DE68902392T2 - Polyethylenimin-matrizen fuer affinitaetschromatographie. - Google Patents

Description

• Diese Erfindung fällt in das Gebiet der Affinitäts-Chromatographie und der immoblisierten Enzyme und Affinitätsmatrizen zur Verwendung in der Affinitäts-Chromatographie.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Affinititäts-Chromatographie ist eine Trennungs- und Reinigungstechnik, welche auf einer einzigartigen und fundamentalen biologischen Eigenschaft von biologischen Molekülen basiert, nämlich ihrer selektiven, spezifischen, affinititätsabhängigen Wiedererkennung und einer reversiblen molekularen Wechselwirkung mit anderen Molekülen. Die meisten biologischen Makromoleküle besitzen ein Substrat oder eine funktionelle Bindungsstelle für einen spezifischen Liganden oder ein Effektormolekül, welches selbst ein anderes Protein sein kann.
• Im allgemeinen ist ein spezifischer Ligand an eine feste Trägermatrix gebunden. Eine Probe, welche das biologische Molekül enthält, welches sich spezifisch an den immoblisierten Liganden bindet (absorbiert), wird in Kontakt mit dem immobilisierten Liganden gebracht. Nachdem unabsorbierte und verunreinigende Moleküle entfernt wurden, wird das spezifisch gebundene Molekül von dem festen Träger eluiert, indem die Wechselwirkung zwischen dem spezifisch gebundenen Molekül und dem Liganden durch ein oder mehrere Verfahren zerstört wird, wie beispielsweise durch Ändern der Ionenstärke oder des pH der Elutionspuffer.
• In diesem Verfahren können immobilisierte Wirkstoffe, Vitamine, Peptide, Hormone und ähnliche verwendet werden, um entsprechende Rezeptoren oder Transportproteine zu isolieren. Immobilisierte Proteine können zum Isolieren von anderen komplementären oder wechselwirkenden Proteinen dienen. Analog kann ein derartiges Verfahren verwendet werden, um aus Einzelteilchen bestehende biologische Proben, wie Zellmembranen und auch intakte Zellen, welche spezifische Rezeptoren tragen, zu trennen. Die Verwendung eines derartigen Verfahrens ist für die Reinigung von Polynukleotiden, Antigenen, Antikörpern, Viren, Enzymen und ähnlichen verwendbar. Zusätzlich können derartige feste Affinitätsträgermatrizen für die Immobilisierung von Enzymen zur Verwendung in Reaktionen als Katalysatoren und dgl. verwendet werden.
• Bis dato besaßen die am meisten verwendeten festen Matrizen für die Affinitäts-Chromatographie Matrizen auf der Basis von Polysacchariden, wie beispielsweise Agarose, Zellulose und quervernetztem Dextrin obwohl quervernetzte Polyacrylamide und Siliziumdioxid oder poröse Glaskugeln ebenfalls verwendet wurden.
• Jedoch wird mit den meisten derartigen festen Matrizen, insbesondere mit den festen Matrizen auf der Basis von Siliziumdioxid das feste Basismaterial nicht ausreichend von den Molekülen der interessierenden biologischen Probe abgeschirmt mit dem Ergebnis, daß eine nicht spezifische Bindung in der Art der Absorption mit Materialien, welche anders als der spezifische Bindungspartner des immobilisierten Liganden sind, auftritt. Bei den festen Matrizen auf der Basis von Siliziumdioxid wurden bis dato starke Wasserstoffbindungen verwendet und es tritt eine Absorption an den Silanolgruppen auf und dies stört das Verfahren. Darüber hinaus bewirken die wässrigen Lösungen, welche bei Proteinen oder anderen interessierenden biologischen Materialien angewandt werden müssen, unerwünschte Hydrolyse der Siliziumdioxidmatrizen, laugen unerwünschtes Material aus den Matrizen aus und ergeben instabile Matrizen.
• Die bis dato verwendeten festen Trägermatrizen, welche in der Affinitäts-Chromatographie angewandt wurden, konnte man nur 200 bis 300 Stunden in wässrigen Lösungen und noch weniger in sauren und alkalischen pH-Umgebungen anwenden. Weiters konnten derartige Matrizen nach dem Stand der Technik keiner Aussetzung einer 0,1-molaren NaOH standhalten.
