DE69633567T2

DE69633567T2 - Verfahren zur reinigung von proteinen

Info

Publication number: DE69633567T2
Application number: DE69633567T
Authority: DE
Inventors: François Pierre FAUQUEX; Catherine Georges
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1995-07-26
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2016-07-18
Also published as: WO1997005159A3; JPH11509853A; ZA966315B; TW442492B; EP0840746A2; CA2226080A1; PT840746E; US5990289A; DK0840746T3; AU6700796A; ATE278705T1; ES2227603T3; JP3833255B2; DE69633567D1; EP0840746B1; WO1997005159A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung von Proteinen unter Verwendung der Kupfer-Chelat-Affinitätschromatographie.
Die Kupfer-Chelat-Affinitätschromatographie funktioniert oder wirkt durch Bindung der verfügbaren oder zugänglichen Elektronen spendenden Gruppe eines Proteins, wie z. B. Histidin, an ein Kupferion, das gehalten oder festgehalten wird durch eine chelatisierende Gruppe, die kovalent gebunden ist an einen stationären Träger. Das Vorliegen oder die Gegenwart eines einzelnen verfügbaren oder zugänglichen Histidins ist in der Regel ausreichend für die Adsorption eines Proteins an ein Kupfer(II)-IDA-Chelat (IDA = Iminodiacetat). Die Proteinretention in einer Kupfer-Chelat-Affinitätschromatographie hängt ab von der Anzahl und dem Typ von Seitengruppen an dem Protein, die mit dem Metall wechselwirken können. Diese Wechselwirkung wird beeinflusst durch eine Vielzahl oder Verschiedenheit von unabhängigen Variablen, wie z. B. pH, Temperatur, Lösungsmitteltyp, Salztyp und Salzkonzentration. Die Proteine, die gebunden sind an das Kupfer-Chelat in einem neutralen oder schwach alkalischen pH Bereich, werden in der Regel eluiert durch einen abnehmenden pH Gradienten (kontinuierlich oder stufen- oder schrittweise) oder durch einen zunehmenden Konzentrationsgradienten (kontinuierlich oder stufen- oder schrittweise) eines kompetitiven Mittels, z. B. einer Lewis-Base, wie z. B. Imidazol, in einem Puffer. Alternativ schließt ein drittes mögliches Elutionsverfahren ein Chelatisierungsmittel, wie z. B. EDTA, in dem Elutions- oder Laufmittel ein.
Diese Verfahren weisen jedoch mehrere Nachteile auf:

– Geringe Selektivität, d. h. mehrere Proteine werden unter den gleichen Bedingungen eluiert.
– Geringe Anreicherung.
– Co-Elution des Proteins mit hohen Konzentrationen an Kupfer(II)-ionen, wenn kompetitive oder ihelatisierungsmittel verwendet werden.
– Weitere Reinigungsschritte sind notwendig, um das Elutionsmittel zu entfernen.
– In der Regel muss ein kontinuierlicher Gradient angewendet werden für die Elution des gewünschten Proteins, um die Selektivität zu erhöhen.

Z. B. in einem Fall, bei dem das Protein eluiert wird unter Verwendung eines kompetitiven oder Chelatisierungsmittels, enthält die Elution das Protein, das kompetitive oder Chelatisierungsmittel und gelöste oder freigesetzte oder freigegebene Kupfer(II)-ionen. Daher müssen das kompetitive Mittel und die Kupfer(II)-ionen entfernt werden durch zusätzliche Reinigungsschritte, und außerdem sind eine Menge von Proteinen in Gegenwart von hohen Konzentrationen an Kupfer(II)-ionen in Lösung (Oxidation) oder bei niedrigen pH Werten (Präzipitation) instabil und werden inaktiviert.
Die vorliegende Erfindung stellt nun ein überraschend vorteilhaftes Verfahren für die Elution von Proteinen aus einem Kupfer-Chelatkomplex bereit. Unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es überraschenderweise möglich, das gewünschte Protein mit de- oder entionisiertem Wasser zu eluieren, das gegebenenfalls zusätzliche Stabilisatoren für das Protein enthalten kann. Die Verwendung von deionisiertem Wasser weist mehrere Vorteile gegenüber dem Stand der Technik auf:

– Kein kompetitives oder Chelatisierungsmittel wird verwendet, und daher sind keine zusätzlichen Reinigungsschritte notwendig.
– Das gewünschte Protein wird nicht co-eluiert mit hohen Konzentrationen an Kupfer(II)-ionen, die Oxidationsprobleme verursachen können.
– Das gewünschte Protein wird nicht eluiert bei niedrigen pH Werten, die Präzipitations- oder Inaktivierungsprobleme verursachen können.
– Das gewünschte Protein wird in einer besonders hohen Reinheit und mit einer hohen Ausbeute gewonnen.
– Die Elution kann in einem Schritt ausgeführt werden anstelle einer Anwendung eines Gradienten (kontinuierlich oder schrittweise).
– Das eluierte Protein kann gelagert werden ohne weitere Behandlung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung eines unreinen oder vorgereinigten Proteins, das die folgenden Stufen umfasst:

a) Adsorption des unreinen oder vorgereinigten Proteins an immobilisierte Kupfer(II)-ionen,
b) Waschung des adsorbierten Proteins mit einer Lösung einer Lewis-Base und
c) Elution des gewünschten Proteins mit deionisiertem Wasser, das nicht mehr als 0,001 M an ionischen Verbindungen enthält.

In der Regel werden die Kupfer(II)-ionen an einem stationären Träger immobilisiert, d. h. z. B. an einem anorganischen Träger, wie z. B. Silica oder Siliciumoxid oder einer polymeren Matrix.
Es ist notwendig, dass der stationäre Träger in der Lage oder dazu eingerichtet ist, Chelate mit Kupfer(II)-ionen zu bilden. Beispiele solcher stationären Träger sind solche, in denen chelatisierende Gruppen, wie z. B. Imidoessigsäure (IDA), N,N,N'-Tris(carboxymethyl)ethenylendiamin (TED), carboxymethylierte Asparaginsäure (CM-ASP), Tetraethylenpentamin (TEPA), Nitriloessigsäure (NTA) oder carboxymethylierte α,β-Diaminosuccin- oder -bernsteinsäure (CM-DASA), kovalent an den stationären Träger oder die stationäre Phase gebunden sind. Die chelatisierenden Gruppen können direkt oder über Spacer oder Abstandshalter an dem stationären Träger befestigt sein. Der polymere Träger kann irgendeine polymere Verbindung sein, die herkömmlicherweise verwendet wird für die Metallionen-Affinitätschromatographie. Beispiele solcher polymeren Materialien schließen Agarose, Dextrane oder andere synthetische Polymere ein; bevorzugt sind Agarose und Vinylpolymere. Verfahren zur Herstellung stationärer Träger, die kovalent gebundene chelatisierende Gruppen aufweisen, sind z. B. beschrieben in Hochuli, CHIMIA (1986), 40, 408 bis 412 (siehe auch Figueroa et al., J. Chromatography (1986), 371, 335 bis 352; Porath, Protein expression and purification (1992), 3, 263 bis 281; L. Kågedal in „Protein purification, principles, high resolution methods and applications", Janson and Ryden Hrsg. (1989), 227 bis 251, VCH Publishers, New York). Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der stationäre Träger in der Lage oder dazu eingerichtet, Chelate mit Kupfer(II)-ionen bei einer Konzentration von 1 bis 200, und besonders bevorzugt 10 bis 100, μmol/ml des stationären Trägers zu bilden.
Geeignete polymere Träger zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung sind auch kommerziell erhältlich, wie:

– Chelating-Sepharose Fast Flow^® (Pharmacia, Uppsala), worin Iminodiessigsäuregruppen an Spacern gebunden sind an Sepharose Fast Flow durch stabile Etherbindungen;
– Chelating Sepharose 6B^® (Pharmacia, Uppsala); und
– TSK Toyopearl AF-Chelate-650 M^® (TosoHaas, Stuttgart), worin Iminodiessigsäuregruppen an einem hydrophilen semi- oder halbstarren stationären Träger aus einem Copolymer von Oligoethylenglycol, Glycidylmethacrylat und Pentaerythroldimethacrylat immobilisiert sind.

