DE69032025T2

DE69032025T2 - Menschlicher elastase-inhibitor

Info

Publication number: DE69032025T2
Application number: DE69032025T
Authority: DE
Inventors: Eileen Remold-O'donnell
Original assignee: Immune Disease Institute Inc
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 1989-02-23
Filing date: 1990-02-22
Publication date: 1998-05-20
Anticipated expiration: 2010-02-23
Also published as: ATE162931T1; EP0460072A4; JPH04505914A; US5370991A; EP0460072A1; DE69032025D1; AU5192790A; WO1990009737A1; JP2972328B2; EP0460072B1

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Molekularbiolagie, der Pharmazie und der Medizin und insbesondere das Isolieren, Reinigen und Klonen eines menschlichen Elastase-Inhibitors.
Die Aufrechterhaltung der Integrität von lokalen Organfunktionen erfordert ein genaues Gleichgewicht zwischen den Aktivitäten der phagozytischen Zellproteinase und der Wirkung des Proteinase-Inhibitors. Es wird angenommen, daß ein Verlust dieses Gleichgewichts ein wesentlicher ursächlicher Faktor für die Pathogenese von Asthma, chronischer Bronchitis, Emphysema, Sarcoidosis, Atembeschwerdesyndromen, Arthritis und bestimmten Hauterkrankungen und möglicherweise Übelkeit ist. Zum Beispiel ist eine übermäßige Freisetzung von Elastase durch Neutrophile und Monozyten offenbar ebenso wie eine übermäßige Ansammlung von Monozyten und Neutrophilen für Gewebeschädigungen bei Entzündungen wie Arthritis und Emphysema und für eine durch Neutrophile herbeigeführte Schädigung von endothelen Zellen verantwortlich. Zur Schaffung der Möglichkeit, das Gleichgewicht des Proteinase-Proteinase-Inhibitors zu überwachen und zu beeinflussen ist es erforderlich, die betreffenden Moleküle zu identifizieren, zu isolieren und zu reinigen.
Eine wichtige phagozytische Zellproteinase ist die Stelle der serin aktiven Proteinase, die allgemein als "neutrophile Elastase" bezeichnet wird. Menschliche neutrophile Elastase ist ein 218 Aminosäureglycosyliertes Protein mit bekannter Sequenz, das besonders reich an Neutrophilen (0,5 % des gesamten proteins) ist und auch in Monozyten und Macrophagen gefunden wird. Elastase spaltet extrazelluläre Matrixproteine wie Elastin, Proteoglycans, Fibronectin, Kollagen vom Typ III und Typ IV sowie bestimmte lösliche Proteine. Es wird auch von den Neutrophilen zur Wanderung durch die Zellbarrieren in vitro benötigt.
Die kontinuierliche Wirkung von Elastase-Inhibitoren in vivo ist aufgrund der Umsatzrate des Neutrophils offensichtlich. Trotz der Tatsache, daß Neutrophile an die meisten Körperstellen gelangen, tritt täglich im menschlichen Körper eine Umsatzrate von etwa 10¹¹ mit einem Gehalt von etwa 50 mg Elastase auf, ohne daß ein unkontrollierter Gewebeabbau offensichtlich wird.
Ein weit verbreitetes lösliches Blutprotein, al-Antitrypsin (al-AT), ist ein schnell wirkender Elastase-Inhibitor in vitro. Individuen mit genetisch bedingten, reduzierten Pegeln von al-AT (homozytische Z-Variante) sind in der dritten oder vierten Lebensdekade aufgrund der unkontrollierten Elastasewirkung für eine Lungenemphysema anfällig. Gegenwärtig wird menschliches al-AT zur Behandlung von angeborenen al-AT Mängeln verwendet.
In Monozyten und Neutrophilen sind Moleküle mehrerer Arten entdeckt worden, die sich von al-AT unterscheiden und die Anforderungen an einen physiologischen Regulator der neutrophilen Elastase erfüllen. 1971 wurde berichtet, daß in dem zytosoliten Anteil von Leukozyten des menschlichen Blutes und in menschlichen Lungen-Macrophagen ein endogener Elastase.- Inhibitor mit den Eigenschaften eines Proteins entdeckt wurde (1, 2). Zytosolite Proteine, die die Elastase hemmen, wurden in Pferdeblut-Neutrophilen (3, 4), Schweineblut-Leukozyten (5) und Lungen-Macrophagen von Rindern (6) identifiziert und gereinigt. Ein Elastase-Inhibitor wurde in der extrazellularen Flüssigkeit von Macrophagen des kultivierten Guinea-Schweins durch seine Fähigkeit identifiziert, einen kovalenten Komplex mit Elastase zu bilden (7). Größere Mengen von Elastase-Inhibitoren des Guinea-Schweins wurden in Macrophagen-Lysaten gefunden (7). In jüngerer Zeit ist ein weit verbreitetes, schnell wirkendes, endogenes Elastase-Inhibitorprotein in ausgereiften menschlichen Monozyten und monozytähnlichen Zellen gefunden worden (8). Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt ist es nicht gelungen, diesen menschlichen Elastase-Inhibitor zu isolieren, zu reinigen, zu charakterisieren und zu klonen.
Erfindungsgemäß wird dieser menschliche monozyte Elastase-Inhibitor (nachfolgend als menschlicher monozyter EI oder menschlicher EI bezeichnet) isoliert, gereinigt, mit dem molekularen Pegel charakterisiert und geklont. Menschlicher EI ist im wesentlichen nichtglycosyliert, kann einen kovalenten Komplex mit Elastase bilden und die elastinolytische Aktivität der Elastase hemmen. Das Molekül scheint einen Zystein-Rest aufzuweisen, der wesentlich für das Zusammenwirken mit Elastase ist, da die Behandlung von menschlichem EI mit Iodoacetamid den menschlichen EI davor bewahren kann, einen Komplex mit Elastase zu bilden. Menschlicher EI ist stabil gegenüber reduzierenden Mitteln. Gereinigter menschlicher EI scheint einen blockierenden Asino- Terminus aufzuweisen. Menschlicher EI hat ein Molekulargewicht von etwa 42.000.
Menschlicher EI ist teilweise sequenziert worden und weist folgende Segmente auf:
(1) Leu-Gly-Val-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Ser;
(2) Phe-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ile-Glu-Asp-Leu-Lys;
(3) Tyr-Asn-Phe-Leu-Pro-Glu-Phe-Leu-Val-Ser-Thr-Gln- Lys;
(4) Leu-Asp-Asn-Val-Gly-His-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Ala- Val-Lys;
(5) Glu-Ala-Thr-Thr-Asn-Ala-Pro-Phe-Arg;
(6) Phe-His-Phe-Asn-Thr-Val-Glu-Glu-Val-His-Ser;
(7) Tyr-Gly-Ala-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-His- Ala-Ser-Glu-Asp-Ala;
(8) Val-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Gln-Gly-Glu-Glu-Leu-Ser- Met-Val-Iso-Leu-Leu-Pro;
(9) Lys-Ile-Glu-Glu-Gln-Leu-Thr-Leu-Glu-Lys; und
(10) Phe-Lys-Leu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp- Leu-Ala-Arg.
Deshalb wird mit der Erfindung unter einem ersten Gesichtspunkt eine im wesentlichen reine Zubereitung aus einem einzelnen menschlichen monozyten Polypeptidmolekül mit einem Molekulargewicht von etwa 42.000 und einer nichtglycosylierten Struktur geschaffen, das einen kovalenten Komplek mit Elastase bilden und als ein Inhibitor der elastinolytischen Aktivität von Elastase wirken kann.
Unter einem zweiten Gesichtspunkt wird mit der Erfindung eine im wesentlichen reine Zubereitung eines menschlichen monozyten EI oder einer Variation, eines Teils oder eines Derivats davon geschaffen, die eine aus den Segmenten (1) bis (10) ausgewählte Proteinsequenz aufweist.