• Folglich wurde die Entwicklung der Affinitäts-Chromatographie in einem großen Umfang durch diese Nachteile der gegenwärtig verwendeten festen Trägermatrizen behindert, insbesondere aufgrund der Absorption von nicht spezifischen Materialien und der Instabilität der Matrizen.
• Es ist daher wünschenswert, daß feste Trägermatrizen für die Affinitäts-Chromatographie zur Verfügung gestellt werden können, welche das Risiko von nicht spezifischen Bindungen eliminieren oder wenigstens wesentlich reduzieren und welche unter einer Vielzahl von pH-Bedingungen und in wässrigen Lösungen stabil sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Es wurde nun gefunden, daß Festphasenträger auf der Basis von kovalent gebundenem, nicht quervernetzten Polyethyleniminkieselgel Affinitäts-Chromatographiematrizen zur Verfügung stellen, welche von einer stark erhöhten Stabilität in wässriger, saurer und alkalischer Umgebung sind und welche die Absorption von nicht spezifischen Molekülen wesentlich reduzieren oder nahezu eliminieren. Die festen Träger auf der Basis von kovalent gebundenem, nicht quervernetzten Polyethyleniminkieselgel, die angewandt werden, um die Affinitiäts- Chromatographiematrizen dieser Erfindung zu ergeben, sind die Reaktionsprodukte von Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan mit teilchenförmigen Kieselgel oder teilchenförmigem, kontrollierten Porenglas und werden durch die Formel
• Silica-PrSi-PEI
• bezeichnet.
• Der Ausdruck Silica-PrSi-PEI, wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet die kovalent gebundenen, nicht quervernetzten Polyethyleniminfestphasenträger, welche das Reaktionsprodukt von (1) entweder a) teilchenförmigem Kieselgel, welches einen mittleren Teilchendurchmesser von 1 bis 200, vorzugsweise 3 bis 70 um und eine mittlere Porengröße von 0 bis 100 nm 0 bis 1000 Å), vorzugsweise 5 bis 100 nm (50 bis 1000 Å) aufweist, oder b) teilchenförmiges kontrolliertes Porenglas, welches einen mittleren Teilchendurchmesser von etwa 1 bis 200 um und eine mittlere Porengröße von 0 bis 100 nm (0 bis 1000 Å), vorzugsweise 4 bis 100 nm (40 bis 1000 Å), aufweist, mit (2) Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan, welches ein mittleres Molekulargewicht von 400 bis 1800 aufweist, oder des schwach sauren carboxylierten Produktes davon mit einem zweibasigen Säureanhydrid, wobei das carboxylierte Produkt 0,3 bis 1,2 Carboxyl Milliäquivalente pro Gramm aufweist. Derartige Silica-PrSi-PEI-Produkte, ihre carboxylierten Derivate und ihre Herstellung sind in der US- PS 45 40 486 von Hugh Ramsden, ausgegeben am 10.September 1985, beschrieben und beansprucht. Derartige Produkte sind gegenwärtig von J.T.Baker Inc. als BAKERBOND Säulenchromatographiematrizen erhältlich.
• Die Affinitäts-Chromatographiematrizen dieser Erfindung sind derivatisierte Silica-PrSi-PEI-Matrizen, in welchen die primären und sekundären Aminogruppen des Polyethyleniminrestes mit einem reaktiven Rest umgesetzt werden, welcher fähig ist, kovalente Bindungen mit Liganden unter nicht denaturierenden Bedingungen herzustellen, und welcher unter wässrig-hydrolytischen Pufferbedingungen stabil ist.
• So können die Affinitäts-Chromatographiematrizen dieser Erfindung durch die allgemeine Formel
• Silica-PrSi-PEI R)x
• dargestellt werden, worin R im Fall des nicht schwach-sauren carboxylierten Träger der Rest von jeder chemisch reaktiven Gruppe ist, welche fähig ist, nukleophile Substitutionen an zwei verschiedenen Stellen einzugehen, so daß R kovalent an die primären oder sekundären Aminogruppen des PEI an einer derartigen Stelle gebunden wird, während die andere Stelle für die folgende nukleophile Substitution unter nicht denaturierenden Bedingungen durch einen Affinitäts-Chromatographie-Liganden frei und reaktiv bleibt, um eine zweite kovalente Bindung zu bilden, welche unter