Vor der Immobilisierung von Kupfer(II)-ionen wird der stationäre Träger in der Regel gewaschen. Der stationäre Träger wird z. B. nacheinander oder schrittweise gewaschen mit 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 7, Bettvolumen von 5 bis 50%, vorzugsweise 10 bis 30%, Ethanol; 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 7, Bettvolumen von deionisiertem Wasser, 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 7, Bettvolumen an 0,01 bis 0,1 M, vorzugsweise 0,03 bis 0,07 M, EDTA und 0,1 bis 1 M, vorzugsweise 0,3 bis 0,7 M, NaCl; 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 7, Bettvolumen an 0,05 bis 1 M, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 M, NaOH und 0,1 bis 5 M, vorzugsweise 0,5 bis 2 M, NaCl; 1 bis 15, vorzugsweise 3 bis 10, Bettvolumen an deionisiertem Wasser; schließlich 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 7, Bettvolumen an 0,01 bis 1%, vorzugsweise 0,05 bis 0,5%, Ameisensäure, und 1 bis 15, vorzugsweise 3 bis 10, Bettvolumen an deionisiertem Wasser. Die Flussrate dieser Waschlösungen beträgt in der Regel 1 bis 50, vorzugsweise 5 bis 20, Bettvolumen pro Stunde.
Die Immobilisierung von Kupfer(II)-ionen an dem obigen stationären Träger kann einfach erreicht werden durch Beladen oder Auffüllen des stationären Trägers mit Kupfer(II)-ionen. Herkömmliche Kupfer(II)-ionenquellen sind Kupfer(II)-salze, wie z. B. CuCl₂, Cu(CH₃COO)₂ und insbesondere CuSO₄. In der Regel werden 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 7, Bettvolumen an 0,001 bis 0,1 M, vorzugsweise 0,003 bis 0,01 M, wässerige CuSO₄ × 5H₂O Lösung verwendet, und nacheinander wird der stationäre Träger gewaschen mit einem großen Überschuss an Wasser, um die verbleibenden nicht gebundenen Kupfer(II)-ionen zu entfernen oder zu eliminieren. Der auf diese Weise hergestellte stationäre Träger, der immobilisierte Kupfer(II)-ionen enthält, ist fertig zur Verwendung für das Verfahren der vorliegenden Erfindung.
In Abhängigkeit von dem stationären Träger, dem pH und der Ionenstärke der das Protein enthaltenden Lösung, ist es manchmal bevorzugt, den stationären Träger mit einer Lösung zu behandeln, die den gleichen pH und Ionenstärke aufweist vor dem Beladen oder Einbringen der das Protein enthaltenden Lösung, um ein Quellen oder Schrumpfen zu vermeiden, wenn das Protein adsorbiert wird. Die Notwendigkeit für eine solche Behandlung kann leicht untersucht werden durch einen Test im kleinen Maßstab. Diese Vorbehandlung kann erreicht werden durch Hindurchfließenlassen von 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 7, Bettvolumen der Behandlungslösung durch den stationären Träger.
Die Adsorption des Proteins an dem oben zubereiteten stationären Träger durch Chelatbildung wird einfach erreicht durch Beladen einer Lösung, die das Protein enthält, auf die Säule, die die immobilisierten Kupfer(II)-ionen enthält.
Die Proteinlösung kann von verschiedener Herkunft sein und kann vorgereinigt sein oder nicht. Wenn das Protein, das isoliert werden soll, z. B. von dem Wirt in die Kulturbrühe ausgeschieden wird, ist es z. B. möglich die Kulturbrühe nach einer Zentrifugation direkt auf den stationären Träger anzuwenden oder einzusetzen. Wenn das Protein innerhalb des Wirts hergestellt und gelagert oder gespeichert wird, müssen die Zellen aufgeschlossen oder aufgebrochen werden, und die das Protein enthaltende Lösung muss von den Zellrückständen, z. B. durch Zentrifugation, abgetrennt werden. Die das Protein enthaltenden Lösungen, die soweit erhalten wurden, können direkt auf den stationären Träger angewendet werden, wie es oben beschrieben ist, oder können weiter gereinigt werden, z. B. durch Präzipitation oder Kristallisation, Extraktion oder chromatographische Mittel, die alle im Stand der Technik wohl bekannt sind. Demzufolge kann die Lösung, die das Protein enthält, von verschiedener Herkunft sein, und sie kann verschiedene Verunreinigungen enthalten, wie z. B. ionische Spezien, fremde Proteine, etc.
Ob ein Protein nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt werden kann oder nicht, kann einfach bestimmt werden in einem Test in einem kleinen Maßstab, wobei das Protein auf eine kleine Menge des mit Kupfer(II) beladenen stationären Trägers adsorbiert wird, mit einer Lewis-Base, wie unten definiert, behandelt wird und nachfolgend die Menge des Proteins, die mit deionisiertem Wasser eluiert werden kann, bestimmt und verglichen wird mit der Menge des Proteins, die mit 2 M NH₄Cl eluiert werden kann. Im Allgemeinen kann das erfindungsgemäße Verfahren auf Proteine angewendet werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Lewis-Base, wie sie unten definiert ist, nicht vollständig einen Komplex zwischen dem Protein und Kupfer(II)-ionen zerstört. Bevorzugte Proteine sind Interferon, Amylase, Trypsin und verwandte Proteine. Insbesondere bevorzugt sind Interferon-α, Trypsin und α-Amylase.
Die Menge der das Protein enthaltenden Lösung, die auf den stationären Träger gegeben oder beladen wird, ist abhängig von der Konzentration der Kupfer(II)-ionen, die auf diesem stationären Träger immobilisiert sind, der Konzentration des Proteins in der Lösung und der Natur des Proteins. Daher wird die geeignete Menge der Lösung, die aufgetragen oder beladen wird, empirisch bestimmt durch Beobachtung des Abflusses unter Verwendung eines Detektors, wie z. B. eines UV-Kontrollinstruments.
Eine wichtige Stufe oder ein wichtiger Schritt gemäß der Erfindung ist die Waschung des Proteins, das an dem stationären Träger adsorbiert ist, mit einer Lewis-Base vor der Elution mit deionisiertem Wasser. Eine Lewis-Base ist ein Elektronenpaardonor, wie z. B. Amine, HO^–, Phosphan oder Phosphine. Beispiele sind NH₃, CH₃NH₂, (CH₃)₂NH, (CH₃)₃N, C₂H₅(CH₂)₂N, C₂H₅NH₂, (C₂H₅)₂NH, (C₂H₅)₃N, C₃H₇NH₂, C₄H₉NH₂, C₅H₁₁NH₂, C₆H₁₃NH₂, CH₃PH₂, (CH₃)₂PH, (CH₃)₃P, Aminosäuren, Cystin, Hydroxylgruppen tragende oder enthaltende Amine, wie z. B. HOCH₂NH₂, (HOCH₂)₂NH oder (HOCH₂)₃N, HOC₂H₄NH₂, (HOC₂H₄)₂NH oder (HOC₂H₄)₃N; oder TRIS-HCl.
Bei einer bevorzugten Form der Erfindung enthält die Lösung der Lewis-Base NH₄ ⁺ oder ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin in einem neutralen oder schwach alkalischen pH Bereich oder OH^– bei einem stark alkalischen pH Bereich. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Lösung der Lewis-Base NH₄ ⁺ oder ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin und ist ganz besonders bevorzugt eine Lösung, die NH₄ ⁺ oder ein primäres Amin enthält, wie z. B. Ethanolamin, Cystin, NH₄SCN, NH₄Cl, NH₄ ⁺CH₃COO^–, (NH₄)₂SO₄ und TRIS-HCl.
Um das gewünschte Protein nicht mit der Lösung der Lewis-Base zu eluieren, kann die Konzentration der Lewis-Base oder der pH der Lösung, die die Lewis-Base enthält, reguliert werden. Ein bevorzugter Bereich für die Konzentration des Amins (Lewis-Base) beträgt von 0,001 bis 1 M.
Die optimale Konzentration der Lewis-Base hängt stark ab von dem Elektronendonor. Eine Konzentration von 1 mM ist z. B. optimal in dem Fall von Cystein, während die Konzentration von 300 bis 500 mM optimal ist in dem Fall von NH₄Cl. Optimale Konzentrationen von mehreren Salzen sind z. B. 10 bis 100 mM für NH₄SCN, 10 bis 500 mM für NH₄Cl, 10 bis 800 mM oder mehr für NH₄(CH₃COO) und 10 bis 500 mM oder mehr für (NH₄)₂SO₄.
Wenn ein Amin als Lewis-Base verwendet wird, wird der pH eingestellt, vorzugsweise auf pH 6 bis 9, besonders bevorzugt auf 6,5 bis 8,5, und ganz besonders bevorzugt auf 7,0 bis 8,0. Wenn OH^– als Lewis-Base verwendet wird, wird der pH vorzugsweise auf 9 bis 11 eingestellt, z. B. mit Borat- oder Phosphatpuffer.
Es ist auch möglich, Mischungen von verschiedenen Lewis-Basen zu verwenden, um die Ergebnisse zu verbessern oder zusätzlich Salze zuzugeben, die keine Lewis-Basen sind, wie z. B. NaCl oder KCl. Die Konzentration der (des) zusätzlichen Salzes) kann bis zu 5 M und vorzugsweise bis zu 2 M betragen.
Typischerweise wird die stationäre Phase, an welche das Protein bereits adsorbiert ist, mit 1 bis 10 oder vorzugsweise 3 bis 7 Bettvolumen der oben beschriebenen Waschlösung gewaschen. Die Flussrate wird empirisch bestimmt und beträgt z. B. 1 bis 10 oder vorzugsweise 3 bis 5 Bettvolumen/Stunde.