Unter einem dritten Gesichtspunkt wird mit der Erfindung eine Zubereitung geschaffen, die eine therapeutisch wirksame Menge von menschlichem monozyten EI oder eine Variation, ein Teil oder ein Derivat davon enthält, die eine aus den Segmenten (1) bis (10) ausgewählte Proteinsequenz aufweist.
Unter einem vierten Gesichtspunkt wird mit der Erfindung ein rekombinanter Vektor geschaffen, der eine einen menschlichen monozyten EI codierende DNA-Sequenz oder ein Molekül mit einer aus den Segmenten (1) bis (10) ausgewählte Proteinseqäenz aufweist. Unter einem fünften Gesichtspunkt wird mit der Erfindung eine im wesentlichen reine Zubereitung eines einen menschlichen monozyten EI codierenden Oligonucleotids oder eines Proteins mit einer aüs den Segmenten (1) bis (10) ausgewählte Aminosäuresequenz geschaffen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung der Gene für menschliches monozytes EI, das die Verwendung einer Detektorsonde mit einer Oligonucleotidsequenz umfaßt, die zumindest einen Teil eines menschlichen monozyten EI, der eine aus den Segmenten (1) bis (10) ausgewählte Aminosäuresequenz umfaßt, codiert.
Vorzugsweise wird eine Bibliothek menschlicher cDNA aus monozyten oder monozytähnlichen Zellen in geeigneten Wirtszellen unter Verwendung üblicher Expressionsvektoren ausgedrückt, um Kolonien zu erhalten, wobei jede Kolonie einen anderen Teil der cDNA Bibliothek ausdrückt. Anschließend können die Kolonien unter Verwendung eines Oligonucleotids entsprechend der Erfindung abgetastet werden, um diejenige Kolonie zu identifizieren, die die cDNA für den menschlichen EI oder ein funktionell äquivalentes Derivat oder einen Teil davon enthält.
Aus der ausgewählten Kolonie kann dann ein rekombinanter Expressionsvektor entsprechend der Erfindung isoliert werden. Der Vektor kann zur Bewirkung der Expression der DNA Sequenz verwendet werden, die entsprechend der Erfindung ein Molekül codiert, das bei einer Ausführungsform ein nichtnatürlich auftretendes Molekül ist, das als ein Inhibitor einer Serinproteinase wirken kann und mindestens einen Teil des menschlichen monozyten EI umfaßt, der eine aus den Segmenten (1) bis (10) ausgewählte Aminosäuresequenz aufweist.
Im wesentlichen reine Zubereitungen von Oligonudeotiden, die menschlichen monozyten EI oder Variationen, Derivate oder Teile davon codieren, werden ebenfalls geschaffen. Die erfindungsgemäßen Oligonudeotide können DNA, RNA, Sense oder Antisense und natürlich, synthetisch oder rekombinant sein. In ähnlicher Weise erfolgt die Zubereitung von Antikörpern, die menschlichen monozyten EI binden oder binden können.
Der menschliche EI, die Antikörper des menschlichen EI und Oligonudeotide und Vektoren, die menschlichen EI und Variationen, Derivate oder Teile davon codieren, können allein oder mit anderen Moieten verbunden verwendet werden, um verschiedene medizinischen Zustände zu behandeln und/oder als diagnostische Werkzeuge bei der Bestimmung der Existenz und des Grades solcher Zustände dienen.
Fig. 1 zeigt einen Autoradiograph, in dem das Vorhandensein eines menschlichen EI in verschiedenen Stufen während der Reinigung zu erkennen ist;
Fig. 2 zeigt eine Kurve der Dosis-abhängigen Hemmung der durch menschlichen EI verursachten Elastinolyse;
Fig. 3 zeigt einen Autoradiograph, in dem ein menschlicher EI und ein mit Elastase zu einem Komplex verbundener menschlicher EI dargestellt ist;
Fig. 4 zeigt die Aminosäurezusammensetzung von reinem EI im Vergleich zu derjenigen von al-AT; und
Fig. 5 zeigt einen Autoradiograph, in dem das Vorhandensein eines menschlichen EI in monozyten, neutrophilen und U937 Zellen zu erkennen ist.
Menschlicher EI ist ein schnell wirkender, zeilverbundener, im wesentlichen irreversibler Inhibitor von Bauchspeicheldrüsen-Elastase vom Schwein und menschlicher neutrophiler Elastase, die beide Proteinelastasen mit aktiver Seite (nachfolgend "Elastase" genannt) sind. Diese wird mit hohen Werten in Neutrophilen, Monozyten und Macrophagen gefunden. Menschlicher EI reagiert quantitativ mit Elastase, um einen EI-Elastasekomplex zu bilden und die elastinolytische Aktivität von Elastase zu hemmen. Der Komplex ist in kochendem SDS (Natriumdodecylsulfat) stabil, was auf eine kovalente Bindung zwischen dem EI und der Elastase hindeutet.
Auf der Grundlage von funktionalen Kriterien kann menschlicher EI in die Serin-Proteinase-Inhibitoren der Serpin-Familie eingruppiert werden. Menschlicher EI reagiert nicht mit Elastase, die mit der Serin-aktiven Seite des Reagens DFP (Diisopropylfluorophosphat) inaktiviert wurde. Der kovalente Komplex ist stabil in kochender SDS und auch für eine Basis-katalysierte Spaltung anfällig. Diese Wirkungsmechanismen sind für Serinproteinase-Inhibitoren der Serpinfamilie charakteristisch. Menschlicher EI unterscheidet sich jedoch von anderen Serinproteinase-Inhibitoren darin, daß die Behandlung von menschlichem EI mit Iodoacetamid seine Fähigkeit außer Kraft setzt, einen Komplex mit Elastase zu bilden, was auf einen bedeutenden Rückstand von Cystein schließen läßt.
Menschlicher EI ist ein einzelnes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 42.000. Eine Analyse der Zusammensetzung ergibt, daß fünf Cystein-Rückstände pro Molekül von näherungsweise 360 Aminosäureresten vorhanden sind. Die vernachlässigbaren Werte von mit einem Gaschromatographen erfaßtem Kohlenhydrat und die Unempfindlichkeit von menschlichem EI gegenüber einer Behandlung mit Glycoeidase PNGase F (peptid:N-Glycosidase F) lassen darauf schließen, daß menschlicher EI nichtglycosyliert oder im wesentlichen nichtglycosyliert (möglicherweise ein oder zwei Rückstände) ist. Der Amino-Terminus von gereinigtem menschlichen EI scheint blockiert zu sein.
Reiner menschlicher EI wurde teilweise sequentiert und umfaßt die folgenden Sequenzen:
Leu-Gly-Val-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Ser;
Phe-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ile-Glu-Asp-Leu-Lys;
Tyr-Asn-Phe-Leu-Pro-Glu-Phe-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Lys;
Leu-Asp-Asn-Val-Gly-His-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Ala-Val- Lys;
Glu-Ala-Thr-Thr-Asn-Ala-Pro-Phe-Arg;
Phe-His-Phe-Asn-Thr-Val-Glu-Glu-Val-His-Ser;
Tyr-Gly-Ala-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-His-Ala-Ser-Glu-Asp-Ala;
Val-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Gln-Gly-Glu-Glu-Leu-Ser-Met-Val-Iso-Leu-Leu-Pro;
Lys-Ile-Glu-Glu-Gln-Leu-Thr-Leu-Glu-Lys; und
Phe-Lys-Leu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp-Leu- Ala-Arg .

