DE69227860T2

DE69227860T2 - Rekombinante Geflügelpockenvazzine zum Schutz gegen die Marek-Krankheit

Info

Publication number: DE69227860T2
Application number: DE69227860T
Authority: DE
Inventors: Lucy F. East Lansing Michigan 48823 Lee; Yi East Lansing Michigan 48823 Li; Keyvan Haslett Michigan 48840 Nazerian; Ryohei Yokohama-Shi Ogawa; Noboru East Lansing Michigan 48823 Yanagida
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd; US Department of Agriculture USDA
Current assignee: Zeon Corp; US Department of Agriculture USDA
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1992-06-24
Publication date: 1999-05-12
Anticipated expiration: 2012-06-25
Also published as: JPH0678764A; EP0520753B1; JP3045609B2; EP0520753A1; DE69227860D1; US5369025A; AU657962B2; AU1842092A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Vakzin, welches gegen die Marek-Krankheit schützt.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Marek-Krankheit (MD) ist eine hochansteckende neoplastische Krankheit des Haushuhns, welche Hühner weltweit befällt und hohe Sterblichkeit und Kondemnierung verursacht, wenn die Hühner nicht eines Tages geimpft werden. MD wird durch ein in hohem Maße zellassoziiertes onkogenes Herpesvirus, bekannt als Marek-Krankheit-Virus (MDV) verursacht.
Eine Anzahl von lebenden viruszellassoziierten Lebendimpfstoffen sind erhältlich, welche Hühner gegen MD schützen. Diese Impfstoffe werden in delikater zellassoziierter Form gehalten und Verabreicht. Diese Impfstoffe benötigen spezielle Handhabung und müssen in in flüssigem Stickstoff eingefrorenem Zustand gelagert und transportiert werden, um ihre Lebensfähigkeit und Wirksamkeit zu erhalten. Diese vorhandenen Impfstoffe müssen in zellassoziierter Form gehalten und verabreicht werden, eine Bedingung, welche kostspielig und umständlich ist.
Die bekannten Impfstoffe enthalten das gesamte MDV-Genom, einschließlich Sequenzen, welche die Induktion der Pathogenese betreffen. Obwohl die vorhandenen Impfstoffe gegen MD entweder geschwächt sind, oder natürlicherweise apathogen sind, ist es bekannt, daß Virusmutationen in Herpesviren auftreten, und es besteht eine Möglichkeit, daß virulente pathogene Mutanten in solchen Impfstoffen auftreten können. Solche Mutanten könnten weniger wirksam und sogar schädlich sein.
Churchill et al. Nature, 221:744-747 (1969) und Okazaki et al. Avian Dis., 14:413-429 (1970), entwickelten die ersten wirksamen und sicheren Impfstoffe gegen MD. Diese Impfstoffe wurden in den vergangenen 20 Jahren verwendet und verminderten Verluste der Geflügelindustrie weltweit. Weitere Kandidaten für Impfstoffe auf der Basis von natürlicherweise apathogenem Serotyp-2-MDV, Schat et al. J. Natl. Cancer Inst., 60, 1075-1082 (1978), oder frisch geschwächtem Serotyp-1-MDV, Rispens et al. Avian Dis., 16:108-125 (1972), und Kombinationen dieser Viren als bivalente Vakzine, Witter, Arian Dis., 81:252-257 (1987), halfen einen besseren Schutz gegen MD bereitzustellen. Alle diese Impfstoffe, außer dem Truthahn-Herpesvirus(HVT)-Impfstoff, erfordern Lagerung und Transport in in flüssigem Stickstoff gefrorenem Zustand und müssen als infizierte Zellen verabreicht werden, was schonende Verfahren erfordert, um eine Inaktivierung des Impfstoffs zu verhindern. Sogar im Fall des HVT-Impfstoffs wurden meistens zellassoziierte Viren verwendet, da sie wirksamer als zellfreier Virus in Gegenwart von maternalen Antikörpern sind, Witter et al. Avian Pathol., 8:145-156 (1978).
Rekombinante DNA-Technologie gestattete die Konstruktion rekombinanter Impfstoffe, welche nur diejenigen erwünschten viralen Gene oder Genprodukte enthalten, welche Immunität induzieren, ohne das Tier Genen, welche pathologische Störungen induzieren können, auszusetzen. Pockenviren, einschließlich das Vogelpockenvirus, insbesondere das Geflügelpockenvirus (FPV) stellen ausgezeichnete Modelle für solche Impfstoffe dar. Diese Viren besitzen ein großes DNA-Molekül mit zahlreichen nichtessentiellen Bereichen, welche die Insertion mehrerer immunogener Gene in das gleiche Virus zu dem Zweck multivalente Impfstoffe zu erzeugen, gestatten. Diese multivalenten Impfstoffe können sowohl eine zellvermittelte als auch eine Antikörpervermittelte Immunantwort in einem geimpften Wirt induzieren. Vakzinia-Virus (VV) wurde umfangreich für diesen Zweck verwendet, und eine Anzahl von VV-Rekombinanten wurden konstruiert, welche eine Vielfalt fremder Gene, einschließlich solcher, welche die Neutralisation von Antikörpern gegen Glykoproteine des Herpes simplex-Virus (HSV) Typ 1, hervorbringen, Blacklaws et al. Virology, 177:727- 736 (1990), exprimieren. Entsprechend gibt es eine Anzahl von Berichten, welche die Expression fremder Gene in rekombinantem FPV beschreiben, Boyle et al. Virus Res., 10:343-356 (1988) und Ogawa et al. Vakzine, 8:486-490 (1990).
MDV-Homologe des HSV-Gens, welches für die Glykoprotelne B, C, D, H, und I (gBh, gCh, gDh, gHh und gIh) codieren, wurden kürzlich cloniert und sequenziert, Coussens et al. J. Virol., 62:2373-2379 (1988), Ross et al. J. Gen. Virol., 70:1789-1804 (1989), Ross et al. J. Gen. Virol., 72:939-947 (1991), Ross et al. Europäische Patentanmeldung Internationale Veröffentlichung Nr. WO 90/02803 (1990).
WO 90/02803 betrifft ein rekombinantes Truthahn-Herpesvirus (HVT), welches (entweder in dem HVT-Homologen des HSV gC-Gens, dem RiboNukleotidreductase-Gen oder dem Thymidinkinase-Gen) ein Gen, welches für ein MDV-Antigen codiert, trägt. Die Verwendung von MDV-Homologen der HSV gB-, gC-, gD- und gH-Glykoproteine und der IE-68 und IE-175 unmittelbar frühen Gene wurde vorgeschlagen. Die Wirksamkeit oder irgendetwas anderes der vorgeschlagenen HVT-Impfstoffe wurde beschrieben.
WO 89/12684 betrifft ein rekombinantes FPV, welches in einem nichtessentiellen Bereich ein Gen aus dem Virus (NDV), welches die Newcastle-Krankheit verursacht, trägt. Alle Beispiele betreffen die Konstruktion rekombinanter Viren, welche das NDVF- und das HN-Gen tragen. Einzelheiten der Experimente zeigen anscheinend auch, daß Vögel, welche mit den FPV-NDV-Rekombinanten immunisiert wurden, durch eine NDV-Exposition nicht affiziert wurden.