Die Stufe oder der Schritt der Waschung, wie oben beschrieben, wird vorzugsweise durchgeführt unmittelbar vor der Elution des Proteins mit deionisiertem Wasser. Es ist auch möglich, diesen Waschschritt simultan oder gleichzeitig, mit dem Beladen oder dem Aufbringen des Proteins durchzuführen, unter der Bedingung, dass der Schritt oder die Stufe der Elution unmittelbar danach erfolgt.
Das gewünschte Protein kann eluiert werden nach dem Waschen oder der Waschung mit einer Lewis-Base, wie oben beschrieben, durch einfache Waschung des stationären Trägers mit deionisiertem Wasser. Um eine hohe Reinheit zu erhalten, sollte das deionisierte Wasser nicht mehr als 0,001 M ionische Verbindungen enthalten. Im Gegensatz dazu kann das deionisierte Wasser nicht-ionische Verbindungen, z. B. um die Tertiär- oder Quartärstruktur des Proteins zu stabilisieren, enthalten. Geeignete nicht-ionische Verbindungen sind z. B. Zucker oder Polyole, wie Mannit, Glucose, Lactose, Fructose, Glycerin, Polyethylenglycol; oder andere Verbindungen, die die Oxidationsstufe der Sulfhydrylgruppen des Proteins aufrechterhalten. Das deionisierte Wasser wird vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 10 und ganz besonders bevorzugt 3 bis 7 Bettvolumen verwendet.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die meisten fremden Proteine, die spezifisch an den stationären Träger gebunden sind, nicht mit deionisiertem Wasser eluiert. Sie bleiben adsorbiert und können danach entfernt werden unter Verwendung einer klassischen Elutionslösung (z. B. 2 M NH₄Cl in 25 mM TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6). Daher ist die erhaltene Anreicherung des Produkts besonders hoch. Z. B. ist für den Fall von Interferon-α B₁D₂B₃B₄ die Produktreinheit so hoch wie etwa 90%, ausgehend von einer Adsorptionslösung von 30% Reinheit, während die Kupfer-Chelat-Affinitätschromatographie aus dem Stand der Technik eine Reinheit von nur 30 bis 50% erreicht.
Um die Reinheit und die Wieder- oder Rückgewinnung des gewünschten Proteins zu optimieren, können eine oder mehrere zusätzliche Waschschritte oder Waschungsstufen mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. Kaliumboratpuffer und/oder mit deionisiertem Wasser gegebenenfalls eingeschoben werden zwischen den Schritt oder die Stufe der Adsorption des Proteins und die Stufe der Waschung mit einer Lewis-Base. Demzufolge wird bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung das adsorbierte Protein mit einem Puffer gewaschen, der keine Lewis-Base ist, und/oder mit deionisiertem Wasser vor einer Waschung mit einer Lösung einer Lewis-Base. Dieses Ergebnis ist überraschend, da die Waschstufe und die Elutionsstufe unter Verwendung des gleichen Mittels, nämlich deionisiertem Wasser, durchgeführt werden können.
Diese Zwischenwaschungsstufe unter Verwendung von deionisiertem Wasser ist wirksam z. B. zur Eliminierung oder Beseitigung von Nebenprodukten, insbesondere solchen, die an den stationären Träger gebunden sind durch hydrophobe Wechselwirkungen (und nicht durch spezielle Kupferionenaffinität).
Wie aus anderen Reinigungsverfahren basierend auf Kupfer(II)-Chelaten bekannt ist, kann die Lösung des isolierten Proteins geringe Mengen an Kupfer(II)-ionen enthalten. Diese Ionen können einfach entfernt werden durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, wie Ionenaustausch- oder Kupfer(II)-ionen chelatisierende Säulen. Der letzt genannte Reinigungsschritt kann separat oder getrennt oder unmittelbar danach ausgeführt werden, z. B. durch Befüllen des unteren Teils der Säule mit dem Kupfer(II)-ionen entfernenden Material.
Nach der Reinigung kann der mit Kupfer beladene stationäre Träger gewaschen werden und für eine weitere Reinigung verwendet werden oder, vorzugsweise um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, werden die Kupfer(II)-ionen von dem stationären Träger mit einem kompetitiven Chelatisierungsmittel, z. B. EDTA, entfernt, und nachfolgend wird der stationäre Träger wieder mit Kupfer(II)-ionen, wie oben beschrieben, beladen.
Beispiele
Beispiel 1: Reinigung von IFN-B/D
Das rekombinante menschliche Hybridinterferon-α B₁D₂B₃B₄, das nachfolgend als IFN-B/D bezeichnet wird, ist aufgebaut, wie in EP 0 205 404 A beschrieben. IFN-B/D wird hergestellt durch den Saccharomyces cerevisiae Stamm HT 393, der identisch ist zu E 95-1-2A, veröffentlicht von Heinemeyer et al. (EMBO Journal (1991), 10, 555 bis 562, DSM 9697), und der mit dem Plasmid pDP34R/PHO5/IFN AM119 transformiert wurde. Der Hefenvektor pDP34R und der Hefen-saure Phosphatase-Genpromoter PHO5 beziehen sich auf Hinnen et al. (in: Yeast Genetic Engeneering", Barr et al., Hrsg., Butterworths, Boston, (1989), 193 bis 213). IFN AM 119 ist die codierende Sequenz von IFN-B/D und bezieht sich auf EP 0 205 404 A .
Der Hefenstamm HT 393, der das rekombinante Plasmid enthält, das IFN-B/D codiert, wird in großen Fermentationstanks oder -behältern gezüchtet. Nachdem die Fermentation vervollständigt ist, wird die Biomasse gesammelt durch Zentrifugation. Das erhaltene Zellsediment wird verdünnt auf eine nasse oder feuchte Zellkonzentration von 50% (trockene Zellkonzentration etwa 10%) mit einem 0,07 M Kaliumphosphatpuffer mit pH 7, der 0,5 M NaCl enthält. Nach dem Aufbrechen oder dem Aufschließen der Zellen durch einen Durchgang oder ein Passieren durch eine Glaskugelmühle wird das IFN-B/D-Protein aus dem Zellhomogenat extrahiert durch Verteilung in einem wässerigen Zwei-Phasen-System, das 40 Gew.-% des Zellhomogenats, 18 Gew.-% Polyethylenglycol 1500, 4 Gew.-% Kaliumphosphat mit pH 7 und NaCl in einer Gesamtkonzentration von 1 mol/kg enthält. Nach einer Phasentrennung durch einen Durchgang oder ein Passieren durch einen Zentrifugalscheibenstackseparator bei 8150 UpM (13000 g), wird die obere Phase gesammelt und gewaschen durch Verteilung in einem zweiten wässerigen Zwei-Phasen-System, gebildet durch Mischen von 4 Gewichtsteilen der oberen Phase und 1 Gewichtsteil einer 1 mol/kg NaCl Lösung, die 20 Gew.-% Kaliumphosphat mit pH 7 enthält. Nach der Phasentrennung in einem Absetztank wird IFN-B/D wieder- oder rückgewonnen aus der neuen oberen Phase, die erhalten wird durch Rückextraktion in ein drittes wässeriges Zwei-Phasen-System, das erzeugt wird durch Mischen von 3 Gewichtsteilen der oberen Phase des zweiten Zwei-Phasen-Systems und 7 Gewichtsteilen einer 1,56 mol/kg Magnesiumsulfatlösung. Nach der Phasentrennung in einem Setz- oder Klärtank wird die schwere Phase gesammelt, mit einem doppelten Volumen an Wasser verdünnt, durch einen 0,2 μm Filter gefiltert, dann bei 4°C über einen Zeitraum von wenigen Tagen vor einem Bearbeiten oder Verarbeiten durch eine Kupfer-Chelat-Chromatographie gelagert.
Diese Adsorptionslösung weist die folgenden Eigenschaften auf: pH 5,6, Leitfähigkeit etwa 43 mS/cm (hauptsächlich aufgrund von MgSO₄), Polyethylenglycolkonzentration 6 mg/ml, IFN-B/D Konzentration von etwa 0,1 bis 0,15 mg/ml, IFN-B/D Reinheit von etwa 30% des gesamten Proteingehalts.
Die Kupfer-Chelat-Chromatographie wird bei Raumtemperatur durchgeführt unter Verwendung einer Säule (Durchmesser 44 mm), die gefüllt ist mit 100 ml Chelating-Sepharose Fast Flow^® (Pharmacia, Uppsala). Der stationäre Träger wird nacheinander gewaschen mit: 5 Bettvolumen von 20% Ethanol, 5 Bettvolumen deionisiertem Wasser, 5 Bettvolumen an 0,05 M EDTA und 0,5 M NaCl, 5 Bettvolumen an 0,25 M NaOH und 1 M NaCl, 7 Bettvolumen an deionisiertem Wasser, 5 Bettvolumen an 0,1% Ameisensäure und 7 Bettvolumen an deionisiertem Wasser, bei einer Flussrate von 12 Bettvolumen pro Stunde. Dann wird die stationäre Phase beladen mit Kupfer(II)-ionen durch Beladen oder Aufbringen von 5 Bettvolumen einer 0,008 M CuSO₄·5H₂O Lösung und wird gewaschen mit großen Mengen an deionisiertem Wasser, um das verbleibende ungebundene Kupfer zu eliminieren oder zu entfernen. Vor dem Schritt oder der Stufe der Adsorption wird die Säule mit 500 ml einer Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht oder äquilibriert, die zusammengesetzt ist aus 0,68 M MgSO₄ und 0,092 M Natriumacetat, die auf einen pH von 5,6 eingestellt ist, mit Essigsäure, die etwa die gleiche Leitfähigkeit wie die Adsorptionslösung aufweist, d. h. 43 mS/cm. Dann wird ein Volumen von 5000 ml der IFN-B/D Adsorptionslösung bei einer Flussrate von 300 ml/h auf die Säule aufgebracht oder beladen. Der Ausfluss wird verfolgt durch ein UV-Erkennungs- oder Untersuchungsinstrument, das auf eine Wellenlänge von 280 nm gesetzt ist.