Reinigung von menschlichem EI

Zur Reinigung von menschlichem EI gehört eine Reihe von Schritten. Das Vorhandensein von menschlichem EI wurde in jedem Schritt durch die Fähigkeit einer in jedem Schritt entnommenen Probe bestätigt, einen kovalenten Komplex mit ¹²&sup5;I-Elastase zu bilden (7, 8). Die Einzelheiten der Vorgänge zur Bestätigung werden in den oben genannten Quellen erläutert, die durch Bezugnahme zum Bestandteil dieser Offenbarung gemacht werden sollen.
Im allgemeinen werden Bruchteile, von denen man erwartet, daß sie menschlichen EI enthalten, 10 Minuten lang bei 37ºC mit 30 bis 200 ng von ¹²&sup5;I-markierter Elastase aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins inkubiert (Elastin Products; Pacific, MO.). Der kovalente EI-Elastasekomplex wurde durch Autoradiographie nach SDS Polyacrylamid Slab Gel-Elektrophorese unter Verwendung des Fairbanks/Laemmli Gelsystems detektiert. In diesem System werden relativ niedrige pH-Werte und geringe primäre Amin-Konzentrationen zur Minimierung der Hydrolyse des Komplexes während der Elektrophorese (8) verwendet.

Erzeugung von Zell-Lysaten

Als Quelle für menschlichen EI wurden U937-Zellen verwendet. U937-Zellen sind menschliche histiocytische lymphomatische Zellen (9). Es wird angenommen, daß die spezifisch verwendeten U937-Zellen eine Unterlinie an einer geringfügig fortgeschritteneren Stufe der Differentiation sind als die ursprünglich charakterisierten U937-Zellen (9). Die verwendete Zellinie wird nachfolgend mit U937-EI bezeichnet. Diese Zellinie ist am ATCC in Rockville, Maryland, unter der Zugriffsnummer CRL 10026 hinterlegt.
U937-EI-Zellen wurden in eineu RPMI 1640 Medium oder einem Dulbecco's modifizierten Eagles Medium mit 4,5 mg/ml Glucose, 10 % FCS und 50 Mikrogramm Gentamycinpro ml gezüchtet. Die U937-EI-Zellen aus 12 Liter Kulturen (näherungsweise 1,8 x 10¹&sup0; Zellen), die durch das "Massachusetts Institute of Technology Cell Culture Center" gezüchtet wurden, wurden zweimal durch Schrot bei 4ºC in Ca&spplus;&spplus;/Mg&spplus;&spplus;, das PBS enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden mit 2 x 10&sup7; pro ml in HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) bei etwa 22ºC für 15 Minuen inkubiert, um absorbiertes al-AT zu entfernen (8). Die Zellen wurden auf 4ºC abgekühlt und pelletiert. Lysates (2,5 x 10&sup7; Zellen pro ml) wurden durch Extraktion der Zellen mit 0,5 % NP-40 (Nonidet P-40 [NP-40] ist ein nichtionisches Reinigungsmittel, das in den USA von Gallard Schlesinger, Carle Place, NY vertrieben wird. Das Material ist ein Octylphenolethylenoxid-Kondensat mit 9 Mol Ethylenoxid. Es handelt sich um ein Produkt der Firma BDH Limited, Poole, England; BDH bezieht das Material von der Firma Shell Chemical Co., England) in PBS für 4 Minuten bei etwa 22ºC und 10 Minuten bei 4ºC zubereitet und durch Zentrifugieren in einem Sorvall SS34 Rotor (Dupont Co., Wilmington, Delaware) bei 18.000 U/min und für eine Zeitdauer von 30 Minuten bei 4ºC geklärt.

Trennung von Actin aus DNAse-Sepharose

Bei vorbereitenden Reinigungsversuchen ging die EI-Aktivität gleichzeitig mit der Bildung von Actin (10) enthaltenden Ausfällungen verloren. Um diesen Verlust zu vermeiden, wurden die Zell-Lysaten unmittelbar auf der DNAse-Sepharose chromatographiert, die besonders Actin absorbiert.
Das Harz mit Affinität zur DNAse Sepharose wurde wie folgt zubereitet: Deoxyribonudease I (Rinderpankreas; 800 Kunitz Einheiten pro mg Protein; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde mit 2 mM Diisopropylfluorophosphat (DFP) in PBS für 30 Minuten bei 22ºC behandelt und bei 3 mg/ml in 0,1 M NaHCO&sub3; mit einem pH-Wert von 8,5 durch 18 Stunden langes Mischen bei 400 mit aktivierter Sepharose verbunden (der Verbindungs- Wirkungsgrad war größer als 90 %). Die aktivierte Sepharose war entweder aktivierte Sepharose 48, die als ein aktiviertes lyophilliertes Puder durch die Firma Pharmacia Fine Chemical (nun Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, New Jersey) geliefert wird, das zur Verbindung entsprechend den Vorschlägen des Herstellers rekonstituiert und zubereitet wurde (d.h. mit 1 mM HCl rekonstituiert und 15 Minuten mit 1 mM HCl bei 22ºC gewaschen und anschließend mit einem Verbindungspuffer gewaschen), oder sie war Sepharose 6B; die unmittelbar vor der Verbindung aktiviert wurde (P. Cuatrecasas, "Protein Purification by Affinity Chromatography: Derivatives of Agarose and Polyacrylamide Beads", J. Biol. Chem., 1970, 245: 3509-3065), und zwar durch Behandlung mit CNBr (2,3 g pro 100 ml Sepharose) bei einem pH-Wert von 11 und einer Temperatur von etwa 22ºC für 10 Minuten. Das Harz wurde bei 22ºC einmal mit 10 mM Tris-HCl Puffer bei einem pH-Wert von 8 für 2 Stunden; für drei Zyklen mit 100 mM Natriumacetat-Puffer bei einem pH-Wert von 4, gefolgt von 100 mM NaHCO&sub3; bei pH = 8,5; einmal mit PBS; und einmal mit 2 mM DFP in PBS für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde in PBS mit 0,02 % Natriumazid bei 4ºC gespeichert und unmittelbar vor der Anwendung mit PBS ins Gleichgewicht gebracht.
Das Zell-Lysat (etwa 720 ml) wurde für 30 Minuten bei 400 mit 180 ml DNAse-Sepharose in einer Rollflasche inkubiert. Die Mischung wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 6,5 cm eingebracht und die nichtanhaftende Fraktion wurde zusammen mit einem Waschmittel mit einem Volumen von 0,8 der Säule mit 0,5 % NP-40 in PBS bei -70ºC gespeichert. Das Vorhandensein von menschlichem EI in der nichtanhaftenden Fraktion wurde wie oben erläutert gemessen. Wie in Figur 1 gezeigt ist, ist ein Protein in der nichtanhaftenden Fraktion mit Elastase kombiniert, um den ¹²&sup5;I-Elastase-Elastase- Inhibitor-Komplex mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 66.000 zu bilden.

Thiopropyl-Sepharose-6B-Separation

Thiopropyl-Sepharose-6B ist ein gemischtes Disulfid- Affinitäts-Harz der Firma Pharmacia Fine Chemicals. Es enthält näherungsweise 20 µ Mol pro ml gequollenes Gel aus 2-Thiopyridyl Niederschlägen in gemischten Disulfidverbindungen zu Hydroxpropyl Niederschlägen; die letztgenannten Niederschläge sind über eine Etherverbindung mit der Sepharose 6B Matrix verbunden. Thiopropyl-Sepharose-6B wird mit einem Verfahren synthetisiert, wie es z.B. von R. Axen, Drevin, H. und Carlsson, J. (Preparation of modified agarose gels containing thiol groups, Acta Chem. Scand B, 1975, 29, 471-474) beschrieben wird. Menschlicher EI haftet an Thiopropyl-Sepharose-6B an, was bei den meisten Proteinen nicht der Fall ist. Die Thiopropyl- Sepharose-6B wurde gegen 0,5 % NP-40, 10 mM Tris-HCl Puffer, bei pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA (NP-40/Tris/150-NaCl/EDTA) bei 22ºC und 30 Minuten ins Gleichgewicht gebracht. Die DNAse-nichtanhaftende Fraktion (etwa 900 ml) wurde dann unter gelegentlichem Umrühren bei 22ºC mit 30 ml der Thiopropyl-Sepharose-6B inkubiert. Die Mischung wurde in eine 3 cm Säule eingebracht und aufeinanderfolgend mit einem Säulenvolumen von NP-40/Tris/150-NaCl/EDTA, NP-40/Tris/500-NaCl, Tris/500-NaCl und Tris/150-NaCl gewaschen. Die Säule wurde mit 50 mM Mercaptoethanol in Tris/150-NaCl elutiert, um eine einzige 70 ml "Thiol Eluate" Fraktion zu gewinnen. Das Vorhandensein von menschlichem EI wurde wiederum gemäß obiger Beschreibung bestätigt. Wie in Figur 1 gezeigt ist, ist ein Protein in der Thiol Eluate Fraktion mit Elastase kombiniert, um den ¹²&sup5;I-Elastase-Elastase-Inhibitor-Komplex zu bilden.