EP-A1-0314569 betrifft ein rekombinantes FPV, welches in einem nichtcodierenden Bereich ein Gen für das F-Protein des Virus, welches Masern ("rotes Gesicht") verursacht, trägt. Es wird keine Offenbarung betreffend die in-vivo- Wirksamkeit eines solchen rekombinanten Virus gemacht.
EP-A3-0513921 ist eine Druckschrift unter Artikel 54(3) EPÜ. Es betrifft rekombinante Impfstoffe gegen die Marek- Krankheit. In der Hauptsache betrifft die Druckschrift die Verwendung eines rekombinanten Proteins als ein Immunogen, aber es wird Bezug genommen auf einen Impfstoff, umfassend ein rekombinantes Truthahn-Herpesvirus (HVT), welches ein Gen, welches für ein MDV-Antigen codiert, trägt. Keine Offenbarung betreffend die in-vivo-Wirksamkeit entweder der MDV-Proteine oder der HVT-Rekombinanten, welche Gene tragen, welche für MDV-Polypeptide codieren, wird gemacht.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, einen neuen wirksamen und sicheren Impfstoff gegen MD bereitzustellen, welcher die Hühner nur dem immunogenen Genprodukt/den immunogenen Genprodukten des MDV aussetzt und sie dagegen immunisiert ohne Exposition seiner pathogenen Genprodukte. Der neue erfindungsgemäße Impfstoff, welchem eine Sequenz fehlt, welche zu den pathogenen Elementen von MDV gehört, ist in zellfreier Form verfügbar und induziert wirksam eine Immunität gegen virulente MD. Dieser ist viel erstrebenswerter als die vorhandenen Impfstoffe.
Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, einen zellfreien Impfstoff gegen MD, enthaltend rekombinantes (rec) FPV, welcher unter normalen Bedingungen lyophilisiert, gelagert und verwendet werden kann, bereitzustellen, wodurch kostspielige und schwierige Verfahren zur Lagerung des Impf stoffs in flüssigem Stickstoff, die delikate Handhabung und Verabreichung, welche bei den vorhandenen zellassoziierten MD-Impfstoffen notwendig sind, überflüssig gemacht werden. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann z. B. nach Lyophilisierung gelagert, gehandhabt und bei Raumtemperatur (20-22ºC) transportiert und über längere Zeiträume bei 4ºC gelagert werden. Der Impfstoff kann auch in gefrorenem Zustand gelagert werden, wobei das zellfreie rekombinante Virus in einer wässrigen Lösung vorliegt, welche gefroren ist, und bei z. B. -20ºC oder -70ºC gelagert wird.
Die Erfindung betrifft die Entwicklung eines neuen rekombinanten FPV-Impfstoffs, welcher ein Gen, welches für ein Glykoprotein-B-Homologes (gBh) von MDV codiert, enthält, dieses gBh-Gen in Zellkultur exprimiert, und einen starken Schutz gegen MD im natürlichen Wirt (Huhn) bewirkt, wenn es als ein zellfreies Material verabreicht wird. Außerdem schützt der Impfstoff auch gegen Geflügelpocken.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, rekombinante FPV-Impfstoffe gegen MD bereitzustellen, bei denen das gBh-Gen von MDV sowie andere MDV-Gene, wie diejenigen, welche für ein Glykoprotein-C-Homologes, ein Glykoprotein- D-Homologes, Hüllproteine, und Glykoproteine aus anderen Serotypen von MDV codieren, in FPV insertiert sind, zu dem Zweck, einen Breitspektrumimpfstoff, welcher gegen mehrere Isolate von MDV wirksam ist, zu erzeugen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt die Konstruktion des Insertionsvektors pNZ1729R;
Fig. 2 zeigt die Sequenzen von 10 Oligonukleotiden (SEQ. ID. No. 1-10), welche für die Konstruktion des pNZ1729R- Insertionsvektors verwendet wurden;
Fig. 3 zeigt die Stufen, in denen das MDV gBh aus dem HSV-Gen cloniert wurde;
Fig. 4 zeigt die Konstruktion des Transfervektors pNZ29RMDgB-S; und
Fig. 5 zeigt die Immunpräzipitation von Zellen, welche mit rec.FPV/MDVgBh oder mit einem GA-Stamm von MDV infiziert sind.
Die Entwicklung des rekombinanten FPV, welcher das Antigen-Gen von MDV exprimiert und die Hühner gegen MD schützt, schließt ein Mehrstufenverfahren ein, welches folgendes umfaßt: 1) Konstruktion eines Insertionsvektors unter Verwendung eines nichtessentiellen Bereichs von FPV- DNA, welcher in einen Vektor cloniert wird; 2) Clonierung und Sequenzierung des MDV gBh-Antigen-Gens; 3) Konstruktion eines Transfervektors, welcher das gBh-Antigen-Gen und das Markergen in entgegengesetzten Richtungen und unter der Kontrolle unterschiedlicher Pockenviruspromotoren einschließt; 4) Transfektion von FPV infizierten Wirtszellkulturen mit diesem Transfervektor, Erzeugung von Rekombinanten und Reinigung der Rekombinanten, welche Markergen exprimieren; 5) Nachweis der Expression des MDV gBh-Antigens in Wirtszellkulturen, welche mit dem rekombinanten FPV infiziert sind; und 6) Nachweis des vollen Schutzes, welcher durch das rekombinante FPV-Vakzin gegen Tod und Tumore, verursacht durch virulentes Tumor-erzeugendes MDV, offeriert wird. gBh beschützt den Wirt sehr gut gegen sehr virulente Stämme von MDV, wie Md5.
Jeder Virus ist als FPV bei der Erfindung verwendbar, sofern es zur Gattung FPV in einem weiten Sinn klassifiziert wird, aber es werden solche bevorzugt, welche in Zellen von Geflügel, wie Huhn, Truthahn, Ente, etc. wachsen können. Spezifische Beispiele schließen FPV in einem engen Sinn ein, wie ATCC VR-251, ATCC VR-250, ATCC VR-229, ATCC VR-249, ATCC VR-288, Nishigawara-Stamm, Shisui-Stamm, CEVA-Stamm, etc.; und solche, welche mit FPV in einem engen Sinne verwandt sind und als Stamm für Geflügel-Lebendimpfstoffe verwendet werden, wie den NP-Stamm (Hühnerembryo-habitualisierter Nakano-Stamm von Taubenpockenvirus), etc.. Diese Stämme sind alle kommerziell verfügbar und leicht zugänglich.
Jeder DNA-Bereich ist bei der Erfindung als nichtessentieller Bereich verwendbar, sofern er nicht essentiell für die Proliferation von FPV ist. Spezifische Beispiele für den nichtessentiellen Bereich schließen Bereiche ein, welche homologe Rekombination mit dem EcoRI-Fragment (etwa 7,3 kbp), dem HindIII-Fragment (etwa 5,2 kbp), dem EcoRI- HindIII-Fragment (etwa 5,0 kbp), dem BamHI-Fragment (etwa 4,0 kbp), etc. der DNA des NP-Stammes und dergleichen verursachen.
Jeder Vektor ist als Vektor bei der Konstruktion des Insertionsvektors zur Verwendung als das Vehikel, um das gBh-Antigen-Gen von MDV in FPV zu überführen, verwendbar. Spezifische Beispiele für den Vektor schließen ein Plasmid, wie pBR322, pBR325, pUC7, pUC8, pUC18, etc.; einen Phagen, wie λ-Phage, M13-Phage, etc.; ein Cosmid, wie pHC79, etc., ein.
Das rekombinante FPV mit einem gBh-Gen kann zusätzlich ein Gen, welches für ein weiteres Antigen-Gen von MDV z. B. ein Gen, welches für gCh codiert, ein Gen, welches für gDh codiert, ein Gen, welches für gHf codiert, ein Gen, welches für gIh codiert, ein Hüllgen, etc. und Varianten davon umfassen.
Jedes Markergen ist bei der Erfindung als Markergen verwendbar, sofern es in Wirtszellen exprimierbar ist. Spezifische Beispiele für das Markergen schließen das lacZ-Gen von E. coli., das Ecogpt-Gen, etc. ein.
Jede Wirtszelle ist bei der Erfindung als FPV-Wirtszelle verwendbar, sofern FPV dort wachsen kann. Spezifische Beispiele sind Hühnern entstammende Kulturzellen, wie Hühnerembryofibroblasten, etc. Ferner ist naturgemäß auch Hühner-Chorionallantoismembran in der Gruppe der Wirtszellen eingeschlossen.
Jeder Promotor ist bei der Erfindung als Promotor für das Antigen-Gen verwendbar, sofern er in der Wirtszelle funktioniert. Spezifische Beispiele für den Promotor schließen den Promotor des Vakzinia-Virusgens, welches für ein 7,5 K-Polypeptid codiert, den Promotor des Vakzinia-Virusgens, welches für ein 11 K-Polypeptid codiert, den Promotor des Vakzinia-Virusgens, welches für das Thymidinkinasepolypeptid codiert, etc.; einen synthetischen Pockenvirusprometor, einschließlich des frühen Promotors und des späten Promotors etc., und Varianten davon, etc. ein. Bevorzugte Promotoren sind der synthetische Pockenviruspromotor einschließlich des frühen Promotors und des späten Promotors (A. J. Davidson et al., J. Mol. Biol., 215, 749-769 und 771-794 (1989)) und solche Varianten (die Basensequenz des synthetischen Pockenviruspromotors ist z. B. TTTTTTTTTTTTT GGCATATAAATAATAAATACAATAATTAATTACGCGTAAAAATTGAAAiACTATTCTA ATTTATTGCACTC).
Ein Beispiel für den Insertionsvektor zur Verwendung als Vehikel, um das gBh-Gen von MDV in FPV zu überführen, ist pNZ1729R. Dieser Insertionsvektor wurde durch vielfache molekulare Manipulation eines clonierten nichtessentiellen Bereichs der FPV-DNA, Yanagida et al. Europäische Patentanmeldung Nr. 0 284 416 (1988) und Insertion eines bakteriellen lacZ-Gens als Reportergen und Erzeugung einer multiplen Clonierungsstelle zur Insertion fremder Gene in diesen Bereich der FPV-DNA abgeleitet. Ein 3,0 Kilobasen(kb)Paarfragment der FPV-DNA wurde in eine geeignete Clonierungsstelle des bakteriellen Plasmids pUC18 cloniert. Das resultierende Konstrukt wurde durch mehrere Re striktionsendonuclease(RE)-Verdauungen, Religation und Insertion einer multiplen Clonierungsstelle verändert. Das beta-Galactosidase-Gen (lacZ) von E. coli wurde in eine singuläre RE-Stelle dieser FPV-DNA insertiert, nachdem es mit einem Pockenviruspromotor, gefolgt von einem ATG-Initiationscodon, verbunden und mit einem Transkriptionsterminationssignal des frühen Pockenviruspromotors, terminiert worden war, Yuen et al. PNAS USA, 84:6417-6421 (1987). Als dieses Konstrukt in FPV infizierte Zellen transfiziert wurde, wurden rekombinante Viren gebildet, welche das Produkt des lacZ-Gens herstellten; die beta-Galactosidase, welche ihrerseits in Gegenwart des Blu-o-gal- Substrats blaue Plaques hervorrief.
In getrennten Experimenten wurde das MDV-gBh-Genhomologe des HSV-gB-Gens in das bakterielle Plasmid pUC18 cloniert. Die Nukleotidsequenz dieses Gens wurde durch Analyse eines Satzes von Deletionsmutanten mit Hilfe der Didesoxykettenabbruchsreaktion, Sanger et al. PNAS USA, 74:5463-5467 (1977) bestimmt. Eine dieser Mutanten (pUCgBdB13), über die herausgefunden wurde, daß sie den gesamten codierenden Bereich von MDVgBh enthält, wurde für die Konstruktion des Transfervektors pNZ29RMDgB-S verwendet. Stellenspezifische Mutagenese, Tsurushita et al. Gene, 62:135-139 (1988) wurde dazu verwendet, ein potentielles Pockenvirussignal für frühe Transkriptionstermination, Yuen et al. PhTAS USA, 84:6417-6421 (1987), in dem gBh-Gen von MDV zu verändern, ohne die Aminosäure des Translationsprodukts zu ändern. Außerdem wurde eine Anzahl molekularer Verfahren einschließlich RE-Verdauung, Ligation, stellenspezifische Mutation, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit geeigneten Primern angewendet, um das gBh-Gen von MDV in geeigneter Weise aus der Mutante pUCgBdB13 in den pNZ1729R-Insertionsvektor zu insertieren, um den Transfervektor pNZ29RMDgB-S zu erzeugen.
Gereinigtes pNZ29RMDgB-S-Plasmid wurde verwendet, um CEF- Kulturen, infiziert mit einem große Plaques bildenden Phänotyp, isoliert aus einem FPV (CEVA-Stamm)-Vakzin zu transfizieren, und die Virusnachkommen, welche von diesen Zellen freigesetzt wurden, wurden auf rekombinantes Virus, welches in Gegenwart von Blu-o-gal blaue Plaques bildet, untersucht. Rekombinanten wurden gereinigt und auf Stabilität, Struktur der viralen DNA, Expression von lacZ und Synthese des gBh-Antigens von MDV in Zellkultur geprüft. Gereinigte Rekombinanten produzierten beta-Galactosidase (blaue Plaques) und das gBh-Antigen, wie durch Immunfluoreszenz(IF)- oder Immunpräzipitationsassays unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers spezifisch für das MDV gBh-Antigen oder eines reconvaleszenten Serums aus einem MDV-infizierten Huhn getestet. Drei identische Banden von 100 kd, 60 kd und 49 kd Molekulargewicht wurden in Extrakten von Zellen, welche mit rec.FPV/MDVgBh und MDV infiziert waren, beobachtet. Es wurde auch gezeigt, daß diese Polypeptide glykosyliert sind. Ähnliche Glykoproteine wurden mit dem gleichen monoclonalen Antikörper im MDV "B-Antigen-Komplex" identifiziert und als gP100, gP60 und gP49, Sithole et al. J. Virol., 62:4270-4279 (1988) bezeichnet. Unser Befund ist der erste klare Nachweis, daß das MDV gBh-Gen für diese drei Glykoproteine bezeichnet als der "B-Antigen-Komplex" codiert.
Drei Wochen alte Hühner wurden mit dem rekombinanten FPV, welche das MDV gBh-Antigen exprimiert, geimpft, und Seren von diesen Hühnern wurden auf die Gegenwart von Antikörpern gegen MDV infizierte Zellen in Kultur untersucht. Positive Antikörper gegen MDV gBh-Antigen wurden in diesen Seren gefunden, was aufzeigt, daß das MDV gBh-Gen wirksam in dem Huhn exprimiert wurde und eine Immunantwort induzierte.
Getrennte Gruppen nichtgeimpfter Hühner wurden eines Tages mit parentalem FPV, rekombinantem FPV (rec.FPV), welcher das MDV gBh-Antigen exprimierte oder einem herkömmlichen MD-Vakzin (HVT) geimpft. Alle Gruppen wurden später einem tumorigenen GA-Isolat von MDV ausgesetzt. Hühner, welche mit rec.FPV geimpft worden waren, sowie solche, welche mit HVT geimpft worden waren, waren vollständig gegen MD geschützt, wohingegen nichtgeimpfte Kontrollhühner und diejenigen, welche mit parentalem FPV geimpft worden waren, starben oder MD-spezifische Tumore hatten.
Ähnliche Impfversuche wurden durchgeführt, um die Wirkung der Vakzindosis, der Impfart und der Promotorstärke auf die Immunität gegen MD und die Fähigkeit von rec.FPV/MDVgBh gegen sehr virulente Stämme von MDV zu schützen, zu bestimmen. Hühner, welche mit einer Dosis von 10&sup4; PFU von rec.FPV/MDVgBh geimpft worden waren, waren gegen die Exposition von drei unterschiedlichen getesteten Stämmen von MDV geschützt. Die Impfart, intramuskulär (IM), intraabdominal (IA) oder Impfung IM und IA schien das Schutzniveau nicht zu verändern, da alle Hühner aus jeder Gruppe vollständig gegen MD geschützt waren. Wir erzeugten ein weiteres rec.FPV (rec.FPV/MDVgBh-P7,5), welches das MDVgBh-Gen unter der Kontrolle des Promotors (P7,5) des 7,5 kd-Proteingens von Vakziniavirus, Ventakesan et al. Cell, 125:805-813 (1981) exprimierte, und testeten seine Fähigkeit gegen MD zu schützen im Vergleich zum rec.FPV/MDVgBh, welches durch einen synthetischen Pockenviruspromotor (Ps) gesteuert wurde. Das rec.FPV/MDVgBh- P7,5 ergab auch eine gute schützende Immunität gegen MD, aber nicht so gut wie diejenige, welche durch Impfung mit rec.FPV/MDVgBh, gesteuert durch den synthetischen Pockenviruspromotor, erhalten wurde. Wir zeigten auch die Fähigkeit von rec.FPV/MDVgBh gegen zwei sehr virulente Stämme von MDV zu schützen (RB1B; Schat et al. Avian Pathol., 11:593-605 (1982) und MdS; Witter et al. Avian Dis., 24:210-232 (1980))
Der erfindungsgemäße zellfreie Impfstoff kann mittels einer Vielfalt von Verfahren hergestellt werden. Z. B. wird eine Zellkultur, in der das erfindungsgemäße rekombinante Virus wachsen und replizieren kann, mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Virus infiziert. Die Zellkultur wird dann inkubiert, bis das Virus eine Gelegenheit hatte, in der Zellkultur zu replizieren. Die Zellen werden dann geerntet und aufgeschlossen. Die Zelltrümmer können dann zentrifugiert werden, wobei sich ein Zelltrümmersediment am Boden des Zentrifugenröhrchens und ein zellfreier Überstand mit wesentlich höherem Titer, enthaltend das rekombinante Virus, bildet. Der zellfreie Überstand, welcher hauptsächlich aus dem Zellkulturmedium und dem rekombinanten FPV besteht, wird dann als ein Impfstoff, enthaltend das rekombinante Virus, verwendet. Bei einer Alternative wird der zellfreie Überstand lyophilisiert, um einen lyophilisierten Impfstoff herzustellen, welcher vor Gebrauch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, wie physiologische Kochsalzlösung, wiederhergestellt wird.
Der erfindungsgemäße Impfstoff kann Hühnern auf jede Weise, welche zuläßt, daß das rekombinante Virus in dem Impfstoff die Hühner infiziert und eine schützende Immunantwort erzeugt, verabreicht werden. Der Impfstoff kann Hühnern z. B. subkutan (s. c.) durch Abschürfen der Haut oder Injektion mit einer Nadel oder einem anderen Hilfsmittel, welches das Virus enthält, appliziert werden. Das rekombinante Virus kann auch zur oralen Verabreichung im Trinkwasser der Hühner aufgelöst oder suspendiert werden. Das Virus kann auch mit einem festen Träger (z. B. Hühnerfutter) zur oralen Verabreichung vermischt werden. Andere Verabreichungsarten, wie Inhalation durch Verwendung eines Aerosols oder eines Sprays, intravenöse Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung, intraperitoneale Verabreichung, Verabreichung in Flügelgewebe, etc. werden auch erwogen.
Eine bevorzugte Injektionsdosis scheint 10&sup4; Plaque-bildende Einheiten (plaque forming units; PFU) pro Huhn in 0,1 ml physiologisch verträglicher flüssiger Träger zu sein. Demgemäß soll die injizierbare Lösung 10&sup5; PFU/ml Träger, üblicherweise von 10&sup4; bis 10&sup6; PFU/ml, Träger enthalten. Die Dosis und die Art der Verabreichung sollten so ausgewählt werden, daß eine schützende Immunantwort hervorgerufen wird.
Wie oben ausgeführt, kann das erfindungsgemäße rekombinante Virus andere MDV-Antigen-Gene zusätzlich zu dem gBh- Gen, z. B. ein oder mehrere Antigene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glykoprotein-C-Homologem, Glykoprotein-D-Homologem, Glykoprotein-H-Homologem und Hüllproteinen, enthalten. Bei einer Alternative können mehrere rekombinante Viren in dem Impfstoff eingeschlossen sein, wobei jedes einzelne Virus ein einziges Gen exprimiert. Es wird angenommen, daß durch die Exposition der Hühner mit mehreren Antigenen des Marek-Krankheit-Virus, welche eine Immunantwort hervorrufen, ein verbesserter Schutz erreicht werden kann.
Zusätzlich zu den oben genannten spezifischen Glykoproteinen wird erfindungsgemäß auch ins Auge gefaßt, daß Fragmente der Gene, welche für die oben genannten Antigene codieren, oder Varianten der Gene, welche für Varianten der oben genannten Antigene codieren, auch nützlich sein können, sofern das resultierende Protein (Antigen) eine schützende Immunantwort hervorruft. Es wird erwartet, daß solche Fragmente oder Varianten für Proteine (Antigene) codieren würden, welche im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die natürlichen Proteine besitzen, so daß dadurch eine im wesentlichen gleichwertige Immunantwort in dem Wirt hervorgerufen wird. Die Fragmente oder Varianten codieren üblicherweise für ein Protein, welches mehr als 80%, vorzugsweise mehr als 90%, und mehr bevor zugt mehr als 95% Homologie zu dem natürlichen Protein besitzt.
Das erfindungsgemäße rekombinante Virus besitzt das Gen für das Antigen, welches in das Virus insertiert wurde, unter der Kontrolle geeigneter Promotoren, Terminatoren, etc., so daß der Virus, nachdem es eine Wirtszelle inifiziert hat, das Protein (Antigen) exprimieren kann, und dadurch eine Immunantwort in dem Wirt hervorruft. Ps, welches ein starker synthetischer Pockenviruspromotor ist, welcher hohe Expressionsniveaus sowohl während der frühen als auch der späten Infektionsstadien erzeugt, ist besonders nützlich. Der Promotor P7,5 ist auch nützlich. Andere Pockenviruspromotoren können auch verwendet werden.

BEISPIEL 1

Konstruktion des Insertionsvektors pNZ1729R (Fig. 1)

Ein 3,0 kb HpaI-SpeI-Fragment aus einem 7,3 kb EcoRI-Fragment des FPV NP-Stamms, Yanagida et al. Europäische Patentanmeldung Nr. 0 284 416 (1988), wurde in pUC18 in mehreren Stufen auf herkömmliche Weise subcloniert. Nach Entfernen aller multipler Clonierungsstellen von beiden Verbindungsbereichen zwischen pUC18 und FPV-DNA wurde eine multiple Clonierungsstelle (HindIII-EcoRI 52 bp aus pUC18) in zwei benachbarte EcoRV-Stellen in dem clonierten FPV- Fragment mit Linkem (HindIII-Linker; 5'-CAAGCTTG-3', EcoRI-Linker; 5'-GGAATTCC-3') eingefügt, um pNZ133SR herzustellen.
Ein 3,5 kb EcoRI-HindIII-Fragment (gezeigt in Fig. 1 rechts Mitte) wurde durch Ligieren-Assoziieren der Oligonukleotide 1 (SEQ. ID. NO. 1) und 2 (SEQ. ID. NO. 2) (Fig. 2; enthaltend einen Geflügelpockenpromotor, gefolgt von einem ATG-Codon für lacZ), an ein lacZ-Gen (aus pMC1871 und pMA001), Shirakawa et al. Gene, 28:127-132 (1984), und Assoziieren der Oligonukleotide 3 (SEQ. ID. NO. 3), 4 (SEQ. ID. NO. 4), 5 (SEQ. ID. NO. 5), 6 (SEQ. ID. NO. 6), 7 (SEQ. ID. NO. 7), 8 (SEQ. ID. NO. 8), 9 (SEQ. ID. NO. 9) und 10 (SEQ. ID. NO. 10) (Fig. 2; enthaltend einen synthetischen Pockenviruspromotor, gefolgt von einer multiplen Clonierungsstelle und einem bidirektionalen Terminationssignal der frühen Pockenvirustranskription (SEQ. ID. NO. 11), Yuen et al. PNAS, 88:6417-6421 (1989)) abgeleitet. Das 3,5 kb EcoRI-HindIII- Fragment wurde in pNZ133SR eingefügt, um den pNZ1729R-Insertionsvektor herzustellen.

BEISPIEL 2

Clonierung des MDV gBh-Gens (Fig. 3)

Das MDV gBh von HSV aus einem BamHI I3- (5,2 kb) und einem K3-(3,6 kb)Fragment vom MDV GA-Stamm wurden in das pUC18- Plasmid cloniert. Ein 2,8 kb BamHI-SalI-Subfragment aus dem I3-Fragment und ein 1,1 kb BamHI-EcoRI-Subfragment aus dem K3-Fragment wurden mit einem EcoRI-, SalI-verdauten pUC18 ligiert.
Die Gesamtsequenz des putativen MDV gBh wurde durch Sequenzierung eines Satzes Deletionsmutanten mittels des Sanger-Didesoxykettenabbruchverfahrens, Sanger et al. PNAS USA, 74:5463-5467 (1977), bestimmt. Es wurde herausgefunden, daß die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen (SEQ. ID. NO. 12 und 13) identisch mit den publizierten Sequenzen des gBh vom RB1B-Stamm von MDV, Ross et al. J. Gen. Virol., 70:17B9-1804 (1988), sind.

BEISPIEL 3

Konstruktion des Transfervektors DNZ29RMDgB-S (Fig. 4)

Eine der Deletionsmutanten zur Sequenzierung des MDV gBh- Gens, bezeichnet als pUCgBdB13, welche den gesamten codierenden Bereich des gBh mit etwa 250 bp 5'-flankierendem Bereich enthielt, wurde für die Insertion in den Insertionsvektor pNZ1729R ausgewählt.
Das Plasmid pLELR, welches von pNZ1037 abgeleitet wurde, Ogawa et al. Vakzine, 8:488-490 (1990), mit einem synthetischen Adapter
5'-CGAATTCGTCGAC-3' (SEQ. ID. NO. 14)
3'-TCGAGCTTAAGCAGCTGTTAA-5' (SEQ. ID. NO. 15)
um eine SalI-Stelle neben der EcoRI-Stelle zu erzeugen, wurde mit SmaI und EcoRI verdaut und mit einem 1,9 kb Hind III-(Klenow-glattem)-BamHI-Fragment und einem 1,1 kb Bam- HI-EcoRI-Fragment, beide aus pUCgBdB13, ligiert. Stellenspezifische Mutagenese wurde verwendet, um etwa 250 bp 5'-flankierenden Bereich zu entfernen und ein potentielles frühes Transkriptionsterminationssignal aus Pockenvirus in dem gBh-Gen von pUCgB7,5 (TTTTTTT; Nukleotide 382-388 in SEQ. ID. NO. 12) zu TATTTTT zu verändern. Oligonukleotide für die stellenspezifische Mutagenese von (P7,5-gB) waren ein 34mer; Oligonukleotid (SEQ. ID. NO. 16) und für die stellenspezifische Mutagenese von (TTTTTTT) ein 26mer; (SEQ. ID. NO. 17).
Um eine neue BamHI-Stelle vor dem Translationsinitiationscodon (ATG) von gBh zu erzeugen, um das gBh-Gen mit einem synthetischen Promotor zu verbinden, wurde eine PCR mit synthetischen Oligonukleotiden (SEQ. ID. NO. 18) und (SEQ. ID. NO. 19) durchgeführt.
Ein etwa 200 bp BamHI-XbaI-Fragment aus dem PCR-Produkt wurde mit einem 2,7 kb XbaI-SalI-Fragment von gBh und einem BamHI, SalI-verdauten Vektor pNZ1729R ligiert, um den Transfervektor pNZ29RMDgB-S herzustellen.

BEISPIEL 4

Erzeugung und Reinigung von rekombinantem FPV/MDVgBh

CEF-Kulturen, vermehrt als Monoschichten, wurden mit 0,1- Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection; moi) eines Virus mit einem große-Plaques-Phänotyp, isoliert aus einer Vakzinpräparation von FPV, infiziert. 3 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen durch Trypsinierung dispergiert und in Suspension gebracht. 2 · 10&sup7; Zellen aus dieser Suspension wurden mit 10 Mikrogramm (ug) Transfervektor pNZ29RMDgB-S in einem Zell-Porator (Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD) entsprechend den Erläuterungen des Herstellers vermischt. Das Gemisch aus der Zellsuspension und der Transfervektor-DNA in 0,8 ml Saline G, enthaltend 0,14M NaCl, 0,5 mM KCl, 1,1 mM NalHPO&sub4;.12 H&sub2;O, 1,5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 mM MgCl&sub2;.6 H&sub2;O und 0,011% Glucose, wurde einer Elektroporation mit einem elektrischen Feld von 300 V · cm&supmin;¹ bei Raumtemperatur unter Verwendung von 330 uF Kapazitanz unterzogen. Die transfizierten Zellen wurden dann für 72 Stunden (h) bei 37ºC inkubiert, und wurden dann durch drei Zyklen von Gefrieren und Tauen lysiert. Das freigesetzte Virus wurde dann auf Rekombinanten wie folgt durchgemustert.
Sekundäre CEF-Kulturen wurden mit serial zehnfacher Verdünnungen das Virusnachkommen aus den Lysaten infiziert und mit 10 ml Agarlösung, enthaltend Wachstumsmedium, überschichtet und bei Raumtemperatur erstarren gelassen und bei 37ºC inkubiert, bis typische FPV-Plaques erschienen. Eine weitere Agarüberschichtung, enthaltend 250 ug/ml von Blu-o-gal (BRL) wurde auf jede Platte gegeben und für weitere 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. Blaue Plaques erschienen mit einer Häufigkeit von etwa 1% der gesamten Virusnachkommen. Diese blauen Plaques wurden aus dem Agar entfernt, und das rekombinante aus diesem Agar freige setzte Virus wurde in der gleichen Weise weitergereinigt, bis alle FPV-Plaques blaue Plaques bildeten, wenn sie in Gegenwart von Blu-o-gal untersucht wurden. Dieses Verfahren erforderte üblicherweise nur drei Passagen. Das gereinigte rekombinante Virus wurde rec.FPV/MDVgBh genannt. Die DNA aus diesem rec.FPV/MDVgBh wurde durch Southern blot- Hybridisierung analysiert, und es wurde gefunden, daß sie das MDVgBh- und das lacZ-Gen an den erwarteten Positionen enthielt. Das Virus rec.FPV/MDVgBh wurde bei der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U. S. A.) am 20. Juni 1991 hinterlegt, und ihm wurde die Hinterlegungsnummer ATCC-VR-2330 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags zugeordnet.

BEISPIEL 5

Expression des MDV gBh-Antigens in Zellkultur

Um zu zeigen, daß rec.FPV/MDVgBh das gBh-Antigen synthetisiert, wurden CEF-Kulturen, welche mit diesem Virus infiziert waren, durch IF unter Verwendung von Antikörpern, welche spezifisch gegen die des Antigens gezüchtet wurden, untersucht. Die mit rec.FPV/MDVgBh infizierten CEF-Kulturen wurden bei 37ºC inkubiert, bis typische FPV-Plaques entwickelt wurden. Diese Kulturen wurden in kaltem Aceton fixiert, dann mit geeigneten Verdünnungen von reconvaleszentem Hühnerserum gegen den GA-Stamm von MDV oder einem monoclonalen Antikörper spezifisch für das MDV gB-Antigen, Silva et al. Virology, 136:307-320 (1984), umgesetzt. Diese Kulturen wurden dann mit Fluorescein, konjugiert mit Anti-Huhn- oder mit Anti-Maus-Immunglobulinen umgesetzt, und nach gründlichem Waschen, um nichtspezifische Färbung zu entfernen, wurden sie mit einem Mikroskop bei ultravioletter (UV) Beleuchtung untersucht. Mit nichtrekombinantem parentalem FPV infizierte CEF-Kulturen wurden in ähnlicher Weise angefärbt. Eine spezifische cytoplasmatische Färbung der Zellen wurde in Kulturen, welche mit dem rec.FPV/MDVgBh infiziert wurden, und nicht in Kulturen, welche mit dem nichtrekombinanten parentalen FPV infiziert wurden, beobachtet. Diese Beobachtungen zeigten deutlich, daß das rekombinante Virus das Produkt des gBh-Gens von MDV in Zellkulturen synthetisieren kann.
Die Western-Blot-Analyse der Proteine aus mit rekombinantem FPV infizierten Zellen ergab nicht die erwarteten Glykoproteinbanden, assoziiert mit dem gBh-Gen, wenn die Lysate in Puffer, wie unter normalen Bedingungen des Assays, gekocht wurden. Als jedoch mit Probenpuffer bei Raumtemperatur anstatt 100ºC solubilisiert wurde, wurde eine Bande mit hohem Molekulargewicht mit einem Rf-Wert, ähnlich dem in Lysaten von MDV-infizierten Zellen, solubilisiert bei Raumtemperatur, nachgewiesen. Um die drei Arten Glykoproteine, von denen zuvor gezeigt wurde, daß sie mit dem MDV "B-Antigen-Komplex" assoziiert sind, deutlich zu zeigen, wurde die Expression des gBh-Gens durch Immunpräzipitation untersucht, wie von Silva et al. Virology, 136:307-320 (1984) beschrieben. Sekundäre CEF-Kulturen, welche entweder mit parentalem oder rekombinantem FPV mit einer moi von 15 infiziert worden waren, wurden für 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Medium wurde dann durch 1 ml frisches Methionin-freies Medium ersetzt und für eine weitere Stunde inkubiert. Etwa 1,5 · 10&sup5; Bq (40 uCi) ³&sup5;S-Methionin (NEN, Wilmington, DE) wurden dann hinzugefügt, und die Kulturen wurden für weitere 12 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen, abgeschabt und in ein 15 ml- Falcon-Röhrchen überführt. Die Zellen wurden zentrifugiert, in Lysepuffer (150 mM NaCl, 1% Natriumdes-oxycholat, 1% TritonTM X-100, 0,1% SDS und 10 mM Tris HCl, pH 7,5) resuspendiert und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein halbes Volumen 10% (Vol./Vol.) S. aureus Cowan 1 (SAC) wurde dem Zelllysat hinzugefügt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Das Lysat wurde dann zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt. Etwa 3 ul monoclonaler Antikörper, IAN86 gegen MDV "B-Antigen-Komplex", Silva et al. Virology, 136:307-320 (1984) wurden zu 100 ul Lysat gegeben und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Ein gleiches Volumen 10% (Vol./Vol.) SAC wurde hinzugefügt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Immunpräzipitate wurden dann gewaschen, in Probenpuffer suspendiert und dann gekocht. Nach Zentrifugation wurde der Überstand mittels Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese, Laemmli, Nature, 207:680-685 (1970) analysiert. Fig. 5 zeigt das Ergebnis der Immunpräzipitation mit einem monoclonalen Antikörper (IAN86) spezifisch gegen den MDV "B-Antigen- Komplex". Spur 1 ist eine Kontrolle, enthaltend nichtrekombinantes Geflügelpockenvirus-Zelllysat. Drei identische Banden mit 100 kd, 60 kd und 49 kd Molekulargewicht wurden in Extrakten von Zellen, welche mit rec.FPV/MDVgBh (Fig. 5, Spur 2) und MDV (Fig. 5, Spur 3) infiziert waren, beobachtet. Es wurde auch gezeigt, daß diese Glykoproteine glykosyliert sind, dadurch, daß nachgewiesen wurde, daß sie radioaktiv markiertes Glucosamin aufgenommen haben. Ähnliche Glykoproteine wurden mit dem gleichen monoclonalen Antikörper in dem MDV "B-Antigen-Komplex" identifiziert, und wurden als gP100, gP60 und gP49, Sithole et al. J. Virol., 62:4270-4279 (1988) bezeichnet.
Dies ist der erste klare Nachweis, daß das MDV gBh-Gen für diese drei Glykoproteine, welche zuvor als der "B-Antigen- Komplex" bezeichnet wurden, codiert. Es wird angenommen, daß die beiden letzten Glykoproteine Spaltprodukte von gP100 sind, was die eher schwachen Signale, welche für dieses Glykoprotein bei unserer Immunpräzipitation von Zelllysaten aus späten Infektionsstadien erhalten wurden, erklären kann (Fig. 5).

BEISPIEL 6

Fähigkeit des rec.FPV/MDVgBh eine humorale Immunität gegen das MDV gBh-Antigen bei Hühnern zu induzieren

Einer Gruppe von fünf 3 Wochen alten Hühnern der spezifisch pathogenfreien (SPF) Linie O, welche in diesem Laboratorium gezogen wurde, wurden infektiöse Dosen von 10&sup6; (PFUs) des rec.FPV/MDVgBh intramuskulär injiziert, während einer anderen Gruppe von fünf ähnlichen Hühnern nichtrekombinantes FPV injiziert wurde. Ähnliche Booster- Inokulationen wurden nach 2 und 4 Wochen gegeben. Von allen Hühnern wurden 2 Wochen nach der letzten Inokulation Seren gesammelt. Die Seren wurden auf die Gegenwart von Antikörpern gegen das MDV gBh-Antigen getestet. Deckglas- Monoschichtkulturen (Coverslip monolayer cultures) von CEF wurden mit dem MDV GA-Stamm infiziert, und bei 37ºC inkubiert, bis typische MDV-Plaques mit dem Lichtmikroskop sichtbar wurden. Diese Kulturen wurden dann mit geeigneten Verdünnungen der Seren von Hühnern beider Gruppen umgesetzt, gefolgt von umfangreichem Waschen und der Umsetzung mit Fluorescein-konjugiertem Ziege-anti-Huhn-Immunglobulin. Die Kulturen wurden dann mit einem Mikroskop, ausgestattet mit einer UV-Beleuchtung, untersucht. Seren aus Hühnern, welche mit rec.FPV/MDVgBh immunisiert wurden, reagierten positiv mit MDV-infizierten Zellen und färbten cytoplasmatische Antigene typisch für das gBh-Antigen von MDV an. Bei Seren von Hühnern, welche mit dem nichtrekombinanten FPV immunisiert wurden, blieb die Anfärbung des gBh-Antigens von MDV aus. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß das rec.FPV/MDVgBh spezifische Antikörper gegen das gBh-Antigen von MDV induzieren kann, wenn es in Hühner injiziert wird.

BEISPIEL 7

rec.FPV/MDVgBh schützt Hühner vollständig gegen die Exposition mit virulentem Tumor-induzierendem MDV