wässrig-hydrolytischen Pufferbedingungen stabil ist, und x eine positive ganze Zahl, welche kleiner oder gleich der Gesamtzahl der primären oder sekundären Aminogruppen in dem PEI-Rest ist, und in dem Fall, daß der schwach-saure carboxylierte Träger R der Rest von jeder chemisch-reaktiven Gruppe ist, welche fähig ist, das Carboxyl Hydroxyl leicht nukleophil umzulagern, um eine kovalente Bindung an dem Carboxyl-Kohlenstoffatom zu bilden und hiebei eine ausreichend elektrophile Stelle auszubilden, so daß sie leicht von dem Carboxyl-Kohlenstoffatom durch eine nukleophile funktionelle Gruppe auf einen Affinitäts-Chromatographieleganden umgelagert werden kann, und x eine positive ganze Zahl, welche kleiner oder gleich der Gesamtzahl der Carboxylgruppen in dem carboxylierten PEI-Rest ist, bedeutet. Als Beispiele für R-Reste von Gruppen, welche mit den primären und sekundären Aminogruppen oder Carboxylgruppen des PEI-Restes reaktiv sind und welche den anderen zuvor aufgezählten Bedingungen genügen, können genannt werden:
• welche von: Glutaraldehyd, Cyanurchlorid, Epichlorhydrin, 1,4- Butandioldiglycidylether, p-Nitrophenylchloroformat, Ethylchloracetat, 1,1'-Carbonyldiimidazol, diazotiertes p-Nitrobenzaldehydfluoborat-Salz und diazotiertes p-Nitrobenzoylchloridflouborat-Salz abgeleitet sind.
• Die Affinitätsmatrizen dieser Erfindung können für die Bindung jedes Liganden, welcher sich kovalent an die Affinitätsmatrix bindet, verwendet werden. Die Affinitätsmatrix ist insbesondere für die Umsetzung mit Liganden, welche reaktive Aminogruppen aufweisen, geeignet, jedoch ist sie auch für die Umsetzung mit Liganden, welche andere reaktive Gruppen enthalten, wie beispielsweise Liganden, welche reaktives Hydroxyl, Sulfhydryl und ähnliche Gruppen enthalten, geeignet. Die Affinitätsmatrizen dieser Erfindung können leicht mit derartigen reaktiven Gruppen eines Proteins, eines Enzyms oder einem anderem derartigen Liganden reagieren, um den Liganden auf der Affinitätsmatrix zu immobilisieren. Als Beispiele von Liganden, welche derartige reaktive Gruppen enthalten, welche an den Affinitätsmatrizen dieser Erfindung durch kovalente Bindung fixiert werden können, können beispielsweise Antigene, Antikörper, Enzyme, Inhibitoren, Cofaktoren, Hormone, Vitamine, Toxine, Wachstumsfaktoren, Glykokonjugate, Lezithine, Nukleinsäuren und Proteine, welche in der Technik bekannt sind und in Parikh, I. et al., Affinity Chromatography, C&EN, 17- 24,32, August 26, 1985 definiert sind, angeführt werden. Die ligandengebundenen Affinitätsmatrizen dieser Erfindung können für die Reinigung oder Abtrennung von Substanzen, wie beispielsweise Proteine aus Lösungen, welche derartige Substanzen enthalten, durch Binden oder Adsorbieren der Substanz in Lösung verwendet werden, wobei die Affinitätsmatrix dieser Erfindung einen Liganden kovalent an die Affinitätsmatrix gebunden besitzt. Unter derartigen abzutrennenden oder zu reinigenden Substanzen können beispielsweise Enzyme, Rezeptoren, Antikörper, Antigene, Nukleinsäuren und ähnliche genannt werden.
• Zusätzlich können die Affinitätsmatrizen dieser Erfindung für die Immobilisierung von Enzymen entweder als Liganden für die Affinitäts-Chromatographie, wie zuvor beschrieben, oder als immobilisierte Enzyme zur Verwendung als Reaktionskatalysatoren verwendet werden. Derartige immobilisierte Enzyme, welche auf den Affinitätsmatrizen dieser Erfindung immobilisiert sind, sind hoch wirksame und stabile Katalysatoren und behalten ihre entsprechende Spezivität. Derartige immobilisierte Enzymkatalysatoren können wiederverwendet werden, erlauben kontinuierliche Reaktionen, ermöglichen eine bessere Reaktionskontrolle und ergeben eine höhere Reinheit und Ausbeute der Produkte. Darüber hinaus bewirken derartige immobilisierte Enzymkatalysatoren allgemein eine geringere Verunreinigung aufgrund der Reduktion oder Eliminierung des Verlustes an Enzymkatalysator. Die Verwendung von derartigen immobilisierten Enzymen findet eine weite Anwendung in einer Vielzahl von enzymkatalysierten Reaktionen, beispielsweise in Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren.
