JPH04505914A - ヒトエラスターゼインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に分子生物学、薬理学および医学に関し、特にヒトプロテイナーゼ インヒビターの単離、精製およびクローニングに関する。

局部組織の機能を健全に維持するためには、食細胞のプロテイナーゼの活性およ びプロテイナーゼインヒビターの作用の微妙なバランスが要求される。このバラ ンスの消失が、喘息、慢性気管支炎、肺気腫、類肉腫症、呼吸障害症候群、関節 炎およびある種の皮膚病およびおそらく悪性腫瘍の発病の主要な原因因子である と信じられている。例えば、好中球および単球による過剰のエラスターゼの放出 ならびに単球および好中球の過剰蓄積は、炎症状態例えば関節炎および肺気腫の 組織損傷および好中球が介在する上皮細胞の損傷の原因であると信じられている 。プロテイナーゼとプロテイナーゼインヒビターとのバランスを監視し、操作す る能力の獲得のためには、関係する分子を量定し、単離しそして精製することが 必要である。

食細胞のプロテイナーゼの中で、重要なものはセリン活性部位プロテイナーゼで 、これは一般に「好中球エラスターゼ」と呼ばれている。ヒト好中球エラスター ゼは、２１８アミノ酸を持つグリコジル化された公知配列の蛋白質で、特に好中 球中に豊富であり（全蛋白質の０．５％）、そして単球およびマクロファージ中 にも見出される。エラスターゼは細胞外マトリックス蛋白質、例えばエラスチン 、プロテオグリカン類、フィブロネクチン、タイプｒＨおよびタイプＩｖのコラ ーゲン、およびある種の可溶性蛋白質を開裂させる。エラスターゼは好中球がｉ ｎ　ｖｉｔｒｏで細胞バリヤーを通過して移動するためにも必要とされる。

エラスターゼインヒビターのｉｎ　ｖｉｖｏでの連続作用は、好中球の代謝回転 率（ターンオーバーレート）から明らかであるつ好中球は体の殆どの部位に入り こむ事実にもかかわらず、約５０［のエラスターゼを含む約１０口の好中球の代 謝回転が、未調節組織変性の証拠を持たないヒトにおいて、−日当たり生じる普 通に存在する可溶性血液蛋白質である、Ｇ１−アンチトリプシン（Ｇ１−ＡＴ） は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける即効性エラスターゼインヒビターである。遺伝的 にＧ１−ＡＴレベルの低いヒト（ホモ接合性のＺ−変異）は、調節されないエラ スターゼ作用のために、３０才台または４０才台に肺気腫を発症する傾向がある 。現在ヒトα１−ＡＴが先天性α１−ＡＴ欠損の治療に使用されている。

α１−ＡＴとは異なる分子で、好中球エラスターゼ活性の生理学的レギュレータ ーの要求を満たすいくつかの分子が、何種かの動物の単球および好中球中に見つ かっている。１９７１年に、蛋白性の特性をもつ内因性エラスターゼインヒビタ ーが、ヒト血中白血球およびヒト肺マクロファージの細胞質ゾルフラクション中 に検出されたと報告された（１．　２）。エラスターゼを阻害する細胞質ゾル蛋 白質は、ウマ血液好中球から（３，４Ｌブタ血血中白球から（５）、およびウシ 肺マクロファージから（６）、同定および精製された。培養されたモルモットマ クロファージの細胞外液中のエラスターゼインヒビターは、エラスターゼと共有 結合複合体を形成する能力で同定された（７）。大量のモルモットエラスターゼ インヒビターはマクロファージの溶解物中に見出された（７）。より最近、成熟 ヒト単球および単球様細胞中に、多量の、即効性の内因性エラスターゼインヒビ ター蛋白質が検出された（８）。現在まで、このヒトエラスターゼインヒビター の単離、精製、同定およびクローニングに成功したヒトはいない。

発明の概要 本発明によれば、ヒトエラスターゼインヒビター（ヒトＥｒ）が、単離、精製さ れ、分子レベルで同定されそしてクローニングされる。ヒトＥＩは実質的にグリ コジル化されておらず、エラスターゼと共有結合複合体を形成する能力を有し、 そしてエラスターゼのエラスチン分解活性を阻害する能力を有する。その分子は 、エラスターゼとの相互作用に必須とみられるシスティン残基を有するようであ る。何故ならヒトＥＩをヨードアセトアミドで処理すると、ヒトＥｌがエラスタ ーゼと複合体を形成する能力を阻害するためである。ヒトＥＩは還元剤に対して 安定であり、精製ヒトＥＩは保護されたアミノ末端を有するようである。ヒトＥ Ｉの分子量は約４２，０００である。

ヒトＥＩは部分的に配列決定されておりそして次のセグメントを含む：Ｌｅｕ− ＾ｓｐ−＆５ｎ−ｖａｌ−Ｇｌｙ−１１ｆｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌ ｙ−ＧＩＹ−＾１ａＪａｌ−Ｌｙｓ　；Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−λ５ ｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ：Ｐｈｅ−Ｈｉ　５−Ｐｈｅ−Ａ　５ｎ− Ｔｈｒ−Ｙａｌ　−Ｇ　１ｕ−ＧｌｕＪａｌ−Ｈｉｓ−３ｅｒ　；Ｔｙ　ｒ−Ｇ 　１　ｙ−Ａ　１　ａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ− Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｇ戟@ｕ−Ａｓ　ｐ−Ａ　ｌａ　； Ｙａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ− Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−５ｅｔ−ＭｅｔＪａｌ−Ｉｓｏ−Ｌｅｕ−kｅｕ−Ｐｒｏ； Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ− Ｌｙｓ　；およびＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｙｒ− Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−＾ｓｏ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ。

精製もしくは実質的に精製されたヒトＥｌに加えて、本発明はまた組換え由来ヒ １−Ｅｌ、および誘導体、変異体およびヒトＥｒの部分体も提供する。

好ましくは、単球もしくは単球様細胞からのヒトｃＤＮＡライブラリーを適当な 宿主内で慣用的発現ベクターを用いて発現させて各コロニーがｃＤＮＡライブラ リーの異なる部分を発現するコロニ一群を得る。次いで、このコロニ一群を、前 記蛋白質配列の一つの少なくとも一部分をコードするオリゴヌクレオチドを用い てスクリーニングして、ヒトＥＩのｃＤＮＡもしくはその機能的に均等な誘導体 もしくは部分を含むコロニーを同定する。

次に選択されたコロニーから組換え発現ベクターを単離することができる。この ベクターは、ヒトＥＩ分子の少なくとも一部をコードするＤＮＡ配列を含み、そ して好ましくは、このベクターはセリンプロテイナーゼのインヒビターとして作 用できる分子をコードするＤＮＡ配列の発現を行う能力を有する。一つの態様と して１、コードされた分子はエラスターゼと共有結合複合体を形成することがコ ードされる分子は下記の群から選択されるものである。

（１）ヒトＥ■： （２）ヒトＥＩの変異体、部分または誘導体；む分子： （６）　Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｉａｌ−Ｇｌｙ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ｖａｌ−Ｌｙｓの蛋白■z列 を含む分子： （７）　Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−＾Ｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ− Ａｒｇの蛋白質配列を含む分子：（８）　Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｔ ｈｒ４ａｌ−Ｇｌｕ−ＧｌｕＪａｌ−Ｈｉｓ−３ｅｒの蛋白質配列を含む分子。

（９）　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｖａｌ− 人５ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−Ｈｉｓ−＾１ａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ|Ａｓｐ−Ａｌａ の蛋白質配列を含む分子。

（１０）　Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ −Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｉｓ潤|Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −Ｐｒｏの蛋白質配列を含む分子： （１１）　Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ −Ｇｌｕ−Ｌｙｓの蛋白質配列を含む分子、および ヒトＥＩ、その変異体、誘導体または一部をコードするオリゴヌクレオチドの実 質的に純粋な標品も提供される。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮ Ａセンス配列またはアンチセンス配列であり得、そして天然、合成または組換え オリゴヌクレオチドでありうる。同様に、ヒトＥｒに選択的特異性を有し又はこ れと結合することのできる抗体標品も提供される。

本発明のヒトＥＩ、ヒトＥｌに対する抗体ならびにヒトＥｌおよびその変異体、 誘導体または部分をコードするオリゴヌクレオチドおよびベクターは、単独もし くは他の部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）と−緒に、種々の医学的症状の処置のために および／またはそのような症状の存在および程度を調べる診断の道具として使用 することができる。