Phenyl-Sepharose-CL4B Separation

Sepharose ist eine eingetragene Marke für sphärisch agarose Gelperlen, die von der Firma Pharmacia Fine Chemicals hergestellt werden. Sepharosee 6B mit etwa 6 % Agarose besteht aus etwa 40 bis 210 Mikron Partikeln; Sepharose 4B mit etwa 4 % Agarose besteht aus etwa 40 bis 190 Mikron Partikeln. Die zur Herstellung von Sepharose verwendete Agarose wird aus ausgewähltem Agar hergestellt (Hjerten, S., "A New Method for Preparation of Agarose for Gel Electropheresis", Biochim. Biophys. Acta 1962, 62: 445-449 und 5. Hjerten, Chromatography on agarose spheres, in "Methods in Immunology and Immunochemistry", Ed: M.W. Chase und C.A. Williams, Academis Press, Inc., New York, 1968, Seiten 149-154).
Phenyl-Sepharose-CL4B ist ein Derivat von Sepharose- CL4B; die letztgenannte wird durch Quervernetzung der Agarose mit 2,3-Dibromopropanol (geschützt durch das UK-Patent I 352 613 und entsprechende Patente in anderen Ländern) und Desulphatierung des sich ergebenden Gels mit Alkalinhydrolyse unter reduzierenden Bedingungen hergestellt (J. Porath, Janson, J-C, Laas, T., "Agar derivatives for chromatography, electrophoresis and gel-bound enzymes. I. Desulphated and reduced crosslinked agar and agarose in spherical bead form". J. Chromatogr., 1971, 60: 167-177). Die Phenylgruppen werden durch Reaktion der Sepharose CL-4B mit dem Glycidylether (S. Hjerten, Rosengren, J., und Pahlman, S., "Hydrophobic interaction chromatography. The synthesis and the use of some alkyl and aryl derivatives of agarose." Chromatogr., 1974, 101, 281-288) eingeführt, um ein Derivat mit der Phenylgruppe zu erzeugen, die an der Monosaccharid-Einheit der Agarosematrix über die Etherverbindung befestigt ist. Die Konzentration des verbundenen Phenol-Ligand liegt bei näherungsweise 40 µmol/ml gequollenes Gel.
Die EI aktive Fraktion des Thiol-Eluat wurde bei näherungsweise 22ºC an eine 3,5 cm Säule aus Phenyl- Sepharose-CL4B (70 ml; Pharmacia) angelegt und gegen 10 mM Tris-HCl Puffer mit pH = 7,4 und 150 mM NaCl und 1 mM Mercaptoethanol (Tris/150-NaCl/ME) in Gleichgewicht gebracht. Phenyl-Sepharose-CL4B trennt Proteine auf der Basis der Unterschiede der Hydrophobizität. Die nichtanhaftende Fraktion wurde gesammelt, zusammen mit einer näherungsweise 20 ml Waschung unter Verwendung von Tris/150-NaCl/ME. Das Vorhandensein von menschlichem EI in der nichtanhaftenden Fraktion wurde gemäß obiger Beschreibung bestätigt (Fig. 1).

Matrex Gel Red A Separation

Matrex Gel Red A ist ein "gruppenselektives" Affinitätsharz, das von der Firma Amicon Corp., Lexington, MA vertrieben wird. Es besteht aus quervernetzter 5% Agarose mit 3-5 mg von kovalent verbundenem Farbstoff pro ml gequollenem Gel. Der Farbstoff ist unter der Bezeichnung Red A, Reaktiv Red 120 und Procion Red HE3B bekannt, einer eingetragenen Marke der Firma Imperial Chemical Industries (Baird, J., Sherwood, R., Carr, R. und Atkinson, A., "Enzyme Purification by Substrate Elution Chromatography from Procion Dye-Polysaccharide Matrices.", FEBS Lett., 70: 61).
Die Phenyl- nichtanhaftende Fraktion (näherungsweise 110 ml) wurde mit 0,5 Volumen Tris/ME verdünnt und bei 4ºC an eine Säule mit 2 cm Durchmesser mit 20 ml Matrex Gel Red A angelegt, das gegen Tris/100-NaCl/ME im Gleichgewicht war. Matrex Gel Red A trennt Proteine auf der Basis ihrer Fähigkeit, sich an Red A Farbstoff zu binden. Die nichtanhaftende Fraktion, einschließlich einer Waschung mit einem Säulenvolumen mit Tris/100-NaCl/ME, wurde gesammelt, auf das Vorhandensein von menschlichem EI (Fig. 1) untersucht, für 3 Stunden bei 4ºC gegen Tris/50-NaCl/ME dialysiert und bei -70ºC gespeichert.

HPLC DEAE-5PW Separation

DEAE-5PW ist ein schwaches Anionen-Austauschharz für Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC), das Proteine auf der Basis von kleinen Unterschieden der Ladungseigenschaften trennt. DEAE-5PW wird durch Einführen von Diethylaminoethyl (DEAE) -Gruppen in ein hydrophiles festes Harz zubereitet; es ist ein Produkt der Firma Waters Division, Millipore Corp., Milford, MA und auch als Protein-Pak DEAE-5PW bekannt; (Protein-Pak ist eine Marke für verschiedene Waters-Harze). Pro ml Harz sind 0,1 Mikromol wirksame DEAE Gruppen vorhanden. DEAE-5PW ist ein 10 Mikron sphärisches Diethylaminoethyl-funktionalisiertes Polymethacrylat- Harz mit Poren von 1000 Ångström. Das Harz ist in einer 316 rostfreien Stahisäule mit den Abmessungen 7,5 x 75 mm eingeschlossen.
Teile (50 ml) der dialysierten Red A- nichtanhaftenden Fraktion wurden durch eine 0,2 µm Nylonmemban (Schleicher und Schuell, Keene, NH) gefiltert und mit 0,8 ml/min an eine DEAE-5PW Säule angelegt, die bei 22ºC gegen Tris/50-NaCl/ME ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Säule wurde mit einem Gleichgewichtspuffer gewaschen. Zur Elutierung von menschlichem EI wurde Tris/85-NaCl/ME zugeführt, und die Bruchteile, die bei 280 nm absorbieren, wurden gesammelt und gemäß obiger Erläuterung auf das Vorhandensein von menschlichem EI untersucht.
Zur Konzentration von EI wurden die aktiven Fraktionen von 3 bis 4 DEAE-Fraktionierungen gesammelt, mit Tris/ME verdünnt und erneut an die DEAE-5PW Säule in Tris/50-NaCl/ME angelegt. Eine einzelne, EI enthaltende Fraktion aus 1 bis 2,5 ml wurde mit Tris/140-NaCl/ME elutiert. Das Vorhandensein von menschlichem EI wurde wie oben bestätigt. Diese Fraktion ist ein zu 85 bis 95 % reiner menschlicher EI, was durch goldgefärbte SDS Elektrophorese-Gels angezeigt wurde. Da es ferner aktiv und konzentriert ist (z.B. 0,4 mg/ml), wird diese Zubereitung von menschlichem EI bevorzugt für Aktivitäts- und funktionale Untersuchungen verwendet.

HPLC-Gel Filtrations-Chromatographie

Für einige Anwendungen wurden die vorhandenen Verschmutzungen durch eine HPLC-Gel Filtrations- Chromatographie unter Verwendung des HPLC-Gel Filtrations-Harzes Protein-Pak I-125 entfernt. Protein-Pak I-125 ist ein Produkt der Firma Waters Division und stellt ein 10 Mikron, zweifach gebundenes Kieselgel mit einer Porengröße von 100 Ångström dar. Es besteht aus unregelmäßigen Kieselerde-Partikeln, die kovalent mit einem Dihydroxyalkyl-Silan gebunden sind, um einen hydrophilen Stoff zu erzeugen, der im Hinblick auf Proteine nichtabsorbierend und für eine Gel-Filtrations-Chromatographie geeignet ist. Es wird in Säulen von 7,8 x 30 mm aus 316 rostfreiem Stahl eingeschlossen zugeführt.
Teile von gesammeltem konzentriertem menschlichem EI aus DEAE-5PW (200 - 1000 µl) wurden mit 1,0 ml/min an zwei in Reihe liegenden Protein-Pak I-125 Säulen, die insgesamt 7,8 x 600 mm ergaben, Gel-gefiltert und gegen 10 mM Tris HCl Puffer mit pH = 7,4 und 90 mM NaCl ins Gleichgewicht gebracht. Die bei 214 nm (zwei Spitzen) absorbierenden Fraktionen wurden gesammelt und nach Zusatz von Mercaptoethanol auf 1 mM auf den Gehalt von menschlichem EI gemäß obiger Darstellung untersucht. Die gesammelte aktive Spitze (zweite Spitze) stellt reinen oder im wesentlichen reinen menschlichen EI dar. Alternativ dazu wurde die HPLC-Gel Filtration unter Verwendung von 50 mM NH&sub4;HCO&sub3; als Puffer durchgeführt. Der Puffer wurde durch Lyophilisation aus der gesammelten Fraktion, die den menschlichen EI enthielt, entfernt.
Mit der Laemmli SDS-Elektrophorese gemäß der Beschreibung in (8) werden Fraktionen aus der Aufbereitung analysiert. Die Polypeptide wurden nach der Überführung zu den PVDF Membranen (Polyvinylidin Difluorid; 0,45 µm; Millipore Corp., Bedford, MA) mit Gold gefärbt (konstant 70 mAmps; 160V / 1,6A Leistungsversorgung; Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), und zwar mit 42 mM Tris/190 mM Glycin Puffer und einem pH- Wert von 8,3 für 18 Stunden bei etwa 22ºC (Transphor Cell; Hoefer Scientific, San Francisco, CA). Die PVDF Membranen wurden siebenmal mit 0,1 % Tween-20 (Tween-20 ist eine Marke für ein Polyethoxyethanolsorbitant der Firma ICI Americas; das Produkt wurde in Form einer 10 % wässrigen Lösung geliefert, die unter Stickstoff in Glassampullen verpackt und von der Firma Pierce Co., Rockford, IL mit Surfact-Amp 20 bezeichnet wird) in PBS (2 x 15 Minuten; 5 x 5 Minuten) und zweimal mit Wasser gewaschen und bei etwa 22ºC für 4 oder mehr Stunden mit 0,2 bis 0,3 ml/cm² AuroDye Protein-Farbstoff (Janssen Pharmaceutica, Piscataway, NJ) inkubiert. AuroDye ist ein stabilisiertes kolloidales Gold-Sol (20 nm), das auf näherungsweise pH 3 eingestellt ist und Proteine dunkelrot färbt.

