DE69632235T2

DE69632235T2 - Newcastle-Krankheitsvirus-Kombinationsimpfstoff

Info

Publication number: DE69632235T2
Application number: DE69632235T
Authority: DE
Inventors: Carla Christina Schrier; Heinrich Dieter Lütticken
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1995-10-18
Filing date: 1996-10-15
Publication date: 2004-08-26
Anticipated expiration: 2016-10-16
Also published as: JPH09169663A; MX9604907A; DE69632235D1; DK0770397T3; EP0770397B1; PT770397E; ES2219679T3; US5733556A; JP3947254B2; BR9605153B1; CA2187974C; CA2187974A1; BR9605153A; EP0770397A1; ATE264691T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kombinationsimpfstoff zur Verwendung beim Schutz von Geflügel gegen Newcastle Disease (ND) umfassend eine NDV immunogene Untereinheit oder einen heterologen Vektor, der fähig ist, ein NDV immunogenes Protein zu exprimieren, sowie ein Kit umfassend die Komponenten für solch einen Kombinationsimpfstoff.
Die Newcastle Disease ist eine virale Infektionskrankheit von Geflügel mit einer breiten geographischen Verteilung, welche grosse wirtschaftliche Verluste in der Geflügelindustrie verursacht. Das Newcastle Disease Virus (NDV) ist das etiologische Agens dieser Krankheit und stellt das Prototypvirus des Genus Paramyxovirus dar. Die Newcastle Disease ist deswegen kompliziert, weil verschiedene Isolate und Stämme des Virus enorme Variationen der Schwere der Krankheit verursachen können. Allgemein kann gesagt werden, dass, je jünger das Huhn, desto akuter und schwerer die Erkrankung. Die Infektion kann entweder durch Inhalation oder durch Nahrungsaufnahme erfolgen und die infektiöse Form des Virus breitet sich von einem Vogel zum anderen aus.
Wie oben angemerkt, sind verschiedene Pathogenitätstypen von NDV identifiziert worden, d. h. velogene, mesogene und lentogene Viren. Obwohl diese Bezeichnungen von einem Labortest herrühren, werden diese Bezeichnungen nun allgemein verwendet, um Viren mit hoher, mässiger oder niedriger Virulenz für Hühner zu beschreiben. Die neurotrope velogene Form der Krankheit wird durch hoch-pathogene NDV-Stämme verursacht und ist durch einen plötzlichen Ausbruch schwerer respiratorischer Symptome, gefolgt von neurologischen Symptomen gekennzeichnet. In den meisten Fällen überleben die infizierten Tiere nicht. Viszerotrope velogene NDV-Stämme sind hoch-pathogen und verursachen hohe Mortalität und ernste Läsionen im Gastrointestinaltrakt. Mesogene NDV-Stämme verursachen gewöhnlich eine ernste respiratorische Erkrankung in voll empfänglichen Vögeln und in ausgewachsenen vögeln einen bemerkenswerten Rückgang der Eiproduktion. Lentogene NDV-Stämme verursachen im allgemeinen eine milde Erkrankung, die durch respiratorische Symptome gekennzeichnet ist, insbesondere bei jungen, voll empfänglichen Vögeln.
Um die auf die Newcastle Disease (ND) zurückzuführenden wirtschaftlichen Verluste in der kommerziellen Geflügelindustrie zu reduzieren, wurden Hühner gegen ND geimpft. Lebendimpfstoffe, die von lentogenen und mesogenen Stämmen stammten, wurden routinemässig verwendet, wobei sich die mesogenen Stämmen nur für eine Zweitimpfung eigneten. Allerdings besteht auch in der lentogenen Gruppe bezüglich der Virulenz der Viren eine beachtliche Bandbreite. NDV-Stämme, die als Lebendimpfstoffe verwendet werden, schliessen V4, Hitchner B1, F, La Sota (lentogen) und Stamm H, Mukteswar, Komarov und Roakin (mesogen) ein. Der Hauptvorteil der lebenden ND-Impfstoffe ist der, dass diese durch billige Massenapplikationstechniken wie in Form von Spray und Trinkwasser verabreicht werden können. Diese Impfstoffe können jedoch ernste Impfreaktionen, insbesondere nach einer Sprayimpfung im Respirationstrakt, hervorrufen. Aus diesem Grund ist es wichtig einen ausserordentlich milden Virus zur Impfung, insbesondere für eine Erstimpfung, zu verwenden, als ein Ergebnis davon sind jedoch gewöhnlich mehrfache Impfdurchführungen notwendig.
Älteren Vögel werden im allgemeinen inaktivierte Impfstoffe durch Injektion verabreicht. Meistens enthalten diese Impfstoffe das abgetötete Virus mit einem Adjuvansträger gemischt, wie beispielsweise Aluminiumhydroxid oder einer Wasser-in-Öl-Emulsion. Viren, die für die Herstellung von Öl-Emulsions-Impfstoffen verwendet werden, schliessen Ulster 2C, Hitchner B1, La Sota, Roakin und verschiedene virulente Viren ein (D. J. Alexander, in Di seases of Poultry, 9. Ausgabe 1991, Hrsg. Ca1nek et al., Iowa State University Press, Ames, Iowa, 496–519).
Die allgemein verwendeten Lebendstämme von NDV, Hitchner B1 und La Sota, verursachen immer noch milde respiratorische Impfreaktionen. Als Folge davon wurden NDV-Impfstoffe basierend auf milderen Lebendstämmen entwickelt, obwohl es im allgemeinen akzeptiert wird, dass die Immunogenizität der Impfstoffstämme, insbesondere in MDA positiven Vögeln, mit deren Virulenz abnimmt. Verschiedene solcher milder Stämme wurden im Stand der Technik beschrieben. US-Patent Nr. 5,250,298 (University of Delaware) offenbart eine lebende, Kälte-adaptierte, Temperaturempfindliche Mutante des Hitchner-B1-Elternstammes, als CaTs bezeichnet. US-Patent Nr. 5,149,530 (Duphar Int. Res. B.V.) beschreibt den von dem Ulster 2C Stamm hergeleiteten NDW-Stamm. Darüber hinaus wird im US-Patent Nr. 5,188,502 (University of Georgia Research Foundation, Inc.) ein natürlich abgeschwächter NDV-Stamm offenbart, der aus dem Intestinaltrakt eines Truthahns isoliert wurde, der keine Symptome einer respiratorischen Erkrankung zeigt. Ein weiterer milder NDV Stamm, als C2 bezeichnet, wird in US Patent Nr. 5,750,111 (AKZO Nobel N.V.) beschrieben.