BEISPIEL 1
• Zu 25,0 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) in einem Reaktionskessel werden 13,0 g (0,128 Mol) Triethylamin gemeinsam mit 100 ml Chloroform, 27,6 g (0,115 ml) Cyanurchlorid bei etwa 20ºC zugesetzt. Die Reaktion ist stark exotherm. Zusätzliche 200 Mol Chloroform wurden zugesetzt und die Reaktion wurde bei etwa 20ºC 5 1/2 Stunden gerührt, filtriert, mit 3 x 100 ml Chloroform gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26,2 g. Analyse: C = 10.74%; H = 2,11%; N = 6.32%; Cl = 5,52%.
BEISPIEL 2
• 300 ml Chloroform wurden in einen Reaktionskessel, welcher mit einem Thermometer, einem Rührer und einem Kühler ausgestattet war und welcher mit Hilfe von Eis und Salz auf etwa 0 bis 5ºC gekühlt war, gegeben. 27,6 g (0,15 Mol) Cyanurchlorid wurden über einen Zeitraum von 20 Minuten zugesetzt während die Temperatur zwischen 0 und 5ºC gehalten wurde. Dann wurden 15.0 g (0.15 Mol) Triethylamin auf einmal zugesetzt und die Suspension färbte sich gelb und die Temperatur stieg auf etwa 25ºC. Die Lösung wurde dann neuerlich auf 0 bis 5ºC gekühlt und 25,0 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) wurden in kleinen Portionen über einen Zeitraum von 20 Minuten zugesetzt, während die Temperatur bei 0 bis 5ºC gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei dieser Temperatur etwa 30 Minuten gerührt, wonach das Eisbad entfernt wurde und die Mischung 22 Stunden gerührt wurde, filtriert wurde, mit 3 x 100 ml Chloroform gewaschen wurde und dann bei etwa 0ºC etwa 4 Stunden getrocknet wurde. Ausbeute = 25,4 g. Analyse: C= 10,22%; H = 2,12%; N = 5,78%; Cl = 5,59%.
BEISPIEL 3
• 25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) wurden in 100 ml Chloroform suspendiert, wozu 15,0 g (0,15 Mol) Triethylamin zugesetzt wurden. 28,0 g Triazin wurden mit 200 ml Chloroform aufgeschlämmt und in den Reaktionskessel überführt, wobei eine stark exotherme Reaktion auftritt. Die Mischung wurde etwa 5 1/2 Stunden bei etwa 20ºC gerührt, filtriert, mit 3 x 100 ml Chloroform gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26 g. Analyse: C = 10,95%; H = 2,12%; N = 5,96%; Cl = 5,63%.
BEISPIEL 4
• In einem Reaktionskessel wurden 50,0 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) in 200 ml Chloroform suspendiert, wozu 29,0 g Triethylamin zugesetzt wurden. 20,0 g Cyanurchlorid wurden teilweise zugesetzt und der Rest des Cyanurchlorids wurde mit 200 ml Chloroform aufgeschlämmt und in den Reaktionskessel überführt, wodurch eine stark exotherme Reaktion auftrat. Die Mischung wurde etwa 5 1/2 Stunden bei etwa 20ºC gerührt, filtriert, mit 3 x 200 ml Chloroform gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 51 g. Analyse: C = 10,71%; H = 2,14%; N = 5,88%; Cl = 5,33%.
BEISPIEL 5
• 400 ml Chloroform wurden in einem Reaktionskessel, welcher mit einem Kühler, Rührer oder Thermometer ausgestattet war und welcher auf 0 bis 5ºC mit Hilfe eines Eis-/Salzbades abgekühlt wurde, suspendiert. 56 g (0,29 Mol) Cyanurchlorid wurden zu der gekühlten Chloroformlösung während 15 bis 20 Minuten zugesetzt während die Temperatur bei 0 bis 5ºC gehalten wurde. 36 g (0,35 Mol) Triethylamin in 50 ml Chloroform wurden tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Minuten zugesetzt, wobei die Temperatur unter 10ºC gehalten wurde. Die Lösung färbte sich, nachdem der Zusatz von Triethylamin vollständig war, gelb. Die Mischung wurde auf 0 bis 5ºC gekühlt und 50 g Silica-PrSi-PEI-Triazin, welches in Übereinstimmung mit Beispiel 4 hergestellt wurde, wurden zugesetzt während die Temperatur auf unter 10ºC gehalten wurde. Der Zusatz des Kieselgels war in etwa 10 Minuten vollständig. Die Reaktionsmischung wurde bei dieser Temperatur etwa 10 Minuten gerührt, wonach das Eisbad entfernt wurde und die Mischung bei etwa 20ºC 18 1/2 Stunden gerührt wurde, filtriert, mit 4 x 250 ml Chloroform gewaschen wurde und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet wurde. Ausbeute = 49 g. Analyse: C = 11,3%; H = 2,25%; N = 6,31%; Cl = 4,86%.