Bestimmung des Molekulargewichtes von EI

Das scheinbare Molekulargewicht von menschlichem EI wurde durch Vergleich seiner Mobilität auf SDS Elektrophorese-Gelen (11) mit derjenigen von vorher beschriebenen (8) reinen Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht zu 42.000 bestimmt. Die Proteine wurden durch Goldfärbung von elektrophoretischen Übergängen erfaßt.

Inhibition der Elastinolyse

Menschlicher EI wurde durch Erzeugung einer lytischen Zone in einem Elastin enthaltenden Agar-Gel auf seine elastinolytische Aktivität untersucht (12). Allgemein wurden verschiedene Mengen von menschlichem EI (gesammelte, konzentrierte DEAB Fraktion) für fünf Minuten bei etwa 22ºC mit entweder 75 ng oder 150 ng pankreatischer Elastase kombiniert und dann für 48 Stunden bei 37ºC in Schächte aus Fluorescein-Elastin- Agar Anoden inkubiert. Das Ausmaß der Elastinolyse, das in Form des Durchmessers der Lysis-Ringe gemessen wurde (Mittelwert von zweimaligen Bestimmungen), wurde durch Bezug auf eine parallele Standardkurve in Einheiten konvertiert (wobei eine Einheit gleich der Aktivität von 1 ng Elastase ist). Untersuchungen wurden unter Verwendung von 75 ng Elastase (Gehäuse) und 150 ng (Kreise) durchgeführt. Menschlicher EI bewirkte eine Dosis-unabhängige Inhibition der Elastinolyse durch Elastase, wodurch gezeigt wurde, daß menschlicher EI die Elastase hemmt (Fig 2).
Um zu zeigen, daß das Mr 42.000 -Polypeptid der Elastase-Inhibitor ist, wurde die DEAE-gereinigte Fraktion mit nicht gekennzeichneter Elastase inkubiert und auf mit Silber gefärbten SDS-Elektrophorese-Gelen untersucht. Das SDS Gel umfaßte drei Streifen, und zwar einen für EI, einen für Elastase und einen für eine Mischung des EI mit der Elastase. Bei der Co-Inkubation für 1 Minute verschwanden das Mr 42.000 -Polypeptid und die Elastase gleichzeitig mit der Bildung eines Mr 66.000 -Elastase-Elastase Inhibitor-Komplexes (Fig. 3). Dieses Ergebnis zeigte, daß das Mr 42.000 -Polypeptid der Elastase-Inhibitor ist. Weiterhin zeigte es, daß die Masse der gereinigten Moleküle die Komplex-bildende Aktivität beibehalten haben und daß die Reaktion der gereinigten Moleküle mit Elastase schnell ist (abgeschlossen nach 1 Minute). Die Molekulargewichte der Reaktionsmittel und der Komplexe deuten klar darauf hin, daß die Reaktion eine Stöchiometrie von 1 : 1 aufweist.

Aminosäurezusammensetzung

Ein Aliquot von lyophilisiertem reinem menschlichen EI wurde bei 110ºC 24 Stunden in 6 N HCl hydrolisiert. Die Aminosäurezusammensetzung wurde mit einem Dionex D-500 Analysierer bestimmt. Der Gehalt an Cys/2 (Cystein mit 1/2 Cystin) wurde nach performischer Säureoxidation (14) als Cysteicsäure bestimmt. Die Aminosäurezusammensetzung der Probe ist zusammen mit der mittleren Zusammensetzung von 200 gereinigten Proteinen und derjenigen von al-AT, dem bekannten, im Plasma gefundenen Elastase-Inhibitor, in Fig 4 dargestellt.

Kohlenhydratzusammensetzung

Der Kohlenhydratgehalt von reinem menschlichen EI wurde durch Methanolyse einer lyophilisierten Probe durch Gas-Flüssigkeitschromatographie nach Umwandlung zu den Per(trimethylysilyl) Derivaten (15) bestimmt. Pro Molekül von EI wurden 3,6 Rückstände Xylose (offenbar eine Verunreinigung) und 0,5 Rückstände Mannose (mittlerer Wert für zwei Zubereitungen) erfaßt. Galactose, N-Acetylglucosamine, N-Acetylgalactosamine und Sialicsäure wurden nicht gefunden. Reiner menschlicher EI wurde auch mit Glycosidase Pngase F behandelt, die alle Klassen von N-verbundenen Kohlenhydrateinheiten (16) spaltet. Bei der Behandlung mit 140 - 4200 mU/ml PNGase F wurde keine Änderung des scheinbaren Molekulargewichts von EI festgestellt. All dieses bedeutet, daß reiner menschlicher EI ein nichtglykosyliertes oder im wesentlichen nichtglycosyliertes Protein ist.

Aminosäuresequenz

Zwei Versuche zur Bestimmung der Aminoterminalsequenz von reinem menschlichen EI ergaben keine Sequenz, was die Vermutung nahelegt, daß der Aminoterminus geblockt ist. Deshalb entschloß man sich, das Protein zu spalten, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen. Es wurden zwei Zubereitungen von menschlichem EI mit jeweils 40 µg bzw. 76 µg untersucht, wobei zur Spaltung eine Behandlung mit Proteinasetrypsin gewählt wurde. Aufgrund der Möglichkeit, daß menschlicher EI Trysin hemmt, wurde der erstgenannte hitzebehandelt (für 8 Minuten bei 85 - 95ºC), um seine hemmende Aktivität zu zerstören. Das hitzebehandelte Protein wurde mit 0,003 Teilen Trypsin bei einem pH-Wert von 8 und 37ºC für 18 Stunden inkubiert, wobei diese Bedingungen durch Vorversuche in kleinem Maßstab ermittelt wurden. Ein kleiner Teil der mit Trypsin behandelten Zubereitung wurde mit SDS-Elektrophorese und Goldfärbung analysiert, um sicherzustellen, daß der Abbau von menschlichem EI abgeschlossen war.
Die sich ergebenden tryptischen Peptide wurden durch Chromatographie an einer C&sub1;&sub8; Säule mit umgekehrter Phasen-HPLC mit einem 2 - 75 % Acetonitril-Gradienten in 0,1 % Trifluoroaceticsäure in Wasser fraktioniert. Die C&sub1;&sub8; Säule ist eine Kieselerde mit einer Porengröße von 300 Ångström mit einer gebundenen Phase mit 5 Mikron Partikeln, die in einer Säule aus rostfreiem Stahl von der Firma Vydac Dividion, The Separations Groups, Hesperia, CA, mit 0,46 x 25 cm eingeschlossen ist. Diese ist für die Chromatographie von Proteinen und Peptiden mit umgekehrter Phasen-HPLC vorgesehen. Fraktionen, die die abgetrennten Peptidspitzen enthielten, wurden auf der Basis einer Absorption bei 214 nm gesammelt, wobei das Lösungsmittel durch Lyophilisation entfernt wurde. Die Peptidspitzen wurden an einem Gasphasen-Proteinsequenzer (ABI 470A, Applied Biosystems, Foster City, CA), der mit einem on-line Phenylthiohydantoin HPLC Analysator ausgerüstet war (ABI 120A On-line PTH Analysato), einer Amino- Terminal-Aminosäuren Sequenzierung unterzogen.