Nach dem Beladen werden drei nachfolgende Waschungen ausgeführt bei einer Flussrate von 500 ml/h: Die erste mit 500 ml des Gleichgewichtspuffers mit pH 5,6, der bereits verwendet wurde vor der Adsorption, die zweite mit 500 ml an deionisiertem Wasser und die dritte mit 500 ml an 0,025 M TRIS-HCl-Puffer mit pH 7,6, der 0,2 M NH₄Cl und 1 M NaCl enthält. Dann wird IFN-B/D eluiert unter einfach erneuter Verwendung von 400 ml deionisiertem Wasser bei einer Flussrate von 500 ml/h. Die 3 Waschungen und das Wassereluat werden gesammelt, wie es kontrolliert wird durch das UV-Untersuchungsinstrument.
Die IFN-B/D Konzentration der Adsorptionslösung, der 3 Waschlösungen und des Wassereluats wird gemessen durch Umkehrphasen-HPLC-Analyse (Säule: Vydac C-18, 30 nm, Partikelgröße 5 μm; mobile Phase A: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, mobile Phase B: 80% Acetonitril, 19,91% Wasser und 0,09% Trifluoressigsäure; Flussrate 1 ml/min, Injektionsvolumen 0,05 ml, UV-Detektion bei 216 nm).
Die Menge an IFN-B/D, die in den 3 Waschflüssigkeiten gefunden wurde, ist vernachlässigbar. Entgegen allen Erwartungen wird gefunden, dass das Wassereluat IFN-B/D enthält, das wieder gewonnen wird mit einer Ausbeute von etwa 70% und das eine hohe Reinheit aufweist: Etwa 90% des gesamten Proteingehalts (d. h. Anreicherung von IFN-B/D um einen Faktor 3).
Diese Elution mit Wasser ist besonders überraschend, da kein IFN-B/D in der zweiten Waschflüssigkeit gefunden wird (Wiedergewinnungsausbeute weniger als 5%), die genau aus der gleichen Flüssigkeit besteht, d. h. reines Wasser).
Das Wassereluat, das eine besonders hohe IFN-B/D Konzentration (etwa 1 mg/ml) bei einer niedrigen Salzkonzentration und bei einem pH Wert von etwa 8 aufweist, ist stabil, wenn es bei 4°C gelagert wird: Keine Präzipitation von IFN-B/D findet über Tage hinweg statt.
Beispiel 2: Charakterisierung von verschiedenen IFN-B/D Lösungen, die durch Elution mit Wasser erhalten werden
Wässerige Lösungen von IFN-B/D werden erhalten durch Elution mit Wasser auf eine ähnliche Art und Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, aber durch Veränderung des Volumens an Wasser, das verwendet wird für die Elution und/oder die Zusammensetzung des Puffers, der verwendet wird für die Stufe der Waschung, die der Elution mit Wasser unmittelbar vorausgeht.
Eine erste IFN-B/D Lösung wird erhalten unter Verwendung des gleichen Waschpuffers, wie er in Beispiel 1 genannt wird (0,025 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6, der 0,2 M NH₄Cl und 1 M NaCl enthält) und unter Verwendung von nur etwa 0,67 Bettvolumen an deionisiertem Wasser für die Elution.
Eine zweite IFN-B/D Lösung wird erhalten unter Verwendung von 0,025 M Kaliumphosphatpuffer mit pH 7,6, der 0,2 M NH₄Cl als Waschpuffer enthält und 1,5 Bettvolumen an deionisiertem Wasser für die Elution.
Eine dritte IFN-B/D Lösung wird erhalten unter Verwendung von 0,025 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6 (ohne NH₄Cl und ohne NaCl) als Waschpuffer und 4 Bettvolumen an deionisiertem Wasser für die Elution. Die Eigenschaften der 3 IFN-B/D Lösungen sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1 Eigenschaften der verschiedenen IFN-B/D Lösungen, die durch Elution mit Wasser erhalten werden
Die erste Lösung weist eine besonders hohe Interferonkonzentration (7 mg/ml) auf, und man findet, dass sie überraschenderweise stabil ist, wenn sie bei 4°C gelagert wird: Keine Präzipitation von IFN-B/D findet über Nacht statt. Im Vergleich ist die Löslichkeit von reinem IFN-B/D in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer mit pH 7,6 oder in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer mit pH 8,0 niedriger als 0,5 mg/ml.
Die zweite und dritte Lösung werden über Tage hinweg bei 4°C gelagert. Bei beiden dieser Lösungen findet man, dass die Interferonkonzentration, die gemessen wird durch Umkehrphasen-HPLC-Analyse (wie in Beispiel 1 beschrieben) unverändert ist nach 1 Woche. Diese Stabilität ist besonders überraschend in dem Fall der dritten Lösung, die eine sehr niedrige Salzkonzentration (Leitfähigkeit < 0,5 mS/cm) aufweist bei einer Interferonkonzentration von so hoch wie 1,5 mg/ml.
Beispiel 3: Bewertung der Wieder- oder Rückgewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B/D
Die Experimente werden bei Raumtemperatur durchgeführt unter Verwendung eines FPLC^® Chromatographiesystems (Pharmacia, Uppsala) und einer Glassäule (Durchmesser 10 mm), gefüllt mit 5 ml Chelating-Sepharose Fast Flow^® (Pharmacia, Uppsala). Die Flussrate wird eingestellt auf 60 ml/h für alle Lösungen, die durch die Säule gepumpt werden. Der Ausfluss wird verfolgt über ein UV-Erkennungs- oder -Aufzeichnungsinstrument, das auf eine Wellenlänge von 280 nm eingestellt ist. Die Regeneration und die Zubereitung des stationären Trägers werden ausgeführt, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, durch nacheinander erfolgendes Durchpumpen der folgenden Lösungen durch die Säule: 25 ml von 0,05 M EDTA und 0,5 M NaCl, 25 ml von 0,25 M NaOH und 1 M NaCl, 35 ml von deionisiertem Wasser, 25 ml von 0,1% Ameisensäure, 35 ml von deionisiertem Wasser, 25 ml von 0,008 M CuSO₄ × 5H₂O und 40 ml von deionisiertem Wasser.
In einem ersten Experiment werden etwa 80 ml einer Lösung von reinem IFN-B/D (Reinheit: 99,9% des Proteingehalts; Konzentration: etwa 0,3 mg/ml) in 0,2 M Mannit und 0,03 M Natriumphosphat mit pH 7,6, auf die Säule geladen oder aufgetragen. Nach einem Waschen mit 35 ml eines 0,3 M Ammoniumchloridpuffers mit pH 7,6, wird das Interferon eluiert unter Verwendung von 35 ml an deionisiertem Wasser. Dann wird ein Volumen von 35 ml von 0,025 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6, der 2 M Ammoniumchlorid enthält, durch die Säule gepumpt, um die Elution des gesamten Interferon, das noch an den stationären Träger gebunden ist, zu gewährleisten. Die Interferonkonzentration der gesammelten Fraktionen wird gemessen durch Umkehrphasen-HPLC-Analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten, die erhalten werden, sind in Tabelle 2 angegeben.
Das gleiche Experiment wird wiederholt aber unter Verwendung von 0,1 M Kaliumborat mit pH 7,6 als Waschpuffer anstelle von 0,3 M Ammoniumchlorid mit pH 7,6. Die Ergebnisse sind ebenso in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2 Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B/D
Wie in Tabelle 2 gezeigt, beeinflusst die Zusammensetzung des Puffers, der verwendet wird für die Stufe der Waschung unmittelbar vor der Elution, die Elution mit Wasser in großem Ausmaß.
Beispiel 4: Einfluss der Stufe der Waschung
Das gleiche Experiment, wie in Beispiel 3 beschrieben, wird mehrere Male durchgeführt, wobei nur die Zusammensetzung des Waschpuffers geändert wird. Die verschiedenen Waschpuffer, die getestet werden, und die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten, die erhalten werden, sind in Tabelle 3 aufgelistet.
Tabelle 3 Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B/D
Wie in Tabelle 3 gezeigt, findet die Elution mit Wasser mit einer guten Ausbeute (höher als 60%) statt, wenn entweder der Waschpuffer einen pH Wert im basischen Bereich (z. B. mit 0,1 M Kaliumborat mit pH 9,5) liegt, oder wenn der Waschpuffer ein Amin oder ein Ammoniumsalz bei einem fast neutralen pH Wert (z. B. mit 0,3 M Ammoniumacetat mit pH 7,6, aber nicht mit 0,3 M Kaliumacetat mit pH 7,6) enthält. In diesem Falle ist es erlaubt, dass das Amin primär (z. B. Ethanolamin), sekundär (z. B. Diethanolamin) oder tertiär (z. B. Triethanolamin), aber nicht quartär (z. B. Tetramethylammoniumchlorid) ist. Die optimale Konzentration des Waschpuffers hängt in großem Ausmaß von dem verwendeten Amin ab: z. B. etwa 1 mM im Fall von Cystin mit pH 7,6 oder 300 bis 500 mM im Fall von NH₄Cl mit pH 7,6.
Beispiel 5: Einfluss eines zweiten Waschschritts nach der Behandlung mit Lewis-Base