図面の簡単な説明 図１は精製の特定の過程におけるヒトＥＴの存在を示すオート・ラジオグラフで ある： 図２はエラスチン溶解がヒトＥＩにより用量依存的に阻害されることを示すグラ フである。

図３はオートラジオグラフであり、ヒトＥＩならびにエラスターゼと複合体を形 成したとトＥＩを示している。

図４は純粋なＥＩのアミノ酸組成を、α１−ＡＴのアミノ酸組成と比較して示し ：そして 図５は単球、好中球およびＵ９３７細胞中にヒ１−Ｅｌが存在することを示すオ ートラジオグラフである。

図面の簡単な説明 ヒトＥＩは、即効性で細胞関与性の、ともに活性部位にセリンをもつ蛋白質エラ スターゼであるブタ膵臓エラスターゼおよびヒト好中球エラスターゼ（以下単に エラスターゼという）の実質的に不可逆的なインヒビターである。ヒトＥＩは好 中球、単球およびマクロファージ中に高レベルで存在する。ヒトＥＩはエラスタ ーゼと定量的に反応して１，１−エラスターゼ複合体を形成し、エラスターゼの エラスチン溶解活性を阻害する。この複合体は沸騰ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナト リウム）中で安定であり、ＥＩとエラスターゼとの間の共有結合を示唆する。

機能面からの定義に基づき、ヒトＥｌはセルビン（Ｓｅｒｐｉｎ）Ｗのセリンプ ロテイナーゼインヒビターに分類される。ヒトＥｌは、セリン活性部位試薬であ るＤＦＰ　（ジイソプロピル　フルオロホスフェート）により不活性化されたエ ラスターゼとは反応しない。この共有結合複合体は沸騰ＳＤＳ中で安定でありそ して塩基を触媒とする開裂に感受性である。これらの作用メカニズムはセルピン 類のセリンプロテイナーゼインヒビターの特徴である。しかしながら、ヒトＥｌ は他のセリンプロテイナーゼインヒビターとは異なり、ヒトＥＩをヨードアセト アミドで処理するとエラスターゼと複合体を形成する能力を消失し、このことは システィン残基が必須であることを示唆する。

ヒトＥＩは分子量約４２．０００の一本鎖ポリペプチドである。組成の分析によ れば、約３６０アミノ酸残基の分子量たり５個のシスティン残基の存在が示唆さ れる。気液クロマトグラフィーで検出される炭水化物のレベルは無視できる程度 であり、そしてヒトＥＩがグリコシダーゼＰＮＧａｓｅ　Ｆ’（ペプチド：Ｎ− グリコシダーゼ　Ｆ）処理に不感受性であることは、ヒトＥＩが非グリコジル化 物であるかまたは実質的にグリコジル化されていない（おそらく１または２個の 糖残基しかない）ことを示唆している。精製ヒトＥＩのアミン末端は保護されて いるようである。

純粋なヒトＥ′Ｌを部分的に配列決定すると次の配列を含んでいた・Ｌｅｕ−Ｇ ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−５ｅｒ　；Ｐｈｅ− λ１ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ−λ５ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　 ；Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ −Ｌｙｓ　；およびＰｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｔｙｒ −Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−λｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ。

ヒトＥｌの精製 ヒトＥｌの精製には一連の工程を含む。ヒトＥＩの存在は各工程において採取し たサンプルが１２５　丁−エラスターゼと共有結合複合体を形成することにより 確認した（７．　８）。この確認方法の詳細は前記文献に記載されており、その 内容は本発明に含まれるものとする。概略すれば、ヒトＥｌを含むと思われるフ ラクションを３７℃１０分間３３０−２００ｎの＋！５ｉ　ｇ識ブタ膵臓エラス ターゼ（エラスチン製品、Ｐａｃ　ｉ　ｆ　ｉ　ｃ、　ＭＯ）とともにインキュ ベートした。共有結合Ｅｌ−エラスターゼ複合体の検出は、フェアバンクス／レ ムリ（Ｆａｉｒｂａｎｋｓ／Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）ゲルシステムを用いたＳＤＳポ リアクリルアミドスラブゲル−電気泳動の後、オートラジオグラフィーにより行 った。このシステムは比較的低いｐＨおよび低濃度の一級アミンを用いて電気泳 動の間の複合体の加水分解を最小限にしている（８）。

細胞溶解物の取得 ヒトＥＩの供給源として、Ｕ９３７細胞を用いた。Ｕ９３７細胞はヒト細網肉腫 細胞である（９）。使用した特定のＵ９３７細胞は、最初に特性決定されたＵ９ ３７よりも分化の段階が若干進んだサプラインであると思われる（９）。使用さ れたこの細胞ラインを以下に０９３７−Ｅｌという。この細胞ラインはＡＴＣＣ ，ロックビル、メリーランドに、寄託番号ＣＲＬ１００２６で寄託されているＵ ９３７−ＥＩｍ胞を、４．　５ｍｇ、／＋１のグルコース、１０％ＦＣＳおよび １ｍ１当たり５０μｇのゲンタマイシンを含む、ＲＰＭ１１６４０培地またはダ ルベツコの修飾イーグル培地中で生育させた。マサチュセツツ　インステイテユ ートオブ　テクノロジー　セル　カルチャー　センターで増殖させた１２リツト ルの培養液（約１．８Ｘ１０”細胞）からのＵ９３７−Ｅ　Ｉ細胞を、４℃でＣ ａ”／Ｍｇ”含有ＰＢＳ中で、沈澱させて２回洗浄した。２Ｘ１０”の細胞をＨ ＢＳＳ（ハンクス　バランスド　ソルト　ソリューション）中で約２２℃にて１ ５分間インキュベートして、吸着しているＣ１−ＡＴを除去した（８）。細胞を ４℃とし、沈澱させた。溶解物（針当たり２．５Ｘ１０’細胞）は、細胞を０． ５％ＮＰ−４０を含むＰＢＳで約２２℃にて４分間そして４℃にて１０分間抽出 し、そして：５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ３４ａ−ター（Ｄｕｐｏｎｔ社、ウイルミン トン。

プラウエアー）で４℃において１８，０００ｒｐｍ　３０分遠心分離して澄明化 することにより調製した（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０）は、米国、 ＮＹ、カール　プレースのＧａ１ｌａｒｄ　Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒから市販さ れている非イオン性界面活性剤である。この界面活性剤の材料は、エチレンオキ シド９モルを含むオクチル　フェノール　エチレンオキシド縮合物である。これ は英国、プールのＢＤＨ社の（転）品であり、ＢＤＨ社はこれを英国の５ｈｅｌ ｌ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社から購入している）。

ＤＮＡ５ｅ−セファロースによるアクチンの分離予備精製実験において、ＥＩ活 性はアクチン（１０）含有沈澱の形成と同時に消失した。この消失を避けるため に細胞溶解物を直ちにＤＮＡ５ｅ−セファロースでクロマトグラフィーし、アク チンを特異的に吸着させた。

ＤＮＡ５ｅ−セファロースアフィニティー樹脂は次のようにして調製した：デオ キシリボヌクレアーゼエ（ウシ膵ＩＩ；１８００クニブツ単位／■蛋白質：Ｓｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、セントルイス、ＭＯ）を、２」ジイソプロピルフ ルオロホスフェート（ＤＦＰ）とＰＢＳ中で２２℃において３０分間処理し、３ ｅｇ／ｍｌの割合で、Ｏ，ＬＭ　ＮａＨＣＯｓ　、ｐＨ［８，５中で４℃１８時 間混合して、活性化セファロースに結合させた（結合効率は９０％以上であった ）。活性化セファロースは、ファルマシア　ファイン　ケミカル（現在ファルマ シア　ＬＫＢ　バイオテクノロジー社、ビス力タウニイ、ニューシャーシー）か ら活性化凍結乾燥粉末として販売されている活性化セファロース４Ｂを、発売元 の指示にしたがってカップリングのために再生して調製（即ち、１ｍｊ［ＨＣｌ で再生し、１ｍｊ［ＨｃＬで２２°Ｃにおいて１５分間洗浄し、カップリング用 バブファーで洗浄した）したもの、又はカップリングの直前に、ＣＮＢｒ（セフ ァロース１００ｍ１半たり２．３ｇ）によりｐＨ１１において２２℃付近で１０ 分間処理することにより活性化したセファロース６Ｂ（Ｐ、カトレカサス、　「 アフィニティークロマトグラフィーによる蛋白質の精製：アガロースおよびポリ アクリルアミドビーズの誘導体（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃｔｉｏｎ　ｂ ｙ　ＡｆｆｉｎｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｓ　ｏｆ　Ａｇａｒ。