Entwicklungen neueren Datums in der Gentechnologie ermöglichten die Verwendung einer neuen Generation von Impfstoffen basierend auf der Expression von immunogenen Viruskomponenten, den sogenannten Untereinheiten. Der Hauptvorteil dieser Art von Impfstoffen über den gängigen NDV Lebendimpfstoffen basierend auf lentogenen NDV Stämmen ist, dass diese keine respiratorischen Impfreaktionen verursachen, die im allgemeinen nach einer konventionellen Impfung vorkommen. Zudem ist keine NDV Herstellung mehr nötig und die Möglichkeit einer Reversion zu Virulenz des Impfstoffvirus ist herabgesetzt.
Impfstoffe basierend auf entweder einem immunogenen NDV Untereinheit-Protein oder auf einem heterologen Vektor, der fähig ist ein immunogenes NDV Protein zu exprimieren, sind im Stand der Technik offenbart. Insbesondere Impfstoffe basierend auf der Expression des NDV Fusions (F) oder Hemagglutinin-Neuramidinase Proteins mittels lebender viraler Vektoren, wie zum Beispiel dem Herpesvirus von Truthähnen (HVT) und dem Geflügelpockenvirus (FPV), oder mittels des Baculovirus Expressionssystems wurden kürzlich beschrieben (Morgan, R. W. et al., Avian Diseases 36, 858–870, 1992; Boursnell, M. E. G. et al., Virology 178, 297–300, 1990 und J. Gen. Virology 71, 621–628, 1990; Mori, H. et al., Avian Diseases 38, 772–777, 1994; Nagy, E. et al., Avian Diseases 35, 585–590, 1991).
Ein lokaler Atemwegsschutz ist wichtig um eine anfängliche NDV Infektion und anschliessende Erkrankung zu verhindern und um die Ausbreitung des Virus auf empfängliche Hühner via Inhalation oder Nahrungsaufnahme von kontaminierter Nahrung oder Trinkwasser zu limitieren. Im allgemeinen erzeugen gebräuchliche NDV Lebendimpfstoffe einen ausreichenden lokalen, respiratorischen Schutz. Die meisten Untersuchungen, die nur FPV-NDV Impfstoffe verwendeten, untersuchten systemische Immunität gegen neurologische Symptome, untersuchten jedoch nicht die respiratorische Immunität. Zudem erzeugte ein durch die okuläre Route verabreichter FPV-NDV/F oder FPV-NDV/HN Impfstoff nur einen geringen systemischen Schutz und kein zusätzlicher Nutzen konnte von einer Immunisierung mit beiden rekombinanten FPV-NDV/F und FPV-NDV/HN festgestellt werden (Edbauer, C. et al., Virology 179, 901–904, 1990). Zusätzlich wurde in Morgan et al., Avian Diseases 36, supra; und Avian Diseases 37, 1032–1040, 1993, demonstriert, dass die Verabreichung eines auf einem viralen Vektor basierenden NDV Lebendimpfstoffes zu einem relativ geringen Grad an lokalem, respiratorischem Schutz führte, insbesondere in Gegenwart von maternal hergeleiteten Antikörpern (maternal derived antibodies, MDA) zu NDV und einem späten Challenge.
Die vorliegende Erfindung stellt einen NDV Kombinationsimpfstoff bereit, der einen verstärkten Schutz gegen ND sowohl auf lokaler wie auch systemischer Ebene bezüglich des Schutzes erzeugt.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung einen Kombinationsimpfstoff zur Verwendung beim Schutz von Geflügel gegen ND umfassend einerseits eine erste aktive Komponente, die eine NDV immunogene Untereinheit oder einen heterologen Vektor, der fähig ist, ein NDV immunogenes Protein zu exprimieren, darstellt und andrerseits eine zweite aktive Komponente, die einen lebenden NDV Impfstoff-Stamm darstellt. Der Nutzen der besagten ersten Komponente, falls sie als einzige Komponente verabreicht wird, liegt hauptsächlich in der Erzeugung von systemischem Schutz (gegen Mortalität und nervlichen Symptomen, wie zum Beispiel klonische Spasmen, Muskelzittern, Tortocollis, Opisthotonus und Paralyse) in inokulierten Vögeln, wobei die besagte zweite Komponente in diesem Fall hauptsächlich einen lokalen Atemwegsschutz (gegen Multiplikation des NDV Challenge Virus in den Luftröhren) herbeiführt. In der vorliegenden Erfindung wurde überraschend gefunden, dass der hierin definierte Kombinationssimpfstoff sowohl systemisch wie auch lokal eine synergistische, schützende Immunantwort hervorruft. Als Folge davon erzeugt der beanspruchte Impfstoff einen hohen Schutz gegen NDV Infektion mittels sowohl mesogener NDV wie auch neurotroper, velogener NDV Stämme, sogar in Gegenwart von maternal hergeleiteten Antikörpern.
Der Kombinationsimpfstoff umfasst vorzugsweise einen heterologen Vektor, der fähig ist, ein NDV immunogenes Protein zu exprimieren. Solch ein Vektor ist ein Mikroorganismus, z. B. ein Bakterium oder Virus, oder ein Polynukleotid, welches das das immunogene NDV Protein kodierende Gen enthält. Der Vektor ist fähig in inokulierten Vögeln das besagte Protein zu exprimieren oder sich zu replizieren und dadurch das besagte Protein zu exprimieren, wodurch als Folge davon das immunisierte Tier eine Immunantwort gegen das Protein erzeugt. Der Begriff „heterolog" weist darauf hin, dass der Vektor in der Natur das NDV Gen nicht enthält.