BEISPIEL 6
• In einem Reaktionskessel wurden 250 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0.05 meq) und 100 ml 25% Glutaraldehyd-Lösung gemischt. Die Mischung wurde in einem Schüttler etwa 4 Stunden bei etwa 20ºC gehalten. Die Mischung färbte sich leicht braun, und wurde nach 4 Stunden abfiltriert, mit 3 x 100 ml deionisiertem Wasser, 3 x 100 ml Methanol und 3 x 100 ml Aceton gewaschen, bei etwa 20ºC in einem Vakuumofen über Nacht bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet. Ausbeute = 26 g. Analyse: C = 15,43%; H = 2,48%; N = 2,34%.
BEISPIEL 7
• 25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) wurden in einem 500 ml Rundkolben gegeben und 5,1 g (0,05 ml) Triethylamin in 100 ml Tetrahydrofuran wurden zugesetzt, gefolgt von 10,15 g (0,05 Mol) p-Nitrophenylchloroformat und zusätzlich 150 ml Tetrahydrofuran. Die Mischung wurde in einem Schüttler etwa 16 Stunden bei etwa 20ºC gehalten, dann filtriert, mit 4 x 125 ml Chloroform gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26 g. Analyse: C = 9,73%; H = 2,51%; N = 3,26%.
BEISPIEL 8
• 25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) wurden in 250 ml Tetrahydrofuran suspendiert und 10.12 g (0,1 Mol) Triethylamin wurden zugesetzt, gefolgt von 9,32 g (0,01 Mol) Epichlorhydrin. Die Mischung wurde in einem Schüttler etwa 19 Stunden bei 20ºC gehalten, dann filtriert, mit 2 x 250 ml Tetrahydrofuran, 2 x 250 ml Chloroform und 2 x 250 ml Aceton gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 25,5 g. Analyse: C = 7,84%, H = 1,61%; N = 2,63%.
BEISPIEL 9
• In einem Reaktionskessel wurden 25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,86% N, 0,05 meq) in 250 ml Tetrahydrofuran suspendiert und 11,25 g (0,055 Mol) 1,4 Butandiolglycidylether wurden zugesetzt. Die Mischung wurde in einen Schüttler gegeben, etwa 8 Stunden bei 20ºC , dann filtriert, mit 3 x 100 ml Methanol gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Analyse: C = 7,09%; H = 1,62%; N = 2,36%.
BEISPIEL 10
• Beispiel 9 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das Produkt mit 3 x 100 ml Aceton und 3 x 100 ml Diethylether gewaschen wurde. Analyse: C = 7,13%; H = 1,61%; N = 2,75%.
BEISPIEL 11
• 10 g (0,061 ml) 1,1'-Carbonyldiimidazol wurde in 150 ml Aceton suspendiert und die Suspension wurde zu 25 g Silica-PrSi-PEI (40 u, 2,8% N, 0,05 meq) in einem Reaktionskessel zugesetzt. Zusätzliche 100 ml Aceton wurden in den Reaktionskessel zugegeben und er wurde auf einem Rotavapor etwa 18 Stunden bei etwa 30ºC gehalten. Das Produkt wurde filtriert mit 3 x 250 ml Aceton und 1 x 250 ml Diethylether gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26 g. Analyse: C = 8,99%; H = 1,72%; N = 3,98%.
BEISPIEL 12
• 25 g Silica-PrSi-PEI (C = 5,92%, H = 2,82%; 0,05 meq) wurden in 125 ml Tetrahydrofuran suspendiert und 5,05 g (0,05 Mol) Triethylamin wurden zugesetzt und die Reaktionsmischung wurde bei etwa 20ºC etwa 10 Minuten gerührt, wonach 6,12 g (0,05 Mol) Ethylchloracetat zugesetzt wurden, gefolgt von 125 ml Tetrahydrofuran. Die Reaktionsmischung wurde bei etwa 20ºC in einem Schüttler etwa 24 Stunden gerührt, filtriert, mit 2 x 250 ml Chloroform, 2 x 250 ml Aceton gewaschen und bei etwa 80ºC etwa 4 Stunden getrocknet. Analyse: C = 6,61%; H = 1,67%; N = 2,80%.
BEISPIEL 13