ｓｅ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｂｅａｄｓ）Ｊ、１．Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、、１９７０．２４５：３５０９−３０６５）のいずれかである。こ の樹脂を２２℃において１０ｄトリス塩酸バブフアー、ｐｔ［８，０で２時間− 回、１００ｄ酢酸ナトリウムバγフアー、　ｐＨ１４，０で三回処理してさらに １００ｍｊｌＮａＨＣＯｘ　、ｐＨ，５で処理し、ＰＢＳで一回、そしてＰＢＳ に溶解した２ＩＩＭＤＦＰで３０分間−回処理した。この樹脂を０．０２％ナト リウムアジドを含むＰＢＳ中に４℃で保存し、使用直前にＰＢＳで平衡化した。

細胞溶解物（−７２０＠ｌ）を、１８０ｍ１のＤＮＡ５ｅ−セファロースと共に ローラーボトル中で４℃において３０分間インキュベートした。混合物を６．　 ５ｃｍの直径のカラムに移し、そして非付着フラクションを、ＰＢＳに溶かした ０、５フラクシヨン中のヒトＥｌの存在は上記のようにして測定した。図１に示 すように、非付着フラクション中の蛋白質はエラスターゼと一緒にすると、見掛 は分子１６６．０００の”’Ｉ−エラスターゼーニラスターゼインヒビター複合 体を形成した。

チオプロピル−セファロース−６Ｂによる分離チオプロピル−セファロース−６ Ｂは、ファルマシア　ファイン　ケミカルズ社から市販されている混合ジスルフ ィドアフィニティー樹脂である。これは膨潤ゲル１針当たり約２０μモルの２− チオピリジル残基をヒドロキシプロピル残基との混合ジスルフィド結合の形で含 み：該ヒドロモジプロピル残基はセファロース６Ｂマトリｌクスにエーテル結合 を介して結合している。チオプロピル−セファロース−６Ｂは、Ｒ，Ａｘｅｎ、 Ｄｒｅｖｉｎ、Ｈ，およびＣａｒｌｓｓｏｎ。

Ｊ、により、［チオール基を含む修飾アガロースゲルの調製（Ｐｒｅｐａｒａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌｓ　ｃｏｎｔａｉｎ ｉｎｇ　ｔｈｉｏｌ　ｇｒｏｕｐｓ）Ｊ、Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ、Ｂ 、１９７５．２９．４７１−４７４に記載された方法により合成される。ヒトＥ ■はチオプロピル−セファロース−６Ｂに付着するが、大多数の蛋白質は付着し ない。チオプロピル−セファロース−６Ｂを、０．５％ＮＰ−４０，１０−）リ ス塩酸バッフｙ　−、ｐＨ１７，４，１５０ｍ１　ＮａＣ１，１ａｄ［ＥＤＴＡ 　（ＮＰ−４０／トリス／１５０−ＮａＣｌ／ＥＤＴＡ）で、２２℃において３ ０分間平衡化した。次に、ＤＮＡ５ｅ−非付着フラクション（〜９００ｍ１）を 時々撹拌しながら、２２℃において３０ｍ１のチオプロピル−セファロース−６ Ｂとインキュベートした。混合物を３ｃｍのカラムに移し、そして連続的に、１ カラム量のＮＰ−４０／トリス／１５０−ＮａＣ１／ＥＤＴＡ、ＮＰ−４０／） −リス１５００−ＮａＣ１、トリス１５００−ＮａＣＬおよびトリス／１５０− ＮａＣ１で洗浄した。カラムを５０ｍＭメルカプトエタノールを含むトリス／１ ５０−ＮａＣ１で溶出し、７０ｍ１の「チオール溶出」フラクションを一つ得た 。ヒトＥｌの存在は、この場合も前記のようにして確認した。図１に示すように 、チオール溶出フラクション中の蛋白質は、エラスターゼと混ぜると１２５１− エラスターゼ−エラスターゼインヒビター複合体を形成する。

フェニル−セファロース−ＣＬ４Ｂによる分離゛　セファロースはファルマシア 　ファイン　ケミカルズ社により製造されている粒状アガロースゲルビーズの登 録商標である。セファロース６Ｂ、〜６％アガロース、４０−２１０ミクロンの 粒子からなる：セファロース４Ｂ、ル４％アガロース、〜４０−１９０ミクロン の粒子からなる。セファロースを製造するために用られるアガロースは、選ばれ た寒天から製造される（Ｈｊｅｒｔｅｎ、Ｓ、。

「ゲル電気泳動のためのアガロース製造の新たな方法（Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅ　ｔｈ 。

ｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇａｒｏｓｅ　ｆｏｒ　Ｇｅ１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ： ：ａ、１９６２．６２−４４５−４４９；および「イムノロシーおよびイムノケ ミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒＹ ）、Ｍ、Ｗ、ＣｈａｓｅおよびＣ，−Ａ、　Ｗｉ　１１　ｉ　ａｍｓＷ！、アカ デミツクブレス社、ニューヨーク、１９６８．１４９−１５４頁中のＳ、Ｈｊｅ ｒｔｅｎ、　「アガロース粒子によるクロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ ｒａｐｈｙｏｎ　ａｇａｒｏｓｅ　５ｐｈｅｒｅｓ）Ｊ）。

フェニル−セファロース−ＣＬ４ＢはセファロースＣＬ−４Ｂの誘導体であり、 後者はアガロースを２．３−ジブロモプロパノールと架橋させ（英国特許　ｆ３ ５２　６１３および他国での相半する特許）そして得られたゲルを還元条件下で アルカリ加水分解して脱すルフヱートする（Ｊ、Ｐｏｒａｔｈ、Ｊａｎｓ。

ｎ、Ｊ−Ｃ，Ｌａａｓ、　Ｔ、　、ｒクロマトグラフィー、電気泳動およびゲル 固定酵素のための寒天誘導体　■８粒状ビーズ形の脱サルフェートおよび還元架 橋寒天および７ガｏ−ス（Ａｇａｒ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｆｏｒ　ｃｈｒ ａｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｇｅｌ −ｂｏｕｎｄ　ｅｎｚｙｍｅｓ、　１．Ｄｅｓｕｌｐｈａｔｅｄ　ａｎｄ　ｒｅ ｄｕｃｅｄ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ａｇａｒ　ａｎｄ　ａｇａｒｏｓｅ　１ ｎｓｐｈｅｒｉｃａｌ　ｂｅａｄ　ｆｏｒｍ）Ｊ、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ。

、１９７Ｌ　６０：１６７−１７７）ことにより、調製される。フェニル基はセ ファロースＣＬ−４Ｂとグリシジルエーテルとの反応により導入され（Ｓ、Ｈｊ ｅｒｔｅｎ、Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎ、Ｊ、、およびＰａｈｌｍａｎ、Ｓ、、ｒハイ ドロフォービック　ィンタラクション　クロマトグラフィー、ある種のアガロ− １ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ｔｈｅ　５ｙｎｔ ｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ａｌｋｙｌ　ａｎｄａ ｒｙｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　ａｇＡｒｏｓｅ）Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ ｏｇｒ、、１０１，２８１−２８８））、フェニル基がアガロースのマトリック スのモノサブカライド単位にエーテル結合で結合した誘導体が得られる。結合さ れたフェノールのリガンドの濃度は、膨潤ゲル１ｍｌ百たり約４０μモルである チオール溶出分のＥｔ活性フラクションは、１０ｍＭトリス塩酸バッファー、ｐ Ｈ７、４，１５０ｍｆ　ＮａＣ１，１ｍｊ！メル刀ブｒエタノール（トノス、二 ５Ｏ−Ｎａｃｌ／ＭＥ）で平衡化されたフェニル−セフ７０−スーＣＬ４Ｂ　（ ７０ｍｌ；ファルマシア）の３．　５ｃａカラムに約２２℃で導入した。フェニ ル−セファロース−ＣＬ４Ｅは、疎水性の相違に基づいて蛋白質を分離する。非 吸看フラクションを、トリス／　１５０−Ｎ　ａ　Ｃｌ　／ＭＥでの約２０ｍ１ の洗？！ｐ液と一緒に、回収した。