Lebende Virusvektoren sind am meisten bevorzugt. Viele lebende Virusvektoren, die Gene enthalten, die Proteine aviärer Pathogene kodieren, wurden im Stand der Technik bereits beschrieben, insbesondere Virusvektoren, die NDV Proteine kodieren. Geeignete Virusvektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Fachleuten bekannt und umfassen Pockenviren, Herpesviren und aviäre Retroviren.
Ein Beispiel eines geeigneten Pockenvirus ist Vaccinia, wobei jedoch Avipox Viren mehr bevorzugt sind, da deren Wirteauswahl beschränkter ist. Insbesondere Taubenpocken Viren (Pigeon Pox Virus, PPV) und Geflügelpocken Viren (Fowl pox Virus, FPV) werden als geeignet erachtet.
Beispiele solcher geeigneter PPV und FPV Vektoren, die ein immunogenes NDV Gen enthalten, sind in Letellier, C. et al., Archives of Virology 118, 43–56, 1991; Edbauer, C. E. et al., Virology 179, 901–904, 1990; Taylor, J. et al., J. Virology 64, 1441–1450, 1990; Ogawa, R. et al., Vaccine 8, 486–490, 1990; Bournsell, M. E. G. et al., Virology 178, 297–300, 1990 und J. Gen. Virology 71, 621–628, 1990; und Boyle, D. B. et al., Virus Research 10, 343–356, 1988, offenbart.
Ein Beispiel eines aviären retroviralen Vektors (aviäres Leukosevirus), der das NDV HN-Gen enthält, ist in Morrison, T. et al., Microbial Pathogenesis 9, 387–396, 1990 offenbart.
Ein sogar noch mehr bevorzugter viraler Vektor zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist HVT (Herpesvirus von Truthähnen; siehe Sondermeyer, P. J. A. et al., Vaccine 11, 349– 358, 1993). HVT hat einige Vorteile einschliesslich dessen be wiesene Sicherheit und Wirksamkeit gegen die Marek's Krankheit. Zudem kann HVT routinemässig ein-Tage-alten Küken verabreicht werden. Die Konstruktion eines HVT-NDV Vektors, der das HN- oder F-Gen enthält, und dessen Wirksamkeit als die einzige aktive Komponente in einem Impfstoff wurde in Morgan R. W. et al., Avain Diseases 36, 858–870, 1992 und 37, 1032–1040, 1993 beschrieben.
Ein wie hierin zuvor beschriebener Virusvektor kann mittels konventioneller rekombinanter DNA-Methoden hergestellt werden, wonach mit dem Vektorvirus infizierte Wirtszellen kultiviert werden können, um genügende Mengen des Vektorvirus zu produzieren. Anschiessend können Virus-enthaltende Zellen und/oder Vektorviren in gereinigter Form von der Kultur geerntet werden, gefolgt von deren Einbau in einen Impfstoff gemäss Standardverfahren.
Geeignete bakterielle Vektoren, die hierin zu verwenden sind, umfassen E.coli und einige Salmonella Arten.
Andrerseits ist der Vektor ein Polynukleotid enthaltend das NDV Gen, das funktionell mit einem Promotor, Enhancer oder anderen Sequenzen verbunden ist, die das Gen befähigen in aviären Zellen exprimiert zu werden. Im allgemeinen kann das Polynukleotid ein lineares DNA Molekül sein. Normalerweise ist das NDV Gen innerhalb eines bakteriellen Plasmides lokalisiert. Solch ein Vektor kann für eine auf DNA basierende Immunisierung verwendet werden, worin das Polynukleotid mittels in vivo Transfektion unter Verwendung von zu diesem Zweck bekannter Verfahren direkt in die aviären Zellen transferiert wird (Donnelly, J. J. et al., The Immunologist 2, 20–26, 1994).
Als eine Alternative zum hierin zuvor definierten heterologen Vektor kann eine NDV immunogene Untereinheit in den erfindungsgemässen Impfstoff eingebaut werden. Im Falle eines Untereinheit-Impfstoffes wird ein NDV immunogenes Protein in vitro in ausreichenden Mengen hergestellt, sodass es einem zu immunisie renden Tier als eine aktive Komponente des Impfstoffes verabreicht werden kann. Der Begriff NDV immunogene Untereinheit bezieht sich auf eine Verbindung oder Zusammensetzung umfassend ein NDV immunogenes Protein, das im wesentlichen frei von NDV (bestehend aus Protein) Material ist, mit dem es in der Natur normalerweise assoziiert ist.
Prinzipiell kann die NDV immuogene Untereinheit von den NDV Virionen mittels standardmässigen biochemischen Reinigungsmethoden gereinigt werden, obwohl die Expression der Untereinheit mittels eines rekombinanten DNA-Expressionssystems bevorzugt ist.
Im letzteren Fall wird die NDV immunogene Untereinheit durch eine Wirtszelle exprimiert. Eine geeignete Wirtszelle ist eine Zelle, die mit einem die Untereinheit kodierenden DNA-Fragment transformiert werden kann und die fähig ist, die besagte Untereinheit zu exprimieren.
„Transformation", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Einführung einer heterologen Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle, ungeachtet des angewendeten Verfahrens, zum Beispiel direkte Aufnahme oder Transduktion. Die heterologe Nukleinsäuresequenz kann in das Wirtsgenom integriert werden. Zur Expression wird das heterologe DNA Fragment mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen versehen, die mit dem ausgewählten Wirt kompatibel sind und die Expression der eingefügten Nukleinsäuresequenz regulieren können.
Die Wirtszelle kann prokaryotischen Ursprungs sein, z. B. bakterielle Expressionssysteme hergeleitet von E. coli, Bacillus subtilis oder Pseudomonas Arten.
Die Wirtszelle ist vorzugsweise eukaryotischen Ursprungs, z. B. Saccaromyces cerevisiae oder eine höhere eukaryotische Zelle wie zum Beispiel eine Insekten, Pflanzen oder Säugetierzelle, inklusive HeLa Zellen und Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen. Insektenzellen umfassen die Sf9 Zelllinie von Spodoptera frugi perda (Luckow et al., Biotechnology 6, 47–55, 1988). Informationen bezüglich Klonierung und Expression der NDV immunogenen Untereinheit in eukaryotischen Klonierungssystemen kann in Esser, K. et al. (Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verlag, 1986) gefunden werden.
Andrerseits ist eine geeignete Wirtszelle eine Zelle, die empfänglich für eine Infektion mittels eines rekombinanten Virus, das ein die NDV immunogene Untereinheit kodierendes DNA Fragment enthält, ist. Im Virus wird das heterologe DNA Fragment in eine nicht-essentielle Region des Virus eingebaut, z. B. eine Region, die zum Einbau des besagten DNA Fragmentes verwendet werden kann ahne essentielle Funktionen des Virus, wie diejenigen, die zur Infektion oder Replikation des Virus notwendig sind, zu unterbrechen.
Um grosse Quantitäten der NDV immunogenen Untereinheit zu erhalten, ist das bevorzugte Expressionssystem das Baculovirus-Expressionssystem (BVES). In diesem System werden Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda (Sf, IPLB-Sf21) Zellen in Zellkultur als Wirt für einen Baculovirus, wie ein Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV), gehalten. Gewisse Gene in AcNPV werden in hohen Mengen exprimiert, sind jedoch nicht essentiell für den viralen Infektionszyklus. Diese Gene sind das Ziel für eine homologe Rekombination in transfizierten Zellen zwischen einem Baculo-transfer Plasmid wie pAcAS3 und wildtyp (wt) AcNPV DNA. In pAcAS3 (J. Vlak et al., Virology 179, 312–320, 1990) werden heterologe Gene downstream des p10 Promotors an Stelle des nicht-essentiellen p10 Gens eingefügt, umgeben von Sequenzen des wt AcNPV die auf den Rekombinationsprozess abzielen. Um das Sondieren für Rekombinante zu erleichtern, enthält pAcAS3 ebenso das LacZ Gen, was verursacht, dass sich sie rekombinanten Plaques nach Zugabe von X-gal zum Medium blau verfärben.
Die Konstruktion von rekombinanten Baculoviren, die das NDV F- oder HN-Gen enthalten, sowie die Expression davon in Insektenzellen wurde im Stand der Technik beschrieben, z. B. von Kamiya, N. et al., Virus Research 32, 373–379, 1994; Murakami, Y. et al., Virus Research 33, 123–137, 1994; Niikura, M. et al., Virus Research 20, 31–43, 1991; Mori H., et al., Avian Diseases 38, 772–777, 1994; Nagy, E. et al., Virology 176, 426–438, 1990 und Avian Diseases 35, 585–590, 1991.
Cossett, F-L et al., Virology 185, 862–866, 1991 beschreiben die Herstellung eines NDV Untereinheit-Impfstoffes basierend auf einer Zelllinie, die das HN Protein konstitutiv exprimiert.
In der vorliegenden Erfindung können die hierin zuvor definierten Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression der NDV immunogenen Untereinheiten günstig sind, kultiviert werden. Impfstoffe können unter Verwendung von Proben der Rohkultur, Wirtszelllysate, Wirtszellextrakte oder Kulturüberstand hergestellt werden, obwohl in einer anderen Variante weiter gereinigte Untereinheiten je nach dem vorgesehenen Gebrauch hergestellt werden können. Zur Reinigung der hergestellten Proteine werden die die Untereinheiten exprimierenden Wirtszellen in einem geeigneten Volumen kultiviert und die hergestellten Proteine werden von solchen Zellen oder vom Medium, falls die Proteine ausgeschieden werden, isoliert. In das Medium ausgeschiedene Proteine können mittels Standardmethoden, wie Salzfraktionierung, Zentrifugation, Ultrafiltraton, Chromatographie, Gelfiltration, Immunopräzipitation oder Immunoaffinitäts-Chromatographie isoliert und gereinigt werden, während interzelluläre Proteine durch zuerst Sammeln der besagten Zellen, Aufbrechen der Zellen, zum Beispiel mittels Sonifikation oder mittels anderer mechanisch aufbrechender Mittel wie einer French Press, gefolgt von, falls erwünscht, Trennung der Proteine von den anderen intrazellulären Komponenten, isoliert werden können. Zellaufbrechung kann ebenso mittels chemischer (z. B. EDTA- Behandlung) oder enzymatischer Mittel wie zum Beispiel Lysozym Verdauung erzielt werden.
Als die zweite aktive Komponente der vorliegenden Erfindung können jede der wohlbekannten lebenden NDV lentogenen Impfstoff-Stämme verwendet werden. Solche Stämme umfassen Hitchner B1 und La Sota Impfstoff-Stämme.
Detaillierte Information bezüglich lebender NDV Impfstoff-Stämme, Impfstoffherstellung und Impfstoffverabreichung werden zum Beispiel von Allan et al., FAO Animal Production and Health Series No. 10, FAO, Rom, 1978 und D. J. Alexander, in: Diseases of Poultry, 9. Ausgabe 1991, Hrsg. Calneck et al., Iowa State University Press, Amer., Iowa, 496–519 offenbart.
Ein mit der Verwendung von lebenden ND-Impfstoffen assoziiertes Problem ist die Gegenwart von maternal hergeleiteten NDV Antikörper in kommerziellen Hühnern, die die Erstellung des Schutzes nach der Impfung stören. Dieses Problem kann durch Verwendung von relativ virulenten NDV Impfstoffstämmen überwunden werden. Ein Nachteil von solch virulenteren lebenden NDV Impfstoffen ist jedoch, dass diese respiratorische Erkrankungen verursachen oder dazu beitragen, was zu verminderter Leistung der Hühner oder sogar Mortalität in jungen Hühnern führt.