• 2,5 g (0,013 ml) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid wurde in 50 ml Aceton:2-Propanol (1:1) gelöst. 1,3 g (0,011 Mol) N-Hydroxysuccinimid wurden in 100 ml Aceton suspendiert und in einem Schüttler gehalten (es löst sich nicht vollständig). 25 g des succinoylierten Silica-PrSi- PEI (C = 11,89%; H = 1,86%; N = 2,69%, Carboxylgruppe = 0,95 meq/g) wurden in einen Reaktionskessel gegeben und die Lösung von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid-Hydrochlorid in Aceton/2-Propanol wurde zugesetzt. Der Reaktionskessel wurde etwa 5 Minuten geschüttelt und dann wurde die Lösung von N-Hydroxysuccinimid in Aceton zugesetzt gefolgt von 25 ml 2-Propanol. Der Reaktionskessel wrude etwa 22 Stunden in einem Schüttler gehalten und dann wurde das Produkt filtriert, mit 2 x 250 ml Isopropanol, 2 x 250 ml Aceton gewaschen und bei etwa 80ºC 4 Stunden getrocknet. Ausbeute = 26,4 g. Analyse: C = 13,60%; H= 2,14%; N = 3,38%.
BEISPIEL 14
• Die Herstellung von Diazo-Affinitätschromatographie-Matrizen in Übereinstimmung mit dieser Erfindung kann entsprechend den folgenden Verfahren durchgeführt werden:
• A) Silica-PrSi-PEI wird mit p-Nitrobenzaldehyd in Methanol umgesetzt und das resultierende Produkt wird mit Natriumborhydrid in Methanol umgesetzt. Das Produkt wird in Natriumdithionit-Lösung bei etwa 60ºC suspendiert. Das resultierende Produkt wird mit eiskaltem HBF&sub4; umgesetzt und das Produkt wird filtriert, mit Eiswasser gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das gewünschte Diazoniumfluoborat-Produkt zu ergeben:
• B) Silica-PrSi-PEI wird mit p-Nitrobenzoylchlorid in Tetrahydrofuran und Triethylamin umgesetzt und das resultierende Produkt wird in einer Natriumditionit-Lösung suspendiert gefolgt durch eine Behandlung des Reaktionsproduktes mit eiskaltem HBF&sub4;, Filtrieren, Waschen mit Eiswasser und Trocknen des Produktes im Vakuum ergibt das gewünschte Diazoniumfluoborat-Produkt:
EXAMPLE 15
• 10 g Glutaraldehyd PEI-Silica-Gel Affinititsmatrix, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 6 hergestellt wurde, wurden mit 0,1 M Phosphat (pH 8,0) gewaschen bis der pH der ablaufenden Lösung gleich dem pH des Wasch-(Equilibrierungs-)Puffers ist. 20,0 ml einer 25 mg/ml menschlisches IgG-Lösung (in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0) wurde zu der Affinitätsmatrix zugegeben. Eine konzentrierte Proteinlösung wurde verwendet, um die Reaktionsvolumen klein zu halten und die Reaktion wurde über Nacht bei 4ºC ablaufen gelassen. Die Affinitätsmatrix wurde mit der folgenden Sequenz von Puffern gewaschen um das nicht kovalent gebundene Material zu entfernen: 0,1 M Phosphat, 0.1 M Phosphat + 1.5 M NaCl, 0,1 M Phosphat. Der pH aller Puffer wurde auf 8,0 eingestellt. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,2 M Ethanolamin (PH 8,0) gewaschen, um nichtreagierte Stellen abzudecken 1 bis 3 Stunden bei 4ºC. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,1 M Phosphat, pH 7,0 equilibriert. Die Affinitätsmatrix wurde bei 4ºC gelagert, wobei 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel zugesetzt wurde. 96% des Immunoglobulin-Proteins wurden immobilisiert, wie dies durch Analyse der in der Lösung verbliebenen Menge an Immunoglobulin-Protein mit Hilfe von Umkehrphasen HPLC bestimmt wurde. Der immobilisierte Antikörper war immunologisch wirksam, wie dies durch Retention seines spezifischen Antigen Somatotropins bestimmt wurde, wenn dieses Peptid in Lösung über eine gepackte Säule der Antikörperaffinitätsmatrix geleitet wurde. Strukturell nicht bestimmte Peptide wurden von der Säule nicht zurückgehalten.
BEISPIEL 16