Das gleiche Experiment, wie in Beispiel 3 beschrieben, wird wiederholt, aber eine Stufe einer zweiten Waschung wird eingeschoben mit 35 ml eines 0,1 M Kaliumboratpuffers mit pH, 7,6 zwischen der Stufe der ersten Waschung, die mit 35 ml an 0,3 M Ammoniumchloridpuffer mit pH 7,6 und der Elution mit Wasser durchgeführt wurde. Die Wiedergewinnungsausbeuten, die gefunden wurden, sind wie folgt:

Bei der ersten Waschung (0,3 M NH₄Cl pH 7,6):	0%
Bei der zweiten Waschung (0,1 M K-Borat pH 7,6):	0%
Bei dem ersten Eluat (Wasser):	22%
Bei dem zweiten Eluat (2 M NH₄Cl + 0,025 M TRIS-HCl pH 7,6):	78%.

Eine geringe Menge an IFN-B/D wird in dem Wassereluat gefunden. Aber trotz der Gegenwart von Ammonium in der ersten Stufe der Waschung, ist die Wiedergewinnungsausbeute gering (etwa 22%), was einen höheren Einfluss der Waschungsstufe anzeigt, die unmittelbar der Elution vorausgeht.
Beispiel 6: Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B/D ohne Waschungsstufe
Das gleiche Experiment, wie in Beispiel 3 beschrieben, wird wiederholt, aber ohne Waschungsstufe zwischen der Adsorptionsstufe und der Elutionsstufe mit Wasser.
Ein erster Durchlauf wird durchgeführt unter Verwendung der genau gleichen Beladungslösung, die in Beispiel 3 genannt ist (0,3 mg/ml IFN-B/D in 0,2 M Mannit und 0,03 M Natriumphosphat mit pH 7,6). Ein zweiter Durchlauf wird dann durchgeführt ebenfalls mit der gleichen Beladungslösung, die aber zusätzlich Ammoniumchlorid in einer Konzentration von 0,3 mol/l enthält. Die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4 Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B/D (Fall ohne Waschungsstufe)
Wie in Tabelle 4 gezeigt, beeinflusst die Zusammensetzung des Beladungspuffers, der unmittelbar der Elution vorangeht, in großem Ausmaß die Elution mit Wasser.
Beispiel 7: Einfluss des Aussalzeffekts
Eine wässerige Lösung von teilweise reinem IFN-B/D (Reinheit: etwa 90% des Proteingehalts) wird erhalten durch Elution mit Wasser auf eine ähnlich Art und Weise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben ist. Aliquote Teile dieser Lösung werden gefroren, bei etwa –5°C bis –10°C gelagert und dann vor der Verwendung aufgetaut.
Die Zusammensetzung dieser Vorratslösung ist wie folgt:

IFN-B/D: 0,5 bis 1 mg/ml

TRIS-HCl: etwa 0,02 M

NaCl: etwa 0,01 M

Na-Acetat: etwa 0,01 M

NH₄Cl: etwa 0,002 M

Cu²⁺: etwa 1 μM

pH: 8

Leitfähigkeit: 2,2 mS/cm
Das gleiche Experiment, wie in Beispiel 3 beschrieben, wird mehrere Male durchgeführt, wobei 50 ml der Vorratslösung beladen werden und nur die Zusammensetzung des Waschpuffers verändert wird. Die verschiedenen Waschpuffer, die getestet werden und die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten sind in Tabelle 5 aufgelistet.
Tabelle 5 Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B/D
Alle der getesteten Waschpuffer weisen Ammoniumsalze bei einem pH von 7,6 auf. Die als Gegenionen verwendeten Anionen sind in der Tabelle 5 in einer solchen Reihenfolge angeordnet, dass sie eine Tendenz zeigen von solchen, die die Struktur von Wasser (chaotroper Effekt) aufbrechen und zu einer relativen Abnahme in der Stärke der hydrophoben Wechselwirkungen führen, zu solchen, die insbesondere wirksam sind bei einer Zunahme der hydrophoben Wechselwirkungen (Aussalzeffekt):
Zunehmender Aussalzeffekt: SCN^– < Cl^– < CH₃COO^– < SO₄ ^2–
Wie in Tabelle 5 gezeigt:

– Im Fall von NH₄SCN (niedriger Aussalzeffekt), wenn die Ammoniumkonzentration zu hoch ist (≥ 0,3 M), wird IFN-B/D direkt mit dem Waschpuffer eluiert. Die Elution mit Wasser findet mit einer hohen Ausbeute (≥ 90%) statt, wenn die Konzentration von NH₄SCN ≤ 0,1 M beträgt.
– Im Fall von NH₄Cl findet die Elution mit Wasser mit einer hohen Ausbeute statt, wenn die Konzentration an NH₄Cl ≤ 0,5 M beträgt.
– Im Fall von NH₄-Acetat ist es möglich eine Konzentration von so hoch wie 0,8 M zu verwenden und eine hohe Ausbeute für die Elution mit Wasser zu erhalten.
– Im Fall von (NH₄)₂SO₄ (hoher Aussalzeffekt) ist es möglich eine Ammoniumkonzentration von so hoch wie 1,0 M zu erhalten und eine hohe Ausbeute für die Elution mit Wasser zu erhalten.