Getrennte Gruppen von 1 Tag alten Hühnern der 15 · 7-Hühnerlinie, empfindlich gegen MD, wurden mit 10&sup6; Plaque-bildenden Einheiten (PFU) von rec.FPV/MDVgBh, 10&sup6; PFU von paren talem FPV oder 10³ PFU HVT-Vakzin geimpft. Eine weitere Gruppe ähnlicher Hühner wurde ungeimpft belassen. Alle wurden in strenger Isolation gehalten. Im Alter von 12 Tagen wurden alle mit 1 · 10³ PFU des virulenten Tumorverursachenden GA-Stamms von MDV stimuliert. Eine fünfte Gruppe Hühner wurde weder geimpft noch stimuliert. Die Mortalität, verursacht durch MD, wurde während des Experiments registriert, und am Ende des 10 Wochen Experiments wurden alle Hühner auf starke Läsionen und für MD typische Tumore untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 1 dargelegt.
Bei einem zweiten Experiment wurden 1 Tag alte Hühner entweder intraabdominal (IA) mit 10³ PFU HVT geimpft oder halbintramuskulär (IM) und halb-IA mit 10&sup4; PFU rec.FPV/MDVgBh geimpft. Eine Gruppe erhielt als Vakzin nur IA und eine andere Gruppe erhielt das Vakzin IM. Eine Gruppe erhielt rec.FPV/MDVgBh-P7,5, bei dem das MDVgBh-Gen durch das Vaccinia-Virus 7,5 kd Proteinpromotor (P7,5) gesteuert wurde. Sechs Tage nach der Impfung wurden sechs Gruppen mit 10³ PFU des pathogenen GA-Stamms von MDV stimuliert, während drei andere Gruppen jeweils mit 10³ PFU von sehr virulenten Stämmen von MDV (RB1B-Stamm, Schat et al. Avian Pathol., 11:593-605 (1982) oder MdS, Witter et al. Avian Dis., 24:210-232 (1980)) stimuliert wurden. Die Ergebnisse dieser Studie werden in Tabelle 2 dargelegt. Tabelle 1: Schutz gegen MD durch rec.FPV/MDVgBh. Tabelle 2: Schutz gegen verschiedene Stämme von MDV durch rec.FPV/MDVgBh.
Eine bedeutende Zahl nichtgeimpfter Hühner in den Gruppen, welche mit allen drei Stämmen stimuliert wurden, starben an MD oder hatten MD-spezifische Tumoren und Läsionen am Ende des Experiments. Diejenigen, welche mit rec.FPV/MDVgBh oder HVT geimpft worden waren, waren vollständig gegen GA- oder sehr virulente Md5-Stämme geschützt. Diejenigen, welche mit einem der oben genannten Vakzine geimpft worden waren, waren auch signifikant und gleich gegen die sehr virulenten RB1B-Stämme von MDV geschützt. Es bestand kein wesentlicher Unterschied beim Schutzniveau, induziert durch die Art zu Impfen, da alle Vögel, welche IM-, IA- oder IM-&IA-geimpft und mit dem GA- Stamm von MDV stimuliert worden waren, vollständig gegen MD geschützt waren. Das rec.FPV/MDVgBh, welches das MDVgBh-Gen unter der Kontrolle eines synthetischen Pockenviruspromotors exprimiert, war dem rec.FPV/MDVgBh-P7,5, welches das gleiche Gen unter der Kontrolle des Vakzinia- Virus-P7,5-Promotors exprimiert, insofern überlegen, als das eher vollständig gegen MD schützte, während die letztere Rekombinante einen signifikanten Schutz, aber einen nicht so guten wie die Rekombinante, welche durch den synthetischen Pockenvirus-Promotor gesteuert wird, bot.
Eine bedeutende Anzahl der nichtgeimpften Hühner und diejenigen, welche mit parentalem FPV geimpft worden waren, welche mit MDV stimuliert worden waren, starben an MD oder hatten am Ende des Experiments MD-Läsionen und -Tumore. Hühner, welche mit rec.FPV/MDVgBh geimpft worden waren, waren vollständig gegen MD ohne Mortalität und ohne für MD typische Läsionen geschützt. In ähnlicher Weise waren alle mit HVT geimpften Hühner geschützt. Keine Mortalität oder Läsionen waren bei Hühnern vorhanden, welchen kein MDV injiziert wurde. Diese Ergebnisse zeigten, daß das rec.FPV/MDVgBh Hühner vollständig gegen MD schützte, genauso gut, wie das verbreitet verwendete handelsübliche HVT-Vakzin.

BEISPIEL 8

Herstellung eines zellfreien Vakzins aus rekombinantem FPV/MDVgBh

Konfluente Monoschichten von Hühnerembryo-Fibroblastenkulturen, enthaltend etwa 4 · 10&sup7; Zellen in Kunststoffgewebekulturschalen, wurden mit 1 ml rec.FPV/MDVgBh-Vorrat, enthaltend etwa 1 · 10&sup6; PFU das Virus, infiziert und für 2 Stunden bei 37ºC inkubieren gelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurden 20 ml frisches Kulturmedium zu jeder Platte gegeben. Die Kulturen wurden dann für 3 bis 4 Tage bei 37ºC in einem 5% CO&sub2;-Inkubator inkubiert bis die gesamte Zellmonoschicht Anzeichen von Infektion zeigte. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Zellmonoschicht von der Kulturschale unter Verwendung eines Zelllifters (Costar Corp.) abgeschabt. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation pelletiert und in 5 ml des ursprünglichen Kulturmediums suspendiert und bei halber Stärke für 60 Sekunden unter Verwendung eines Braun-Sonic U-Beschallungsgeräts (Braun Co. Ltd.) auf Eis beschallt. Das beschallte Material wurde dann zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die überstehende Flüssigkeit wurde dann zum verbliebenen ursprünglichen Kulturmedium gegeben. Diese Vakzinpräparation wurde dann in 1 ml-Aliquots aufgeteilt, in Glasfläschchen gegeben und bei -70ºC in einem Gefrierschrank gelagert.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: NAZERIAN, Keyvan LEE, Lucy F. YANAGIDA, Noboru LI, Yi
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: REKOMBINANTES GEFLÜGEL- POCKENVIRUSVAKZIN ZUM SCHUTZ GEGEN DIE MAREK-KRANKHEIT
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 19
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: BIRCH, STEWART, KOLASCH & BIRCH (B) STRASSE: 301 North Washington Street (C) ORT: Falls Church (D) BUNDESLAND: Virginia (E) LAND: USA (F) POSTLEITZAHL: 22040-0747
(v) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patent in Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US (B) ANMELDETAG: (C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANGABEN ZUM ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Murphy Jr., Gerald M. (B) REGISTRATIONSNUMMER: 28977 (C) AKTENZEICHEN: 1644-103P
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: (703) 241-1300 (B) TELEFAX: (703) 241-2848 (C) TELEX: 248345

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 48 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 48 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 55 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 55 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 40 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 40 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 42 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 42 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 39 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 14 Hasen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 3209 Basenpaare (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS (B) LAGE: 357..2951
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 865 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE; 13 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 26 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 40 Basen (B) ART: Nukleinsäure (C) STRANGFORM: Einzel (D) TOPOLOGIE: Linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

Claims

1. Rekombinanter Geflügelpocken-Virus (FPV), welcher ein Gen, welches für ein antigenes Glykoprotein-B-Homologes vom Marek-Krankheit-Virus (MDV) codiert, unter der Kontrolle eines Pockenviruspromotors, in einem Bereich der DNA von FPV, welcher nicht für das Viruswachstum essentiell ist, umfaßt.

2. Rekombinanter FPV nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Promotor-Antigen-Gen mit dem lac-Z-Gen von E. coli als ein Markergen unter der Kontrolle eines weiteren Pockenviruspromotors eingefügt ist.

3. Rekombinanter FPV nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombinante zusätzlich zu dem Gen, welches für das Glykoprotein-B-Homologe von MDV codiert, ein Gen, welches für ein weiteres Antigen von MDV, ausgewählt aus Glykoprotein- C-Homologem, Glykoprotein-D-Homologem und Hüllproteinen, codiert, umfaßt.

4. Rekombinanter FPV nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Virus, wie bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC-VR-2330 hinterlegt, umfaßt.

5. Vaccinzusammensetzung, welche eine wirksame Menge eines rekombinanten FPV gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

6. Vaccinzusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie in zellfreiem lyophilisiertem Zustand vorliegt.

7. Vaccinzusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie in zellfreiem gefrorenem Zustand vorliegt.

8. Vaccinzusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwischen 10&sup4; und 10&sup6; plaquebildende Einheiten (PFU) des rekombinanten FPV pro ml Träger umfaßt.

9. Vaccinzusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie 10&sup5; PFU des rekombinanten FPV pro ml Träger umfaßt.

10. Mittel zum Füttern oder Tränken von Geflügel, welches eine wirksame Menge eines rekombinanten FPV gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.