• 5 g Glutaraldehyd PEI-Kieselgel-Affinitätsmatrix, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 6 hergestellt wurde, wurde mit 0,1 M Acetat (pH 8,7) gewaschen bis der pH der abströmenden Lösung gleich dem pH des Wasch- (Equilibrierungs-) Puffers war. 10 ml einer 30 mg/ml Chymotrypsinlösung in 0,1 M Acetatpuffer (pH 8,7) wurde zu der Affinititätsmatrix zugegeben. Eine konzentrierte Proteinlösung wurde verwendet, um das Reaktionsvolumen gering zu halten und die Reaktion wurde über Nacht bei 5ºC laufen gelassen. Die Affinitätsmatrix wurde mit 0,1 M Acetatpuffer pH 7,0 gewaschen, um nicht kovalent gebundenes Material zu entfernen. Die Affinitätsmatrix wurde bei 4ºC trocken oder in Acetatpuffer (pH 7,0): 2-Propanol (9:1) gelagert. 90% des Enzyms wurden immobilisiert, wie dies durch Analysieren der in Lösung verbliebenen Enzymproteinmenge durch Umkehrphasen-HPLC bestimmt wurde. Das immobilisierte Enzym wurde in eine Glassäule gepackt und wurde als Chromatographiematrix verwendet, um Aminosäuren und Aminosäurederivate zu chromatographieren.
BEISPIEL 17
• 50 mg Glutaraldehyd PEI-Silica Kieselgel Affinitätsmatrix, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 6 hergestellt wurde, wurden mit 0,05 bis 0,1 M Phosphat (pH 7,5 bis 8,5) gewaschen bis der pH der durchströmenden Lösung gleich dem pH des Wasch- (Equilibrierungs)-Puffers war. 2,0 ml einer 0,5 mg/ml Galactoseoxidase-Lösung (in 0,05 bis 0,01 M Phosphat oder Boratpuffer, pH 7,5 bis 8,5) wurde zu der Affinitätsmatrix zugesetzt. Eine konzentrierte Proteinlösung wurde verwendet, um das Reaktionsvolumen gering zu halten und die Reaktion wurde über Nacht bei 4ºC durchgeführt. Die Affinitätsmatrix wurde mit der folgenden Puffersequenz gewaschen, um nicht kovalent gebundenes Material zu entfernen: 0,1 M Phosphat, 0,1 M Phosphat + 1,0 M NaCl, 0,1 M Phoshphat, wobei der pH aller Puffer auf 8,05 eingestellt war. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,2 M Ethanolamin oder Tris (pH 8,0) gewaschen, um unreagierte Stellen abzudecken 1 bis 3 Stunden bei 4ºC. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,1 M Phosphat pH 7,0 equilibriert. Die Affinitätsmatrix wurde bei 4ºC gelagert. 98% des Enzyms wurden immobilisiert wie dies durch Analysieren mit Umkehrphasen-HPLC, der in der Lösung verbliebenen Enzymproteinmenge bestimmt wurde. Immobilisiertes Enzym war wirksam wie dies durch eine cholorimetrische Oxidations-Reduktions- Reaktion unter Verwendung von O-Dianisidin bestimmt würde.
BEISPIEL 18
• Triazin PEI-Kieselgel-Affinitätsmatrix, welche in Übereinstimmung mit Beispiel 3 hergestellt wurde, wurde mit 0,1 M Phosphat (pH 7,5) gewaschen bis der pH der durchströmenden Lösung gleich dem pH des Waschpuffers war. 2,5 ml einer 1 mg/ml Peroxidaselösung (in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5) wurde zu der Affinitätsmatrix zugesetzt und bei Raumtemperatur 4 Stunden reagieren gelassen. Die Affinitätsmatrix wurde mit der folgenden Puffersequenz gewaschen, um nicht kovalent gebundenes Material zu entfernen: 0,1 M Phosphat, 0,1 M Phosphat + 1,0 M NaCl, 0,1 M Phosphat). Ein pH von 8,0 wurde für alle Puffer verwendet. Die Affinitätsmatrix wurde dann mit 0,2 M Ethanolamin (pH 8,0) 1 bis 3 Stunden bei Raumtemperatur gewaschen, um die unreagierten Stellen abzudecken. Dann wurde die Affinitätsmatrix mit 0,1 M Phosphat, pH 7,0, equilibriert. Die Affinitätsmatrix wurde bei 4ºC gelagert. Das Immoblisierungsverfahren wurde durch Beobachtung der Absorption bei 280 nm der überstehenden Lösung von der Reaktionssuspension bestimmt. 54% des Enzyms in Lösung wurden absorbiert. Das immobilisierte Enzym zeigte 55% Wirksamkeit einer äquivalenten Menge eines löslichen Enzyms.
BEISPIEL 19
• 50 mg Glutaraldehyd PEI-Kieselgel-Affinitätsmatrix wurden sorgfältig mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8 gewaschen und mit demselben Puffer equilibriert. 2,5 ml einer 0,8 mg/ml Lösung von β-Galactosidase wurde zu der Affinitätsmatrix-Suspension zugesetzt und die Immobilisierungsrate wurde durch Beobachtung der Absorption bei 280 nm der überstehenden Lösung bestimmt. Nach 20 Stunden bei 4ºC waren 73% des Enzyms an die Matrix gebunden und zeigten 40% der spezifischen Aktivität des löslichen Enzyms.