Als Konsequenz betrifft eine besonders bevorzugte Variante der vorliegenden Erfindung einen Kombinationsimpfstoff, worin der lebende NDV Impfstoff-Stamm ein milder lentogener NDV Stamm ist. Solch ein Kombinationsimpfstoff verursacht keine oder nur geringe respiratorische Impfreaktionen und ruft gleichzeitig eine verstärkte schützende Immunantwort hervor. Unter milden lentogenen Impfstoff-Stämmen versteht men Impfstoff-Stämme mit einem Vakzinalen Reaktionsindex (Vaccinal Reaction Index, VRI 1 und VRI 2) kleiner als 2. VRI's basieren unter anderem auf Gewichtsverlust aufgrund der Impfung und reichen von 0 bis 10 (van Eck, J. H. H. et al., Avian Pathology 20, 497–507, 1991). Bei spiele solcher milder, lentogener Impfstoff-Stämme sind NDV Stämme C2 (CNCM Deposit Nr. I-1614; hinterlegt bei Intervet International BV, Wim de Korverstraat 35, 5831 AN Boxmeer, Niederlande), CaTs (US Patent Nr. 5,250,298), den natürlich abgeschwächten Truthahnstammm offenbart in US Patent Nr. 5,188,502 und NDW (US Patent Nr. 5,149,530), wobei der C2 Stamm am meisten bevorzugt ist.
Die NDV immunogene Untereinheit oder Protein, die hierin zu verwenden ist, ist eine Proteinkomponente des ND Virus, die fähig ist eine schützende Immunantwort in Geflügel zu erzeugen und umfasst die F-, HN-, Matrix (M) und Nukleoprotein (NP) Proteine.
Die bevorzugte NDV immunogene Untereinheit oder Protein ist insbesondere das F- oder HN-Protein.
Beispiele dieser Viruskomponenten und der Gene, die die besagten Komponenten kodieren, sind in einigen der hierin zuvor erwähnten Dokumente erwähnt.
Ein sehr vorteilhafter Kombinationsimpfstoff gemäss der vorliegenden Erfindung umfasst den lebenden NDV C2 Stamm und den HVT-NDV/F Vektor.
Obwohl der Impstoff gemäss der vorliegenden Erfindung wirksam in Hühnern verwendet werden kann, kann anderes Geflügel, wie zum Beispiel Truthähne, Perlhühner und Rebhühner, ebenso erfolgreich mit dem Impfstoff geimpft werden. Hühner schliessen Fleischhühner, Reproduktionsherden und Legeherden ein.
Obwohl es bevorzugt wird, müssen die beiden aktiven Komponenten des Kombinationsimpfstoffes nicht notwendigerweise in einer gemischten Form verabreicht werden. Die Art der Verabreichung für jede Komponente kann von den spezifischen Eigenschaften von jeder der Komponenten abhängen. Zum Beispiel werden die NDV Lebendimpfstoffstämme vorzugsweise mittels der kostengünstigen Massenapplikationstechniken, die im allgemeinen für NDV-Impfungen verwendet werden, wie zum Beispiel mittels Spray oder Trinkwasser, verabreicht. Für solche Impfstoffe wird jedoch auch eine Verabreichung mittels Injektion in Betracht gezogen. Die NDV immunogene Untereinheit, die zum Beispiel durch einen Baculovirus oder einen wie hierin zuvor definierten heterologen Vektor, zum Beispiel von HVT oder FPV hergeleitet, exprimiert wurde, wird für gewöhnlich parenteral verabreicht. Es werden jedoch auch andere Impfrouten in Betracht gezogen, wie zum Beispiel in ovo, solange wie die spezifische aktive Komponente fähig ist, nach Verabreichung eine schützende Immunantwort hervorzurufen. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung können ebenso erzielt werden, wenn die Komponenten des kombinierten Impfstoffes den Vögeln getrennt durch ein kleines Zeitintervall verabreicht werden, z. B. durch ein Intervall von ungefähr 24 Stunden, vorzugsweise 8 Stunden. Zum Beispiel kann der vorteilhafte Effekt des Kombinationsimpfstoffes ebenso erhalten werden, wenn eine der Komponenten, z. B. der hierin zuvor beschriebene HVT Vektor, in ovo gerade vor dem Schlüpfen verabreicht wird, und der lebende NDV Impfstoff-Stamm unmittelbar nach dem Schlüpfen, z. B. im Alter von einem Tag, verabreicht wird.
Der erfindungsgemässe Impfstoff umfasst eine wirksame Dosis der aktiven Komponenten, d. h. eine Menge an immunisierender aktiver Komponente, die eine Immunität in geimpften Vögeln gegen eine Challenge-Impfung mit einem virulenten ND Virus hervorrufen wird. Immunität wird hierin als Induktion eines signifikant höheren Schutzniveaus in einer Vogelpopulation nach der Impfung im Vergleich zu einer ungeimpften Gruppe definiert.
Typischerweise kann der erfindungsgemässe Impfstoff in einer Dosis von 10^3,0–10^8,0 infektiöse Embryonaldosen₅₀ (EID₅₀) pro Tier, vorzugsweise in einer Dosis zwischen 10^5,0–10^7,0 EID₅₀ verabreicht werden. Auf HVT basierende Vektoren können in einer Menge von 10–10'000 pfu, vorzugsweise 100–1500 pfu, verabreicht werden, während FPV Vektoren im allgemeinen wirksam sind, wenn sie in einer Menge von 10^2,0–10^5,0 TCID₅₀ verabreicht werden.
Effektive Baculovirus-exprimierte Untereinheit-Impfstoffe werden normalerweise von 10^5,0–10^8,0 Zellen hergeleitet.
Der erfindungsgemässe Kombinationsimpfstoff kann den Vögeln direkt nach dem Schlüpfen verabreicht werden, d. h. ab einem Alter von einem Tag. Der Impfstoff kann als eine Primärimpfung erfolgen, wenn erwünscht gefolgt von einer oder mehreren Zweitimpfungen. Der kombinierte Impfstoff ist ebenso zum Einbau in Impfprogramme, die ebenso die Verwendung eines monovalenten NDV-Impfstoffes in lebend oder inaktivierter Form einschliessen, geeignet.
Als ein Beispiel können Fleischhähnchen im Alter von einem Tag geimpft werden, gefolgt von einer zweiten Immunisierung bei 14–21 Tagen. Lege- oder Reproduktionsherden können bei 1–10 Tagen geimpft werden, gefolgt von Booster-Impfungen bei 26–38 Tagen und 16–20 Wochen.
Die Erfindung schliesst auch multivalente Impfstoffe ein, die zusätzlich zu den hierin zuvor definierten zwei aktiven Komponenten, einen Impfstoff umfassen, der ein oder mehrere Immunogene, die von anderen, für Geflügel infektiösen Pathogenen hergeleitet sind, umfassen.
Vorzugsweise umfasst der Kombinationsimpfstoff zusätzlich einen oder mehrere Impfstoff-Stämme des Infektiösen Bronchitis Virus (IBV), des Infektiösen Bursa-Krankheitsvirus (IBDV), des Hühner-Anämie-Agens (CAA) oder eines Reovirus.
Der erfindungsgemässe Impfstoff kann in Form einer Suspension oder in lyophilisierter Form hergestellt und vermarktet werden und enthält zusätzlich einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel, die gewöhnlich für solche aktiven Komponenten verwendet werden. Trägerstoffe schliessen Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Puffer ein. Geeignete Stabilisatoren sind zum Beispiel SPGA, Carbohydrate (wie getrocknetes Milchserum, Albumin oder Casein) oder Abbauprodukte davon. Ge eignete Puffer sind zum Beispiel Alkalimetallphosphate. Geeignete Konservierungsmittel sind Thimerosal, Merthiolat und Gentamicin. Verdünnungsmittel schliessen Wasser, wässrige Puffer (z. B. gepufferte Salzlösung), Alkohole und Polyole (wie Glycerol) ein.
Falls erwünscht, können die erfindungsgemässen Impfstoffe ein Adjuvans enthalten. Zu diesem Zweck geeignete Verbindungen oder Zusammensetzungen umfassen Aluminiumhydroxid, -phosphat oder -oxid, Öl-in-Wasser-Emulsionen oder Wasser-in-Öl-Emulsionen basierend auf, zum Beispiel einem Mineralöl wie Bayol F^® oder Marcol 52^®, oder ein Pflanzenöl wie zum Beispiel Vitamin E Acetat, sowie Saponine.
Die vorliegende Erfindung erwägt hierin ebenso ein Kit-Format, das eine verpackte Multicontainer-Einheit mit Behältern von jeder wie hierin zuvor definierten, aktiven Komponente umfasst. Das Kit kann ebenso einen Behälter mit einem Trägermittel oder Verdünnungsmittel für eine oder beide der aktiven Komponenten beinhalten.
Beispiel 1
Wirksamkeit der kombinierten Verabreichung des HVT-NDV/F Vektors und eines lebenden NDV Impfstoff-Stammes
Der HVT-NDV/F-Vektor wurde wie in Morgan, R. W. et al., Avian Diseases 36, 858–870, 1992 und Sondermeyer, P. J. A. et al., Vaccine 11, 349–358, 1993 beschrieben hergestellt. HVT-NDV/F wurde auf primären Hühnerembryo Fibroblasten (CEF), die von 10-Tage alten embryovierten spezifischen Pathogen-freien Eiern hergestellt wurden, propagiert. Die Zellen wurden in einer Kombination von Glasgow's und Eagle's modifiziertem minimalem essentiellen Medium, das mit 5% fötalem Kälberserum und einem Cocktail von Antibiotika ergänzt wurde, erhalten.
CEF wurden in Rollerflaschen in einer Dichte von ungefähr 6 × 10⁵ Zellen/cm² angesiedelt, mit HVT-NDV-F bei einer moi von ≤ 0.01 pfu/Zelle infiziert und bei 37°C für 48–72 Std inkubiert. Wenn die Kulturen einen ungefähr 80% zytopathischen Effekt erreichten, wurden die infizierten Zellen unter Verwendung von Trypsin geerntet, heruntergeschleudert und in Gefriermedium resuspendiert. Aliquote der infizierten Zellen wurden in versiegelten Glassampullen in der Gasphase von flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Der lebende NDV Impfstoff wurde ausgehend vom milden NDV Impfstoff-Stamm C2 (bei CNCM des Institute Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, Paris, Frankreich unter der Zugangsnummer Nr. I-1614 hinterlegt) hergestellt.
NDV C2 X + 4 wurde verdünnt, sodass er ungefähr 3–4 logs des Virus pro 0.1 ml enthielt und wurde in 200 10–12-Tage alte SPF Embryos inokuliert. Die Embryos wurden bei 37°C gehalten. Vier Tage nach der Inokulation wurden die Embryos durchleuchtet und alle lebenden Embryos wurden für 2 Stunden bei 4°C gehalten. Dann wurde die Allantoisflüssigkeit geerntet. Insgesamt wurden 1340 ml Allantoisflüssigkeit mit 660 ml eines Stabilisa tors und 20 ml Gentocin gemischt. Dies wurde für 15 Minuten gemischt und in 10 ml fassende Glassgefässe, 2 ml pro Gefäss gegeben. Die Gefässe wurden dann gefriergetrocknet.
Zwei Gruppen von jeweils 30 ein-Tage-alten kommerziellen Fleischhühnern wurden mit dem NDV-C2 Stamm via der okulonasalen Route inokuliert.
Zwei Gruppen von jeweils 30 ein-Tage-alten kommerziellen Fleischhühnern wurden mit dem HVT-NDV/F-Stamm via der intramuskulären Route inokuliert.
Vier Gruppen von jeweils 30 ein-Tage-alten kommerziellen Fleischhühnern wurden mit dem HVT-NDV/F-Stamm via der intramuskulären Route und mit dem NDV-C2 Stamm via der okulonasalen Route inokuliert.
Im Alter von zwei und fünf Wochen würden 2 SPF Kontroll-Hühner desselben Alters zu jeder Challenge-Gruppe hinzugefügt.
Pro Inokulum wurde eine Gruppe der Hühner mit dem NDV Herts 33/56 Stamm via der intramuskulären Route einem Challenge ausgesetzt. Diese Hühner wurden über einen Zeitraum von zwölf Tagen auf das vorkommen von klinischen Symptomen der Newcastle Disease und/oder Mortalität überwacht.
Die anderen Gruppen wurden mit dem NDV Beaudette Stamm via der okulonasalen Route einem Challenge unterzogen. Sechs Tage nach dem Challenge wurden diese Hühner geopfert und deren Luftröhren wurden zur Virus Reisolierung entfernt.
Blutproben wurden bei einem Alter von einem Tag zur Bestimmung von Antikörpern gegen NDV im HI-Test gesammelt (der durchschnittliche HI-Titer war 10^6.4). In den Seren der fünf-Wochealten SPF Hühnern konnten keine Antikörper gegen NDV nachgewiesen werden.
Die Hühner wurden geimpft mit:

NDV-C2: 0.1 ml pro Huhn (7.6 log₁₀ EID₅₀ pro Dosis)

HVT-NDV/F 0.2 ml pro Huhn (±1200 PFU pro Dosis)
Die Hühner wurden einem Challenge unterzogen mit:

NDV Beaudette: 0.2 ml pro Huhn (7.6 log₁₀ EID₅₀ pro Dosis

NDV Herts 33/56 0.2 ml pro Huhn (7.6 log₁₀ EID₅₀ pro Dosis
Bestimmung des systemischen Schutzes
Für einen Zeitraum von zwölf Tagen nach dem Challenge mit dem NDV Herts Stamm wurden alle Hühner täglich auf das Vorkommen von Mortalität oder klinischen Anzeichen von Newcastle Disease beobachtet. Die Daten wurden täglich aufgezeichnet. Das Auswertungssystem war wie folgt:
0 : kein Vorkommen, von klinischen Anzeichen von Newcastle Disease
1 : Vorkommen von klinischen Anzeichen von Newcastle Disease Zentralnerven-Anzeichen:

– klonische Spasmen
– Muskelzittern
– Tortocollis
– Opisthotonus
– Paralyse der Beine, allenfalls der Flügel

Bestimmung des lokalen Schutzes
Alle Hühner, die mit dem NDV-Beaudette Stamm einem Challenge unterzogen wurden, wurden sechs Tage nach dem Challenge geopfert und deren Luftröhren wurden entfernt. Alle Luftröhren wurden gefroren in Tryptose 2.5% Brühe bei –70°C aufbewahrt bis die Virus-Reisolierung durchgeführt wurde.
Pro Luftröhre-Probe wurden 8–10 Eier via der Allantoishöhle inokuliert. Die Eier wurden für acht Tage bei +37°C in einem Ei-Inkubator unter Schütteln inkubiert. Es wurde angenommen, dass die Embryomortalität, die nach 24 Stunden nach der Inokulierung auftrat, eine Folge der NDV Replikation war.
Die Resultate betreffend den lokalen und systemischen Schutz, die zwei und fünf Wochen nach der Impfung erhalten wurden, sind in Tabelle 1 aufgezeigt.
Tabelle 1

ND: nicht durchgeführt

Der lebende NDV C2 Impfstoff erzeugte nur einen partiellen Schutz, sowohl systemisch wie auch lokal, in Gegenwart von hohen MDA-Werten. Ebenso erzeugte der monovalente HVT-NDV/F Impfstoff einen dürftigen lokalen (und systemischen) Schutz unter diesen Umständen.
Unerwartet war die Tatsache, dass nach der Verabreichung der NDV-C2 und HVT-NDV/F Kombination, im Vergleich zu den einzelnen Verabreichungen, sich sowohl der lokale wie auch der systemische Schutz aussergewöhnlich verbesserte.
Dieser synergistische Effekt macht die Kombination sicherlich zu einem guten Impfstoff Kandidat zur Impfung gegen NDV, insbesondere von ein-Tage-alten kommerziellen Fleischhühnern.
Beispiel 2
Wirksamkeit der kombinierten Verabreichung von HVT-NDV/HN oder FPV-NDV/F und lebendem NDV Impfstoff-Stamm C2 oder VG/GA
Beide Impfstoffe, die die milden lentogenen NDV Stämme C2 oder VG/GA umfassen, wurden auf ähnliche Weise wie der in Beispiel 1 beschriebene, auf NDV C2 basierende Impfstoff hergestellt. Der NDV Stamm VG/GA wird in US Patent Nr. 5,118,502 (ATTC Nr. VR 2239) beschrieben. Der HVT-NDV/HN Vektorimpfstoff wurde wie in Morgan et al. und Sondermeyer et al. (Beispiel 1) beschrieben hergestellt.
Das in Beispiel 1 beschriebene NDV F Gen wurde in eine nicht-essentielle Region in das Bam-HI J Fragment des FPV (Geflügelpocken Virus) Genoms wie in der internationalen Anmeldung WO 90/02191 offenbart eingefügt. Eine Expressionskassette enthaltend das F-Gen unter Kontrolle eines Vaccinia Promotors und ein LacZ Markergen wurde in vivo durch Transfektion der DNA in die FPV infizierten Hühnerzellen rekombiniert. Rekombinante wurden mittels bluo-gal Färbung identifiziert und bis zur Homogenität mittels aufeinanderfolgenden Runden von Plaque-Reinigung gereinigt. Die Expression des F-Gens wurde mittels Fluoreszenz-Färbung und Immunopräzipitation mit NDV spezifischen Antisera bestätigt.
140 kommerzielle Fleischhühner wurden zufallsmässig sieben Gruppen zugewiesen, so dass jede Gruppe 20 Hühner enthielt.
Weiteren 20 ein-Tage-alte Schlüpfgenossen wurde Blut entnommen und Seren wurden auf die Anwesenheit von Antikörper gegen NDV untersucht. Im Alter von einem Tag wurden die Hühner der Gruppe 1 mit dem NDV VG/GA Stamm inokuliert, die Hühner der Gruppe 2 wurden mit dem HVT-NDV/HN Stamm inokuliert, die Hühner der Gruppe 3 wurden sowohl mit dem NDV VG/GA Stamm wie auch mit dem HVT-NDV/HN Stamm inokuliert, die Hühner der Gruppe 4 wurden mit dem NDV-C2 Stamm inokuliert, die Hühner der Gruppe 5 wurden mit dem FPV-NDV/F Stamm inokuliert, die Hühner der Gruppe 6 wurden sowohl mit dem NDV-C2 Stamm wie auch mit dem FPV-NDV/F Stamm inokuliert und die Hühner der Gruppe 7 wurden nicht inokuliert und dienten als Kontrollen. Im Alter von 14 und 31 Tagen wurden von allen Hühnern individuell Blutproben gesammelt und Seren wurden auf die Abwesenheit/Anwesenheit von Antikörpern gegen NDV untersucht. Im Alter von 31 Tagen wurden alle Hühner einem Challenge mit dem NDV Herts Stamm unterzogen. Für einen Zeitraum von 10 Tagen nach dem Challenge wurden die Hühner täglich auf das Vorkommen von Mortalität beobachtet.