Beispiel 8: Einfluss des pH und der Konzentration
Die gleichen Experimente, wie sie in Beispiel 7 beschrieben sind, werden wiederholt, wobei die Zusammensetzung der Waschpuffer verändert wird. Die verschiedenen getesteten Waschpuffer und die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten, die erhalten werden, sind in Tabelle 6 aufgelistet.
Tabelle 6 Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B/D
Wie in Tabelle 6 gezeigt:

– Im Fall von K-Acetat mit pH 5,6 (niedriger pH Wert; kein Amin) und im Fall von TRIS-HCl mit pH 5,6 (niedriger pH Wert; Gegenwart von Amin) sind die erhaltenen Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution mit Wasser sehr niedrig.
– Im Fall von TRIS-HCl mit pH 7,6 (nahezu neutraler pH Wert; Gegenwart von Amin) ist die Wiedergewinnungsausbeute, die erhalten wird für die Elution mit Wasser, gut (höher als 60%). Wenn die Aminkonzentration zu hoch ist (> 0,3 M), findet eine teilweise Elution von IFN-B/D direkt mit dem Waschpuffer statt. Wenn die Aminkonzentration zu niedrig ist (< 0,1 M), ist die Elution mit Wasser nicht quantitativ, und eine verbleibende Menge von IFN-B/D kann danach eluiert werden unter Verwendung des 2 M NH₄Cl + 0,025 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6. Dieses letzte Problem kann vermieden werden durch den Einschluss von NaCl (bei einer Konzentration von 1,7 M), welches die ionischen Wechselwirkungen zwischen dem stationären Träger und dem Interferonprotein quencht oder löscht.

Beispiel 9: Elution mit einem Gradienten
Das gleiche Experiment, wie in Beispiel 7 beschrieben, wird ausgeführt unter Verwendung von 0,1 M TRIS-HCl mit pH 7,6 als Waschpuffer. Die Wiedergewinnungsausbeute, die erhalten wird für die Elution mit Wasser beträgt 89%. Die verbleibende Menge an IFN-B/D (11%) wird danach mit dem 2 M NH₄Cl + 0,025 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6 eluiert.
Dieses Experiment wird wiederholt unter Verwendung des gleichen Waschpuffers (20 ml 0,1 M TRIS-HCl mit pH 7,6), aber nach dieser Waschstufe wird eine Elution mit einem linearen Gradienten durchgeführt von 100% Waschpuffer bis 100% deionisiertes Wasser in 12 Bettvolumen (60 ml). Die Säule wird ferner gespült mit 55 ml Wasser, und dann wird ein zweiter linearer Gradient angewendet von 100% Wasser zu 100% des 2 M NH₄Cl + 0,025 M TRIS-HCl Puffers mit pH 7,6 in 7 Bettvolumen (35 ml). Die Säule wird schließlich mit 15 ml dieses letzten Puffers gespült.
Man findet, dass IFN-B/D an dem Ende des ersten Gradienten, bei einer entsprechenden Konzentration von etwa 10 bis 5 mM TRIS-HCl mit pH 7,6 und mit einer Wiedergewinnungsausbeute von 60% eluiert wird. Die verbleibende Menge an IFN-B/D (40%) wird in der Mitte des zweiten Gradienten eluiert, bei einer entsprechenden Konzentration von etwa 1 M NH₄Cl + 12,5 mM TRIS-HCl mit pH 7,6.
Beispiel 10: Zusammensetzung der Elutionslösung
Die gleichen Experimente, die in Beispiel 7 beschrieben sind, werden wiederholt unter Verwendung von immer einer Lösung von 0,1 M TRIS-HCl mit pH 7,6 als Waschpuffer, aber unter Veränderung der Zusammensetzung der ersten Elutionslösung, nämlich der Zusammensetzung des Wassers zur Elution. Die verschiedenen Elutionslösungen, die getestet werden, und die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten, die erhalten werden, sind in Tabelle 7 aufgelistet.
Tabelle 7 Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B/D
Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen folgendes:

– Die verbleibende Salzkonzentration in Wasser muss extrem niedrig sein (< 0,001 M), um eine Elution von IFN-B/D mit einer Wiedergewinnungsausbeute von mehr als 50% zu erhalten.
– Ungeladene gelöste Verbindungen, wie z. B. Mannit oder Glycerin, können in der Elutionslösung vorliegen, selbst in einer hohen Konzentration (in einem Bereich von 1 M), Zwitterionen jedoch nicht. Die Konzentration von MES (2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure) muss z. B. niedriger sein als 0,001 M, μm eine gute Wiedergewinnungsausbeute zu erhalten.
– Die Leitfähigkeit der Elutionslösung kann nicht als ein Kriterium verwendet werden, um das Auftreten oder das Nichtauftreten der Elution von IFN-B/D vorherzusagen.

Beispiel 11: IFN-B und IFN-D
Die Experimente werden durchgeführt mit menschlichem Interferon-α-B (IFN-B) oder mit menschlichem Interferon-α-D (IFN-D), wie in Beispiel 3 beschrieben, für menschliches Hybridinterferon-α B₁D₂B₃B₄ (IFN-B/D), aber unter Verwendung einer kleineren Glassäule (Durchmesser 5 mm), gefüllt mit nur 0,5 ml Chelating-Sepharose Fast Flow^® (Pharmacia, Uppsala). Die entsprechende Flussgeschwindigkeit und die entsprechenden Volumina der Lösungen, die durch die Säule gepumpt werden, werden um einen Faktor 10 im Maßstab nach unten korrigiert.
IFN-B und IFN-D, die Ursprungs- oder Elternmoleküle von IFN-B/D, beschrieben in EP 0 205 404 A , werden hergestellt durch Expression von rekombinanter DNA in Hefe (Saccharomyces cerevisiae), Fermentation, Wiedergewinnung und Teilreinigung.
Für IFN-B wird eine Vorratslösung erhalten in 0,025 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6, die eine Interferonkonzentration von 0,05 mg/ml aufweist und etwa die gleiche Reinheit wie die IFN-B/D Vorratslösung, die in Beispiel 7 beschrieben ist.
Für IFN-D wird eine Vorratslösung erhalten, die die gleiche Zusammensetzung aufweist und etwa die gleiche Reinheit wie die IFN-B/D Adsorptionslösung, die in Beispiel 1 beschrieben ist.
Wie in Beispiel 3 beschrieben, wird das auf die Säule geladene Interferon nacheinander gewaschen mit einem geeigneten Puffer, mit deionisiertem Wasser eluiert und mit 0,025 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6, der 2 M Ammoniumchlorid enthält, eluiert. Die Interferonkonzentration der gesammelten Fraktionen wird durch Umkehrphasen-HPLC-Analyse gemessen, wie in Beispiel 1 beschrieben, und bestätigt durch Analyse der biologischen antiviralen in vitro Aktivität an Rinderzellen (Madin-Darby Rinderzellen) gegen einen Blasenstomatititsvirus. Die verschiedenen getesteten Waschpuffer und die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten, die erhalten wurden, sind in Tabelle 8 aufgelistet.
Tabelle 8 Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von IFN-B oder IFN-D
Wie in Tabelle 8 gezeigt, kann IFN-B und IFN-D mit Wasser eluiert werden.
Beispiel 12: α-Amylase und Trypsin
Die Experimente wurden mit verschiedenen Proteinen, wie in Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt für IFN-B/D unter Verwendung des gleichen FPLC^® Chromatographiesystems, der gleichen Menge (5 ml) an Chelating-Sepharose Fast Flow^® und den gleichen Chromatographiebedingungen.
Die getesteten Proteine sind: α-Amylase aus Bacillus species (Sigma Produkt Nr. A 6380), Trypsin aus Rinderpankreas (Serva Produkt Nr. 37260). Die Durchläufe werden durchgeführt durch Beladen von etwa 50 ml der entsprechenden Proteinlösung (Konzentration 0,5 mg/ml), entweder in 0,01 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6, wenn TRIS-HCl als folgender Waschpuffer verwendet wird, oder in 0,01 M Kaliumboratpuffer mit pH 7,6, wenn K-Borat als nachfolgender Waschpuffer verwendet wird, oder wenn die Waschungsstufe ausgelassen wird.
Wie in Beispiel 3 beschrieben, wird das auf die Säule beladene Protein nacheinander mit einem Puffer (TRIS-HCl oder K-Borat) gewaschen, mit deionisiertem Wasser eluiert und mit 0,025 M TRIS-HCl Puffer mit pH 7,6, der 2 M Ammoniumchlorid enthält, eluiert. Die Proteinkonzentration der gesammelten Fraktionen wird gemessen durch den Bio-Rad Proteinassay (Bio-Rad Produkt Nr. 500-0006, Mikroassayverfahren). Die Proteine und die Waschpuffer, die getestet werden, sowie die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten, die erhalten werden, sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9 Wiedergewinnungsausbeuten für die Elution von verschiedenen Proteinen
Die Ergebnisse aus Tabelle 9 zeigen folgendes:

– α-Amylase (aus Bacillus species) kann mit Wasser eluiert werden (Wiedergewinnungsausbeute: etwa 90 bis 100%), entweder wenn der Waschpuffer einen pH Wert im basischen Bereich (z. B. mit 0,1 M Kaliumborat mit pH 9,5) aufweist, oder wenn der Waschpuffer ein Amin enthält bei einem nahezu neutralen pH Wert und bei einer entsprechenden Konzentration (z. B. bei 0,025 bis 0,1 M TRIS-HCl mit einem pH von 7,6).
– Trypsin (aus Rinderpankreas) kann auch eluiert werden mit Wasser (Wiedergewinnungsausbeute höher als 40%), z. B. unter Verwendung von 0,025 M TRIS-HCl mit pH 7,6 als Waschpuffer.

Beispiel 13: Chromatographiemedien oder -mittel
Das gleiche Experiment, wie in Beispiel 7 beschrieben, wird zweimal durchgeführt unter Verwendung von jeweils 0,1 M TRIS-HCl mit pH 7,6 als Waschpuffer, aber unter Veränderung des Chromatographiemediums.
Für den ersten Durchlauf ist das Medium, das verwendet wird, Chelating-Sepharose Fast Flow^® (Pharmacia, Uppsala), wie in den Beispielen 1 bis 12. Der Kugel- oder Partikeldurchmesser beträgt 0,045 bis 0,165 mm. Chelating-Sepharose Fast Flow^® besteht aus Iminodiessigsäuregruppen an Spacern oder Abstandshaltern, gebunden oder gekoppelt an Sepharose Fast Flow^® durch stabile Etherverknüpfungen:
[Sepharose Fast Flow]-O-CH₂-CHOH-CH₂-O-CH₂-CNOH-CH₂-N-(CH₂COOH)₂
Die Grundmatrix – Sepharose Fast Flow – ist vernetzte Agarose.
Für den zweiten Durchlauf ist das Medium, das verwendet wird, TSK Toyopearl^® AF-Chelate-650 M (TosoHaas, Stuttgart). Der Kugel- oder Teilchendurchmesser beträgt etwa 0,065 mm. TSK Toyopearl^® ist ein hydrophiles semi- oder halbstarres Gel, ein Copolymer aus Oligoethylenglycol, Glycidylmethacrylat und Pentaerythroldimethacrylat. Der Ligand besteht aus immobilisierten Iminodiessigsäuregruppen.
Für jeden Durchgang wird eine Glassäule (Durchmesser 10 mm) gefüllt mit 5 ml des jeweiligen Gels. Das gleiche Verfahren der Regeneration und Herstellung (Beladung mit Kupfer(II)-ionen) wird angewendet für das Chelating-Sepharose Fast Flow^® Medium und für das TSK Toyopearl AF-Chelate-650 M^® Medium, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Adsorptionslösung von IFN-B/D, die verwendet wird, ist die Vorratslösung, die in Beispiel 7 beschrieben ist. Die entsprechenden Wiedergewinnungsausbeuten, die erhalten werden, sind in Tabelle 10 angegeben. In beiden Fällen wird eine hohe Wiedergewinnungsausbeute erhalten für die Elution mit Wasser.
Tabelle 10 Wiedergewinnungsausbeuten der Elution von IFN-B/D für verschiedene Chromatographiemedien (der Waschpuffer ist 0,1 M TRIS-HCl mit pH 7,6)
Hinterlegung von Mikroorganismen
Die folgenden Mikroorganismenstämme wurden hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1B, D 38142 Braunschweig, Deutschland (Zugangsnummern und Hinterlegungsdaten sind angegeben):
Saccharomyces cerevisiae HT 393 DSM 9697 27.01.1995

Claims

Verfahren zur Anreicherung eines unreinen oder vorgereinigten Proteins, das die folgenden Stufen umfasst: a) Adsorption des unreinen oder vorgereinigten Proteins an immobilisierte Kupfer(II)-ionen, b) Waschung des adsorbierten Proteins mit einer Lösung einer Lewis-Base und c) Elution des gewünschten Proteins mit deionisiertem Wasser, das nicht mehr als 0,001 M an ionischen Verbindungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kupfer(II)-ionen an einem stationären Träger immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der stationäre Träger Agarose oder ein Vinylpolymer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lösung der Lewis-Base NH₄ ⁺ oder ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin in einem neutralen oder niederen alkalischen pH Bereich oder OH^– in einem hohen alkalischen pH Bereich enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lösung der Lewis-Base NH₄ ⁺ oder ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lösung der Lewis-Base NH₄ ⁺ oder ein primäres Amin enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lösung der Lewis-Base OH^– in einem gepufferten pH Bereich von 9 bis 11 enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lewis-Base ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Ethanolamin, Cystin, NH₄SCN, NH₄Cl, NH₄ ⁺CH₃COO^–, (NH₄)₂SO₄ und TRIS-HCl.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lewis-Base in einer Konzentration von 0,001 bis 1 M verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lösung der Lewis-Base ein oder mehr zusätzliche Salze enthält, die keine Lewis-Basen sind.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das zusätzliche Salz NaCl oder KCl ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das zusätzliche Salz in einer Konzentration von bis zu 5 M verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das zusätzliche Salz in einer Konzentration bis zu 2 M verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Lewis-Base auf einen pH von 6 bis 9 eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das unreine oder vorgereinigte Protein dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Komplex aus Protein und Kupfer(II)-ionen nicht vollständig durch eine Lewis-Base zerstört wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das unreine oder vorgereinigte Protein dadurch gekennzeichnet ist, dass es Interferon, Amylase, Trypsin oder ein verwandtes Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das unreine oder vorgereinigte Protein dadurch gekennzeichnet ist, dass es ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Interferon-α, Trypsin und α-Amylase.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das deionisierte Wasser nicht ionische Verbindungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das deionisierte Wasser Zucker oder ein Polyol enthält.
Verfahren nach Anspruch 18, worin das deionisierte Wasser Mannit oder Glycerin enthält.