Vorhandensein von Disulfidbindungen

200 mM Mercaptoethanol beeinflussen die Fähigkeit von reinem menschlichen EI zur Bildung eines Komplexes mit Elastase nicht nachteilig. EI scheint somit keine Disulfidbindungen und insbesondere keine solchen Disulfidbindungen zu enthalten, die für die Aktivität wesentlich sind.

Wesentlicher Cystein-Rückstand

Der Zusatz von Sulfhydryl-Iodoacetamid (3 mM) zu reinem menschlichen EI verursacht einen nahezu vollständigen Verlust der kovalenten Komplexaktivität mit Elastase. Eine Zerstörung von nichtreagiertem Iodoacetamid durch Zusatz von Mercaptoethanol oder die Entfernung durch Dialyse führt nicht zu einer Widerherstellung der Aktivität von reinem menschlichen EI. EI scheint somit einen Cystein-Rückstand aufzuweisen, der für die Bildung des kovalenten Elastase-Komplexes wesentlich ist.

Nachweis von EI in Monozyten, Macrophagen und Neutrophilen

Menschlicher EI wurde unter Verwendung der ¹²&sup5;I-Elastase- Komplex-Probe in Lysaten von menschlichen Monozyten, die in einer Kultur ausgereift wurden, und in der Monozyt-ähnlichen Zellinie U937-EI gefunden, jedoch nicht in frisch isolierten menschlichen Monozyten oder Neutrophilen. Wenn diese letztgenannten Zellen mit der aktiven Seite des Reagens Diisopropyl-Fluorophosphat (DFP) inkubiert und in Anwesenheit von DFP lysiert wurden und überschüssiges DFP durch Dialyse aus den Lysaten entfernt wurde, konnte die Aktivität des menschlicher EI in frischen Monozyten ebenso wie in Neutrophilen (Fig. 5) schnell nachgewiesen werden. Die Aktivität von menschlichem EI wurde auch in Lysaten von Lungen-Macrophagen nachgewiesen, die durch Bronchialwaschung bei gesunden, nichtrauchenden Versuchspersonen gewonnen wurden.

Klonen von menschlichem EI

Die gesamte mRNA wird aus U937-EI-Zellen isoliert und unter Verwendung üblicher Verfahren der cDNA "zurücktransformiert". Als nächstes wird jedes der cDNA Moleküle in einen Vektor, wie z.B. eine Phage lgtll eingesetzt, wodurch eine cDNA Bibliothek erzeugt wird. Alternativ dazu kann auch eine menschliche monozyte oder monozytähnliche cDNA Bibliothek in einem Vektor wie z.B. lgtll erstellt werden.
Die cDNA Bibliothek wird in E. coli ausgedrückt und wächst bis auf etwa 10&sup5; E. coli Kolonien heran, wobei jede Kolonie von einem infizierten Bakterium abgeleitet ist. Die Kolonien werden dann untersucht, um diejenigen Kolonien zu identifizieren, die die lgtll Phage mit der interessierenden monozyten cDNA enthalten. Die Detektorsonde zur Untersuchung der E. coli Kolonien kann entweder ein Oligonukleotide codierender Teil von menschlicher EI oder ein Antikörper oder Antikörper von menschlicher EI sein. Geeignete Oligonukleotid-Sonden werden synthetisch mit üblichen Verfahren auf der Basis der oben genannten Sequenzdaten von menschlichem EI hergestellt. Geeignete Überprüfungs-Antikörper werden mit üblichen Immunisationsverfahren unter Verwendung von gereinigtem menschlichen EI als Immunogen hergestellt. Alternativ dazu werden Peptide mit üblichen Verfahren unter Verwendung von Sequenzen des EI- Peptiden synthetisiert und als Immunogene verwendet, um Antikörper gegen menschliches EI zu erzeugen. Wenn die interessierende Kolonie identifiziert ist, wird die cDNA aus dem Expressionsvektor in dieser Kolonie isoliert und das genome Komplement zu der cDNA für menschlichen EI isoliert, wobei für all dies übliche Verfahren angewendet werden.
Für den einschlägigen Fachmann ist klar, daß es zu der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform zahlreiche Äquivalente gibt. Während z.B. mit der Erfindung unter anderem ein Verfahren zur Erzeugung einer cDNA- Kopie der MRNA für menschlichen EI und die Darstellung (Ausdruck) für diese cDNA geschaffen wird, liegen verschiedene Modifikationen der cDNA und des dargestellten Produktes im Schutzbereich der Erfindung. Die den menschlichen EI codierenden cDNA Sequenzen können z.B. an einer oder mehreren Basis-Paar-Positionen geändert oder Abschnitte der cDNA können beseitigt werden, ohne daß die Fähigkeit des dargestellten (ausgedrückten) Proteins beeinträchtigt wird, als ein Inhibitor von Elastase oder von anderen Serin-Proteinasen zu wirken. Das dargestellte Protein kann deshalb Aminosäuresubstitutionen oder Streichungen umfassen, ohne daß die funktionelle Äquivalenz des natürlich auftretenden menschlichen EI beeinträchtigt wird. Der genetisch konstruierte menschliche EI umfaßt somit natürlich vorkommenden menschlichen EI und Variationen, Derivate oder Teile davon, die nach wie vor die Fähigkeit haben, einen Komplex mit Elastase zu bilden und/oder deren Aktivität zu hemmen. In diesem Zusammenhang ist es für den Fachmann klar, daß ein Molekül die Aktivität von Elastase hemmen kann, ohne einen kovalenten Komplex mit Elastase zu bilden. Somit können sehr kleine Anteile von menschlichem Inhibitor und vorzugsweise solche, die die Sequenz des Elastase-Bindungsbereiches von menschlichem EI haben, ausreichende Affinität zur Elastase haben, um sich an diese zu binden und diese zu hemmen, ohne jedoch einen kovalenten Komplex mit Elastase zu bilden. Solche kleinen Anteile oder Derivate davon liegen im Bereich der Erfindung. Diese Teile oder Derivate können durch übliche Peptidsynthese oder mit rekombinanten Verfahren zubereitet werden.
Zur Erfindung gehören auch Teile und Variationen von menschlichem EI, die mit Moietäten verbunden sind und mit der aktiven Seite einer Serin-Proteinase reagieren können. In diesem Fall würde der Teil oder die Variation die Serin-Proteinase erkennen und die aktive Moietät zur hemmenden Interaktion mit der Serin-aktiven Seite zuführen.
Teile von menschlichem EI können auch als Inhibitoren von menschlichem EI verwendet werden. Zum Beispiel können Teile von menschlichem EI, die eine Wechselwirkung mit Elastase aufweisen, die jedoch nicht auf die Aktivität der Elastase einwirken, zum Blocken der hemmenden Wirkung von menschlichem EI in vivo verwendet werden, indem sie verhindern, daß sich der Komplex zwischen menschlichem EI und Elastase bildet. Somit ist es fur einen Fachmann klar, daß die erfindungsgemäßen Produkte auch Teile von menschlichem EI umfassen, die nicht in der Lage sind, einen kovalenten Komplex mit Elastase und Oligonukleotide zu bilden, die solche Teile codieren.
Ferner ist es für einen Fachmann klar, daß es mehrfach bezogene, jedoch geringfügig abweichende Formen von natürlich auftretendem menschlichen EI gibt. Somit ist klar, daß es mehr als eine mRNA-Sequenz- und mehr als eine entsprechende cDNA-Sequenz-Kodierung für natürlich auftretenden menschlichen EI gibt. Jedoch kann jede solche DNA-Sequenz mit den oben genannten Verfahren isoliert werden und jede Form von menschlichem EI kann durch Expressionsvektoren erzielt werden, die jede solche cDNA-Sequenz tragen. In ähnlicher Weise kann dann mit bekannten Verfahren die den verschiedenen Formen von menschlichem EI entsprechende genome DNA isoliert werden.
Der natürlich auftretende menschliche EI und Variationen, Derivate und Teile davon können in pharmazeutisch wirksamen Mengen zur Behandlung von medizinischen Zuständen verwendet werden. Im allgemeinen können diese zur Behandlung von Zuständen verwendet werden, die eine zerstörerische Wirkung von Elastase und von anderen Proteinasen beinhalten, mit denen sie reagieren, einschließlich einer Gewebeschädigung infolge einer Entzündung. Besondere Anwendungen sind Bronchiectasis infolge einer Lungenentzündung, Schäden des Darmgewebes bei chronischer Granulatomous- Krankheit und LAD (leukocyte adhesion deficiency), zystische Fibrose, Pancreatitis, Krebsgeschwüre, Blutgefäßschäden infolge Verklebungen, blasenbildende Hautfunktionsstörungen, Reperfusion-Verletzungen und geschwürbildende Colitis. Andere Anwendungen sind alle Zustände, bei denen der Wert des menschlichen EI unnormal ist, bei denen zuviel Elastase oder andere, mit menschlichem EI reaktive Proteinasen vorhanden sind oder bei Vorliegen einer übermäßigen phagozyten Ansammlung.
Der natürlich auftretende menschliche EI und Variationen, Derivate und Teile davon können auch zur Herstellung von Antisera für die Feststellung des Vorhandenseins oder Fehlens oder der Menge von menschlichem EI verwendet werden, was zur Abschätzung von angeborenen oder erworbenen Fehlern und auch zur Abschätzung von Krankheitszuständen nützlich ist. Antikörper für menschlichen EI können z.B. zur Abschätzung des Ausmaßes der phagozytischen Zellantwort bei infektiösen Krankheitszuständen wie Tuberkulose und Lepra verwendet werden. In ähnlicher Weise können solche Antikörper zur Diagnose von Entzündungszuständen wie rheumatologischen Erkrankungen (z.B. rheumatische Arthritis), immunologischen Erkrankungen (z.B. Pemphigus), idiopathischen Erkrankungen (z.B. Sarcoidosis) und entzündlichen Erkrankungen (z.B. Atembeschwerdesyndromen bei Erwachsenen) verwendet werden. Antikörper können ferner als diagnostisches Mittel in Verbindung mit neoplastischen Erkrankungen (z.B. Überwachung von bösartigen Geschwüren durch Abschätzung der Host-Antwort, Abschätzung der metastatischen Kapazität von Krebszellen), genetischen Erkrankungen (z.B. zystische Fibrose oder erbliche Abnormalitäten in dem Elastase-Elastase-Inhibitorsystem), abnormaler Reifung von myelomonozytischen Zellen (z.B: Chediak-Higashi Syndrom), Pancreatitis und anderen Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse und allgemein zur Abschätzung der genetischen Veränderlichkeit des Elastase-Elastase- Inhibitorsystems in der Bevölkerung und deren Abhängigkeit von Erkrankungen verwendet werden.
Antikörper für menschlichen EI finden auch therapeutische Anwendungen einschließlich der Behandlung von Zuständen, bei denen die Elastase abnormal ist, der Elastase-Inhibitor über die Elastase hinausgeht, oder die Phagozyt-Ansammlung fehlerhaft ist. Zu solchen Zuständen gehören Abnormalitäten und Anfälligkeiten bei Infektionen oder eine unangemessene Immunabwehr.
In ähnlicher Weise können Oligonukleotide, die komplementär zu Ribonukleotiden sind und den menschlichen EI oder Teile davon codieren, für einige der oben genannten diagnostischen Zwecke nützlich sein. Ferner können die Oligonukleotide, die den menschlichen EI oder einen Teil, Derivate oder Variationen davon codieren, allein oder als Teil eines geeigneten Expressionsvektors oder Zuführsystems bei der Gen-Austauschtherapie bezüglich der oben beschriebenen Zustände nützlich sein. Zubereitungen, die wirksame Mengen von solchen Oligonukleotiden, geeignete Expressionsvektoren oder Zuführsysteme enthalten, werden mit üblichen Klon- und Isolierverfahren gemäß obiger Beschreibung oder mit anderen Verfahren wie z.B. PCR (polymerase Kettenreaktion) hergestellt. Diese und viele andere Anwendungen sind für den einschlägigen Fachmann offensichtlich.
Die obige Beschreibung dient nur zur Verdeutlichung und nicht zur Beschränkung der Erfindung.