非吸看７ラクシヨン中のヒトＥＩの存在は上記のようにして［認した（図１）。

マドレックス　ケル　レッドＡによる分離マドレックス　ゲル　レッドＡは、マ サチュセッッ州レキシントンのアミコン社から市販されている、「基選択性」ア フィニティー樹脂である。これは架橋した５％アガロースと、膨潤ゲル１針当た り３−５ｍｇの共有結合で結合した色素からなる。この色素はレッドＡ（ｒｅｄ 　Ａ）、反応性レッド１２０　（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｒｅｄ　１２０）およびプ ロシオンレブドＨＥ３Ｂ　（ＰｒｏｃｉｏｎＲｅｄ　ＨＥ３Ｂ）　（ＩＣＩ社の 登録商標）として知られている（Ｂａｉｒｄ。

Ｊ、、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ、Ｒ，、Ｃａｒｒ、Ｒ，およびＡｔｋｉｎｓｏｎ、Ａ。

、　「プロジオン色素−多糖体マトリックスからの基買溶出クロマトグラフィー による酵素の精製（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｙ　５ｕｂｓ ｔｒａｔｅ　Ｅｌｕｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｆｒｏｍ　Ｐｒ 。

ｃｉｏｎ　Ｄｙｅ−Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　Ｍａｔｒｉｃｅｓ）、ＦＥ ＢＳ　Ｌｅｔｔ、、７０：６１）Ｊ）。

フェニル−非吸看フラクション（約１１０ｍ１）を０．　５倍量のトリス／ＭＥ で希釈して、４℃において、トリス／１００−ＮａＣ１／ＭＥで平衡化した直径 ２−備のカラムの２０ｍ１マドレツクス　ゲル　レッド　Ａに導入した。マドレ ックスゲル　レッド　Ａは、レッド　へ色素への結合能力に基づいて蛋白質を分 離する。非吸着フラクションを１カラム量の洗浄液トリス／１００−ＮａＣ１／ ＭＥと一緒に集め、ヒトＥＩの存在を調べ（図１）、トリス１５０−ＮａＣｌ／ ＭＥに対して４℃で３時間透析して、−７０℃に保存した。

ＨＰＬＣＤＥＡＥ−５ＰＷによる分離 ＤＥＡＥ−５ＰＷは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用の弱アニオン 交換樹脂であり、荷電特性の僅かな差に基づいて蛋白質を分離する。ＤＥＡＥ− ５ＰＷは親水性の剛性樹脂にシエチルアミノニチル（ＤＥＡＥ）基を導入して製 造され：マサチュセγツ州、ミル７オードＯ’Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅ肚のＷ ａｔｅｒｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎの製品であり、そしてＰｒｏｔｅｉｎ−ｐａｋ　 ＤＥＡＥ−５ＰＷの名前でも知られている（Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐａｋはＷａｔｅ ｒｓの種々の樹脂の製品名である）。１ｍｌの樹脂当たりの有効ＤＥＡＥ基は０ ．１マイクロモルである。ＤＥＡＥ−５ＦＷは１０ミクロンの粒状ジエチルアミ ンエチル官能性ポリメタクリル樹脂で、１０００オングストロームの細孔を有す る。この樹脂は７．５Ｘ７５Ｍの３１６ステンレススチールカラムに収容されて いる。

透析したレッド　八−非吸着フラクションの５０ｍ１分のいくつかを、０．２μ 厘のナイロン膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅ１１．Ｋｅｅｎｅ 、ＮＨ）で濾過し、そして０．　８ｍｌ／分の速度で、２２℃でトリス１５０− ＮａＣ１／ＭＥで平衡化したＤＥＡＥ−５ＦＷカラムに導入した。このカラムを 平衡化バッファーで洗浄した。ヒトＥＩを溶出するため、トリス／８５−ＮａＣ １／ＭＥを流し、そして２８０ｎ＋１に吸収をもつフラクションを集めて前記の ようにしてヒトＥＩの存在をアッセイした。

Ｅｌをｉｌ！縮するために、３〜４０のＤＥＡＥ分画操作からの活性フラクショ ンをまとめ、トリス／ＭＥで希釈し、そしてトリス１５０−ＮａＣｌ／ＭＥ中の ＤＥＡＥ−５ＦＷカラムに再度導入した。ＥＩを含有する工ないし２．　５ｉ１ の単一のフラクションをトリス／１４０−ＮａＣ１／ＭＥで溶出した。ヒトＥｌ の存在を前記のようにして確認した。このフラクションは全染色した５ＤＳｉｌ 気泳動ゲルから、８５−９５％純度のヒトＥｌであり、そして活性且つ濃厚（例 えば０゜−４ｍｇ／ａ＋１）であるため、このヒトＥｌ標品は活性の研究および 機能の研究に好ましい。

ＨＰＬＣ−ゲル濾過クロマトグラフィーある棚の用途のために、ＨＰＬＣゲル濾 過樹脂であるＰｒｏ　ｔｅ　１ｎ−Ｐａｋｆ−１２５を用いたＨＰＬＣゲル濾過 クロマトグラフィーにより、残存夾雑成分を除去した。Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ 　ｌ−１２５はＷａｔｅｒｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎの製品であり、１００オングス トロームの孔径をもつ１０ミクロンのジオール結合シリカゲルである。これは蛋 白質に対して非吸着性でそのためにゲル濾通りロマトグラフィーに適する類本性 材料を得るために、ジヒドロ牛ジアルキルシランと共有結合させた不ＭＨＵシｒ １力粒子からなる。こｎは３１６ステンレススチール製の７．８Ｘ３０ｍｍのカ ラムに収容されて市販さｎている。

ＤＥＡＥ−５ＰＷからの濃縮ヒトＥ［プール（２００−１０００μＬ　）（７） 一部を、１１０１ｎトリス塩酸バッフｙ−１ｐＨ７，４，９０ｍｊ［ＮａＣｌで 平衡化した合計で７．８Ｘ６００ｍｍの直列の二つのＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ　 ｌ−１２５カラムにより、１．　０１ｌＩｌ／分でゲル濾過した。２１４卯に吸 収を示す（二つのピーク）フラクションを集め、メルカプトエタノールを１−に 添加した後で、上記のようにしてヒトＥＩの量をアッセイした。プールした活性 ピーク（第二ビーク）が純粋もしくは実買的に純粋なヒトＥｌである。別法とじ て、５０ＩＩＬＩｌ［ＮＨ＜　ＨＣＯ３をバッファーとして用いてＨＰＬＣゲル 濾過を行い、そしてヒトＥｆを含むプールフラクシランから凍結乾燥によりバッ ファーを除去した。

精製からのフラクションを文献（８）に記載のレムリの５ＤＳｉｌ気泳動で分析 した。ポリペプチドを、ＰＶＤＦ膜（ポリビニリデン　ジフルオリド；０．４５ μ組ミリポア社、ベブドフｔ−ド、ＭＡ）に、４２−トリス／１９Ｍグリシンバ フファー、　ｐｆｒ８．　３を用いて〜２２℃で１８時間転写しく定電圧７０ミ リアンペア；１６０ｙ／１．６Ａｉｆｌ源；Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ。

リッチモンド、ＣＡ）（転写装置はＴｒａｎｓｆｅｒ　Ｃｅ１ｌ；Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、サンフランシスコ、ＣＡを用いた）、その後金染色した 。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳに溶解した０、１％ツイーン−２０（ツイーン　２０はｒ ｃｒ　Ａｍｅｒｉｃａｓの持つポリエトキシエタノール　ンルビタンの登録商標 であり；この製品は、イリノイ州ロブクフォードのＰｉｅｒｃｅ社からＳｕｒｆ ａｃｔ−Ａｍｐ　２０の部品名で、窒素置換ガラスアンプル中に充填された１０ ％水溶液として市販されている）で７回（２Ｘ　１５分：５×５分）、そして水 で２回洗浄し、そして０．　２−０．　３１１１１／Ｃａ１ｚのＡｕｒｏＤｙｅ 蛋白質染色剤（Ｉａｎｓｓｅｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ、ビス力タウエイ 、ＮＪ）と共に、〜２２℃において４時間以上インキュベートした。ＡｕｒｏＤ ｙｅは、ｐｆ［を約３に調整した安定化コロイド性金ゾル（２０ｎ＋＊）であり 、蛋白質を暗赤色に染めるＥｌの分子量の測定 ヒトＥｌの見掛は分子量は、ＳＤＳ電忽電動泳動ゲル１）での移動度を既に記載 された分子量か既知の純粋蛋白質の移動度（８）と比較して、４２．０００と決 定された：蛋白質の検出は電気泳動転写物の金染色により行った。

エラスチン溶解の阻害 ヒトＥＩのエラスチン溶解阻害活性は、エラスチン含有寒天ゲルの溶解ゾーンの 形成により（１２）アッセイした。挺略をのべると、種々の量のヒトＥＩ（プー ルした濃厚ＤＥＡＥフラクシ！ン）を、７５ｎｇまたは１５０ｎｇの膵臓エラス ターゼと一緒に５分間約２２℃で混合し、そしてフルオレツセインーエラスチン ー寒天プレートのウェル中で３７℃において４８時間インキュベートした。溶解 リング（２回の測定の平均）の直径として測定したエラスチン溶解の程度を、並 行して作成した標準カーブと比較して単位に換算した（１単位はエラスターゼＬ ｏｇの活性に相当する）。試験はエラスターゼ７５ｎｇ（四角）およびエラスタ ーゼ１５０ｎｇ（丸）を用いて行った。ヒトＥｌはエラスターゼによるエラスチ ン溶解を用量依存的に阻害し、したがってヒトＥｆがエラスターゼを阻害するこ とを示した（図２）。

分子量４２．０００のポリペプチドがエラスターゼインヒビターであることを証 明するため、ＤＥＡＥ−精製フラクションを未標識エラスターゼとインキュベー トシ、銀染色（１３）ＳＤＳ−電気泳動ゲルで検査した。ＳＤＳは三つのレーン を含んだ、即ち一つはＥｌ、一つはエラスターゼ、そして一つはＥＩとエラスタ ーゼとの混合物である。同時インキュベートを１分間行うと、この分子量４２． ０００のポリペプチドとエラスターゼとは、分子量６６．０００のエラスターゼ −エラスターゼインヒビター複合体の形成と同時に消失した（図３）。この知見 は、分子１４２．０００のポリペプチドがエラスターゼインヒビターであるこ゛ とを示している。この知見はまた、精製分子の多くが複合体形成活性を保持しモ してＭＨ分子とエラスターゼとの反応が迅速である（１分間で完了する）ことも 示している。反応体と複合体のそれぞれの分子量から、反応は１：１の化学量論 反応であることが明確に示唆される。

アミノ酸組成 凍結乾燥した純粋ヒトＥＩの一部を、６Ｎ塩酸中で１１０℃において２４時間加 水分解し、Ｄｉｏｎｅｘ　Ｄ−５００分析装置でアミノ酸組成を決定した。Ｃｙ ｓ／２（システィンと１／２シスチン）の量は、過蟻酸酸化（１４）のあとでシ スティン酸としで測定した。サンプルのアミノ酸組成は、２００種の純粋蛋白質 のアミノ酸組成の平均および血漿中に見られる既知のエラスターゼインヒビター であるα１−ＡＴのアミノ酸組成と一緒に、図４に示す。

炭水化物組成 純粋ヒトＥＩの炭水化物含量は、凍結乾燥サンプルをベル（トリメチルシリル） 誘導体に変換した後（１５）、気液クロマトグラフィーによるメタツリシス（ｍ ｅ　ｔｈａｎｏ　ｔｙｓ　ｉ　ｓ）で行った。Ｅｌの分子量たりキシロース３． ６残基（夾雑物と考えられる）およびマンノース０．　５残基（二つの調製品の 平均）が検出された。

ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよび シアル酸は検出されなかった。さらに純粋ヒトＥＩをグルコシダーゼＰＮＧａｓ ｅＦで処理した：この酵素は全ての種類のＮ−結合炭水化物単位を開裂する（１ ６）、１４０−４２００＋ｉＵ／ｍｌのＰＮＧａｓｅ　Ｆによる処理で、ＥＩ（ ７）見掛は分子量に変化は見られなかった。このことは純粋ヒトＥＩが非−グリ コモル化蛋白質であるか、または実買的にグリコジル化されていないことを示唆 している。

アミノ駿配列決定 純粋ヒトＥＩのアミノ末端配列をめる試みを２回行ったが、相当する配列が得ら れず、このことからアミノ末端がブロックされていることが示唆された。そこで 、アミン末端配列を決定するために蛋白質の開裂を行った。ヒトＥＩの二つの標 品、それぞれ４０μｇおよび７６μｇを調べ、そのための開裂法にはプロテイナ ーゼのトリプシン処理を選択した。ヒトＥｌはトリプシンを阻害する可能性−が あるため、熱処理（８５−９０℃、８分間）してその阻害活性を破壊した。熱処 理した蛋白質を、０．００３容のトリプシンとともにｐＨ８，０において、３７ ℃で１８時間インキュベートした、この条件は小スケールでの予備実験で定めら れた。トリプシン処理物の少量を５ＤＳ−１１気泳動および金染色で分析して、 ヒトＥＩの分解が完全であることを確認した。

得られたトリプシン分解ペプチドをＣＵ逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーで、０ 、　１％トリプルオロ酢酸水溶液中の２−７５％アセトニトリルの勾配を用いて 分画した。ＣＵカラムは、カリフォルニア州、ヘスペリアのＶｙｄａｃ　Ｄｉｙ ｉｓｉｏｎ、Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａむ１ｏｎｓ　ＧｒＯｕｐｓから市販され、０ ．４６Ｘ２５ｃ＋１１のステンレススチール製カラムに充填された５ミクロンの 粒子サイズの固定相（ｂｏｎｄｅｄ　ｐｈａｓｅ）を持つ３００オングストロー ムの孔径のシリカであり、蛋白質およびペプチドの逆相ＨＰＬＣクロマトグラフ ィー用の製品である。分離されたペプチドのピークを含むフラクションを、２１ ４ｎｍでの吸収に基づいて集め、溶媒を凍結乾燥で除去した。ペプチドのピーク を、オンラインでフェニルチオヒダントインＨＰＬＣ分析装５！（ＡＢＩ　１２ ＯＡ　０ｎ−１ｉｎｅ　ＰＴＨａｎａｌｙｚｅｒ）を備えた気相蛋白質配列決定 装置（ＡＢｆ　４７０Ａ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスタ ーシティ−、ＣＡ）により、アミノ末端アミノ酸配の分析に付した。

ジスルフィド結合の存在 ２００ｉのメルカプトエタノールは、純粋ヒトＥＩがエラスターゼと複合体を形 成する能力に阻害的影響を及ぼさなかった。したがって、ＥＩはジスルフィド結 合を持たないようであり、少なくとも活性に必須のジスルフィド結合は含まない 。

必須のシスティン残基 純粋ヒトＥｌにスルフヒドリル　ヨードアセタミド（３ｄ）を添加すると、エラ スターゼとの共有結合複合体形成能力がほぼ完全に消失する。未反応のヨードア セトアミドをメルカプトエタノールの添加により破壊するか、または透析で除去 しても純粋ヒトＥｌの活性は再生されない。したがってＥｌは共有結合によるエ ラスターゼ−ＥＩ複合体の形成に必須のシスティン残基を有するものと思われヒ トＥＩは、１５■−エラスターゼ複合体アッセイを用いて、培養中の成熟ヒト単 球の溶解物中および単球用細胞ラインＵ９３７−Ｅｌ中に検出されたが、しかし 単離されたばかりのヒト単球または好中球中には検出できなかった。これらの後 者の細胞を、活性部位試薬であるジイソプロピル　フルオロホスフェート（ＤＦ Ｐ）とインキュベートし、モしてＤＦＰの存在下で溶解し、そして過剰のＤＦＰ を透析により溶解物から除去すると、ヒトＥｒ活性は新鮮単球並びに好中球中に 容易に検圧された（図５）。ヒトＥｒ活性はまた、儒康な非喫煙志願者の肺洗浄 により得られた肺マクロファージの溶解物中にも検出された。

ヒトＥｒのクローニング Ｕ９３７−Ｅｒ細胞から全ｍＲＮＡを単離し、慣用の方法によりｃＤＮＡへ逆転 写した。次に各ｃＤＮＡ分子をベクター例えばファージλｇｔｌｌに挿入し、ｃ ＤＮＡライブラリーを得た。別法として、例えばλｇｔｌｌのようなベクター中 のヒト単球または単球様ｃＤＮＡライブラリーを市販品として人手することも可 能である。

ｃ　Ｄ　Ｎ−Ａライブラリーをｊ　ＣｃＩ　ｉ中で発現させ、各々が一つの感染 微生物由来の〜１０５のＥ、ｃｏＬｉコロニーに生育させる。このコロニーを次 に目的の単球ｃＤＮＡを含むλｇｉｌｌファージを含むコロニーを突き止めるた めにスクリーニングする。Ｅ−ｃｏｌｉコロニーをスクリーニングするための検 出プローブは、ヒトＥｌの一部をコードするオリゴヌクレオチドまたはヒトＥｌ の単数もしくは複数の抗体であってよい。適当なオリゴヌクレオチドプローブは 、合成法で、慣用技術により、前記ヒトＥ■の配列データに基づいて調製できる 。適当なスクリーニング用抗体は、免疫原として精製ヒトＥＩを用いて、慣用の 免疫技術を用いて調製可能である。別法として、ＥＩペプチドの配列を用いて慣 用方法でペプチドを合成し、これを免疫原として抗−ヒトＥＩ抗体を製造するこ ともできる。目的のコロニーを突き止めて、該コロニーの発現ベクターからのｃ ＤＮＡを単離し、そしてこのヒトＥＩのｃＤＮＡに対するゲノム相補部分を単離 するが、これらは全て慣用の技術で行うことができる。

当業者にとって、前記好ましい態様に多くの均等物があることが理解されよう。

例えば、本発明は他のものと一緒に、ヒトＥｌのｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーおよ び該ｃＤＮＡの発現を提供するか、該ｃＤＮＡおよび発現産物の多くの修飾が本 発明の範囲である。例えば、発現蛋白質がエラスターゼもしくは他のセリンプロ テイナーゼのインヒビターとして作用する能力を保持したままで、ヒトＥＩをコ ードするｃＤＮＡ配列を一つ以上の塩基対部位で変化させ、または該ｃＤＮＡの 一部を欠失させることが可能であろう。したがって、発現蛋白貫はアミノ酸宣換 もしくは欠失を含み、且つ天然ヒトＥＩの機能的均等物であるものを含みつる。

したがって、遺伝子工学的に操作したヒトＥｒは、天然に存在するヒトＥｌおよ びその変異体、誘導体または部分であって、エラスターゼと複合体を形成しおよ び／またはエラスターゼの活性を阻害する能力を保持しているものを包含する。

この点に関して当業者は、分子はエラスターゼとの共有結合複合体を形成するこ となくエラスターゼの活性を阻害できることを理解するであろう。即ち、非常に 小さいヒトＥＩの部分、好ましくはヒトＥＩのエラスターゼ結合部位の配列を持 つ部分が、エラスターゼに結合して阻害するのに十分なアフィニティーを有する が、しかしエラスターゼとの共有結合複合体を形成しない可能性がある。そのよ うな小部分またはその誘導体は本発明の範囲内である。これらの部分または誘導 体は、慣用のペプチド合成また；ま組換え技術で製造できろ。

本発明はまたセリ〉ブコテイナーセの活性部位と反応できる成分（ｍｏｉｅｔｉ ｅｓ）と結合したヒ１−ＥＩの部分及び変異体も含む。この場合には、該部分ま たは変異体はセリンブーテイナーセを２臓し、そして該活性成分をセリンの活性 部位との阻害相互作用のために体内に輸送する。

ヒトＥＩの部分はまた、ヒトＥｌのインヒビターとしても使用できるであろう。

例えば、エラスターでと相互作用するがエラスターゼの活性に干渉しないヒトＥ １部分は、ヒトＥ１−エラスターゼ複合体か形成するのを防止してｉｎ　ｖｉｖ ＯにおいてヒトＥＩの阻害作用をブロツクするために使用できるであろう。した かって、当業者には本発明の生成物が、エラスターゼと共有結合複合体を形成す る能力のないヒトＥ［の部分並びにそのような部分をコードするオリゴヌクレオ チドを含むことが理解されよう。

当業者にとって、天然存在ヒ１−Ｅｌには多くの関連するが若干異なる形態があ ることも理解されよう。したかって、天然に存在するヒトＥｌをコードする一つ 以上のｍＲＮＡ配列および一つ以上のｃＤＮＡ配列が存在することもまた、理解 されよう。しかしながら、そのようなりＮＡ配列の各々は上記の方法で単離しそ して、そのようなｃＤＮＡ配列の各々を含む発現ベクターにより冬型のヒトＥＩ がえられるであろう。同様に、各ヒトＥｌの形に対応するゲノムＤＮＡを慣用の 方法で１１離することも可能であろう。

天然に存在するヒトＥＩおよびその変異体、誘導体および部分を薬学的に有効な 量で、医学症状の治療に用いることが可能であろう。一般に、これらをこれらと 反応するエラスターゼや他のプロテイナーゼによる破壊作用を含む症状（炎症の 結果としての組織破壊を含む）の治療に使用することができる。具体的応用例に は、肺内の炎症の結果としての気管支拡張屈、慢性のグラニュラトマス病（ｇｒ ａｎｕｌａｔｏｍｏｕｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）およびＬＡＤ　（白血球の粘着性の 不足）、嚢胞性繊維症、膵臓炎、悪性腫瘍、血栓による損傷血管、水庖性の皮膚 病、再潅流障害（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　１ｎｊｕｒｙ）、潰瘍性の結腸炎が 含まれる。他の応用例に：よ、ヒトＥＩレベルか異常である場合、ヒトＥｆと反 応性のエラスターゼあるいは他のプロテイナーゼが過剰である場合、または食細 胞の蓄積が過剰である場合の全ての症状が含まれる。

天然に不在するヒトＥｌおよびその変異体、誘導体および部分は、先天的または 後天的欠損症の診断並びに病気状態の診断に有用な、ヒｈＥＩの存在もしくは不 存在または量を検出するための抗体を製造するためにも使用できる。例えば、ヒ トＥｌに対する抗体は、結核およびハシセン病のような感染症状態における食細 胞応答のレベルの評価に使用できるであろう。同様にそのような抗体を用いて、 リウマチ病（例えば関節リウマチ）、免疫病（例えば天庖癒）、特発性疾、虫（ 例えば類肉腫症）および炎症性疾患（例えば成人呼吸困難症）のような炎症性状 態を診断することが可能であろう。抗体はさらに新生物症状（例えば宿主応答に よる悪性度の監視、悪性細胞の転移能力の評価）に関連して、遺伝病において（ 例えば嚢胞性繊維症またはエラスターゼ−エラスターゼインヒビターシステムの 遺伝的異常）において、骨髄単球細胞の成熟異常（例えばチニディアブクーヒガ シ（Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ）シンドローム）において、膵ｌ１ｉｉ灸 および他の膵臓の病気において、診断手段として使用でき、および一般にある集 団におけるエラスターゼ−エラスターゼインヒビターシステムの遺伝的評価とそ の病気との関係の評価のために使用できる。

ヒトＥＩに対する抗体はまた、エラスターゼが異常である症状、エラスターゼイ ンヒビターがエラスターゼに対して過剰である症状、または食細胞の補給が不足 している症状の治療を含めた治療の用途を有する。そのような症状は、感染に対 する異常およびｇ染に対する抵抗力不足または不十分な免疫防御を含む。

同様に、ヒトＥＩまたはその部分をコードするりポヌクレオチドに相補的なオリ ゴヌクレオチドは、上記の診断目的のあるものに有用であろう。さらに、ヒト− ＥＩまたはその部分、誘導体または変異体をコードするオリゴヌクレオチドは、 単独または適当な発現ベクターもしくは配給システムの一部として、上記症状に 関連する！換治療に有用であろう。そのようなオリゴヌクレオチド、適当な発現 ベクターまたは配給システムの有効量を含む調製物は、上記した慣用のクローニ ングおよびｌｌ離技術を用いて、またはＰＣＲ（ポリメラーゼ　チェーン　リア クション）のような他の方法を用いて行われる。これらの用途および他の多くの 用途が、当業者に明らかであろう。

以上の説明は説明のためのものであって、限定するためのものではない。

参照文献 （１）Ｊａｎｏｆ　ｆ、Ａ、、Ｂｌｏｄｉｎ、Ｊ、、ｒヒト白血球細胞の液によ るヒト白血球粒子中のエラスターセ様エステラーゼの阻害（Ｉｎｈｉｂ　ｉｔ　 １ｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｌａｓｔａｓｅ−Ｌｉｋｅ　Ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｉｎ　 Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｇｒａｎｕｌｅｓ　ｂｙ　Ｈｕｍａｎ　Ｌｅ ｕｋ。

ｃｙｔｅ　Ｃｅ１ｌ　５ａｐ）Ｊ、Ｐｒｏｃ、ＳＯＣ，ＥＸＤ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅ ｄ、、１９７Ｌ　１３６・１１０５０−４０５３（２）Ｂｌｏｄｉｎ、Ｊ、、Ｒ ｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｒ，、Ｊａｎｏｆｆ、Ａ−、ｒヒト好中球エラスターゼに対 して活性なヒト肺マクロファージ中のインヒビター（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｉｎ 　Ｈｕｍａｎ　Ｌｕｎｇ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　Ａｃｔｉｖｅ　Ａｇａｉｎ ｓｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　Ｅｌａｓｔａｓｅ）Ｊ、Ａｍ−Ｒｅ ｖ、Ｒｅ５ｐ、Ｄｉ　ｓ、、１９７２，１０６　：　４７７−４７９゜ （３）　Ｄｕｂ　ｉ　ｎ、　Ａ、　、ｒウマ血液白血球の細胞ゾルからの多価プ ロテイナーゼインヒビター（Ａ　Ｐｏ１ｙｖａｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ 　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｆｒｏｍ　Ｈｏｒｓｅ−Ｂｌｏｏｄ、−Ｌｅｕｃｏｃｙ ｔｅ　Ｃｙｔ。

５ｏｌ）Ｊ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９７７．７３：４２９−４３５ （４）Ｐｏｔｅｍｐａ、Ｊ、、Ｄｕｂｉｎ、Ａ、、Ｔｒａｖｉｓ、Ｊ、、ｒウマ 白血球細胞ゾルからの、セルピンのスーパーファミリーに属するエラスターゼイ ンヒビター（Ａｎ　Ｅｌａｓｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｆｒｏｍ　Ｅｑｕ ｉｎｅ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｃｙｔｏｓｏｌ　Ｂｅｌｏｎｇｓ　ｔｏ　ｔｈｅ −Ｓｅｒｐｉｎ　Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）Ｊ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、１ ９８８．２６３ニア３６４ （５）Ｋｏｐｉ　ｔａｒ、Ｍ、およびＭ、Ｂｏｚｉｃ、ｒブタ白血球エラスター ゼ方法（Ｐｉｇ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｅｌａｓｔａｓｅ　［ｎｈｉｂｉｔｏｒ ）Ｊ、Ａｃｔａ　Ｐｈａｒｍ、Ｊｕｇｏｓｌ、、１９８５．３５：２０３−２１ ２゜（６）Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ、Ｒ，、Ｇｏｅｔｔｌｉｃｈ−Ｒｉｅｍａｎｎ、 Ｗ−。

Ｆｉｓｈｅｒ、Ｇ、およびＲｕｃｋｅｒ、Ｒ，Ｂ、、ｒ単離されたウシノ肺マク ロファージからのエラスターセインヒビター（八ｎ　Ｅｌａｓｔａｓｅ　Ｉｎｈ ｉｂｉｔｏｒ　ｆｒｏｍ　ｌ５ｏｌａｔｅｄ　Ｂｏｖｉｎｅ　ＰｕＬｍｏｎａｒ ｙ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）Ｊ、Ｐｒｏｃ、Ｓａｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅ ｄ、、１９８Ｌ　１６８：２３８−２４４゜（７）　Ｒｅｍａ　ｌｄ　−０’　 Ｄｏｎｎｅ　１１．　Ｅ、およびに、Ｌｅｗａｎｄｒｏｗｓｋｉ、ｒ末梢マクロ ファージに関連する二種のプロテイナーゼインヒビター（Ｔｗｏ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ　Ｐｅｒｉｔ ｏｎｅａｌ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）Ｊ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、１９８ ３，２５８：３２５１−３２５７゜（８）Ｒｅｍｏ　１　ｄ−〇’　Ｄｏｎｎｅ ｌｌ、Ｅ、、ｒヒト単球中の即効性エラスターゼインヒビター（Ａ　Ｆａｓｔ− Ａｃｔｉｎｇ　Ｅｌａｓｔａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｍ ｏｎｏｃｙｔｅｓ）Ｊ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１９８５，１６２：２１４２−２ １５５（９）Ｓｕｎｄｓ　ｔ　ｒ６ｍ、Ｃ，およびＮｉ　ｌ５ｓｏｎ、に、、ｒ ヒト組織球性リンホーマ細胞ライン（Ｕ−９３７）の確立および同定（Ｅｓｔａ ｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　 Ｈｕｍａｎ　Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅ 　（Ｕ−９３７）ｊ、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、１９７６．１７：５６５−５ ７７゜（１０）　Ｌａｚａｒｄｅｓ、Ｅ、およびＬｉｎｄｂｅｒｇ、Ｕ、ｒアク チンはデオキシリボヌクレアーゼ　エの天然に存在するインヒビターである（Ａ ｃｔｉｎｉｓ　ｔｈｅ　ｎａｔｕｒａｌｌｙ　ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　１ｎｈｉｂ ｉｔｏｒｏｆ　ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｒ）Ｊ、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９７４．７１巻、４７４２−６゜（１１）　Ｗｅ 　ｂ　ｅ　ｒ、　Ｋ、および０ｓｂｏｒｎ、Ｍ、ｒドデシルｆ！ＥＭ！−ポリア クリルアミドゲル電兜泳動による分子量決定の信頼性（Ｔｈｅ　ｒｅｌｉａｂｉ ｌｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ ｏｎｓ　ｂｙ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄ ｅＧｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）Ｊ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ’Ｌ９６９．２４４：４４０６−４４２１゜（１２）　Ｓｅｎ　ｉｏ　ｒ、　Ｒ ，Ｍ、　、　Ｈｕｅｂｎｅ　ｒ、Ｐ、　Ｆ、およびＰｉｅｒｃｅ、Ｊ、Ａ、、ｒ エラスチン寒天によるニラスターセ活性の測定およびそのアンチトリプシン欠描 症の検出のための使用（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｌａｓｔａｓｅ　Ａ ｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ　Ｅｌａｓｔｉｎ　Ａ、ｇａｒ　ａｎｄ　１仁　ｓ　Ｕｓ ｅ　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ　Ｄｅ ｆｉｃｉｅｎｃｙ）Ｊ、Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、、１９７１．７７：５ １０−６゜ （１３）Ｍｅｒｒｉ　１．Ｃ，Ｒ，Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｄ、、Ｓｅｄｍａｎ　Ｓ、 Ａ。

、Ｅｂｅｒｔ、Ｍ、Ｈ，、ｒポリアクリルアミドゲル中の蛋白質の超感度染色は 脳を髄液蛋白質の領域変異を示す（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　５ｔａｉｎ ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓｓ ｈｏｗｓ　ｒｅｇｉｏｎａｌ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｃｅｒｅｂｒｏｓ ｐｉｎａｌ　ｆｌｕｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８Ｌ、 ２１１＠、１−４３７−８゜ （１４）　Ｈｉ　ｒｓ、Ｃ，Ｈ，Ｗ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−，１９５６， ２１９：６１１およびＭｏｏｒｅ、Ｓ、、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ−，１９６ ３，２３８：　２３５゜ ）　（１５）Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｖ、Ｎ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｚｙｍｏＬ　 、１９７２．２５：２４４〜２４９゜ （１６）Ｔａｒｅｎｔ　ｉｎｏ、Ａ、Ｌ、、Ｇｏｍｅｚ、Ｃ，Ｍ、、Ｐｌｕｍｍ ｅｒ、Ｔ、Ｈ，、Ｊｒ、、ｒペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦによるアスパラギ ン−結合グリカンの脱グリコジル化（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　 Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｇｌｙｃａｎｓ　ｂｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ ：Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ　Ｆ、）Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８ ５゜２４・４６６５−４６７１゜ 浄書（内容に変更なし） 図Ｔ 浄書（内容に変更なし） 図５ 図４ アミノ酸組成 ムｓｘ　Ｌ（Ｌ７　１１−Ｌ　Ｌｏ、９　４０　４３Ｇｌｘ　１０．６　１２． ３　Ｌ２．４　４４　５０Ｈｉｓ　２．２　１．９　３．５　７　１３Ｌｙｓ　 ６．５　７．１　８．６　２６　３４ムｒｇ　１４．　３．８　１．８　１４　 ７Ｓｅｔ　６．３　ｇ、１　５．３　２９　２１Ｔｈｒ　５−７　５．７　７． ６　２１　３０Ｐｒｏ　４．８　５．４　４．３　２０　ＨＡｌａ　８−５　８ ．　Ｌ　６．１　２９　２４Ｃｙｓ　２−３　１．５　０．２　５　１Ｇｌｙ　 ８１　７．０　５．６　２５　２２Ｔｙｒ　３．３　２．Ｌ　１．５　８　６Ｖ ａｌ　６．８　５．２　６．１　１９　２４１１ｅ　５．０　３．０　４．８　 １１　１９Ｌｅｕ　８．１　９，２　１１．４　３３　４５Ｐｈｅ　３．７　４ ．９　６．８　１８　２７夏ｅｔ　Ｌ、９　２．０　２．３　７　９Ｔｒｐ　１ −３　１ＪＤ　Ｏ，５ＮＤ　２合計　−３６０３９４ 零−２００種類以上の蛋白質の平均アミノ酸組成は、Ｒｅｅｃｋ、　Ｇ、Ｌ、　 Ｆｉｓｈｅｒ、　Ｌ、ｒ蛋白質のアミノ酸組成の統計分析（λ５ｔａｔｉｓｔｉ ｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ　ｃ。

ｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　Ｊ　、　ｒａｔ、　Ｊ、　 Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、　１９７３．T：　１０９−１ １７による。

ｊＥｒの値は三つの標品からのデータの平均値である。ＥＩの分子当たりの残基 数は、［ｒ＝４２．０００を基準にして計算した。

＃ａＬ−ＡＴの組成は、Ｃａｒｒｅｌｌ、　ＲＪ、、　Ｊｅｐｐｓｓｏｎ、　Ｊ −０，、Ｌａｕｒｅｌｌ、　Ｃ−Ｂ、、　Ｂｒｅｎｎａｎ、　Ｓ、０．、０ｖｅ ｎ、　ＩＣ，、Ｙａｕｇｈａｎ、　Ｌ、、　Ｂｏｓｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｌ、　ｒヒ トα１−アンチトリプシンの構造および変異（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｖ ａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　αｌ−ｊ＋ｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）Ｊ、　 Ｎａｔｕｒｅ、　１９８２．２９８：３２９−３３４から計算した。

（社）−測定せず 手続補正書□ 平成　４年　６月２５日国

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約４２，０００の分子量及び実質的にグリコシル化されていない構造を有し 、そしてエラスターゼと共有結合複合体を形成する能力を有し、そしてエラスタ ーゼのエラスチン溶解活性に対するインヒビターとして作用する、実質的に純粋 な一本鎖ポリペプチド分子。 ２．ヨードアセトアミドで処理すると膵臓エラスターゼとの複合体形成が阻害さ れ、そして必須のジスルフィド結合を分子内に有しない、請求項１記載の実質的 に純粋な一本鎖ポリペプチド分子。 ３．実質的に純粋なヒトＥＩ、またはその変異体、部分または誘導体。 ４．治療に有効な量のヒトＥＩ、またはその変異体、部分または誘導体を含んで なる組成物。 ５．さらに、プロテイナーゼの活性部位に反応する能力を持つ成分を、ヒトＥＩ の部分誘導体または変異体に結合して有する、請求項４記載の組成物。 ６．ヒトＥＩ、またはその変異体、部分または誘導体が下記の群：（１）【配列 があります】 （２）【配列があります】 （３）【配列があります】 （４）【配列があります】 （５）【配列があります】 （６）【配列があります】 （７）【配列があります】 （８）【配列があります】 （９）【配列があります】および （１０）【配列があります】 からなる配列から選択されたアミノ酸配列を含むものである、請求項４記載の組 成物。 ７．下記の群： （１）ヒトＥＩ； （２）ヒトＥＩの変異体、部分または誘導体；（３）【配列があります】の蛋白 質配列を含む分子；（４）【配列があります】の蛋白質配列を含む分子；（５） 【配列があります】の蛋白質配列を含む分子； （６）【配列があります】の蛋白質配列を含む分子； （７）【配列があります】の蛋白質配列を含む分子；（８）【配列があります】 の蛋白質配列を含む分子；（９）【配列があります】 の蛋白質配列を含む分子； （１０）【配列があります】の蛋白質配列を含む分子；（１１）【配列がありま す】の蛋白質配列を含む分子；および （１２）【配列があります】の蛋白質 配列を含む分子； から選択される分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクター。 ８．上記分子がセリンプロテイナーゼのインヒビターとして作用できるものであ る、請求項７記載の組換えベクター。 ９．上記分子がエラスターゼのインヒビターとして作用できるものである、請求 項７記載の組換えベクター。 １０．上記分子がエラスターゼと共有結合による複合体を形成でき、そしてエラ スターゼのインヒビターとして作用できるものである、請求項７記載の組換えベ クター。 １１．ヒトＥＩをコードするＤＮＡ配列を含むベクターである、請求項７記載の ベクター。 １２．ヒトＥＩの誘導体、変異体または部分をコードするＤＮＡ配列を含むベク ターである、請求項７記載の組換えベクター。 １３．【配列があります】の蛋白質配列を含む分子をコードするＤＮＡ配列を含 むベクターである、請求項７記載のベクター。 １４．【配列があります】の蛋白質配列を含む分子をコードするＤＮＡ配列を含 むベクターである・請求項７記載のベクタ、１５．【配列があります】の蛋白質 配列を含む分子をコードするＤＮＡ配列を含むベクターである、請求項７記載の ベクター。 １６．【配列があります】の蛋白質 配列を含む分子をコードするＤＮＡ配列を含むベクターである、請求項７記載の ベクター。 １７．【配列があります】の蛋白質配列を含む分子をコードするＤＮＡ配列を含 むベクターである・請求項７記載のベクター。 １８．【配列があります】の蛋白質配列を含む分子をコードするＤＮＡ配列を含 むベクターである、請求項７記載のベクター。 １９．【配列があります】の蛋白質配列を含む分子をコードするＤＮＡ配列を含 むベクターである、請求項７記載のベクター。 ２０，セリンプロテイナーゼのインヒビターとして作用する能力を有し、そして ヒトＥＩの少なくとも一部を含む、非天然分子。 ２１．エラスターゼのインヒビターとして作用する能力を有する、請求項２°記 載の非天然分子。 ２２．上記分子がエラスターゼと共有結合による複合体を形成する能力を有し、 そしてヨードアセトアミドにより処理すると該分子がエラスターゼと複合体を形 成する能力が損なわれることをさらに特徴とする、請求項２１記載の非天然分子 。 ２３．下記の群： （１）【配列があります】 （２）【配列があります】 （３）【配列があります】 （４）【配列があります】 （５）【配列があります】 （６）【配列があります】 （７）【配列があります】 （８）【配列があります】 （９）【配列があります】 （１０）【配列があります】からなる配列から選択されたアミノ酸配列を有する ことをさらに特徴とする、請求項２１記載の非天然分子。 ２４．ヒトＥＩの少なくとも一部をコードするオリゴヌクレオチドを含む検出プ ローブを用いることよりなる、ヒトＥＩの遺伝子を単離する方法。 ２５．ヒトＥＩまたはその変異体、誘導体または部分をコードする、実質的に純 粋なオリゴヌクレオチド。 ２６．オリゴヌクレオチドが、下記の群：（１）【配列があります】 （２）【配列があります】 （３）【配列があります】 （４）【配列があります】 （５）【配列があります】 （６）【配列があります】 （７）【配列があります】 （８）【配列があります】 （９）【配列があります】および （１０）【配列があります】から選択されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコード するものである、請求項２５記載の実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 ２７．ヒトＥＩに対して選択的特異性を有する抗体の診断に効果的な量を含んで なる組成物。 ２８．ヒトＥＩに結合する能力を有する、実質的に純粋な抗体。 ２９．ヒトＥＩまたはその変異体、部分または誘導体の薬学的に有効な量を患者 に投与することよりなる、医学的症状の治療方法。 ３０．ヒトＥＩに対する抗体を含む組成物の薬学的に有効な量を患者に投与する ことよりなる、医学的症状の治療方法。 ３１．ヒトＥＩまたはその変異体、部分または誘導体をコードするＤＮＡ配列を 含むオリゴヌクレオチドを患者に投与することよりなる、医学的症状の治療方法 。 ３２．ヒトＥＩまたはその変異体、部分または誘導体の診断に効果的な量を使用 することよりなる、医学的症状を診断する方法。 ３３．ヒトＥＩに対する抗体の診断に効果的な量を使用することよりなる、医学 的症状を診断する方法。 ３４．ヒトＥＩをコードするオリゴヌクレオチドの診断に効果的な量を使用する ことよりなる、医学的症状を診断する方法。 ３５．ベクターが【配列があります】 【配列があります】の蛋白質配列を含む分子をコードするＤＮＡ配列を含むもの である、請求項７記載の組換えベクター。 ３６．ベクターが【配列があります】の蛋白質配列を含む分子をコードするＤＮ Ａ配列を含むものである、請求項７記載の組換えベクター。 ３７．ベクターが【配列があります】の蛋白質配列を含む分子をコードするＤＮ Ａ配列を含むものである、請求項７記載の組換えベクター。