Claims (6)

1. Festphasenträger gewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem Träger der allgemeinen Formel

Silica-PrSi-PEI(R)x,

worin Silica-PrSi-PEI ein kovalent gebundener, nicht quervernetzter Polyethylenimin gebundener Festphasenträger ist, welcher das Reaktionsprodukt von

(1) a) teilchenförmigem Silicagel mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 1 bis 100 um und einer mittleren Porengröße von 0 bis 100 nm (0 bis 1000Angström) oder

b) teilchenförmigen kontrollierten Porenglas mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 1 bis 100 um und einer mittleren Porengröße von 0 bis 100 nm (0 bis 1000Angström) mit

(2) Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan, welches ein mittleres Molekulargewicht von 400 bis 1800 aufweist, ist oder

(b) dem schwach sauren carboxylierten Produkt des festen Silica-PrSi-PEI Trägers mit einem dibasigen Säureanhydrid, wobei das carboxylierte Produkt von 0,3 bis 1,2 Carboxyl- Milliäquivalente pro Gramm enthält

und worin R im Fall des nicht-schwach sauren carboxylierten Trägers der Rest von jeder chemisch reaktiven Einheit ist, welche fähig ist, eine nukleophile Substituenten an zwei unterschiedlichen Stellen einzugehen, so daß R an einer derartigen Stelle kovalent an die primären oder sekundären Aminogruppen des PEI gebunden wird, wohingegen die andere Stelle für eine folgende nukleophile Substitution unter nicht-denaturierende Bedingungen mit einem Affinitätschromatographie ligand verfügbar und reaktiv bleibt, um eine zweite kovalente Bindung zu bilden, welche unter wäßrigen hydrolytischen Pufferbedingungen stabil ist und X eine positive ganze Zahl bedeutet, welche kleiner oder gleich der Gesamtzahl von primären oder sekundären Aminogruppen in der PEI-Einheit ist

und im Fall des schwach sauren carboxylierten Trägers R der Rest von jeder chemisch reaktiven Einheit ist, welche zur leichten nukleophilen Verlagerung der Hydroxylgruppe des Carboxyl fähig ist, um eine kovalente Bindung an dem Carboxyl-Kohlenstoff zu bilden, wobei eine ausreichend elektrophile Stelle gebildet wird, so daß sie leicht an den Carboxyl- Kohlenstoff mit einer nukleophilen funktionellen Gruppe auf einem Affinitätschromatographieliganden verlagert werden kann und X eine positive ganze Zahl bedeutet, welche kleiner oder gleich der Gesamtzahl der Carboxylgruppen in der carboxylierten PEI-Einheit ist.

2. Festphasenträger nach Anspruch 1, worin das Silicagel einen mittleren Teilchendurchmesser von 3 bis 70 um und eine mittlere Porengröße von 5 bis 100 nm (50 bis 1000 Angström) aufweist.

3. Festphasenträger nach Anspruch 1 oder 2, worin R aus

gewählt ist.

4. Immobilisiertes Festphasenenzym, umfassend das Enzym immobilisiert auf einem Affinitätschromatographiematrix- Festphasenträger, worin der Festphasenträger wie in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert ist.

5. Ligandengebundene Affinitätschromatograpiematrix, worin die Affinitätsmatrix aus einem Träger (a) und einem Produkt (b) wie in den Ansprüchen 1 bis 3 definiert, gewählt ist.

6. Verfahren zum Abtrennen oder Reinigen einer Substanz aus einer Lösung durch Binden der Substanz in Lösung mit einer Affinitätsmatrix, welche einen Lignaden für die Substanz kovalent an die Affinitätsmatrix gebunden aufweist, worin die Affinitätsmatrix ein Festphasenträger nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist.