und L einen Liganden bezeichnet, welcher sich von Verbindungen, ausgewählt aus Benzimidazolen; Benzothiazolen und Benzoxazolen, ableitet, mit der Maßgabe, dass das Molekulargewicht des Liganden -L höchstens 500 Dalton beträgt, wobei mindestens ein Teil der Immunglobuline an die Festphasenmatrix gebunden wird; b) Trennen der Festphasenmatrix, an der Immunglobuline gebunden sind, von der Lösung; c) gegebenenfalls Waschen der Festphasenmatrix; und d) Kontaktieren der Festphasenmatrix mit einem Eluent, um das eine oder die mehreren Immunglobuline von der Festphasenmatrix freizusetzen mit der weiteren Maßgabe, das mindestens Kriterien (a) und (c) oder Kriterien (b) und (c) erfüllt sind: (a) die Festphasenmatrix weist eine Bindungseffizienz von mindestens 50% auf, wenn bei einem pH-Wert im Bereich von 2,0 bis 10,0 in dem hier beschriebenen "Standard-Immunglobulinbindungstest" getestet wird; oder (b) die Festphasenmatrix weist eine durchschnittliche Bindungseffizienz von mindestens 60% für all die Immunglobuline auf, welche im "Monoklonalen Antikörperarray-Bindungstest" getestet werden, wenn bei einem pH-Wert im Bereich von 2,0 bis 10,0 getestet wird; oder (c) die Stabilität der Festphasenmatrix in 1 M NaOH ist so, dass Inkubation der Matrix in 1 M NaOH in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 7 Tage die Bindungseffizienz bei einem pH-Wert im Bereich von einer pH-Einheit unterhalb des pH-Werts des Bindungsmaximums bis einer pH-Einheit oberhalb des pH-Werts des Bindungsmaximums, wie in dem hier beschriebenen "Standard-Immunglobulinbindungstest" bestimmt, um weniger als 25% im Vergleich zu einer entsprechenden unbehandelten Matrix verringert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Immunglobulin(e) enthaltende Lösung ein negativ geladenes Detergens umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Ligand von 2-Mercaptobenzimidazol abgeleitet ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Kriterien (a) und (c) zutreffen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Kriterien (b) und (c) zutreffen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei alle drei der Kriterien (a), (b) und (c) erfüllt sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Ligandkonzentration im Bereich von 10 bis 990 μmol/g Trockenmaterial der Festphasenmatrix liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Ligandkonzentration im Bereich von 1 bis 145 μmol/ml der hydratisierten, sedimentierten Festphasenmatrix liegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Ligandkonzentration im Bereich von 1 bis 130 μmol/g feuchte, aber durch Absaugen entwässerte Festphasenmatrix liegt.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Ligand -L ein Rest der Formel -X-A-SUB ist, wobei X die Bedeutung -O-, -S- oder -NH- hat; A eine Benzimidazol-; Benzothiazol- oder Benzoxazolgruppe bezeichnet und SUB einen oder mehrere Substituenten bezeichnet.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei SUB einen Substituenten der Formel -SP2-ACID umfasst, wobei SP2 einen optionalen zweiten Spacer bezeichnet und ACID einen sauren Rest bezeichnet.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der saure Rest aus einer Carbonsäuregruppe (-COOH), einer Sulfonsäuregruppe (-SO₂OH), einer Sulfinsäuregruppe (-S(O)OH), einer Phosphinsäuregruppe (-PH(O)(OH)), einem Phosphonsäuremonoesterrest (-P(O)(OH)(OR)) und einer Phosphonsäuregruppe (-P(O)(OH)₂) ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12, wobei SP2 einen C_1-6-Alkylen-, C_2-6-Alkenylenrest oder eine Einfachbindung bezeichnet.
Festphasenmatrix gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei alle Einheiten -SP1-L im Wesentlichen identisch sind.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert der die Immunglobuline enthaltenden Lösung im Bereich von 2,5 bis 5,5 liegt.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Gesamtsalzkonzentration der die Immunglobuline enthaltenden Lösung einer Ionenstärke im Bereich von 0,05 bis 2,0 entspricht.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der verwendete Eluent (Verfahrensschritt (d)) weniger als 10% (Vol./Vol.) organische Lösungsmittel umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei eine Lösung im Bereich von 0,1 bis 30 mg Immunglobuline pro Gramm Festphasenmatrix umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Waschen der Festphasenmatrix (Verfahrensschritt (c)) Waschen mit einer wässrigen, ein negativ geladenes Detergens umfassenden Lösung umfasst.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Waschen der Festphasenmatrix (Verfahrensschritt (c)) Waschen mit einem anorganischen oder organischen, ein negativ geladenes Detergens umfassenden Salzpuffer umfasst.