Bezugsquellen:

(1) Janoff, A., Blodin, J.: "Inhibition of the Elastase-Like Esterase in Human Leukocyte Granules by Human Leukocyte Cell Sap.", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1971, 136: 1050-1053.
(2) Blodin, J., Rosenberg, R., Janoff, A.: "An Inhibitor in Human Lung Macrophages Active Against Human Neutrophil Elastase", Am. Rev. Resp. Dis., 1972, 106: 477 - 479.
(3) Dubin, A.: "A Polyvalant Proteinase Inhibitor from Horse-Blood-Leukocyte Cytosol", Eur. J. Biochem., 1977, 73: 429 - 435.
(4) Potempa, J., Dubin, A., Travis, J.: "An Elastase Inhibitor from Equine Leukocyte Cystosol Belongs to the Serpin Superfamily", J. Biol. Chem., 1988, 263: 7364.
(5) Kopitar, M. und M. Bozic: "Pig Leukocyte Elastase Inhibitor", Acta Pharm. Jugosl., 1985, 35: 203 - 212.
(6) Valentine, R., Goettlich-Riemann, W., Fisher, G. und Rucker, R.B.: "An Elastase Inhibitor from Isolated Bovine Pulmonary Macrophages", Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1981, 168: 238 - 244.
(7) Remold-O'Donnell, E. und K. Lewandrowski: "Two Proteinase Inhibitors Associated with Peritoneal Macrophages", J. Biol. Chem., 1983, 258: 3251 - 3257.
(8) Remold-O'Donnell, E.: "A Fast-Acting Elastase Inhibitor in Human Monocytes", J. Exp. Med., 1985, 162: 2142 - 2155.
(9) Sundström, C. und Nilsson, K.: "Establishment and Characterization of a Human Histiocytic Lymphoma Cell Line (U-937)", Int. J. Cancer, 1976, 17: 565 - 577.
(10) Lazardes, E. und Lindberg, U.: "Actin is the Naturally Occurring Inhibitor of Deoxyribonudease I", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, Vol 71, 4742 - 6.
(11) Weber, K. und Osborn, M.: "The Reliability of Molecular Weight Determinations by Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis", J. Biol. Chem., 1969, 244: 4406 - 4412.
(12) Senior, R.M., Huebner, P.F. und Pierce, JA.: "Measurement of Elastase Activity by Elastin Agar and Its Use in the Detection of Antitrypsin Deficiency", J. Lab. Clin. Med., 1971, 77: 510 - 6.
(13) Merril, C.R., Goldman, D., Sedman, S.A., Ebert, M.H.: "Ultrasensitive Stain for Proteins in Polyacrylamide Geis Shows Regional Variations in Cerebrospinal Fluid Proteins", Science, 1981, Vol 211, 1437 - 8.
(14) Hirs, C.H.W.: J. Biol. Ohem., 1956, 219: 611 und Moore, S.: J. Biol. Chem., 1963, 238: 235.
(15) Reinhold, V.N.: Methods Enzymol, 1972, 25: 244 - 249.
(16) Tarentino, A.L., Gomez, C.M., Plummer, T.H., Jr.: "Deglycosylation of Asparagine-Linked Glycans by Peptide:N-glycosidase F.", Biochemistry, 1985, 24: 4665 - 4671.

Claims

1. Im wesentlichen reine Zubereitung aus einem einzelnen menschlichen monocyten Polypeptid-Molekül mit einem Molekulargewicht von etwa 42.000 und einer nichtglycosylierten Struktur, die einen kovalenten Komplex mit Elastase bilden kann und als ein Inhibitor der elastinolytischen Aktivität von Elastase wirkt.

2. Im wesentlichen reine Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß eine Behandlung des Moleküls mit Iodoacetamid verhindern kann, daß das Molekül einen Komplex mit pancreatischer Elastase bildet und daß das Molekül keine wesentlichen Disulfidbindungen aufweist.

3. Im wesentlichen reine Zubereitung aus menschlichem monocyten EI oder einer Variation, eines Teils oder eines Derivats davon, das eine Proteinsequenz aufweist, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(1) Leu-Gly-Val-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Ser;

(2) Phe-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ile-Glu-Asp-Leu-Lys;

(3) Tyr-Asn-Phe-Leu-Pro-Glu-Phe-Leu-Val-Ser-Thr-Gln- Lys;

(4) Leu-Asp-Asn-Val-Gly-His-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Ala- Val-Lys;

(5) Glu-Ala-Thr-Thr-Asn-Ala-Pro-Phe-Arg;

(6) Phe-His-Phe-Asn-Thr-Val-Glu-Glu-Val-His-Ser;

(7) Tyr-Gly-Ala-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-His- Ala-Ser- Glu-Asp-Ala;

(8) Val-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Gln-Gly-Glu-Glu-Leu-Ser- Met-Val-Iso-Leu-Leu-Pro;

(9) Lys-Ile-Glu-Glu-Gln-Leu-Thr-Leu-Glu-Lys; und

(10) Phe-Lys-Leu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp- Leu-Ala-Arg.