Behandlung
20 ein-Tage-alte Hühner der Gruppe 1 und Gruppe 3 wurden jeweils mit 0.1 ml NDV VG/GA-GA enthaltend 5.2 log₁₀ EID₅₀ infektiöse NDV Partikel via der okulären Route inokuliert.
20 ein-Tage-alte Hühner der Gruppe 4 und Gruppe 6 wurden jeweils mit 0.1 ml NDV C2 enthaltend 7.2 log₁₀ EID₅₀ infektiöse NDV Partikel via der okulären Route inokuliert.
20 ein-Tage-alte Hühner der Gruppe 2 und Gruppe 3 wurden jeweils mit 0.2 ml HVT-NDV-HN enthaltend 838 PFU infektiöse HVT Partikel via der intramuskulären Route inokuliert.
20 ein-Tage-alte Hühner der Gruppe 5 und Gruppe 6 wurden jeweils mit 0.2 ml FPV-NDV/F enthaltend 45000 PFU infektiöse FPV Partikel via der subkutanen Route inokuliert.
Im Alter von 31 Tagen wurden die Hühner einem Challenge mit 0.2 ml des NDV Stammes Herts enthaltend 7.4 log₁₀ EID₅₀ infektiöse NDV Partikel via der intramuskulären Route ausgesetzt.
Beobachtung auf klinische Symptome der Krankheit
Nach dem Challenge mit dem NDV Herts Stamm wurden die Hühner täglich über einen Zeitraum von 10 Tagen auf das Vorkommen von Mortalität beobachtet.
Serologie
Im Alter von 14 und 35 Tagen wurden von allen Hühnern individuell aus der Flügelvene Blutproben gesammelt.
Serumproben wurden im NDV HI-Test gemäss Standardverfahren auf Antikörper gegen NDV untersucht.
Die Wirksamkeit von sowohl monovalenten- wie auch Kombinationsimpfstoffen ist in Tabelle 2A und 2B aufgezeigt.
Tabelle 2A Serologie Resultate:
Tabelle 2B Prozent Schutz gegen einen intramuskulären NDV Herts Challenge im Alter von 31 Tagen:
Tabelle 1A zeigt, dass sowohl der milde lentogene NDV VG/GA Stamm wie auch der HVT-NDV/HN Impfstoff-Stamm nur eine geringe HI-Antikörper Antwort erzeugten, während der Kombinationsimpfstoff eine hohe synergistische Immunantwort erzeugte. Gleichermassen war der Schutz, der durch den Kombinationsimpfstoff, der sowohl den milden lentogenen NDV C2 Stamm wie auch den FPV-NDV/F-Vektor umfasste, erbracht wurde, höher als die Summe des Schutzes, die durch die monovalenten Impfstoffe erzeugt wurde.

Claims

Kombinationsimpfstoff zur Verwendung beim Schutz von Geflügel gegen Newcastle Disease (ND) umfassend eine Newcastle Disease Virus (NDV) immunogene Untereinheit oder einen heterologen Vektor, der fähig ist, ein NDV immunogenes Protein zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass der Impfstoff zusätzlich einen lebenden NDV Impfstoff-Stamm umfasst.
Kombinationsimpfstoff gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der heterologe Vektor ein lebender Virusvektor ist.
Kombinationsimpfstoff gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die NDV immunogene Untereinheit das Expressionsprodukt eines bakteriellen oder Insektenzellen-Expressionssystem ist.
Kombinationsimpfstoff gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die immunogene Untereinheit das Expressionsprodukt eines rekombinanten Baculovirus ist.
Kombinationsimpfstoff gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das lebende Vektorvirus ein Truthahn Herpesvirus (HVT) oder Geflügelpocken Virus (FPV) ist.
Kombinationsimpfstoff gemäss Ansprüchen 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die NDV immunogene Untereinheit oder Protein das Fusions (F)- oder Hemagglutinin-Neuramidinase (HN)-Protein ist.
Kombinationsimpfstoff gemäss Ansprüchen 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass der lebende NDV Impfstoff-Stamm ein milder, lentogener NDV Stamm ist.
Kombinationsimpfstoff gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der milde, lentogene NDV Stamm der C2 Stamm ist, der am CNCM des Institute Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Zulassungsnummer I-1614 hinterlegt ist.
Ein Impfkit zur Immunisierung von Geflügel gegen ND, wobei das Kit die folgenden Komponenten umfasst: a. eine NDV immunogene Untereinheit oder einen heterologen Vektor, der fähig ist ein NDV immunogenes Protein zu exprimieren, und b. einen lebenden NDV Impfstoff-Stamm, und c. gegebenenfalls einen Träger oder ein Verdünnungsmittel für Komponenten a und/oder b.
Ein Kit gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger oder das Verdünnungsmittel ein Adjuvans darstellt.
Verwendung einer NDV immunogenen Untereinheit oder eines heterologen Vektors, der fähig ist ein NDV immunogenes Protein zu exprimieren, als eine erste Komponente und einen lebenden NDV Impfstoff-Stamm als eine zweite Komponente zur Herstellung eines Impfstoffs für die kombinierte Verabreichung der Komponenten zum Schutz von Geflügel gegen Newcastle Disease.
Verwendung gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Komponente parenteral oder in ovo verab reicht wird und die zweite Komponente mittels einer Massenverabreichungsroute verabreicht wird.
Verwendung gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Komponente in ovo vor dem Ausschlüpfen verabreicht wird und die zweite Komponente den Vögeln in einem Alter von einem Tag verabreicht wird.