4. Zubereitung mit einer therapeutisch wirksamen Menge aus menschlichem monocyten EI oder einer Variation, eines Teils oder eines Derivats davon, das eine Proteinsequenz aufweist, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(1) Leu-Gly-Val-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Ser;

(2) Phe-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ile-Glu-Asp-Leu-Lys;

(3) Tyr-Asn-Phe-Leu-Pro-Glu-Phe-Leu-Val-Ser-Thr-Gln- Lys;

(4) Leu-Asp-Asn-Val-Gly-His-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Ala- Val-Lys;

(5) Glu-Ala-Thr-Thr-Asn-Ala-Pro-Phe-Arg;

(6) Phe-His-Phe-Asn-Thr-Val-Glu-Glu-Val-His-Ser;

(7) Tyr-Gly-Ala-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-His- Ala-Ser-Glu-Asp-Ala;

(8) Val-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Gln-Gly-Glu-Glu-Leu-Ser- Met-Val-Iso-Leu-Leu-Pro;

(9) Lys-Ile-Glu-Glu-Gln-Leu-Thr-Leu-Glu-Lys; und

(10) Phe-Lys-Leu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp- Leu-Ala-Arg.

5. Zubereitung nach Anspruch 4, die ferner eine Moietät aufweist, die mit der aktiven Seite einer Proteinase reagieren kann, die mit dem Teil, dem Derivat oder einer Variation von menschlichem monocyten EI verbunden ist.

6. Rekombinanter Vektor mit einer DNA Sequenz, in der ein Molekül codiert ist, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(a) menschliches monocytes EI;

(b) ein Molekül mit einer Proteinsequenz, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(1) Leu-Gly-Val-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Ser;

(2) Phe-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ile-Glu-Asp-Leu-Lys;

(3) Tyr-Asn-Phe-Leu-Pro-Glu-Phe-Leu-Val-Ser-Thr-Gln- Lys;

(4) Leu-Asp-Asn-Val-Gly-His-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Ala- Val-Lys;

(5) Glu-Ala-Thr-Thr-Asn-Ala-Pro-Phe-Arg;

(6) Phe-His-Phe-Asn-Thr-Val-Glu-Glu-Val-His-Ser;

(7) Tyr-Gly-Ala-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-His- Ala-Ser-Glu-Asp-Ala;

(8) Val-Leu-Glu-Leu-Prb-Tyr-Gln-Gly-Glu-Glu-Leu-Ser- Met-Val-Iso-Leu-Leu-Pro;

(9) Lys-Ile-Glu-Glu-Gln-Leu-Thr-Leu-Glu-Lys; und

(10) Phe-Lys-Leu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp- Leu-Ala-Arg.

7. Rekombinanter Vektor nach Anspruch 6, bei dem das Molekül als Inhibitor einer Serinproteinase und/oder als Inhibitor von Elastase wirken kann und/oder einen kovalenten Komplex mit Elastase bilden kann und als Inhibitor von Elastase wirken kann.

8. Nichtnatürlich auftretendes Molekül, das als ein Inhibitor einer Serinproteinase wirken kann und mindestens einen Teil von menschlichem monocyten EI aufweist, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

(1) Leu-Gly-Val-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Ser;

(2) Phe-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ile-Glu-Asp-Leu-Lys;

(3) Tyr-Asn-Phe-Leu-Pro-Glu-Phe-Leu-Val-Ser-Thr-Gln- Lys;

(4) Leu-Asp-Asn-Val-Gly-His-Leu-Pro-Ala-Giy-Gly-Ala- Val-Lys;

(5) Glu-Ala-Thr-Thr-Asn-Ala-Pro-Phe-Arg;

(6) Phe-His-Phe-Asn-Thr-Val-Glu-Glu-Val-His-Ser;

(7) Tyr-Gly-Ala-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-His- Ala-Ser-Glu-Asp-Ala;

(8) Val-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Gln-Gly-Glu-Glu-Leu-Ser- Met-Val-Iso-Leu-Leu-Pro;

(9) Lys-Ile-Glu-Glu-Gln-Leu-Thr-Leu-Glu-Lys; und

(10) Phe-Lys-Leu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp- Leu-Ala-Arg.

9. Nichtnatürlich auftretendes Molekül nach Anspruch 8, wobei das Molekül als ein Inhibitor von Elastase wirken kann.

10. Nichtnatürlich auftretendes Molekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Molekül einen kovalenten Komplex mit Elastase bilden kann und die Behandlung mit Iodoacetamid die Fähigkeit des Moleküls zur Bildung eines Komplexes mit Elastase außer Kraft setzt.

11. Verfahren zur Isolierung der Gene von menschlichem monozyten EI unter Verwendung einer Detektorsonde, die eine Oligonucleotidsequenz enthält, die mindestens einen Teil des menschlichen monozyten EI codiert, das eine Aminosäuresequenz aus folgender Gruppe aufweist:

(1) Leu-Gly-Val-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Ser;

(2) Phe-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ile-Glu-Asp-Leu-Lys;

(3) Tyr-Asn-Phe-Leu-Pro-Glu-Phe-Leu-Val-Ser-Thr-Gln- Lys;

(4) Leu-Asp-Asn-Val-Gly-His-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Ala- Val-Lys;

(5) Glu-Ala-Thr-Thr-Asn-Ala-Pro-Phe-Arg;

(6) Phe-His-Phe-Asn-Thr-Val-Glu-Glu-Val-His-Ser;

(7) Tyr-Gly-Ala-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-His- Ala- Ser-Glu-Asp-Ala;

(8) Val-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Gln-Gly-Glu-Glu-Leu-Ser- Met-Val-Iso-Leu-Leu-Pro;

(9) Lys-Ile-Glu-Glu-Gln-Leu-Thr-Leu-Glu-Lys; und

(10) Phe-Lys-Leu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp- Leu-Ala-Arg.

12. Im wesentlichen reine Zubereitung eines Oligonucleotids, das menschliches monocytes EI oder ein Protein codiert, das eine aus folgender Gruppe ausgewählte Aminosäuresequenz umfaßt:

(1) Leu-Gly-Val-Gln-Asp-Leu-Phe-Asn-Ser;

(2) Phe-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ile-Glu-Asp-Leu-Lys;

(3) Tyr-Asn-Phe-Leu-Pro-Glu-Phe-Leu-Val-Ser-Thr-Gln- Lys;

(4) Leu-Asp-Asn-Val-Gly-His-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Ala- Val-Lys;

(5) Glu-Ala-Thr-Thr-Asn-Ala-Pro-Phe-Arg;

(6) Phe-His-Phe-Asn-Thr-Val-Glu-Glu-Val-His-Ser;

(7) Tyr-Gly-Ala-Asp-Leu-Ala-Ser-Val-Asp-Phe-Gln-His- Ala-Ser-Glu-Asp-Ala;

(8) Val-Leu-Glu-Leu-Pro-Tyr-Gln-Gly-Glu-Glu-Leu-Ser- Met-Val-Iso-Leu-Leu-Pro;

(9) Lys-Ile-Glu-Glu-Gln-Leu-Thr-Leu-Glu-Lys; und

(10) Phe-Lys-Leu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp- Leu-Ala-Arg.

13. Zubereitung mit einer diagnostischen Menge eines Antikörpers mit selektiver Spezifizität für menschliches monocytes EI.

14. Im wesentlichen reine Zubereitung eines Antikörpers mit selektiver Spezifizität für menschliches monocytes EI mit einem Molekulargewicht von etwa 42.000.

15. Menschliches monocytes EI, eine Variation, ein Teil oder ein Derivat davon, oder Antikörper für menschliches monocytes EI oder ein Oligonucleotid, das menschliches monocytes EI codiert, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 8 bis 10 und 12 bis 14, zur Anwendung in einem Verfahren zur Diagnose eines medizinischen Zustandes

16. Verwendung von menschlichem monocyten EI, einer Variation, eines Teil oder eines Derivat davon, oder von Antikörpern für menschliches monocytes EI oder eines Oligonucleotids, das menschliches monocytes EI codiert, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, 8 bis 10 und 12 bis 14, zur Herstellung eines Medikaments zur Diagnose eines medizinischen Zustandes.